JP6045292B2 - Cell counting device and cell counting program - Google Patents
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Description
本発明は、細胞画像群に基づいて、細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムに関する。 The present invention relates to a cell counting device and a cell counting program for counting the number of cells based on a group of cell images.
いわゆるライフサイエンス分野においては、以前より、顕微鏡を用いて撮影された細胞の画像(以降、細胞画像と称する)に基づいた種々の細胞解析が行われている。例えばES細胞やiPS細胞等の幹細胞の研究においては、細胞分裂メカニズムの解明や、創薬開発等を目的とした細胞解析が行われている。より詳しくは、タイムラプス(微速度撮影)により時系列で撮像された複数の細胞画像(以降、細胞画像群と称する)に基づいて、細胞の分裂過程や形態的特徴変化等を観察し、細胞毎の性質の違いを調べるといった解析(以降、細胞解析と称する)が、以前より行われている。 In the so-called life science field, various cell analyzes based on images of cells taken with a microscope (hereinafter referred to as cell images) have been performed. For example, in the study of stem cells such as ES cells and iPS cells, cell analysis for the purpose of elucidating the mechanism of cell division and developing drug discovery has been performed. More specifically, cell division processes, morphological feature changes, etc. are observed based on a plurality of cell images (hereinafter referred to as cell image groups) captured in time series by time lapse (time-lapse photography), and each cell is observed. Analysis (hereinafter referred to as cell analysis), such as investigating the difference in properties, has been performed.
上述したような細胞解析に関しては、従来では目視によって行われていた個々の細胞のスクリーニング等の煩雑な作業を、画像認識等の画像処理技術を応用することで自動化することが可能になりつつある。このような画像処理技術を応用すれば、細胞画像中に含まれる個々の細胞を自動的に認識し、その形態的特徴、細胞数及びその変化、並びに、個々の細胞を追跡することによる細胞の移動量等を把握することができる。特に細胞分裂に伴う細胞数の変化は、細胞の活性度合いを表す重要な指標となるものである。一方で、目視による細胞分裂の確認、細胞数計数及び確認記録作業は単調かつ非常に手間のかかる煩雑な作業である。したがって、画像認識技術及び画像追跡技術を応用した細胞数計数の自動化が望まれている。 With regard to the cell analysis as described above, it is becoming possible to automate complicated operations such as screening of individual cells that have been conventionally performed visually by applying image processing techniques such as image recognition. . By applying such image processing technology, the individual cells included in the cell image are automatically recognized, and the morphological characteristics, the number of cells and the changes thereof, and the tracking of the individual cells are followed. The amount of movement can be grasped. In particular, the change in the number of cells accompanying cell division is an important index representing the degree of cell activity. On the other hand, visual confirmation of cell division, counting of cells, and confirmation recording are monotonous and very troublesome operations. Therefore, it is desired to automate cell number counting by applying image recognition technology and image tracking technology.
ところで、細胞解析対象となる細胞画像の取得には、細胞を蛍光プローブ等の外部試薬で染色し、励起光を当てることで蛍光を得る蛍光顕微鏡が用いられる場合も多い。しかしながら、光毒性や外部試薬の影響を考慮して、細胞に対する負荷が少ない明視野顕微鏡により撮影された画像が用いられる場合もある。明視野顕微鏡の一種である位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡は、光の回折や干渉現象を利用した顕微鏡であり、異なる屈折率を持つ物質間を透過する光の位相差(光路差)をコントラストとして得ることができる顕微鏡である。したがって、このような顕微鏡は、透明な細胞や微生物等を対象物とした観察に適した顕微鏡である。以上のことから、明視野顕微鏡画像に基づく精度の良い細胞解析、又は細胞計数処理が望まれている。 By the way, in order to acquire a cell image to be analyzed, a fluorescence microscope is often used in which cells are stained with an external reagent such as a fluorescent probe and fluorescence is obtained by applying excitation light. However, in consideration of phototoxicity and the influence of external reagents, there are cases where an image taken with a bright field microscope with a small load on cells is used. Phase contrast microscopes and differential interference microscopes, which are types of bright field microscopes, are microscopes that use light diffraction and interference phenomena, and use the phase difference (optical path difference) of light transmitted between materials with different refractive indexes as contrast. It is a microscope that can be obtained. Therefore, such a microscope is a microscope suitable for observation using transparent cells, microorganisms, and the like as objects. From the above, accurate cell analysis or cell counting processing based on bright-field microscope images is desired.
一般に、細胞画像中から細胞の個々の領域を特定(以降、細胞認識と称する)し、細胞数を計数する場合、細胞画像から細胞境界線上にあるエッジ成分を所定のエッジ抽出処理等により抽出し、このエッジ成分を手がかりに細胞領域を切り分けることが行われている。しかしながら、明視野顕微鏡を用いて収集した細胞画像は、細胞内に含まれる細胞核等の内部構造に起因するエッジ成分と、細胞境界線上にあるエッジ成分とが混在し、精度良く細胞境界線上のエッジ成分だけを得ることは困難である。このため、正確に細胞領域を特定することは難しく、例えば一つの細胞領域が複数の細胞領域として誤認識されてしまったり、複数の細胞領域が一つの細胞領域として誤認識されてしまったり等の種々の誤認識が生じる可能性が大きい。その結果、正確な細胞数の計数は困難である。 In general, when specifying individual areas of cells from a cell image (hereinafter referred to as cell recognition) and counting the number of cells, edge components on the cell boundary line are extracted from the cell image by a predetermined edge extraction process or the like. The cell region is divided by using the edge component as a clue. However, cell images collected using a bright-field microscope have a mixture of edge components due to internal structures such as cell nuclei contained in the cells and edge components on the cell boundary line. It is difficult to obtain only the ingredients. For this reason, it is difficult to specify a cell region accurately. For example, one cell region is misrecognized as a plurality of cell regions, or a plurality of cell regions are misrecognized as one cell region. There is a high possibility that various misrecognitions occur. As a result, accurate cell counts are difficult.
