JP6083728B2 - Protein function modification method - Google Patents
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Description
本発明は、標的分子を特異的に認識するプローブを進化工学的に効率的に創出するための方法に関するものであり、具体的には、ランダム変異ライブラリーの進化ポテンシャルの評価方法、選択方法の評価、及び選択過程のモニタリング方法に関する。 The present invention relates to a method for efficiently creating a probe that specifically recognizes a target molecule in terms of evolutionary engineering. Specifically, the present invention relates to a method for evaluating and selecting the evolution potential of a random mutation library. It relates to a method for monitoring the evaluation and selection process.
抗体を代表とする分子認識プローブは、細胞表層分子を標的として、バイオ医薬品として様々な疾患の治療に用いることができる。特に抗体は現在では癌や関節リウマチ、感染症のための治療薬として用いられている。また、抗体アレイやレクチンアレイに用いることで、バイオマーカー探索に応用できるだけでなく、バイオマーカーの検出試薬としても有効である。更に、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質など様々な生体分子を研究するための検出試薬としても利用できる。
目的とする標的分子を認識する分子プローブを人工的に創出するための技術として進化工学がある。生物の進化の過程では多くの異なる子孫の中から最適者が選択される。進化工学では、この進化の原理をタンパク質や核酸設計に応用する。進化工学では各種方法を用いて遺伝子配列にランダム変異を導入し、異なる配列を有する変異遺伝子ライブラリーを作製する。次に変異遺伝子ライブラリーから変異タンパク質（あるいは核酸分子）を作製し、その中から目的とする性質を有するタンパク質（あるいは核酸分子）を作る遺伝子をスクリーニングあるいはセレクションして、目的とする分子に人工的に進化させる。
この目的のため、DNA分子とそれがコードするタンパク質分子とを、生物的あるいは物理的に関連付けを行う技術が開発されてきた。関連付ける技術として、ファージ提示法、細胞表層提示法、リボソーム提示法、mRNA提示法などが知られている。一方、遺伝子に変異を導入する方法として、大きくランダム変異導入法、リコンビネーション法、標的化ランダム変異導入法などが知られている。
とりわけ、簡便に効率良く変異遺伝子ライブラリーを作製するために、リボソームを介する複合体（リボソーム複合体）を用いた無細胞系ディスプレイシステムであるリボソーム提示法に、ランダム変異導入法を適用した進化方法が開発されている。リボソーム提示法では、終止コドンを欠くmRNAを用いることにより、試験管内でmRNA-リボソーム-タンパク質の複合体を形成させ、mRNA（遺伝子型）とタンパク質（表現型）とを、リボソームを介して関連づける。進化工学に用いる際の主な手順は以下の通りである。すなわち、遺伝子にランダム変異を導入して、転写反応により終止コドンが存在しないmRNAを作製する。次にmRNAを鋳型とした翻訳反応を無細胞系で行う。次いで生成したリボソーム複合体に対するアフィニティーセレクションを行い、選択された複合体から、結合したタンパク質をコードするmRNAを回収し、RT-PCRによって目的とするDNAを獲得する。以上の手順を繰り返すことで、ある特定のリガンドに対して結合性を有するタンパク質を得ることができる。
Molecular recognition probes typified by antibodies can be used as biopharmaceuticals for the treatment of various diseases by targeting cell surface molecules. In particular, antibodies are currently used as therapeutic agents for cancer, rheumatoid arthritis and infectious diseases. Moreover, by using it for an antibody array or a lectin array, it can be applied not only to biomarker searches but also as a biomarker detection reagent. Furthermore, it can be used as a detection reagent for studying various biomolecules such as nucleic acids, proteins, sugar chains, and lipids.
Evolutionary engineering is a technique for artificially creating a molecular probe that recognizes a target molecule of interest. In the process of biological evolution, the optimal person is selected from many different offspring. In evolutionary engineering, this evolutionary principle is applied to protein and nucleic acid design. In evolutionary engineering, random mutations are introduced into gene sequences using various methods to create mutant gene libraries having different sequences. Next, a mutated protein (or nucleic acid molecule) is prepared from the mutated gene library, and a gene for producing a protein (or nucleic acid molecule) having the desired property is screened or selected from the mutated gene library, and the target molecule is artificially created. To evolve.
For this purpose, a technique for biologically or physically associating a DNA molecule with a protein molecule encoded by the DNA molecule has been developed. As a related technique, a phage display method, a cell surface display method, a ribosome display method, an mRNA display method, and the like are known. On the other hand, as a method for introducing a mutation into a gene, a random mutation introduction method, a recombination method, a targeted random mutation introduction method and the like are widely known.
In particular, in order to create a mutant gene library simply and efficiently, an evolution method that applies random mutagenesis to the ribosome display method, which is a cell-free display system using a ribosome-mediated complex (ribosome complex) Has been developed. In the ribosome display method, mRNA lacking a stop codon is used to form an mRNA-ribosome-protein complex in vitro, and the mRNA (genotype) and the protein (phenotype) are linked via the ribosome. The main procedure for use in evolutionary engineering is as follows. That is, a random mutation is introduced into a gene, and mRNA without a stop codon is produced by a transcription reaction. Next, translation reaction using mRNA as a template is performed in a cell-free system. Next, affinity selection is performed on the generated ribosome complex, and mRNA encoding the bound protein is recovered from the selected complex, and the target DNA is obtained by RT-PCR. By repeating the above procedure, a protein having a binding property to a specific ligand can be obtained.
このように、リボソーム提示法などによって標的分子に対して結合性を有するタンパク質を進化工学的に創出しようとする際には、完全にランダムなペプチド配列から進める方法もあるが、より効率性を考えると、認識分子としての認識特性や安定性などを考慮して適切と思われる親タンパク質を選定し、ランダム変異を導入することにより変異遺伝子ライブラリーを作製する方法が好適である。このようにして得られた変異遺伝子ライブラリーを対象として、翻訳されたペプチドと標的分子との結合性を指標に選別（アフィニティーセレクション）を繰り返すことで、標的分子に対して結合性を有するペプチドをコードする変異遺伝子を濃縮し、当該配列を決定して標的分子に対する結合性を有するタンパク質を創出することになる。 In this way, when trying to create a protein with binding properties to the target molecule by the ribosome display method, etc., there is a method of proceeding from a completely random peptide sequence, but consider more efficiency A method for preparing a mutant gene library by selecting a suitable parent protein in consideration of recognition characteristics and stability as a recognition molecule and introducing random mutations is preferable. For the mutant gene library obtained in this way, by repeating the selection (affinity selection) using the binding property between the translated peptide and the target molecule as an index, a peptide having binding property to the target molecule can be obtained. The encoded mutant gene is concentrated, and the sequence is determined to create a protein having a binding property to the target molecule.
しかしながら、望みの標的分子結合性を有するタンパク質が確実に含まれる変異遺伝子ライブラリーの確立した作製法はないため、ランダム変異導入のための親タンパク質としてどのようなタンパク質が適しているのか、または、親タンパク質のどの領域にどの程度の頻度でランダム変異を導入すればよいかは、対象となる標的分子ごとに研究者の経験と勘に頼る他はなく、どうしても試行錯誤を余儀なくされる。しかも、それぞれの親タンパク質は本来、それぞれに進化する指向性が決まっていると予想される。そのため、作製した変異遺伝子ライブラリーの中に、標的分子に結合するように性質が変化した変異型分子が果たして存在しているのかどうか（進化指向性）を効率的に確認する方法がなかったため、仮に作製した変異遺伝子ライブラリーでは、いくらセレクションをかけても望みの変異ペプチドに到達できないとしても、そのことに気付くのは、何度もセレクション及び遺伝子増幅の工程を繰り返した後であるから、膨大な時間の無駄を伴うことは必至であった。
更に、作製した変異遺伝子ライブラリーの中に標的分子に結合するように性質が変化した変異型分子が存在していたとしても、セレクション方法がその変異型分子の濃縮に適切であるかどうか、濃縮工程がうまくいっているかどうか、が不明であった。しかし、従来、望みの変異遺伝子を効率的に確実に取得するための研究開発としては、主に、より効率的で確実な変異遺伝子ライブラリーの作製手法自体や、抗体に代わる新規認識分子の合理的設計を目指そうとする技術開発に目が向けられており、作製した変異遺伝子ライブラリーに対して、その「進化指向性」を簡便に評価するための有効な方法の開発にはほとんど注意が向けられていなかった。
したがって、標的分子に特異的な結合活性を有するタンパク質または核酸（標的分子に対する認識プローブ）を得るために、一旦ある親タンパク質を出発材料とする「変異遺伝子ライブラリー」を作製してしまうと、最終的な結果が得られるまでは、当該変異ライブラリーが目的とする変異遺伝子を、その後のセレクションに耐えられるほどに充分量含んでいるのかどうか、セレクション方法が適しているかどうか、また各セレクション過程がうまく進んでいるのか、いつセレクション及び増幅工程を終了させればいいかが全く不明な状態でセレクション工程及び増幅工程を繰り返さざるを得なかった。そして、最終的な結果が得られてはじめて、目的とする標的分子に対する認識プローブが得られているかどうかが判明するから、仮にいずれかの工程で失敗があれば、また最初からの試行錯誤的な実験の繰り返しを余儀なくされる。そのために、望みの標的分子に対する特異性を有する変異型分子を創出することは必ずしも容易ではなかった。
However, since there is no established method for producing a mutant gene library that surely contains a protein having the desired target molecule binding property, what kind of protein is suitable as a parent protein for random mutagenesis, or How often random mutations should be introduced into which region of the parent protein depends on the researcher's experience and intuition for each target target molecule, and trial and error are unavoidable. In addition, each parent protein is expected to have a specific directionality to evolve. Therefore, there was no way to efficiently check whether there were any mutant molecules whose properties were changed to bind to the target molecule in the prepared mutant gene library (evolution directionality) Even if a mutant gene library is created, no matter how much selection is performed, the desired mutant peptide cannot be reached, but it is only after the selection and gene amplification processes have been repeated many times. It was inevitable that time was wasted.
Furthermore, even if there are mutant molecules whose properties have changed so that they bind to the target molecule in the prepared mutant gene library, whether or not the selection method is appropriate for enrichment of the mutant molecule. It was unclear whether the process was successful. However, in the past, research and development for efficiently and reliably obtaining the desired mutant gene has mainly focused on a more efficient and reliable method for constructing a mutant gene library itself and the rationalization of a new recognition molecule to replace an antibody. Attention is being focused on the development of technologies that aim to achieve the objective design, and little attention is paid to the development of an effective method for simply evaluating the “evolutionary orientation” of the created mutant gene library. It was not done.
Therefore, in order to obtain a protein or nucleic acid (recognition probe for a target molecule) having a specific binding activity to the target molecule, once a “mutant gene library” starting from a parent protein is prepared, Until the desired result is obtained, whether the mutation library contains a sufficient amount of the target mutant gene to withstand the subsequent selection, whether the selection method is suitable, and whether each selection process is The selection process and the amplification process had to be repeated in a state where it was completely unknown whether the progress was successful or when the selection and amplification process should be completed. Only after the final result is obtained, it is determined whether or not a recognition probe for the target molecule has been obtained. If there is a failure in any of the steps, trial and error from the beginning You will be forced to repeat the experiment. Therefore, it has not always been easy to create a mutant molecule having specificity for a desired target molecule.
本発明者らは、以前、α２-６シアル酸特異的レクチンの創出に成功したが、その際、出発材料の親タンパクとしてヒトからバクテリアまで広く生物に存在しているガラクトース特異的なＲ型レクチンファミリー内のミミズ由来レクチンEW29（GenBank登録番号：AB010783）のＣ末端ドメイン（EW29ch：配列番号１）を選定した。EW29chが有しているＲ型レクチン共通のβ-トレフォイル構造が、ガラクトースへの特異性を決定する糖認識ドメインであると考え、当該領域に対してランダム変異を導入したランダム変異ライブラリーを用いて、本来のガラクトース特異性を、α２-６シアル酸特異的に改変することに成功した（非特許文献４）。更に最近、同様の方法を用いてEW29chから６硫酸ガラクトースに結合する変異体の創出にも成功した（非特許文献５）。
その際には、結果的に見ると、選定した親タンパクの選定が適切であり、セレクションのサイクルでも順調に濃縮できたために、目的の糖鎖結合特異性を有する改変体の取得に成功したわけではあるが、逆転写PCR後のPCR産物量から濃縮過程を推定することはできたものの、実際には最終結果を確認するまでは、当初設定した実験のストラテジーの方向性が正しいか否かに確信が持てなかった。その理由として、それぞれのタンパク質によって進化の指向性は決まっていると考えられ、間違えた標的分子を設定してしまった場合には、そのような変異体を、いくら努力や検討を重ねても創出することができないからである。この経験に基づき、本発明者らは、作製した変異遺伝子ライブラリーが、標的分子に対して結合する可能性があるかどうかの「進化ポテンシャル」評価、更にある分子に対してセレクションをかけたあとのライブラリーの「進化ポテンシャル」評価、及びセレクション過程の各ステップにおける変異ライブラリーの「進化ポテンシャル」のモニタリングの必要性を痛感するに至り、選定した親タンパクについての簡便でかつ的確な評価法、及びセレクション過程での高感度かつ網羅的なモニタリング方法の開発を本発明の「解決すべき課題」として設定することとした。
すなわち、本発明は、標的分子に対する特異的な結合活性を有するタンパク質（特異的認識プローブ）を、簡便、迅速に、かつ確実に得ることを目的とするものである。そのために、出発材料として選択した親タンパク質の進化ポテンシャルの評価、すなわち作製された変異遺伝子ライブラリーが標的分子に対する認識プローブを進化工学的に創出することが容易なライブラリーであるか否かの評価が簡便かつ的確にできる手法を提供するものである。そして、それと共に、アフィニティーセレクションの方法が適切かどうか、またその過程で標的分子に特異的に結合する分子が濃縮されていく状態を、高感度且つ網羅的にモニタリングする方法を提供するものでもある。
The present inventors have previously succeeded in creating an α2-6 sialic acid-specific lectin, and at that time, a galactose-specific R-type lectin that exists widely in organisms from humans to bacteria as a parent protein of the starting material. The C-terminal domain (EW29ch: SEQ ID NO: 1) of the earthworm-derived lectin EW29 (GenBank accession number: AB010783) in the family was selected. The β-trefoil structure common to R-type lectins possessed by EW29ch is considered to be a sugar recognition domain that determines specificity for galactose, and a random mutation library in which random mutations are introduced into the region is used. The original galactose specificity was successfully modified in an α2-6 sialic acid-specific manner (Non-patent Document 4). Furthermore, recently, the same method was used to create a mutant that binds to 6-sulfate galactose from EW29ch (Non-patent Document 5).
