JP6057265B2

JP6057265B2 - 標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法、ならびに該方法に使用するための試薬助剤およびキット

Info

Publication number: JP6057265B2
Application number: JP2015532865A
Authority: JP
Inventors: 松岡　茂; 茂松岡; 道雄村田
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-08-19
Also published as: JPWO2015025856A1; WO2015025856A1

Description

本発明は、標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法、ならびに該方法に使用するための試薬助剤およびキットに関し、より詳細には、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）などの化学物質間での結合親和性をより効率良く測定することができる方法ならびに該方法に使用するための試薬助剤およびキットに関する。

細胞膜の疎水部における分子間相互作用は、細胞内外物質移動の障壁だけでなく、膜タンパク質の構造形成・機能発現、細胞膜構成分子の集合分配によるドメイン形成など、細胞膜のダイナミックな生理機能発現を理解するうえで重要な現象である。

例えば、「外来性脂肪酸」を「細胞膜」から「ミトコンドリア」に運ぶ機能を有する脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ３（fatty acid binding protein ３）は、脂肪酸の細胞内輸送に関与する分子量１５ｋＤａの可溶性タンパク質であり、一分子の脂肪酸に結合する（非特許文献１）。

しかし、このようなＦＡＢＰ３は脂肪酸に対して独特の選択的親和性を示すことが様々な実験から示唆されている（非特許文献２）にすぎない。

従来、標的物質とリガンドとの間の選択的親和性（結合親和性）は、例えば、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）法を用いて解析することができるが、一連の脂肪酸について、このような測定方法を用いた同一条件における網羅的な比較を行うことは、特に長鎖脂肪酸が疎水性のため難しい。

このように同一条件での結合親和性の比較が困難であることは、例えば、創薬開発の現場において、膨大な数の標的物質の効率的な評価にも多大な影響を及ぼす。

標的物質の種類に影響なく、同一条件での結合親和性の比較を可能とする技術が所望されている。

J. Storch, A. E. Thumser, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1486, 28-44. R.-Z. Liu, R. Mita, M. Beaulieu, Z. Gao, R. Godbout, Int. J. Dev. Biol. 2010, 54, 1229-1239.

本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、標的物質の種類に影響なく、当該標的物質とリガンドとの結合親和性を測定することができ、かつ得られた測定結果について、各標的物質との比較が可能となる、標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法、ならびに該方法に使用するための試薬助剤およびキットを提供することにある。

本発明は、標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法であって、
標的物質と脂質集合体を構成し得る物質とを混合して、該標的物質を含有する脂質集合体を形成する工程；
該標的物質を含有する脂質集合体をリガンドと合わせて測定サンプルを調製する工程；および
該測定サンプルの物性変化量を測定する工程；
を包含する、方法である。

１つの実施形態では、上記脂質集合体は、リポソーム、バイセル、およびデンドリマーからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である。

１つの実施形態では、上記脂質集合体を構成し得る物質はリン脂質である。

１つの実施形態では、上記標的物質は疎水性化合物である。

さらなる実施形態では、上記疎水性化合物は、疎水性脂肪酸およびその誘導体ならびにそれらの塩、疎水性タンパク質、疎水性ペプチド、疎水性低分子化合物、疎水性ＤＮＡ、ならびに疎水性ＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の化合物である。

１つの実施形態では、上記物性変化量は、等温滴定熱測定法または表面プラズモン共鳴法により測定される。

本発明はまた、脂質集合体を構成し得る物質を含有する、標的物質とリガンドとの結合親和性の測定に使用するための試薬助剤である。

１つの実施形態では、上記脂質集合体を構成し得る物質がリン脂質である。

本発明はまた、標的物質とリガンドとの結合親和性の測定に使用するためのキットであって、
脂質集合体を構成し得る物質を含む、キットである。

本発明によれば、標的物質の物性（水溶性の程度など）によらず、標的物質とリガンドとの間の結合親和性を効率的に測定することができる。さらに本発明によれば、得られた測定結果について、当該標的物質の種類を問わず互いに比較することができる。

標的物質と脂質集合体を構成し得る物質とを混合して、標的物質を含有するリポソームを形成した際の、当該リポソームにおける標的物質分子が局在した状態を説明するための模式図である。

