JP6049305B2 - Method for acquiring an image of a test sample derived from a biological sample - Google Patents

Method for acquiring an image of a test sample derived from a biological sample Download PDF

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Description

本発明は、生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法に関する。   The present invention relates to a method for acquiring an image of a test sample derived from a biological sample.

細胞の癌化にWnt/β−カテニン経路が関与することが報告されている。Wntとは、広い生物種において保存されている分泌性糖タンパク質であり、発生や形態形成等に関与することが確認されている。β−カテニンは細胞内に発現するタンパク質であり、核内に移行した場合、転写因子と結合して、種々の遺伝子の発現を促進する。Wnt/β−カテニン経路において、Wntの刺激に応じてβ−カテニンの細胞内濃度が調節される。   It has been reported that the Wnt / β-catenin pathway is involved in cell carcinogenesis. Wnt is a secreted glycoprotein that is conserved in a wide range of biological species and has been confirmed to be involved in development, morphogenesis, and the like. β-catenin is a protein expressed in cells, and when transferred into the nucleus, it binds to a transcription factor and promotes expression of various genes. In the Wnt / β-catenin pathway, the intracellular concentration of β-catenin is regulated in response to Wnt stimulation.

Wnt/β−カテニン経路は、新規抗癌剤検索における有力なターゲットとして有力視されている。また、Wnt/β−カテニン経路は癌以外にも様々な疾患との関連性が報告されている。新規で有効なWnt/β−カテニン経路の研究手段は、これらの研究の進展において重要である。   The Wnt / β-catenin pathway is regarded as a promising target in the search for new anticancer agents. In addition, the Wnt / β-catenin pathway has been reported to be associated with various diseases other than cancer. New and effective means of studying the Wnt / β-catenin pathway are important in the progress of these studies.

生体試料から情報を取得する方法として、ルミノメーターを用いて発光検出する方法や、免疫組織学的染色法を用いて遺伝子発現パターンを検出する方法が存在する。   As methods for obtaining information from a biological sample, there are a method for detecting luminescence using a luminometer and a method for detecting a gene expression pattern using an immunohistological staining method.

ルミノメーターを用いた発光検出では、ショウジョウバエといった生体試料の胚、幼虫、蛹、成虫について、その発生過程におけるプロモーター活性の変化を測定する方法が知られている。しかしながら、ルミノメーターのような分光測定で得られるデータは、プロモーター活性の数値データのみであり、画像データを得ることは出来ない。このため、胚、幼虫、蛹および成虫における遺伝子発現パターンを測定することは出来ない。   In luminescence detection using a luminometer, a method for measuring changes in promoter activity during the development process of embryos, larvae, pupae and adults of biological samples such as Drosophila is known. However, data obtained by spectroscopic measurement such as a luminometer is only numerical data of promoter activity, and image data cannot be obtained. For this reason, it is not possible to measure gene expression patterns in embryos, larvae, pupae and adults.

また、免疫組織学的染色法(in situハイブリダイゼーション、βガラクトシダーゼおよびX−galを用いたプロモーターアッセイ法等)は、古くから遺伝子発現パターンを検出する手法として使用されてきものの、染色に際してサンプルの固定が必要であるため、生きているショウジョウバエといった生体試料を連続的に観察することは出来ない。   In addition, immunohistological staining methods (such as in situ hybridization, promoter assay using β-galactosidase and X-gal) have been used as a method for detecting gene expression patterns for a long time, but sample fixation was performed during staining. Therefore, it is impossible to continuously observe biological samples such as living Drosophila.

特許文献1には、光透過性に乏しい厚みのある胚等の生体試料について、遺伝子発現に関する情報をルシフェラーゼによる発光を用いて異なる角度から画像取得することにより、異なる試料外面付近に分布する遺伝子発現を解析する方法が開示されている。   Patent Document 1 discloses gene expression distributed in the vicinity of the outer surface of a different sample by acquiring information about the gene expression from a different angle using light emission by luciferase for a biological sample such as a thick embryo having poor light transmission. A method of analyzing is disclosed.

特開2008−089521号公報JP 2008-089521 A

Cell (1992) Vol.26:1073-1087Cell (1992) Vol.26: 1073-1087

本発明の目的は、生体試料由来の被験試料についての有用な情報を提供することにある。   An object of the present invention is to provide useful information about a test sample derived from a biological sample.

本発明に係る光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法は、プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第1画像を取得すること、および前記第1画像の取得と同時にまたは前記取得と連続して、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部構造および/または外観を示す第2画像を取得することを含む。   A method for acquiring an image of a test sample derived from a biological sample using the optical imaging means according to the present invention comprises a biological sample having a nucleic acid comprising a promoter binding region and a region comprising a luminescent enzyme gene located downstream thereof. Detecting a luminescence derived from the luminescent enzyme emitted from a test sample from which the test sample is derived, obtaining a first image showing the intensity and distribution of the activity of the promoter in the test sample, and obtaining the first image Simultaneously or continuously with the acquisition, the test sample is irradiated with irradiation light, and the light emitted from the test sample is detected according to the irradiation light, and the internal structure of the test sample and / or Obtaining a second image showing the appearance.

本発明によれば、生体試料由来の被験試料についての有用な情報が提供される。   According to the present invention, useful information about a test sample derived from a biological sample is provided.

図1は、Wntおよびβ−カテニンが関与するシグナル伝達経路を概略的に示す図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing a signal transduction pathway involving Wnt and β-catenin. 図2は、第1画像および第2画像の一例を示す図である。FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the first image and the second image. 図3は、胚の2つの異なる面の各々から画像を取得する様子を概略的に示す図である。FIG. 3 is a diagram schematically showing how images are acquired from each of two different faces of an embryo. 図4は、本発明に使用できるショウジョウバエを作製するための掛け合わせの例を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing an example of crossing for producing Drosophila that can be used in the present invention. 図5は、経時的に取得された第1画像および第2画像の例を示す図である。FIG. 5 is a diagram illustrating an example of a first image and a second image acquired over time. 図6は、イオノマイシンを投与した場合の影響を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the effects of administering ionomycin. 図7は、6−ブロモインジルビン−3−オキシムを投与した場合の影響を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing the effects of administering 6-bromoindirubin-3-oxime. 図8は、ラパマイシンを投与した場合の影響を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing the effects of administration of rapamycin.

本発明の第1実施形態は、光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法に関する。   1st Embodiment of this invention is related with the method of acquiring the image of the test sample derived from a biological sample using an optical imaging means.

光学的結像手段とは、例えば、観察の対象を所定の結像面において光学的に検出して画像を取得する手段である。光学的結像手段は、結像面に生じている光信号を特異的に取得するための結像光学系を有していることが好ましい。また、光学的結像手段は、試料から照射される光のうち特定の波長を有した光を選択的に検出する手段を備えてよい。さらに、光学的結像手段は、試料に対して、特定の波長を有した光を選択的に照射する手段を備えてよい。これらの手段の例は、特定の波長を有した光を主に透過させることができるフィルターである。光学的結像手段は、検出した画像を電子データに変換するための撮像素子を備えてよい。光学的結像手段は、コンピューターに接続され、コンピューターによって、画像の電子データが表示または記録されてよい。光学的結像手段の一例は、光学顕微鏡である。光学的結像手段の具体的な例は、発光イメージングシステムLV200(オリンパス株式会社)である。   The optical imaging means is means for acquiring an image by optically detecting an observation target on a predetermined imaging plane, for example. The optical imaging means preferably has an imaging optical system for specifically acquiring an optical signal generated on the imaging surface. Further, the optical imaging means may include means for selectively detecting light having a specific wavelength among light irradiated from the sample. Further, the optical imaging means may include means for selectively irradiating the sample with light having a specific wavelength. An example of these means is a filter that can mainly transmit light having a specific wavelength. The optical imaging means may include an image sensor for converting the detected image into electronic data. The optical imaging means is connected to a computer, and the electronic data of the image may be displayed or recorded by the computer. An example of the optical imaging means is an optical microscope. A specific example of the optical imaging means is a light emission imaging system LV200 (Olympus Corporation).

生体試料とは、ヒトを除いたあらゆる生物を意味する。生体試料として、例えば、発生学的に内部構造、外観の形状および/またはサイズ等が変化し、その変化の過程で遺伝学的な活性も変化するような生物を使用することができる。生体試料は、変態を行う生物であってよく、特に昆虫であってよい。生体試料は、生きた生物であってよい。生体試料の具体的な例はショウジョウバエである。   A biological sample means any living organism except humans. As the biological sample, for example, an organism whose internal structure, appearance shape and / or size, etc. change in development and whose genetic activity also changes in the course of the change can be used. The biological sample may be an organism that undergoes transformation, in particular an insect. The biological sample may be a living organism. A specific example of a biological sample is Drosophila.