In that case, the selection of the selected parent protein was appropriate, and as a result, it was possible to successfully obtain a variant having the target sugar chain binding specificity because it was successfully concentrated even in the selection cycle. However, although it was possible to estimate the enrichment process from the amount of PCR product after reverse transcription PCR, whether or not the direction of the initial experimental strategy was correct until the final result was actually confirmed. I wasn't sure. The reason for this is thought to be the direction of evolution determined by each protein, and if a wrong target molecule is set, such mutants will be created no matter how much effort and investigation is repeated. Because you can't. Based on this experience, the present inventors evaluated the “evolution potential” of whether or not the generated mutant gene library may bind to the target molecule, and after selecting a certain molecule. A simple and accurate evaluation method for the selected parent protein, and the need to monitor the “evolution potential” of the library and the monitoring of the “evolution potential” of the mutation library at each step of the selection process. The development of a high-sensitivity and comprehensive monitoring method in the selection process is set as the “problem to be solved” of the present invention.
That is, an object of the present invention is to obtain a protein (specific recognition probe) having specific binding activity for a target molecule simply, rapidly and reliably. Therefore, evaluate the evolution potential of the parent protein selected as the starting material, that is, evaluate whether the created mutant gene library is an easy library for evolutionary creation of recognition probes for target molecules. Provides a technique that can be easily and accurately performed. At the same time, it also provides a method for highly sensitive and comprehensive monitoring of whether the affinity selection method is appropriate and the state in which molecules that specifically bind to the target molecule are concentrated. .
本発明者らは、作製した変異遺伝子ライブラリーの「進化ポテンシャル」評価のためのモデル系として、以前成功したミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29ch）を親タンパク質とする６硫酸ガラクトース特異的レクチンの創出系を選択し、矢部らの方法（非特許文献４）に準じて行った「エラー導入PCR/リボソーム提示法」（図１）でのアッセイ過程を詳細に検討することを試みた。具体的には、エラープローンPCR法を用いて、EW29ch遺伝子（420塩基）に平均8塩基の変異導入効率でランダム変異を導入したライブラリーを作製した後、さらに当該変異導入EW29chに対して、その3’側にオーバーラップPCR法をにより、リンカーであるGeneIII遺伝子(477bp)を融合させることによって、ランダム変異遺伝子ライブラリーを作製した。この際、GeneIIIの3’末端側には、終止コドンの代わりにレアコドンを導入しておくことで、安定したリボソーム-mRNA-タンパク質複合体を形成できるようにした。次に、この変異遺伝子ライブラリーをin vitro転写、in vitro翻訳し、ランダム変異「リボソーム-mRNA-タンパク質複合体」ライブラリーを形成した。当該ライブラリーに対して、標的の糖鎖を固定化したビーズを用いてアフィニティーセレクションを行い、選択された複合体から、結合したタンパク質をコードするmRNAを回収し、逆転写PCRにより、結合性を示したタンパク質をコードするDNAを獲得した。以前に行った方法では、このサイクルを２−５回程度繰り返すことにより、標的の糖鎖に結合性を示すタンパク質をコードする遺伝子を濃縮した後にはじめて、得られたDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換後、タンパク質を発現させて、標的の糖鎖に対する結合活性を解析していた。この従来の方法では、最終的にタンパク質を発現させて結合活性を確認するまでは、たしかに標的の糖鎖に結合する遺伝子が濃縮されているのかがわからず、どこでサイクルをとめればよいのかの判断はつけられない。 As a model system for evaluating the “evolution potential” of the generated mutant gene library, the present inventors have used a 6-sulfate galactose-specific lectin whose parent protein is the C-terminal domain (EW29ch) of the earthworm-derived lectin EW29. In order to examine in detail the assay process in the “error-introduced PCR / ribosome display method” (FIG. 1) performed according to the method of Yabe et al. (Non-patent Document 4). Specifically, after creating a library in which random mutations were introduced into the EW29ch gene (420 bases) with an average of 8 bases of mutagenesis efficiency using error-prone PCR, A random mutant gene library was prepared by fusing the gene III gene (477 bp), which is a linker, to the 3 ′ side by overlapping PCR. At this time, a rare codon was introduced instead of a stop codon on the 3 'end side of GeneIII, so that a stable ribosome-mRNA-protein complex could be formed. Next, this mutant gene library was in vitro transcribed and translated in vitro to form a random mutant “ribosome-mRNA-protein complex” library. Affinity selection is performed on the library using beads to which the target sugar chain is immobilized, and mRNA encoding the bound protein is recovered from the selected complex, and binding properties are obtained by reverse transcription PCR. DNA encoding the indicated protein was obtained. In the method performed before, this cycle is repeated about 2-5 times, so that the obtained DNA is incorporated into an expression vector only after concentrating a gene encoding a protein that binds to a target sugar chain. After the transformation, the protein was expressed and the binding activity to the target sugar chain was analyzed. In this conventional method, until the protein is finally expressed and the binding activity is confirmed, it is not certain that the genes that bind to the target sugar chain are concentrated, and where should the cycle be stopped? Judgment cannot be made.
我々は、今回、以前の硫酸ガラクトース特異的レクチン創出までの過程を追試する中で、上記セレクション工程に先立ち、変異遺伝子ライブラリーの標的の糖鎖や、非標的糖鎖など多種類の糖鎖に対する結合活性を解析することにより、EW29chが獲得しうる糖鎖結合特異性、すなわち進化指向性をモニタリングできないかと検討を重ねた。また、同時に標的糖鎖を固定化したビーズによるセレクション工程で濃縮する際にも、各セレクション工程ごとに糖鎖結合活性の解析を行うことで、濃縮レベルのモニタリングができないかと検討した。その結果、「変異遺伝子ライブラリー」をin vitro転写、in vitro翻訳後、形成されたリボソーム-mRNA-タンパク質複合体の、多種類の糖鎖に対する糖鎖結合性、すなわち「糖鎖結合プロファイル」を親タンパク質の「糖鎖結合プロファイル」と比較解析することで、「変異遺伝子ライブラリー」における糖鎖結合性の変化傾向を概観し、対象の「変異遺伝子ライブラリー」が望みの標的糖鎖分子結合性への変化傾向を含むライブラリーであるかという質的な評価が可能ではないかと着想するに至った。そして、対象とする「変異遺伝子ライブラリー」全体としての「糖鎖結合プロファイル」の作製に、従来本発明者らなどによって開発されたスライドグラス上に様々な糖鎖複合体が固定化されている「糖鎖アレイ」を利用することとした。特にエバネッセント波励起蛍光スキャナーを検出系として用いた「糖鎖アレイ」解析法は、目的とする分子の糖鎖結合特異性を、精製操作なしに、クルードな状態で、高感度に解析できる技術として、本発明者らが開発している（非特許文献６）。 In this time, we are pursuing the previous process until creation of a galactose sulfate-specific lectin, and prior to the above selection process, we targeted multiple types of sugar chains such as target sugar chains and non-target sugar chains in the mutant gene library. By analyzing the binding activity, we investigated whether it is possible to monitor the sugar chain binding specificity that EW29ch can acquire, ie, the evolutionary directionality. At the same time, when concentrating in the selection step using beads with immobilized target sugar chains, it was examined whether the concentration level could be monitored by analyzing the sugar chain binding activity for each selection step. As a result, the mutated gene library was in vitro transcribed and translated in vitro, and the ribosome-mRNA-protein complex formed was linked to various types of sugar chains. By comparing and analyzing with the “glycan binding profile” of the parent protein, the change tendency of the sugar chain binding in the “mutant gene library” is reviewed, and the target “mutant gene library” is binding to the desired target sugar chain molecule I came up with the idea that it would be possible to qualitatively evaluate whether the library includes a tendency to change to sex. In addition, various sugar chain complexes are immobilized on a slide glass that has been developed by the inventors of the present invention in order to produce a “sugar chain binding profile” as a whole “mutant gene library” of interest. We decided to use “sugar chain array”. In particular, the “glycan array” analysis method using an evanescent wave-excited fluorescence scanner as a detection system is a technique that enables high-sensitivity analysis of the glycan binding specificity of the target molecule in a crude state without purification. Developed by the present inventors (Non-Patent Document 6).
しかし、糖鎖とその結合性タンパク質（レクチン）との関係は、抗原抗体反応のような鍵と鍵穴の関係ではなく、単一のレクチンが認識する糖鎖は多種類有り、反対に単一の糖鎖を認識するレクチンも多種類存在する場合が多いため、従来「糖鎖アレイ」を用いてレクチンの糖鎖結合特異性を解析する対象は、基本的には単一分子である。これに対して、本発明者らが発想したものは、多種類のレクチン分子からなる「変異遺伝子ライブラリー」由来の混合物を一度に糖鎖アレイと反応させ、各レクチン分子がどのような糖鎖に対して結合活性を有するかを糖鎖アレイ上の様々な糖鎖との結合の強さの傾向を概観しようというものであり、すなわち、対象レクチン混合物全体としての「糖鎖結合プロファイル」を作成しようというものである。そもそも当時は各種分子の混合物を同時に糖鎖アレイに適用して作成する、混合物全体としての「糖鎖結合プロファイル」という概念自体が存在しなかったため、変異ライブラリー評価に用いてみようと発想した本発明者ら自身も、「変異遺伝子ライブラリー」全体で発現している膨大な種類を含むペプチドが糖鎖アレイ表面に１度に供給された場合に、当該「変異遺伝子ライブラリー」由来タンパク質群がどのような糖鎖結合性の傾向を示すか全く想像ができなかった。その上、ランダム変異導入により特異性が改変する変異体は、全ライブラリーの中の極微量であると考えられるため、少なくともセレクション工程前で単にランダム変異導入しただけの「変異遺伝子ライブラリー」の場合、発現しているタンパク質変異群全体の糖鎖結合プロファイルを作製してみたところで、親タンパク質の糖鎖結合特異性と比較して、特異性が変化した変異体の分子数は微量であると想定されるから、むしろ親タンパク質の糖鎖結合プロファイルとほとんど同じであると想定された。更には、リボソーム-mRNA-タンパク質複合体の状態では、翻訳されたタンパク質量も少ないことが予想され、またこのような複合体の状態では糖鎖結合活性を見ることなど到底できないことも危惧していた。 However, the relationship between a sugar chain and its binding protein (lectin) is not a key-keyhole relationship as in an antigen-antibody reaction, and there are many types of sugar chains recognized by a single lectin. Since there are many types of lectins that recognize sugar chains, the target for analyzing the sugar chain binding specificity of lectins using a “sugar chain array” is basically a single molecule. In contrast, the present inventors have conceived that a mixture derived from a “mutant gene library” composed of many kinds of lectin molecules is reacted with a sugar chain array at one time, and what kind of sugar chain each lectin molecule has. It is intended to give an overview of the tendency of strength of binding to various sugar chains on the sugar chain array, that is, to create a “glycan binding profile” for the entire target lectin mixture It is to try. In the first place, there was no concept of “glycan binding profile” as a whole mixture, which was created by applying a mixture of various molecules to a glycan array at the time, so this book was designed to be used for mutation library evaluation. When the inventors themselves also supplied a large number of peptides expressed in the entire “mutant gene library” to the surface of the sugar chain array at once, the protein group derived from the “mutant gene library” It was impossible to imagine what kind of sugar chain binding tendency was exhibited. In addition, mutants whose specificity is altered by random mutagenesis are considered to be very small in the entire library, so at least the “mutant gene library” in which random mutagenesis has been introduced at least prior to the selection step. In this case, when the sugar chain binding profile of the entire expressed protein mutation group was created, the number of molecules of the mutant whose specificity was changed was very small compared to the sugar chain binding specificity of the parent protein. Since it was assumed, it was rather assumed that it was almost the same as the sugar chain binding profile of the parent protein. Furthermore, in the ribosome-mRNA-protein complex state, the amount of translated protein is expected to be small, and it was feared that in such a complex state, sugar chain binding activity could not be seen at all. .
本発明者らは、そのような大きな懸念の存在にもかかわらず、わずかな可能性にかけ、あえて「変異遺伝子ライブラリー」全体の糖鎖結合性プロファイルを作製し、親タンパク質（EW29ch）に対して作製した糖鎖結合性プロファイルとの比較解析を行ってみた。
具体的には、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29ch）を親タンパク質として、エラー導入PCR/リボソーム提示法（非特許文献４）の手法に基づき、平均8塩基／420塩基程度ののランダム変異を導入して「変異遺伝子ライブラリー（以下、「変異タンパク質ライブラリー」ともいう。）を作製し、in vitro転写、in vitro翻訳後に、リボソーム-mRNA-タンパク質複合体を作製した。このリボソーム-mRNA-タンパク質複合体群全体にEW29chのＮ末端に導入したFLAGタグに対する抗FLAG抗体と、Cy3ラベル化抗マウス２次抗体を混合して糖鎖アレイに反応させ、糖鎖結合性プロファイルを作製した。あわせて、ランダム変異を導入していない親タンパク質に対して作製した糖鎖結合性プロファイルと比較したところ、予想に反して親タンパク質とは異なる糖鎖結合性が明瞭に認められた（図２）。今回、モデル標的糖鎖に選んだ「６硫酸ガラクトース（[6’S]LN（[6S]Galβ1-4GlcNAc））」に対して、親タンパク質の糖鎖結合性プロファイルではほとんど反応性が見られなかったのに対して、変異タンパク質ライブラリーの糖鎖結合性プロファイルでは、明瞭な結合性を示すピークが確認できた。すなわち、このことは変異タンパク質ライブラリー中に、６硫酸ガラクトースへの結合性を獲得した変異体が確実に存在していることを示している。平均8塩基／420塩基程度という少ない変異導入数でありながら、結合の特異性にこれほど大きな変化が生じることは、驚くべきことであり、本発明者らも想定していなかったことである。同じ条件で３回、変異タンパク質ライブラリーを作製した結果、３種類の変異タンパク質ライブラリーは相互に類似の糖鎖結合プロファイルを示し、何れも共通して[6’S]LN（[6S]Galβ1-4GlcNAc）への結合性を示しており、再現性の高い実験手法であることが確認できた。
そして、このように糖鎖アレイを用いて「変異タンパク質ライブラリー」に対して作成された糖鎖結合プロファイルを、親タンパク質に対する糖鎖結合プロファイルと比較解析することで、「変異タンパク質ライブラリー」の中に標的とする変異体が充分な量存在するかどうかはもちろんのこと、どのような糖鎖に結合する変異体の取得に適したライブラリーであるかもわかる。つまり、選択した親タンパク質の「進化ポテンシャル」を予測することができるということに他ならない。
In spite of such a great concern, the present inventors dared to create a glycan binding profile of the entire “mutant gene library” and to create a parent protein (EW29ch). A comparative analysis with the prepared sugar chain binding profile was performed.