以下、本発明について詳述する。

（標的物質およびリガンドの結合親和性の測定方法）
本発明の標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法では、まず、標的物質と脂質集合体を構成し得る物質とを混合して、該標的物質を含有する脂質集合体が形成される。

本発明に用いられる標的物質は、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）法または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を通じて後述するリガンドとの結合親和性の測定を必要とする化合物全体を指して言う。標的物質は、必ずしも限定されないが、例えば、水溶性化合物または疎水性化合物のいずれであってもよい。ここで、本明細書中に用いられる用語「疎水性」とは、水に対して不溶、あるいは例えば、２０℃の水１００ｇに対して１ｇ以下、好ましくは０．１ｇ以下の溶解度を有することを指して言う。また、「疎水性化合物」とは、このような疎水性を示す化合物を指して言う。さらに、水溶性化合物とは、水に対して溶解性を示すもの、すなわち、上記疎水性化合物以外の化合物を指して言う。

疎水性化合物としては、特に限定されず、例えば、疎水性脂肪酸およびその誘導体または塩、疎水性タンパク質、疎水性ペプチド、疎水性低分子化合物、疎水性ＤＮＡ、疎水性ＲＮＡ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

疎水性脂肪酸は、フェニル基またはハロゲン置換されたフェニル基のようなアリール基で置換されていてもよい、疎水性の脂肪酸基またはアシル基を有する脂肪酸であり、例えば、炭素数が１０以上の長鎖脂肪酸であり、炭素数が、好ましくは１２以上、より好ましくは１４以上である脂肪酸が挙げられる。なお、当該脂肪酸を構成する炭素数（上記置換されたアリール基部分を除く）の上限は必ずしも限定されないが、例えば、５０以下、４５以下、４０以下および３５以下が挙げられる。脂肪酸はまた、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸のいずれであってもよく、そして不飽和脂肪酸は一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸（例えば、ω３脂肪酸およびω６脂肪酸）のいずれをも包含する。疎水性脂肪酸の誘導体としては、上記疎水性脂肪酸のエステル（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_４０）エステル）、脂肪酸アルケニル（Ｃ_１〜Ｃ_４０）エステル、および脂肪酸アルキニル（Ｃ_１〜Ｃ_４０）エステルなどが挙げられる。疎水性脂肪酸の塩としては、上記疎水性脂肪酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、鉄塩および銅塩などが挙げられる。

なお、本発明では、このような疎水性脂肪酸を包含する任意の脂肪酸を標的物質とすることができる。標的物質とすることができる脂肪酸の例としては、必ずしも限定されないが、例えば、Ｃ６：０、Ｃ７：０、Ｃ８：０、Ｃ９：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１９：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０などの飽和脂肪酸、ならびにＣ１６：１ω７ｃ、Ｃ１８：１ω１２ｃ、Ｃ１８：１ω１１ｃ、Ｃ１８：１ω９ｃ、Ｃ１８：１ω９ｔ、Ｃ１８：１ω７ｃ、Ｃ１８：１ω７ｔ、Ｃ１８：２ω６ｃ、Ｃ１８：３ω３ｃ、Ｃ２０：４ω６ｃ、Ｃ２０：５ω３ｃ、Ｃ２２：１ω９ｃ、Ｃ２２：６ω３ｃ、Ｃ２４：１ω９ｃなどの不飽和脂肪酸が挙げられる。標的物質とすることができる脂肪酸の誘導体および脂肪酸の塩もまた、これらの脂肪酸に由来する誘導体および塩が包含される。

疎水性タンパク質としては、特に限定されず、例えば、インテグリンなどの膜タンパク質；コリシンＡ、αヘモリシン、プリオン、アミロイドβペプチドなどのポリペプチド毒；などが挙げられる。