明視野顕微鏡に基づく細胞画像から細胞数を精度良くカウントするための技術が提案されている。例えば特許文献1に開示されている技術は、明視野顕微鏡によるタイムラプス(微速度撮影)画像において細胞数をカウントすることで細胞の成育状況を観察する細胞観察装置に係るものである。この細胞観察装置は、細胞数のカウントにおいて、まずタイムラプス画像列の最初のフレームに写っている細胞の数を初期値として算出する。次に細胞観察装置は、タイムラプス画像列内においてハロ(アーティファクト)と呼ばれる強いコントラストが発生している細胞を分裂期にある細胞として検出し、これら細胞の追跡を行い細胞分裂が完了したか否かを確認する。続いて細胞観察装置は、細胞分裂が確認できた細胞の数を細胞数の初期値に順次加算していくことにより、観察中の細胞数の総数を更新する。
A technique for accurately counting the number of cells from a cell image based on a bright field microscope has been proposed. For example, the technique disclosed in
上述の特許文献1に係る技術で用いられているハロは、細胞の分裂期の細胞境界線上においてのみ現れるに限らず、分裂期にない細胞境界線上においても現れる。また細胞の分裂が進み多数の細胞が密集して隣り合う場合などにおいては、密着した細胞間の境界線上に強くハロが現れる。このため、ハロに基づいて分裂期の細胞を精度良く抽出することは難しい。
The halo used in the technique according to
本発明は、時系列的に得られた複数の細胞画像に基づいて、精度良く細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a cell counting device and a cell counting program for counting the number of cells with high accuracy based on a plurality of cell images obtained in time series.
前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、細胞計数装置は、時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得する画像取得部と、前記細胞画像群のうち所定の第1の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第1の数を決定する第1の計数部と、前記細胞画像群のうち前記第1の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第2の数を決定する母細胞検出部と、前記第1の数と前記第2の数とに基づいて、前記第1の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第2の計数部と、を備え、前記第1の計数部は、前記第1の時点における前記細胞数を前記第1の数とし、前記母細胞検出部は、円形の細胞を前記細胞分裂直前の前記母細胞として検出し、各々の前記細胞画像において、新たに発生した前記母細胞の細胞数を前記第2の数とし、前記第2の計数部は、前記第1の数に前記細胞画像毎に得られた前記第2の数を加算することで前記現細胞数を算出する。 In order to achieve the above object, according to one aspect of the present invention, the cell counting apparatus acquires an image for acquiring a cell image group including a plurality of cell images representing a time-dependent change of a living cell imaged in time series. A first counting unit for determining a first number by counting the number of cells present in the cell image captured at a predetermined first time point in the cell image group, and the cell image group A mother cell detection unit for detecting and counting mother cells immediately before cell division based on the shape of the cells from the cell images captured after the first time point, and determining a second number; , wherein the first number on the basis of the second number, and a second counting unit for calculating the current number of cells in the acquisition point of the first point on any of the cell image, the The first counting unit sets the number of cells at the first time point as the first number, The mother cell detection unit detects a circular cell as the mother cell immediately before the cell division, and in each of the cell images, sets the number of newly generated mother cells as the second number, and The second counting unit calculates the current cell number by adding the second number obtained for each cell image to the first number .
前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、細胞計数プログラムは、時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得することと、前記細胞画像群のうち所定の第1の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して、前記第1の時点における前記細胞数を第1の数として決定することと、前記細胞画像群のうち前記第1の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、円形の細胞を細胞分裂直前の母細胞として検出して計数し、各々の前記細胞画像において、新たに発生した前記母細胞の細胞数を第2の数として決定することと、前記第1の数に前記細胞画像毎に得られた前記第2の数を加算することで、前記第1の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出することと、をコンピュータに実行させる。
To achieve the above object, according to one aspect of the present invention, a cell counting program obtains a cell image group including a plurality of cell images representing a time-dependent change of a living cell imaged along a time series. and said cell of the image group by counting the number of cells present in the cell image captured at a predetermined first time point to determine the number of cells in the first time point as a first number , from the cell image the cell image in captured after the first time point of the group, based on the shape of the cells was counted by detecting the circular cells as parent cells of the immediately preceding cell division, each of the In the cell image, determining the number of newly generated mother cells as a second number, and adding the second number obtained for each cell image to the first number , Any of the cell fractions after the first time point And calculating the current number of cells in the time of obtaining, causes the computer to execute.
本発明によれば、時系列的に得られた複数の細胞画像に基づいて、精度良く細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムを提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell counting apparatus and a cell counting program for counting the number of cells with high accuracy based on a plurality of cell images obtained in time series.