Specifically, using the EW29 C-terminal functional domain (EW29ch) as a parent protein, random mutations with an average of about 8 bases / 420 bases based on the error-introduced PCR / ribosome display method (Non-patent Document 4) After introduction, a “mutant gene library (hereinafter also referred to as“ mutant protein library ”) was prepared, and after in vitro transcription and in vitro translation, a ribosome-mRNA-protein complex was prepared. This ribosome-mRNA-protein complex group is mixed with an anti-FLAG antibody against the FLAG tag introduced at the N-terminus of EW29ch and a Cy3-labeled anti-mouse secondary antibody and reacted with the glycan array to form a glycan binding profile. Was made. In addition, when compared with the sugar chain binding profile prepared for the parent protein into which random mutations were not introduced, contrary to expectation, sugar chain binding different from the parent protein was clearly recognized (FIG. 2). . This time, the reactivity of the glycoprotein binding profile of the parent protein to the 6-sulfate galactose ([6'S] LN ([6S] Galβ1-4GlcNAc)) selected as the model target sugar chain was not seen. On the other hand, in the sugar chain binding profile of the mutant protein library, a peak showing clear binding could be confirmed. That is, this indicates that mutants that have acquired binding ability to 6-sulfate galactose are surely present in the mutant protein library. It is surprising that the present inventors have not assumed such a large change in the specificity of binding while the number of mutation introductions is as small as an average of about 8 bases / 420 bases. As a result of preparing the mutant protein library three times under the same conditions, the three mutant protein libraries showed similar sugar chain binding profiles to each other, and [6'S] LN ([6S] Galβ1-4GlcNAc It was confirmed that this was a highly reproducible experimental technique.
Then, by comparing the sugar chain binding profile created for the “mutant protein library” with the sugar chain array in this way with the sugar chain binding profile for the parent protein, the “mutant protein library” It can be seen whether or not there is a sufficient amount of the target mutant in the library, as well as what kind of sugar chain the mutant is suitable for obtaining. In other words, the “evolution potential” of the selected parent protein can be predicted.
本発明者らは、次にこの進化ポテンシャル法を用いて糖鎖ポリマー固定化ビーズでセレクション後の変異タンパク質ライブラリーの進化ポテンシャル評価を行った。EW29chの変異タンパク質ライブラリーからβGal-PAA(ポリアクリル酸の上にβGalが提示されている糖鎖ポリマー、Glycotech社製)もしくは[6’S]LN（[6S]Galβ1-4GlcNAcβ1）-PAA固定化マグネティックビーズを用いてリボソーム提示法を用いてセレクションを行った。βGal-PAA固定化マグネティックビーズで選択した場合には、非還元末端がガラクトースであるアシアロα1酸性糖タンパク質(Asialo-AGP)に結合する変異体が濃縮された一方で、[6’S]LN-PAA固定化マグネティックビーズで選択した場合には、２回目のセレクション後には[6’S]LN-PAAに結合する変異体が濃縮されていた。[6’S]LN-PAA固定化マグネティックビーズで２回セレクションしたライブラリーをシークエンスした結果、８クローン中５クローンは、２０番目のグルタミン酸（Ｅ）が塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）に置換されていた。本発明者らが以前に（EW29ch）を親タンパク質として創出に成功した[6’S]LN-PAAに結合する改変体も、２０番目のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）に置換された変異体であり（非特許文献５）、モデル実験である本実験結果で得られた変異体の配列自体は予想通りであった。この結果は、本発明のセレクション工程での糖鎖結合プロファイルによる評価方法により、セレクション後の変異遺伝子ライブラリーの進化ポテンシャル評価ができること、すなわちセレクション過程をモニタリングできることを示している。変異遺伝子ライブラリー全体の標的糖鎖への結合性を解析することで、標的糖鎖に結合する変異遺伝子がどの程度濃縮されているかがわかる。このことは、セレクション工程でも糖鎖結合プロファイルによりモニタリングを行えば、必要最小限のセレクション及び増幅工程サイクル数で反応を終了させることができることを示しており、「進化ポテンシャル法」がセレクション過程でも威力を発揮することが実証された。
これらの知見を得たことで本発明を完成するに至った。
Next, the present inventors evaluated the evolution potential of the mutant protein library after selection with the sugar chain polymer-immobilized beads using this evolution potential method. ΒGal-PAA (glycan polymer with βGal displayed on polyacrylic acid, Glycotech) or [6'S] LN ([6S] Galβ1-4GlcNAcβ1) -PAA-immobilized magnetic beads from EW29ch mutant protein library The selection was performed using the ribosome display method. When selected with βGal-PAA-immobilized magnetic beads, [6'S] LN-PAA immobilization was enriched while the non-reducing end bound to asialo α1 acidic glycoprotein (Asialo-AGP), which is galactose. In the case of selecting with activated magnetic beads, mutants that bind to [6 ′S] LN-PAA were concentrated after the second selection. As a result of sequencing a library selected twice with [6'S] LN-PAA-immobilized magnetic beads, 5 out of 8 clones showed lysine (K) or arginine (R) in which the 20th glutamic acid (E) is a basic amino acid. ). The 20 th glutamic acid (E) is replaced with lysine (K) or arginine (R) in the variant that binds to [6 ′S] LN-PAA that the present inventors have successfully created (EW29ch) as a parent protein. (Non-patent Document 5), and the sequence of the mutant obtained as a result of this experiment, which is a model experiment, was as expected. This result shows that the evolution potential of the mutant gene library after selection can be evaluated by the evaluation method based on the sugar chain binding profile in the selection step of the present invention, that is, the selection process can be monitored. By analyzing the binding properties of the entire mutant gene library to the target sugar chain, it can be seen how concentrated the mutant genes that bind to the target sugar chain are. This indicates that if the sugar chain binding profile is monitored in the selection process, the reaction can be completed with the minimum number of selection and amplification process cycles. The “evolution potential method” is also powerful in the selection process. It has been demonstrated that
Obtaining these findings led to the completion of the present invention.
即ち，本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕 標的分子を特異的に認識するプローブを創出するための方法であって、下記(１)〜(１０)を含む方法；
（１）少なくとも標的分子を含む分子群が固定化された分子アレイを用意する工程、
（２）選定した親タンパク質又は親核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ライブラリーを作製する工程、
（３）工程(２)で用いた親タンパク質又は親核酸と、作製されたランダム変異ライブラリーのそれぞれに対して、工程(１)で得られた分子アレイを反応させることにより、両者の分子結合プロファイルを作成する工程、
（４）工程(３)で得られた親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルと、同ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルとを比較解析する工程、
（５）ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い場合に、前記ランダム変異ライブラリーが、標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価する工程、
（６）工程(５)により、前記ランダム変異ライブラリーが標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価された場合に、前記ランダム変異ライブラリーを固定化された標的分子と反応させることにより、標的分子結合性の変異体群を選択する工程、
（７）工程(６)により選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成し、工程(３)で得られた前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析し、前者で観察される標的分子に対する反応性が、後者で観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、工程(６)の選択工程が有効であると判定する工程、
（８）工程(７)において、選択工程が有効であると判定された場合であって、かつ、分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他の分子に対する反応性と明確な有意差を持たない場合に、工程(６)で選択された標的分子結合性変異体群に対して、さらに工程(６)及び(７)の選択工程を繰り返す工程、
（９）工程(７)又は工程(８)により得られた標的分子結合性の変異体群に対して作成した分子結合プロファイルにおいて、観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他のいずれの分子に対する反応性と比較しても高い有意差を持つに至った場合に、選択工程サイクルの終了時と判定する工程、
（１０）工程(９)で得られた標的分子結合性の変異体群から、目的とする標的分子を特異的に認識するプローブを単離する工程。
〔２〕 標的分子を特異的に認識するプローブが、標的分子を特異的に認識するタンパク質であって、かつ工程(２)で作製したランダム変異ライブラリーが、選定した親タンパク質をコードする核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ＤＮＡライブラリーを、in vitroで転写、翻訳したリボソーム-mRNA-タンパク質複合体ライブラリーであることを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記標的分子を特異的に認識するプローブが、標的糖鎖を特異的に認識するレクチンタンパク質であって、前記分子アレイが糖鎖アレイであり、前記分子結合プロファイルが、糖鎖結合プロファイルであることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 標的分子を特異的に認識するプローブを創出するために作製したランダム変異ライブラリーに対して、標的分子結合性変異体の創出可能性を有するライブラリーであるか否かを評価、判定する方法であって、下記(１)〜(５)を含む方法；
（１）少なくとも標的分子を含む分子群が固定化された分子アレイを用意する工程、
（２）選定した親タンパク質又は親核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ライブラリーを作製する工程、
（３）親タンパク質又は親核酸と共に、ランダム変異ライブラリーに対して、工程(１)で得られた分子アレイを反応させることにより、それぞれの分子結合プロファイルを作成する工程、
（４）工程(３)で得られた親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルと、同ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルとを比較解析する工程、
（５）ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い場合に、前記ランダム変異ライブラリーが、標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価する工程。
〔５〕 標的分子を特異的に認識するプローブが、標的分子を特異的に認識するタンパク質であって、かつ工程(２)で作製したランダム変異ライブラリーが、選定した親タンパク質をコードする核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ＤＮＡライブラリーを、in vitroで転写、翻訳したリボソーム-mRNA-タンパク質複合体ライブラリーであることを特徴とする、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕 標的分子を特異的に認識するプローブを創出するための標的分子結合性変異体の選択サイクルに対する有効性を評価する方法であって、下記の(１)〜(３)を含む方法；
（１）ランダム変異ライブラリーから標的分子結合性変異体を濃縮する１もしくは複数回の工程において、固定化された標的分子を用いて標的分子結合性の変異体群を選択する１回目の工程の後に、当該選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成する工程、
（２）工程(１)で作成した分子結合プロファイルを、前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析する工程、
（３）標的分子結合性の変異体群で観察される標的分子に対する反応性が、ランダム変異ライブラリーで観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、工程(１)での固定化された標的分子を用いた選択サイクルが、標的分子を特異的に認識するプローブを創出するために有効であると判定する工程。
〔７〕 標的分子を特異的に認識するプローブを創出するための標的分子結合性変異体の選択サイクルの終了時を判定する方法であって、下記の(１)〜(４)を含む方法；
（１）ランダム変異ライブラリーから標的分子結合性変異体を濃縮する１もしくは複数回の工程において、前記ランダム変異ライブラリーを固定化された標的分子と反応させて、標的分子結合性の変異体群を選択する工程の後に、当該選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成し、前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析する工程、
（２）標的分子結合性の変異体群で観察される標的分子に対する反応性が、ランダム変異ライブラリーで観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、工程(１)での固定化された標的分子を用いた選択サイクルが、標的分子を特異的に認識するプローブを創出するために有効であると判定する工程、
（３）工程(２)において、選択サイクルが有効であると判定された場合であって、かつ、分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他の分子に対する反応性と明確な有意差を持たない場合に、工程(２)で選択された標的分子結合性変異体群に対して、さらに、工程(１)及び(２)の選択サイクルを繰り返す工程、
（４）工程(２)又は工程(３)により得られた標的分子結合性の変異体群に対して作成した分子結合プロファイルにおいて、観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他のいずれの分子に対する反応性と比較しても高い有意差を持つに至った場合に、選択サイクルの終了時であると判定する工程。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A method for creating a probe that specifically recognizes a target molecule, the method comprising the following (1) to (10):
(1) preparing a molecular array in which a molecular group including at least a target molecule is immobilized;
(2) creating a random mutation library in which random mutations are introduced into the selected parent protein or nucleic acid;
(3) By reacting the molecular array obtained in step (1) with each of the parental protein or nucleic acid used in step (2) and the prepared random mutation library, molecular binding between the two Creating a profile,
(4) a step of comparatively analyzing the molecular binding profile for the parent protein or nucleic acid obtained in step (3) and the molecular binding profile for the random mutation library;
(5) When the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile for the random mutation library is significantly higher than the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid, Evaluating the random mutation library as a population capable of creating target molecule-binding mutants;
(6) When the random mutation library is evaluated as a population capable of creating a target molecule-binding mutant in step (5), the random mutation library is reacted with the immobilized target molecule. By selecting a target molecule binding mutant group,
(7) A molecular binding profile of the target molecule-binding mutant group selected in step (6) is prepared, and compared with the molecular binding profile of the random mutation library obtained in step (3). A step of determining that the selection step of step (6) is effective when the reactivity to the target molecule observed in is significantly higher than the reactivity to the target molecule observed in the latter,
(8) In step (7), when it is determined that the selection step is effective, and the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile is the reactivity to other molecules on the molecular array If the target molecule-binding mutant group selected in step (6) has no clear significant difference, the step of repeating the selection steps of steps (6) and (7) is repeated.