ショウジョウバエとは、ハエ目ショウジョウバエ科に属するハエを意味する。本発明で使用できるショウジョウバエとは、例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)である。ショウジョウバエ由来の被験試料は、例えばショウジョウバエの個体である。個体は、受精卵から成虫まで成長する途中のいずれかの状態であってよい。被験試料は、例えば受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫である。被験試料は生きた状態のまま使用することができる。   Drosophila means flies belonging to the order Drosophilidae. The fruit fly that can be used in the present invention is, for example, Drosophila melanogaster. The test sample derived from Drosophila is, for example, an individual of Drosophila. An individual may be in any state during the growth from a fertilized egg to an adult. The test sample is, for example, a fertilized egg, embryo, larva, pupa or adult. The test sample can be used alive.

本発明に係る方法は、プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第1画像を取得することを含む。   The method according to the present invention detects luminescence derived from a luminescent enzyme emitted from a test sample derived from a biological sample having a nucleic acid comprising a promoter binding region and a luminescent enzyme gene located downstream thereof. Obtaining a first image showing the intensity and distribution of the activity of the promoter in the test sample.

この核酸は、生体試料のゲノム中に含まれる核酸であってよく、あるいは生体試料の細胞中に含まれるベクターに含まれる核酸であってよい。   This nucleic acid may be a nucleic acid contained in the genome of the biological sample, or may be a nucleic acid contained in a vector contained in the cells of the biological sample.

プロモーター結合領域とは、特定の塩基配列を有した核酸の領域である。一般に、プロモーター結合領域の下流には、特定の遺伝子が存在しており、プロモーター結合領域にプロモータータンパク質が結合した場合、この遺伝子の発現が促進される。プロモーター結合領域は、例えば、生体試料が本来有している内在性のものであってよい。例えば、プロモーター結合領域は、種々の生物種において保存されているタンパク質についてのプロモーター結合領域である。あるいは、プロモーター結合領域は、特定の薬剤に対して応答性を有するプロモーターに対応したものである。また、プロモーター結合領域は、特定のシグナル伝達に関連するタンパク質についてのプロモーター結合領域である。また、プロモーター結合領域は、研究の目的に応じて選択することができる。例えば、生体試料の発生を研究する場合、発生の進行に応じて活性が変動するタンパク質についてのプロモーター結合領域を使用することができる。さらに、プロモーター結合領域は、生体試料が本来有していない外在性のものであってよい。   A promoter binding region is a region of a nucleic acid having a specific base sequence. In general, a specific gene exists downstream of the promoter binding region, and when a promoter protein is bound to the promoter binding region, expression of this gene is promoted. The promoter binding region may be, for example, an endogenous one inherent in a biological sample. For example, a promoter binding region is a promoter binding region for a protein that is conserved in various biological species. Alternatively, the promoter binding region corresponds to a promoter having responsiveness to a specific drug. The promoter binding region is a promoter binding region for a protein related to specific signal transduction. The promoter binding region can be selected according to the purpose of research. For example, when studying the development of a biological sample, a promoter binding region for a protein whose activity varies as the development progresses can be used. Furthermore, the promoter binding region may be an exogenous one that is not inherently contained in the biological sample.

プロモーター結合領域の一例は、Armadillo遺伝子についてのプロモーター結合領域である。ショウジョウバエの有するArmadilloは、哺乳類の有するβ−カテニンと高い相同性を有する。   An example of a promoter binding region is a promoter binding region for the Armadillo gene. Armadillo possessed by Drosophila has high homology with β-catenin possessed by mammals.

図1には、Wntおよびβ−カテニンが関与するシグナル伝達経路が概略的に示されている。   FIG. 1 schematically shows a signal transduction pathway involving Wnt and β-catenin.

図1(a)は、細胞に対してWntによる刺激がない状態を示している。Wnt2が存在しない場合、細胞膜100上に存在するWnt2に対する受容体/細胞膜タンパク質11は、Wnt2と結合することができず、活性化されない。この場合、細胞内では、β−カテニン1に対して、カゼインキナーゼ1α(CK1α)12、Adenomatous Polyposis Coli(APC)13、Axin14およびグリコーゲン合成酵素リン酸化酵素−3β(GSK−3β)15等が結合する。β−カテニン1に結合したこれらのタンパク質の作用により、β−カテニン1はユビキチン化され、複数のユビキチン16が結合する。このユビキチン16のシグナルに起因して、β−カテニン1はプロテアソームに運ばれ分解される。図1(a)には、分解されたβ−カテニン1’が比喩的に示される。   FIG. 1 (a) shows a state where there is no stimulation by Wnt on the cells. In the absence of Wnt2, the receptor / cell membrane protein 11 for Wnt2 present on the cell membrane 100 cannot bind to Wnt2 and is not activated. In this case, casein kinase 1α (CK1α) 12, Adenomatous Polyposis Coli (APC) 13, Axin14, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) 15 and the like bind to β-catenin 1 in the cell. To do. By the action of these proteins bound to β-catenin 1, β-catenin 1 is ubiquitinated and a plurality of ubiquitin 16 are bound. Due to this ubiquitin 16 signal, β-catenin 1 is transported to the proteasome and degraded. FIG. 1 (a) shows metabolized β-catenin 1 'degraded.

一方、図1(b)は、細胞がWnt2による刺激を受けた状態を示している。Wnt2は受容体/細胞膜タンパク質11に結合し、これらを活性化する。活性化された受容体/細胞膜タンパク質11は、その後、Dishevelledタンパク質(Dvl)17を活性化し、活性化されたDvl17は、Axin14等と結合して、Axin14等とβ−カテニン1との結合を抑制する。これにより、β−カテニン1はプロテアソームによる分解を逃れ、その結果、β−カテニン1の細胞内濃度が上昇する。次にβ−カテニン1は核101の内部に移行し、転写因子であるT cell factor/Lymphocyte enhancing factor(Tcf/Lef)18と結合して複合体を形成し、この複合体は核酸102の転写調節領域に結合して、遺伝子発現を促進する。なお、Wntシグナル経路についての詳細は、例えば、生化学第80巻第12号,pp.1079−1093,2008が参照される。   On the other hand, FIG.1 (b) has shown the state which the cell received the stimulation by Wnt2. Wnt2 binds to and activates the receptor / cell membrane protein 11. The activated receptor / cell membrane protein 11 then activates the disheveled protein (Dvl) 17, and the activated Dvl17 binds to Axin14 and the like and suppresses the binding between Axin14 and the like and β-catenin 1 To do. Thereby, (beta) -catenin 1 escapes decomposition | disassembly by a proteasome, As a result, the intracellular density | concentration of (beta) -catenin 1 rises. Next, β-catenin 1 moves into the nucleus 101 and binds to T cell factor / Lymphocyte enhancing factor (Tcf / Lef) 18 which is a transcription factor to form a complex. It binds to the regulatory region and promotes gene expression. Details of the Wnt signal pathway are described in, for example, Biochemistry Vol. 80 No. 12, pp. Reference is made to 1079-1093, 2008.

Wnt/β−カテニン経路により発現の調節を受ける遺伝子には、細胞の増殖、分化、体軸形成および器官形成に関与する遺伝子が含まれている。そのため、β−カテニンは、これらの現象において重要な働きを有する。   Genes whose expression is regulated by the Wnt / β-catenin pathway include genes involved in cell proliferation, differentiation, body axis formation, and organ formation. Therefore, β-catenin has an important function in these phenomena.

発光酵素は、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光酵素の例は、ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼに対する発光基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ATPの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光が生じる。ルシフェラーゼは、ホタルに由来するもの、バクテリアに由来するもの、コメツキムシ(クリックビートル)に由来するもの等を使用することができる。ルシフェラーゼの具体的な例は、東洋紡績株式会社から市販されているpELucベクターに含まれるEmerald Lucである。被験試料の細胞内にて発現した発光酵素は、細胞に対して別途供給された発光基質の発光反応を促進し、その結果、発光を生じさせる。   A luminescent enzyme means an enzyme that catalyzes a chemical reaction in which luminescence occurs. An example of a luminescent enzyme is luciferase. A substance that becomes a luminescent substrate for luciferase is called luciferin. Luminescence occurs when luciferin undergoes a chemical change by the catalytic action of luciferase in the presence of ATP. As the luciferase, one derived from fireflies, one derived from bacteria, one derived from a click beetle (click beetle), or the like can be used. A specific example of luciferase is Emerald Luc contained in a pELuc vector commercially available from Toyobo Co., Ltd. The luminescent enzyme expressed in the cells of the test sample promotes the luminescent reaction of the luminescent substrate separately supplied to the cells, and as a result, generates luminescence.

発光酵素の遺伝子とプロモーター結合領域との位置関係は、プロモーター結合領域に対してプロモーターが結合した場合に、発光酵素の遺伝子の発現が促進されるような位置関係となっている。プロモーターは、例えば、被験試料の本来の生命活動に伴って、または被験試料に対する外部からの刺激等に起因してプロモーター結合領域に結合する。プロモーターのプロモーター結合領域への結合を受けて、その下流に位置する発光酵素の遺伝子の発現が促進される。   The positional relationship between the luminescent enzyme gene and the promoter binding region is such that expression of the luminescent enzyme gene is promoted when the promoter is bound to the promoter binding region. The promoter binds to the promoter binding region, for example, due to the original life activity of the test sample or due to external stimuli on the test sample. In response to the binding of the promoter to the promoter binding region, expression of the gene for the luminescent enzyme located downstream thereof is promoted.