以下、本発明の一実施形態に係る細胞計数装置及び細胞計数プログラムについて、図面を参照して説明する。本発明の一実施形態に係る細胞計数装置を備えた顕微鏡システムの構成例を図1に示す。この図に示されるように、顕微鏡システム1は、顕微鏡10と、顕微鏡10に設けられた撮像部20と、本実施形態に係る細胞計数装置を含む制御装置30と、入力装置40と、表示装置50とを備える。
Hereinafter, a cell counting device and a cell counting program according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 shows a configuration example of a microscope system including a cell counting device according to an embodiment of the present invention. As shown in this figure, a
顕微鏡10は、例えば明視野顕微鏡である。顕微鏡10は、細胞の画像が得られれば、蛍光顕微鏡や、共焦点レーザ走査型顕微鏡等でもよい。ただし、明視野顕微鏡であるとき、本実施形態に係る細胞計数装置は顕著な効果を奏する。顕微鏡10は、明視野顕微鏡のうち、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡であることが好ましい。撮像部20は、例えばCCDカメラ等であり、顕微鏡による細胞の拡大画像を撮像する。このようにして得られた細胞の画像を以降、細胞画像と称する。撮像部20として、細胞画像が得られれば、フォトマル等を利用する共焦点レーザ走査型顕微鏡による画像取得が用いられてもよい。
The
制御装置30は、例えばPCで構成される。制御装置30は、CPU32と、メモリ34と、HDD36と、インターフェース(I/F)38とを含む。制御装置30は、顕微鏡10、撮像部20、入力装置40、表示装置50に接続されている。制御装置30は、撮像部20の動作や、顕微鏡10の動作を制御する。また、制御装置30は、撮像部20で得られた画像の画像処理を含む各種演算を行う。また、本実施形態に係る細胞計数装置は、制御装置30が含むCPU32、メモリ34、HDD36等により実現されている。この細胞計数装置は、HDD36に記録された細胞計数プログラムに従ってCPU32が演算を行うことで、撮像部20から入力された顕微鏡10により取得された細胞画像について、細胞の計数を行う。なお、メモリ34は、必要な情報やCPU32の演算結果等を一時記憶する。また、細胞計数装置は、I/F38を介して、例えば記録メディアに記録された細胞画像や、ネットワークを介して取得された細胞画像について細胞の計数を行うこともできる。細胞計数装置による細胞計数結果は、I/F38を介して外部の記録メディアやネットワークに出力されてもよい。細胞計数プログラムは、I/F38を介して接続された記録媒体や、ネットワークを介して接続されたサーバに記録されていてもよい。
The
入力装置40はキーボードやマウス等を含む。入力装置40にはユーザの指示が入力される。入力装置40は、入力されたユーザの指示を制御装置30に出力する。表示装置50は、例えば液晶ディスプレイといったディスプレイ等であり、制御装置30による制御情報や、撮像部20で取得された細胞画像等を表示する。また、表示装置50は、本実施形態に係る細胞計数装置に係る設定情報や計数結果等の各種情報を表示する。この他に、制御装置30には、プリンタなどの出力装置が接続されてもよい。
The
本実施形態に係る細胞計数装置について説明する。細胞計数装置100の機能ブロック図を図2に示す。この図に示されるように、細胞計数装置100は、制御部110と、画像取得部120と、細胞認識部130と、初期細胞数計数部140と、初期細胞数記録部150と、前フレーム画像記録部160と、細胞追跡部170と、消失細胞記録部180と、母細胞検出部200と、新規母細胞記録部190と、細胞数計数部250とを備える。細胞計数装置100には、例えば撮像部20と、出力部300とが接続されている。
The cell counting device according to the present embodiment will be described. A functional block diagram of the
制御部110は、当該細胞計数装置100の各部に接続され、それら各部を統括的に制御するシステムコントローラである。画像取得部120は、例えば撮像部20から例えば顕微鏡を用いて撮像された細胞画像を取得する。
The
撮像部20は、例えばCCD等の撮像素子とA/D変換器とを有し、明視野顕微鏡の一種である位相差顕微鏡(Phase contrast microscope)に取り付けられたカメラである。このカメラは、位相差顕微鏡を利用した撮影で取得した細胞の位相差像をデジタル信号に変換し、例えば8ビット(256階調)のモノクロ原画像信号として出力する。このカメラは、カラー画像を出力するカメラ等でもよい。
The
撮像部20は、タイムラプス(微速度撮影)によって、例えば所定の撮影周期によって決められた複数の時点において観察対象の細胞群を撮像する。この撮像によって、時系列に従って撮像された複数の細胞画像を含む細胞画像群が得られる。この細胞画像群が細胞計数装置100に入力される。
The
前記位相差顕微鏡は、光の回折現象を利用した顕微鏡であり、異なる屈折率を持つ物質間を透過する光の位相差(光路差)をコントラストとして得ることができる顕微鏡である。したがって、位相差顕微鏡は、透明な細胞や微生物等を対象物とした観察に適している顕微鏡である。位相差顕微鏡を利用した撮影で取得した画像は、背景領域と試料との境界線上においてハロ(アーティファクト)と呼ばれる強いコントラストが発生するという特徴を有する。細胞画像においてこのハロは、主に背景領域と個々の細胞領域との境界部分にオーラ状の光として出現する。 The phase contrast microscope is a microscope that utilizes a light diffraction phenomenon, and is a microscope that can obtain a phase difference (light path difference) of light transmitted between substances having different refractive indexes as contrast. Therefore, the phase contrast microscope is a microscope suitable for observation using transparent cells, microorganisms, and the like as objects. An image acquired by imaging using a phase contrast microscope has a feature that a strong contrast called a halo (artifact) occurs on the boundary line between the background region and the sample. In the cell image, this halo appears as an aura-like light mainly at the boundary between the background region and each cell region.
なお、撮像部20による撮影において、位相差顕微鏡の代わりに、例えば微分干渉顕微鏡(Differential interference contrast microscope;DIC)等、他の明視野顕微鏡が利用されても勿論よい。
In the imaging by the
本実施形態においては、細胞分裂が始まる前から例えば30分間隔で1回ずつ細胞群の撮影が行われるものとする。それらの撮影によって収集された複数の細胞画像を個々に識別可能とするために、個々の細胞画像に対しては、撮影された順番に画像番号が付与されるものとする。すなわち、例えば画像番号Nの細胞画像は、撮影開始からN×30分後に撮影された画像信号である等とする。なお、撮影開始時点の細胞画像は、画像番号N=0である。 In the present embodiment, it is assumed that imaging of a cell group is performed once every 30 minutes, for example, before cell division starts. In order to be able to individually identify a plurality of cell images collected by photographing, image numbers are assigned to the individual cell images in the order of photographing. That is, for example, the cell image with the image number N is an image signal captured N × 30 minutes after the start of imaging. Note that the cell image at the start of imaging is image number N = 0.