(9) In the molecular binding profile created for the target molecule-binding mutant group obtained in step (7) or step (8), the observed reactivity to the target molecule is different from that on the molecular array. A step of determining the end of the selection process cycle when it has a significant difference compared to the reactivity to any molecule,
(10) A step of isolating a probe that specifically recognizes the target molecule of interest from the target molecule-binding mutant group obtained in step (9).
[2] The probe that specifically recognizes the target molecule is a protein that specifically recognizes the target molecule, and the random mutation library prepared in step (2) is a nucleic acid that encodes the selected parent protein. The method according to [1] above, wherein the random mutant DNA library into which the random mutation has been introduced is a ribosome-mRNA-protein complex library that has been transcribed and translated in vitro.
[3] The probe that specifically recognizes the target molecule is a lectin protein that specifically recognizes the target sugar chain, the molecular array is a sugar chain array, and the molecular binding profile is a sugar chain binding profile. The method according to [1] or [2] above, wherein
[4] Evaluate and determine whether or not a random mutation library created to create a probe that specifically recognizes a target molecule has the possibility of creating a target molecule-binding mutant. A method comprising the following (1) to (5):
(1) preparing a molecular array in which a molecular group including at least a target molecule is immobilized;
(2) creating a random mutation library in which random mutations are introduced into the selected parent protein or nucleic acid;
(3) A step of preparing each molecular binding profile by reacting the molecular array obtained in step (1) against a random mutation library together with the parent protein or the nucleic acid.
(4) a step of comparatively analyzing the molecular binding profile for the parent protein or nucleic acid obtained in step (3) and the molecular binding profile for the random mutation library;
(5) When the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile for the random mutation library is significantly higher than the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid, Evaluating the random mutation library as a population capable of creating a target molecule-binding mutant.
[5] The probe that specifically recognizes the target molecule is a protein that specifically recognizes the target molecule, and the random mutation library prepared in step (2) is a nucleic acid encoding the selected parent protein. The method according to [4] above, wherein the random mutant DNA library into which the random mutation has been introduced is a ribosome-mRNA-protein complex library that has been transcribed and translated in vitro.
[6] A method for evaluating the effectiveness of a target molecule-binding mutant for creating a probe that specifically recognizes a target molecule with respect to the selection cycle, the method comprising the following (1) to (3);
(1) In one or more steps of concentrating target molecule-binding mutants from a random mutation library, the first step of selecting a target molecule-binding mutant group using an immobilized target molecule A step of generating a molecular binding profile of the selected target molecule-binding mutant group,
(2) a step of comparing and analyzing the molecular binding profile created in step (1) with the molecular binding profile of the random mutation library;
(3) When the reactivity to the target molecule observed in the target molecule binding mutant group is significantly higher than the reactivity to the target molecule observed in the random mutation library, the step (1) Determining that the selection cycle with the immobilized target molecule in step is effective to create a probe that specifically recognizes the target molecule.
[7] A method for determining the end of a selection cycle of a target molecule-binding mutant for creating a probe that specifically recognizes a target molecule, comprising the following (1) to (4);
(1) A target molecule-binding mutant group by reacting the random mutation library with an immobilized target molecule in one or a plurality of steps of concentrating a target molecule-binding mutant from a random mutation library. A step of generating a molecular binding profile of the selected target molecule-binding mutant group after the step of selecting the molecular binding profile of the random mutation library,
(2) When the reactivity to the target molecule observed in the target molecule binding mutant group is significantly higher than the reactivity to the target molecule observed in the random mutation library, the step (1) Determining that the selection cycle with the immobilized target molecule at is effective to create a probe that specifically recognizes the target molecule;
(3) In step (2), when the selection cycle is determined to be effective, and the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile is the reactivity to other molecules on the molecular array And repeating the selection cycle of steps (1) and (2) for the target molecule-binding mutant group selected in step (2) when there is no clear significant difference between
(4) In the molecular binding profile created for the target molecule-binding mutant group obtained in step (2) or step (3), the observed reactivity to the target molecule is different from that on the molecular array. A step of determining that it is at the end of the selection cycle when it has a highly significant difference compared to the reactivity to any molecule.
本発明の標的リガンド固定化アレイを用いたランダム変異ライブラリーの「進化ポテンシャル」の評価方法により、親タンパク質または親核酸に対してランダム変異を導入して作製した「ランダム変異ライブラリー」が、標的とするリガンド結合能を有する変異体を濃縮できる可能性のある「ランダム変異ライブラリー」であるか否かを評価、判定することができるので、無駄な選択サイクル工程への移行を防ぐことができる。また、本発明における選択サイクル中の標的リガンド固定化アレイを用いたモニタリング方法により、選択サイクルがうまくいっているか否かをサイクルごとにチェックすることができ、無駄な選択サイクル回数を減らすことができる。特に本方法はリボソーム提示法を用いたセレクションに有効であり、セレクション過程で産生されるリボソーム-mRNA-タンパク質複合体の一部を用いて、迅速かつ簡便にランダム変異ライブラリーの評価を行うことができる。
例えば、標的リガンドが糖鎖の場合には、糖鎖アレイを用いた糖鎖結合プロファイルにより進化ポテンシャルを評価することができ、標的糖鎖に結合するプローブを効率的に創出することが可能となる。また同様に、標的リガンドが抗原である場合には抗原アレイを用いて抗原に結合するプローブ、化合物である場合には化合物アレイを用いて化合物に結合するプローブを効率的に創出することが可能となる。
本発明の「進化ポテンシャル法」を利用することで、各種疾患の診断や幹細胞評価のための検出試薬だけでなく、目的とする分子や細胞を標的とした医薬品の開発にも応用できる。
A “random mutation library” prepared by introducing a random mutation into a parent protein or parent nucleic acid by the method of evaluating the “evolution potential” of a random mutation library using the target ligand-immobilized array of the present invention Since it is possible to evaluate and determine whether it is a “random mutation library” that can concentrate the mutants having ligand binding ability, it is possible to prevent the transition to useless selection cycle process . In addition, the monitoring method using the target ligand-immobilized array during the selection cycle in the present invention can check whether the selection cycle is successful or not, and can reduce the number of useless selection cycles. . This method is particularly effective for selection using the ribosome display method, and it is possible to evaluate a random mutation library quickly and easily using a part of the ribosome-mRNA-protein complex produced in the selection process. it can.
For example, when the target ligand is a sugar chain, the evolution potential can be evaluated by a sugar chain binding profile using a sugar chain array, and a probe that binds to the target sugar chain can be efficiently created. . Similarly, when the target ligand is an antigen, it is possible to efficiently create a probe that binds to the antigen using an antigen array, and when it is a compound, a probe that binds to the compound can be efficiently generated using the compound array. Become.
By utilizing the “evolution potential method” of the present invention, it can be applied not only to detection reagents for diagnosis of various diseases and evaluation of stem cells, but also to the development of drugs targeting target molecules and cells.
１．本発明の進化ポテンシャル法について
本発明において「進化ポテンシャル」法というとき、ランダム変異導入後のランダム変異ライブラリー（「変異遺伝子-タンパク質複合体ライブラリー」、「変異遺伝子ライブラリー」または「変異タンパク質ライブラリー」などともいう。）に対する「進化ポテンシャル」の評価方法、及び当該ランダム変異ライブラリーを用いて標的分子を濃縮し単離するための選択サイクルにおけるモニタリング方法のいずれをも指す。つまり、本発明で「進化ポテンシャル」すなわち「進化指向性」とは、目的とする標的分子特異的結合性を獲得したタンパク質または核酸（両者をあわせて、「特異的認識プローブ」ともいう。）に進化する可能性の高さを指す用語である。
1. About the Evolution Potential Method of the Present Invention In the present invention, the “evolution potential” method refers to a random mutation library (“mutant gene-protein complex library”, “mutant gene library” or “mutant protein live” after random mutation introduction). It also refers to both the evaluation method of “evolution potential” for the “lary” and the like, and the monitoring method in the selection cycle for concentrating and isolating the target molecule using the random mutation library. That is, in the present invention, “evolution potential”, that is, “evolution directivity” refers to a protein or nucleic acid that has acquired the target molecule-specific binding property (also referred to as “specific recognition probe”). It is a term that refers to the high possibility of evolution.
（１）ランダム変異ライブラリーに対する「進化ポテンシャル」の評価方法
（１−１）「ランダム変異ライブラリー」とその「進化ポテンシャル」について
本発明のランダム変異ライブラリーに対する、標的リガンドアレイを用いた「進化ポテンシャル」の評価方法により、親タンパク質に対してランダムに変異を導入して作製した「ランダム変異ライブラリー」が、増幅工程を含む濃縮サイクルを経ることなく、標的とするリガンド結合性の変異体を創出できる可能性のある集団であるか否か、という「ランダム変異ライブラリー」自体が有する「進化ポテンシャル」を評価することができる。つまり、下記(２)で述べる進化工学的な「選択サイクル」に入る前に、ランダムな変異を導入する親タンパク質として選択したポリペプチドの種類及びその長さが適切であったか否かを評価、判定することができるので、無駄な選択サイクル工程を省くことができる。なお、「親タンパク質に対してランダムに変異を導入する」というとき、典型的には全長の親タンパク質全体にランダムな変異が導入される場合を指すが、全長のタンパク質の１部領域をランダム変異導入領域としてランダム変異を導入した場合も含まれる。ランダム変異が導入される場合には、一般的に1kbpあたり1-16bp程度の変異導入を行う。
標的リガンドアレイの典型的な例として、本発明者らの開発した糖鎖アレイがあげられる（非特許文献６）。当該糖鎖アレイを用いて、親タンパク質とランダム変異ライブラリーそれぞれの「糖鎖結合プロファイル」を作製でき、両者を比較解析することで、ランダム変異ライブラリーの「進化ポテンシャル」を評価することができる。ランダム変異ライブラリー中に、標的とする糖鎖リガンドが検出限界以上に存在していることをまず確認してから、当該ランダム変異ライブラリーを用いた選択サイクルに移行する。
(1) “Evolution Potential” Evaluation Method for Random Mutation Library (1-1) “Random Mutation Library” and its “Evolution Potential” “Evolution Using Target Ligand Array for Random Mutation Library of the Present Invention A “random mutation library” created by randomly introducing mutations into the parent protein using the “potential” evaluation method allows the target ligand-binding mutants to be obtained without going through an enrichment cycle including an amplification step. It is possible to evaluate the “evolution potential” of the “random mutation library” itself, which is whether it is a group that can be created. In other words, before entering the evolutionary engineering “selection cycle” described in (2) below, the type and length of the polypeptide selected as the parent protein into which random mutations were introduced were evaluated and determined. Therefore, a useless selection cycle process can be omitted. In addition, “random mutation is introduced into the parent protein” typically refers to the case where a random mutation is introduced into the entire full length parent protein, but a partial mutation of the full length protein is randomized. The case where a random mutation is introduced as the introduction region is also included. When a random mutation is introduced, generally a mutation of about 1-16 bp per 1 kbp is performed.
A typical example of the target ligand array is a sugar chain array developed by the present inventors (Non-patent Document 6). Using this glycan array, it is possible to create a “glycan binding profile” for each of the parent protein and the random mutation library. By comparing and analyzing both, the “evolution potential” of the random mutation library can be evaluated. . After first confirming that the target sugar chain ligand is present in the random mutation library above the detection limit, the process shifts to a selection cycle using the random mutation library.
標的リガンドアレイとして、種々の抗原タンパク質（ペプチド）が固定化された抗原タンパク質（ペプチド）アレイを用い、親タンパク質として特定の抗体の可変領域などを選定し、当該親タンパク質と、例えばそのCDR3領域をランダム化したランダム変異ライブラリーとの「エピトープ結合プロファイル」を比較解析すれば、標的抗原に対して特異的に結合するタンパク質への進化ポテンシャルを評価することが可能である。標的抗原に限らずどのようなタンパク質（ペプチド）を標的分子としても、その「分子結合プロファイル」の比較解析により進化ポテンシャルを評価できる点は同様である。その際、親タンパク質に代えて、親核酸を用い、対象となる核酸配列に直接ランダム変異導入した場合には、標的分子に対して特異的に結合する変異型核酸が目的分子となるが、その場合にも親核酸とランダム変異核酸ライブラリーとの「分子結合プロファイル」の比較解析により、同様に、選択した親核酸の進化ポテンシャルが評価できる。
さらに、各種化合物が固定化された化合物アレイを用いれば、化合物に結合するタンパク質や核酸等の進化ポテンシャル評価に用いることができる。
以上のように、本発明の「進化ポテンシャル法」は、標的分子も、アレイ表面上の分子も、進化工学的手法が適用できさえすればどのような分子であっても対象とすることができる。
As a target ligand array, an antigen protein (peptide) array on which various antigen proteins (peptides) are immobilized is selected, and a variable region of a specific antibody is selected as a parent protein, and the parent protein and, for example, its CDR3 region are selected. By analyzing the “epitope binding profile” with a randomized random mutation library, it is possible to evaluate the evolution potential to a protein that specifically binds to the target antigen. The same is true in that the evolution potential can be evaluated by comparative analysis of the “molecular binding profile” of any protein (peptide) as well as the target antigen. At that time, when the parent nucleic acid is used in place of the parent protein and random mutation is directly introduced into the target nucleic acid sequence, the mutant nucleic acid that specifically binds to the target molecule becomes the target molecule. In some cases, the evolutionary potential of the selected parental nucleic acid can be similarly evaluated by comparative analysis of the “molecular binding profile” between the parental nucleic acid and the random mutant nucleic acid library.
Furthermore, if a compound array in which various compounds are immobilized is used, it can be used for evaluating the evolution potential of proteins, nucleic acids and the like that bind to the compounds.
As described above, the “evolution potential method” of the present invention can be used for target molecules and molecules on the surface of the array as long as evolution engineering techniques can be applied. .