第1画像は、発光酵素が触媒する化学反応により生じた発光を、光学的結像手段を用いて検出することにより取得される。このとき、被験試料に対して任意の方法で発光基質を提供することができる。被験試料がショウジョウバエといった変態を行う昆虫の胚である場合には、例えば、発光基質を含む溶液中に胚を浸漬し、胚の内部に発光基質を浸入させることができる。あるいは、親となる成虫に対して発光基質を含む餌を与えて、その親から産まれる胚の内部に発光基質を提供することができる。被験試料が幼虫または成虫である場合には、例えば、発光基質を混入した餌を与えることで、被験試料の体内に発光基質を提供することができる。被験試料が蛹である場合には、幼虫の段階において発光基質を混入した餌を与え、変態後の蛹の体内に発光基質を提供することができる。マイクロインジェクション法を使用することで、個体の体内に直接発光基質を提供することもできる。被験試料として胚を使用し、発光基質を含む溶液中に浸漬して発光基質を提供する場合、発光基質の濃度は好ましくは5mM以下であり、さらに好ましくは3mM以下である。発光基質の濃度が高すぎる場合、被験試料の生育に異常が生じる可能性がある。発光酵素および発光基質は、目的に応じて、種々の由来または組成物からなる溶液から任意に選ぶことができる。   The first image is acquired by detecting luminescence generated by a chemical reaction catalyzed by a luminescent enzyme using an optical imaging means. At this time, the luminescent substrate can be provided to the test sample by any method. When the test sample is an embryo of an insect that undergoes transformation such as Drosophila, for example, the embryo can be immersed in a solution containing a luminescent substrate, and the luminescent substrate can be infiltrated into the embryo. Alternatively, the parent adult worm can be fed with a luminescent substrate to provide the luminescent substrate within the embryo born from the parent. When the test sample is a larva or an adult, the luminescent substrate can be provided in the body of the test sample, for example, by giving a food mixed with the luminescent substrate. When the test sample is a pupa, a feed containing a luminescent substrate can be given at the larval stage to provide the luminescent substrate in the body of the transformed pupae. By using the microinjection method, it is also possible to provide a luminescent substrate directly in the body of an individual. When an embryo is used as a test sample and immersed in a solution containing a luminescent substrate to provide the luminescent substrate, the concentration of the luminescent substrate is preferably 5 mM or less, more preferably 3 mM or less. If the concentration of the luminescent substrate is too high, abnormalities may occur in the growth of the test sample. The luminescent enzyme and the luminescent substrate can be arbitrarily selected from solutions of various origins or compositions depending on the purpose.

図2には、第1画像および第2画像の一例が示される。図2(a)は、第2画像の例であり後述する。図2(b)および(c)は、第1画像の例である。この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を使用し、プロモーター結合領域としてArmadillo遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてELucの遺伝子を使用している。ショウジョウバエのように比較的光透過性の高い生体試料の胚、蛹、成虫においては、発光酵素、発光基質および画像取得時の露光時間を適宜組み合わせることで、生体内部の情報を、発光画像として画像取得できることが分かった。発光基質と被験試料の生体組織等の関係については、出願人による特開2007−248050号を参照してもよい。図2(b)および(c)は、それぞれ開始から1時間20分後および10時間後に取得した第1画像である。図2(b)では、被験試料の一部が発光していることがわかり、図2(c)では、被験試料の全体が発光していることがわかる。   FIG. 2 shows an example of the first image and the second image. FIG. 2A shows an example of the second image, which will be described later. 2B and 2C are examples of the first image. In this example, a Drosophila embryo is used as a test sample, a promoter binding region for the Armadillo gene is used as a promoter binding region, and an ELuc gene is used as a gene for a luminescent enzyme. In embryos, pupae, and adults of biological samples with relatively high light transmission like Drosophila, information inside the living body can be imaged as a luminescent image by appropriately combining the luminescent enzyme, luminescent substrate, and exposure time at the time of image acquisition. I found that I can get it. Regarding the relationship between the luminescent substrate and the biological tissue of the test sample, JP-A-2007-248050 by the applicant may be referred to. FIGS. 2B and 2C are first images obtained after 1 hour 20 minutes and 10 hours from the start, respectively. 2B shows that a part of the test sample emits light, and FIG. 2C shows that the entire test sample emits light.

被験試料中のプロモーターの活性の強度は、例えば、第1画像中の発光量から特定することができる。また、被験試料中のプロモーターの活性の分布は、例えば、第1画像中の発光の位置から特定することができる。   The intensity of the activity of the promoter in the test sample can be identified from the amount of luminescence in the first image, for example. Moreover, the distribution of the activity of the promoter in the test sample can be specified from the position of luminescence in the first image, for example.

本発明に係る方法は、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部構造および/または外観を示す第2画像を取得することを含む。とくに、本発明では、照明光を用いて画像取得するか励起光を照明して蛍光画像を取得するのが好ましい。しかも、被験試料の生体内部における同一の結像面について第1画像と第2画像の両方を取得し、それぞれの画像から第1画像由来および第2画像由来の内部構造を照合することにより、外表面またはその表皮近傍付近からは把握できない生体内部における形状および/またはプロモーター活性を知ることができる。さらに、生体内部における形状および/またはプロモーター活性を時系列な第1画像および第2画像を用いて解析することにより、生体内部で実際に起こっている変化を正確に把握することができる。   The method according to the present invention irradiates the test sample with irradiation light, detects light emitted from the test sample according to the irradiation light, and shows the internal structure and / or appearance of the test sample Obtaining a second image. In particular, in the present invention, it is preferable to acquire an image using illumination light or illuminate excitation light to acquire a fluorescence image. Moreover, by acquiring both the first image and the second image for the same imaging plane inside the living body of the test sample, and collating the internal structures derived from the first image and the second image from the respective images, It is possible to know the shape and / or promoter activity in the living body which cannot be grasped from the surface or the vicinity of the epidermis. Furthermore, by analyzing the shape and / or promoter activity in the living body using the first image and the second image in time series, it is possible to accurately grasp the change actually occurring in the living body.

第1画像の取得と第2画像の取得とは、ほぼ同時に行うことができる。すなわち、第1画像の取得と第2画像の取得とを同時に行うことができ、あるいは、第1画像の取得と第2画像の取得とを短時間のうちに連続して行うことができる。連続して行う場合、例えば、第1画像の取得が完了した直後に、第2画像の取得を開始することができ、またはその逆の順序で画像を取得することができる。   Acquisition of the first image and acquisition of the second image can be performed almost simultaneously. That is, the acquisition of the first image and the acquisition of the second image can be performed simultaneously, or the acquisition of the first image and the acquisition of the second image can be performed continuously in a short time. When performing continuously, for example, the acquisition of the second image can be started immediately after the acquisition of the first image is completed, or the images can be acquired in the reverse order.

照射光は、例えば、様々な波長の光が混ざったものであってよい。例えば、照射光は、タングステンランプや、ハロゲンランプといった一般的な光源から照射される光であってよい。この場合、第2画像として明視野画像が取得される。すなわち、第2画像の取得のために、照射光が被験試料を透過して生じる光および/または照射光が被験試料に反射して生じる光が検出される。照明光は、例えば可視光であり、例えば光学的結像手段に備わった光源から被験試料に対して照射される。   For example, the irradiation light may be a mixture of light of various wavelengths. For example, the irradiation light may be light emitted from a general light source such as a tungsten lamp or a halogen lamp. In this case, a bright field image is acquired as the second image. That is, for the acquisition of the second image, light generated by transmitting the irradiation light through the test sample and / or light generated by reflecting the irradiation light to the test sample is detected. The illumination light is, for example, visible light, and is irradiated to the test sample from a light source provided in the optical imaging means, for example.

図2には、第1画像および第2画像の一例が示される。図2(a)は、第2画像を明視野画像として取得した場合の例である。この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を使用し、プロモーター結合領域としてArmadillo遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてELucの遺伝子を使用している。同一の結像面における第1画像と第2画像とを照合した結果、確認できる内部構造はまだ形成されていないことがわかる。   FIG. 2 shows an example of the first image and the second image. FIG. 2A shows an example when the second image is acquired as a bright field image. In this example, a Drosophila embryo is used as a test sample, a promoter binding region for the Armadillo gene is used as a promoter binding region, and an ELuc gene is used as a gene for a luminescent enzyme. As a result of collating the first image and the second image on the same imaging plane, it can be seen that an internal structure that can be confirmed has not yet been formed.

照射光が被験試料を透過して生じる光を検出する場合、被験試料の透明度を上げる処理を行ってもよい。例えば、ガラス板上に被験試料を置き、被験試料にシリコンオイル、グリシンまたはミネラルオイル等を滴下した状態で、光学的結像手段により画像を取得することができる。   When detecting the light generated when the irradiation light passes through the test sample, a process for increasing the transparency of the test sample may be performed. For example, an image can be acquired by an optical imaging means in a state where a test sample is placed on a glass plate and silicon oil, glycine, mineral oil or the like is dropped on the test sample.

