JP6085083B2 - Additives for matrix for mass spectrometry - Google Patents
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Description
本発明は、医療及び創薬分野において応用されうるＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より具体的には、本発明は、質量分析用マトリックスの添加剤であるアルコールに関する。 The present invention relates to MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry) applications that can be applied in the medical and drug discovery fields. More specifically, the present invention relates to an alcohol that is an additive of a matrix for mass spectrometry.
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。
例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（3-CHCA）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（3H4NBA）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）や２，５−ジヒドロ安息香酸（DHB）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
In MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization) mass spectrometry, conditions for realizing efficient ionization of molecules to be measured have been searched.
For example, in JP-A-2005-326391 (Patent Document 1), a hydrophobic peptide is previously modified with a 2-nitrobenzenesulfenyl group, and α-cyano-3-hydroxycinnamic acid (3-CHCA), 3-hydroxy- By performing mass spectrometry using 4-nitrobenzoic acid (3H4NBA) or a mixture thereof as a matrix, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-CHCA) or 2,5- A method for efficiently ionizing a hydrophobic peptide as compared with dihydrobenzoic acid (DHB) is described.
上記のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。
このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、従来の方法によってもイオン化効率が低いという問題がある。
本発明の目的は、測定対象分子の修飾を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる物質を提供することにある。
In the above MALDI mass spectrometry method, when the molecule to be measured is modified, a certain degree of ionization promoting effect is obtained, but when the modification is not performed, the ionization efficiency is not sufficient.
Thus, molecular species that are difficult to ionize MALDI, such as hydrophobic peptides, have a problem that the ionization efficiency is low even by the conventional method.
An object of the present invention is to provide a substance capable of improving ionization efficiency in mass spectrometry easily and efficiently without modifying a molecule to be measured.
本発明者らは鋭意検討の結果、特定のアルコールが、マトリックスとしては機能しないが、マトリックスの添加剤として用いられることによって本発明の目的を達成することができるものであることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that a specific alcohol does not function as a matrix but can achieve the object of the present invention by being used as an additive for the matrix. It came to complete.
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、炭素数８〜１４のアルキルアルコールである質量分析用マトリックスの添加剤。
前記アルキルアルコールの炭素数は、８〜１４、より好ましくは８〜１０である。
好ましくは、前記アルキルアルコールは、直鎖アルコールである。
好ましくは、前記アルキルアルコールは、第一級アルコールである。
（２）
α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、及びシナピン酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、（１）に記載の添加剤。
（３）
（１）又は（２）に記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた、疎水性ペプチドの質量分析法。
The present invention includes the following inventions.
(1)
A matrix additive for mass spectrometry, which is an alkyl alcohol having 8 to 14 carbon atoms , which is used for mass spectrometry of hydrophobic peptides .
The number of carbon atoms before Symbol alkyl alcohol, 8-14, more preferably 8-10.
Preferably, the alkyl alcohol is a linear alcohol.
Preferably, the alkyl alcohol is a primary alcohol.
(2)
The additive according to (1), which is added to a matrix for mass spectrometry selected from the group consisting of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, and sinapinic acid.
(3)
(1) A mass spectrometry method for a hydrophobic peptide using the additive for a matrix for mass spectrometry described in (2) .
本発明により、測定対象分子（特に疎水性ペプチド）のイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を提供することができる。
本発明により、測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができる。
According to the present invention, a matrix additive capable of improving the ionization efficiency of a molecule to be measured (particularly a hydrophobic peptide) can be provided.
According to the present invention, an improvement in detection sensitivity can be achieved by mass spectrometry measurement of a molecule to be measured (particularly a hydrophobic peptide).
本発明は、質量分析用マトリックスの添加剤として用いられるアルキルアルコールである。アルキルアルコールの炭素数は４以上、好ましくは４〜１４、より好ましくは８〜１４、さらにより好ましくは８〜１０である。アルキルアルコールのアルキル基部分は、直鎖及び分岐鎖であることを問わない。アルキルアルコールは、第一級アルコールであることが好ましいが、第二級アルコール及び第三級アルコールであってもよい。本発明においては、例えば質量分析対象が疎水性化合物である場合、アルキルアルコールは、疎水性度がより高いものがより好ましい傾向にある。 The present invention is an alkyl alcohol used as an additive in a matrix for mass spectrometry. The alkyl alcohol has 4 or more carbon atoms, preferably 4 to 14, more preferably 8 to 14, and still more preferably 8 to 10. It does not matter whether the alkyl group portion of the alkyl alcohol is linear or branched. The alkyl alcohol is preferably a primary alcohol, but may be a secondary alcohol and a tertiary alcohol. In the present invention, for example, when the mass spectrometric object is a hydrophobic compound, alkyl alcohol having a higher degree of hydrophobicity tends to be more preferable.