本発明におけるランダム変異ライブラリーの標的分子結合性プローブの創出可能性に対する「進化ポテンシャル」を評価判定する方法を、手順を追って示すと以下のようになる。
（１）少なくとも標的分子を含む分子群が固定化された分子アレイを用意する工程。
ここで、固定化される分子群は、糖鎖、抗原性ペプチド、抗体、低分子化合物など種々の種類であり、少なくとも標的分子を含み、親タンパク質又は親核酸が結合する分子を含むことが好ましい。標的分子と類似した分子を含むとさらに好ましいため、固定化される分子群の種類は、通常３種類以上、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは５０〜１００種類程度であり、市販の糖鎖アレイ、DNAアレイ、抗原アレイ、化合物アレイ、細胞アレイ、組織アレイなどを適宜用いることができる。
（２）選定した親タンパク質又は親核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ライブラリーを作製する工程。
ここで、目的の標的分子結合性プローブがタンパク質である場合は、親タンパク質をコードする核酸に対してランダム変異が導入され、かつ当該親タンパク質と関連づけられたランダム変異ライブラリーである必要がある。例えば、選定した親タンパク質をコードする核酸にランダム変異が導入されたランダム変異遺伝子ライブラリーを、in vitroで転写、翻訳することで作製された「リボソーム-mRNA-タンパク質複合体」群からなるランダム変異ライブラリーを指す。また、ファージ提示法や細胞提示法の場合には、変異遺伝子が導入された細胞ライブラリーを示す。
（３）親タンパク質又は親核酸と共に、ランダム変異ライブラリーに対して、工程(１)で得られた分子アレイを反応させることにより、それぞれの分子結合プロファイルを作成する工程。
例えば、親タンパク質が特定のレクチンであって、当該レクチンを改変して、新たな標的となる糖鎖結合性レクチン改変体を作製しようという場合は、この工程において、親レクチンとランダム変異ライブラリーそれぞれを糖鎖アレイに反応させて、両者の糖鎖分子結合プロファイルを作成することになるが、その際には、上記「リボソーム-mRNA-タンパク質複合体」群からなるランダム変異ライブラリーを作製する際に、あらかじめタンパク質に例えばFLAGタグを結合しておき、FLAGタグに対する抗体と、それに対する２次抗体などを作用させて蛍光ラベル化する。そのような、蛍光ラベル化された親レクチン及び蛍光ラベル化ランダム変異ライブラリーのそれぞれをアレイ表面に作用させて、その結合をエバネッセント波蛍光スキャナー等で検出することにより、簡単に両者の「糖鎖分子結合プロファイル」が作成できる。
（４）工程（３）で得られた親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルと、同ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルとを比較解析する工程。
例えば、糖鎖結合性レクチン改変体を作製しようという場合には、蛍光ラベル化された親レクチン及び蛍光ラベル化ランダム変異ライブラリーそれぞれの「糖鎖分子結合プロファイル」を比較検討する。
（５）ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い場合に、前記ランダム変異ライブラリーが、標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価する工程。
この工程では、当該親タンパク質又は親核酸から上記工程(２)で作製したランダム変異ライブラリーをそのまま用いて、標的分子結合性改変タンパク質又は核酸の選択サイクルに移行させた場合に、効率よく望みの標的分子結合性改変タンパク質又は核酸を取得できる可能性があるかを判断する工程であるから、ここで、「親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い」、というときの「有意差」とは、次の選択サイクルで効率よく濃縮できると確信できる程度の有意差であり、例えばt検定などを用いて統計学的に決定する。
The method for evaluating and judging the “evolution potential” for the possibility of creating a target molecule-binding probe of a random mutation library in the present invention is as follows.
(1) A step of preparing a molecular array in which a molecular group including at least a target molecule is immobilized.
Here, the group of molecules to be immobilized is of various types such as sugar chains, antigenic peptides, antibodies, low molecular compounds, and preferably includes at least a target molecule and a molecule to which a parent protein or parent nucleic acid binds. . Since it is more preferable to include a molecule similar to the target molecule, the number of types of molecules to be immobilized is usually 3 or more, more preferably 10 or more, and even more preferably about 50 to 100, and commercially available sugar chains. Arrays, DNA arrays, antigen arrays, compound arrays, cell arrays, tissue arrays and the like can be used as appropriate.
(2) A step of preparing a random mutation library in which random mutations are introduced into the selected parent protein or parent nucleic acid.
Here, when the target target molecule-binding probe is a protein, it is necessary to be a random mutation library in which random mutations are introduced into the nucleic acid encoding the parent protein and associated with the parent protein. For example, a random mutation consisting of a group of “ribosome-mRNA-protein complexes” created by in vitro transcription and translation of a random mutation gene library in which random mutations are introduced into the nucleic acid encoding the selected parent protein. Points to the library. In the case of the phage display method and the cell display method, a cell library into which a mutated gene has been introduced is shown.
(3) A step of preparing each molecular binding profile by reacting the molecular array obtained in step (1) with a random mutation library together with a parent protein or a parent nucleic acid.
For example, when the parent protein is a specific lectin and the lectin is to be modified to produce a sugar chain-binding lectin variant as a new target, in this step, each of the parent lectin and the random mutation library Will react with the glycan array to create a glycan molecule binding profile for both. In this case, when creating a random mutation library consisting of the above-mentioned “ribosome-mRNA-protein complex” group In addition, for example, a FLAG tag is bound to the protein in advance, and an antibody against the FLAG tag and a secondary antibody against the antibody are allowed to act on the protein for fluorescent labeling. By allowing each of the fluorescence-labeled parent lectin and the fluorescence-labeled random mutation library to act on the surface of the array and detecting the binding with an evanescent wave fluorescence scanner or the like, both “sugar chains” can be easily obtained. Molecular binding profiles can be created.
(4) A step of comparatively analyzing the molecular binding profile for the parent protein or nucleic acid obtained in step (3) and the molecular binding profile for the random mutation library.
For example, when preparing a sugar chain-binding lectin variant, the “sugar chain molecule binding profiles” of the fluorescently labeled parent lectin and the fluorescence labeled random mutation library are compared and examined.
(5) When the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile for the random mutation library is significantly higher than the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid, Evaluating the random mutation library as a population capable of creating a target molecule-binding mutant.
In this step, when the random mutation library prepared in the above step (2) is used as it is from the parent protein or parent nucleic acid as it is and transferred to the selection cycle of the target molecule binding modified protein or nucleic acid, it is efficiently desired. Since it is a process to determine whether the target molecule-binding modified protein or nucleic acid can be obtained, the expression “there is a significant difference from the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid”. The “significant difference” when it is “high” is a significant difference that can be confident that it can be efficiently concentrated in the next selection cycle, and is determined statistically using, for example, a t-test.
（１−２）ランダム変異ライブラリーの作製方法
進化工学的に核酸（遺伝子）に対してランダムな変異を導入する方法としては、DNAポリメラーゼにエラーを起こさせることにより遺伝子のランダムな位置に核酸置換を導入するエラープローンPCR法などのランダム変異導入法の他、キメラ遺伝子を作製するための技術であるリコンビネーション法（DNAシャッフリング法）、遺伝子中の特定の塩基に集中的にランダム変異を導入する標的化ランダム変異導入法などが知られており、本発明ではいずれのタイプのランダム変異遺伝子ライブラリーも対象となる。
また、標的分子に特異的に結合するタンパク質（ペプチド）を取得する場合には、当該タンパク質（ペプチド）をコードする核酸（遺伝子）に対して、エラープローンPCR法などでランダムに変異を導入した後に、タンパク質（ペプチド）と核酸（遺伝子）とを関連づける。そのような両者を関連づける手法としては、ファージ提示法、酵母表層提示法、バクテリア表層提示法、フラジェリン提示法、リボソーム提示法、mRNA提示法、in vitroコンパートメンタリゼーション法などが広く知られており、いずれの方法であってもよいが、タンパク質−遺伝子複合体のランダム変異ライブラリーを形成させる。
なお、標的分子に対する特異的な結合活性を有する分子として核酸アプタマーを選択した場合には、上記ランダム変異遺伝子ライブラリーを、そのまま、上記各種の標的リガンドアレイに適用し、親遺伝子との分子結合プロファイルの比較解析を行えばよい。
本発明の実施態様では、標的糖鎖に特異的に結合するタンパク質を得るためのモデル親タンパク質としてミミズ由来レクチンEW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29ch）を選択し、EW29chをコードする遺伝子に対してエラー導入PCR/リボソーム提示法（非特許文献４）によりランダム変異を導入し、リボソーム-mRNA-タンパク質複合体で形成される「変異ライブラリー」を作製した。
具体的には、鋳型となる野生型のEW29ch遺伝子を含むプラスミドを用い、矢部らの方法（非特許文献４）に従い、エラー導入PCRによりランダム変異を導入したEW29chの全コード領域、及びアンカーの繊維状ファージ由来の遺伝子GeneIII部分を増幅し、両者をオーバーラップPCRで融合する。このPCR産物の精製物をin vitro転写、in vitro翻訳して、得られたリボソーム-mRNA-タンパク質複合体からなる「ランダム変異ライブラリー」を作製した。
(1-2) Random mutation library preparation method As a method of introducing random mutations into nucleic acids (genes) by evolutionary engineering, nucleic acid substitution at random positions of genes by causing an error in DNA polymerase. In addition to random mutagenesis methods such as error-prone PCR, which introduces DNA, the recombination method (DNA shuffling method), which is a technology for producing chimeric genes, introduces random mutations intensively at specific bases in the gene. Targeted random mutagenesis methods are known, and any type of random mutant gene library is targeted in the present invention.
In addition, when obtaining a protein (peptide) that specifically binds to a target molecule, after introducing random mutations into the nucleic acid (gene) encoding the protein (peptide) by error-prone PCR or the like Associate a protein (peptide) with a nucleic acid (gene). As a method for associating such both, phage display method, yeast surface display method, bacterial surface display method, flagellin display method, ribosome display method, mRNA display method, in vitro compartmentalization method, etc. are widely known, Any method may be used to form a random mutation library of protein-gene complexes.
When a nucleic acid aptamer is selected as a molecule having specific binding activity for the target molecule, the random mutant gene library is applied as it is to the various target ligand arrays, and the molecular binding profile with the parent gene. The comparative analysis may be performed.
In an embodiment of the present invention, the C-terminal functional domain (EW29ch) of earthworm-derived lectin EW29 is selected as a model parent protein for obtaining a protein that specifically binds to the target sugar chain, and the gene encoding EW29ch is selected. Random mutations were introduced by an error-introducing PCR / ribosome display method (Non-patent Document 4) to prepare a “mutation library” formed by a ribosome-mRNA-protein complex.
Specifically, using a plasmid containing a wild-type EW29ch gene as a template, according to the method of Yabe et al. (Non-patent Document 4), all EW29ch coding regions into which random mutations have been introduced by error-introducing PCR, and anchor fibers Gene Gene III derived from filamentous phage is amplified, and both are fused by overlap PCR. This PCR product was in vitro transcribed and translated in vitro to create a “random mutation library” consisting of the resulting ribosome-mRNA-protein complex.
（１−３）「分子結合プロファイル」の作製法及び比較解析方法
本発明の親タンパク質と変異ライブラリーの進化ポテンシャル評価法においては、両者それぞれの「分子結合プロファイル」を作成し、かつ両者を比較解析する工程を含む。
「分子結合プロファイル」は、親分子（親タンパク質）に対する「分子結合プロファイル」と、親分子に対してエラープローンPCRなどでランダム変異を導入した変異体分子群である「ランダム変異ライブラリー」に対する「分子結合プロファイル」とを比較解析する必要があるため、少なくとも、ランダム変異ライブラリーと共に、親分子（親タンパク質）との結合活性を有する分子を含む各種分子群が固定化されたアレイをあらかじめ作製しておく必要がある。特定の標的分子への結合活性のあるタンパク質を取得しようというのであれば、当然のことながら、当該標的分子がアレイ上に含まれていることは必須である。その上で、親分子（親タンパク質）及び「ランダム変異ライブラリー」それぞれを、タグに対する蛍光ラベル化抗体などを作用させて蛍光ラベル化した後に、アレイ表面に作用させて、その結合を蛍光スキャナー等で検出することにより、それぞれの「分子結合プロファイル」を作製する。
本発明の実施態様においては、特定の糖鎖（６硫酸ガラクトース）に特異的な結合活性を有するタンパク質を創出する場合をモデルケースとして用い、「分子結合プロファイル」として、多数の複合糖鎖を基板上に固定化した糖鎖アレイを用いた。そして、親タンパク質のEW29ch及び「ランダム変異ライブラリー」を、それぞれEW29chのＮ末端側に配置したFLAGタグに対する１次抗体と、蛍光ラベル化２次抗体と共に「糖鎖アレイ」に供して２０℃で一晩反応させ、洗浄後に、エバネッセント型スキャナーで「糖鎖アレイ」上の各糖鎖に対応して観察される蛍光強度をノーマライズした値を、各糖鎖に対する結合パターンとして表示した「糖鎖結合プロファイル」を各々について作製し、両者を比較した（図３）。
本実施例では、「ランダム変異ライブラリー」を同じ手順で３回作製し、それぞれに対する「糖鎖結合プロファイル」も同時に比較したが、３回作製した「ランダム変異ライブラリー」の「糖鎖結合プロファイル」それぞれが、親タンパク質の「糖鎖結合プロファイル」とは明瞭な差異があるのに対して、３回の「ランダム変異ライブラリー」同士ではほとんど差異が生じなかった。このことから、当該実験の再現性が極めて良好であり、対象とする親タンパク質由来の「ランダム変異ライブラリー」に対する進化ポテンシャルの評価法として優れた手法であることが実証された。
(1-3) “Molecular Binding Profile” Production Method and Comparative Analysis Method In the parent protein and the mutation library evolution potential evaluation method of the present invention, both “molecular binding profiles” are prepared and compared. Including the step of analyzing.