疎水性ペプチドとしては、特に限定されず、例えば、グライコフォリンＡ、グラミシジンＤ、Ｍ２-ＴＭ、およびｐ２４−ＴＭなどが挙げられる。

疎水性低分子化合物としては、特に限定されず、例えば、インドメタシン、アセメタシン、スリンダク、マレイン酸プログルメタシン、ピンドロールなどのインドール誘導体；アスピリン、ジフルニサルなどのサリチル酸誘導体；イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェンなどのフェニルプロピオン酸誘導体；メフェナム酸、フルフェナム酸アルミニウムなどのアントラニル酸誘導体；ピロキシカム、アンピロキシカムなどのベンゾチアジン誘導体；チアプロフェン酸などのチオフェン酢酸誘導体；酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸クロルマジノン、ダナゾール、フルオロメトロン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾンなどのステロイド誘導体；葉酸、メトトレキサートなどの葉酸誘導体；パクリタキセル、ドセタキセル水和物などのタキサン誘導体；メルカプトプリンなどのプリン誘導体；フルオロウラシル、テガフールなどのピリミジン誘導体；シクロスポリンＡなどのペプチド系薬剤；エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、トシル酸トスフロキサシン、スパルフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、フレロキサシンなどのピリドンカルボン酸誘導体（ニューキノロン系抗生物質）；イトラコナゾール、フルコナゾールなどのトリアゾール誘導体；クロフィブラート、クリノフィブラート、ベザフィブラートなどのフィブラート系薬剤；ニフェジピンなどのジヒドロピリジン誘導体；トリアゾラム、ジアゼパム、ニトラゼパム、塩酸フルラゼパム、ミダゾラム、エスタゾラムなどのベンゾジアゼピン誘導体；ハロペリドール、ドロペリドールなどのブチロフェノン誘導体；テオフィリンなどのキサンチン誘導体；ジギトキシン、ジゴキシンなどのジギタリス誘導体；フェノバルビタールなどのバルビツール酸誘導体；フェニトインなどのヒダントイン誘導体；シメチジンなどのイミダゾール誘導体；オメプラゾール、ランソプラゾールなどのベンズイミダゾール誘導体；ファモチジンなどのチアゾール誘導体；シンバスタチンなどのスタチン系薬剤のほか、プロブコール、マイトマイシンＣ、クエン酸タモキシフェン、シスプラチン、タクロリムス水和物、グリセオフルビン、アシクロビル、ジピリダモール、塩酸プラゾシン、レセルピン、塩酸ベラパミル、アテノロール、スルピリド、フマル酸クレマスチン、テルフェナジン、塩酸シプロヘプタジン、オキセサゼイン、スクラルファート、ゲファルナート、レバミピド、メトクロプラミド、パルミチン酸レチノール、酪酸リボフラビン、リン酸ピリドキサール、メコバラミン、酢酸トコフェロール、フィトナジオン、メナテトレノン、フロセミド、インダパミド、スピロノラクトン、トラニラスト、塩酸ブロムヘキシン、ベンズブロマロン、アロプリノール、トルブタミド、レボドパ、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンメチルエステル、カンデサルタン、アトルバスタチンなどの、医薬および／または動物薬して用いられ得る化合物、ならびにジブチルヒドロキシトルエン（抗酸化剤）、１１−（（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホニル）アミノ）ウンデカン酸、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、２−（２−（１−（４−ブロモフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシ）酢酸などの、試薬類が挙げられる。

疎水性ＲＮＡとしては、例えば、疎水性構造で修飾された、３〜１００の塩基で構成されるＲＮＡ、ｔＲＮＡなどが挙げられる。

疎水性ＤＮＡとしては、例えば、疎水性構造で修飾された、３〜１００の塩基で構成されるＤＮＡが挙げられる。

本発明に用いられる脂質集合体を構成し得る物質とは、上記標的物質と一緒になって後述する脂質集合体を形成することができる物質であり、本発明の標的物質とリガンドとの結合親和性の測定における試薬助剤の一成分として機能する。脂質集合体を構成し得る物質（以下、単に「集合体構成物質」ということがある）の例としては、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、アーキオール、カルドアーキオールなどが挙げられ、より具体的な例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、コレステロールならびにスフィンゴミエリンが挙げられる。ジミリストイルホスファチジルコリンがより好ましい。