本発明のアルコールは、単独では測定対象のイオン化能力はないため、マトリックスとしては機能しない。しかしながら、マトリックスと混合して使用されることによって、マトリックスによる測定対象のイオン化能力を増強し、検出限界の向上を図ることができる。 The alcohol of the present invention alone does not function as a matrix because it has no ionization ability to be measured. However, when used in combination with a matrix, the ionization ability of the measurement object by the matrix can be enhanced and the detection limit can be improved.
本発明の添加剤と共に使用されるマトリックスとしては特に限定されない。一般的なマトリックスから当業者によって適宜選択されてよいが、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロ安息香酸、及びシナピン酸からなる群から選ばれることができる。 The matrix used with the additive of the present invention is not particularly limited. Although it may be appropriately selected by a person skilled in the art from a general matrix, for example, it can be selected from the group consisting of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydrobenzoic acid, and sinapinic acid.
本発明の添加剤を用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３００００、好ましくは１０００〜１００００の分子でありうる。好ましくは、質量分析対象は疎水性物質である。疎水性物質の疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて当業者によって適宜決定することができる。例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは例えば１０００以下、好ましくはー１０００以下でありうる。 The mass spectrometric object using the additive of the present invention is not particularly limited. For example, the molecular weight may be 500 to 30,000, preferably 1000 to 10,000. Preferably, the mass spectrometric object is a hydrophobic substance. The degree of hydrophobicity of the hydrophobic substance is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on various known hydrophobicity indices and hydrophobicity calculation methods. For example, the degree of hydrophobicity of the hydrophobic substance may be such that a person skilled in the art can determine that the substance is hydrophobic by the BB index (Bull and Breese Index). More specifically, the BB index can be 1000 or less, preferably −1000 or less.
本発明においては、特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、より疎水性度の高いアミノ酸残基を、より多く含むものである。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。 In the present invention, the effect of enhancing ionization ability of hydrophobic peptides (in the present invention, peptides include proteins) is particularly high. Specifically, the amino acids constituting the peptide contain more amino acid residues having a higher degree of hydrophobicity. For example, examples of the hydrophobic amino acid include isoleucine, leucine, valine, alanine, phenylalanine, proline, methionine, tryptophan, and glycine. It may also contain cysteine, tyrosine and the like.
本発明の添加剤とマトリックスとの組み合わせの比率は特に制限はないが、例えば以下のような量的関係で組み合わせることができる。
例えば、添加剤を質量分析用マトリックスの０．０１〜５０倍、好ましくは０．０１〜１倍のモル比で組み合わせることができる。
The ratio of the combination of the additive of the present invention and the matrix is not particularly limited, but for example, they can be combined in the following quantitative relationship.
For example, the additives can be combined in a molar ratio of 0.01 to 50 times, preferably 0.01 to 1 times that of the matrix for mass spectrometry.
本発明の添加剤は、通常、マトリックスとの混合溶液に調製される。マトリックスと添加剤との混合溶液は、通常、マトリックス溶液と添加剤溶液とをそれぞれ調製しておき、両溶液を混合することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、アセトニトリル−TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液、アセトニトリル水溶液、TFA水溶液などを用いることができる。アセトニトリル−TFA水溶液におけるアセトニトリルの濃度は例えば１０〜９０体積％であり、トリフルオロ酢酸の濃度は例えば０．０５〜１体積％でありうる。 The additive of the present invention is usually prepared in a mixed solution with a matrix. A mixed solution of a matrix and an additive can be usually prepared by preparing a matrix solution and an additive solution, respectively, and mixing both solutions. As the solvent, for example, acetonitrile-TFA (trifluoroacetic acid) aqueous solution, acetonitrile aqueous solution, TFA aqueous solution and the like can be used. The concentration of acetonitrile in the acetonitrile-TFA aqueous solution can be, for example, 10 to 90% by volume, and the concentration of trifluoroacetic acid can be, for example, 0.05 to 1% by volume.
添加剤は、例えば、０．５〜５０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば５ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。マトリックスは、例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば１０ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。これら添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１０：１〜１：１０、１０：１〜１：１又は１：１〜１：１０、例えば１：１０の体積比で混合することができる。 The additive can be prepared, for example, in a solution of 0.5 to 50 mg / ml, preferably 5 to 10 mg / ml, for example 5 mg / ml. The matrix can be prepared, for example, in a solution of 1 mg / ml to a saturated concentration, preferably 1 to 10 mg / ml, for example 10 mg / ml. These additive solutions and matrix solutions can be mixed, for example, in a volume ratio of 10: 1 to 1:10, 10: 1 to 1: 1, or 1: 1 to 1:10, for example 1:10.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
本実施例においては、長鎖アルコールを、マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin；BBインデックスは-5800）の測定を行った。長鎖アルコールとしては、1-オクタノール(C8-OH)、1-デカノール(C10-OH)、1-ドデカノール(C12-OH)及び1-テトラデカノール(C14-OH)を用いた。比較用として、従来のマトリックスCHCAを単独で用いた測定も行った。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[Example 1]
In this example, a long-chain alcohol was used as an additive for α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) as a matrix, and a hydrophobic peptide (Humanin; BB index was −5800) was measured. . As long-chain alcohols, 1-octanol (C8-OH), 1-decanol (C10-OH), 1-dodecanol (C12-OH) and 1-tetradecanol (C14-OH) were used. For comparison, measurement using a conventional matrix CHCA alone was also performed.
