JP6063384B2 - プレターゲットキット、プレターゲット方法及びその使用試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ターゲット医療用イメージング及び／又は治療のためのプレターゲット方法に関し、お互いに対して生体直交反応性を示す非生物的化学基の使用からなる。本発明はまた、プレターゲットキットに関連し、少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが、第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性基を含み、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生物直交反応性基を含む。本発明はまた、前記方法及びキットで使用されるプレターゲット試薬に関する。本発明は、特に核イメージング及び放射線治療に関連する。

医用診断及び治療の多くの分野で、治療薬（医薬）又は診断（イメージング、画像化）試薬を、患者などの対象体の体内の、特定のサイト又は定められた領域に選択的に輸送することが望まれる。

器官又は組織の活性ターゲット化は、前記望ましい活性部（例えば造影剤又は細胞毒性化合物）を、対象となる前記ターゲットサイトで又はその近くで細胞表面に結合するか又は細胞取り込みを促進するターゲット構成物に直接又は間接的に共役させること(conjugation)で達成される。かかる試薬をターゲットするために使用される前記ターゲット部は、通常、細胞表面ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）、又は細胞内ターゲット（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路）への親和性を持つ構成物である。これらの部分は、特定の疾患又は不全に蓄積されることが知られている、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、同様にペプチド、ペプトイド及び有機薬物化合物などであり得る。又は、造影剤／治療薬は、ＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物吸収などでの疾患（例えば感染又は癌）の際にアップレギュレートされる代謝経路をターゲットすることも可能である。これらの疾患組織では、前記マーカーは、疾患細胞を健康組織から識別することができ、早期検出、特異的診断及び（ターゲット）治療のための独自の可能性を提供する。

一般に分子イメージング／治療薬の成功、特に核イメージング／治療薬の成功のための重要な判断基準は、高いターゲット取り込みと、一方で非ターゲット組織及び血流からの迅速な消失（腎及び／又は肝胆蔵系を介して）を示す、ということである。しかしこれはしばしば問題となり：例えば、ヒトでのイメージング研究では、前記腫瘍サイトでの放射性ラベル化抗体の最大濃度が２４時間以内に達成されるが、循環中の前記ラベル化抗体の濃度が、イメージングを成功させるために十分低いレベルに減少するまでにさらに数日を必要とする、ことが示されている。
ターゲット組織での遅い又は不十分な蓄積と、非ターゲット領域からの遅い消失というこの問題（特に核イメージング及び治療で）は、プレターゲット方法の適用を導くことになった。

プレターゲットとは、ターゲット方法の１つのステップを意味し、そこでは、第１のターゲット（例えば細胞表面）がプレターゲットプローブで提供される。前記プレターゲットプローブは、第２のターゲットを含み、これは最終的には、第２のターゲット部を持つさらなるプローブ（前記エフェクタープローブ）によりターゲットされることとなる。

従って、プレターゲットでは、プレターゲットプローブが第１のターゲットへ結合される。前記プレターゲットプローブはまた、第２のターゲットを持ち、これは、診断（イメージング）及び／又は治療試薬への前記エフェクタープローブの特異的共役を容易にする。前記プレターゲットプローブを形成する前記構成物が前記ターゲットサイトに局所化されると（例えば２４時間後）、自然消失が不十分である場合にはクリーニング試薬を使用して前記血液から過剰量を除去する。第２のインキュベーションステップで（好ましくは短時間、例えば１から６時間）で、前記エフェクタープローブは、その第２のターゲット部を介してプレターゲットプローブに結合される。前記第２のターゲット（前記プレターゲットプローブ上に存在する）及び前記第２のターゲット部（前記エフェクタープローブ上に存在する）は、高特異性高親和性を持って迅速に結合し、体内で安定化される。

プレターゲット方法の一般的概念は、図１でイメージングについて概説されている。ここで前記エフェクタープローブは、イメージングモダリティのための検出可能なラベルを含むイメージングプローブである。前記エフェクタープローブは、その第２のターゲット基を介して前記（プレ）結合したプレターゲットプローブへ結合する。

第２のターゲット／第２のターゲット部ペアのための共通の例は、ビオチン／ストレプトアビジン又は抗体／抗原システムである。有効であるためには、前記エフェクタープローブは、体内から迅速に排泄（例えば腎臓を介して）されて、非ターゲット蓄積が比較的低く、前記望ましい高腫瘍蓄積を与えることが必要である。従って、これらのプローブは通常は小さい。

核イメージング及び放射線治療では、プレターゲットの概念は、さらに有利となり、前記時間消費性プレターゲットステップが放射性核を用いることなく実施され、一方放射性核を用いる前記第２のターゲットステップはより迅速に実施され得る、からである。後者は、より短寿命の放射性核の使用を可能にし、例えばＳＰＥＣＴ試薬の代わりにＰＥＴ試薬を使用することで患者への放射線暴露を最小化し得る、からである。多配座リガンドシステム（ストレプトアビジン、デンドリマー）と組合せて、ＭＲＩでプレターゲット方法を用いることで、ターゲットサイトでのシグナルを増幅させることを可能にする。さらに、一般的に、この方法は汎用の造影剤の使用を容易にする。

一般的に、生物学における（例えば抗体−抗原）、及び特にプレターゲット（ビオチン−ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）での高度に選択的な相互作用を実行する構造体は非常に大きい。その結果、第１のターゲット基としてのペプチド及び小有機部分でプレターゲットすることは、代謝イメージング及び細胞内ターゲットイメージングと同様に、前記第２ターゲットのサイズが小さい第１の基の使用を的外れとすることから、不十分のままであった。

さらに、現在のプレターゲットシステムは、その生物的性質に伴うファクタで妨げられる。ビオチンは内因性の分子であり、その共役は血清酵素ビオチニダーゼで切断され得る。アンチセンスプレターゲットが使用される場合には、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡアーゼ及びＤＮＡアーゼの攻撃対象とされ得る。タンパク質及びペプチドはまた、天然の分解経路の対象とされる。これらの相互作用はさらに、それらの非共有結合性及び動的性質で損なわれ、及びオンターゲット滞留時間に限定され得る。また、内因性ビオチンは、ストレプトアビジン結合についてビオチン共役(conjugates)と競合する。最後に、ストレプトアビジンは非常に免疫性である。

最近の進展は、前記天然／生体ターゲット構造（即ち、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に基づくのみのプレターゲットに関連する欠点を回避することである。

これについての参照は、国際出願公開第２０１０／０５１５３０号であり、プレターゲットが、テトラジンなどの特定のジエンとトランス−シクロオクテノール（ＴＣＯ）などのジエノフィルとの反応に基づき説明されている。

これについてのさらなる参照は、ＬｉらのＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１０、 ４６（４２）、 ｐ． ８０４３−８０４５であり、３，６−ジアリール−ｓ−テトラジン及び^１８Ｆラベル化トランス−シクロオクテンとのディールスアルダー反応に基づく生体共役のための放射性ラベル化方法を記載している。

Ｒｏｓｓらの「Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．、 Ｅｄ ２０１０、 ４９、 ｐ． ３３７５−３３７８」は、逆電子要求ディールスアルダー反応を用いることによる腫瘍プレターゲットに関する。

Ｂｌａｃｋｍａｎらの「 Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、 ２００８、 １３０、 ｐ． １３５１８−１３５１９」は、逆電子要求ディールスアルダー反応に基づく、迅速生体共役を記載する。

Ｒｏｙｚｅｎらの「Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、 ２００８、 １３０、 ｐ． ３７６０−３７６１」は、金属錯体により誘導された官能基化トランス−シクロオクテンの光化学合成に関する。

かかるシステムに基づいて、比較的迅速な反応が得られるけれど、これは前記ビオチン−ストレプトアビジンシステムの反応性とは異なる。従って、この欠点を回避するために、前記反応の第１の要求、即ち速度を犠牲にする。従って、前記の生体分子に基づかないシステムであり、なお望ましい迅速な反応速度を持つシステムを提供することが望まれる。

国際出願公開第２０１０／０５１５３０号

Ｌｉ ｅｔ ａｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１０、４６（４２）、ｐ．８０４３−８０４５ Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．、Ｅｄ ２０１０、４９、ｐ．３３７５−３３７８ Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２００８、１３０、ｐ．１３５１８−１３５１９ Ｒｏｙｚｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、２００８、１３０、ｐ．３７６０−３７６１

本発明は、プレターゲットキット、プレターゲット方法及びその使用試薬を提供することを課題とする。

前記望みに対応するために、本発明は、１つの側面で、ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットを提供し、前記キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性基を、前記エフェクタープローブが、ラベル又は医薬的活性化合物などのエフェクター部及び第２の生体直交反応性基を含み、前記第１及び第２の生体直交反応性基のいずれか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：

ここでＲの位置はエカトリアルであり、Ｒ_ａの位置はアキシャルであり、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６の場合において、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）_２−アリール、Ｓ（Ｏ）_２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ_３、ＳＯ_２Ｈ、ＳＯ_３Ｈ、ＳＯ_４Ｈ、ＰＯ_４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ_２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ_３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル、アリールである）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルである）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（ここでＲ’はＨ、アルキル又はアリールである）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルールである）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルールである）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルールである）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルールである）、ＣＲ’ＮＲ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル又はアルールである）；からなる群から選択される置換基を表し；Ｒ_ａ の１つは、場合によりスペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部に含まれ；Ｒ又はＲ_ａ 部分の２つが共に環を形成してよく；及び少なくとも１つかつ最大４つのＲ_ａは水素ではない。

他の側面で、本発明は、プレターゲット方法、並びに同方法で使用するプレターゲット試薬、及びこのキットが使用されるターゲット化医用イメージング又は治療を提供する。

さらなる側面で、本発明は、動物又はヒトでのプレターゲット方法の使用のための前記式（１）を満たす化合物である。

さらに他の側面は、本発明は、レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でのジエノフィル反応物として１以上のアキシャル置換基を持つトランスシクロオクテンの使用に関する。

図１は、前記のプレターゲット方法の一般的スキームを示す。 図２は、（３,６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジン及びＥ−シクロオクテンとの間の［４＋２］ディールスアルダー反応、続いてレトロディールスアルダー反応により生成物とＮ_２が形成される反応スキームを示す。前記トランスシクロオクテン誘導体は古典的ディールスアルダー反応でのような電子吸引性基を含まないことから、このタイプのディールスアルダー反応は古典的反応とは区別され、しばしば「逆電子要求ディールスアルダー反応」と称する。以下の記載で、両方の反応ステップの連続、即ち最初のディールスアルダーシクロ付加（通常逆電子要求ディールスアルダーシクロ付加）及び続くレトロディールスアルダー反応は、短く「レトロディールスアルダー反応」又は「レトロ−ＤＡ」と称する。 図３の（ａ）及び（ｂ）は、レトロディールスアルダー化学を用いるプレターゲットのための一般的スキームを示す。 図４は、ＴＣＯ−変性ｍＡｂ（Ｂ）及び放射性ラベル化テトラジン（Ａ）が関与するレトロ−ＤＡにより、腫瘍プレターゲットのスキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 実施例で参照される化合物の合成スキームを示す。 図１１は、シクロオクテノールの立体化学、以下説明するＥ−マイナー及びＥ−メジャー異性体及びＺ異性体の比較を示す。 図１２はテトラジン−ＤＯＴＡプローブ２８の構造を示す。 図１３は、３つの異なるシクロオクテンジエノフィルのマウス中でのインビボ安定性を示す。 図１４は、生きたマウスのＳＰＥＣＴ／ＣＴ投影像を示す。 図１５は、テトラジンプローブ２８の別合成手順、及び対応するＧｄ−錯体、２８−Ｇｄ^ＩＩＩの合成を示す。 図１６は、テトラジンモデルプローブ３５、３８、４０及び４２の合成経路を示す。 図１７は新規ＴＣＯの合成経路を示す。 図１８は、低濃度のＰＢＳ中でＴＣＯ（２０ａ又は２０ｂ）及び１７７Ｌｕ−テトラジン２８（１当量）添加キャリアとの基準化反応収率を与える。 図１９は、血液消失について補正されたＣＣ４９結合ＴＣＯ２０ｂのインビボ安定性を示す。データ点は、平均を表し、エラーバーは、１標準偏差（ｎ＝３）を表す。 図２０は、ＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）構造体の血液曲線を示す。データ点は、平均を表し、エラーバーは、１標準偏差（ｎ＝３）を表す。 図２１は、無腫瘍マウスでのＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）の生体内分布を表す。バーは平均を表し、エラーバーは、１標準偏差（ｎ＝３）を表す。 図２２は、無腫瘍マウス（ｎ＝３）での^１２５Ｉ−ＣＣ４９及び^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（７．５）の血中動態を示す。データは、１グラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）として、１標準偏差（誤差バー）と共に表される。 図２３は、ｍＡｂ注入４日後無腫瘍マウス（ｎ＝３）での^１２５Ｉ−ＣＣ４９（白棒）及び^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（７．５）（黒棒）の生体分布を表す。バーは、１グラム当たりのパーセント注入用量（％ＩＤ／ｇ）として、１標準偏差（誤差バー）と共に表される。 図２４は、ＣＣ４９へ共役されたＴＣＯ４４ｂのインビボ安定性を示す。データ点は、３回の測定の平均と１標準偏差（誤差バー）と共に示され、これは２次多項式でフィッティング（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ ｖ． ５．０１）されている。

本発明で使用される歪シクロオクテンジエノフィルは以下Ｅ−シクロオクテンとする。前記従来命名を参照する上で理解されるべきことは、置換Ｘ又はＹの結果として、前記置換基の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテン異性体が形式的にＺ異性体となり得る、ということである。本発明及び本発明のいずれの置換変更例において、形式的に「Ｅ」又は「Ｚ」、即ち「シス」又は「トランス」異性体かどうかは、無置換トランス−シクロオクテン又は無置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体と考えられる。用語「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）並びにＥ−シクロオクテンは、互いに交換可能に使用され、本発明の全てのジエノフィルについて維持され、又置換基が形式的に逆の命名を必要とする場合であっても、維持される。即ち、本発明は、シクロオクテンに関し、ここで以下で炭素原子１及び６と数字付けされた炭素原子がＥ（エントゲーゲン）即ちトランス位置にある。

一般的意味において、本発明は、ジエノフィルとして、誘導体化されたトランス−シクロオクテン、例えばトランス−シクロオクテノールの形態を使用するシステムにおいて、前記異性体は、リンカー構造に誘導体化するために使用される前記ヒドロキシル基が、アキシャル位置となるように選択されるという認識に基づく。Ｅ−シクロオクテノールは、所謂冠型立体配座であるが、２つの異性体を有し、その１つはＯＨをエカトリアル位置に持ちメジャー異性体となり、他の１つはＯＨをアキシャル位置に持ちマイナー異性体となる。後者異性体は、本発明により選択され以下「Ｅ−マイナー」と表記する。

理論に縛られるものではないが、本発明者は、この知見に基づき、ＴＣＯの１以上のアキシャル置換基の存在が、前記レトロディールスアルダー反応に基づくプレターゲット方法でのより高い反応性の必要性に答えることができるものである、と考える。

広い意味で、本発明は従って、前記の式（１）を参照して与えられた置換基の定義を超えるものである。１以上のアキシャル置換基が存在するという事実は、結果としてより高いＨＯＭＯエネルギーとなる、と考えられる。当業者に知られるＨＯＭＯは、最高占有分子軌道の略である。本発明によれば、ＭＯＰＡＣシミュレーションが前記ＴＣＯのＨＯＭＯエネルギーを決定するために使用される。ＭＯＰＡＣ（分子軌道パッケージ）は計算化学の分野ではよく知られたソフトウェアである。前記ＭＯＰＡＣソフトウェアは、ＡＭＩＴＩＥやＰＭ３を含むいくつかのよく知られた半経験的分子軌道計算方法を取り込んでいる。用語ＡＭＩ及びＰＭ３は異なるハミルトニアン、即ちオースチンモデル１及びパラメータ化モデル３ハミルトニアンを意味する（ＡＭＩについては、Ｍ．Ｊ．Ｓ．Ｄｅｗａｒ、ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１０７、３９０２（１９８５）；ＰＭ３についてはＪ．Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１０、２０９（１９８９）及びＪ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．、１０、２２１（１９８９）を参照）。

本発明においては、コンピュータ環境下で、シクロオクテン誘導体の分子構造を与え、それぞれの分子構造を形成について最低エネルギーを決定することにより最適化し、前記ＡＭＩ及びＰＭ３ハミルトニアンを決定し、及びそれにより最高占有分子軌道（ＨＯＭＯ）を決定する、ことを含む方法が使用される。

表６のＭＯＰＡＣデータは、アキシャル置換基の存在は、トランス−シクロオクテン環に増加したＨＯＭＯエネルギーを与える目的に役立つ、ということを示す。

本発明は、さらに、具体的な実施態様及び添付図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲にのみ限定される。請求項の全ての参照符号は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。記載される図面は概略的なものであり限定するものではない。図面で、いくつかの要素のサイズは誇張されている場合があるが、これは説明のためだけに描かれており寸法通りではない場合がある。用語「含む」は、本発明の説明及び特許請求の範囲で使用される場合には、他の要素又はステップを排除するものではない。単数名詞を示す定冠詞もしくは不定冠詞「１つの」、「ひとつの」、「the」は、特に記載がない限り、複数を含む。

さらに留意すべきことは、詳細な説明及び特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、続いて列挙される手段に限定されるものではなく、他の要素及びステップを排除するものではない、ということである。従って、「手段Ａ及びＢを含む装置」なる表現の範囲は、部品Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるものではない。本発明に関しては、これは、前記装置の単に関連する部品がＡ及びＢである、ということを意味する。

いくつかの化学式で、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この観点で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、場合によりＯ、Ｎ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０まで、好ましくは１〜６の炭素原子の、脂肪族、直鎖、分岐又は環状アルキル基を示し、「アリール」とは、それぞれ独立して、場合によりＮ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０までの芳香族又はヘテロ芳香族基を示す。いくつかの式で、基又は置換基は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」、及び種々の番号付き「Ｒ」基などの文字を参照して示される。これらの文字の定義は、それぞれの式に付されており、即ち特に記載のない限り異なる式ではこれらの文字はそれぞれ独立して異なる意味を持ち得る。

本発明のさらなる好ましい実施態様では、以下いくつかの化学式において、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この側面で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、場合により１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る、１０までの炭素電子の、脂肪族、直鎖、分岐、飽和、不飽和及び／又は環状ヒドロカルビル基を示し、及び「アリール」とは、それぞれ独立して、２０炭素原子までの芳香族又はヘテロ芳香族基を示し、これは場合により置換されており、且つ場合により１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る。「アリール」基はまた、「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」基（簡単例：ベンジル基）を含む。「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」及び「アリールアルキル」が含み得る炭素原子の数は、かかる用語に先行する指定用語により示される（砂割、Ｃ_１〜１０アルキルとは、前記アルキル基が炭素原子を１〜１０含み得る、ということを意味する）。本発明のいくつかの化合物は、キラル中心及び／又は互変異性体（トートマー）を含み得るが、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及び互変異性体は本発明の範囲に含まれる。