本発明において、標的物質と集合体構成物質との混合比は、必ずしも限定されないが、標的物質１モルに対し、集合体構成物質が、例えば、０．５モル〜５００モル、好ましくは１モル〜１００モル、より好ましくは５モル〜２０モルである。集合体構成物質の量が、０．５モルを下回ると、水中で当該標的物質を含有する脂質集合体が適切に形成されず、結果として等温滴下熱測定などの上記結合親和性の実測値が得られなくなるおそれがある。集合体構成物質の量が、５００モルを上回ると、水中で構成される脂質集合体に含まれる当該標的物質が僅かとなって、上記結合親和性の検出感度が低下するおそれがある。

上記標的物質および集合体構成物質は、試験管などの所定の容器中に入れられる。その後、両物質を均一に混合するための目的で、クロロホルム、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフラン、ならびにそれらの組合せなどの有機溶媒を添加して均一に分散させた後、当業者に周知の手段を用いて当該有機溶媒のみが除去されてもよい。有機溶媒の添加量は特に限定されず、当業者によって任意の量が選択される。

なお、当該有機溶媒は、上記集合体構成物質とともに成分の１種として、試薬助剤に予め含有されたものであってもよい。このような場合には、集合体構成物質と有機溶媒とを含有する試薬助剤を上記標的物質とを混合することにより上記と同様に有機溶媒中に標的物質と集合体構成物質とを均一に分散させることができる。

このようにして得られた上記標的物質および集合体構成物質の混合物には、水性媒体（例えば、水または緩衝液）が添加される。添加される水性媒体の量は特に限定されず、脂質集合体を形成するに充分な量のものが添加される。

水性媒体の添加により、集合体構成物質は、当該標的物質を含有する形態で脂質集合体を形成する。このようにして形成される脂質集合体の例としては、リポソーム、バイセル（平面状脂質二重層）、およびデンドリマー（球状脂質ベシクル）ならびにこれらの組合せが挙げられる。

標的物質および集合体構成物質を用いて形成された脂質集合体は、例えば、以下のような形状を有していると考えられる。

図１は、標的物質と脂質集合体を構成し得る物質とを混合して、標的物質を含有するリポソームを形成した際の、当該リポソームに標的物質分子が局在した状態を説明するための模式図である。

図１に示すように、標的物質含有リポソーム１００は、主にリン脂質で構成される略球状の脂質集合体であって、内側層を構成する内皮膜１０６と、外側層を構成する外皮膜１０８とを備えるリポソーム部分１２０が存在する側に標的物質分子１１０の疎水性基部分１０４が配向し、親水基部分１０２が当該リポソーム部分１２０の外部側に配向する。

これにより、リポソーム１００は全体として親水性を示す１種の粒子となって、上記水性媒体に対して均一に分散するものと考えられる。

次いで、本発明においては、上記標的物質を含有する脂質集合体がリガンドと合わせられ、測定サンプルが調製される。

ここで、本明細書中で用いられる用語「リガンド」とは、上記標的物質との結合を期待して選択された物質全体を包含して言い、必ずしも当該標的物質と特異的に結合する物質のみに限定されるものではない。本発明の方法は、特定の標的物質と特定の対象物質との間の結合親和性を評価するために使用され得るものである。そのため、両者の間に必ずしも結合親和性が生じていなければならないわけではなく、結合親和性が生じていない場合であっても、本発明の方法はその評価のために使用することができる。よって、当該評価を行うために採用される全ての対象物質が本明細書中における「リガンド」となり得る。

本発明において用いられ得るリガンドは、特に限定されないが、例えば、タンパク質、多糖、低分子化合物、ペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる。

リガンドとして使用され得るタンパク質の種類もまた、特に限定されないが、例えば、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ１〜１２（fatty acid binding protein 1-12）、外膜特異的リポタンパク質分子シャペロンＬｏｌＡ、外膜特異的リポタンパク質受容体ＬｏｌＢ、リポキシゲナーゼ、およびシクロオキゲナーゼが挙げられる。

リガンドとして使用され得る多糖の種類もまた、特に限定されないが、例えば、ヒアルロン酸、デキストリンおよびセルロースが挙げられる。

リガンドとして使用され得る低分子化合物の種類もまた、特に限定されないが、例えば、チロフィバン、および２−ピロリジン−１−イル−Ｎ−［４−［４−（２−ピロリジン−１−イル−アセチルアミノ）−ベンジル］−フェニル］−アセトアミドが挙げられる。