細胞認識部130は、細胞計数装置100に入力された各細胞画像に対して後述する“領域分割処理”を行って領域分割する。細胞認識部130は、この領域分割によって生じた各分割領域について、細胞領域であるか背景領域(非細胞領域)であるかを判定する。すなわち、細胞認識部130は、細胞画像中の個々の細胞が位置する細胞領域を特定する“細胞認識処理”を行う。細胞認識部130によって領域分割されて、各分割領域が細胞領域であるか背景領域であるかが特定された細胞画像である分割領域画像は、初期細胞数計数部140、前フレーム画像記録部160、及び細胞追跡部170に出力される。
The
上述の“領域分割処理”は、処理対象の細胞画像を構成する画素集合を、互いに特徴が類似しており、かつ空間的に近接している1つ以上の画素集合(領域)に分割する処理である。一般に、位相差顕微鏡を通して撮影した細胞画像において、細胞境界線上は輝度が高く、細胞内部は輝度が低い。本実施形態においては、この特徴に鑑みて、細胞認識部130は、公知の領域分割手法の一つであるウォーターシェッド法(分水嶺領域分割法)を用いた領域分割処理を行うことで、細胞画像を細胞領域毎に切り分ける(分割する)。ウォーターシェッド法によれば、画像の輝度値勾配に基づく分割が行われ、画像中の輝度値が高く輝度値勾配の高い部分、すなわち細胞の境界線部分を分割線にした分割がなされる。
The above-mentioned “region division processing” is a processing for dividing a pixel set constituting a cell image to be processed into one or more pixel sets (regions) having similar characteristics and spatially close to each other. It is. In general, in a cell image taken through a phase contrast microscope, the luminance is high on the cell boundary and the luminance inside the cell is low. In the present embodiment, in view of this feature, the
上述した領域分割処理によって生じた個々の分割領域に対して、細胞認識部130は、公知のラベリング処理によって領域番号として領域ID=Ns(Nsは0以上の整数)を付与する。細胞認識部130は、領域IDを画素値として領域毎に分割した細胞画像を生成する。ここで、背景領域は領域ID=0を付与するものとしている。
The
なお、領域分割手法として利用される公知技術は、ウォーターシェッド法に限定されるものではなく、細胞領域を適切な精度で領域分割することができる技術であれば、どのような技術が適用されてもよい。 The known technique used as the area dividing method is not limited to the watershed method, and any technique can be applied as long as the technique can divide the cell area with appropriate accuracy. Also good.
上述の“細胞認識処理”では、領域分割処理によって生じた各分割領域について、細胞領域であるか背景領域(非細胞領域)であるかが特定される。ここで、背景領域は、細胞領域と異なり、領域内の輝度値の変動が極度に少ない。そこで、細胞認識部130は、各分割領域内に含まれるエッジ強度の平均値等を算出し、その値が非常に小さい領域を背景領域であると特定することができる。
In the “cell recognition process” described above, whether each divided area generated by the area dividing process is a cell area or a background area (non-cell area) is specified. Here, unlike the cell region, the background region has extremely small fluctuations in the luminance value in the region. Therefore, the
初期細胞数計数部140は、予め初期画像として設定された所定の画像番号Niの細胞画像について、分割領域画像に基づきカウントした分割領域画像中の細胞領域の数を計数し、初期細胞数Cinit(Ni)として決定する。初期細胞数計数部140は、決定した初期細胞数Cinit(Ni)を初期細胞数記録部150に出力する。初期細胞数記録部150は、初期細胞数計数部140が決定した初期細胞数Cinit(Ni)を記録する。また、初期細胞数記録部150は、細胞数計数部250の要求に応じて、記録した初期細胞数Cinit(Ni)を細胞数計数部250に出力する。ここで、できるだけ精度良く領域分割され、正確に細胞数がカウントされるように、画像番号Niは、細胞数が少なく、かつ細胞が分散して位置している等、条件の良い画像番号が選択されることが望ましい。本実施形態においては、画像番号Ni=0(撮影開始時の細胞画像に相当)とする。撮影開始時は、細胞数が少なく分散して位置しているので、初期細胞数を計数するのに適している。このように、初期細胞数計数部140は、細胞画像群のうち所定の第1の時点において撮像された細胞画像中に存在する細胞数を計数して第1の数を決定する第1の計数部として機能する。ここで、例えば初期細胞数Cinit(Ni)は、第1の数に相当する。
The initial cell
前フレーム画像記録部160は、現時点で処理対象としている現フレームの細胞画像(画像番号Nrの細胞画像)に対する、1フレーム過去に取得した細胞画像(例えば画像番号Nr−1の細胞画像)についての領域分割画像を記録する。前フレーム画像記録部160は、撮像部20による撮像で細胞画像が新たに取得される毎に、所定のタイミングで領域分割画像を更新する。前フレーム画像記録部160が記録した過去フレームの細胞画像の領域分割画像は、後述する細胞追跡部170による処理が実行される前に、細胞追跡部170へ出力される。前フレーム画像記録部160は、細胞追跡部170による処理が終了した後に、細胞認識部130から出力された時点において処理対象となっている細胞画像(画像番号Nrの細胞画像)についての領域分割画像を、上書きして更新する。
The previous frame
細胞追跡部170は、細胞認識部130から現フレームの細胞画像(画像番号Nrの細胞画像)の領域分割画像を読み込むと共に、前フレーム画像記録部160から過去フレームの細胞画像(例えば1フレーム前の画像番号Nr−1の細胞画像)の領域分割画像を読み込む。細胞追跡部170は、前フレームの領域分割画像と現フレームの領域分割画像とを比較することで、現フレームの領域分割画像中の領域から、前フレームの各領域の移動先に相当する領域を特定する追跡処理を行う。具体的には、細胞追跡部170は、前フレームの領域と現フレームの領域との間で類似度を評価し、最も類似した領域同士を移動前後の領域として特定する。本実施形態では、類似度の評価に各領域同士の重心間距離が用いられており、重心間距離が小さい場合、類似性が高いと評価される。なお、類似度の評価には、重心間距離に限らず、各領域に対応する細胞画像上の画素値に基づき算出した領域内の輝度平均値、勾配、領域形状等どのような評価手段も適用され得る。
The
