JP6044923B2 - New PI polyamide - Google Patents
New PI polyamide Download PDFInfo
- Publication number
- JP6044923B2 JP6044923B2 JP2012106382A JP2012106382A JP6044923B2 JP 6044923 B2 JP6044923 B2 JP 6044923B2 JP 2012106382 A JP2012106382 A JP 2012106382A JP 2012106382 A JP2012106382 A JP 2012106382A JP 6044923 B2 JP6044923 B2 JP 6044923B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polyamide
- gene
- cells
- expression
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
本発明は、新規のピロール−イミダゾール ポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す場合がある）に関する。さらに詳しくは、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、転写制御因子であるＥＴＳ ｆａｍｉｌｙに属するＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制する新規のＰＩポリアミドに関する。 The present invention relates to a novel pyrrole-imidazole polyamide (hereinafter sometimes referred to as PI polyamide). More specifically, the present invention relates to a novel PI polyamide that suppresses the expression of a fusion gene of a TMPRSS2 gene that is an androgen response gene and an ERG gene that belongs to the ETS family that is a transcriptional control factor.
ステロイドホルモンのひとつとであるアンドロゲンと、この受容体であるアンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ（以下、ＡＲと示す場合がある））は、前立腺細胞において、その増殖、さらには癌化に密接に関与していることが知られている。
そこで、前立腺癌の治療法のひとつとして、アンドロゲン除去療法が行われてきた。アンドロゲン除去療法は、ＡＲの作用を抑制することにより、前立腺癌の進行を抑制させる方法である。しかし、この治療法では、治療が進むに従って、癌化した前立腺細胞の形質が変化するため効果がなくなり、その後の治療が困難であるという問題があった。
Androgen, which is one of steroid hormones, and androgen receptor (AR (hereinafter sometimes referred to as AR)), which is a receptor, are closely involved in the proliferation and further canceration of prostate cells. It is known that
Therefore, androgen deprivation therapy has been performed as one of the treatment methods for prostate cancer. Androgen deprivation therapy is a method of suppressing the progression of prostate cancer by suppressing the action of AR. However, this treatment method has a problem that as the treatment progresses, the character of cancerous prostate cells changes, so that the effect is lost, and subsequent treatment is difficult.
近年、正常な前立腺細胞において発現しているアンドロゲン応答遺伝子のＴＭＰＲＳＳ２遺伝子が、細胞増殖・分化に関与するとともに、細胞の癌化に重要な役割を果たしているＥＴＳ ｆａｍｉｌｙの遺伝子と融合することによって、前立腺細胞におけるアンドロゲン感受性を変化させ、細胞の癌化や癌の悪性度の進行等に影響を与えていることが報告されている（非特許文献１）。ＥＴＳ ｆａｍｉｌｙの遺伝子としては、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、ＥＴＶ４遺伝子またはＥＴＶ５遺伝子等が知られており、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は細胞の増殖、細胞周期、アポトーシス等の調節に作用する。 In recent years, the TMPRSS2 gene, which is an androgen response gene expressed in normal prostate cells, is involved in cell proliferation / differentiation and fused with the ETS family gene, which plays an important role in canceration of cells. It has been reported that androgen sensitivity in cells is changed to affect the canceration of cells and the progression of malignancy of cancer (Non-patent Document 1). As ETS family genes, ERG gene, ETV1 gene, ETV4 gene, ETV5 gene and the like are known, and proteins encoded by these genes act on regulation of cell proliferation, cell cycle, apoptosis and the like.
また、前立腺細胞において、ＡＲがＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列上に存在するＡＲ結合配列（ＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＡＲＥ（以下、ＡＲＥと示す場合がある））と結合する際に、ＡＲＥに隣接する共通の塩基配列（Ｂｒｅａｋ ｆｕｓｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）で切断が起こり、互いに結合することで、遺伝子転座が起こることも近年報告されている（非特許文献２）。
すなわち、ＡＲは、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現をアンドロゲン依存的に促進させるだけでなく、前立腺癌細胞の発生、増殖に有利な環境を作っている可能性が考えられる。
In prostate cells, AR is adjacent to ARE when it binds to an AR binding sequence (AR responding elements; ARE (hereinafter sometimes referred to as ARE)) present on the base sequences of TMPRSS2 gene and ERG gene. In recent years, it has also been reported that gene translocation occurs when cleavage occurs at a common base sequence (Break fusion sites) and binds to each other (Non-Patent Document 2).