あるいは、照明光は、特定の波長の光を主に含むものであってよい。例えば、照明光は、特定の蛍光タンパク質を励起することが可能な光であってよい。この場合、被験試料としてこの特定の蛍光タンパク質を発現したもの使用し、この照明光によって蛍光タンパク質を励起させて、蛍光を生じさせることができる。この場合、この蛍光を検出することで第2画像として蛍光画像を取得することができる。   Or illumination light may mainly contain the light of a specific wavelength. For example, the illumination light may be light that can excite a specific fluorescent protein. In this case, the test sample that expresses the specific fluorescent protein can be used, and the fluorescent protein can be excited by the illumination light to generate fluorescence. In this case, a fluorescence image can be acquired as the second image by detecting this fluorescence.

蛍光タンパク質の発現は、被験試料が有する核酸中に蛍光タンパク質の遺伝子を導入することで行うことができる。蛍光タンパク質としては、既知のものを使用できる。蛍光タンパク質の例は、例えばGFPである。   The expression of the fluorescent protein can be performed by introducing a fluorescent protein gene into the nucleic acid of the test sample. Known fluorescent proteins can be used. An example of a fluorescent protein is GFP, for example.

蛍光タンパク質は、単独で被験試料の細胞中に発現させることができる。あるいは、蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質とは異なるタンパク質と融合した状態で被験試料の細胞中に発現させることができる。すなわち、蛍光タンパク質を異なるタンパク質の蛍光タグとして使用することができる。ここにおいて、異なるタンパク質は、目的に応じて選択することが可能であり、例えば特定のタイミングにおいて特定の細胞にのみ発現するものを選択することができる。   The fluorescent protein can be expressed alone in the cells of the test sample. Alternatively, the fluorescent protein can be expressed in the cells of the test sample in a fused state with a protein different from the fluorescent protein. That is, fluorescent proteins can be used as fluorescent tags for different proteins. Here, different proteins can be selected according to the purpose. For example, a protein that is expressed only in a specific cell at a specific timing can be selected.

第2画像として、上記のような明視野画像および上記のような蛍光画像を併せて取得することもできる。   As the second image, the bright field image as described above and the fluorescent image as described above can be obtained together.

被験試料の内部構造は、明視野画像を取得する場合には、被験試料を透過した光に基づいて特定することができる。一方、蛍光画像を取得する場合には、被験試料中の特定の組織や器官に特異的に発現することが既知であるタンパク質に融合した蛍光タンパク質を発現させることで、その蛍光タンパク質から発せられる蛍光に基づいてその組織や器官を特定することができる。   When acquiring a bright field image, the internal structure of the test sample can be specified based on the light transmitted through the test sample. On the other hand, when acquiring a fluorescent image, the fluorescence emitted from the fluorescent protein is expressed by expressing a fluorescent protein fused to a protein that is known to be specifically expressed in a specific tissue or organ in the test sample. The tissue or organ can be specified based on the above.

また、被験試料の外観は、明視野画像を取得する場合には、被験試料に反射して生じた光に基づいて特定することができる。一方、蛍光画像を取得する場合には、被験試料の外表面に蛍光タンパク質を発現させて、その蛍光に基づいて外観を特定することができる。被験試料の外表面に蛍光タンパク質を発現させるには、被験試料中に蛍光タンパク質を単独で発現させてもよく、被験試料の少なくとも外表面に特異的に発現することが既知のタンパク質に融合させた状態で蛍光タンパク質を発現させてもよい。   In addition, when a bright field image is acquired, the appearance of the test sample can be specified based on light generated by reflection on the test sample. On the other hand, when acquiring a fluorescence image, a fluorescent protein is expressed on the outer surface of the test sample, and the appearance can be specified based on the fluorescence. In order to express the fluorescent protein on the outer surface of the test sample, the fluorescent protein may be expressed alone in the test sample or fused to a protein known to be specifically expressed on at least the outer surface of the test sample. The fluorescent protein may be expressed in a state.

本発明の第2実施形態では、核酸は、上述のプロモーター結合領域とは異なる第2プロモーター結合領域と、その下流に位置し上述の発光酵素とは異なる第2発光酵素の遺伝子とから成る少なくとも1つの領域をさらに含む。そして、第2実施形態は、被験試料から放射される、第2発光酵素に由来する発光を検出して、被験試料における第2プロモーターの活性の強度および分布を示す第3画像を取得することをさらに含む。   In the second embodiment of the present invention, the nucleic acid comprises at least one of a second promoter-binding region different from the above-mentioned promoter-binding region and a gene of a second luminescent enzyme located downstream thereof and different from the above-mentioned luminescent enzyme. It further includes one area. And 2nd Embodiment detects the light emission derived from the 2nd luminescent enzyme radiated | emitted from a test sample, and acquires the 3rd image which shows the intensity | strength and distribution of the activity of the 2nd promoter in a test sample. In addition.

第2プロモーター結合領域は、第1画像を取得するためのプロモーター結合領域と同様に選択することができる。ただし、これらのプロモーター結合領域は、互いに異なる遺伝子の上流に位置するものである。   The second promoter binding region can be selected in the same manner as the promoter binding region for acquiring the first image. However, these promoter binding regions are located upstream of different genes.

第2発光酵素は、第1画像を取得するための発光酵素と同様に選択することができる。ただし、第1画像を取得するための発光酵素に起因して生じる蛍光の波長と、第2発光酵素に起因して生じる蛍光の波長とは異なる。特に、これらの波長は、光学的結像手段によって区別可能な程度に異なることが好ましい。   The second luminescent enzyme can be selected in the same manner as the luminescent enzyme for acquiring the first image. However, the wavelength of fluorescence generated due to the luminescent enzyme for acquiring the first image is different from the wavelength of fluorescence generated due to the second luminescent enzyme. In particular, these wavelengths are preferably different to the extent that they can be distinguished by optical imaging means.

本発明の第3実施形態では、第1画像および前記第2画像の取得は、複数回繰り返して行われる。   In the third embodiment of the present invention, acquisition of the first image and the second image is repeated a plurality of times.

取得のタイミングは任意に設定することができる。例えば、一定の間隔で取得することができる。すなわち、この場合、第1画像と第2画像とがほぼ同時に取得され、一定時間をおいて再び第1画像と第2画像とがほぼ同時に取得され、その後、必要に応じてこのような取得を繰り返すことができる。あるいは、画像の取得は、被験試料の特定の段階において選択的に行うことができる。すなわち、例えば、本発明の開始段階において第1画像と第2画像とをほぼ同時に取得し、被験試料に変化が生じた段階において再び第1画像と第2画像とをほぼ同時に取得し、その後も何らかの変化が生じる度に取得を行うことができる。   The acquisition timing can be set arbitrarily. For example, it can be acquired at regular intervals. That is, in this case, the first image and the second image are acquired almost simultaneously, the first image and the second image are acquired again almost at the same time after a predetermined time, and then such acquisition is performed as necessary. Can be repeated. Alternatively, image acquisition can be performed selectively at a particular stage of the test sample. That is, for example, the first image and the second image are acquired almost simultaneously at the start stage of the present invention, and the first image and the second image are acquired again almost simultaneously at the stage where the change occurs in the test sample. Acquisition can be performed whenever any change occurs.

本発明の第4実施形態では、被験試料の複数の異なる面の各々から第1画像および第2画像が取得される。   In the fourth embodiment of the present invention, the first image and the second image are acquired from each of a plurality of different surfaces of the test sample.

この実施形態の例を図2に示す。図3には、ショウジョウバエの胚の2つの異なる面からそれぞれ画像を取得する様子が示されている。図3(a)には、ショウジョウバエの胚200を側面から対物レンズ201で観察する様子が示されている。観察される観察面202aは、対物レンズ201の光軸に対して垂直となっている。図3(b)には、胚200を上面から対物レンズ201で観察する様子が示されている。観察される観察面202bは、対物レンズ201の光軸に対して垂直となっている。   An example of this embodiment is shown in FIG. FIG. 3 shows how images are acquired from two different faces of a Drosophila embryo, respectively. FIG. 3A shows a state in which a Drosophila embryo 200 is observed with the objective lens 201 from the side. The observation surface 202 a to be observed is perpendicular to the optical axis of the objective lens 201. FIG. 3B shows a state in which the embryo 200 is observed with the objective lens 201 from the upper surface. The observation surface 202 b to be observed is perpendicular to the optical axis of the objective lens 201.

この実施形態では、例えば、被験試料のある面から第1画像および第2画像を取得し、それとほぼ同時に別の面から第1画像および第2画像を取得することができる。あるいは、ある面から取得した後、時間をおいて別の面から取得してもよい。複数の面についての画像を同一の被験試料から取得してもよく、あるいは、取得しようとする面の数に応じて被験試料を用意し、それぞれ異なる面についての画像を取得してもよい。   In this embodiment, for example, the first image and the second image can be acquired from one surface of the test sample, and the first image and the second image can be acquired from another surface almost simultaneously. Or after acquiring from one surface, you may acquire from another surface after time. Images for a plurality of surfaces may be acquired from the same test sample, or test samples may be prepared according to the number of surfaces to be acquired, and images for different surfaces may be acquired.