一般に、細胞はフレーム間で不規則に移動して位置を変える。このため、細胞の移動の仕方によっては、現フレーム画像においては細胞が画面外へ移動し、現フレーム中から対応する領域が見つからないことが起こり得る。細胞追跡部170は、領域追跡結果に基づき、細胞が撮影画角から外れ画面枠外へ移動し現フレームにおいて対応する領域が見つからない(消失する)ケースをカウントし、消失細胞数Ce(Nr)を決定する。細胞追跡部170は、消失細胞数Ce(Nr)を消失細胞記録部180に出力する。消失細胞記録部180は、細胞追跡部170から入力された消失細胞数Ce(Nr)を画像番号Nrと共に記録する。また、消失細胞記録部180は、細胞数計数部250からの要求に応じて、消失細胞数Ce(Nr)を細胞数計数部250に出力する。このように、細胞追跡部170は、細胞画像群に含まれる各細胞の位置を時系列に沿って追跡し、細胞画像の画像範囲外へ移動する消失細胞を検出して計数し、第3の数を決定する細胞追跡部として機能する。ここで、例えば消失細胞数Ce(Nr)は、第3の数に相当する。
In general, cells move irregularly between frames and change position. For this reason, depending on how the cells move, it may happen that the cells move out of the screen in the current frame image, and the corresponding region cannot be found in the current frame. Based on the region tracking result, the
一般に細胞分裂の結果生じる2つ以上の細胞を“娘細胞”と呼称する。また、細胞分裂前の細胞を対義的に“母細胞“と呼称する。母細胞検出部200は、分裂直前の状態にある母細胞のうち新規に出現した母細胞を検出する(ここで、過去フレームにおいて検出済みの母細胞は、現フレームにおける検出対象には含まない)。一般に、細胞の形状は、細胞周期(細胞分裂から次の分裂が起きるまでの過程)のうちM期(細胞分裂が行われる期間)の直前の段階において、急激に丸みを帯び球形状に変形すると共に厚みを増す。
In general, two or more cells resulting from cell division are referred to as “daughter cells”. A cell before cell division is referred to as a “mother cell”. The mother
明視野顕微鏡を利用して撮影した細胞分裂の過程にある細胞画像の一例の模式図を図3乃至図5に示す。これら図を参照して細胞分裂について説明する。母細胞510は、図3に示す状態から図4に示す状態へ遷移する。このとき、とりわけ位相差顕微鏡を利用した撮影で取得された細胞画像においては、当該細胞領域の境界線近傍にハロ(アーティファクト)が強く現れ、円形状を示す母細胞境界線(図4における黒太線で描かれた円511)上の輝度値が増す。その後、この母細胞510は細胞分裂を行い、図5に示すように2個の娘細胞521及び娘細胞522が生じる。
3 to 5 are schematic diagrams showing examples of cell images in the process of cell division photographed using a bright field microscope. Cell division will be described with reference to these drawings. The
本実施形態において、母細胞検出部200は、母細胞が細胞分裂直前の段階において略円形状を呈するという性質に鑑みて、画像中から円形状をパターン認識することで新規に出現した分裂直前の母細胞を検出する。より詳しくは、現フレームにおける細胞画像中に存在する細胞分裂直前の母細胞領域を特定した後、これらの母細胞領域の中で、前フレーム画像中で特定した母細胞位置との比較を行い、新規に発生した母細胞を特定する。すなわち、検出対象としている分裂直前の母細胞には、前フレームにおいて検出済みで現フレームにおいても継続して存在する母細胞は含まれず、新たに円形状に変形した出現直後の母細胞のみが含まれる。
In the present embodiment, the mother
母細胞検出部200は、円形状パターン検出部210と、前フレーム母細胞位置記録部220と、新規母細胞検出部230とを含む。円形状パターン検出部210には、画像取得部120が接続されている。円形状パターン検出部210は、新規母細胞検出部230に接続されている。新規母細胞検出部230と前フレーム母細胞位置記録部220は相互に接続されている。新規母細胞検出部230は、新規母細胞記録部190に接続されている。
The mother
以下、母細胞検出処理の詳細について説明する。まず画像取得部120によって取得された現フレームにおける細胞画像(画像番号Nrの細胞画像)は円形状パターン検出部210に転送される。円形状パターン検出部210は、円形状パターン検出処理により、細胞画像中の円形状をなす母細胞の位置P(Nr)を特定する。
Hereinafter, the details of the mother cell detection process will be described. First, the cell image (cell image of the image number Nr) in the current frame acquired by the
円形状パターン検出処理について説明する。円形状パターン検出部210では、細胞分裂直前の細胞の円形状をモデル化して作成した“円形状カーネル”が予め設定されている。円形状パターン検出部210は、この円形状カーネルを利用して細胞画像中の全画素を対象としたフィルタ処理を行い、その出力の値を評価することで、細胞画像中に存在する略円形状を呈する母細胞領域を検出する。
The circular pattern detection process will be described. In the circular
母細胞領域の検出のためのフィルタ処理において利用する円形状カーネルの一例を図6に示す。同図に示す“R1”は円形状カーネルの内側半径を示しており、同図に示す“R1+W”は円形状カーネルの外側半径を示している。内側半径R1は、細胞画像中に存在する平均的な母細胞領域の大きさより若干小さめの寸法に設定されており、内外半径差Wは、母細胞境界線上に現れるハロの平均的な幅より若干大きめに設定されている。内側半径R1及び内外半径差Wは、いずれも予め設定されるパラメータである。円形状カーネル自体の“縦×横”の寸法は、例えば“2×(R1+W)画素”である。 An example of a circular kernel used in the filter processing for detecting the mother cell region is shown in FIG. “R1” shown in the figure represents the inner radius of the circular kernel, and “R1 + W” shown in the figure represents the outer radius of the circular kernel. The inner radius R1 is set to be slightly smaller than the size of the average mother cell region existing in the cell image, and the inner / outer radius difference W is slightly smaller than the average width of the halo appearing on the mother cell boundary line. It is set large. Both the inner radius R1 and the inner / outer radius difference W are preset parameters. The dimension of “vertical × horizontal” of the circular kernel itself is, for example, “2 × (R1 + W) pixels”.