“Molecular binding profile” includes “molecular binding profile” for the parent molecule (parent protein) and “random mutation library” that is a group of mutant molecules in which random mutations are introduced into the parent molecule by error-prone PCR or the like. Since it is necessary to conduct comparative analysis with the molecular binding profile, at least a random mutation library and an array in which various molecular groups including molecules having binding activity with the parent molecule (parent protein) are immobilized are prepared in advance. It is necessary to keep. If it is intended to obtain a protein having binding activity to a specific target molecule, it is essential that the target molecule is included on the array. After that, each parent molecule (parent protein) and “random mutation library” are fluorescently labeled with a fluorescently labeled antibody against the tag and then applied to the surface of the array to bind the binding to a fluorescent scanner, etc. Each “molecular binding profile” is created by detecting the above.
In an embodiment of the present invention, a case where a protein having a specific binding activity for a specific sugar chain (galactose hexasulfate) is used as a model case, and a large number of complex sugar chains are used as a substrate as a “molecular binding profile”. The sugar chain array immobilized above was used. The parent protein EW29ch and the “random mutation library” were each subjected to a “glycan array” together with a primary antibody against the FLAG tag arranged on the N-terminal side of EW29ch and a fluorescently labeled secondary antibody at 20 ° C. After reacting overnight, after washing, the value obtained by normalizing the fluorescence intensity observed corresponding to each sugar chain on the "sugar chain array" with an evanescent scanner was displayed as a binding pattern for each sugar chain. A “profile” was prepared for each and compared (FIG. 3).
In this example, a “random mutation library” was prepared three times in the same procedure, and the “glycan binding profiles” for each were also compared at the same time, but the “sugar chain binding profile” of the “random mutation library” prepared three times was also compared. “There was a clear difference from the“ glycan binding profile ”of the parent protein, whereas there was little difference between the three“ random mutation libraries ”. From this, the reproducibility of the experiment was extremely good, and it was proved to be an excellent method for evaluating the evolution potential for the “random mutation library” derived from the target parent protein.
（２）ランダム変異ライブラリーを用いた選択サイクルにおけるモニタリング方法
（２−１）ランダム変異ライブラリーを用いたモニタリング方法
本発明では、リボソーム提示法などにおける選択サイクルを繰り返す過程で、１回の選択サイクル終了ごとに標的分子を含むアレイを用いて分子結合プロファイルを作製し、親タンパク質の分子結合プロファイル、または１つ前の回の選択サイクルの分子結合プロファイルと比較解析する。この分子結合プロファイルの比較解析により、１回の選択サイクルによって標的分子結合性分子群がどれほど増加しているか、また、これ以上選択サイクルを回さなくても配列決定または構造決定するに充分な量の分子が取得できる状態になっているのかを判断することが可能となる。従来の一般的なモニタリング手法であっても、標的分子が１種類に定まっていれば、当該標的分子と元のリガンドに対しての結合をELISA法などで解析することで選択過程をモニタリングすることができる。しかし、この場合には１種類の標的分子に対する結合を確認することはできるものの、他の分子への結合性を決定することができないために、仮に標的分子結合性が高いという結果を得ても、ノイズとなる標的分子類似体への結合性が不明であるから、選択サイクル終了時期を決定することが難しい。また、含まれる変異体全体が示す特異性変化の傾向を評価することもできない。更に、この従来法では、各クローンを発現ベクターに導入して発現させ、得られた産物の結合性を解析することになるため、アッセイに時間がかかる点が大きな問題である。一方、本発明の方法では、例えば、リボソーム提示法の場合、セレクション過程で得られるリボソーム-mRNA-タンパク質複合体を用いて迅速且つ簡便にライブラリーの評価を行うことができる。また、リボソーム提示法を用いた場合の従来のモニタリング方法として、逆転写PCR産物量を指標に選択過程をモニタリングする手法が用いられることがある。これに関しても選択サイクル終了時期を決定できない点は同様であり、変異体全体の特異性の把握にも適さない。
すなわち、本発明のモニタリング方法により、選択サイクルにおける各工程がうまくいっているかどうかと共に、選択サイクルの終了時期を決定することができる。
標的分子に対する特異的な結合活性を有する分子として核酸を選択した場合にも、上記タンパク質と同様に、評価後のランダム変異遺伝子ライブラリーを用いて、標的分子を固定化したELISAプレート、セファロースビーズや磁気ビーズなどによる選択サイクルごとに適用すればよい。
(2) Monitoring Method in Selection Cycle Using Random Mutation Library (2-1) Monitoring Method Using Random Mutation Library In the present invention, in the process of repeating the selection cycle in the ribosome display method, etc., one selection cycle A molecular binding profile is generated using an array containing target molecules at each end and compared with the molecular binding profile of the parent protein or the molecular binding profile of the previous selection cycle. This comparative analysis of molecular binding profiles shows how much the target molecule-binding molecule group is increased by one selection cycle, and an amount sufficient for sequencing or structure determination without further selection cycles. It is possible to determine whether or not the molecule can be acquired. Even if it is a conventional general monitoring method, if the target molecule is determined to be one type, the selection process can be monitored by analyzing the binding of the target molecule to the original ligand using the ELISA method. Can do. However, in this case, although binding to one type of target molecule can be confirmed, since binding to other molecules cannot be determined, even if the result of high target molecule binding is obtained. Since the binding to the target molecule analog that causes noise is unknown, it is difficult to determine the end time of the selection cycle. In addition, it is not possible to evaluate the tendency of the change in specificity exhibited by the entire mutant contained. Furthermore, in this conventional method, each clone is introduced into an expression vector to be expressed, and the binding property of the obtained product is analyzed, so that it takes a long time for the assay. On the other hand, in the method of the present invention, for example, in the case of the ribosome display method, the library can be evaluated quickly and easily using the ribosome-mRNA-protein complex obtained in the selection process. In addition, as a conventional monitoring method using the ribosome display method, a method of monitoring the selection process using the amount of reverse transcription PCR product as an index may be used. In this respect as well, the point that the selection cycle end time cannot be determined is the same, and it is not suitable for grasping the specificity of the whole mutant.
That is, according to the monitoring method of the present invention, it is possible to determine the end time of the selection cycle as well as whether each step in the selection cycle is successful.
Even when a nucleic acid is selected as a molecule having specific binding activity to a target molecule, as in the case of the above protein, an ELISA plate, a sepharose bead, What is necessary is just to apply for every selection cycle by a magnetic bead.
本発明における標的分子結合性プローブを得るための選択サイクルの有効性を評価する方法を手順を追って示すと以下のようになる。
（１）ランダム変異ライブラリーから標的分子結合性変異体を濃縮する１もしくは複数回の工程において、固定化された標的分子による１回目の、標的分子結合性の変異体群を選択する工程の後に、当該選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成し、前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析する工程。
例えば、糖鎖結合性レクチン改変体を作製しようという場合は、親レクチンをコードする核酸にランダム変異が導入されたランダム変異遺伝子ライブラリーを、in vitroで転写、翻訳することで作製された「リボソーム-mRNA-レクチン複合体」群からなるランダム変異ライブラリーを糖鎖アレイに作用させ、蛍光スキャナー等で解析して糖鎖分子結合プロファイルを作成する。同様に当該ランダム変異ライブラリーをビーズなどの表面に固定化された標的糖鎖分子に反応させた後に、ビーズなどを洗浄し、50mM EDTA含有リン酸緩衝液により溶出させた溶出液を同一の糖鎖アレイに作用させて同様に作成した糖鎖分子結合プロファイルを比較すればよい。
なお、「１もしくは複数回の工程」とは、１回の選択工程のみで、通常のタンパク質又は核酸の精製方法を適用すれば充分に望みの標的分子結合性プローブが取得可能である場合であって、さらなる選択工程を行わない場合を包含する。
（２）標的分子結合性の変異体群で観察される標的分子に対する反応性が、ランダム変異ライブラリーで観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、選択サイクルが有効であると判定する工程。
この工程では、当該ランダム変異ライブラリーから、標的分子結合性プローブを濃縮するために用いた標的糖鎖分子を固定化したビーズなどが、望みの標的分子結合性改変タンパク質又は核酸を効率よく採取するためのツールとして有効か否かを判定する工程であるから、ここで、「有意差を持って高い」、というときの「有意差」とは、次の選択サイクルで効率よく濃縮できると確信できる程度の有意差であり、例えばp値が0.01未満を有意差とするなど統計学的に判断する。
A method for evaluating the effectiveness of a selection cycle for obtaining a target molecule-binding probe in the present invention is shown as follows.
(1) After the step of selecting a target molecule-binding mutant group for the first time by the immobilized target molecule in one or a plurality of steps of concentrating the target molecule-binding mutant from the random mutation library. A step of creating a molecular binding profile of the selected target molecule-binding mutant group and comparing it with the molecular binding profile of the random mutation library.
For example, in the case of preparing a sugar chain-binding lectin variant, a “ribosome” prepared by in vitro transcription and translation of a random mutant gene library in which random mutations are introduced into the nucleic acid encoding the parent lectin. A random mutation library consisting of “-mRNA-lectin complex” group is allowed to act on a sugar chain array and analyzed by a fluorescence scanner or the like to create a sugar chain molecule binding profile. Similarly, after reacting the random mutation library with a target sugar chain molecule immobilized on the surface of a bead or the like, the bead is washed, and the eluate eluted with a phosphate buffer containing 50 mM EDTA is used as the same sugar chain. What is necessary is just to compare the sugar chain molecule | numerator binding profile produced similarly by making it act on a chain | strand array.
“One or more steps” refers to the case where a desired target molecule-binding probe can be obtained sufficiently by applying a normal protein or nucleic acid purification method in only one selection step. And the case where no further selection step is performed.
(2) The selection cycle is effective when the reactivity to the target molecule observed in the target molecule-binding mutant group is significantly higher than the reactivity to the target molecule observed in the random mutation library. The process of determining that it is.
In this step, the target sugar-binding molecule used for concentrating the target molecule-binding probe is efficiently collected from the random mutation library in the desired target molecule-binding modified protein or nucleic acid. Because it is a process that determines whether or not it is effective as a tool for the purpose, here, “significant difference” when “high with significant difference” can be confident that it can be efficiently concentrated in the next selection cycle It is a significant difference in degree, for example, a statistical judgment is made such that the p value is less than 0.01.
また、本発明における標的分子結合性プローブを得るための選択サイクルの終了時を判定する方法を手順を追って示すと以下のようになる。
（１）ランダム変異ライブラリーから標的分子結合性変異体を濃縮する１もしくは複数回の工程において、前記ランダム変異ライブラリーを固定化された標的分子と反応させて、標的分子結合性の変異体群を選択する工程の後に、当該選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成し、前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析する工程。
例えば、糖鎖結合性レクチン改変体を作製しようという場合は、「リボソーム-mRNA-レクチン複合体」群からなるランダム変異ライブラリー、及び当該ランダム変異ライブラリーをビーズなどの表面に固定化された標的糖鎖分子に反応させた後に、ビーズなどを洗浄し、50mM EDTA含有リン酸緩衝液により溶出させた溶出液のそれぞれを糖鎖アレイに作用させ、蛍光スキャナー等で解析して作成した、両者の糖鎖分子結合プロファイルを比較解析する。
（２）標的分子結合性の変異体群で観察される標的分子に対する反応性が、ランダム変異ライブラリーで観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、選択サイクルが有効であると判定する工程。
この工程では、当該ランダム変異ライブラリーから、標的分子結合性プローブを濃縮するための選択工程の有効性を判定する必要、とりわけ工程(１)の選択工程で用いた標的分子を固定化したビーズなどが、望みの標的分子結合性改変タンパク質又は核酸を効率よく採取するためのツールとして有効か否かを判定する必要があるから、ここで、「有意差を持って高い」、というときの「有意差」とは、次の選択サイクルで効率よく濃縮できると確信できる程度の有意差であり、例えばｔ検定などを用いて統計学的に判断する。
（３）工程(２)において、選択サイクルが有効であると判定された場合であって、かつ、分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他の分子に対する反応性と明確な有意差を持たない場合に、工程(２)で選択された標的分子結合性変異体群に対して、さらに、工程(１)及び(２)の選択サイクルを繰り返す工程。
（４）工程(２)又は工程(３)により得られた標的分子結合性の変異体群に対して作成した分子結合プロファイルにおいて、観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他のいずれの分子に対する反応性と比較しても高い有意差を持つに至った場合に、選択サイクルの終了時であると判定する工程。
ここで、「高い有意差を持つ」というとき、さらに選択サイクルを繰り返さなくても、得られた固定化標的分子と結合している変異体群を溶出させた溶出液に通常のタンパク質又は核酸の精製技術を適用しさえすれば充分に単離精製可能な状態であると判定可能な程度の「有意差」であって、例えばｔ検定などを用いることで統計学的に判断することができる。
例えば、糖鎖結合性レクチン改変体を作製しようという場合にも、ｔ検定などの統計学的方法が有効である。
Further, the method for determining the end of the selection cycle for obtaining the target molecule-binding probe in the present invention is shown as follows.
(1) A target molecule-binding mutant group by reacting the random mutation library with an immobilized target molecule in one or a plurality of steps of concentrating a target molecule-binding mutant from a random mutation library. After the step of selecting, a step of creating a molecular binding profile of the selected target molecule-binding mutant group and comparing and analyzing it with the molecular binding profile of the random mutation library.
For example, when creating a sugar chain-binding lectin variant, a random mutation library consisting of a group of “ribosome-mRNA-lectin complex” and a target in which the random mutation library is immobilized on a surface such as a bead After reacting with glycan molecules, the beads were washed, and each eluate eluted with a phosphate buffer containing 50 mM EDTA was allowed to act on the glycan array, and analyzed by a fluorescence scanner etc. Comparative analysis of glycan molecule binding profiles.
(2) The selection cycle is effective when the reactivity to the target molecule observed in the target molecule-binding mutant group is significantly higher than the reactivity to the target molecule observed in the random mutation library. The process of determining that it is.
In this step, it is necessary to determine the effectiveness of the selection step for concentrating the target molecule-binding probe from the random mutation library, in particular, beads immobilized with the target molecule used in the selection step of step (1), etc. Must be effective as a tool for efficiently collecting the desired target molecule-binding modified protein or nucleic acid. Here, “significantly high” means “significant” The “difference” is a significant difference that can be confident that it can be efficiently concentrated in the next selection cycle.