リガンドとして使用され得るペプチドの種類もまた、特に限定されないが、例えば、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、バソプレシン、オキシトシンなどが挙げられる。

リガンドとして使用され得るＲＮＡおよびＤＮＡの種類もまた、特に限定されないが、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および核酸医薬（例えば、サイトメガロウイルス性網膜炎治療薬「ヴィトラミューン」、加齢黄斑変性症治療剤「マクジェン」など）が挙げられる。

本発明において、標的物質を含有する脂質集合体とリガンドとの混合比は、必ずしも限定されないが、例えば、混合される標的物質とリガンドとのモル比は、好ましくは１：２〜１０：１、より好ましくは１：１〜２：１である。

なお、標的物質を含有する脂質集合体とリガンドとの混合は、上記水性媒体の存在下で行われる。

このようにして測定サンプルが調製される。

その後、本発明においては、測定サンプルの物性変化量が測定される。

測定サンプルの物性変化量は、所定の物質間（例えば、通常の標的物質とリガンドとの間）の結合親和性を測定するための当業者に公知の方法を用いて測定され得る。このような方法の例としては、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）法および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が挙げられる。このような測定方法に使用される条件、手段等もまた当業者に公知のものが採用され得る。

本発明においては、たとえ疎水性の標的物質を用いたとしても、上記のように当該物質を一旦脂質集合体に取り込ませることにより、水性媒体内で均一に分散させることができる。このため、リガンドとの間の結合親和性を上記のような公知の方法を用いて簡易に測定することができる。さらに、本発明においては、標的物質が疎水性または親水性のいずれを有するかを問わず、同一条件でリガンドとの間の結合親和性を測定することができる。このため、疎水性または親水性のいずれをも問わない複数の標的物質について、同一リガンドに対する結合親和性を対比して評価することも可能である。このような同一条件での結合親和性の対比が可能となることにより、例えば、創薬開発の現場において、膨大な数の標的物質を効率的な評価することができる。

（標的物質とリガンドとの結合親和性の測定に使用するためのキット）
本発明のキットは、例えば、標的物質とリガンドとの結合親和性の測定にあたり、当該標的物質の結合親和性の評価だけではなく、他の標的物質との対比も可能とするものである。すなわち、本発明のキットは、脂質集合体を構成し得る物質を含む。

本発明のキットに含まれる、脂質集合体を構成し得る物質（集合体構成物質）は、上記と同様である。なお、本発明のキットは、標的物質の添加量、脂質集合体の形成方法、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）法および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の測定条件等を記載した取扱説明書を備えていてもよい。

本発明のキットでは、上記集合体構成物質は、例えば、アンプルなどの所定の容器内に収容されている。１つのアンプル中に収容され得る集合体構成物質の量は、必ずしも限定されないが、使用する標的物質の量を１モルとした場合に、例えば、０．５モル〜５００モル、好ましくは１モル〜１００モル、より好ましくは５モル〜２０モルに相当する割合を満足する量である。１つのアンプル中に収容され得る集合体構成物質の量がこのような範囲を満足することにより、結合親和性の検出感度を一層良好にすることができる。

本発明のキットにおいて、上記アンプルは、クロロホルム、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフラン、ならびにそれらの組合せなどの有機溶媒が含まれていてもよい。アンプルにおける有機溶媒の含有量は特に限定されず、当業者によって任意の量が選択され得る。

本発明のキットは、標的物質とリガンドとの結合親和性の測定のために、例えば以下のようにして使用され得る。

まず、キットを構成する上記集合体構成物質を含有するアンプル内に、所定量の標的物質が添加される。その後、アンプルには、脂質集合体を形成するに充分な量の水性媒体（例えば、水または緩衝液）が添加される。こうして、アンプル内に当該標的物質を含有する脂質集合体が形成される。

なお、例えば、ある標的物質に対し複数のリガンドとの結合親和性を一度に評価するような場合は、このような脂質集合体を形成したアンプルが複数個準備される。脂質集合体を形成したアンプルは、実際の使用まで所定場所に保管してもよい。