レトロディールスアルダー反応
前記レトロディールスアルダーカップリング化学は一般的には、１対の反応物を含み、これらはカップリングして不安定な中間体を形成し、前記中間体はレトロディールスアルダー反応の唯一の副生成物として小分子（これは出発物質に依存し、例えばＮ_２、ＣＯ_２、ＲＣＮなど）を除去して安定な生成物を形成する。前記一対の反応物は、１つの反応物として（即ち１つの生体直交反応性基）、テトラジンの誘導体、例えば電子欠乏テトラジンなどの好適なジエン、及び他の反応物として（即ち他の生体直交反応性基）、式（１）による歪シクロオクテンを含む。

例えば電子欠乏性（置換）テトラジンと本発明の歪Ｅ−シクロオクテンとの例外的に速い反応により、中間体を経て、Ｎ_２を［４＋２］レトロディールスアルダーシクロ付加での唯一の副生成物として除去することで安定なジヒドロピリダジンへ再編成される連結中間体となる。これは図２に示される。

前記２つの反応種は非生物的であり、従って、インビボで迅速に代謝されることはない。それらは生体直交性であり、例えばこれらは生理的媒体中でお互いに選択的に反応する。その利点は、前記ジエン及びシクロオクテンは共に、細胞の内部又は表面及び血清などの他の全ての領域において生体分子とは本質的に反応しない、ということである。従って、本発明の前記化合物及び方法は、生体細胞、組織又は器官で使用され得る。さらに、前記反応基は比較的小さく、生体サイズを大きく変化させることなく生体サンプル又は生体器官内に導入可能である。［４＋２］レトロディールスアルダー反応を用いることで、抗体などの大きいサイズの第１のターゲット部と、ラベル化剤、又は小さい反応相手、例えばテトラジン又はシクロオクテンを用いる他の分子と結合させることが可能となる。より有利には、比較的小さい、例えばペプチドである第１のターゲット部は、ラベル化剤又は小さい（適合化された）反応相手、例えばテトラジン又はシクロオクテンを用いる他の分子と結合させることが可能となる。プレターゲットプローブ及びエフェクタープローブのサイズ及び性質は、第２のターゲット及び第２のターゲット部でそれほど影響されず、（プレ）ターゲット方法を小さいターゲット部のために使用されることを可能にする。このために、他の組織がターゲットされ得ることとなり、即ち前記プローブの目標は、抗体−ストレプトアビジンによる現在のプレターゲット方法の場合のように、血管系及び間質空間に限定されるものではない。

前記逆電子要求ディールスアルダー反応、及び反応性化学種のペアの挙動についての参考文献は：「Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４」；「Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５」；「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９」；「Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．Ｒｅｎａｒｔ Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｓａｎｄｒａ Ｍ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、１．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５」；「Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ、Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ、Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ、Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ、Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２００９、４８、７０１３」及び「Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、１−５」を含む。

理解されるべきことは、広い意味で、本発明により、前記カップリング化学は、プレターゲットで使用され得る基本的にいずれのペアの、分子、基又は部分に適用され得る。即ち、かかる対の１つは、第１のターゲット部を持ち、これは第１のターゲットへ結合でき、及びさらに少なくとも１つの第２のターゲットを含む。他の１つは、前記第２のターゲットとの結合に使用される好適な第２のターゲット部であり、さらに、治療作用（通常は医薬活性化合物）を発揮するか、又はイメージング技術（即ちラベル）を適用されるか、又はその両方のために好適な部分を含む。

従って、本発明によれば、プレターゲットプローブ及びエフェクタープローブのいずれかは、前記のアキシャル置換されたシクロオクテンで官能基化され、かつ他方はテトラジン又は他の好適なジエンで官能基化されている。これは図３に示される。スキーム上（図３ａ）は、プレターゲットプローブを示し、これはジピリジルテトラジンを含み、これはリンカー部（場合によりフレキシブルなスペーサーを含む）を介して前記第１のターゲット部としての抗体へ結合されており、及びエフェクタープローブがリンカー（フレキシブルなスペーサー）を介して検出可能なラベルに結合されている（第２のターゲット化部分としての）シクロオクテンを有する。スキーム下（図３ｂ）は、丁度逆の場合を示し、即ちプレターゲットプローブがシクロオクテンを含み、及びエフェクタープローブがテトラジンを含む。

図には立体化学が明記されていないが、本発明において前記シクロオクテンが前記式（１）によるアキシャル置換シクロオクテンであることは、理解される。

ジエノフィル
本発明の基本的な成果は、ジエノフィルが選択されること、即ち前記の式（１）によるアキシャル置換ＴＣＯ、これにより前記生体直交カップリング反応の反応速度を１０倍以上増加させることができる、ということである。又は言い換えると、反応時間は当初必要とされていた時間のほんの１０％である、ということである。さらに言い換えると、１つの反応物の濃度が１０倍低くてよいことである。

広い意味で、ジエノフィルは、少なくとも１つアキシャル置換基を持つトランス−シクロオクテンであり、即ち少なくとも１つの飽和炭素原子の少なくとも１つの位置が水素ではない、ということである。

前記の通り、少なくとも１つ且つ最大４のＲ_ａは水素ではなく、これはかかるＲ_ａが置換基又はリンカー構造に一部であることを意味する。好ましくは非水素のＲ_ａの数は１又は２である。

より好ましくは、少なくとも１つ、最大４の非水素Ｒ_ａは、Ｒ^２ _ａ、Ｒ^３ _ａ、Ｒ^４ _ａ及びＲ^５ _ａからなる群から選択される位置にある。さらに好ましくは、Ｒ^２ _ａ、Ｒ^３ _ａ、Ｒ^４ _ａ及びＲ^５ _ａの１又は２が非水素である。最も好ましくは、置換基又はリンカー構造が、Ｒ^３ａ及びＲ^４ａの１つ又は両方として存在することである。

好ましくは、前記置換基は前記式（１）の説明に定義された基から選択される。より好ましくは、前記置換基Ｒ_ａはアルキル基又はＯ−アルキル基、より好ましくはメチル又Ｏ−ｔ−ブチル基である。

留意すべきことは、Ｒａの前記オプション及び選択は、エカトリアル位置（即ち前記式（１）のＲ基）に、他の炭素原子又は同じ炭素原子上にいずれかの置換基が存在するかどうかには関係ない、ということである。好ましくは、１又は２のアキシャル置換基に加えてまた、１又は２のエカトリアル置換基が存在し、前記置換基が好ましくはリンカー構造の一部分であるＲ又はＲ_ａを含む。しかし、他の選択では、合成の努力と反応性の間のバランスをとるために、１又は２のＲ_ａが水素ではなく、かつ全ての他のＲ及びＲ_ａは水素である。

さらなる選択では、Ｘ及び／又はＹは、Ｏ−アルキル又はアルキルであり、さらの好ましくはメチルである。

ジエン
当業者は、前記レトロディールスアルダー反応で反応性であるジエンの多くを認識する。好ましくは、ジエンは、以下式（２）から（５）に示される。

ここで、Ｒ^１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２、ＣＦ_２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルである）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ^＋Ｏ⁻、Ｎ^＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキルである）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルである）からなる群から選択される。

シクロオクテンの反応相手として特に好適なジエンは：

であり、ここで、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ’、ＮＯ_２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール及びアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり：Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル基であり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻からなる群から選択される。

シクロオクテンの反応相手として特に好適な他のジエンは：

であり、
ここで、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ’、ＮＯ_２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ^＋Ｏ⁻からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキルである）から成る群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻からなる群から選択される。

特に有用なテトラジン誘導体は、電子欠乏テトラジン、即ち一般的に電子供与として保持せず、好ましくは電気吸引性置換基を持つ基又は部分で置換されたテトラジンである。

これらの電子欠乏テトラジンは一般的には次の構造式を満足し：

ここでＲ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、２，５−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル又はフェニルであって、これらは場合によりＮＯ_２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ_３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されていてもよい（ＲはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニル、ピリジル又はナフチル基を表す）、からなる群から選択される置換基を表す。

式（２）から（５）のそれぞれによる化合物で、Ｒ^１及びＲ^２基（そのＸ及びＹ基を含む）は、さらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーを含み得る。同様に且つ独立して、前記式（１）のジエノフィルはさらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーを含み得る。

１つの実施態様によると、本発明はターゲットイメージングのために使用される。
この実施態様によると、特異的第１のターゲットのイメージングが、前記プレターゲットプローブの前記第１のターゲット部の特異的な結合及びこの結合を前記エフェクタープローブに含まれる検出可能なラベルを用いて検出することにより達成され得る。

第１のターゲット
本発明で使用される「第１のターゲット」は、診断及び／又はイメージング方法で検出されるターゲット、及び／又は変更され、結合され又は医薬活性化合物、又は他の治療方法により対処されるターゲットに関連する。

前記第１のターゲットは、ヒト又は動物体内又は病原体や寄生虫のいずれの好適なターゲット、例えば、細胞膜や細胞壁などの細胞、細胞膜受容体のような受容体、ゴルジ体やミトコンドリアなどの細胞内構造、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスまたはウイルス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミン酸化酵素、ムスカリン受容体、心筋神経系、例えば白血球上ロイコトリエン受容体、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（μＰＡＲ）、葉酸受容体、アポトーシスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ドーパミン系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動性システム、アドレナリン作動系、コリン作動系、オポイド受容体、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体や他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフシン受容体、インテグリン受容体、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＥＧＦマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌ−セレクチン受容体、ＬＤＬ受容体、Ｐ−糖蛋白質、ニューロテンシン受容体、神経ペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼを含む群から選択され得る。

本発明の特に具体的な実施態様によると、前記第１のターゲットはレセプターなどのタンパク質である。又は、前記第１のターゲットは、感染や癌などの疾患の際にアップレギュレートされる代謝経路であり得、例えばＤＮＡ合成、タンパク質合成、膜合成及び炭水化物取り込みなどである。疾患組織で、前記マーカーは健康な組織とは異なり、早期検出、特異的診断及び治療、特にターゲット治療のためのユニークな可能性を提供し得る。

プレターゲットプローブ
プレターゲットプローブは、興味対象の前記第１のターゲットへ結合し得る部分を含む。

ターゲット部分は通常は、細胞表面ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）、又は細胞内ターゲット（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達系）に親和性を持つ構造体である。これらの部分は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、並びに特定の疾患又は異常において蓄積されることが知られているペプチド、ペプトイド及び有機医薬化合物である得る。

本発明のキットで使用される好適な第１のターゲット部分の具体的な実施態様は、本書に記載され、レセプター結合性ペプチド及び抗体を含む。本発明の特定の実施態様は、ペプチドなどの小さいターゲット部分の使用に関し、それにより細胞透過性ターゲットプローブを得ることが可能となる。

本発明で使用される「第１のターゲット部分」は、第１のターゲットに結合する前記ターゲットプローブの部分に関する。第１のターゲット部分の具体的例示はレセプターに結合するペプチド又はタンパク質である。第１のターゲット部分の他の例示は細胞性化合物に結合する抗体又はその断片である。抗体は、非タンパク質性化合物に、並びにタンパク質又はペプチドに産生させることも可能である。他の第１のターゲット部分は、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖と同様に、ペプトイド及び有機医薬化合物からも作成され得る。第１のターゲット部分は好ましくは、高特異性、高親和性で、場合により共有結合で結合し、前記第１のターゲットとの結合は好ましくは体内安定である。

前記列挙の第１のターゲットの特異的ターゲットを可能にするために、前記ターゲットプローブの第１のターゲット部分は、限定されるものではないが、Ｆａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体断片、二重特異的抗体、ポリマー（ＥＰＲ効果による腫瘍ターゲット化）、タンパク質、ペプチド例えばオクトレオチド及び誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド類似物、炭水化物、単糖類、多糖類、ウイルス、全細胞、ファージ、医薬物、化学療法剤、レセプター作動薬及び拮抗剤、サイトカイン、ホルモン、ステロイドが含まれる。本発明に含まれる有機化合物の例は、エストロゲン、例えばエストラジオール、アンドロゲン、プロゲスチン、コルチコステロイド、パクリタキセル、エトポシド、ドキソルブリシン、メトトレキサート、葉酸及びコレステロールであり、又はそれらから誘導される。

本発明の１つの特定の実施態様によると、前記第１のターゲットは、レセプターであり、好適な第１のターゲット化部分は、限定されるものではないが、このようなレセプターのリガンド又はその一部分であってなお前記レセプターに結合するもの、例えばレセプター結合性タンパク質リガンドの場合のレセプター結合性ペプチドを包含する。

タンパク質性の第１のターゲット部分の他の例は、アルファ、ベータ、ガンマインターフェロンなどのインターフェロン、インターロイキン、及び腫瘍成長因子などのタンパク質成長因子、例えばアルファ、ベータ腫瘍成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、μＰＡＲターゲットタンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン及びアンジオスタチンを含む。

第１のターゲット部分の他の例は、例えば前記第１のターゲットと相補的である、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。

本発明の１つの特定の実施態様によると、細胞内の第１のターゲットへ結合し得る小さい脂質親和性第１のターゲット部分が使用される。

本発明のさらなる特定の実施態様によると、前記第１のターゲット及び第１のターゲット部分は、癌、炎症、感染症、心血管疾患などの組織又は疾患、血栓、アテローム性動脈硬化症などの心臓欠陥疾患、脳卒中などの低酸素サイト、腫瘍、心臓血管疾患、脳疾患、アポトーシス、血管形成、器官、およびレポーター遺伝子／酵素などの特異的ターゲット化又は強調ターゲット化を可能にするように選択させる。これは、組織、細胞又は疾患特異的発現を用いて第１のターゲットを選択することで達成できる。例えば、膜葉酸レセプターは、葉酸エステル及びメトトレキサートなどの類似物の細胞内蓄積を媒介する。発現は正常組織では限定されているが、種々の腫瘍細胞タイプではレセプターが過剰発現している。

１つの実施態様によると、前記プレターゲットプローブ及び前記エフェクタープローブは、多量体化合物であって、複数の第１の及び／又は第２のターゲット及び／又はターゲット部分を含む。これらの多量体化合物は、ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ポリマー粒子又は他のポリマー性構造体であり得る。検出シグナルの増幅の特に興味あることは、１以上の第２のターゲットを持つターゲットプローブであり、これはいくつかのエフェクタープローブの結合を可能にする。

プレターゲットプローブはさらに、前記の第１の生体直交反応基を持つ。この基は、「第２のターゲット」として、即ち前記レトロディールスアルダーカップリング化学の第１の反応相手を与える前記ターゲットプローブの部分として作用する。

前記第２のターゲットは前記の通り、前記カップリング反応のいずれかの相手となり得る。即ち、１つの実施態様では、電子欠乏テトラジンである。他の実施態様では、前記式（１）のアキシャル置換ＴＣＯである。

前記プレターゲットでは、前記第１のターゲット部分及び前記第１の生体直交反応基はお互いに直接リンクされている。これらはまた、お互いにリンカーを介して結合され、さらにこれらは共に第１のターゲット足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーにリンクされ得る。即ち、最も単純な意味で、前記リンカー部は１つの結合である。好適なリンカー部はさらに、限定されるものではないが、２から２００、特に３から１１３、及び好ましくは５から５０の間の繰り返し単位のポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）を含む。前記ＰＥＧ鎖長を調節することで、生理的システム中での前記プローブの循環時間を変更することができる。これはプレターゲットプローブについて特に関係がある（前記第１のターゲット部分と前記第１のターゲットをリンクする最初のターゲットステップが、比較的遅いプロセスを含み、比較的長い循環時間を必要とするからである）。リンカー部は場合により生体ポリマー断片、例えばオリゴ又はポリペプチド又はポリラクチドを含む。

理解されるべきは、本発明は、前記ジエンとジエノフィルが前記プレターゲット又はエフェクタープローブのいずれかに付着され得るいずれか考えられる方法を含む、ということである。例えばリジンやシステインなどの反応性アミノ酸によりこれらのプローブへ共役させる方法は当業者に知られている。

エフェクタープローブ
エフェクタープローブは、望ましい診断、イメージング、及び／又は治療の効果を与えることのできるエフェクター部分を含む。前記エフェクタープローブは第２のターゲット部分を含む。

前記第２のターゲット部分は、利用可能な第２のターゲットの反応相手、即ち前記プレターゲットプローブ内に含まれる前記生体直交反応基を形成する前記エフェクタープローブの部分である。理解されるべきことは、前記第２のターゲットが前記式（１）のアキシャル置換ＴＣＯであるという範囲において、前記第２のターゲット部分はテトラジンなどのジエンであり、又はその逆である、ということである。

前記エフェクター部分は例えば検出可能なラベルであり得る。ここで使用される「検出可能なラベル」とは、前記エフェクタープローブの部分であり、例えば細胞、組織又は器官内に存在する場合に前記プローブの検出を可能にする部分を意味する。本発明の範囲に含まれる検出可能なラベルの１つのタイプは造影剤である。異なるタイプの検出可能なラベルが本発明の範囲に含まれ以下説明される。

従って、本発明の特定の実施態様によれば、本発明のプレターゲットキット及び方法はイメージングにおいて使用され、特に医用イメージングにおいて使用される。前記第１のターゲットを識別するために、エフェクタープローブとして、１以上の検出可能なラベルを含むイメージングプローブが使用される。前記イメージングプローブの検出可能なラベルの特定の例は、ＭＲＩ−イメージング可能構造体、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答構造体、Ｘ線応答部分、放射性核種、（生体）発光及びＦＲＥＴタイプの色素などの従来のイメージングシステムで使用される造影提供部分である。本発明に含まれる検出可能なラベルの例は、限定されるものではないが、蛍光分子、例えば自動発光分子、試薬に接触すると発光する分子、放射性ラベル；ビオチン、例えばアビジンによるビオチンの結合を介して検出される；蛍光タグ、常磁性金属を含むＭＲＩのためのイメージング構造体、米国特許第４、７４１、９００号及び５、３２６、８５６号に記載されたイメージング試薬を含む。イメージングに使用される放射性核種は、例えば ^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２Ｍｎ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｚｎ、^６２Ｃｕ、^６３Ｚｎ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７０Ａｓ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７４Ａｓ、^７５Ｓｅ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１４Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１２０Ｉ、^１２２Ｘｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１９３Ｐｔ、^１９５Ｐｔ、^２０１Ｔｌ及び^２０３Ｐｂからなる群から選択される同位体であり得る。

他の元素及び同位体で、治療のためなどに使用されるものはまた、ある応用においてイメージングのために適用され得る。

ＭＲＩイメージング可能部分は、例えば常磁性イオン又は超常磁性粒子であり得る。前記常磁性イオンは、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｔｌからなる群から選択される元素であり得る。超音波応答部分は、マイクロバブル、リン脂質からなるシェル及び／又は（生分解性）ポリマー、及び／又はヒト血清アルブミンを含み得る。前記マイクロバブルは、フッ化ガス又は液体で充填され得る。

Ｘ線応答部分は、限定されるものではないが、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィンを含み、又ベシクル、リポソーム又はヨウ素化合物及び／又は硫酸バリウムで充填されたポリマー性カプセルを含み得る。