(3) In step (2), when the selection cycle is determined to be effective, and the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile is the reactivity to other molecules on the molecular array If the target molecule-binding mutant group selected in step (2) does not have a clear significant difference, the selection cycle of steps (1) and (2) is further repeated.
(4) In the molecular binding profile created for the target molecule-binding mutant group obtained in step (2) or step (3), the observed reactivity to the target molecule is different from that on the molecular array. A step of determining that it is at the end of the selection cycle when it has a highly significant difference compared to the reactivity to any molecule.
Here, when having a “highly significant difference”, a normal protein or nucleic acid can be added to the eluate obtained by eluting the mutant group bound to the immobilized target molecule, without repeating the selection cycle. It is a “significant difference” to the extent that it can be determined that it can be sufficiently isolated and purified as long as the purification technique is applied, and can be statistically determined by using, for example, a t-test.
For example, a statistical method such as t-test is also effective when preparing a sugar chain-binding lectin variant.
本発明の実施態様では、６硫酸ガラクトース特異的な結合活性を有するタンパク質を創出する場合をモデルケースとし、６硫酸ガラクトースポリマーを用いた選択過程におけるEW29chの進化ポテンシャル評価を行い、糖鎖アレイを用いて選択過程のモニタリングが可能であることを示した。具体的には、１回の選択サイクル終了ごとに糖鎖アレイを用いて糖鎖結合プロファイルを作製し、標的となる６硫酸ガラクトース特異的な結合活性を有するタンパク質が順調に濃縮されているかをモニターでき、またこれ以上選択サイクルを回す必要がないほどに、配列決定するために充分な量の遺伝子が取得可能な状態となっているかどうかがわかる。今回モデルとした６硫酸ガラクトースの場合はたった２回の選択サイクルで充分な量であることがわかり、無駄に選択サイクルを繰り返すことなく、４クローン／８クローンの割合で目的とする６硫酸ガラクトース特異的結合性変異体（E20K）の取得に成功した。 In the embodiment of the present invention, the case of creating a protein having binding activity specific to 6-sulfate galactose is used as a model case, and the evolution potential of EW29ch in the selection process using 6-sulfate galactose polymer is evaluated, and a sugar chain array is used. It was shown that the selection process can be monitored. Specifically, at the end of each selection cycle, a glycan binding profile is created using a glycan array, and the target protein that has 6-sulfate galactose-specific binding activity is monitored to be steadily concentrated. It can also be seen whether a sufficient quantity of genes is available for sequencing so that no further selection cycles need to be performed. In the case of the 6-sulfate galactose modeled this time, only two selection cycles proved to be sufficient, and the desired 6-sulfate galactose specificity was achieved at a ratio of 4/8 clones without wasting the selection cycle unnecessarily. Succeeded in obtaining an experimental binding mutant (E20K).
（２−２）進化工学的な選択サイクル
進化工学的な選択方法としては、ELISAプレート、セファロースビーズや磁気ビーズなどに標的分子を固定化して選択する方法などが一般的に用いられており、これらのいずれの方法も本発明の選択工程で用いることができる。
本発明の実施態様でモデルケースとして用いたセレクション法は、本発明者らが以前に開発した糖鎖ポリマー固定化磁気ビーズを用いるセレクション法（非特許文献５）である。具体的には、親タンパク質（EW29ch）の変異DNAライブラリーを転写・翻訳した後、標的糖鎖（[6’S]LN-PAA（[6S]Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA））を固定化したマグネティックビーズと混合して反応させ、洗浄後に溶出緩衝液を添加して、ビーズから結合したmRNAを溶出する。なお、本実施例では、磁気ビーズに対して標的糖鎖を固定化する方法は非特許文献５に記載の方法に従い、ストレプトアビジン被覆マグネティックビーズにビオチン化糖鎖を固定化する方法を用いた。その後、精製したmRNAをcDNAに変換して、転写・翻訳後に、抗FLAG抗体とCy3ラベル化抗マウスIgGと混合する。この工程を複数回繰り返して、標的糖鎖に特異的に結合する変異タンパク質を濃縮単離する。
(2-2) Evolutionary Engineering Selection Cycle As an evolutionary engineering selection method, methods such as ELISA plate, sepharose beads, magnetic beads, etc. are used by immobilizing a target molecule, and these are generally used. Any of these methods can be used in the selection step of the present invention.
The selection method used as a model case in the embodiment of the present invention is a selection method (Non-patent Document 5) using sugar chain polymer-immobilized magnetic beads previously developed by the present inventors. Specifically, after transcription and translation of a mutant DNA library of the parent protein (EW29ch), magnetic beads with immobilized target sugar chains ([6'S] LN-PAA ([6S] Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA)) The mixture is allowed to react, and after washing, elution buffer is added to elute the bound mRNA from the beads. In this example, the method for immobilizing the target sugar chain on the magnetic beads was carried out according to the method described in
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Other terms and concepts in the present invention are based on the meanings of terms that are conventionally used in the field, and various techniques used to implement the present invention include those that clearly indicate the source. Except for this, it can be easily and reliably carried out by those skilled in the art based on known documents and the like. In addition, various analyzes were performed by applying the methods described in the analytical instruments or reagents used, kit instruction manuals, catalogs, and the like.
In addition, the description content in the technical literature, the patent gazette, and the patent application specification cited in this specification shall be referred to as the description content of the present invention.
（実施例１）親タンパク質と変異ライブラリーの進化ポテンシャル評価
EW29chはミミズ由来のレクチンでR型レクチン固有のβ-トレフォイル構造をとっており、大腸菌で大量に発現でき、また、アミノ酸配列や立体構造がすでにわかっている。そこで、本実施例では、理想的な鋳型モデルタンパク質としてこのEW29chレクチンを用い、矢部らの方法（非特許文献５）に従ってEW29ch変異ライブラリーの作製を行った。
図１に記載のプラスミドpRARE-FLAG-EW29chをテンプレートにエラープローンPCRで420塩基中平均8塩基のエラー導入効率でEW29chの全コード領域にランダム変異を導入した。
その際用いたプライマー配列は、以下の通りである。プライマー位置は実施例１に記載。
T7lac primer
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTG (配列番号２)
GeneIIIrev primer
CCACCTCCTCCTCCGCCGGTAGAAGATATC (配列番号３)
同時にpRARE-FLAG-EW29chをテンプレートとして下記のプライマーセットを用いたPCRでアンカーのGeneIII部分を増やした。
GeneIIIfor primer
CTCGAGGGGATATCTTCTACCGGCGGAGGA (配列番号４)
4base Rare link primer
GCTAGCAACCCGAACCCGTCCCCGTGAAT (配列番号５)
得られた二つのPCR産物を精製し、上記のT7lac primerと4base Rare link primerを用いてオーバーラップPCRで融合した。このPCR産物を精製して変異ライブラリーとしてリボソーム提示法に用いた。
変異DNAライブラリーをin vitroで転写させ、得られたmRNAを精製した。精製したmRNAを翻訳し、非特許文献６の方法に従い、得られたリボソーム-mRNA-タンパク質複合体にマウス抗FLAGモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社製）と、Cy3ラベル化抗マウスIgG(H+L)抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を混合して、９８種類の糖鎖複合体が固定化された糖鎖アレイに供した。２０℃で一晩インキュベートしてプロービングバッファーで洗浄した後、エバネッセント型蛍光スキャナーで解析した。EW29chの野生型（WT）と、同一の方法で３回作製した変異ライブラリー（E1-E3）との糖鎖結合プロファイル結果を図３に示す。黒（WT）は親タンパク質、グレーは３種の変異ライブラリー（E1-E3）を示す。黒（WT）とグレー（３種の変異ライブラリー、E1-E3）の糖鎖結合プロファイルは、全体としてみると大きく異なっていることが見て取れる。またそれと同時に、３回作製した変異ライブラリーのプロファイル同士は極めて類似している。そのことからみて、得られたプロファイル、即ち進化ポテンシャルは、実験ごとに変化しない、その変異ライブラリー特有のものであることが立証された。すなわち、選択されたタンパク質フォールドごとに特有の「進化ポテンシャル」が存在することを示すものであるから、本発明の親タンパク質と変異ライブラリーとの「糖鎖結合プロファイル」比較法は、優れた「進化ポテンシャル」評価法であることを示すものである。
(Example 1) Evaluation of evolution potential of parent protein and mutation library
EW29ch is a worm-derived lectin that has a β-trefoil structure unique to R-type lectins, can be expressed in large amounts in E. coli, and the amino acid sequence and three-dimensional structure are already known. Therefore, in this example, this EW29ch lectin was used as an ideal template model protein, and an EW29ch mutation library was prepared according to the method of Yabe et al. (Non-patent Document 5).
Using the plasmid pRARE-FLAG-EW29ch shown in FIG. 1 as a template, random mutation was introduced into all coding regions of EW29ch by error-prone PCR with an error introduction efficiency of an average of 8 bases out of 420 bases.
The primer sequences used at that time are as follows. Primer positions are described in Example 1.
T7lac primer
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTG (SEQ ID NO: 2)
GeneIIIrev primer
CCACCTCCTCCTCCGCCGGTAGAAGATATC (SEQ ID NO: 3)
At the same time, the GeneIII part of the anchor was increased by PCR using the following primer set using pRARE-FLAG-EW29ch as a template.
GeneIIIfor primer
CTCGAGGGGATATCTTCTACCGGCGGAGGA (SEQ ID NO: 4)
4base Rare link primer
GCTAGCAACCCGAACCCGTCCCCGTGAAT (SEQ ID NO: 5)
The obtained two PCR products were purified and fused by overlap PCR using the above T7lac primer and 4base Rare link primer. This PCR product was purified and used as a mutation library in the ribosome display method.
The mutated DNA library was transcribed in vitro, and the resulting mRNA was purified. The purified mRNA is translated, and the obtained ribosome-mRNA-protein complex is mixed with a mouse anti-FLAG monoclonal antibody (Sigma-Aldrich) and Cy3-labeled anti-mouse IgG (H + L) according to the method of Non-Patent Document 6. ) Antibody (manufactured by Jackson ImmunoResearch) was mixed and subjected to a sugar chain array on which 98 kinds of sugar chain complexes were immobilized. After incubation overnight at 20 ° C. and washing with a probing buffer, analysis was performed with an evanescent fluorescent scanner. FIG. 3 shows the results of glycan binding profiles of EW29ch wild type (WT) and a mutation library (E1-E3) prepared three times by the same method. Black (WT) indicates the parent protein, and gray indicates three mutation libraries (E1-E3). It can be seen that the sugar chain binding profiles of black (WT) and gray (three kinds of mutation libraries, E1-E3) differ greatly as a whole. At the same time, the profiles of the mutation libraries prepared three times are very similar. In view of that, it was proved that the obtained profile, that is, the evolution potential, is unique to the mutation library, which does not change from experiment to experiment. That is, since it indicates that there is a unique “evolution potential” for each selected protein fold, the “glycan binding profile” comparison method between the parent protein of the present invention and the mutant library is an excellent “ It shows that it is an “evolution potential” evaluation method.
詳細には、図３の親タンパク質（WT）と、変異ライブラリー（E1-E3）との「糖鎖結合プロファイル」を比較してみると、親タンパク質では、TG（チログロブリン、Sigma-Aldrich社製）、A-di（GalNAcα1-3Galβ1-PAA）、Lac（Galβ1-4Glcβ1-PAA）、Asialo-FET（アシアロフェツイン、Sigma-Aldrich社製のフェツインをアシアロ化処理したもの）、アシアロα1酸性糖タンパク質（Asialo-AGP、Sigma-Aldrich社製のフェツインをアシアロ化処理したもの）、アシアロトランスフェリン（Asialo-TF、Sigma-Aldrich社製のトランスフェリンをアシアロ化処理したもの）、アシアロチログロブリン（Asialo-TG、Sigma-Aldrich社製のチログロブリンをアシアロ化処理したもの）、アシアロBSM（Asialo-BSM、Sigma-Aldrich社製のBSMをアシアロ化処理したもの）、アシアロGP（Asialo-GP、Sigma-Aldrich社製のGPをアシアロ化処理したもの）などへの結合性ピークが高いのに対して、変異ライブラリーでは、A-di（GalNAcα1-3Galβ1-PAA）、Lac（Galβ1-4Glcβ-PAA）、アシアロウシ顎下腺ムチン（Asialo-BSM）、アシアロGP（Asialo-GP）などへの結合性は減少する一方、TG（チログロブリン、Sigma-Aldrich社製）、[6’S]LN（[6S]Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA）、アシアロチログロブリン（Asialo-TG）、アガラクトトランスフェリン（Agalacto-TF、Sigma-Aldrich社製のトランスフェリンをアガラクト化したもの）、オボアルブミン（OVA、Sigma-Aldrich社製）、ヘパリン(HP、Calbiochem社製のヘパリンをＢＳＡに固定化したもの）などへの結合ピークが親タンパク質と比べて上昇している。なお、糖鎖の末尾の「-PAA」は、糖鎖がポリアクリルアミドポリマーに固定化されていることを意味する。
ここで特に注目すべき点は、親タンパク質ではほとんど見られなかった[6’S]LNの結合性ピークが上昇している点（図３、白矢印）で、このことは、得られた変異型ライブラリーには、この実験で標的とする[6’S]LNの糖鎖に結合する変異体分子が検出限界以上に含まれていることを示している。
すなわち、モデルとしてランダム変異導入のために選択した「EW29ch」の選択が適切であり、その結果、得られたランダム変異ライブラリーの集団の「進化ポテンシャル」が良好である、と評価できることに他ならない。
そしてこのことは、糖鎖アレイによる解析法を適用して、同様に親タンパクとランダム変異ライブラリーそれぞれの「糖鎖結合プロファイル」を作製し、両者を比較することで、増幅工程を含む濃縮サイクルを経ることなく、対象のランダム変異ライブラリーが標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であるかどうかというランダム変異ライブラリーの「進化ポテンシャル」を評価できることを意味する。
Specifically, when comparing the “glycan binding profile” between the parent protein (WT) in FIG. 3 and the mutation library (E1-E3), the parent protein is TG (thyroglobulin, Sigma-Aldrich). ), A-di (GalNAcα1-3Galβ1-PAA), Lac (Galβ1-4Glcβ1-PAA), Asialo-FET (Asialo fetuin, Sigma-Aldrich fetuin produced by asialization), asialo α1 acid sugar Protein (Asialo-AGP, Sigma-Aldrich Fetuin asialogized), Asialotransferrin (Asialo-TF, Sigma-Aldrich Transferrin asialogized), Asialotyroglobulin (Asialo-TG) , Thyroglobulin manufactured by Sigma-Aldrich, asialized), Asialo BSM (Asialo-BSM, processed by Sigma-Aldrich BSM), asialo GP (Asialo-GP, Sigma-Aldrich) Asiaro made of GP In the mutant library, A-di (GalNAcα1-3Galβ1-PAA), Lac (Galβ1-4Glcβ-PAA), Asarou submandibular mucin (Asialo- BSM), Asialo-GP (Asialo-GP), etc., but the binding is reduced, TG (thyroglobulin, Sigma-Aldrich), [6'S] LN ([6S] Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA), asialotyroglobulin (Asialo-TG), agaractotransferrin (Agalacto-TF, galactorylated transferrin from Sigma-Aldrich), ovalbumin (OVA, Sigma-Aldrich), heparin (HP, heparin from Calbiochem) The binding peak to those immobilized on BSA) is higher than that of the parent protein. “-PAA” at the end of the sugar chain means that the sugar chain is immobilized on the polyacrylamide polymer.