次いで、各アンプルにリガンドが添加され、上記と同様にして測定サンプルが調製される。

この測定サンプルについて、等温滴定熱測定（ＩＴＣ）法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などの当業者に公知の方法を適用することにより、当該標的物質についての結合親和性が測定される。

このように、本発明では、脂質集合体を構成し得る物質を予めキット内に含めておくことにより、標的物質とリガンドとの結合親和性の測定にあたり、都度、脂質集合体を形成するための材料を個別に準備することから解消される。このため、測定準備の煩雑さを一層解消することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１：リポソームを用いるカプリル酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
飽和脂肪酸として０．５ｍｍｏｌのカプリル酸と５．５ｍｍｏｌ（３．７ｍｇ）のジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）とを４ｍＬ容量の試験管内に入れ、さらに１ｍＬのクロロホルム／メタノール（容量比１：１）を添加して、試験管内の内容物を溶解させた。次いで、試験管内の溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させ、さらに試験管内の残留溶媒を減圧下にて６時間以上かけて完全に除去した。その後、３６．９℃にて試験管内に５００μＬの緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭＮａＣｌ)を添加して内容物を水和させ、試験管をボルテックスミキサーにかけ、次いで超音波に曝して均一な懸濁物を形成した。

試験管内容物を−３０℃で凍結し、その後４０℃で解凍した。この凍結と解凍の操作を合計３回繰り返した。そして、試験管をボルテックスミキサーにかけて、懸濁物を形成し、試験管内の内容物を小容量押出器（製品名：リポソファスト、株式会社セントラル科学貿易製）により、ポリカーボネートフィルター（製品名：ヌクレポアフィルター（孔径１００ｎｍ）、日東機器ファインテック株式会社製）で１９回濾過した。最数的に、この試験管をボルテックスミキサーにかけて、より均一な懸濁物でなる脂肪酸含有リポソームを形成した。

ＩＴＣ装置（ティー・エー・インスツルメント・ジャパン株式会社製）を起動し、測定温度を３７℃に設定した。次いで、ＩＴＣ装置の滴定シリンジ（５０μＬ）とサンプルセル（１９０μＬ）それぞれに脱気した脂肪酸含有リポソーム５０μＬと脱気した０．２ｍＭのＦＡＢＰ３（非特許文献２に記載の方法により調製した。）２１０μＬを充填した。ＩＴＣ装置の測定パラメータ（測定回数：３回；滴下量：２μＬ；滴定間隔：２１０秒；測定温度：３７℃；攪拌速度：２５０ｒｐｍ）を設定し、測定値を得た。得られた結果を表１に示す。

（実施例２〜１２：リポソームを用いる種々の飽和脂肪酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
カプリル酸の代わりに、表１に示す種々の飽和脂肪酸（０．５ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして脂肪酸含有リポソームを形成し、当該リポソームとＦＡＢＰ３との等温滴定熱測定を行った。得られた結果を表１に示す。

（実施例１３〜２６：リポソームを用いる種々の不飽和脂肪酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
カプリル酸の代わりに、表１に示す種々の不飽和脂肪酸（０．５ｍｍｏｌ）を用い、かつクロロホルム／メタノールの蒸発とその後の減圧下での完全除去を窒素雰囲気下で行ったこと以外は実施例１と同様にして脂肪酸含有リポソームを形成し、当該リポソームとＦＡＢＰ３との等温滴定熱測定を行った。得られた結果を表１に示す。

表１に示すように、水に不溶である炭素数２２以上の脂肪酸を含め、実施例１〜２６で使用した全ての脂肪酸について、同一条件下にてＦＡＢＰ３に対する結合親和性をＩＴＣ装置を用いて測定することができたことがわかる。

この結果、ＦＡＢＰ３との結合親和性には、脂肪酸の不飽和度や二重結合の立体配置よりも、鎖長が大きく影響することが明らかとなった。また、β酸化に関わる酵素群の基質として好まれる脂肪酸の中でも水溶性が低いＣ_１０〜Ｃ_１８に対して結合親和性が高く、不飽和度にかかわらず解離定数（Ｋ_ｄ）＝１０^−６Ｍ程度の比較的均一な値を示した。このことは、ＦＡＢＰ３が脂肪酸の細胞内輸送に関与する分子量１５ｋＤａの可溶性タンパク質であり、一分子の脂肪酸に結合するという生物機能を有する点で興味深いとも言える。