さらに、本発明に含まれる検出可能なラベルはまた、抗体結合により、例えば検出可能なラベル化抗体の結合により又はサンドイッチタイプのアッセイにより結合抗体を検出することにより、検出され得るペプチド又はポリペプチドを含む。１つの実施態様では、検出可能なラベルは小さいサイズの有機ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴラベル、例えば ^１８Ｆ、^１１Ｃ又は^１２３Ｉである。この小さいサイズにより、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴラベルは、細胞内事象をモニターするのに理想的に好適であり、というのはそれらは一般に前記ターゲット装置の特性及び特にその膜輸送へ大きくは影響しないからである。ＰＥＴラベル及び第２のターゲット部分としていずれかの前記レトロディールスアルダー活性部分を含むイメージングプローブは脂質親和性であり、結合相手を見出すまで細胞内を又は細胞から受動的に拡散され得る。さらに、両方の成分は、血液脳関門の横断を排除せず、従って脳内の領域をイメージングすることを可能にする。

前記エフェクタープローブが、ランタニド（例えばＧｄ）などの金属に基づくＭＲＩの造影強化のための脱着可能なラベルを含むことができ、これは好ましくはキレートに形で提供される。かかる場合には、エフェクタープローブは好ましくは、かかる金属と配位錯体を形成し得る構造部分を持つ。ここで好ましい例は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（Ｈ_４ｄｏｔａ）、及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−α，α’，α’’，α’’’−テトラメチル−１，４，７，１０−四酢酸（Ｈ_４ｄｏｔｍａ）から誘導される大環状ランタニド（ＩＩＩ）キレートである。

前記エフェクター部分はまた、医薬活性化合物などの治療部分である得る。医薬活性化合物の例はここで与えられている。治療プローブは、場合によりまた検出可能なラベルを含む。

従って、他の実施態様によると、本発明の前記プレターゲットキット及び方法は、ターゲット治療に使用される。これは、第２のターゲット部分及び１以上の医薬活性試薬（即ち、医薬又は放射線治療での放射性同位元素）を含むエフェクタープローブを利用することにより達成される。ターゲット医薬輸送において使用するための好適な医薬は当技術部分野で知られている。場合により、治療プローブはまた、１以上のイメージング試薬などの検出可能なラベルを含むことができる。治療のために使用される放射性同位核種は、例えば、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ、及び^２２５Ａｃからなる群から選択される同位体であり得る。

あるいは、治療プローブ内の医薬は、光動的治療のための増感剤から選択される。

あるいは、前記治療プローブは、インビボで治療実体、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又はその他の内因性構造体、例えばタンパク質に結合する認識部分を含む。

エフェクタープローブにおいて、前記第２のターゲット部分、即ち第２の生体直交反応基及び前記エフェクター部分は、お互いに直接リンクされ得る。これらはまた、リンカーを介してお互いに結合され、さらにこれらは共に第２のターゲット足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に結合され得る。上で考察したように、前記リンカーは、独立して、同じ部分、例えば前記のポリエチレングリコールから選択されることができる。前記第２のターゲット足場は、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーであり得る。

本発明はまた、レトロディールスアルダー反応を用いるプレターゲット方法に関する。ここで、好適なジエン、好ましくは前記式（２）から（５）のいずれか１つの化合物で、又は前記式（１）のシクロオクテンでそれぞれ官能基化された第１のターゲット部分を含むプレターゲットプローブ（例えば抗体及び抗体断片又はレセプター結合ペプチド）を対象物に注入する。前記ターゲット（例えば初期の（primary）又は転移性腫瘍性病変、動脈硬化性プラーク、梗塞領域、炎症又は感染サイトなど）への結合及び前記循環及び非ターゲット組織（例えば血液、肝臓、脾臓、腎臓など）からの除去の後、例えばＥ−シクロオクテン又はテトラジン誘導体（即ち、前記プレターゲットプローブ内の前記生体直交反応基の対向反応相手）をそれぞれ担持する第２のターゲット部分、及び医薬又はイメージング可能ラベルを含むエフェクタープローブが注入される。前記エフェクタープローブは前記第１のターゲット部分に結合し、且つ高いコントラストを提供し、又は前記疾患サイトを選択的に治療する。

本発明はまた、疾患（感染や癌など）の際にアップレギュレートされる一般的な代謝経路、例えばＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物取り込みなどのターゲット化に関する。好適なプローブは、当該技術で現在使用されている代謝トレーサーに類似する、ジエン又はジエノフィルラベル化アミノ酸、糖、核酸及びコリン、［ ^１１ Ｃ］−メチオニン、［ ^１８ Ｆ］−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、デオキシ−［ ^１８ Ｆ］−フルオロチミジン（ＦＬＴ）及び［ ^１１ Ｃ］−コリンを含む。高い代謝や増殖を行う細胞はこれらをより多く取り込む。この方法で、例えばテトラジン又はＥ−シクロオクテン誘導体がこれらの又は他の経路に入り細胞内及び／又は細胞上に蓄積される。十分な蓄積がなされ遊離プローブを洗浄した後、検出可能にラベル化された又は医薬担持（細胞透過性）テトラジンプローブ又はＥ−シクロオクテンプローブ（又は本発明により他のジエン／ジエノフィル担持プローブ）は、前記蓄積されたＥ−シクロオクテン、テトラジン代謝物それぞれに結合するために送られる。通常のＦＤＧ（フッ素１８フルオロデオキシグルコース）タイプのイメージングでの利点は、放射能を導入する前に前記ターゲット部分を高蓄積させる十分な時間があり、それにより前記ターゲットと非ターゲットとの比率を増加させることができる、ということである。又は、疾患に特異的な代謝経路及び／又は代謝物がターゲットされ得る。

本発明はまた、細胞内ターゲットのプレターゲットに関する。サイズが小さいことから、有機ＰＥＴラベル（１８Ｆ、１１Ｃ）は細胞内事象をモニターするために理想的であり、というのは一般に前記ターゲット装置及び特に（大きいかつ極性の放射性金属キレート構造共役と対照的に）前記膜輸送に対して大きな影響を与えないからである。本発明で使用される前記置換テトラジン部分及び前記Ｅ−シクロオクテンは、小さいことは必須ではなく、それらは比較的非極性であり、タンパク質、ｍＲＮＡ、シグナル伝達経路などの細胞内イメージングのために使用され得る。前記第２の（例えばＰＥＴ標識）置換テトラジン部分又はＥ−シクロオクテンプローブ（即ちエフェクタープローブ）は、その結合相手を見出すまで細胞内で又は細胞外へ受動的に拡散することができ、又は能動的な取り込み機構の対象となる。両方の成分が血液脳関門を横断することを排除しないので、これらの性質はまた、脳内でプレターゲットのためにレトロディールスアルダー反応の使用を可能にする。

本発明はまた、プレターゲットシグナル増幅及び／又は多価性装備に関する。少なくとも１つの第１のターゲット装置が、多数のテトラジン部分を含むデンドリマー、ポリマー又はナノ粒子へ共役される。レセプター結合後、核イメージング（例えば放射性金属キレート、放射性ハロゲンなど）又はＭＲＩ（例えばＧｄキレート）のための１以上の造影部分に共役された（１又はそれ以上の）シクロオクテンが注入される。その結果前記続くレトロディールスアルダー反応により、前記ターゲット組織でＭＲＩ造影剤は高濃度となる。さらに、前記ターゲットサイトでの多価性は、前記アキシャル置換ＴＣＯエフェクター共役の反応速度を増加させ、例えばＭＲＩ造影剤の効果的なターゲット蓄積を可能にする。当然、前記アキシャル置換ＴＣＯはまた、前記ターゲット装置共役で、及び前記レセプターと共役された前記テトラジン（又は本発明の他のジエン）で使用され得る。

共役経路及びキット
本発明はさらに、イメージング剤と医薬をペプチドなどのターゲット構造体に共役させる経路としてレトロディールスアルダー反応を使用することに関する。前記エフェクターは、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ核ラベル化合成基、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩ用金属錯体及び超音波イメージングのためのマイクロバブルを含みことができるが、しかしまた、放射線治療用α線及びβ⁻線放射体及び一般に細胞毒性抗癌剤を含み得る。前記イメージング剤／治療薬は、ペンダントテトラジン又はその他の好適なジエン部分で官能基化され、前記ターゲット基が前記アキシャル置換ＴＣＯ誘導体で官能基化されるか、又はそれらの逆が可能である。

現在の経路は特に核イメージング及び放射線治療のために試薬にとって有利である：放射性核の減衰の点から、最も時間を要するステップ（対象物の体内で実際のターゲット化）をプレターゲットステップとして実施することは有利である。本発明によれば、前記第２のターゲット化のための前記の非常に速いレトロディールスアルダー化学を得るためにアキシャル置換ＴＣＯの選択することで、既存の方法と比べてより短寿命の種を含む広い範囲の放射線核種を使用することを可能にする。アキシャル置換ＴＣＯ官能基化エフェクタープローブ及び好適なジエン、例えばテトラジン担持プレターゲットプローブは、インビボで、エフェクター部分（例えば放射性核）を持続的に血液循環させる必要がなく、非常に低い濃度でカップリングさせることを可能にする。理解されるべきことは、このことは、ジエン特にテトラジンと結合されたアキシャル置換ＴＣＯ担持プレターゲットプローブ、官能基化エフェクタープローブについても該当する、ということである。さらに、前記反応基は有利には安定であり、及び従って副反応を容易に生じることなくより長い寿命反応性を表す。

理解されるべきことは、前記方法は、患者へ放射線投与を最小化するなどの利点を与えるということである。またこれは、ＳＰＥＣＴ（即ち、シングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフ）剤の代わりにＰＥＴ（即ちポジトロンエミッショントモグラフ）剤の使用を可能にするということである。さらには前記増大した反応性は、インビボにおいてより低濃度で適用することを可能にする。

本発明は、特に、マルチモーダルイメージング、場合により同じターゲットを可視化させる異なるイメージング剤を用いる、マルチモーダルイメージングに好適である。又は前記イメージングプローブは、少なくとも２つの異なるラベルを有しマルチモーダルイメージングを可能にする。

本発明の前記改良［４＋２］レトロディールスアルダー化学の分子イメージングへの適用は、プレターゲット方法を、全てのタイプ及びサイズのターゲット構造体へ適用可能にするものである。これは、細胞内及び代謝イメージングが、プレターゲット蓄積から達成可能となる、高ターゲット蓄積及び低バックグランドにより、利益を得ることを可能にする。同様に、プレターゲットシグナル増幅方法、例えばポリテトラジン及び／又はポリアルキレンデンドリマー又はリポソームは、より小さく、かつより広範囲のターゲット装置を利用可能なものとする。

前記反応相手が非生物的であり生体直交性であることから、アキシャル置換ＴＣＯを前記ジエノフィルとして用いる［４＋２］レトロディールスアルダー反応を用いるプレターゲットは、内因性競合及び代謝／分館には邪魔されず安定な共有結合を可能にする。ターゲット代謝経路、及び例えば正常細胞に対して腫瘍細胞でその高い濃度の対応するテトラジン代謝誘導体は、高濃度の人工テトラジンレセプターの装備又は細胞中又はターゲット細胞の表面で他の化学的ハンドルの装備を可能にし、場合により低レベルであり得る内因細胞表面レセプターの使用を回避することを可能にする。

本発明のさらなる具体的実施態様はキットに関し、このキットは代謝前駆体とイメージングプローブを含み、より具体的には、前記イメージングプローブは検出可能なラベルを含み、これは通常のイメージングシステインで使用される造影剤である。かかる検出可能なラベルは、限定されるものではないが、ＭＲＩ−イメージング可能な構造体、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答剤、Ｘ線応答剤、放射性核及びＦＲＥＴ−タイプの色素が挙げられる。本発明の具体的な実施態様では、レポータープローブが使用される。かかるレポータープローブは、酵素の基質であり、前記酵素はより具体的には前記細胞には内因性でなく、遺伝子治療又は外部試薬の感染により導入されたものであり得る。ここで細胞又は組織に関して非内因性とは、前記遺伝子が天然には存在せず及び／又は細胞又は組織で発現しないものを意味する。又は、かかるレポータープローブは、レセプター又はポンプの方法で細胞内に導入された分子であり、内因性であるか、又は遺伝子治療又は外部試薬の感染により細胞内に導入されたものであり得る。又は前記レポータープローブは、細胞又は組織環境内である（変化）条件に反応する分子であり得る。

本発明はまた、前記キットのための試薬を含む。１つのかかる試薬は、プレターゲット剤であり、第１のターゲット部分及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の相手である。具体的な反応相手はこれまで説明されたものであり、即ち一般的には、電子欠乏性テトラジン又はその他の前記好適なジエンであるか、又は本発明によるアキシャル置換されたシクロオクテンのいずれかである。本発明はまた、これらの試薬を、ターゲット医用イメージング又はターゲット治療での使用に関し、及びかかる方法でのそれらの試薬の使用に関する。具体的には、本発明はこれらの試薬のプレターゲット方法での使用、及びかかる方法での使用のためのこれらの試薬に関する。他のかかる試薬は、イメージングプローブであり、検出可能なラベル及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。

本発明はまた、イメージングプローブに関し、検出可能なラベル及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。本発明はさらに、治療プローブに関し、医薬活性化合物及び生体直交反応基を含み、前記生体直交反応基が、［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手である。

本発明の一部はまた、プレターゲット方法であり、これは前記プレターゲット試薬を対象物に投与し、及び前記試薬を前記対象物のシステム内に、前記第１の対象物部分が第１のターゲットに到達する有効な時間の間循環させ、続いて非結合の試薬を前記体内から除去することを含む。通常このための時間は１２から９６時間であり、特に約４８時間である。

さらに、本発明はイメージング方法を提供するものであり、前記方法は、前記のプレターゲット方法を実行し、続いてまた本発明によるイメージングプローブを投与し、前記プレターゲット試薬及び前記イメージングプローブ中の前記生体直交反応基が ［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成させることを含む。同様に、本発明は、対象物内で、ターゲット医学治療の方法を提供し、前記方法は、前記プレターゲット方法を実行し、続いてまた本発明による治療プローブを投与し、前記プレターゲット試薬及び前記イメージングプローブ中の前記生体直交反応基が ［４＋２］レトロディールスアルダー反応の反応相手を形成させることを含む。

本発明はまた、前記イメージング又は治療方法で使用するための前記プレターゲット試薬を含む。

まとめると、レトロディールスアルダー化学に基づき、生体直交プレターゲット分子イメージング及び治療が患者に大きな利益をもたらす。一方で、これは、癌及び血液循環器系疾患の顕著な画像を取得することを可能にする。他方で、放射性化合物及び一般的に潜在的に毒性の医薬物の投与から生じる本来的な副作用は、疾患組織へ到達する有効用量が増加することから、大きく低減され得る。さらには、疾患を生じる追跡可能な分子事象の収集を大きく広げるものである。特にこの技術は、血管からずっと離れたターゲット組織へのアクセスを可能にし、情報の豊富な細胞内環境のイメージングを容易にするものである。

本発明は、以下の非限定的な実施例及び添付された非限定的な図面に基づいて説明される。

材料
全ての試薬及び溶媒は、市販品（試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、 Ａｃｒｏｓ、 ＡＢＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＭｅｒｃｋから入手、通常及び重水素化溶媒はＢｉｏｓｏｌｖｅ、 Ｍｅｒｃｋ及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）から入手し、特に記載されていない限りさらに精製することなく使用した。１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノトリアコンタン−３９−酸（２１）はＰｏｌｙｐｕｒｅから入手。^１１１Ｉｎ塩化物及び［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手した。水は蒸留して、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱イオン化（１８ＭΩｃｍ）した。前記ラベル緩衝液は、Ｃｈｅｌｅｘ−１００樹脂（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一晩処理し、次に０．２２μｍを通して４℃で貯蔵した。Ｉｏｄｏｇｅｎヨウ素化チューブ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイのキット、ゲルコード青色タンパク質染色溶液及びＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａＭＷカットオフ、０．５−２ｍＬ）はＰｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を調製するための錠剤はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ （Ｍｅｒｃｋ）から入手した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４及びＵｌｔｒａ−１５遠心濾過ユニット（５０ｋＤａＭＷカットオフ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。マウス血清はＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。テトラジン２８の合成及び放射性ラベル化は、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５」に記載の方法で実施した。

方法
ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ_３又は［Ｄ_６］ＤＭＳＯ中で、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ３００スペクトルメータ又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ６００スペクトルメータで測定した。^１３ＣＮＭＲ多重性（ｑ＝４級、ｔ＝３級、ｓ＝２級及びｐ＝１級）はＤＥＰＴパルスシーケンスを用いて識別した。高分解能ＥＳＩスペクトル（ＨＲＭＳ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置で、陽イオンモードで測定された。

分取用カラムクロマトグラフは、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ装置（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）によりＳｉｌｉＣｙｃｌｅシリカカラムを用いて行った。分取用ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００装置を用いて実施され、Ｃ１８Ｚｏｒｂａｘカラム（２１．２ｘ１５０ｍｍ、５μｍ粒子）で、水及びＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配を用いて行った。分析放射性−ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出装置（Ｒａｙｔｅｓｔ）を付けたＡｇｉｌｅｎｔ １１００システムを用いて行った。サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６Ｘ１５０ｍｍ、５μｍ粒子）に負荷し、０．１％ＴＦＡを含む水中でＭｅＣＮの直線的勾配（２分間は１９％ＭｅＣＮで、次に１１分間４５％ＭｅＣＮに増加）を用いて１ｍＬ／分で溶出した。、ＵＶ波長は２５４ｎｍｍと設定された。サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出装置（Ｒａｙｔｅｓｔ）を付けたＡｇｉｌｅｎｔ １２００システムを用いて行った。サンプルを、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ ２０００カラム（３００ｘ７．８ｍｍ、５μｍ粒子、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に負荷し、２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．８を用いて、１ｍＬ／分で溶出した。ＵＶ波長は２６０及び２８０ｎｍに設定された。

^１１１Ｉｎ及び^１７７Ｌｕラベル化の収率は、ＩＴＬＣ−ＳＧ ストリップ（Ｐａｌｌ）を使用する放射性ＴＬＣにより決定され、０．９％ＮａＣｌ水溶液中の２００ｍＭＥＤＴＡで溶出させ、発光イメージング装置（ＦＬＡ−７０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で画像化された。これらの条件で、遊離の１１１ＩＮ及び１７７Ｌｕは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方^１１１Ｉｎ／^１７７Ｌｕ−テトラジンは最初の位置にとどまった。^１２５Ｉラベル化収率はまた、ＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（Ｐａｌｌ）を使用する放射性ＴＬＣにより行い、１：１ＭｅＯＨ／酢酸エチル混合物で溶出させ、発光イメージング装置上で画像化された。この条件で、遊離の^１２５Ｉ及び^１２５Ｉ−ＳＨＰＰは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方^１２５Ｉ−ｍＡｂは最初の位置にとどまった。