本実施形態においては、前記円形状カーネルにおいて、“内側半径R1以上で外側半径(R1+W)以下”の領域内のフィルタ係数について1が設定され、それ以外のフィルタ係数には0が設定される。円形状パターン検出部210は、細胞画像に対して、まず上述した構成の円形状カーネルに基づくフィルタ処理を行う。このフィルタ処理の出力値は、円形状カーネルにおいて“フィルタ係数=1”の領域内に位置する画素の画素値を積算した“輝度累積値”をフィルタ係数合計で除算した“輝度平均値”にあたる。円形状パターン検出部210は、このフィルタ処理を、細胞画像を構成する全画素について実行し、それぞれの画素について輝度平均値を算出する。さらに円形状パターン検出部210は、輝度平均値が予め設定した閾値より大きく、かつ、近傍画素の輝度平均値よりも高い値を示す(ピーク値を示す)画素を検出する。円形状パターン検出部210は、この検出した画素の位置が略円形状を呈する母細胞領域の中心座標、すなわち母細胞位置であると特定する。円形状パターン検出部210は、検出した母細胞位置P(Nr)を新規母細胞検出部230に転送する。
In the present embodiment, in the circular kernel, 1 is set for the filter coefficient in the region of “the inner radius R1 or more and the outer radius (R1 + W) or less”, and 0 is set for the other filter coefficients. The circular
なお、分裂直前の母細胞においては、円形状にハロが出現する。そこで、このハロの高い輝度値も利用して母細胞を検出することもできる。このように高い輝度値を利用することにより、母細胞を検出する精度がさらに向上し得る。 In mother cells immediately before division, halo appears in a circular shape. Therefore, the mother cells can also be detected using the high luminance value of the halo. By using such a high luminance value, the accuracy of detecting a mother cell can be further improved.
母細胞検出処理では、現フレームにおける処理において、1フレーム前の細胞画像に基づいて検出した母細胞位置が利用される。そこで、前フレーム母細胞位置記録部220は、現フレームに対して1フレーム前の母細胞位置を逐次記録する。
In the mother cell detection process, the mother cell position detected based on the cell image one frame before is used in the process in the current frame. Therefore, the previous frame mother cell
新規母細胞検出部230は、まず前フレーム母細胞位置記録部220から、前フレーム処理時に予め記録しておいた、1フレーム前の細胞画像中から検出した母細胞位置P(Nr−1)を取得する。次に新規母細胞検出部230は、現フレームにおける母細胞位置P(Nr)と前フレームにおける母細胞位置P(Nr−1)とを比較し、前フレーム母細胞位置P(Nr−1)から所定の閾値以上の距離にある現フレームにおける母細胞位置を新規母細胞位置P´(Nr)として抽出する。すなわち、前フレーム母細胞位置P(Nr−1)から所定の閾値未満の距離にある現フレームにおける母細胞位置P(Nr)は、前フレームから継続して存在する既存の母細胞であるとみなして、新規母細胞位置P´(Nr)から除外する。新規母細胞検出部230は、抽出した新規母細胞位置P´(Nr)の数である新規母細胞数Cp(Nr)を決定し、新規母細胞数Cp(Nr)を現フレーム画像番号Nrと共に新規母細胞記録部190へ転送する。
First, the new mother
また、新規母細胞検出部230は、現フレーム母細胞位置P(Nr)を前フレーム母細胞位置記録部220に転送する。前フレーム母細胞位置記録部220は、新規母細胞検出部230における次フレームでの処理において前フレーム母細胞位P(Nr−1)として利用するために、新規母細胞検出部230より転送された母細胞位置P(Nr)を上書き記録する。このように、例えば母細胞検出部200は、細胞画像群のうち第1の時点以降に撮像された細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第2の数を決定する母細胞検出部として機能する。ここで、例えば新規母細胞数Cp(Nr)は、第2の数に相当する。
Also, the new mother
新規母細胞記録部190は、新規母細胞検出部230から入力された新規母細胞数Cp(Nr)を記録する。また、新規母細胞記録部190は、細胞数計数部250からの要求に応じて、新規母細胞数Cp(Nr)を細胞数計数部250に出力する。
The new mother
細胞数計数部250は、初期細胞数記録部150によって記録された初期細胞数Cinit(Ni)と、消失細胞記録部180によって記録された画像番号n(nはNiからNrまで)の消失細胞数Ce(n)と、新規母細胞記録部190によって記録された画像番号n(nはNiからNrまで)の新規母細胞検出数Cp(n)とに基づき、現フレームにおける細胞画像中に存在する細胞数Ctotal(Nr)を下記式(1)に従い算出する。
細胞数計数部250は、算出した細胞数Ctotal(Nr)を出力部300に転送する。このように、細胞数計数部250は、第1の数と第2の数とに基づいて、第1の時点以降の任意の細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第2の計数部として機能する。ここで、例えば初期細胞数Cinit(Ni)は第1の数に相当し、新規母細胞数Cp(N)は第2の数に相当する。出力部300は、例えば、現フレーム画像番号Nrと共にその際の細胞数Ctotal(Nr)を所定の記録媒体に書き込む。
The cell
本実施形態に係る細胞計数装置100による細胞計数処理の一例を図7に示すフローチャートを参照して説明する。ステップS10において細胞計数装置100は、微速度撮影によって撮像された細胞画像群を取得する。ここで、微速度撮影によって収集された細胞画像群とは、所定の撮影周期に従って複数の時点において観察対象の細胞群を撮像した複数の細胞画像である。なお、細胞計数装置100は、全ての細胞画像を含む細胞画像群を一度に取得してもよいし、細胞画像群を構成する細胞画像を、逐次順に取得してもよい。
An example of the cell counting process by the
ステップS20において細胞計数装置100は、細胞画像群の中から時系列に従って順に、解析の対象とする細胞画像を取得する。ステップS30において細胞計数装置100は、細胞画像中の個々の細胞が位置する細胞領域を特定する“細胞認識処理”を行う。
In step S20, the
ステップS40において細胞計数装置100は、現フレームに係る画像番号Nが、初期画像番号Niであるか否かを判定する。ここで、本実施形態では、例えば初期画像番号Ni=0である。画像番号Nが初期画像番号Niでないとき、処理はステップS60に進む。一方、画像番号Nが初期画像番号Niであるとき、処理はステップS50に進む。ステップS50において細胞計数装置100は、初期画像番号Niに対応する分割領域画像に基づいて分割領域画像中の細胞領域の数をカウントし、その結果を初期細胞数Cinit(Ni)として記録する。