That is, it is possible that AR not only promotes the expression of the fusion gene of TMPRSS2 gene and ERG gene in an androgen-dependent manner, but also creates an advantageous environment for the generation and proliferation of prostate cancer cells.
そこで、これらの融合遺伝子や、融合遺伝子の発現によって起こる、ＥＲＧ遺伝子の過剰発現の有無を調べることにより、前立腺癌を検出する方法や、干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することによって前立腺癌を治療する方法、癌化した細胞に細胞毒性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを投与することによって前立腺癌を治療する方法等が開示されている（特許文献１〜４）。
しかし、干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸は生体内で分解され易く、安定性が低い。また、生体内において細胞毒性遺伝子産物を発現させる方法は、必ずしも安全とはいえず、これらの治療方法は前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。
Therefore, by investigating the presence or absence of overexpression of the ERG gene caused by the expression of these fusion genes or fusion genes, methods for detecting prostate cancer, interfering RNA or antisense nucleic acid were administered, and these genes were administered. Disclosed is a method for treating prostate cancer by destabilizing the expression of prostatic cancer, a method for treating prostate cancer by administering an expression vector containing a polynucleotide encoding a cytotoxic gene product to cancerous cells, etc. (Patent Documents 1 to 4).
However, interfering RNA and antisense nucleic acids are easily degraded in vivo and have low stability. Also, methods for expressing cytotoxic gene products in vivo are not necessarily safe, and these treatment methods are not sufficient methods for prostate cancer treatment.
本発明者らは、本発明において、前立腺癌の治療に有効であり、かつ、安定で安全な物質を得るためにＰＩポリアミドに着目した。
ＰＩポリアミドとは、芳香族アミノ酸であるＮ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｅ（Ｎ−メチルピロール（以下、Ｐｙと示す場合がある））、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｎ−メチルイミダゾール（以下、Ｉｍと示す場合がある））で構成される、ＤＮＡに配列特異的に結合する物質のことである（非特許文献３）。
このうちＩｍ／ＰｙペアはＤＮＡにおけるＧ・Ｃを認識し、Ｐｙ／ＰｙペアはＴ・ＡおよびＡ・Ｔを認識する。ＰＩポリアミドはＤＮＡに高い親和性を有し、Ｉｍ／ＰｙとＰｙ／Ｐｙの組み合わせ次第で、多様な配列のＤＮＡに結合させることができる。また、生体内において分解されず、干渉性ＲＮＡ等と比べて安定性が高いという利点もある。
In the present invention, the present inventors have focused on PI polyamide in order to obtain a stable and safe substance that is effective in treating prostate cancer.
PI polyamide is an aromatic amino acid such as N-methylpyrrole (N-methylpyrrole (hereinafter sometimes referred to as Py)), N-methylimidazole (N-methylimidazole (hereinafter sometimes referred to as Im))). It is a substance that binds to DNA in a sequence-specific manner (Non-patent Document 3).
Of these, the Im / Py pair recognizes G · C in DNA, and the Py / Py pair recognizes T · A and A · T. PI polyamide has high affinity for DNA and can be bound to DNA of various sequences depending on the combination of Im / Py and Py / Py. In addition, there is an advantage that it is not degraded in the living body and is more stable than interfering RNA or the like.
そこで、腫瘍で高発現している遺伝子を標的とした様々なＰＩポリアミドが開発されており、抗腫瘍効果を示すことが確認されている（非特許文献４）。
例えば、ヒトの悪性腫瘍において過剰発現が報告されているオーロラキナーゼＡおよびオーロラキナーゼＢの遺伝子を標的として、これらの発現量を制御することを目的とした、ＰＩポリアミドを含む薬剤等も開示されている（特許文献５）。この文献において、この薬剤の対象となり得る悪性腫瘍のひとつとして前立腺癌を挙げている。しかし、ここで示されている薬剤は、前立腺癌に特異的な遺伝子の発現を制御することを目的とするものではない。従って、前立腺癌の予防、治療等において、より有効かつ安全で安定した薬剤の提供が望まれている。
Thus, various PI polyamides targeting genes that are highly expressed in tumors have been developed and confirmed to exhibit antitumor effects (Non-Patent Document 4).