本発明の第5実施形態は、第1画像および第2画像を取得する前および/または後において、被験試料に対して刺激を与えることをさらに含む。   The fifth embodiment of the present invention further includes providing a stimulus to the test sample before and / or after acquiring the first image and the second image.

被験試料への刺激と画像の取得との間の時間は任意に設定される。また、刺激の前後で画像を取得することができる。   The time between the stimulus to the test sample and the acquisition of the image is arbitrarily set. In addition, images can be acquired before and after stimulation.

刺激は、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露および加熱から成る群から選択される少なくとも1つとすることができる。   The stimulus can be at least one selected from the group consisting of administration of a drug, irradiation of light, electrical stimulation, exposure to gas, and heating.

刺激として薬剤を投与する場合、例えば、被験試料に対する影響が既知である薬剤を使用することができる。プロモーター結合領域として、β−カテニン(Armadillo)といったWnt/β−カテニン経路に関与するタンパク質に対する領域を使用する場合、そのような経路に関与するタンパク質の阻害剤を使用することができる。例えば、β−カテニンとTcfとの複合体形成を阻害するイオノマイシン、GSK−3β阻害剤である6−ブロモインジルビン−3−オキシム(BIO)等を使用することができる。あるいは、薬剤として、被験試料に対する影響が未知または不確定のものを使用することができる。例えば、抗癌剤といった薬剤の候補となる物質を投与することができる。   When a drug is administered as a stimulus, for example, a drug whose influence on the test sample is known can be used. When a region for a protein involved in the Wnt / β-catenin pathway such as β-catenin (Armadillo) is used as the promoter binding region, an inhibitor of the protein involved in such a pathway can be used. For example, ionomycin that inhibits complex formation between β-catenin and Tcf, 6-bromoindirubin-3-oxime (BIO) that is a GSK-3β inhibitor, and the like can be used. Alternatively, a drug having an unknown or uncertain influence on the test sample can be used. For example, a substance that is a drug candidate such as an anticancer drug can be administered.

刺激として光を照射する場合、光は可視光でも可視光以外の光でもよい。光は、一定時間照射し続けてもよく、短時間の一度の照射でもよく、またはパルス状に照射してもよい。   When light is irradiated as a stimulus, the light may be visible light or light other than visible light. The light may be continuously irradiated for a certain period of time, may be irradiated once for a short time, or may be irradiated in a pulse form.

電気的な刺激を行う場合、例えば被験試料に電極を挿して刺激することができる。被験試料としてショウジョウバエといった昆虫の成虫を使用する場合、神経細胞に対する応答を確認するために、成虫の神経系またはその付近に電極を挿すこともできる。   When electrical stimulation is performed, for example, an electrode can be inserted into the test sample for stimulation. When an adult insect such as Drosophila is used as a test sample, an electrode can be inserted into or around the adult nervous system in order to confirm the response to nerve cells.

刺激として被験試料をガスに曝露する場合、例えば、ガスで満たした容器に被験試料を入れることでガスに曝露することができる。ガスとして、ジエチルエーテルといった麻酔効果を有するガス等を使用することができる。あるいは、ガスとして、被験試料に対する影響を研究しようとするガスを選択することができる。例えば、アルコール依存症の研究のためにエタノールガスを使用することができる。   When the test sample is exposed to gas as a stimulus, for example, the test sample can be exposed to the gas by placing the test sample in a container filled with gas. As the gas, a gas having an anesthetic effect such as diethyl ether can be used. Alternatively, a gas for which the influence on the test sample is to be studied can be selected as the gas. For example, ethanol gas can be used for the study of alcoholism.

刺激として被験試料を加熱する場合、被験試料を直接加熱してよく、または被験試料を高温の環境に移すことでその温度まで加熱してよい。   When heating a test sample as a stimulus, the test sample may be heated directly or heated to that temperature by moving the test sample to a hot environment.

第1画像および第2画像を、刺激を与える前および後にそれぞれ少なくとも1回ずつ取得する場合、この実施形態は、刺激を与える前に取得された少なくとも1つの第1画像と刺激を与えた後に取得された少なくとも1つの第1画像とを比較し、および/または刺激を与える前に取得された少なくとも1つの第2画像と刺激を与えた後に取得された少なくとも1つの第2画像とを比較することをさらに含むことができる。   In the case where the first image and the second image are acquired at least once before and after applying the stimulus, this embodiment is acquired after applying the stimulus with at least one first image acquired before applying the stimulus. Comparing at least one first image obtained and / or comparing at least one second image obtained before applying the stimulus and at least one second image obtained after applying the stimulus Can further be included.

例えば、刺激を与えた後に複数回画像を取得する場合、取得した全ての画像を時間の進行に沿って並べることで、被験試料の状態の変動をみることができる。また、一定間隔で画像を取得し、特定のタイミングで刺激を複数回与えることもできる。   For example, when images are acquired a plurality of times after giving a stimulus, it is possible to see the change in the state of the test sample by arranging all the acquired images along the progress of time. In addition, images can be acquired at regular intervals, and stimulation can be given multiple times at specific timing.

本発明の第6実施形態は、第1画像および前記第2画像の対応する部分を抽出することをさらに含む。   The sixth embodiment of the present invention further includes extracting corresponding portions of the first image and the second image.

抽出は、その部分を四角で囲むことで、またはフリーハンドで囲むことで行うことができる。1つの画像から複数の部分を抽出することができる。この部分は、例えば、いわゆる関心領域(region of interest:ROI)として抽出することもできる。第1画像から抽出した部分について、発光量を数値化することができる。抽出および発光量の数値化は、コンピューターを用いて行うことができる。   Extraction can be performed by surrounding the portion with a square or by surrounding it with freehand. A plurality of portions can be extracted from one image. This part can also be extracted as, for example, a so-called region of interest (ROI). For the portion extracted from the first image, the light emission amount can be digitized. Extraction and quantification of the amount of luminescence can be performed using a computer.

部分の抽出の際、第2画像に含まれる内部構造および外観の情報を利用することができる。例えば、被験試料内の特定の組織や器官に対応する部分を抽出することができる。   When extracting the portion, the internal structure and appearance information included in the second image can be used. For example, a portion corresponding to a specific tissue or organ in the test sample can be extracted.

複数の画像を取得する場合、すべての画像から部分を抽出する必要はなく、特定の画像のみから必要に応じた部分を抽出することができる。例えば、第2画像から得られる情報に基づいて、特定の内部構造が確認される画像についてのみ、その構造を部分として取得することができる。   When acquiring a plurality of images, it is not necessary to extract a part from all the images, and a part according to need can be extracted from only a specific image. For example, based on information obtained from the second image, only the image in which a specific internal structure is confirmed can be acquired as a part.

本発明の第7実施形態は、第1画像と第2画像とを重ね合わせた画像を取得することをさらに含む。   The seventh embodiment of the present invention further includes obtaining an image obtained by superimposing the first image and the second image.

例えば、ほぼ同時に取得した第1画像と第2画像とを重ね合わせることができる。また、被験試料の同一の面を撮影した第1画像と第2画像とを重ね合わせることができる。重ね合わせはコンピューターを用いて行うことができる。   For example, the first image and the second image acquired almost simultaneously can be superimposed. Moreover, the 1st image and 2nd image which image | photographed the same surface of the test sample can be piled up. Superposition can be performed using a computer.

この実施形態は、重ね合わせた画像を表示または記録することをさらに含んでよい。表示および記録は、コンピューターを用いて行うことができる。   This embodiment may further include displaying or recording the superimposed image. Display and recording can be performed using a computer.

第1の実施形態によれば、生体試料由来の被験試料についての有用な情報を得ることができる。第1画像からはプロモーターの活性の強度および分布の情報が、第2画像からは被験試料の内部構造および/または外観の情報が得られるため、これらの2種類の情報から、プロモーター活性と内部構造や外観との関係等を知ることができる。   According to the first embodiment, useful information on a test sample derived from a biological sample can be obtained. Since the first image provides information on the intensity and distribution of the promoter activity and the second image provides information on the internal structure and / or appearance of the test sample, the promoter activity and internal structure are obtained from these two types of information. And the relationship with the appearance.

また、被験試料として、ショウジョウバエの受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫を使用することができ、ショウジョウバエの成長の様々な段階について情報を取得することができる。   Moreover, fertilized eggs, embryos, larvae, pupae or adults of Drosophila can be used as test samples, and information on various stages of Drosophila growth can be obtained.

第2画像として明視野画像を取得する場合、被験試料の内部構造や外観の情報を容易に取得することができる。   When a bright field image is acquired as the second image, information on the internal structure and appearance of the test sample can be easily acquired.

一方、被験試料中に蛍光タンパク質を発現させて、第2画像として蛍光画像を取得する場合、特定の内部構造や外観を蛍光で標識することが可能となり、その構造や外観をより明確に特定することが可能となる。被験試料として蛹や成虫を使用する場合、その内部構造を明視野画像により捉えることは困難となるものの、蛍光画像を取得することでこのような被験試料においても内部構造を特定することが容易となる。   On the other hand, when a fluorescent protein is expressed in a test sample and a fluorescent image is acquired as the second image, it becomes possible to label a specific internal structure or appearance with fluorescence, and the structure or appearance is specified more clearly. It becomes possible. When moths and adults are used as test samples, it is difficult to capture the internal structure from a bright-field image, but it is easy to identify the internal structure even in such test samples by acquiring a fluorescence image. Become.