等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥは Ｐｈａｓｔｇｅｌシステムを用いて、ＩＥＦ−３−９ゲル及び７．５％ＰＡＧＥ均一ゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそれぞれ使用して行った。前記ＩＥＦ標準溶液（広いＰＩ、ｐＨ３〜１０）はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手し、タンパク質ＭＷ標準溶液（精度及び色標準）はＢｉｏＲａｄから入手した。電気泳動で、前記ゲルを２時間ゲルコード青で染色し、水中で脱染色し、次に慣用のフラットベッドスキャナーでデジタル化した。

ＣＣ４９の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００スペクトルメータ（吸収波長２８０ｎｍ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＢＣＡ試験で決定された。

ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデル。ヒト大腸癌細胞下部ＬＳ１７４ＴはＡＴＣＣから入手し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを追加したＥａｇｌｅの最小必要培地（Ｓｉｇｍａ）中に保持した。ヌードメスＢａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中の５ｘ１０^６細胞を皮下接種した。

実施例１
図３ａで概要が示される抗体へテトラジン誘導体部分をリンクする例として、分子１（図５参照）が合成された。Ｅ−シクロオクテンから誘導される、対応するプローブ２の例は、図６で表される。両方の分子はＰＥＧ鎖を含む。分子１はＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分を含み、これは前記抗体中のアミノ基を持つ前記分子とカップリングするために使用される。分子２のＤＯＴＡ誘導部分は、ＭＲイメージングのためのＧｄ又は核イメージング及び治療（ＳＰＥＣＴ）のためのＬｕ−１７７などの希土類金属イオンを担持するために使用され得る。

１の合成は図５に概説されている。出発テトラジン誘導分子５は、 Ｂｌａｃｋｍａｎらの「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９）」に」より合成された。これは、無水グルタル酸との反応で酸６に変換され、次にそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７へ変換される。このＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、市販（ＩＲＩＳ ｂｉｏｃｈｅｍ）のＰＥＧ誘導体８と反応させて酸９とし、さらにそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１に変換する。

２の合成は図６に概説されている。（Ｅ）−シクロオク−４−テノールは、Ｙａｐらの「Ｙａｐ、ＧＰＡ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（１２）、３７６０−６１）」により合成した。市販（Ａｌｄｒｉｃｈ）のイソシアネート誘導体１１で、これはエステル１２へ変換され、次に加水分解されて酸１３へ変換される。１３から形成されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４は、ＤＯＴＡ及びＰＥＧ誘導アミン１８との反応で最終生成物２が合成される。ＤＯＴＡ誘導体１８は前記１７の脱保護の後合成され、１７はＤＯＴＡＫＥＮ誘導体１５とＰＥＧ誘導体１６から合成され、両方共市販品が利用できる（それぞれＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ及びＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手）。

実施例２
この例は実施例１の分子の逆対（ペア）を示す、前記抗体へ共役した後前記プレターゲット部分を形成するための前記Ｅ−シクロオクテン誘導体３は図７に示されている。前記テトラジン／ＤＯＴＡ誘導体プローブ４は、図３ｂで概説されるエフェクタープローブとして作用し得るものであり、図８に示される。

Ｅ−シクロオクテン誘導体３は、市販（ＩＲＩＳ ｂｉｏｃｈｅｍ）のＰＥＧ誘導体８（図５参照）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４との反応により酸１９を形成し、次にこの酸からＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を形成する（図７）。

前記テトラジン／ＤＯＴＡ誘導プローブの合成は図８に概説されている。このプローブは、ＤＯＴＡとＰＥＧ誘導体アミン１８（図６参照）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル７（図５参照）との反応で合成される。

実施例３
この例は図９に示され、（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（シクロオク−４−テン−１−イルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（ＴＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ_１０−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、メジャー及びマイナー異性体、それぞれ２３ａ及び２３ｂ）の合成のスキームを示す。

本化合物の（数字）ａはＥ−メジャー異性体、及び本化合物の（数字）ｂはＥ−マイナー異性体を表す。

（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（（シクロオク−４−テニルオキシ）メチル）ベンゾエート（２０ａ）。（Ｅ）−シクロオク−４−テノール（約１３％のＺ異性体を含む、１０_ａメジャー異性体）は文献記載の手順「Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｇ．Ｐ．Ａ．Ｙａｐ、Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００８、１３０、３７６０）．」により合成した。

６０％の水素化ナトリウム分散物（１．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を、氷冷された、６０ｍＬのＤＭＦ中の１０ａ（１．７０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）に添加した。室温で４時間撹拌後、４−ブロモメチル安息香酸（３．８５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を小分けにして添加し、前記分散物を室温で一晩撹拌した。混合物を水（１００ｍＬ）に投入し、ｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて、さらに３７％塩酸水（５ｍＬ）を添加した。分離後、水層をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した（２ｘ１００ｍＬ）。有機層を集めて、水（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥して、蒸発させた。４：１ヘキサン／酢酸エチルを用いて、残渣を薄シリカ層に通した。蒸発後得られた残渣をヘプタン（５０ｍＬ）に７０℃での溶解させた後冷却して１９ａを得た。生成物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷し、次にＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０３ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。濾過して蒸発させた後、残渣はシリカのカラムクロマトグラフィにより、ヘプタン中の酢酸エチル勾配（０〜１５％）を用いて精製した。次に、残渣をｔ−ブチルメチルエーテル（２０ｍＬ）中に溶解し、これをヘプタン（５０ｍＬ）中に投入して、２０ａ（１．４２ｇ、２９％）を白色個体として得た。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．６０（ｍ、１Ｈ）、５．３４（ｍ、１Ｈ）、４．５４（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．４０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．０（ｑ）、１６１．５（ｑ）、１４６．７（ｑ）、１３５．１（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１３０．４（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２３．７（ｑ）、８５．３（ｔ）、６８．０（ｓ）、４０．５（ｓ）、３７．７（ｓ）、３４．２（ｓ）、３２．７（ｓ）、３１．４（ｓ）、２５．４（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_２０Ｈ_２３ＮＯ_５Ｎａ^＋（［Ｍ−Ｎａ］^＋）：３８０．１４７４、実測値：３８０．１４７２。

（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（シクロオク−４−テ−１−イルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（２３ａ）。

ジクロロメタン（２ｍＬ）中の２０ａ（１００ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷して撹拌されたジクロロメタン（２ｍＬ）中の２１（１７５ｍｇ、０．２８３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２９０μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）の溶液中に滴下した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。蒸発させて得られた粗中間物２２ａをジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解し氷冷した。ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル） カーボネート（１７０ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）及びピリジン（２８μＬ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物を濾過し、蒸発させ、生成物をシリカカラムクロマトグラフで、ジクロロメタン中のメタノール勾配（５〜１０％）を用いて精製し、２３ａを粘稠なオイル状物として得た（１１９ｍｇ、３９％）。
^１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．７９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．００（ｓ、１Ｈ）、５．５９（ｍ、１Ｈ）、５．３３（ｍ、１Ｈ）、４．４９（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４２（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．４０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６７．０（ｑ）、１６５．４（ｑ）、１６４．８（ｑ）、１４０．８（ｑ）、１３３．５（ｔ）、１３１．７（ｑ）、１３０．４（ｔ）、１２５．３（ｔ）、８３．４（ｔ）、６８．７（ｓ）、６８．４（ｓ）、６８．０（ｓ）、６７．６（ｓ）、６８．４（ｓ）、６３．９（ｓ）、３８．９（ｓ）、３７．９（ｓ）、３６．１（ｓ）、３２．６（ｓ）、３１．１（ｓ）、３０．３（ｓ）、２９．８（ｓ）、２３．７（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_４７Ｈ_７６Ｎ_２Ｏ_１８Ｈ^＋（［Ｍ−Ｈ］^＋）：９５７．５１７１、実測値：９５７．５１７４。

（Ｅ−マイナー）２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（（シクロオク−４−テニルオキシ）メチル）ベンゾエート（２０ｂ）。

（Ｅ）−シクロオク−４−テノール（１０ｂ、マイナー異性体）は前記文献の手順で合成された。６０％水素化ナトリウム（２．１ｇ、５３ｍｍｏｌ）を、氷冷した５０ｍＬテトラヒドロフラン中の１０ｂ（２．５３ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）の溶液中に添加した。室温で４時間撹拌後、混合物を再び冷却し、そこに４−ブロモメチル安息香酸（４．５３ｇ、２１．１ｍｍｏｌ）を小分けにして５分間で添加した。２５ｍＬのテトラヒドロフランを添加し懸濁液を室温で４日間撹拌した。氷を添加し、次に１２．０ｇのクエン酸を添加した。混合物を２回１５０ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した。有機層を２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して溶媒を揮発させた。残渣は、８０ｇのシリカゲルクロマトグラフで、溶出液としてヘプタン中の酢酸エチルの量を徐々に増加させて精製した。生成物の分画（生成物と出発物質アルコールとの完全な分離ではない）を集め、約３０ｍＬヘプタン（−１５０℃へ冷却）から再結晶させて、白色固体として１９ｂを得た（０．８６ｇ、１７％）。これをジクロロメタン４０ｍＬに溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４８ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷で冷却した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．８０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０分間氷冷して撹拌し、次に室温で１８時間撹拌した。濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、ロータリーエバポレータ処理し、残渣を２５ｇのシリカゲル上で、溶出液ヘプタン−酢酸エチルを使用するクロマトグラフィにより生成物を得た。蒸発生成物画分を７５ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルと混合し、混合物を６０℃に温めて溶液を作った。前記溶液を２０ｍＬへ濃縮した。ここにヘプタンをゆっくりと添加することで生成物を沈殿させた。濾過して集め、ヘプタンで洗浄して、１．０５ｇの２０ｂを得た（１５％）。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．７３（ｍ、１Ｈ）、５．５２（ｍ、１Ｈ）、４．６０（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．１０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．０（ｑ）、１６１．５（ｑ）、１４６．７（ｑ）、１３５．１（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１３０．４（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２３．７（ｑ）、８５．３（ｔ）、６８．０（ｓ）、４０．５（ｓ）、３７．７（ｓ）、３４．２（ｓ）、３２．７（ｓ）、３１．４（ｓ）、２５．４（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_２０Ｈ_２３ＮＯ_５Ｎａ^＋（［Ｍ−Ｎａ］^＋）：３８０．１４７４、実測値：３８０．１４７２。

（Ｅ−マイナー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）メチル）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート（２３ｂ）
この化合物は、２０ｂを出発物質として２３ａと同様の方法で得られた。２３ｂは粘稠オイルとして９３％収率で得られた。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．８０（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、５．６７（ｍ、１Ｈ）、５．５５（ｍ、１Ｈ）、４．５７（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４９Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．４３−０．９０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．２．０（ｑ）、１６７．６．４（ｑ）、１６７．０（ｑ）、１４３．４（ｑ）、１３６．２（ｔ）、１３３．８（ｑ）、１３１．６（ｔ）、１２７．４（ｔ）、１２７．１（ｔ）、７４．７（ｆ）、７１．１（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．２（ｓ）、７０．１（ｓ）、６６．１（ｓ）、４０．５（ｓ）、４０．１（ｓ）、３４．９（ｓ）、３３．３（ｓ）、３２．５（ｓ）、３０．２（ｓ）、２８．０（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_４７Ｈ_７６Ｎ_２Ｏ_１８Ｈ^＋（［Ｍ−Ｈ］^＋）：９５７．５１７１、実測値：９５７．５１７９．
実施例４
この実施例は、（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニイルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエートの合成スキームを表す図１０において説明される。

前記化合物（数字）ａはＥ−メジャー異性体を、及び化合物（数字）ｂはＥ−マイナー異性体を示す。

（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（（（シクロクオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）ベンゾエート１４ａ
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（９．５０ｇ、０．０４６ｍｏｌ）を、小分けして、氷冷した４−アミノ安息香酸（５．８４ｇ、０．０４３mol）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５．０ｇ、０．０４４ｍｏｌ）と６０ｍＬのイソプロパノールとの混合物に添加した。室温で１６時間撹拌後、前記懸濁物を濾過し、得られた固体をイソプロパノール６０ｍＬ中でさらに１時間撹拌した。濾過及び真空乾燥して得られた粗固体生成物２４を１００ｍＬのジクロロメタンと混合し氷冷した。トルエン中の２０％ホスゲン溶液（２６ｍＬ、４９．４ｍｍｏｌ）を添加及び３０分間撹拌後、溶液を得た。蒸発させて得られた固体を１００ｍＬのトルエンで２回洗浄し、高真空乾燥した。４．０３ｇの２５（３６％）が白色固体として得られた。固体を小分けして、３５ｍＬのジクロロメタン中１０ａ（１．４０ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。懸濁液を一晩撹拌し、その後２時間４０℃に暖めた。これをシリカ上でジクロロメタンで溶出し、次いでトルエンから再結晶させた後、固体の１．７７の１４ａ（４１％）を得た。得られた生成物は約１２％のＺ異性体を含み、これはクロマトグラフ又は再結晶では除去できなかった。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．０６（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．５１（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、６．８２（ｍ、１Ｈ）、５．５７（ｍ、２Ｈ）、３．４８（ｍ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、４Ｈ）、２．４０（ｍ、３Ｈ）、２．２３−１．５０（ｍ、７Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．７（ｑ）、１６１．６（ｑ）、１５２．７（ｑ）、１３５．２（ｔ）、１３３．４（ｔ）、１３２．５（ｔ）、１１９．４．０（ｑ）、１１７．９（ｔ）、８２．３（ｔ）、４１．３（ｓ）、３８．９（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．８（ｓ）、３１．３（ｓ）、２６．０（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_２０Ｈ_２２Ｎ_２Ｏ_６Ｎａ_＋（［Ｍ−Ｎａ］_＋）：４０９．１３７６、実測値：４０９．１３７２
（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキソ−２−アザヘンテトラコンタ−４１−ノエート２７ａ
ジクロロメタン（２ｍＬ）中の１４ａ（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）溶液を、氷冷撹拌されたジクロロメタン（２ｍＬ）中の２１（１６０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４００μＬ、２．９ｍｍｏｌ）へ滴下した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。蒸発させて得られた粗中間物２６ａをジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷した。ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（８９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を濾過し、３ｍＬの水で３回、３ｍＬの食塩水で１回抽出した。硫酸マグネシウム上で乾燥した後、溶媒を揮発させて、粘稠なオイルとして１．２３ｇの２７ａを得た（４７％）。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．７７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、１Ｈ）、５．５６（ｍ、２Ｈ）、４．４６（ｍ、１Ｈ）、３．８４（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．５０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．２（ｑ）、１６７．２（ｑ）、１６７．１（ｑ）、１５３．２（ｑ）、１４１．６（ｑ）、１３５．２（ｔ）、１３３．４（ｆ）、１２９．３（ｑ）、１２８．６（ｔ）、１１８．１（ｔ）、８１．７（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．２（ｓ）、６６．１（ｓ）、．４１．４（ｓ）、４０．１（ｓ）、３８．９（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３２．５（ｓ）、３１．４（ｓ）、２８．４（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_４７Ｈ_７５Ｎ_３Ｏ_１９Ｈ^＋（［Ｍ−Ｈ］^＋）：９８６．５０７３、実測値：９８６．５０８５．
（Ｅ−マイナー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）ベンゾエート１４ｂ
この化合物は、１４ａと類似の方法で、出発物質を１０ｂとして、収率３２％で得られた。１０ｂが純粋に得られたことから、この生成物はＺ異性体を含まなかった。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．０４（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１（ｓ、１Ｈ）、５．６１（ｍ、２Ｈ）、５．０５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、４Ｈ）、２．３６（ｍ、４Ｈ）、２．２３−１．２０（ｍ、６Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．８（ｑ）、１６１．６（ｑ）、１５２．７（ｑ）、１４４．６（ｑ）、１３５．７（ｔ）、１３２．５（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１１９．４．０（ｑ）、１１８．０（ｔ）、７２．１（ｔ）、４１．３（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３０．３（ｓ）、２８．５（ｓ）、２６．０（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_２０Ｈ_２２Ｎ_２Ｏ_６Ｎａ^＋（［Ｍ−Ｎａ］^＋）：４０９．１３７６、実測値：４０９．１３６７．
（Ｅ−マイナー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル １−（４−（（（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８−ドデカオキサ−２−アザヘンタトラコンタ−４１−ノエート２７ｂ
この化合物は出発物質１４ｂを用いて２７ａと類似の方法で８９％収率で得られた。
^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１_３）：δ＝７．７９（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．４４（ｓ、１Ｈ）、６．９０（ｍ、１Ｈ）、５．６０（ｍ、２Ｈ）、５．０３（ｍ、１Ｈ）、３．８３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．８−３．５（ｍ、４８Ｈ）、２．８９（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）、２．５０−１．２０（ｍ、１０Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６９．２．０（ｑ）、１６７．２（ｑ）、１６７．０（ｑ）、１５３．２（ｑ）、１４１．６（ｑ）、１３５．７（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１２９．３（ｑ）、１２８．５（ｔ）、１１８．３（ｔ）、７１．０（ｓ）、７０．９（ｓ）、７０．６（ｓ）、７０．１（ｓ）、６６．０（ｓ）、．４１．４（ｓ）、４０．１（ｓ）、３４．６（ｓ）、３２．９（ｓ）、３２．５（ｓ）、３０．３（ｓ）、２８．４（ｓ）、２５．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_４７Ｈ_７５Ｎ_３Ｏ_１９Ｈ^＋（［Ｍ−Ｈ］^＋）：９８６．５０７３、実測値：９８６．５０５８．
実施例５
テトラジン放射性ラベル化
ＤＯＴＡ共役テトラジン（２８；図１２、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５」に記載）を、０．２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．０中に溶解し、使用前に−８０℃で保存した。２８の一定量を［^１１１Ｉｎ］塩化インジウム又は、［^１７７Ｌｕ］塩化ルテチウムの適切な量と組み合わせて、ゆっくりと撹拌しつつ３７℃で１０分間インキュベートした。次に、５μＬの１０ｍｍＤＴＰＡを添加して溶液をさらに５分間インキュベートした。支持体添加ラベル化反応を、前記テトラジンに対して０．９モル当量のＩｎＣｌ_３又はＬｕＣｌ_３を添加することで実施した。通常は定量的ラベル収率及び９８％を超える放射化学純度がこの方法で得られた。

トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）ＮＨＳエステル１４、２０、２３、２７とのｍＡｂ共役
ここで、続くステップと同様、全ての化合物の数字は、前記ａ異性体もｂ異性体も意味するものとする。

通常、１ｍｇのＣＣ４９（５ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）が、２５０μＬＰＢＳの全容積内、ＴＣＯ−ＮＨＳ構造体０．６モル（動力学測定）又は１０モル当量（インビボ研究）で変性される。ｐＨは１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で９に調節された。反応は、暗室で室温３０分間撹拌下実施された。続いて、ＴＣＯ−変性ｍＡｂをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心装置を用いてＰＢＳで激しく洗浄した。抗体あたりのＴＣＯ基の数は、以下概説するテトラジン滴定で決定された。