For example, a drug containing PI polyamide for the purpose of controlling the expression level of Aurora kinase A and Aurora kinase B genes that have been reported to be over-expressed in human malignant tumors is also disclosed. (Patent Document 5). In this document, prostate cancer is cited as one of the malignant tumors that can be the target of this drug. However, the drugs shown here are not intended to control the expression of genes specific for prostate cancer. Therefore, it is desired to provide a more effective, safe and stable drug for prevention and treatment of prostate cancer.
前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤の提供を課題とする。 The objective is to provide a safe, stable and useful drug for the prevention and treatment of prostate cancer.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、転写制御因子であるＥＴＳ ｆａｍｉｌｙに属するＥＲＧ遺伝子との融合を抑制する新規のＰＩポリアミドを得るに至った。
本発明者らは、本発明において、このＰＩポリアミドが、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制し、また、この融合遺伝子の発現に伴って起こるＥＺＨ２遺伝子の発現も抑制できるＰＩポリアミドであることを確認するとともに、前立腺癌の予防、治療等に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that a novel PI polyamide that suppresses fusion of the TRPRSS2 gene, which is an androgen-responsive gene, and the ERG gene belonging to ETS family, which is a transcriptional regulator I came to get.
In the present invention, the present inventors, in the present invention, the PI polyamide can suppress the expression of the fusion gene of the TMPRSS2 gene and the ERG gene, and can also suppress the expression of the EZH2 gene accompanying the expression of the fusion gene. As a result, it was found useful for the prevention and treatment of prostate cancer, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は次の（１）〜（５）のＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とする融合遺伝子の発現抑制剤等に関する。
（１）配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部に結合するＰＩポリアミド。
（２）次の式１〜４のいずれかに示される、上記（１）に記載のＰＩポリアミド。
［式１］
［式２］
［式３］
［式４］
（３）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含む、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤。
（４）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含むＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤。
（５）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含む前立腺癌の予防および／または治療剤。
That is, the present invention relates to the following PI polyamides (1) to (5), fusion gene expression inhibitors containing the PI polyamide as an active ingredient, and the like.
(1) PI polyamide that binds to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(2) PI polyamide as described in said (1) shown by either of the following formulas 1-4.
[Formula 1]
[Formula 2]
[Formula 3]
[Formula 4]
(3) An agent for suppressing the expression of a fusion gene of a TMPRSS2 gene and an ERG gene, comprising the PI polyamide described in (1) or (2) as an active ingredient.
(4) An EZH2 gene expression inhibitor comprising the PI polyamide according to (1) or (2) as an active ingredient.
(5) A prophylactic and / or therapeutic agent for prostate cancer comprising the PI polyamide according to (1) or (2) as an active ingredient.
本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。生体内での安定性が高く、組織、細胞への移行性も高い、本発明のＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤は、前立腺癌の予防、治療に効果的な薬剤となり得る。 By providing the PI polyamide of the present invention, it becomes easy to develop a safe and stable drug useful for the prevention and treatment of prostate cancer. A drug comprising the PI polyamide of the present invention as an active ingredient having high in vivo stability and high migration to tissues and cells can be an effective drug for the prevention and treatment of prostate cancer.
本発明の「ＰＩポリアミド」には、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであればいずれのものも含まれる。
この配列表配列番号１に示される塩基配列は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる塩基配列、およびＥＲＧ遺伝子に含まれる塩基配列であって、これらの遺伝子に共通の塩基配列である。
The “PI polyamide” of the present invention includes any PI polyamide that recognizes and binds all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a base sequence included in the TMPRSS2 gene and a base sequence included in the ERG gene, and is a base sequence common to these genes.
本発明の「ＰＩポリアミド」は、例えば、配列表配列番号１に示される塩基配列がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子上に２つ以上複数連続して、または、複数近接して存在する場合に、５’側に存在する配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部と、その下流に存在する配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部とをいずれも認識して結合するＰＩポリアミドであってもよい。 The “PI polyamide” of the present invention is present on the 5 ′ side when, for example, two or more base sequences shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are present in a sequence of two or more on the TMPRSS2 gene or in close proximity. A PI polyamide that recognizes and binds to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 present downstream thereof. There may be.