さらに、被験試料中において特定のタンパク質と融合させた状態で蛍光タンパク質を発現させる場合、その特定のタンパク質が特異的に発現する細胞のみ、またはその特定のタンパク質が局在する細胞中の部位のみを蛍光標識することができる。これにより、被験試料中の特定の構造の位置や形状を第2画像から知ることができる。   Furthermore, when a fluorescent protein is expressed in a state of being fused with a specific protein in a test sample, only cells that specifically express the specific protein or only sites in cells where the specific protein is localized It can be fluorescently labeled. Thereby, the position and shape of the specific structure in the test sample can be known from the second image.

第2実施形態のように、第2プロモーター結合領域と第2発光酵素の遺伝子とをさらに含んだ核酸を有する被験試料を使用して、第2発光酵素に基づく第3画像を取得することで、1つの第1画像から複数のプロモーターの活性についての情報を得ることができる。そのような第1画像から、各プロモーター活性の強度の違いや分布の違いを知ることができる。   As in the second embodiment, by using a test sample having a nucleic acid further containing a second promoter binding region and a gene of the second luminescent enzyme, obtaining a third image based on the second luminescent enzyme, Information about the activities of a plurality of promoters can be obtained from one first image. From such a first image, it is possible to know the difference in intensity and distribution of each promoter activity.

第3実施形態のように、第1画像および前記第2画像の取得を複数回繰り返して行うことで、プロモーター活性の情報および被験試料の内部構造や外観といった情報の変化を知ることができる。特に、生体試料の胚発生や成長に伴う、プロモーター活性の変動や、内部構造等の変動を知ることができる。   As in the third embodiment, by acquiring the first image and the second image repeatedly a plurality of times, it is possible to know changes in information such as information on promoter activity and the internal structure and appearance of the test sample. In particular, it is possible to know changes in promoter activity, changes in internal structure, etc. accompanying embryogenesis and growth of biological samples.

第4実施形態のように、被験試料の複数の異なる面の各々から第1画像および第2画像を取得する場合、単一の面から画像を取得する場合と比較してより多くの情報を得ることができる。すなわち、プロモーター活性が上昇している位置や内部構造を立体的に把握することができる。これにより、そのような位置や構造をより正確に特定することができる。   When acquiring a 1st image and a 2nd image from each of several different surfaces of a test sample like 4th Embodiment, more information is acquired compared with the case where an image is acquired from a single surface. be able to. That is, the position where the promoter activity is increased and the internal structure can be grasped three-dimensionally. Thereby, such a position and structure can be specified more accurately.

第5実施形態のように、被験試料に対して刺激を与えることにより、そのような刺激を受けた状態の被験試料について、第1画像および第2画像を取得することができる。   As in the fifth embodiment, by applying a stimulus to the test sample, the first image and the second image can be acquired for the test sample that has received such a stimulus.

さらに、刺激として、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露または加熱を行った場合、それらの刺激に対する被験試料の応答を調べることができる。特に、刺激として特定の効果を与えることが既知の薬剤を投与した場合、その効果を受けた状態における被験試料の様子を調べることができる。また、投与した薬剤がどのような効果を与えるかを調べることで、薬剤のスクリーニングを行うことができる。刺激として電気を使用する場合、例えば被験試料の神経細胞への影響を調べることができる。   Furthermore, when a drug is administered, light is irradiated, electrical stimulation, gas exposure, or heating is performed as a stimulus, the response of the test sample to the stimulus can be examined. In particular, when a drug known to give a specific effect as a stimulus is administered, the state of the test sample in the state of receiving the effect can be examined. Further, drug screening can be performed by examining what effect the administered drug has. When electricity is used as a stimulus, for example, the influence of a test sample on nerve cells can be examined.

さらに、刺激の前後に画像を取得することにより、刺激を受けることによる被験試料の変化を調べることができる。刺激後に複数回画像を取得する場合には、刺激を受けた時からの経過時間に応じた被験試料の状態を調べることができる。   Furthermore, by acquiring images before and after stimulation, changes in the test sample due to the stimulation can be examined. When images are acquired a plurality of times after stimulation, the state of the test sample according to the elapsed time from when the stimulation is received can be examined.

第6実施形態のように、第1画像および前記第2画像の対応する部分を抽出する場合、そのような部分に着目して情報を取得することができる。また、そのような部分のみのプロモーター活性の量を数値化することができる。   When extracting corresponding portions of the first image and the second image as in the sixth embodiment, it is possible to acquire information by paying attention to such portions. In addition, the amount of promoter activity of only such a portion can be quantified.

第7実施形態のように、第1画像と第2画像とを重ね合わせた画像を取得する場合、第1画像に由来する発光の情報と、第2画像に由来する内部構造や外観の情報とを、重ね合わせた画像において直接照らし合わせることができる。   When acquiring an image obtained by superimposing the first image and the second image as in the seventh embodiment, information on light emission derived from the first image, information on the internal structure and appearance derived from the second image, and Can be directly matched in the superimposed image.

さらに、そのように重ね合わせた画像を表示または記録することにより、取得した画像の利用性を向上させることができる。   Furthermore, by displaying or recording such superimposed images, it is possible to improve the usability of the acquired images.

[例1:被験試料の作製および観察]
この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を作製し、第1画像および第2画像を経時的に取得した。プロモーター結合領域としてはarmadillo遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてクリックビートルに由来するルシフェラーゼの遺伝子を使用した。
[Example 1: Preparation and observation of test sample]
In this example, Drosophila embryos were prepared as test samples, and the first and second images were acquired over time. The promoter binding region for the armadillo gene was used as the promoter binding region, and the luciferase gene derived from Crick Beetle was used as the luminescent enzyme gene.

armadilloプロモーター領域およびクリックビートルルシフェラーゼ遺伝子Emerald Luc(東洋紡績株式会社)をKP124ベクターに導入し、arm::ELucベクターを作成した。   The armadillo promoter region and click beetle luciferase gene Emerald Luc (Toyobo Co., Ltd.) were introduced into the KP124 vector to prepare an arm :: ELuc vector.

このarm::ELucベクターを、86Fb系統のDrosophila melanogasterの受精卵にマイクロインジェクション法により導入した。インジェクション液の組成は、200ng/ulのarm::ELucベクターおよび0.5%のBrilliant Blue FCFとした。受精卵を発生させ、成虫を得た。   This arm :: ELuc vector was introduced into a fertilized egg of Drosophila melanogaster of 86Fb strain by a microinjection method. The composition of the injection solution was 200 ng / ul arm :: ELuc vector and 0.5% Brilliant Blue FCF. Fertilized eggs were generated and adults were obtained.

この成虫について、図4に示される掛け合わせを行い、発光ショウジョウバエ系統であるarm::ELuc系統を作製した。   About this adult, crossing shown by FIG. 4 was performed and the luminescence Drosophila strain | arm :: ELuc strain | stump | stock was produced.

このarm::ELuc系統の胚について発光イメージングを行った。胚を、3mMの濃度のルシフェリン溶液中に入れた。胚は2つ用意し、一方については胚の側面からイメージングし、他方については胚の上面からイメージングした。発光イメージングシステムLV200(オリンパス株式会社)を使用し、Andor、EM−gain 255、binning 1x1、60x対物と設定した。明視野画像の取得のための露光時間は100m秒とし、発光画像の取得のための露光時間は4.5分とした。5分間隔で22時間撮像を続けた。   Luminescence imaging was performed on this arm :: ELuc embryo. Embryos were placed in a 3 mM luciferin solution. Two embryos were prepared, one imaged from the side of the embryo and the other imaged from the top surface of the embryo. A luminescence imaging system LV200 (Olympus Corporation) was used, and Andor, EM-gain 255, binning 1 × 1, and 60 × objective were set. The exposure time for acquiring the bright field image was 100 ms, and the exposure time for acquiring the luminescent image was 4.5 minutes. Imaging was continued for 22 hours at 5-minute intervals.

取得した第1画像および第2画像の内、代表的な4つの段階の画像を図5に示す。図5(a)は、開始から1時間55分の時点で取得された画像であり、左上には側面から見た第2画像(明視野)、左下には側面から見た第1画像(発光)、右上には上面から見た第2画像(明視野)および右下には側面から見た第2画像(発光)がそれぞれ示されている。図5(b)から(d)は、それぞれ6時間45分、9時間および10時間5分の時点で取得された画像であり、各時点での4つの画像の配置は図5(a)と同じである。なお、第1画像は、発光強度に応じて色を付した疑似カラー画像として取得したが、図5はそれをモノクロで表現したものである。   FIG. 5 shows representative four-stage images of the acquired first and second images. FIG. 5A is an image acquired at the time of 1 hour 55 minutes from the start, the second image seen from the side (bright field) in the upper left, and the first image seen from the side in the lower left (light emission). ), The second image (bright field) seen from the upper surface is shown in the upper right, and the second image (light emission) seen from the side is shown in the lower right. FIGS. 5B to 5D are images acquired at the time points of 6 hours 45 minutes, 9 hours, and 10 hours 5 minutes, respectively, and the arrangement of the four images at each time point is as shown in FIG. The same. The first image was acquired as a pseudo color image colored according to the emission intensity, but FIG. 5 represents it in monochrome.