テトラジン−ＤＯＴＡ２８は担持体付加_１７７Ｌｕで放射線ラベル化された。約０．６モル当量のＴＣＯで変性されたｍＡｂ（２５μｇ）を、３モル当量の ^１７７Ｌｕ−２８（０．５ｎＭ）と反応させた。約１０モル当量のＴＣＯで変性されたｍＡｂ（２５μｇ）を、１５モル当量の ^１７７Ｌｕ−２８（２．５ｎＭ）と反応させた。前記反応は、５０μＬのＰＢＳｐＨ７．４中で、３７℃で１０分間行った。反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び蛍光イメージャで分析され、反応収率は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射線から決定された。計数（カウント）はＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を用いて定量化された。前記ＴＣＯ−ｍＡｂ共役収率は、８０〜９０％の範囲であることが見出された。
ｍＡｂ放射性ラベル化
５０μＬのＰＢＳ中の［^１２５Ｉ］ヨウ化物（５〜１５ＭＢｑ）の適切な量に、ＤＭＳＯ中のＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｎ−スクシミジル−３−［４−ヒドロキシフェニル］プロピオネート（ＳＨＰＰ））の１ｍｇ／ｍＬ溶液の１μＬ、及びＰＢＳ中のクロラミン−Ｔ（Ｎ−クロロ−４−メチルベンゼンスルホンアミド、ナトリウム塩）の４ｍｇ／ｍＬの２５μＬを添加した。得られた溶液を１０〜２０秒混合して、５μＬＤＭＦ及び１００μＬトルエンをバイアルに投入し、及び^１２５Ｉ−ＳＨＰＰを有機層に抽出し、次にこれをガラスバイアルに移した。トルエンをＮ_２のゆっくりとした流れで除去し、その後ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液（５０〜２５０μＬＰＢＳ中の０．１〜０．５ｍｇ）を加え、ｐＨを１Ｍ炭酸塩緩衝液で９に調節し、及び反応混合物を室温で３０分間ゆっくりと振り混ぜながらインキュベートした。インキュベート後、前記ラベル化収率を放射性−ＩＴＬＣで決定した。粗反応混合物を次に、生理食塩水で前平衡化させたＺｅｂａスピン脱塩カラムに負荷した。前記反応バイアルを２０μＬ生理食塩水でリンスし、リンスされたものも前記カラムに同様に負荷した。Ｚｅｂａ精製後、^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液の放射性純度を放射性−ＩＴＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定し；タンパク質濃度はＢＣＡアッセイで決定した。

通常、この手順で、７０％を超える^１２５Ｉ−ＳＨＰＰｍＡｂ共役及び、精製^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの放射性純度は９８％を超えるものが得られた。
反応速度
テトラジンＤＯＴＡ２８は、比活性３ＭＢｑ／μｇの担持体付加^１７７Ｌｕで、放射線ラベル化した。^１７７Ｌｕ−２８（３３ｎＭ）は、ｐＨ７．４の２００μＬのＰＢＳ中で３７℃５分間１当量のＴＣＯで変性されたＣＣ４９と増加する濃度（０．３３、１、及び１．６７μＭ）で反応させた。選択された時間で（１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０及び３００秒）、２０μＬのサンプルを取り出し、テトラジン６（図５；Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５」に記載）で失活させた（ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍＬの１．５μＬ）。それぞれの混合物の一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び蛍光イメージャで分析し、シクロ付加反応収率は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射能から決定された。係数（カウント）は、ＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）で定量化した。

実施例６
インビボでのトランスシクロオクテン安定性
無腫瘍性マウス（群あたりｎ＝３）に、ＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２３ａ；ＣＣ４９あたり８．４ＴＣＯ；マウス当たり３００μｇ／１００μＬ）、ＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−２７ｂ；ＣＣ４９あたり３．３ＴＣＯ；マウス当たりμｇ／１００μＬ）及びスペーサーなしＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ；ＣＣ４９あたり８．０ＴＣＯ；マウス当たり３００μｇ／１００μＬ）を静脈注射した。選択された時点（注射後、１時間から４日まで）で、伏在静脈から血液サンプルが取り出され、ヘパリン含有バイアルに集められた。血液サンプルを秤量し、過剰の^１１１Ｉｎ−テトラジン２８が添加された。３７℃で２０分間インキュベートした後、一定量の血液がＰＢＳで１０倍希釈されＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。シクロ付加収率は、ｍＡｂに対応するバンドでの放射能から決定され、係数（カウント）はＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアで定量化された。それぞれの時点で血液中に存在するｍＡｂの量（％ＩＤ／ｇ血液）が対応する^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（マウス当たり３００μｇ／１００μＬ、約０．２ＭＢｑ）を注射されたマウス（ｎ＝３）の３つの別の群で評価された。データは、ｍＡｂのクリアランスが補正され、ｔ＝０で１００％ＩＤＴＣＯに標準化された。

この実験の結果は、ＰＥＧ１０スペーサーを介してＣＣ４９へＴＣＯが共役された構造体を注射された両方の群のマウスにおいて、血液からのｍＡｂクリアランスによるＴＣＯの生理的減少の他に、時間と共に循環する反応性ＴＣＯ基の量がさらに減少した、ということを示す（図１２Ａ及びＢ）。これは、スペーサーなしでＴＣＯがｍＡｂと共役された構成物を注射されたマウスの場合では起こらなかった。このことは、前記ＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯ構成物に関してインビボでスペーサーなしのＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の高い安定性を示唆する。

実施例７
生体内分布実験
二重同位体生体内分布実験が、ＰＥＧ_１０スペーサー有り及び無しの^１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物を腫瘍保持マウス（ｎ＝３）に静脈内注射し（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．２ＭＢｑ）、２４又は７２時間後、^１１１Ｉｎ−テトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、約０．８ＭＢｑ））を注射して実施した。テトラジン投与後３時間、動物をイソフルランで麻酔し頚椎脱臼により屠殺した。血液を心臓穿刺により取り出し、対象となる器官及び組織を取り出し、ドライブロッティングし秤量した。サンプルの放射能は、％ＩＤ／ｇを決定するための標準品と共にγ計数器で測定した。エネルギー窓は、^１２５Ｉ及び^１１１Ｉｎについてそれぞれ、１０〜８０ｋｅＶ、１００〜５１０ｋｅＶとした。放射性ラベル化ｍＡｂ及び^１１１Ｉｎ−テトラジンの分布が表２〜５に示される。

前記生体内分布データは、前記第１のＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯ−Ｏメジャー２３ａに関してスペーサーの無いＣＣ４９−ＴＣＯ構成物のインビボでのより高い安定性を確認する。テトラジンの注射前にＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯＯ（ＣＣ４９−２３ａ）で処理されたマウスでは、腫瘍内に存在する高いｍＡｂ量（１５．８１±０．２２％ＩＤ／ｇ）は、前記ＴＣＯ及びテトラジンとの反応により、３．０９±０．０１％ＩＤ／ｇの^１７７Ｌｕ蓄積を与える結果となった（表３）。残念なことに、１７７Ｌｕ−テトラジンと血液中循環する高濃度のｍＡｂ−ＴＣＯとの反応はまた、低腫瘍対血液比率（Ｔ／Ｂ＝３．１±１．０）を与える結果となった。前記Ｔ／Ｂは、前記放射性ラベル化テトラジンがｍＡｂ後４日で投与される場合には、ｍＡｂクリアランスにより改善された（２１．３±４．０）。しかしこの時点では腫瘍中には約４倍低い^１７７Ｌｕ−テトラジン蓄積がまた観測された（０．８６±０．３９％ＩＤ／ｇ）。絶対的なテトラジン蓄積の減少は、組織からｍＡｂ−ＴＣＯが放出された結果ではなく（１０．９９±４．２４ ％ＩＤ／ｇの^１２５Ｉ−ｍＡｂはなお腫瘍に存在する）、注射の間に４日間でインビボでのＴＣＯ分解によると考えられる。

逆に、前記マウスがＰＥＧ_１０スペーサーの無いＣＣ４９−ＴＣＯ構成物で処理される場合、^１１１Ｉｎ−テトラジンの腫瘍での取り込みの減少は、ｍＡｂ注射後１日に対してｍＡｂ注射後３日でも観測されなかった（表４〜表６）。同時に、前記Ｔ／Ｂ比率は、血液からｍＡｂ−ＴＣＯクリアランスのために約２から４以上に増加した。この時間の間の前記腫瘍結合ＴＣＯの維持された反応性は、前記第１のＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯに対してそのより高い安定性を強化する。

実施例８
イメージング実験
腫瘍保持マウスにＰＥＧ１０スペーサー無しのＣＣ４９−ＴＣＯ構成物を投与した後３又は４日後に^１１１Ｉｎ−テトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、２０〜５０ＭＢｑ）を注射した。約１時間後、マウスを麻酔し、麻酔のためのノーズコーンと呼吸モニターセンサを付けた動物ベッドに置いた。シングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフ（ＳＰＥＣＴ）は、４ヘッドマルチピンホール小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングシステム（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｉｎｃ．）を用いてテトラジン注射後２時間で実施した。前記ＳＰＥＣＴ取得（全１時間）は、１．４ｍｍ直径ピンホールで、及び１視野当たり１２０〜１４０秒の取得時間で実施された。^１１１Ｉｎのエネルギー窓は、２４５ｋｅＶ±１５％及び１７１ｋｅＶ±２０％に設定された。最初のスキャンから２から４日後、マウスを過剰麻酔により安楽死させ、第２のＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャンを一晩取得した。それぞれのＳＰＥＣＴ測定の前にＣＴスキャン（１投影当たり２秒、３６０投影）を実行して放射能分布の解剖学的情報を得た。前記取得後、データは製造者のソフトウェア（ＩｎＶｉｖｏＳｃｏｐｅ １．３９、 ｐａｔｃｈ １）で繰り返し再構成した。興味対象領域（ＲＯＩ）は手動で、腫瘍、肝臓、腎臓及び大腿筋で３回描かれた。既知量の^１１１Ｉｎを充填したファントムを、組織放射能定量化のためにスキャナーを較正するために使用した。ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏマイナー（ＣＣ４９−２０ｂ）、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ）及びＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−１４ｂ）を注射された３マウスのそれぞれの時間でのイメージが、図１３Ａ〜Ｃにそれぞれ示される。

図１３の左側は、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏマイナー（ＣＣ４９−２０ｂ）（Ａ）、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏメジャー（ＣＣ４９−２０ａ）（Ｂ）又はＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナー（ＣＣ４９−１４ｂ）（Ｃ）の注射の３から４日後に、^１１１Ｉｎ−テトラジン２８（マウス当たり２１μｇ／７５μＬ、約４０ＭＢｑ）を注射後２時間での生きたマウスのＳＰＥＣＴ／ＣＴ投影画像である。図１３の右側は、最初のイメージング実験の後２から４日後の同じマウスの死後ＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャンを示す。

マウスでの縦ＳＰＥＣＴ／ＣＴ研究は、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏ（メジャー及びマイナーの両方）での前処理後３日で腫瘍への^１１１Ｉｎ−テトラジン取り込みを示し、それによりこれらのＴＣＯ−構成物のインビボでの安定性を確認する（図１３Ａ及びＢ）。この時点で、非腫瘍結合のｍＡｂ−ＴＣＯのほとんどが循環系から除去され、従って、腫瘍以外の可視化される器官は、^１１１ＩＮ−テトラジン尿中排泄による腎臓及び膀胱のみである。重要なことは、血液中及び肝臓などの血液の多い器官には放射能が見られないということである。バックグランド放射能が非常に低いことは、前記第１世代のＣＣ４９−ＰＥＧ_１０−ＴＣＯで得られる結果に関して基本的な改善となり（Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．Ｒｅｎａｒｔ Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｓａｎｄｒａ Ｍ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、１．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄの「Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ２０１０、４９、３３７５）」参照）、これは患者の骨髄及び投与制限される器官へのより低暴露を与えることとなる。

注目すべきことは、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｏで処理されたマウスの腫瘍は、^１１１Ｉｎ−テトラジン注射後７２から９６時間でもなお高い放射能を持つということであり、これは前記ＴＣＯ−テトラジンシクロ付加生成物のインビボでの高い安定性を示唆するものである。後の時点で、いくらかの活性がなおマウス腎臓で見られ、いくらかが肝臓に蓄積されているが、これは抗原脱離、及びテトラジン注射の時点で血液中になお循環するｍＡｂの除去によると考えられる。長期間腫瘍での放射能が維持されることはまた、癌患者でプレターゲットＲＩＴが目的とされる場合に非常に重要となる。事実、治療用放射性核がより長くターゲット組織に結合すると、前記腫瘍へ輸送される容量は高くなる。
驚くべきことに、ＣＣ４９−ＴＣＯ−Ｃマイナーの投与の後に^１１１Ｉｎ−テトラジンを注射されたマウスではむしろ低放射能取り込みが観察されたということであり、これは前記２つの処置の間の４日の遅延によると考えられる（図１３Ｃ）。しかしこの場合においても、腫瘍でのシグナルは、最初のスキャン後２日でもなお存在し、このことはインビボでのディールスアルダー反応から得られるシクロ付加生成物のインビボでの安定性を確認するものである。

実施例９
この実施例は、トランスシクロオクテンの種々の位置での種々の置換基のインシリコ試験に関する。種々の置換シクロオクテンについて、ＨＯＭＯエネルギーをＭＯＰＡＣソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｓｔｗａｒｅ Ｍｏｐａｃ Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０３）を用いて計算された。得られた結果を以下表６に示す。
表６ 異なる置換基についてＭＯＰＡＣで決定されたＨＯＭＯエネルギー。
ここで（ａ）はアキシャル；（ｅ）はエカトリアルを示す。炭素原子は次の構造式により番号付けされている。

実施例１０
テトラジン２８の他の合成手順及び対応するＧｄ−錯体、２８−Ｇｄ
図１５に、５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−ｌ，４−ジヒドロ−１，２，４，５−ｔテトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタン酸（３０）の合成経路が示される。

６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，４−ジヒドロ−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−アミン（２９）は文献手順（Ｍ．Ｌ．Ｂｌａｃｋｍａｎ、Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ．Ｊ．Ｆｏｘ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８、１３０、１３５１８−１３５１９）に従って合成した。２９（４２８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び無水グルタル酸（２３１ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中混合物を６０℃に４０時間、アルゴン不活性雰囲気下で加熱した。冷却後、オレンジ色の沈殿をＴＨＦ（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥してオレンジ色固体として３０を得た（５３７ｍｇ、８７％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝１２．１（ｂｒ．ｓ、１Ｈ）、１０．３７（ｓ、１Ｈ）、８．９２（ｓ、１Ｈ）、８．８７（ｓ、１Ｈ）、８．８２（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１５（ｄｄ、Ｊ_１＝８．４Ｈｚ、Ｊ_２＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．０−７．９（ｍ、３Ｈ）、７．５３（ｄｔ、Ｊ_１＝１．８Ｈｚ、Ｊ_２＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．４３（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２９（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．８３（ｑ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝１７４．２、１７１．６、１４８．６、１４７．３、１４６．３、１４６．１、１４１．４、１３８．９、１３７．４、１３７．２、１２６．６、１２５．３、１２１．３、１２０．９、３５．３、３２．９、２０．２；ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_１７Ｈ_１８Ｎ_７Ｏ_３ ^＋（［Ｍ＋Ｕ］^＋）：３６８．１５、実測値：３６８．２５
５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタン酸（６）
化合物３０（１６６ｍｇ；０．４５２ｍｍｏｌ）を酢酸（３ｍＬ）中に懸濁させ、亜硝酸ナトリウム（９３．５ｍｇ；１．３６ｍｍｏｌ）を添加した。紫色懸濁液への急速な着色が観察された。撹拌１５分後、反応混合物を濾過し、水（２ｘ６ｍＬ）及びアセトン（３ｍＬ）で洗浄し乾燥して、紫色固体として生成物を得た（１５２ｍｇ、９２％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝１２．１３（ｓ、１Ｈ）、１０．５８（ｓ、１Ｈ）、９．０５（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．９４（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６０（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄｄ、Ｊ_１＝２．３Ｈｚ、Ｊ_２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１６（ｔｄ、Ｊ_１＝７．８Ｈｚ、Ｊ_２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３（ｄｄｄ、Ｊ_１＝１．１Ｈｚ、Ｊ_２＝４．４Ｈｚ、Ｊ３＝７．４Ｈｚ）、２．５０（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．３３（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．８６（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝１７４．１（ｑ）、１７２．０（ｑ）、１６３．０（ｑ）、１６２．７（ｑ）、１５０．６（ｔ）、１５０．２（ｑ）、１４３．８（ｑ）、１４１．３（ｔ）、１３８．４（ｑ）、１３７．７（ｔ）、１２６．５（ｔ）、１２６．１（ｔ）、１２４．８（ｔ）、１２４．１（ｔ）、３５．４（ｓ）、３２．９（ｓ）、２０．２（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_１７Ｈ_１６Ｎ_７Ｏ_３ ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）：３６６．１３１４、実測値：３６６．１３１３．
ｔｅｒｔ−ブチル（３７，４１−ジオキソ−４１−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサ−３６−アザヘンテトラコンチル）カルバメート（３１）
ＰｙＢＯＰ（１４８ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を、６（９４．４ｍｇ、０．２５８ｍｍｏｌ）、アミノ−ＰＥＧ_１０−アミノ−Ｂｏｃ（１５０ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）、及びＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（新規に蒸留した。１００ｍｇ、０．７７４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中混合物に０℃で添加した。混合物を室温に暖め、撹拌を１５分間続けた。透明、暗赤色溶液を揮発させて乾燥し、生成物をクロロホルム（５ｍＬ）に再度溶解させ、０．２ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ＝４．３、３．３ｍＬ）溶液及び飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（２．３ｍＬ）溶液で洗浄し、その後ジエチルエーテル（２０ｍＬ）中で沈殿させた。沈殿は遠心装置で収集し、シリカ上で、クロロホルム中のメタノールの勾配（０〜１０％）を用いてカラムクロマトグラフにより精製し、紫色ワックス状固体として３１を得た（１４８ｍｇ、６４％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝９．０７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．９７（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．７３（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．７２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６３（ｄｄ、Ｊ_１＝２．３Ｈｚ、Ｊ_２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０３（ｔｄ、Ｊ_１＝７．８Ｈｚ、Ｊ_２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５９（ｄｄｄ、Ｊ_１＝１．１Ｈｚ、Ｊ_２＝４．６Ｈｚ、Ｊ_３＝７．４Ｈｚ）、７．０１（ｓ、１Ｈ）、５．１４（ｓ、１Ｈ）、３．９−３．２（ｂｒｏａｄｓ、４８Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．０９（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．４３（ｓ、９Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ＝１７３．８（ｑ）、１７３．１（ｑ）、１６３．８（ｑ）、１６３．７（ｑ）、１５１．３（ｔ）、１５０．５（ｑ）、１４４．０（ｑ）、１４２．７（ｔ）、１３９．２（ｑ）、１３７．９（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２６．９（ｔ）、１２５．５（ｔ）、１２４．７（ｔ）、７９．５（ｑ）、７０．５（ｓ）、７０．１（ｓ）、４０．７（ｓ）、３９．７（ｓ）、３６．５（ｓ）、３５．５（ｓ）、２８．８（ｐ）、２１．９（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_４６Ｈ_７４Ｎ_９Ｏ_１５ ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）：９９２．５３０４、実測値：９９２．５３０１
２，２’ ，２’’−（１０−（２，４０，４４−トリオキソ−４４−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ウンデカオキサ−３，３９−ジアザテトラテトラコンチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（２８）
生成物３１（７２．３ｍｇ、０．０７２７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）中に溶解して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。蒸発させた後、残渣をアセトニトリル（１．５ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で沈殿させた。紫色沈殿をろ過して分離し、３２のＴＦＡ塩を定量的に得た。これをＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に溶解し、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（６９．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（新たに蒸留した４４ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分撹拌した。透明な暗赤色／紫色溶液を揮発させて、粗生成物を水に溶解し、分取用ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、２８（８０．５ｍｇ、収率８７％を超える）が得られた。
^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝９．２２（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、９．１０（ｄｄ、Ｊ１＝４．７Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．７８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．７５（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９（ｄｄ、Ｊ１＝２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３２（ｔｄ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．０８（ｄｄｄ、Ｊ１ｉ＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．７Ｈｚ、Ｊ３＝７．８Ｈｚ）、３．９−３．１（ｍ、８０Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．３４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ＝１７２．８（ｑ）、１７２．５（ｑ）、１６３．８（ｑ）、１６３．５（ｑ）、１５１．３（ｔ）、１５０．９（ｑ）、１４４．５（ｑ）、１４２．０（ｔ）、１３９．３（ｑ）、１３８．５（ｔ）、１２７．３（ｔ）、１２６．９（ｔ）、１２５．６（ｔ）、１２４．９（ｔ）、７０．５（ｓ）、７０．３（ｓ）、６９．９（ｓ）、６９．５（ｓ）、３９．２（ｓ）、３６．４（ｓ）、３５．２（ｓ）、２１．７（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_５７Ｈ_９２Ｎｉ_３Ｏ_２０ ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）：１２７８．６５８２、実測値：１２７８．６５５７
２８のＧｄ^ＩＩＩ−錯体（２８−Ｇｄ^ＩＩＩ）
化合物２８（２０４ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）を水溶性酢酸アンモニウム（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．５、５ｍＬ）中に溶解し、酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）水和物（９６．８ｍｇ、０．２３９ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を室温で３０分撹拌し、直ぐに分取ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、Ｇｄ^ＩＩＩ−錯体が、紫色固体として得られた（１８８ｍｇ、８２％収率）。ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：Ｃ_５７Ｈ_８９Ｎｉ_１３Ｏ_２０Ｇｄ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）：１４３３．５６、実測値：１４３３．５８．
実施例１１
新型テトラジンプローブの化学合成
他のテトラジン部分を持ついくつかのテトラジン型プローブが合成された。
合成経路は図１６に示されている。