Of particular note here is the increase in the binding peak of [6'S] LN, which was rarely seen in the parent protein (Fig. 3, white arrows). The rally shows that mutant molecules that bind to the [6'S] LN sugar chain targeted in this experiment are included above the detection limit.
In other words, the selection of “EW29ch” selected for random mutation introduction as a model is appropriate, and as a result, it can be evaluated that the “evolution potential” of the obtained random mutation library population is good. .
And this applies to the analysis method using a sugar chain array, and similarly creates “glycan binding profiles” for each of the parent protein and the random mutation library, and compares the two to create an enrichment cycle that includes an amplification step. This means that the “evolution potential” of a random mutation library can be evaluated as to whether or not the subject random mutation library is a population capable of creating a target molecule-binding mutant.
（実施例２）糖鎖ポリマーを用いた選択過程における進化ポテンシャル評価
この実施例では、６硫酸ガラクトース（6’S-LN）結合性を獲得する変異体（実施例１）で得られたEW29chの変異DNAライブラリーから、ガラクトース（βGal）と６硫酸ガラクトース（6’S-LN）への結合性を指標に選択し、濃縮する過程がうまくいっているかどうか、またその選択サイクルを終了可能な時期のモニタリングをするものであり、選択サイクルにおけるモデル実験である。
具体的には、EW29chの変異DNAライブラリーを転写・翻訳した後、ビオチン化βGal-PAAもしくはビオチン化[6’S]LN-PAA（[6S]Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA）を固定化したストレプトアビジン被覆マグネティックビーズ（DYNAL社製）と混合して反応させた。洗浄後に溶出緩衝液を添加して、ビーズから結合したmRNAを溶出した。その後、精製したmRNAをcDNAに変換して、転写・翻訳後に、抗FLAG抗体とCy3ラベル化抗マウスIgGと混合して、糖鎖アレイで解析した（選択１回目）。この工程を２回繰り返した。標的糖鎖である６硫酸ガラクトース（6’S-LN）末端を有する、[6’S]LN-PAA固定化マグネティックビーズ（黒太線）を用いて２回選択した場合には、[6’S]LN-PAAに結合する変異体が濃縮されていることがわかる。[6’S]LN-PAA固定化マグネティックビーズでの選択前、もしくは１回、２回選択後に、市販のクローニング用ベクターにクローニングを行い、シーケンシングを行った。その結果、セレクションを行う前は、５クローン中５クローンで２０番目のアミノ酸は確かにグルタミン酸（Ｅ）であったが、１回セレクション後には８クローン中３クローン、２回セレクションを行ったあとには、８クローン中５クローンで、２０番目のグルタミン酸（Ｅ）が塩基性アミノ酸であるLys（Ｋ）もしくはArg（Ｒ）に置換されていた。８種類中、５種類の変異体では[6’S]LN-PAAへの結合性に関与する２０番目のグルタミン酸（Ｅ）が塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）に変換されていた（E20K）（図５）。このことは、EW29Cの末端ドメインにおける「E20K/R」変異体が、６硫酸ガラクトース（6’S-LN）結合性の変異体であり、２回の選択サイクルで、５／８クローンという高い確率で、このような標的糖鎖結合性変異体が得られたことを示すものである。
つまり、リボソーム提示法などにおける選択サイクルを繰り返す過程で、１回の選択サイクル終了ごとに糖鎖アレイによる糖鎖結合プロファイルを作製することにより、選択サイクルにおける工程がうまくいっているかどうかと共に、配列決定するために充分な遺伝子が取得可能な時期、すなわち選択サイクルの終了時期を決定することができる。
なお、比較のため図４の左の列にβGal-PAAで選択した場合を示すが、ガラクトース末端を有するアシアロα1酸性糖タンパク質（Asialo-AGP、グレー）に結合する変異体が濃縮されていくものの、βGal-PAA固定化マグネティックビーズで２回選択後にも、集中的な変異導入は観察されなかった。
(Example 2) Evolution potential evaluation in the selection process using a sugar chain polymer In this example, mutant DNA of EW29ch obtained from a mutant (Example 1) that acquires 6-sulfate galactose (6'S-LN) binding properties. Select from the library the binding to galactose (βGal) and 6-sulfate galactose (6'S-LN) as indicators, and monitor whether the enrichment process is successful and when the selection cycle can be completed. It is a model experiment in the selection cycle.
Specifically, after transcribing and translating EW29ch mutant DNA library, biotinylated βGal-PAA or biotinylated [6'S] LN-PAA ([6S] Galβ1-4GlcNAcβ1-PAA) immobilized streptavidin-coated magnetic The mixture was reacted with beads (DYNAL). After washing, elution buffer was added to elute bound mRNA from the beads. Thereafter, the purified mRNA was converted into cDNA, and after transcription / translation, it was mixed with anti-FLAG antibody and Cy3-labeled anti-mouse IgG, and analyzed with a sugar chain array (first selection). This process was repeated twice. Binds to [6'S] LN-PAA when selected twice using [6'S] LN-PAA-immobilized magnetic beads (black thick line) with 6-sulfate galactose (6'S-LN) end, the target sugar chain It can be seen that the mutants are concentrated. Before selection with [6 ′S] LN-PAA-immobilized magnetic beads, or after selection once or twice, cloning was performed on a commercially available cloning vector, followed by sequencing. As a result, before selection, 5 out of 5 clones and the 20th amino acid was certainly glutamic acid (E). After 1 selection, 3 clones out of 8 clones and after 2 selections. In 5 out of 8 clones, the 20th glutamic acid (E) was replaced with basic amino acid Lys (K) or Arg (R). Of the 8 types, 5 types of mutants had the 20th glutamic acid (E) involved in [6'S] LN-PAA binding converted to the basic amino acid lysine (K) or arginine (R). (E20K) (Figure 5). This means that the “E20K / R” mutant in the terminal domain of EW29C is a 6-sulfate galactose (6′S-LN) -binding mutant, with a high probability of 5/8 clones in two selection cycles, This shows that such a target sugar chain-binding mutant was obtained.
In other words, in the process of repeating the selection cycle in the ribosome display method, etc., by creating a sugar chain binding profile by a sugar chain array at the end of each selection cycle, sequencing is performed along with whether the steps in the selection cycle are successful. It is possible to determine the time at which sufficient genes can be obtained, that is, the end time of the selection cycle.
For comparison, the left column of FIG. 4 shows the case where βGal-PAA is selected, although mutants that bind to asialo α1 acidic glycoprotein (Asialo-AGP, gray) having a galactose end are concentrated. Intensive mutagenesis was not observed even after two selections with βGal-PAA immobilized magnetic beads.
以上のことから、糖鎖アレイを用いることで、変異ライブラリー自体の評価と共に、その選択過程のモニタリングも可能であることがわかった。 From the above, it was found that by using a sugar chain array, the mutation library itself can be evaluated and the selection process can be monitored.
Claims (5)
（１） 少なくとも標的分子を含む分子群が固定化された分子アレイを用意する工程、
（２） 選定した親タンパク質又は親核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ライブラリーを作製する工程、
（３） 工程（２）で用いた親タンパク質又は親核酸と、作製されたランダム変異ライブラリーのそれぞれに対して、工程（１）で得られた分子アレイを反応させることにより、両者の分子結合プロファイルを作成する工程、
（４） 工程（３）で得られた親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルと、同ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルとを比較解析する工程、
（５） ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い場合に、前記ランダム変異ライブラリーが、標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価する工程、
（６） 工程（５）により、前記ランダム変異ライブラリーが標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価された場合に、前記ランダム変異ライブラリーを固定化された標的分子と反応させることにより、標的分子結合性の変異体群を選択する工程、
（７） 工程（６）により選択された標的分子結合性の変異体群の分子結合プロファイルを作成し、工程（３）で得られた前記ランダム変異ライブラリーの分子結合プロファイルと比較解析し、前者で観察される標的分子に対する反応性が、後者で観察される標的分子に対する反応性よりも有意差を持って高い場合に、工程（６）の選択工程が有効であると判定する工程、
（８） 工程（７）において、選択工程が有効であると判定された場合であって、かつ、分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他の分子に対する反応性と明確な有意差を持たない場合に、工程（６）で選択された標的分子結合性変異体群に対して、さらに工程（６）の固定化された標的分子を用いた標的分子結合性変異体群の選択工程、及び（７）の選択された標的分子結合性変異体群に対する分子結合プロファイルを作成し、１つ前の回の選択サイクルの分子結合ファイルと比較解析する工程を繰り返す工程、
（９） 工程（７）で、又は工程（８）で作成された標的分子結合性変異体群の分子結合プロファイルにおいて、観察される標的分子に対する反応性が、分子アレイ上の他のいずれの分子に対する反応性と比較しても高い有意差を持つに至った場合に、選択工程サイクルの終了時と判定する工程、
（１０） 工程（９）で得られた標的分子結合性の変異体群から、目的とする標的分子を特異的に認識するプローブを単離する工程。 A method for creating a probe that specifically recognizes a target molecule, comprising the following (1) to (10):
(1) preparing a molecular array in which a molecular group including at least a target molecule is immobilized;
(2) creating a random mutation library in which random mutations are introduced into the selected parent protein or nucleic acid;
(3) By reacting the parent protein or parent nucleic acid used in step (2) with each of the prepared random mutation libraries, the molecular array obtained in step (1) is reacted, thereby binding both molecules. Creating a profile,
(4) a step of comparing and analyzing the molecular binding profile for the parent protein or nucleic acid obtained in step (3) and the molecular binding profile for the random mutation library;
(5) When the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile for the random mutation library is significantly higher than the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid, Evaluating the random mutation library as a population capable of creating target molecule-binding mutants;
(6) When the random mutation library is evaluated as a group capable of creating a target molecule-binding mutant by the step (5), the random mutation library is reacted with the immobilized target molecule. By selecting a target molecule binding mutant group,
(7) A molecular binding profile of the target molecule-binding mutant group selected in step (6) is prepared, and compared with the molecular binding profile of the random mutation library obtained in step (3). A step of determining that the selection step of step (6) is effective when the reactivity with respect to the target molecule observed in is significantly higher than the reactivity with respect to the target molecule observed in the latter,
(8) In step (7), when it is determined that the selection step is effective, and the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile is the reactivity to other molecules on the molecular array And a target molecule-binding mutation using the target molecule immobilized in step (6) for the target molecule-binding mutant group selected in step (6). A step of selecting a body group, and a step of creating a molecular binding profile for the selected target molecule-binding mutant group of (7) and comparing and analyzing it with the molecular binding file of the previous selection cycle,
(9) In the molecular binding profile of the target molecule-binding mutant group created in step (7) or in step (8), the reactivity to the target molecule observed is any other molecule on the molecular array. A step of determining the end of the selection process cycle when it has a high significant difference compared to the reactivity to
(10) A step of isolating a probe that specifically recognizes a target molecule of interest from the target molecule-binding mutant group obtained in step (9).
（１） 少なくとも標的分子を含む分子群が固定化された分子アレイを用意する工程、
（２） 選定した親タンパク質又は親核酸にランダム変異が導入されたランダム変異ライブラリーを作製する工程、
（３） 親タンパク質又は親核酸と共に、ランダム変異ライブラリーに対して、工程（１）で得られた分子アレイを反応させることにより、それぞれの分子結合プロファイルを作成する工程、
（４） 工程（３）で得られた親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルと、同ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルとを比較解析する工程、
（５） ランダム変異ライブラリーについての分子結合プロファイルで観察される標的分子に対する反応性が、親タンパク質又は親核酸についての分子結合プロファイルで観察される反応性よりも有意差を持って高い場合に、前記ランダム変異ライブラリーが、標的分子結合性の変異体を創出可能な集団であると評価する工程。 A method that evaluates and determines whether or not a random mutation library created to create a probe that specifically recognizes a target molecule has the possibility of creating a target molecule-binding mutant. A method comprising the following (1) to (5):
(1) preparing a molecular array in which a molecular group including at least a target molecule is immobilized;
(2) creating a random mutation library in which random mutations are introduced into the selected parent protein or nucleic acid;
(3) A step of creating each molecular binding profile by reacting the molecular array obtained in step (1) against a random mutation library together with the parent protein or the nucleic acid,
(4) a step of comparing and analyzing the molecular binding profile for the parent protein or nucleic acid obtained in step (3) and the molecular binding profile for the random mutation library;
(5) When the reactivity to the target molecule observed in the molecular binding profile for the random mutation library is significantly higher than the reactivity observed in the molecular binding profile for the parent protein or parent nucleic acid, Evaluating the random mutation library as a population capable of creating a target molecule-binding mutant.
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