第2画像(明視野)から、胚の外観および内部構造の様子がわかる。特に、時間の経過とともに、胚の内部に構造が形成されていくことがわかる。また、側面および上面の画像から、その構造を立体的に把握することができる。   From the second image (bright field), the appearance and internal structure of the embryo can be seen. In particular, it can be seen that the structure is formed inside the embryo over time. Moreover, the structure can be grasped three-dimensionally from the images of the side surface and the top surface.

第1画像(蛍光)から、プロモーター活性が上昇する時期および部位がわかる。プロモーター活性の様子から、armadilloタンパク質(β−カテニンのホモログ)の発現の状態を推定できる。図5(a)から(b)に示されるように、初期の段階ではarmadilloタンパク質はほとんど発現していないのに対し、図5(c)に示されるように、9時間後の時点では、特定の位置において発現が上昇しており、さらに図5(d)に示されるように10時間を過ぎた段階では、発現する位置が広がり、さらにその量も上昇していることがわかる。また、図5(d)において、側面から見た場合、胚の1か所が強く発現していることがわかるものの、上面から見た場合、その強い発現を示す部分は胚の左右にそれぞれ存在することがわかる。   From the first image (fluorescence), it can be seen when and where the promoter activity increases. From the state of promoter activity, the state of expression of armadillo protein (β-catenin homolog) can be estimated. As shown in FIGS. 5 (a) to 5 (b), the armadillo protein is hardly expressed at the initial stage, whereas, as shown in FIG. It can be seen that the expression increases at the position of, and as shown in FIG. 5 (d), at the stage where 10 hours have passed, the position of expression spreads and the amount thereof also increases. In addition, in FIG. 5 (d), it can be seen that one place of the embryo is strongly expressed when viewed from the side, but when viewed from the top, the portions showing the strong expression are present on the left and right sides of the embryo, respectively. I understand that

[例2:薬剤(イオノマイシン)投与に対する応答の観察]
上記例1のように作製した胚に対して薬剤(イオノマイシン)を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
[Example 2: Observation of response to drug (ionomycin) administration]
A drug (ionomycin) was administered to the embryo produced as in Example 1 above, and the appearance of the embryo after administration was observed.

イオノマイシンの構造式は、図6(c)に示される。イオノマイシンはβ−カテニンとTCFの結合を阻害する。この結合が阻害される結果、図1(b)に示されるような、核101の内部におけるβ−カテニン/TCF複合体の核酸102への結合が生じない。その結果、Wnt/β−カテニン経路によって発現が誘導される遺伝子の転写活性が低下すると考えられる。   The structural formula of ionomycin is shown in FIG. Ionomycin inhibits the binding of β-catenin and TCF. As a result of inhibition of this binding, binding of the β-catenin / TCF complex to the nucleic acid 102 does not occur in the nucleus 101 as shown in FIG. As a result, it is considered that the transcriptional activity of genes whose expression is induced by the Wnt / β-catenin pathway is reduced.

上記例1にて作製した胚を10μMのイオノマイシンを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、イオノマイシンを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例1と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。   The embryo prepared in Example 1 was immersed in a solution containing 10 μM ionomycin. As a control, another embryo was immersed in a solution without ionomycin. These embryos were observed over time under the same conditions as in Example 1 above. However, in this example, an image was acquired only from the side.

図6(a)および(b)には、このようにして取得された画像が示される。図6(a)は、イオノマイシンを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から7時間15分の時点に取得した画像であり、右は開始から16時間20分の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第2画像(明視野)であり、下は第1画像(発光)である。図6(b)は、イオノマイシンを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図6(a)と同様である。   FIGS. 6A and 6B show images acquired in this way. FIG. 6 (a) is an image obtained from a control embryo not administered with ionomycin. The left is an image acquired at 7 hours and 15 minutes from the start, and the right is an image acquired at 16 hours and 20 minutes from the start. In each, the top is the second image (bright field) and the bottom is the first image (light emission). FIG.6 (b) is the image acquired from the embryo which administered ionomycin, and arrangement | positioning of each image is the same as that of Fig.6 (a).

図6(a)と(b)との比較から、7時間15分の時点において、コントロールの胚では、頭部側(胚の左側)においてわずかに発現していることがわかるものの、イオノマイシンを投与した胚ではそのような発現が観察できない程度に抑制されていることがわかる。さらに、16時間20分の時点では、コントロールの胚では、全体的に発現しており、特に腹部の発現が強くなっているのに対し、投与した胚では頭部および前胸部の発現は観察できない程度に抑制されており、さらに腹部の発現量はコントロールと比較して低下しており、その分布にも違いがあることがわかる。   From comparison between FIGS. 6 (a) and (b), it can be seen that the control embryo is slightly expressed on the head side (left side of the embryo) at the time point of 7 hours and 15 minutes, but ionomycin was administered. It can be seen that such expression is suppressed to such an extent that it cannot be observed in the embryo. In addition, at 16 hours and 20 minutes, the control embryos are generally expressed, especially in the abdomen, whereas in the administered embryos, the expression of the head and front chest cannot be observed. It is suppressed to a certain extent, and further, the expression level of the abdomen is decreased as compared with the control, and it can be seen that there is a difference in the distribution.

なお、観察を続けた結果、イオノマイシンを投与した胚は、コントロールの胚と同様に孵化した。   As a result of continuing observation, embryos administered with ionomycin hatched in the same manner as control embryos.

[例3:薬剤(BIO)投与に対する応答の観察]
上記例1のように作製した胚に対して薬剤(6−ブロモインジルビン−3−オキシム)を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
[Example 3: Observation of response to drug (BIO) administration]
A drug (6-bromoindirubin-3-oxime) was administered to the embryo prepared as in Example 1 above, and the state of the embryo after administration was observed.

6−ブロモインジルビン−3−オキシム(BIO)の構造式は、図7(c)に示される。BIOはGSK−3βの機能を阻害する、図1(a)に示されるように、Wnt2による刺激がない場合に、GSK−3β15はβ−カテニン1と結合し、β−カテニン1の分解を促進する。BIOによって、GSK−3β15の機能が阻害されると、β−カテニン1の分解が抑制されることが予想される。   The structural formula of 6-bromoindirubin-3-oxime (BIO) is shown in FIG. 7 (c). BIO inhibits the function of GSK-3β. As shown in FIG. 1A, GSK-3β15 binds to β-catenin 1 and promotes the degradation of β-catenin 1 in the absence of stimulation by Wnt2. To do. When the function of GSK-3β15 is inhibited by BIO, it is expected that the degradation of β-catenin 1 is suppressed.

上記例1にて作製した胚を2μMのBIOを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、BIOを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例1と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。   The embryo prepared in Example 1 was immersed in a solution containing 2 μM BIO. As a control, another embryo was immersed in a solution without BIO. These embryos were observed over time under the same conditions as in Example 1 above. However, in this example, an image was acquired only from the side.

図7(a)および(b)には、このようにして取得された画像が示される。図7(a)は、BIOを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から1時間20分の時点に取得した画像であり、右は開始から10時間の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第2画像(明視野)であり、下は第1画像(発光)である。図7(b)は、BIOを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図7(a)と同様である。   FIGS. 7A and 7B show images acquired in this way. FIG. 7A is an image obtained from a control embryo not administered with BIO. The left is an image acquired at 1 hour 20 minutes from the start, and the right is an image acquired at 10 hours from the start. In each, the top is the second image (bright field) and the bottom is the first image (light emission). FIG. 7B is an image acquired from an embryo administered with BIO, and the arrangement of each image is the same as that in FIG.

図7(a)および(b)から、BIOを投与した胚では、1時間20分という発生初期の段階から、頭部に非常に強い発現が生じることがわかる。さらに、時間が進行するにつれて、BIOを投与した胚では、胚全体において発現が上昇していることがわかる。   7 (a) and 7 (b), it can be seen that very strong expression occurs in the head from the early stage of development of 1 hour 20 minutes in the embryo administered with BIO. Furthermore, as time progresses, it can be seen that in the embryo administered with BIO, the expression is increased throughout the embryo.

なお、30時間を経過しても、BIOを投与した胚では、発生が進行せず、孵化に至ることはなかった。   In addition, even if 30 hours passed, development did not progress in embryos administered with BIO, and hatching did not occur.

[例4:薬剤(ラパマイシン)投与に対する応答の観察]
上記例1のように作製した胚に対して薬剤(ラパマイシン)を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
[Example 4: Observation of response to drug (rapamycin) administration]
A drug (rapamycin) was administered to the embryo produced as in Example 1 above, and the appearance of the embryo after administration was observed.