３−（５−ブチルアミド−２−ピリジル）−６−（５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジル）−１２，４，５−テトラジン（３５）
２−シアノ−５−トリフルオロメチル−ピリジン（２００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、２−シアノ−５−アミノ−ピリジン（３００ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）及び硫黄（８０ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中、アルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（０．６０ｇ；１２．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８０℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、水（２ｍＬ）を添加した。遠心分離して得た固体を水／エタノール＝１／２で洗浄し、乾燥して粗生成物３３を１３５ｍｇ得た。遠心分離の上澄みを集めて水を加えることでさらに粗生成物バッチを沈殿させ（１８８ｍｇ）、遠心分離して乾燥させた。
この粗生成物アミン（３３）及び無水酪酸（２８５ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中で一晩６５℃で撹拌した。反応混合物を濃縮して残渣をヘキサン／ジエチルエーテル＝３／１中で撹拌した。この懸濁液をガラスフィルタで濾過し、残渣を、溶出液としてヘキサン／アセトン混合物を用いてシリカカラムクロマトグラフし、粗生成物３４（約６０％純度）を９０ｍｇ得た。前記粗アミド化ジヒドロテトラジン３４（６２ｍｇ）を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）と水（２．０ｍＬ）との混合物に懸濁させた。撹拌の間に、ＮａＮＯ_２（８８ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を添加し、その後水（１ｍＬ）中の硫酸（１３０ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）溶液を、０℃で滴下した。赤色懸濁液への急速な着色が観察された。撹拌３分後、反応混合物をクロロホルムと水で希釈し、紫色沈殿を得、これをガラスフィルタで濾過して分離した。濾液の有機層を濃縮し、ジエチルエーテルで希釈して、第２の紫色固体生成物を析出させた。固体を一緒にして、クロロホルム及びジエチルエーテルの混合物で粉砕し、濾過して、純粋なテトラジン３５（約２５ｍｇ、２−シアノ−５−トリフルオロメチル−ピリジンから計算して全収率８％）を得た。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝９．２（ｓ、１Ｈ）、８．９（ｄ、１Ｈ）、８．７５（多重シグナル、３Ｈ）、８．３（ｄ、１Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ）、１．８（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．^１９ＦＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝−６２．９ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピーク、ｍ／ｚ＝３９０．２（Ｍ＋Ｈ^＋）及び８００．８（２Ｍ＋Ｎａ^＋）、λ_ｍａｘ＝３２９及び５２６ｎｍ
３−（５−フルオロ−２−ピリジル）−６−（５−ブタンアミド−２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（３８）
２−シアノ−５−フルオロ−ピリジン（１００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、２−シアノ−５−アミノ−ピリジン（２００ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）及び硫黄（５５ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を、エタノール（１．５ｍＬ）中アルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（０．３５ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を９０℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、エタノール（５ｍＬ）を添加した。ガラスフィルタで濾過して固体を得、これをヘキサンで洗浄して、乾燥して、粗生成物３６を９０ｍｇ得た。

続いて、この組成アミン生成物３６及び無水酪酸（９３ｍｇ；０．５９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中で６５℃で撹拌加熱した。アルゴン下で一晩反応させた後、反応混合物を冷却し、いくらかのヘキサン（約３ｍＬ）で希釈してガラスフィルタで濾過した。残渣を、溶出溶媒としてヘキサン／アセトン混合物でシリカカラムクロマトグラフにより精製し、純粋なアミド化生成物３７（約２８ｍｇ、２−シアノ−５−フロロ−ピリジンから計算して全収率１０％）を得た。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝９．２５（ｂｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．７（ｓ、１Ｈ）、８．５（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．４（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｇｎａｌｓ、２Ｈ）、８．２（ｍ、１Ｈ）、８．１（ｍ、１Ｈ）、７．９５（ｍ、１Ｈ）、７．５（ｍ、１Ｈ）、２．４（ｔ、２Ｈ）、１．７５（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３Ｏ_Ｄ）：δ＝１７２．８、１６１．６、１５９．０、１４６．６、１４６．１、１４３．５（ｄ）、１４１．６、１３９．３、１３６．８、１３６．６、１３６．４、１２７．０、１２４．０、１２３．８、１２２．６、１２１．５、３８．９、１８．８、１３．５ｐｐｍ（Ｃ−Ｆカップリングによる、いくつかの炭素シグナルはダブレット）．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピークｍ／ｚ＝３４２．１（Ｍ＋Ｈ^＋）、λ_ｍａｘ＝２８８ｎｍ．
アミド化ジヒドロテトラジン３７（２８ｍｇ；０．０８２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２ｍＬ）及び水（２ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。撹拌の間に、ＮａＮＯ_２（８５ｍｇ；１．２３ｍｍｏｌ）、及び水（２ｍＬ）中の硫酸（１２０ｍｇ；１．２３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。紫色懸濁液への急速な着色が観察された。撹拌３分後、クロロホルムと水を添加した。紫色のクロロホルム層を水で２回洗浄し、濃縮した。固体表面対残渣を少量のクロロホルム中で撹拌し、そこにヘキサンを添加した。ほとんど無色の上澄みをデカントし、固体を乾燥させて２１ｍｇの紫色粉末（収率７５％）を得た。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝８．８（多重シグナル、５Ｈ）、７．７５（ｍ、１Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ）、１．８（ｍ、２Ｈ）、１．０５（ｔ、３Ｈ）ｐｐｍ．^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δ＝１７３．４、１６２．９、１６２．６、１６２．４、１５９．８、１４６．０、１４３．２、１４１．３、１３９．７ａｎｄ１３９．４、１３８．８、１２６．９、１２５．８（ｄ）、１２５．２、１２４．４、１２４．２、３９．０、１８．７、１３．５ｐｐｍ（Ｃ−Ｆカップリングによる、炭素シグナルのいくつかはダブレット）．^１９ＦＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３／ＣＤ_３ＯＤ）：δを＝−１２０．４ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムの１つのピークｍ／ｚ＝３４０．２（Ｍ＋Ｈ^＋）、λ_ｍａｘ＝３２４及び５２９ｎｍ．
３−（２−ピリジル）−６−メチル−１，２，４，５−テトラジン（４０）
２−シアノピリジン（５００ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、アセタミジンヒドロクロリド（２．００ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）及び硫黄（１５５ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）中でアルゴン不活性雰囲気下で撹拌した。ヒドラジン水和物（２．７ｇ；５５．２ｍｍｏｌ）を添加して混合物を２０℃で一晩撹拌した。混濁混合物を濾過し、濾液を蒸発乾燥させ、オレンジ色粗生成物３９を２．９ｇ得た。

続いて、この粗生成物（８００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）及び酢酸（４ｍＬ）の混合物中に懸濁させた。水（３ｍＬ９中のＮａＮＯ_２（２．０ｇ；２９．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。直ぐに赤／紫色懸濁液となった。０℃で５分間撹拌後、クロロホルムと水を添加した。紫色クロロホルム層を水で２回洗浄し、その後濃縮した。固体表面対残渣を、クロロホルムとヘキサンの１：１混合物中で撹拌し、その後濾過した。濾液を濃縮し、粗生成物を、クロロホルム／アセトン混合物を溶出溶媒として用いてシリカクロマトグラフで精製し、純粋な生成物４０を得た（４８ｍｇ、２−シアノピリジンから計算して全収率２１％）。
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．９６（ｄ、２Ｈ）、８．６５（ｄ、２Ｈ）、７．９９（ｔ、２Ｈ）、７．５６（ｄｄ、３Ｈ）、３．１７（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ．^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１６８．１．１６３．６、１５０．９、１５０．３、１３７．４、１２６．３、１２３．９、２１．４ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クロマトグラムから１つのピーク、ｍ／ｚ＝１７４．３（Ｍ＋Ｈ^＋）、λ_ｍａｘ＝２７４及び５２４ｎｍ．
３，６−ビス（４−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（４２）
４−シアノピリジン（８５８ｍｇ；８．２４ｍｍｏｌ）及びヒドラジン水和物（１．２４ｇ；２４．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン不活性雰囲気下で９０℃で１６時間加熱した。混合物を室温に冷却し、水で希釈した。オレンジ色の沈殿（４１）を濾過し、水（３ｍＬ）で洗浄し、続いてＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中に溶解した。ＤＤＣ（３７２ｍｇ；１．６４ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。直ぐに暗赤色溶液が観察された。６０分後、飽和水素化炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）を添加し、生成物をクロロホルムで抽出した（３０ｍＬ、３回）。有機層を集めてＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、蒸発させて乾燥して、表題の化合物をピンク色固体として得た（５２ｍｇ；４−シアノピリジンから計算した全収率５％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝８．９７（ｄ、４Ｈ）、８．５２（ｄ、４Ｈ）ｐｐｍ．ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ：クトマトグラムからの１ピーク、ｍ／ｚ＝２３７．２（Ｍ＋Ｈ^＋）、λ_ｍａｘ＝２７１及び５２３ｎｍ．
実施例１２
さらなるトランスーシクロオクテン構成物の化学合成
詳細な合成経路は図１７に示される。