（１）4-CHCA 10mg/mL (50%ACN/0.05%TFA water(%は体積を基準とする。以下において同様)と、長鎖アルコール(50%ACN/0.05%TFA water)とを1/10(v/v)で混合した。得られたマトリックス溶液を、それぞれ、C8-OH/CHCA(1/10)、C10-OH/CHCA(1/10)、C12-OH/CHCA(1/10)、及びC14-OH/CHCA(1/10)と記載する。
（２）疎水性ペプチドのHumanin 20a〜2pmol/μL (50%ACN/0.05%TFA water)溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液それぞれとを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
(1) 4-CHCA 10 mg / mL (50% ACN / 0.05% TFA water (% is based on volume. The same applies hereinafter) and long-chain alcohol (50% ACN / 0.05% TFA water) The resulting matrix solutions were mixed with C8-OH / CHCA (1/10), C10-OH / CHCA (1/10), C12-OH / CHCA (1/10 ), And C14-OH / CHCA (1/10).
(2) A Humanin 20a to 2 pmol / μL (50% ACN / 0.05% TFA water) solution of a hydrophobic peptide was prepared.
(3) On the MALDI plate, 0.5 μL each of the sample solution (2) and the matrix solution (1) was dropped and mixed (on-target mix method).
(4) Measured with AXIMA Performance (Shimadzu Corporation) linear TOF, positive and negative modes.
（比較用）
（１）CHCAの10 mg/mL (50%ACN/0.05%TFA water)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの20a〜2pmol/μL 50%ACN/0.05%TFA waterを作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
(For comparison)
(1) A 10 mg / mL (50% ACN / 0.05% TFA water) solution of CHCA was prepared.
(2) Hydrophobic peptide Humanin 20a to 2 pmol / μL 50% ACN / 0.05% TFA water was prepared.
(3) The sample solution (2) and the matrix solution (1) were dropped 0.5 μL each on the MALDI plate and mixed (on-target mix method).
(4) Measured with AXIMA Performance (Shimadzu Corporation) linear TOF, positive and negative modes.
CHCA単独で使用した場合に比べ、長鎖アルコールを添加剤として使用することにより、ポジティブ（pos）及びネガティブ（neg）の両モ−ドで、感度向上が確認された。特に、C8-OH/CHCA (1/10)及びC10-OH/CHCA(1/10)を用いた場合は検出限界（fmol/well）が1/10となり、すなわち10倍の感度向上効果が確認された（表１）。 Compared with the case of using CHCA alone, the use of long-chain alcohol as an additive confirmed the improvement in sensitivity in both positive (pos) and negative (neg) modes. In particular, when C8-OH / CHCA (1/10) and C10-OH / CHCA (1/10) are used, the detection limit (fmol / well) is 1/10. (Table 1).
Claims (2)
マトリックスと、炭素数８〜１０のアルキルアルコールから選ばれるマトリックスの添加剤とを混合し、前記マトリックスと前記マトリックス添加剤との混合溶液を調製し、
疎水性ペプチドと、前記調製されたマトリックスとマトリックス添加剤との混合溶液とをサンプルプレート上で混合し、前記疎水性ペプチドと前記マトリックスと前記マトリックス添加剤との混合物を形成し（ただし、前記疎水性ペプチドが前記マトリックス添加剤により予め抽出されている場合を除く）、
前記形成された混合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定する
ことからなる疎水性ペプチドの質量分析法。 The mass spectrometry of hydrophobicity peptides using additive for mass spectrometry matrix alkyl alcohol 8-10 carbon atoms,
A matrix and a matrix additive selected from alkyl alcohols having 8 to 10 carbon atoms are mixed to prepare a mixed solution of the matrix and the matrix additive;
A hydrophobic peptide and a mixed solution of the prepared matrix and matrix additive are mixed on a sample plate to form a mixture of the hydrophobic peptide, the matrix and the matrix additive (however, the hydrophobic peptide is added). Unless the peptide is previously extracted with the matrix additive),
The formed mixture is measured by MALDI-MS
Mass spectrometry of hydrophobic peptides consisting of
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