ラパマイシンの構造式は、図8(c)に示される。ラパマイシンは、Mammalian target of rapamycin(mTOR)を特異的に阻害する。免疫抑制剤として使用され、癌治療の作用があることや寿命延長効果(酵母、線虫、ショウジョウバエ、マウス)を有することなどが知られている。   The structural formula of rapamycin is shown in FIG. Rapamycin specifically inhibits Mammalian target of rapamycin (mTOR). It is used as an immunosuppressant, and is known to have a cancer treatment effect and to have a life extension effect (yeast, nematode, drosophila, mouse).

上記例1にて作製した胚を1μMのラパマイシンを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、ラパマイシンを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例1と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。   The embryo produced in Example 1 was immersed in a solution containing 1 μM rapamycin. As a control, another embryo was immersed in a solution without rapamycin. These embryos were observed over time under the same conditions as in Example 1 above. However, in this example, an image was acquired only from the side.

図8(a)および(b)には、このようにして取得された画像が示される。図8(a)は、ラパマイシンを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から1時間20分の時点に取得した画像であり、右は開始から17時間5分の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第2画像(明視野)であり、下は第1画像(発光)である。図8(b)は、ラパマイシンを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図8(a)と同様である。   FIGS. 8A and 8B show images acquired in this way. FIG. 8A is an image obtained from a control embryo not administered with rapamycin. The left is an image acquired at 1 hour 20 minutes from the start, and the right is an image acquired at 17 hours 5 minutes from the start. In each, the top is the second image (bright field) and the bottom is the first image (light emission). FIG. 8B is an image obtained from an embryo administered with rapamycin, and the arrangement of each image is the same as in FIG.

図8(a)および(b)から、1時間20分の段階では、ラパマイシンを投与した胚は、コントロールと同様に発生し、発現パターンもほぼ同じであるものの、コントロールと比較して発現は高いことがわかる。さらに、17時間20分において、コントロールの胚では陥入が生じているものの(明視野画像)、投与した胚では、正常な発生が生じていないことがわかり、また、発現パターンもコントロールとは異なることがわかる。   8 (a) and (b), at the stage of 1 hour and 20 minutes, the embryo administered with rapamycin develops in the same manner as the control, and the expression pattern is almost the same, but the expression is higher than that of the control. I understand that. Furthermore, at 17 hours and 20 minutes, it was found that the control embryo had invaginated (bright field image), but the administered embryo did not have normal development, and the expression pattern was also different from the control. I understand that.

なお、50時間を経過しても、ラパマイシンを投与した胚では、孵化に至ることはなかった。   Even after 50 hours, the embryos administered with rapamycin did not hatch.

1…β−カテニン、1’…分解されたβ−カテニン、2…Wnt、11…受容体/細胞膜タンパク質、12…CK1α、13…APC、14…Axin、15…GSK−3β、16…ユビキチン、17…Dvl、18…Tcf/Lef、100…細胞膜、101…核、102…核酸、200…胚、201…対物レンズ、202a、202b…観察面。   1 ... β-catenin, 1 ′ ... degraded β-catenin, 2 ... Wnt, 11 ... receptor / cell membrane protein, 12 ... CK1α, 13 ... APC, 14 ... Axin, 15 ... GSK-3β, 16 ... ubiquitin, 17 ... Dvl, 18 ... Tcf / Lef, 100 ... cell membrane, 101 ... nucleus, 102 ... nucleic acid, 200 ... embryo, 201 ... objective lens, 202a, 202b ... observation surface.

Claims (14)

プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料内部の結像面における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第1画像を取得すること、および
前記第1画像の取得と同時にまたは前記取得と連続して、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部の結像面における内部構造および外観を示す第2画像を取得することを含む光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法であって、
前記第1画像と前記第2画像は被験試料内部における同一の結像面について取得されたものである方法
Detecting luminescence derived from the luminescent enzyme emitted from a test sample derived from a biological sample having a nucleic acid containing a promoter binding region and a luminescent enzyme gene located downstream thereof, Acquiring a first image showing the intensity and distribution of the activity of the promoter on the imaging plane, and irradiating the test sample with irradiation light simultaneously with the acquisition of the first image or continuously with the acquisition And optical imaging means including detecting light emitted from the test sample in response to the irradiation light and obtaining a second image showing an internal structure and appearance of an imaging surface inside the test sample a method for obtaining a test image of a sample from a biological sample using,
The method in which the first image and the second image are acquired on the same imaging plane inside the test sample .
前記被験試料は、ショウジョウバエの受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫である請求項1に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the test sample is a Drosophila fertilized egg, embryo, larva, moth or adult. 前記第2画像は、前記照射光が前記被験試料を透過して生じる光および/または前記照射光が前記被験試料に反射して生じる光を検出することにより得られる請求項1または2に記載の方法。   3. The second image according to claim 1, wherein the second image is obtained by detecting light generated when the irradiation light is transmitted through the test sample and / or light generated when the irradiation light is reflected by the test sample. Method. 前記核酸は蛍光タンパク質の遺伝子をさらに含み、前記照射光は前記蛍光タンパク質を励起することができる光であり、前記第2画像は、前記被験試料中で発現した前記蛍光タンパク質から放射される蛍光を検出することにより得られる請求項1または2に記載の方法。   The nucleic acid further includes a gene for a fluorescent protein, the irradiation light is light capable of exciting the fluorescent protein, and the second image shows fluorescence emitted from the fluorescent protein expressed in the test sample. The method according to claim 1 or 2, which is obtained by detection. 前記蛍光タンパク質は、前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質と融合した状態で前記被験試料中に存在する請求項4に記載の方法。   The method according to claim 4, wherein the fluorescent protein is present in the test sample in a fused state with a protein different from the fluorescent protein. 前記核酸は、前記プロモーター結合領域とは異なる第2プロモーター結合領域と、その下流に位置し前記発光酵素とは異なる第2発光酵素の遺伝子とから成る少なくとも1つの領域をさらに含み、
前記被験試料から放射される、前記第2発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記第2プロモーターの活性の強度および分布を示す第3画像を取得することをさらに含む請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
The nucleic acid further includes at least one region consisting of a second promoter binding region different from the promoter binding region and a gene of a second luminescent enzyme located downstream thereof and different from the luminescent enzyme,
The method further comprises detecting luminescence derived from the second luminescent enzyme emitted from the test sample to obtain a third image showing the intensity and distribution of the activity of the second promoter in the test sample. 6. The method according to any one of 1 to 5.
前記第1画像および前記第2画像の取得は、経時的に複数回繰り返して行われる請求項1から6の何れか1項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the acquisition of the first image and the second image is repeatedly performed a plurality of times over time . 前記被験試料の複数の異なる面の各々から前記第1画像および前記第2画像が取得される請求項1から7の何れか1項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the first image and the second image are acquired from each of a plurality of different surfaces of the test sample. 前記第1画像および前記第2画像を取得する前および/または後において、前記被験試料に対して刺激を与えることをさらに含む請求項1から8の何れか1項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 8, further comprising applying a stimulus to the test sample before and / or after acquiring the first image and the second image. 前記刺激は、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露および加熱から成る群から選択される少なくとも1つである請求項9に記載の方法。   The method according to claim 9, wherein the stimulation is at least one selected from the group consisting of administration of a drug, irradiation with light, electrical stimulation, exposure to a gas, and heating. 前記第1画像および前記第2画像は、前記刺激を与える前および後にそれぞれ少なくとも1回ずつ取得され、
前記刺激を与える前に取得された少なくとも1つの前記第1画像と前記刺激を与えた後に取得された少なくとも1つの前記第1画像とを比較し、および/または前記刺激を与える前に取得された少なくとも1つの前記第2画像と前記刺激を与えた後に取得された少なくとも1つの前記第2画像とを比較することをさらに含む請求項9または10に記載の方法。
The first image and the second image are acquired at least once before and after applying the stimulus,
Comparing at least one of the first images acquired before applying the stimulus with at least one of the first images acquired after applying the stimulus and / or acquired before applying the stimulus 11. The method of claim 9 or 10, further comprising comparing at least one of the second images and at least one of the second images obtained after applying the stimulus.
前記第1画像および前記第2画像の対応する部分を抽出することをさらに含む請求項1から11の何れか1項に記載の方法。   The method according to claim 1, further comprising extracting corresponding portions of the first image and the second image. 前記第1画像と前記第2画像とを重ね合わせた画像を取得することをさらに含む請求項1から12の何れか1項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 12, further comprising obtaining an image obtained by superimposing the first image and the second image. 前記重ね合わせた画像を表示または記録することをさらに含む請求項13に記載の方法。   The method of claim 13, further comprising displaying or recording the superimposed image.
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JPH0829694A (en) * 1994-07-20 1996-02-02 Nikon Corp Microscope with image processor
EP2562266B1 (en) * 2005-03-30 2016-02-24 Olympus Corporation Predetermined site luminescence measuring method, predetermined site luminescence measuring apparatus, expression amount measuring method, and measuring apparatus
JP5058483B2 (en) * 2005-09-14 2012-10-24 オリンパス株式会社 Long-term or continuous detection method for biological samples
JP5307539B2 (en) * 2006-05-31 2013-10-02 オリンパス株式会社 Biological sample imaging method and biological sample imaging apparatus
JP5860805B2 (en) * 2010-03-23 2016-02-16 オリンパス株式会社 Method for monitoring the differentiation state of stem cells

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