（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−（シクロオク−４−テン−１−ニルオキシ）アセテート（４４ａ）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ａ（１．７３ｇ、１３．７３ｍｍｏｌ、約１０％のシス異性体が混入）の氷冷溶液に、オイル中の水素化ナトリウム（６０％、２．６０ｇ、６５．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１５分間混合物を撹拌した後、５０℃で１時間加熱した。混合物を氷冷し、ブロモ酢酸（２．５０ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を１時間氷冷して撹拌し、その後約２５℃で６４時間撹拌し、さらにＴＨＦを撹拌可能にするために添加した（合計約１００ｍＬ）。５０℃で１時間加熱後、混合物を冷却し水をゆっくりと添加した。ロータリーエバポレーターでほとんどのＴＨＦを除去し、さらに水を加えた（合計５０ｍＬ）。水性混合物を、ＭＴＢＥで抽出し（２ｘ７５ｍｌ）、その後有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。水性層を集めて、１６ｇのクエン酸で酸性化し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥しロータリーエバポレーターで除去し、残渣をカラムクロマトグラフで精製した（４０ｇ、ＳｉＯ_２）。生成物画分を集め、痕跡量のＭＴＢＥを含むヘプタンから再結晶させた。これにより８１０ｍｇの生成物４３ａを得た（８１０ｍｇ、４．４０ｍｍｏｌ、３２％少量のシス異性体を含む）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、３．９−４．１（ＡＢ、２Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
生成物４３ａを３０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（７１５ｍｇ、６．２２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（１．４２ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷して３０分撹拌し、その後室温で４時間撹拌した。濾過して、ロータリーエバポレーターで濃縮し、４０ｇのシリカ上で、ヘプタン／酢酸エチル勾配を使用するクロマトグラフにより、４４ａを得た。生成物画分を集め、少量のＭＴＢＥを含むヘプタンから再結晶した。生成物はこすると結晶化した。濾過後、生成物１８０ｍｇが得られた（０．６４ｍｍｏｌ、１５％、シス異性体が約２０％混在）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、４．３（ｓ、２Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−（シクロオク−４−テン−１−ニルオキシ）アセテート（４４ｂ）
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の１０ｂ（０．７８ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、オイル中の水素化ナトリウム（６０％を超える、０．９４ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１５分間混合物を撹拌した後、５０℃で１時間加熱した。混合物を氷冷し、ブロモ酢酸（１．４１ｇ、１０．１４ｍｏｌ）を添加した。この懸濁液を約２５℃で２０時間撹拌し（サンプルはカップリングが生じていないことを示した）、続いて５５℃で６時間、２５℃で３日間、さらに６時間５５℃で撹拌した。ロータリーエバポレーター及び５０ｍＬ ＭＴＢＥにより、次いで氷及び２５ｍＬ水によりほとんどのＴＨＦを除去した。層分離させ、水層を３０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。有機層を合せて２５ｍＬの水で洗浄した。水層を合せて氷で冷却し、５０ｍＬのＭＴＢＥを添加し、続いて５．１ｇのクエン酸を添加した。層分離させ、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥させロータリーエバポレーターで濃縮して得られた残渣（４３ｂ）を次のステップに使用した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ、２Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
生成物４３ｂを３０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒロソキシスクシンイミド（１．６０ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（３．１１ｇ、１５．１０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷して３０分、その後室温で３時間撹拌した。濾過して、ロータリーエバポレーターで濃縮し、４０ｇのシリカ上で、トルエン及び次いでジクロロメタンを溶出溶媒として用いてクロマトグラフして４４ｂを得、これをブロモ酢酸のＮＨＳエステルと混合した。混合物を２５ｍＬＭＴＢＥ中に溶解させ、２５ｍＬのヘプタンを溶液に添加した。２時間撹拌後、混合物を濾過した（固体はブロモ酢酸のＮＨＳエステル）。濾液をロータリーエバポレーターし、残渣を暖めたＭＴＢＥに溶解し、いくらかのヘプタンを添加して溶液を室温に冷却した。これにより沈殿を得た。ろ過して生成物４４ｂを３０ｍｇ得た（０．１１ｍｍｏｌ、２％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．４（ｓ、２Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−（シクロオク−４−テン−１−イルオキシ）−２−フェニルアセテート（４６ａ）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ａ（３．０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、１０％未満のシス異性体混入）溶液にオイル中の６０％ＮａＨ（３．０ｇ、７５．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１０分間撹拌し、１．５時間５０℃に加熱した。氷冷後、ＤＬ−２−ブロモフェニル酢酸（３．８７ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を小分けにして添加した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）を得られた濃いペースト状物に添加し、得られた懸濁液を２５℃で１８時間撹拌した。ＴＨＦのほとんどをロータリーエバポレーターで５５℃で除去した後、５５ｍＬのＭＴＢＥを加えた。混合物を冷水で冷却して、いくらかの氷を加え、続いて５０ｍＬの水を添加した。層を分離し、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。連続した有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。水層を集めて氷冷し、５０ｍＬのＭＴＢＥを添加し、続いて１０ｇのクエン酸を加えた。層を分離し、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥してロータリーエバポレーターして残った５．０５ｇの生成物４５ａをそのまま次のステップに使用した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．０５−３．１５（ｍ、１Ｈ）、４．８（２ｓ、１Ｈ）、５．１５−５．３（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、１Ｈ）、７．３−７．５（ｍ、５Ｈ）．
生成物４５ａを５０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．５１ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（５．０３ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷中で１５分、その後室温で３時間撹拌した。濾過、ロータリーエバポレーター、さらにトルエン／ジクロロメタン勾配を使用する５５ｇのシリカ上でクロマトグラフにより、２．８ｇの４６ａを得た（７．８３ｍｍｏｌ、１０ａに基づき３３％収率、約５％のシス異性体が混入）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．７（ｓ、４Ｈ）、３．２５−３．３５（ｍ、１Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ、１Ｈ）、５．２（ｓ、２Ｈ）、５．３５−５．６５（ｍ、２Ｈ９、７．３５−７．５５（ｍ、５Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２，５−２，５−ジオキソピリジン−１−イル ２ー（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−フェニルアセテート（４６ｂ）
０℃におけるＴＨＦ（６０ｍＬ）中の１０ｂの溶液（１．０ｇ、７．９ｍｍｏｌ）に、オイル中６０％ＮａＨ（１．２６ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を１．５時間５０℃に加熱した。０℃に冷却後、ＤＬ−２−ブロモフェニル酢酸（２．２２ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の溶液として添加し、粘稠懸濁液を激しく室温で１６時間撹拌した。さらに２４時間４０℃で加熱した後、混合物を水（１００ｍＬ）中のクエン酸（９．２ｇ）溶液中へ投入した。水性混合物をＭＴＢＥで抽出し（３ｘ５０ｍＬ）、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を蒸発させて黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ２％）で精製し、生成物、未反応ＴＣＯ及び副生成物の混合物を得た。さらなる精製は、ＭＴＢＥ及び３３％ＮａＯＨ溶液で塩基性にした水中に溶解することにより達成された。水層をＭＴＢＥで洗浄し、クエン酸で酸性化し、ついでＭＴＢＥで抽出した（３ｘ）。有機層を集めてＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を蒸発させて、化合物４５ｂを黄色油状物として得た（４６３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ、２３％収率）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．７−３．８（ｍ、１Ｈ）、４．９及び４．９５（２ｓ、１Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）、７．３−７．５５（ｍ、５Ｈ）．
４５ｂ（４６３ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９ｍＬ）溶液に、０℃で、ＤＣＣ（３７２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）中溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、その後沈殿を濾過により除去した。濾液を真空で濃縮しカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ _２ 、ヘプタン／酢酸エチル勾配２５％〜４０％）により精製して、４６ｂ（４５１ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、７１％収率）で無色シロップ状物として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．１−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．８（ｓ、４Ｈ）、３．８−３．９（ｍ、１Ｈ）、５．２ａｎｄ５．３（２ｓ、２Ｈ）、５．４−５．７５（ｍ、２Ｈ）、７．３−７．６（ｍ、５Ｈ）．
（Ｅ−メジャー）−２,５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−メチルプロパノエート（４９ａ）
氷浴中で冷やされたＴＨＦ（１２０ｍｌ）中の１０ａ（３．０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、オイル中の６０％水素化ナトリウム（３．８ｇ、９５ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷バスを取り除き、混合物を室温で３０分間撹拌し、次に５０℃で１時間撹拌した。氷冷後、Ｄ９−ブロモプロピオン酸（３．３ｍＬ、３５．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物は添加の間に非常に粘稠となり、ＴＨＦ（５０ｍＬ）で希釈した。添加を完了した後氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行は、ＮＭＲで追跡し、１６時間後４０％の変換が示された。反応混合物を次にさらに２４時間３５℃で撹拌して８４％の変換を達成した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭＴＢＥで希釈し、その後水（２００ｍＬ）で失活させた。層を分離させ、水層を水（６０ｍＬ）中のクエン酸（２２．５ｇ）の溶液で酸性化した。水性層をＭＴＢＥで抽出した（３ｘ２００ｍＬ）。有機層を合せて、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、４７ａを含む混合物（５．１９ｇ）を得た。これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）、１．４（ｄ）（１３Ｈ）、３．１−３．２（ｍ、１Ｈ）、３．９−４．０（ｑ、１Ｈ）、５．３−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
−７０℃でＴＨＦ（２００ｍＬ）中のジイソプロピルアミンの溶液（１３ｍＬ、９２ｍｍｏｌ）に、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム（３２ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物をゆっくりと−２０℃に暖め、再び−７０℃に冷却した。化合物４７ａ（５．１９ｇ）をＴＨＦ溶液として添加し、得られた混合物を−２０℃に暖めた。この温度でヨードメタン（１０．７ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５℃に暖めた。サンプルを取り、ＮＭＲ分析によれば、反応は完了した。反応混合物を水（２００ｍＬ）中のクエン酸（４０ｇ）溶液中に注ぎ、ＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１５０ｍＬ）。有機層を集めて水溶性クエン酸で及びブラインで洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した後溶媒を蒸発させて黄色オイル状物を得た（９．４ｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ＣＨ_２Ｃｌ _２／ＭｅＯＨ１〜４％勾配）で精製し、純粋な４８ａを黄色シロップ状物として得た（１．１５ｇ、５．４ｍｍｏｌ、２ステップで収率２３％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）及び１．４（２ｓ）（１６Ｈ）、３．２−３．３（ｍ、１Ｈ）、５．３−５．７（ｍ、２Ｈ）．
４８ａ（１．１５ｇ、５．４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６２２ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２７ｍＬ）中溶液に、０℃で、ＤＣＣ（１．１２ｇ、５．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）中溶液を添加した。添加後、混合物を室温に暖め、その温度で１６時間撹拌した。混合物をＭＴＢＥで希釈し、沈殿を濾過して除いた。溶媒を蒸発させた後残渣をカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル２０〜４０％勾配）で精製した。ヘプタン／酢酸エチルから結晶化により、４９ａを無色結晶として得た（７０７ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、収率４２％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．５−２．４（ｍ）、１．５５（ｓ）、１．６０（ｓ）（１６Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．２−３．３（ｍ、１Ｈ）、５．４−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）−２−メチルプロパノエート（４９ｂ）
氷冷したＴＨＦ（６０ｍ）中の１０ｂ（１．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液中に、６０％オイル中の水素化ナトリウム（１．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加した。氷冷バスを外して混合物を５０℃で１．５時間撹拌した。氷冷して、ＤＬ−ブロモプロピオン酸（１．７ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物は添加の間に非常に粘稠になり、ＴＨＦ（３５ｍＬ）で希釈した。添加を終了後、氷冷バスを外し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物は次に４３℃にさらに２４時間加熱した。反応混合物を真空で濃縮し、ＭＴＢＥで希釈し、水で失活させた（２００ｍＬ）。層分離させ、水性層を水中のクエン酸で酸性化した。水性層をＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１００ｍＬ）。有機層を集め、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を蒸発させて４７ｂを含む混合物を得た（２．２６ｇ）。その物質はさらに精製することなく次のステップで使用した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．２−２．５（ｍ）及び１．５（２ｄ）（１３Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、３．９５−４．１５（２ｑ、１Ｈ）、５．４−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（５．６ｍＬ、３９．６ｍｍｏｌ）の溶液中に、−７０℃で、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム（１３．５ｍＬ、３３．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を次に０℃にゆっくり暖め、再び−７０℃に冷却した。ＴＨＦ中の溶液として化合物４７ｂ（２．２６ｇ）を添加し、混合物を−２０℃に暖めた。この温度で、ヨードメタン（４．６ｍＬ、７３．９ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を１５℃に暖めた。サンプルを取り、ＮＭＲ分析によれば反応は終了した。反応混合物を水（１４０ｍＬ）中のクエン酸（２０ｇ）に注ぎ、ＭＴＢＥで抽出した（３ｘ１００ｍＬ）。有機層を集めて、水性クエン酸で及びブラインで洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を蒸発させて黄色シロップ状物を得た（４．６ｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＣＨ_２ Ｃｌ _２／ＭｅＯＨ１％〜４％勾配）で繰り返し精製して純粋な４８ｂを白色結晶性固体として得た（１８１ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、２ステップで収率７％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ）及び１．４５（２ｓ）（１６Ｈ）、３．９−４．０（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
ＴＨＦ（５ｍＬ）中の４８ｂ（１８１ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）との溶液に、０℃でＤＣＣ（１７５ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ中溶液を添加した。添加後、混合物を室温に暖め、その温度で５時間撹拌した。混合物をＭＴＢＥで希釈し、沈殿を濾過して除いた。蒸発後の残渣をカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル２５％勾配）で精製して、４９ｂを白色固体として得た（２５７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝０．８−２．６（ｍ）、１．５５（ｓ）、１．６０（ｓ）（１６Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．８−３．９（ｍ、１Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）
（Ｅ−メジャー）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキソ）ベンゾエート（５２ａ）
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の１０ａ（３．５４ｇ、２７．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にオイル中水素化ナトリウム（６０％、２．５ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間氷中で撹拌し、その後５０℃に１時間加熱した。混合物を氷冷して、５ｍＬのＴＨＦ中に溶解された４−フルオロベンゾイルクロリド（１．７２ｇ、１０．８４ｍｍｏｌ）を、５分間にわたり添加した。混合物を２日間２５℃で撹拌し（サンプルのＮＭＲは多くの生成物を示したが、また４−フルオロ安息香酸のＴＣＯエステルの存在も示した）、その後３時間５０℃で撹拌した。混合物を水で冷却し、１０ｍＬの水をゆっくりと添加し、次に２ｇの水酸化ナトリウム及び５ｍＬの水を添加した。ロータリーエバポレーターで溶媒をほとんど除去し、ＴＨＦ及び２ｇの水酸化ナトリウムを添加し、混合物を５０℃で４時間暖めた。ロータリーエバポレーターでほとんどの溶媒を除去し、メタノールを残渣ペースト状物に添加した。混合物を５０℃で２時間温め、次にロータリーエバポレーターで５５℃で暖めた。残渣懸濁物を５０ｍＬの水で希釈した。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を添加し、前記層を分離して有機層を水２５ｍＬで洗浄した。有機層は、ａ．ｏ．トランスシクロオクテノールを含有する。氷冷した水性層を集めて、２０ｇのクエン酸で処理し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥してロータリーエバポレーターで溶媒を除去して得られた固体残渣は、生成物と４−フルオロ安息香酸を含んでいた。前記固体を４０ｍＬのメタノールで暖めた。水（１５〜２０ｍＬ）をゆっくりと前記暖かい溶液に、濁りが生じるまで添加した。濾過及び濾液を冷却することで生成物を沈殿させた。これを濾過し、１／１のメタノール／水で洗浄し、真空乾燥して、望ましい生成物５１ａを０．８２７ｇ得た（３．３６ｍｍｏｌ，４−フルオロベンゾイルクロリドから計算して収率３０％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．５−２．５（ｍ、１０Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．７５（ｍ、２Ｈ）、６．８（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
メジャートランス酸５１ａ（１．１４ｇ、４．６３ｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７２５ｍｇ、６．３０ｍｍｏｌ）の５０ｍＬジクロロメタン中の氷冷混合物を、ＤＣＣ（１．４６ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を１時間氷中で撹拌し、次に室温で３時間撹拌した。濾過、回転式蒸発、及び４０ｇのシリカゲル上でヘプタン／酢酸エチル勾配を用いるクロマトグラフィにより、シス異性体で汚染された５２ａの画分を得た。次の生成物画分と合せ、ヘプタンと酢酸エチル混合物と共に６０℃に暖めた。懸濁液を室温へ冷却し、次に濾過した。これにより生成物５２ａを０．９７３ｇ得た（２．８３ｍｍｏｌ、６１％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．６−２．５（ｍ、１０Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、４．０−４．１（ｍ、１Ｈ）、５．４５−５．７５（ｍ、２Ｈ）、６．８（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル ４−（シクロオク−４−テ−１−ニルオキシ）ベンゾエート（５２ｂ）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１０ｂ（２．８２ｇ、２２．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液にオイル中水素化ナトリウム（６０％、２．０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を氷中で１５分間、室温で３０分間撹拌し、その後５０℃に１時間加熱した。混合物を氷冷して、８ｍＬ ＴＨＦ中に溶解された４−フルオロベンゾイルクロリド（１．７２ｇ、１０．８４ｍｍｏｌ）を、１５分間で添加した。混合物を１８時間室温で撹拌し（サンプルのＮＭＲは多くのトランスシクロオクテノールの存在を示した）、その後５０℃６時間で、２５℃で３日間、及び５０℃でさらに１時間撹拌した。水５ｍＬ中の２．０ｇの水酸化ナトリウム溶液をゆっくりと添加し、次に５ｍＬの水を添加した。ロ回転式蒸発によりＴＨＦをほとんど除去し、４０ｍＬのメタノールを得られるペーストに添加した。混合物を５０℃で３時間温め、２０ｍＬのＴＨＦを添加し、加熱を４時間続けた。混合物を一晩２５℃で撹拌し（ＮＭＲは、なお少量のエステルの存在を示した）、次に４時間５０℃に加熱し、続いてロータリーエバポレーター蒸発させた。残留懸濁物を５０ｍＬの水で希釈した。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を添加し、層を分離し、有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。有機層は、ａ．ｏ．トランスシクロオクテノールを含む。合せて氷冷した水性層を１５ｇのクエン酸で処理し、生成物を２ｘ７５ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。乾燥及びロータリーエバポレーター蒸発させて得られた固体残渣は生成物と４−フルオロ安息香酸との混合物からなっていた。固体を４０ｍＬのメタノールで暖めた。水（２５ｍＬ）を、前記暖めた溶液中にゆっくりと添加し、続いて室温へ冷却し、次いで一晩撹拌した。濾過し、１／１のメタノール／水で洗浄し、真空乾燥して、望む生成物５１ｂを０．７６ｇ得た（３．０９ｍｍｏｌ、４−フルオロベンゾイルクロリドに基づき２８％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．３−２．６（ｍ、１０Ｈ）、４．５５−４．６５（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８５（ｍ、２Ｈ）、６．９（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
前記マイナートランス酸５１ｂ（０．６６ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）の５０ｍＬジクロロメタン中氷冷混合物を、ＤＣＣ（４６０ｍｇ、４．６１ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を氷中で１時間撹拌し、次に室温で１６時間撹拌した。濾過、回転式蒸発、及びジクロロメタンを溶出溶媒として用いる３０ｇのシリカゲル上でクロマトグラフィ。生成物を５ｍＬの酢酸エチルに溶解した。ヘプタンを添加し、溶液を沈殿が現れるまで部分的に６０℃で回転式蒸発した。ヘプタンを加えて混合物を５分間６０℃で撹拌し、次に室温へ冷却した。濾過して、生成物５２ｂを０．４３７ｇ得た（１．２７ｍｍｏｌ、４７％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．４−２．６（ｍ、１０Ｈ）、２．９（ｓ、４Ｈ）、４．５５−４．６５（ｍ、１Ｈ）、５．５５−５．８（ｍ、２Ｈ）、６．９（ｄ、２Ｈ）、８．０５（ｄ、２Ｈ）．
（Ｅ−メジャー、マイナー）２，５−ジオキソピロリジン−１−イル ２−メチルシクロオク−４−テン−１−イル）アセテート（５８）
過酸化水素（２５ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）の３５％溶液を、酢酸パラジウム（４５％Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１．０ｇ、２ｍｍｏｌ）、ベンゾキノン（４３２ｍｇ、４ｍｍｏｌ）及び１，５−シクロオクタジエン（２７ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）の混合物へ添加した。混合物を３０℃で５日間、ＮＭＲ分析が出発物質の９５％変換を示すまで撹拌した。混合物をＥｔ_２Ｏ（１Ｌ）中へ注ぎ、水を添加した（１Ｌ）。混合物を、氷冷しながら、３３％のＮａＯＨ溶液でゆっくりと塩基性とした。層を分離し、水性層をＥｔ_２Ｏで抽出した（２ｘ）。有機層を合せて、１ＮのＮａＯＨで２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。溶媒を注意して蒸発させて、粗生成物５３を黄色オイル状物として得た（１６．１ｇ、１３０ｍｍｏｌ、収率６５％）。

ヘキサン中のｎ−ブチルリチウム１．６Ｍ溶液（４５ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）を、−８０℃に冷却したジイソプロピルアミン（１４ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５０ｍＬ）中溶液に添加した。混合物を徐々に０℃に温めて次に−８０℃に冷却した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のトリエチルホスホノアセテート（１５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）溶液を添加し、混合物を４５分間−７０℃で撹拌した。その後、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の５３（６．２１ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物をゆっくりと室温に暖めた。１６時間後混合物をさらに加熱し、ＮＭＲ分析により完全に変換したことを示すまで８時間還流した。混合物を水（２５０ｍＬ）に注ぎ、ＭＴＢＥで抽出した（３ｘ）。有機層を合せて塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーターで除き、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル５％）で精製して５４を無色オイル状物として得た（４．７４ｇ、２４ｍｍｏｌ、４９％収率）。

メチルリチウム（５９ｍＬ、９４ｍｍｏｌ）の１．６Ｍ溶液を、Ｅｔ_２Ｏ（２１ｍＬ）中ヨウ化銅（Ｉ）（９．５３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の懸濁物を氷冷して添加した。灰色溶液を真空で０℃で濃縮し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で２回逆抽出した(stripped)。残渣を冷ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中で懸濁させ、−８０℃に冷却して後、ＴＭＳＣｌ（４．０ｍＬ、４６．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（６０ｍＬ）中の５４（４．７４ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、混合物を室温で２時間以上暖めた。混合物をさらに１６時間室温で撹拌し、その後飽和水溶性ＮＨ_４Ｃｌ（１５０ｍＬ）で失活させた。混合物を室温で撹拌し、アンモニア（５０ｍＬ）を添加した。混合物を濾過し、濾液をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した（３ｘ７５ｍＬ）。有機層を合せて水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。溶媒をロータリーエバポレーター蒸発させ、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル３％）で精製して、５５を無色オイル状物として得た（４．４７ｇ、２１ｍｍｏｌ、８９％収率）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝０．８−１．９（ｍ）、１．０５（ｓ）及び１．２５（ｔ）（１６Ｈ）、２．１５−２．３（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．２（ｑ、２Ｈ）、５．４−５．５５（ｍ、１Ｈ）、５．６５−５．７５（ｍ、１Ｈ）．
水銀ランプを備え、及びポンプと、１０％硝酸銀（Ｉ）含浸シリカゲル（３６ｇ、底部にはいくらかの通常グレードのシリカゲルを含む）を充填したカラムに接続されたフラスコに、ヘプタン／Ｅｔ_２Ｏ（３：１体積／体積）（約５００ｍＬ）を充填した。５５（４．４７ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）及びメチルベンゾエート（２．７ｍＬ、２１．３ｍｍｏｌ）の少量のＥｔ_２Ｏ中の溶液を添加した後、水銀ランプのスイッチを入れた。前記カラムを通じる照射溶液の連続流に２０時間照射した後、反応器の内容についてＮＭＲ分析で出発物質がもはや観測されなくなり、カラムをヘプタン中３０％のＭＴＢＥで洗浄した。前記カラム内容物をアンモニアで処理し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した（３ｘ）．有機層を合せてＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル３％〜４％勾配）で精製して、無色オイルとして化合物５６を得た（１．４１ｇ、６．７ｍｍｏｌ、収率３１％）。前記メジャー及びマイナー異性体は分離されず、従って、これらの異性体は混合物としてさらに使用した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝０．８−１．９（ｍ）、１．０（ｓ）及び１．２５（ｔ）（１６Ｈ）、２．１−２．４（ｍ、２Ｈ）、４．０−４．２（ｑ、２Ｈ）、５．５−５．６５ （ｍ、２Ｈ）．
水（１ｍＬ）及びＥｔＯＨ（１ｍＬ）中の水酸化リチウム１水和物（８４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を５６（２１０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）に添加した。前記化合物をより溶解させるために、ＴＨＦ（１ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加した。室温で１６時間撹拌後、変換はなお完了しなかった。追加の水酸化リチウム（８５ｍｇ）を添加して、混合物を４５℃に４時間加熱し、３０℃で１６時間及び５０℃で４時間、変換が完了するまで加熱した。混合物を真空で濃縮し、クエン酸溶液で中和した。ＭＴＢＥで抽出（３ｘ）し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させて、５７を黄色オイル状物として得た（１５０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、収率８２％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．０（２ｓ、３Ｈ）、１．３−２．０（ｍ、１０Ｈ）、２．１−２．４５（ｍ、２Ｈ）、５．５
５．６５（ｍ、２Ｈ）．
５７（１５０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１３ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の氷冷ＴＨＦ（５ｍＬ）中溶液に、ＤＣＣ（１７０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、その後ＭＴＢＥで希釈した。沈殿を濾過して除去し、溶媒を蒸発させた後、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／酢酸エチル１０％〜３０％勾配）で精製し、無色オイル状物として化合物５８を得た（１９７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、８６％収率）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ＝１．０５ａｎｄ１．１（２ｓ、３Ｈ）、１．３５−２．３５（ｍ、１０Ｈ）、２．４（ｓ、１Ｈ）、２．５−２．７５（ＡＢ、１Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、５．５−５．６５（ｍ、２Ｈ）．
実施例１３
新規なＴＣＯの反応速度論
新規に合成したＴＣＯ構成物がそれぞれのテトラジン２８に対する反応性について評価された。手順は実施例５に記載されている。