一方、熱力学パラメータの解析からは、実施例１〜２６に記載の全ての脂肪酸において、エンタルピー駆動の分子間相互作用があることが見出された。すなわち、これらの脂肪酸とＦＡＢＰ３の結合では、結合サイトの脱水和による疎水性分子間相互作用の寄与は結果的に小さくなっており、水素結合形成やファンデルワールス力による分子間相互作用が支配的要因であると考察される。

このように、上記方法を用いることにより、従来水に不溶または難溶であるとされていた脂肪酸についても、他の水溶性の脂肪酸と同様の条件にて、等温滴定熱測定を行うことができるだけでなく、各脂肪酸の間でのプロフィールの相違も容易に対比することが可能となったことがわかる。

（実施例２７〜３３：リポソームを用いる種々の飽和脂肪酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
表２に示す種々の飽和脂肪酸（０．５ｍｍｏｌ）を用い、試験管内に５００μＬの緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１００ｍＭＮａＣｌ)を添加して内容物を水和させたこと以外は実施例１と同様にして脂肪酸含有リポソームを形成し、当該リポソームとＦＡＢＰ３との等温滴定熱測定を行った。得られた結果を表２に示す。

表２に示すように、上記実施例１〜２６とは異なるｐＨで作製したリポソームを用いても、ＦＡＢＰ３に対する結合親和性をＩＴＣ装置を用いて測定することができたことがわかる。

（実施例３４および３５：リポソームを用いる種々の脂肪酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
表３に示す種々の飽和脂肪酸（０．５ｍｍｏｌ）を用い、試験管内に５００μＬの緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１００ｍＭＮａＣｌ)を添加して内容物を水和させたこと以外は実施例１と同様にして脂肪酸含有リポソームを形成し、当該リポソームとＦＡＢＰ３との等温滴定熱測定を行った。得られた結果を表３に示す。

表３に示すように、生理活性物質の１種であるプロスタグランジンＥ２、および植物ホルモン様物質の１種であるジャスモン酸のような脂肪酸を用いて作製したリポソームを用いても、ＦＡＢＰ３に対する結合親和性をＩＴＣ装置を用いて測定することができたことがわかる。

（実施例３６〜３８：リポソームを用いる種々の不飽和脂肪酸とＦＡＢＰ３とのＳＰＲによる結合親和性の測定）
カプリル酸の代わりに、表４に示す種々の不飽和脂肪酸（１．１ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして脂肪酸含有リポソームを作製した。

こうして得られた脂肪酸含有リポソームを用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置（ＧＥヘルスケア社製ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００）により、以下のようにしてＳＰＲ測定を行った。

まず、カルボキシル化デキストランマトリックス（ＣＭ５）センサーチップを、５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を用いて、流速２０μＬ／分にて２分間の洗浄を３回行った。次いで、このＣＭ５センサーチップに、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と０．３９Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）との混合液（１：１ｖ／ｖ）７０μＬを、５μＬ／分の流速で７分間かけて添加することにより、当該チップ上のカルボキシル基をスクシンイミジルエステルに変換して活性化した。非特許文献２に記載の方法により調製したＦＡＢＰ３（１００μｇ／ｍＬ）を、２μｍＬ／分の流速で３０分間かけてセンサーチップ上に固定化した。センサーチップ上の未反応のスクシンミジルエステルを、１Ｍのエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）で処理し、次いでセンサー表面をバッファ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

このセンサーチップに、上記にて作製した脂肪酸含有リポソームを、表２に示すような脂肪酸濃度にてｐＨ７．４のＰＢＳ中、１０Ｌ／分の流速で２分間かけて添加し、ＳＰＲ測定を行った。

得られた結果を表４に示す。

表４に示すように、実施例３６〜３８で使用した全ての脂肪酸について、上記ＩＴＣ装置を用いた場合と同様に、同一条件下にてＦＡＢＰ３に対する結合親和性をＳＰＲ装置を用いて測定することができたことがわかる。