In step S40, the
ステップS60において細胞計数装置100は、現フレームにおける画像番号Nが撮影開始から2枚目以降を表す番号であるか否かを判定する。2枚目以降でないと判定されたとき、処理はステップS100に進む。一方、2枚目以降であると判定されたとき、処理はステップS70に進む。ステップS70において細胞計数装置100は、現フレーム画像番号Nrの領域分割画像と前フレーム画像番号Nr−1の領域分割画像とを比較し、細胞の移動を追跡する追跡処理を行う。すなわち、前フレーム画像番号Nr−1の各領域の移動先に相当する領域を、現フレーム画像番号Nrの領域分割画像中の領域から特定する。
In step S60, the
ステップS80において細胞計数装置100は、ステップS70における領域追跡結果に基づいて、画面外へ移動して消失したために、前フレーム画像番号Nr−1にはあるが現フレーム画像番号Nrにおいて対応する領域が見つからない細胞が存在するか否かを判定する。画面外に移動した細胞がないとき、処理はステップS100に進む。一方、画面外に移動した細胞があるとき、処理はステップS90に進む。ステップS90において細胞計数装置100は、細胞が現フレーム画像番号Nrにおいて消失するケースをカウントし、その結果である消失細胞数Ce(Nr)を画像番号Nrと関連付けて記録する。
In step S80, the
ステップS100において細胞計数装置100は、次フレーム画像番号Nr+1における処理時に用いるために、現フレーム画像番号Nrに対する領域分割画像を前フレーム画像として記録する前フレーム画像記録処理を行う。ステップS110において細胞計数装置100は、現フレーム画像番号Nrにおける細胞画像中から円形状のパターンを認識することで分裂直前の母細胞を検出する母細胞検出処理を行う。ステップS120において細胞計数装置100は、予め記録されている前フレーム画像番号Nr−1における母細胞位置と現フレーム画像番号Nrにおける母細胞位置との比較により、新規に発生した母細胞を検出する新規母細胞検出処理を行う。ここで、新規母細胞には、前フレームにおいて検出済みであり現フレームにおいても継続して存在する母細胞は含まれず、新たに円形状に変形した出現直後の母細胞のみが含まれる。
In step S100, the
ステップS130において細胞計数装置100は、新規母細胞が検出されたか否かを判定する。新規母細胞が検出されていないとき、処理はステップS150に進む。一方、新規母細胞が検出されたと判定されたとき、処理はステップS140に進む。ステップS140において細胞計数装置100は、ステップS120において検出した新規母細胞の数を記録する。
In step S130, the
ステップS150において細胞計数装置100は、上記式(1)に基づき現フレーム画像番号Nrにおける細胞数Ctotal(Nr)を算出する。細胞計数装置100は、現フレーム画像番号Nrと算出された細胞数Ctotal(Nr)とを出力する。
In step S150, the
ステップS160において細胞計数装置100は、次フレーム画像番号Nr+1の細胞画像が存在するか否かを判定する。次フレームの画像が存在するとき、処理はステップS20に戻る。一方、次フレーム存在しない場合、処理は終了する。
In step S160, the
本実施形態によれば、例えば明視野顕微鏡を用いて取得された細胞画像群に基づいて、精度良く細胞数が計数され得る。本実施形態では、細胞が分裂の直前において球形に変形することに基づいて母細胞の検出が行われている。したがって、本実施形態によれば、ハロ等を利用した輝度値に基づいて母細胞が検出されるよりも精度良く母細胞が検出され得る。また、細胞の形状が不規則であることによる母細胞の検出の困難さも排除される。また、本実施形態では、細胞が移動して視野から外れる場合も考慮されており、消失する細胞数が細胞数から減算されている。以上のことから、本実施形態によれば、精度良く細胞数が計数され得る。 According to the present embodiment, the number of cells can be accurately counted based on, for example, a group of cell images acquired using a bright field microscope. In this embodiment, the detection of the mother cell is performed based on the fact that the cell is deformed into a spherical shape immediately before division. Therefore, according to the present embodiment, the mother cell can be detected with higher accuracy than the mother cell is detected based on the luminance value using halo or the like. Further, the difficulty of detecting the mother cell due to the irregular shape of the cell is also eliminated. Moreover, in this embodiment, the case where a cell moves and remove | deviates from a visual field is also considered, and the cell number which lose | disappears is subtracted from the cell number. From the above, according to the present embodiment, the number of cells can be accurately counted.
なお、上述の実施形態では、円形をした母細胞が検出されたら、細胞数が増加したと計数されているが、母細胞が2つの娘細胞に分裂したことが確認されてから、その後に、細胞数が増加したとされるように設定されてもよい。このようにすると、母細胞が分裂しないことにより発生する細胞計数の誤差を低減することができる。また、母細胞が2つの娘細胞に分裂後、再び1つの細胞に融合することもあるので、このような場合に細胞数の増加が計数されないように設定されてもよい。 In the above-described embodiment, if a circular mother cell is detected, it is counted that the number of cells has increased, but after confirming that the mother cell has divided into two daughter cells, It may be set so that the number of cells is increased. In this way, it is possible to reduce an error in the cell count that occurs when the mother cell does not divide. In addition, since the mother cell may be divided into two daughter cells and then fused again to one cell, the increase in the number of cells may not be counted in such a case.