全てのＴＣＯについて、前記メジャー（エカトリアル）及びマイナー（アキシャル）異性体の間に重要(profound)且つ一貫した一定の反応性の違いがあり、マイナー異性体がメジャー異性体よりもずっと反応性が高い。さらに、ＴＣＯ５８の高い反応性は、抗体へのリンカーなしでもアキシャル位置での置換はなお、トランスシクロオクテン環の増加した反応性を与えること、を支持する。

実施例１４
新規モデルテトラジンプローブの安定性と反応性
他のテトラジン部分を含むいくつかのテトラジンモデルプローブが、水中でのそれらの反応性及び安定性につき評価された。
テトラジンの加水分解安定性試験
ＤＭＳＯ中の特定のテトラジンの溶液（２５ｍＭ）１０μＬをＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）で希釈し、この溶液を濾過した。
ＵＶスペクトル分析を用いて、５２５ｎｍの吸収バンドの減少をモニタし、このデータから加水分解速度及び半減期を決定した。
テトラジンの、トランス−シクロオク−４−テン−１−オール（マイナー異性体、１０ｂ）に対する反応性
競争実験を、特定テトラジン及び３−（５−アセタミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１.，２，４，５−テトラジン（これは標準テトラジンとして選択された）との反応性の比率を、トランス−シクロオク−４−テン−１−オール（マイナー異性体、１０ｂ）との逆−電子要求ディールスアルダー反応において、決定するために実施した。

アセトニトル（０．１００ｍＬ）に、ＤＭＳＯ中の特定のテトラジン溶液（２５ｍＭ）５μＬ及びＤＭＳＯ中参照テトラジンの溶液（２５ｍＭ）５μＬを添加した。この混合物を水（０．９ｍＬ）で希釈し、両方のテトラジンの絶対量をＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定した。続いて、ＤＭＳＯのトランス−シクロオク−４−テン−１−オール（マイナー異性体、１０ｂ）（２５μＬ、２．５ｍＭ）を添加し、混合物を５分撹拌した。再び、両方のテトラジンの絶対量をＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ分析で決定し、両方のテトラジンの変換を計算した。これらの変換から、両方のテトラジンの反応性比率を決定した。

表８から、テトラジンの置換基は、安定性及び反応性に対して一定の効果を持ち、特定の応用に合わせたプローブの設計において使用することができる、ということを明らかになる。

実施例１５
メジャー対マイナーＴＣＯ、２０ａ対２０ｂのテトラジンプローブ２８との、インビトロ反応性の違い
この実験は、より高いＴＣＯ反応性は、放射性ラベル化テトラジンと、両方の試薬が低濃度でより高い反応収率を与える、ということを示すために実施された。この目的で、我々は、ＣＣ４９（メジャー及びマイナーそれぞれの分子当たり６．１及び６．６ＴＣＯ）と共役したＴＣＯメジャー２０ａ（ｋ_２＝ １９６００±１４００ Ｍ^−１ｓ^−１）及びＴＣＯマイナー２０ｂ（ｋ_２＝１３６７００±２３００Ｍ^−１ｓ^−１）を用いた。ＴＣＯ濃度１ｘ１０ ^−５ Ｍから１ｘ１０ ^−８ Ｍの範囲を得るため、２つのｍＡｂ溶液をＰＢＳで希釈し、、支持体付加^１７７Ｌｕ−テトラジン（ｍＡｂに対して１当量）と３７℃で１分間反応させた。その後過剰のテトラジン６で失活させた前記反応混合物の一部（２０μＬ）に、非還元性サンプル緩衝液を加えＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。シクロ付加反応は、前記ｍＡｂに対応するバンドの放射能から決定し、計数（カウント）をＡＩＤＡ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアで定量化した。実験は３回繰り返した。生体分子反応について予期されるように、溶液中での２つの反応種の濃度における減少は、１分のインキュベート後ではより低い反応収率となる（図１８）。しかし、アキシャルＴＣＯ２０ｂを用いる場合には、反応収率は、エカトリアルＴＣＯ２０ａでマイクロモル濃度以下で得られるよりもずっと高く、これはテトラジンとのより速い反応速度によるものである。

実施例１６
ＴＣＯ２０ｂのインビボ安定性
この実験は、実施例６で説明した一連のインビボＴＣＯ安定性測定を拡張するために実施された。この一連において、ＰＥＧスペーサーでＣＣ４９と結合されたＴＣＯメジャー及びマイナー（２３ａ及び２７ｂ）はインビボでは不安定であることが示され、一方ＰＥＧスペーサのないＴＣＯメジャー（２０ａ）は、少なくとも４日間インビボで安定であることが見出された（図１３）。新たな実験では、同じ手順に従って、我々は、ＰＥＧスペーサなしでＣＣ４９−結合ＴＣＯマイナーのインビボ安定性を試験した（２０ｂ、６．９当量結合）。ｍＡｂクリアランスで補正されたインビボ安定性データは、図１９に示される。前記ＣＣ４９−結合ＴＣＯ２０ｂは、インビボではもっぱらゆっくりと分解されることが見出され、さらに、抗体との短いリンカーを持つＴＣＯはインビボでは、より長いリンカーで共役されたＴＣＯよりもより安定であることが見出された。

実施例１７
ＴＣＯ２０ｂ部分の範囲で官能化されたＣＣ４９抗体の血中動態及び生体内分布
一連の研究が、ＣＣ４９分子当たりのＴＣＯ（２０ｂ）の数の、血液循環及び腫瘍ターゲットに対する影響の評価するために実施された。予想されることは、多すぎるＴＣＯ部分で抗体を修飾することは血液循環半減期を下げることとなり、ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の腫瘍取り込みに影響を与えるであろう、ということである。
ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の血中動態（図２０及び２１参照）
ヌードメスＢａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ体重、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝３）に、ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．５ＭＢｑ）当たり０、４．９、９．３または１５．８ＴＣＯ（２０ｂ）を担持する^１２５Ｉ−ＣＣ４９を注射した。選択された時間（５分、３時間、６時間、１日、２日、３日）で、血液サンプルを伏在静脈から取り出し、秤量して１ｍＬＰＢＳで希釈した。ｍＡｂ注射後４日で、動物は麻酔され頚椎脱臼で屠殺し、血液を心臓穿刺で集め、興味対象である器官及び組織を取り出し、乾燥ブロットし、秤量し１ｍＬＰＢＳを添加した。全てのサンプルの放射能がガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ ＩＩ、 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、１グラムの組織当たりの注入された投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するための標準品とともに測定した。血液中のＣＣ４９−ＴＣＯ構成物の半減期は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０１）を用いて、血液曲線を２相減衰にフィッティングさせて決定した。

ＣＣ４９−ＴＣＯ（２０ｂ）構成物の腫瘍ターゲット
腫瘍保持マウス（方法を参照；１００ｍｍ^３腫瘍サイズ）に、ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．２〜０．４ＭＢｑ、ｎ＝４）当たり、０、８．５、１２．７又は１８．７ＴＣＯ２０ｂグループで官能基化された^１２５Ｉ−ＣＣ４９を注射した。^１２５Ｉ−ＣＣ４９を受けたマウスをｍＡｂ注射後４日で屠殺した。１２５−ＣＣ４９−ＴＣＯ２０ｂを受けたマウスは、ｍＡｂ注射後２８及び７２時間後に^１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−テトラジン２８（ｍＡｂに関し２５当量、約０．８ＭＢｑ）を注射し、テトラジン注射から３時間後屠殺された。屠殺の時点で、血液を心臓穿刺で集め、興味対象である器官及び組織を集め、ブロット乾燥し、秤量し、１ｍＬのＰＢＳを加えた。全てのサンプルの放射能をガンマ計数器（Ｗｉｚａｒｄ ３、 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、二重同位体手順（エネルギー窓は、^１２５Ｉ、^１１１Ｉｎのそれぞれで、１０〜８０ｋｅＶ及び１００から５１０ｋｅＶで設定）により、１グラム組織当たりのパーセント注入投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するための標準と共に測定した。

表９から表１１のデータから、ＴＣＯ変性比率は９を超えるべきではないことが明らかとなる。

実施例１８
ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂの血中動態及びインボビ安定性
血中動態
無腫瘍マウス（群ごとにｎ＝３）に、７．５ＴＣＯ４４ｂグループ（マウス当たり１００μｇ、０．２〜０．４ＭＢｑ）で修飾されたＣＣ４９の^１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９を注射した。選択された時点（１、３、６、２４、４８及び７２時間）で、伏在静脈から血液サンプルを取り出し、ヘパリン含有バイアルに集めた。ｍＡｂ注射後４日で、マウスを麻酔して脊椎脱臼で屠殺した。血液を心臓穿刺で集め、興味対象器官と組織を取り出し、ブロット乾燥し、秤量して１ｍＬのＰＢＳを添加して、器官当たりのパーセント注射投与量（％ＩＤ）を決定するために標準と共に、ガンマ計数器（Ｗｉｚａｒｄ ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で計数した。

この研究で、ＴＣＯ修飾ＣＣ４９は、修飾していないＣＣ４９と比較してやや速いクリアランスを示した（図２２）曲線下領域から計算された血液中の半減期（Ｔ_１／２＝ｌｎ２ｘＡＵＣ／Ｃ_０）は、ＣＣ４９−ＴＣＯ及びＣＣ４９でそれぞれ、２２．２及び２６．３時間であった。我々はこれは、ｍＡｂのＬｙｓ残基の官能化によると考える。短い血液循環の結果として、^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの低含有量がまた、計数の前に灌流されなかったほとんどの器官で実験の終了時に観察されたで、（図２３）。
インビボ安定性
無腫瘍マウスの別の群（ｎ＝３）に、^１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂ（マウス当たり２２０μｇ、０．４ＭＢｑ）を注射した。選択された時間（１、３、６、２４、４８及び７２時間）で、血液サンプルを伏在静脈から取り出し、ヘパリン含有バイアルに集めた。ｍＡｂ注射後４日でマウスを麻酔し、脊椎脱臼で屠殺した。血液を心臓穿刺で取り出し、胃と甲状腺を除去し、ブロット乾燥し、器官当たりにパーセント注射投与量 （％ＩＤ）を決定するため標準と共にガンマ計数器で計数した。これらの器官の低い^１２５Ｉの取り込み（胃で０．１７±０．０３％ＩＤ及び甲状腺で０．８８±０．３３％ＩＤ）は、前記放射線ラベル化ｍＡｂが４日の評価の間、インビボで前記ラベルを維持することを確認する。

血液サンプルを秤量し、ＰＢＳで１００μＬに希釈し、０．１ＭＢｑ／μｇの比放射能で放射性ラベル化過剰の担持体付加^１７７Ｌｕ−テトラジン２８を添加した。この混合物を、２０分３７℃でインキュベートし、４００×ｇで５分間遠心分離して血液細胞を分離した。その後、３０μＬの上澄みをＺｅｂａ脱塩スピンカラム（０．５ｍｌ、 ４０ｋＤａＭＷカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）へ適用した。遠心分離後、高分子量ディールスアルダー反応生成物をカートリッジから溶出し、一方で過剰のテトラジンを保持させた。溶出液中に含まれる放射能を、二重同位体手順（^１２５Ｉ及び^１７７Ｌｕに対してそれぞれ、１０〜８０ｋｅＶ、１５５〜３８０ｋｅＶの窓を設定）でガンマ計数器で測定した。^１７７Ｌｕのみを含む血清サンプルが前記カートリッジから漏れる^１７７Ｌｕを補正するために使用された。前記^１２５Ｉ計数は、放射性崩壊を補正し、^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比率が計算された。^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比率の減少は、マウス血液サンプル中に存在する過剰の^１７７Ｌｕ−テトラジンと^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯとのより低い反応収率を意味し、従ってインビボでの前記ＴＣＯ基の不活性化を意味する。図２４は、時間と共に^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比率の変化を、％当初（インタクト）ＴＣＯ（ｔ＝０で１００％に正規化されている）で示す。注目すべきことに、ＴＣＯ４４ｂ基はｍＡｂ注射後４８時間までインビボで完全に安定して見える（インタクトＴＣＯの９７．８±１．６％）が、一方後の時点でいくらかの分解が見られた（ｍＡｂ注射後４日でインタクトＴＣＯの８０．４±１．８％）。
実施例１９
ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂでプレターゲットされた腫瘍保持マウスでの ^１７７ Ｌｕ−テトラジン２８の生体内分布
腫瘍保持マウス（方法を参照；１００ｍｍ３腫瘍サイズ；ｎ＝４）に、７．５４４ｂ基で官能基化された^１２５Ｉ−ＣＣ４９（マウス当たり、１００μｇ、約０．２ＭＢｑ）を注射した。ｍＡｂ注射後３０及び４８時間後、前記マウスは１投与の洗浄試薬（ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン、１投与当たり１６０μｇ）を投与され、続いて２時間後^１７７Ｌｕ−テトラジン２８を投与された（ｍＡｂに対して１０当量、約０．５ＭＢｑ）。テトラジン注射後３時間、マウスは麻酔され脊椎脱臼で屠殺され、血液を心臓穿刺で取り出し、興味対象の器官と組織を取り出しブロット乾燥した。集めたサンプル全てを秤量し、１ｍＬＰＢＳを添加した。サンプルの放射能を、二重同位体手順（^１２５Ｉについて１０〜８０ｋｅＶ及び^１７７Ｌｕについて、１５５〜３８０ｋｅＶの窓を設定）で、１グラム当たりの組織のパーセント投与量（％ＩＤ／ｇ）を決定するために標準と共にガンマ計数器で計数した。

生体内分布データは、^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ４４ｂの高い腫瘍取り込みを示す。前記腫瘍取り込みは、他のＴＣＯ構成物で得られるよりも高く（下記参照）、これは７．５ＴＣＯ−４４ｂ基で官能化されたＣＣ４９のより長い血液内循環によると考えられる。対照的に、全ての他の器官でのｍＡｂの保持は、２つの洗浄試薬を投与することで低くなるが、これらは前記循環ＣＣ４９−ＴＣＯを補足し、肝臓へ輸送し、そこで迅速に分解させるからである。腫瘍での高いｍＡｂの取り込みの結果として、また、^１７７Ｌｕ−テトラジン取り込みも以前の実験で得られた結果よりもずっと高くなった（下記参照）。また、テトラジン投与の前の段階で非腫瘍結合性のＣＣ４９−ＴＣＯが除去されるために、全ての他の器官への^１７７Ｌｕ取り込みは無視出来る程度となる。腎臓のみがむしろ高い^１７７Ｌｕの保持を示すが、これはテトラジンの尿内排泄の結果である。これにより、腎臓以外の全ての器官において、高いターゲット対非ターゲット比率が得られる。注目すべきことに、腫瘍及び血液に存在するＴＣＯの３４±４％および１０±１％がそれぞれテトラジンと反応した。

表１２： ^１７７ Ｌｕ−テトラジン２８の注射（マウス当たり８．５μｇ／８０μＬ、約０．５MBｑ）３時間後、 ^１２５ Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ−４４ｂの注射（マウス当たり１００μｇ／８０μＬ、約０．２ＭＢｑ）５０時間後の二重同位体生体内分布データ。データは、％ＩＤ／グラム±ＳＤ又は腫瘍／器官比率±ＳＤ（ｎ＝４）として表される。

Claims (7)

1. ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、
   当該キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、
   前記プレターゲットプローブは、第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性基を、前記エフェクタープローブは、ラベル又は医薬的活性化合物を有するエフェクター部及び第２の生体直交反応性基を含み、
   前記第１のターゲット部は、ペプチド、タンパク質、抗体断片、二重特異的抗体、及び腫瘍ターゲット化ポリマーからなる群から選択され、
   前記ラベルは、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２Ｍｎ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｚｎ、^６２Ｃｕ、^６３Ｚｎ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７０Ａｓ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７４Ａｓ、^７５Ｓｅ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１４Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１２０Ｉ、^１２２Ｘｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１９３Ｐｔ、^１９５Ｐｔ、^２０１Ｔｌ及び^２０３Ｐｂからなる群から選択され、
   前記医薬的活性化合物は、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ、及び^２２５Ａｃからなる群から選択され、
   前記第１及び第２の生体直交反応性基のいずれか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性基の他方がテトラジンであり、
   前記ジエノフィルは、式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
   

   

   ここでＲの位置はエカトリアルであり、Ｒ_ａの位置はアキシャルであり、
   Ｒ^４ _ａは−Ｏ−または−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−を有する置換基であり、
   Ｘ、Ｙ、Ｒ及びその他のＲ_ａは、Ｈである、キット。
2. 請求項１に記載のキットであり、前記テトラジンが、下式（５）の化合物であり、
   

   

   ここでＲ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、２，５−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル及びフェニルからなる群から選択される置換基を表す、キット。
3. 請求項２に記載のキットであり、
   前記フェニルは、ＮＯ_２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ_３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒの１以上の電子吸引基で置換され、ここでＲはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、Ａｒは芳香族基である、キット。
4. 請求項２又は３に記載のキットであり、
   前記テトラジンは、スペーサーを介して前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへの少なくとも１つのリンケージを含む、キット。
5. 第１のターゲット部と生体直交反応性基とを含むプレターゲット試薬であり、前記第１のターゲット部が請求項１に記載のペプチド、タンパク質、抗体断片、二重特異的抗体、及び腫瘍ターゲット化ポリマーからなる群から選択されるものであり、前記生体直交反応性基が請求項１に定めた式（１）のジエノフィルである、プレターゲット試薬。
6. ターゲット化医用イメージング及び／又は治療のためのキットであり、
   当該キットは少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、
   前記プレターゲットプローブは、第１のターゲット部及び第１の生体直交反応性基を、前記エフェクタープローブは、ラベル又は医薬的活性化合物を有するエフェクター部及び第２の生体直交反応性基を含み、
   前記第１のターゲット部は、ペプチド、タンパク質、抗体断片、二重特異的抗体、及び腫瘍ターゲット化ポリマーからなる群から選択され、
   前記ラベルは、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２Ｍｎ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｚｎ、^６２Ｃｕ、^６３Ｚｎ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７０Ａｓ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７４Ａｓ、^７５Ｓｅ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１４Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１２０Ｉ、^１２２Ｘｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１９３Ｐｔ、^１９５Ｐｔ、^２０１Ｔｌ及び^２０３Ｐｂからなる群から選択され、
   前記医薬的活性化合物は、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ、及び^２２５Ａｃからなる群から選択され、
   前記第１及び第２の生体直交反応性基のいずれか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交反応性基の他方がテトラジンであり、
   前記ジエノフィルが式（１）を満たす８−員環ジエノフィルであり：
   

   

   ここで、Ｒの位置はエカトリアルであり、Ｒ_ａの位置はアキシャルであり、
   Ｒ^４ _ａは−Ｏ−または−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−を有する置換基であり、
   Ｘ、Ｙ、Ｒ及びその他のＲ_ａは、Ｈである、キット。
7. 請求項６に記載のキットであり、前記テトラジンが以下式（５）で表され、
   

   

   ここでＲ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、フェニル、及びＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒの１以上の電子吸引基で置換されたフェニル（ＲはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基を表す）からなる群から選択される置換基を表す、キット。

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