（実施例３９：バイセルを用いるステアリン酸とＦＡＢＰ３とのＩＴＣによる結合親和性の測定）
５８０μＬのクロロホルム中に、３４ｍｇのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および２４ｍｇのジヘキサノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）を添加し、これを１０個のアンプル（１アンプル当たり５８μＬ）に分け、窒素ガスを通してクロロホルムを除去した。次いで、各アンプルを減圧下で４時間乾燥し、アンプルを窒素ガスで置換してストック用脂質を調製した。

上記得られたストック用脂質の各アンプルに、１ｍＬの緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭＮａＣｌ)を添加して内容物を水和させ、アンプルを３分間超音波処理して、バイセル（１０ｍＭＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ）を作製した。

バイアル中の１μｍｏｌのステアリン酸（Ｃ１８：０）に、上記で得られた１ｍＬのバイセル（１０ｍＭＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ）を添加し、これをボルテックスミキサーにかけ、次いで超音波に曝して均一な懸濁物を形成した。次いで、この懸濁物を液体窒素および４０℃の温度下での凍結かつ解凍を３回行って、より均一な懸濁物でなるステアリン酸含有バイセルを形成した。

ＩＴＣ装置（ティー・エー・インスツルメント・ジャパン株式会社製）を起動し、測定温度を３７℃に設定した。次いで、ＩＴＣ装置の滴定シリンジ（５０μＬ）とサンプルセル（１９０μＬ）それぞれに脱気した上記ステアリン酸含有バイセル５０μＬと脱気した０．２ｍＭのＦＡＢＰ３（非特許文献２に記載の方法により調製した。）２１０μＬを充填した。ＩＴＣ装置の測定パラメータ（測定回数：３回；滴下量：２μＬ；滴定間隔：２１０秒；測定温度：３７℃；攪拌速度：２５０ｒｐｍ）を設定し、測定値を得た。

得られた解離定数（Ｋｄ）は７．６４μＭであり、エンタルピー変化（ｄＨ）は−１９．５８ｋＪ／ｍｏｌであった。

このように、水に不溶であるステアリン酸に対し、ＦＡＢＰ３に対する結合親和性を上記バイセルの作製を通じて、ＩＴＣ装置を用いて測定することができた。

本発明は、例えば、細胞膜の疎水部における分子間相互作用の解明を通じた、膜タンパク質の構造形成・機能発現、細胞膜構成分子の集合分配によるドメイン形成などの、細胞膜のダイナミックな生理機能発現における研究開発において有用である。本発明の方法により測定された結果は、例えば、創薬分野における標的化合物の基礎情報として活用することができる。

１００標的物質含有リポソーム
１０２親水基部分
１０４疎水基部分
１０６内皮膜
１０８外皮膜
１１０標的物質分子
１２０リポソーム部分

Claims

標的物質とリガンドとの結合親和性を測定するための方法であって、
標的物質と脂質集合体を構成し得る物質とを混合して、該標的物質を含有する脂質集合体を形成する工程；
該標的物質を含有する脂質集合体をリガンドと合わせて測定サンプルを調製する工程；および
該測定サンプルの物性変化量を測定する工程；
を包含し、
ここで、該物性変化量が、等温滴定熱測定法により測定される、方法。
前記脂質集合体が、リポソーム、バイセル、およびデンドリマーからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である、請求項１に記載の方法。
前記脂質集合体を構成し得る物質がリン脂質である、請求項１または２に記載の方法。
前記標的物質が疎水性化合物である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
前記疎水性化合物が、疎水性脂肪酸およびその誘導体ならびにそれらの塩、疎水性タンパク質、疎水性低分子化合物、疎水性ＤＮＡ、ならびに疎水性ＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、請求項４に記載の方法。
脂質集合体を構成し得る物質を含有する、標的物質とリガンドとの結合親和性の等温滴定熱測定に使用するための試薬助剤。
前記脂質集合体を構成し得る物質がリン脂質である、請求項６に記載の試薬助剤。
標的物質とリガンドとの結合親和性の等温滴定熱測定に使用するためのキットであって、
脂質集合体を構成し得る物質を含む、キット。