また、本実施形態では、視野外から視野内に移動する細胞は考慮されていないが、これは、細胞分裂を繰り返し、細胞数が増えているときには、視野内から視野外に移動する細胞が多く、視野外から視野内に移動する細胞はほとんどないことに基づく。視野外から視野内に移動する細胞が多い状況で本細胞計数装置100が用いられる場合、母細胞と無関係に新たに出現した細胞を検出して、視野外から視野内に移動する細胞を考慮する構成とされてもよい。
In this embodiment, cells that move from the outside of the field of view to the field of view are not taken into account, but this is because many cells move from the inside of the field of view to the outside of the field of view when cell division is repeated and the number of cells increases. Based on the fact that few cells move from outside the field of view into the field of view. When the present
なお、図7のフローチャートで示された処理順序は一例であり、趣旨から逸脱しない範囲で処理順序は適宜交換可能である。例えばステップS60乃至ステップS90の処理とステップ100乃至ステップS140の処理との順序は交換可能である。 Note that the processing order shown in the flowchart of FIG. 7 is an example, and the processing order can be changed as appropriate without departing from the spirit of the processing order. For example, the order of steps S60 to S90 and steps 100 to S140 can be exchanged.
以上、本発明の一実施形態を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で、種々の変形及び応用が可能なことは勿論である。上述した実施形態には種々の段階の発明が含まれており、開示した複数の構成要件の適当な組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示す全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成も発明として抽出され得る。 Although one embodiment of the present invention has been described above, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications and applications are possible within the scope of the gist of the present invention. . The above-described embodiments include inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent elements. For example, even if some constituent requirements are deleted from all the constituent requirements shown in the embodiment, the problem described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and the effect described in the column of the effect of the invention can be achieved. In the case of being obtained, a configuration from which this configuration requirement is deleted can also be extracted as an invention.
1…顕微鏡システム、10…顕微鏡、20…撮像部、30…制御装置、32…CPU、34…メモリ、36…HDD、38…インターフェース、40…入力装置、50…表示装置、100…細胞計数装置、110…制御部、120…画像取得部、130…細胞認識部、140…初期細胞数計数部、150…初期細胞数記録部、160…前フレーム画像記録部、170…細胞追跡部、180…消失細胞記録部、190…新規母細胞記録部、200…母細胞検出部、210…円形状パターン検出部、220…前フレーム母細胞位置記録部、230…新規母細胞検出部、250…細胞数計数部、300…出力部。
DESCRIPTION OF
Claims (6)
前記細胞画像群のうち所定の第1の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第1の数を決定する第1の計数部と、
前記細胞画像群のうち前記第1の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第2の数を決定する母細胞検出部と、
前記第1の数と前記第2の数とに基づいて、前記第1の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第2の計数部と、
を備え、
前記第1の計数部は、前記第1の時点における前記細胞数を前記第1の数とし、
前記母細胞検出部は、円形の細胞を前記細胞分裂直前の前記母細胞として検出し、各々の前記細胞画像において、新たに発生した前記母細胞の細胞数を前記第2の数とし、
前記第2の計数部は、前記第1の数に前記細胞画像毎に得られた前記第2の数を加算することで前記現細胞数を算出する、
細胞計数装置。 An image acquisition unit for acquiring a cell image group including a plurality of cell images representing a time-dependent change of live cells imaged along a time series;
A first counting unit that counts the number of cells present in the cell image captured at a predetermined first time point in the cell image group and determines the first number;
A mother for determining a second number by detecting and counting mother cells immediately before cell division based on the shape of the cells from the cell images taken after the first time point in the cell image group. A cell detector;
Based on the first number and the second number, a second counting unit that calculates a current cell number at an acquisition time point of any of the cell images after the first time point;
Equipped with a,
The first counting unit sets the number of cells at the first time point as the first number,
The mother cell detection unit detects a circular cell as the mother cell immediately before the cell division, and in each of the cell images, the number of newly generated mother cells is the second number,
The second counting unit calculates the current cell number by adding the second number obtained for each cell image to the first number;
Cell counting device.
前記第2の計数部は、さらに第3の数に基づいて前記現細胞数を算出する、
請求項1又は2に記載の細胞計数装置。 A cell tracking unit that tracks the position of each cell included in the cell image group along the time series, detects and counts lost cells that move outside the image range of the cell image, and determines a third number Further comprising
The second counting unit further calculates the current cell number based on a third number;
The cell counting apparatus according to claim 1 or 2 .
前記細胞画像群のうち所定の第1の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して、前記第1の時点における前記細胞数を第1の数として決定することと、
前記細胞画像群のうち前記第1の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、円形の細胞を細胞分裂直前の母細胞をとして検出して計数し、各々の前記細胞画像において、新たに発生した前記母細胞の細胞数を第2の数として決定することと、
前記第1の数に前記細胞画像毎に得られた前記第2の数を加算することで、前記第1の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出することと、
をコンピュータに実行させるための細胞計数プログラム。 Obtaining a cell image group including a plurality of cell images representing temporal changes of living cells imaged along a time series;
And said cell of the image group by counting the number of cells present in the cell image captured at a predetermined first time point to determine the number of cells in the first time point as the first number,
From the cell image the cell image in captured after the first time point of the group, based on the shape of the cells was counted by detecting the circular cells as the mother cell immediately before cell division, each of the In the cell image, determining the number of newly generated mother cells as a second number;
Adding the second number obtained for each cell image to the first number to calculate a current cell number at an acquisition time point of any of the cell images after the first time point;
Cell counting program for causing a computer to execute.
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