このような本発明の「ＰＩポリアミド」は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部および／またはＥＲＧ遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合することにより、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するためのＰＩポリアミドとして利用することもできる。
また、本発明の「ＰＩポリアミド」は、本発明の「ＰＩポリアミド」が結合する前に、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子が融合してしまった場合でも融合遺伝子に結合することで、その後のＥＲＧ遺伝子の過剰発現を抑制することも可能である。
Such “PI polyamide” of the present invention includes all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the TMPRSS2 gene and / or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the ERG gene. By recognizing and binding all or part of the protein, it can be used as a PI polyamide for suppressing the expression of the fusion gene of TMPRSS2 gene and ERG gene.
In addition, the “PI polyamide” of the present invention binds to the fusion gene even if the TMPRSS2 gene and the ERG gene are fused before the “PI polyamide” of the present invention binds, It is also possible to suppress overexpression.
このような本発明の「ＰＩポリアミド」として、例えば、次の式１〜式４に示されるＰＩポリアミドを挙げることができる。このうち式１に示されるＰＩポリアミド（１）は、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部を認識して結合するＰＩポリアミドである。図１に、このＰＩポリアミド（１）のＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対する結合の様子を模式的に示した。 Examples of the “PI polyamide” of the present invention include PI polyamides represented by the following formulas 1 to 4. Of these, the PI polyamide (1) represented by Formula 1 is a PI polyamide that recognizes and binds to the entire base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing. FIG. 1 schematically shows how PI polyamide (1) binds to a common base sequence (SEQ ID NO: 1) in the TMPRSS2 gene and ERG gene.
また、式２に示されるＰＩポリアミド（２）、式３に示されるＰＩポリアミド（３）および式４に示されるＰＩポリアミド（４）はいずれも配列表配列番号１に示される塩基配列の一部を認識して結合するＰＩポリアミドである。これらのポリアミドはいずれもＴＭＰＲＳＳ２遺伝子上に２つ並んで存在する配列表配列番号１の塩基配列を１分子で認識できるＰＩポリアミドである。図２に、これらのＰＩポリアミドのＴＭＰＲＳＳ２遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対する結合の様子をそれぞれ模式的に示した。
本発明の「ＰＩポリアミド」は、これらの式１〜式４に示されるＰＩポリアミドに限らず、上記のような特性を有する「ＰＩポリアミド」であればいずれのものであってもよく、従来知られている方法により、独自に設計して作製した「ＰＩポリアミド」も含まれる。
In addition, the PI polyamide (2) represented by the formula 2, the PI polyamide (3) represented by the formula 3, and the PI polyamide (4) represented by the formula 4 are all part of the base sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1. It is a PI polyamide that recognizes and binds. All of these polyamides are PI polyamides that can recognize the base sequence of SEQ ID NO: 1 present in a sequence on the TMPRSS2 gene in one molecule. FIG. 2 schematically shows how these PI polyamides bind to a common base sequence (SEQ ID NO: 1) in the TMPRSS2 gene.
The “PI polyamide” of the present invention is not limited to the PI polyamides represented by the formulas 1 to 4, but may be any “PI polyamide” having the characteristics as described above. Also included are “PI polyamides” designed and produced by conventional methods.
［式１］
[Formula 1]
［式２］
[Formula 2]
［式３］
[Formula 3]
［式４］
[Formula 4]
本発明の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、ＥＲＧ遺伝子との融合を抑制し、これらの融合遺伝子の発現を抑制する剤のことをいう。
ここで、「発現抑制」とは、例えば、前立腺癌細胞等の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現」が起こる細胞に本発明の該発現抑制剤を付与した場合に、本発明の該発現抑制剤を付与しない場合と比べて、これらの融合遺伝子の発現が低下する状態のことをいう。この融合遺伝子の発現の低下には、融合遺伝子がまったく発現しない場合も含まれる。
このような本発明の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
有効成分として含まれるＰＩポリアミドは、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部および／またはＥＲＧ遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであることが特に好ましい。
The “suppression gene expression inhibitor of TMPRSS2 gene and ERG gene” of the present invention is an agent containing the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and suppresses fusion between TMPRSS2 gene and ERG gene. An agent that suppresses the expression of the fusion gene.
Here, “expression suppression” means, for example, when the expression inhibitor of the present invention is applied to a cell in which “expression of a fusion gene of TMPRSS2 gene and ERG gene” occurs such as prostate cancer cells. This refers to a state in which the expression of these fusion genes decreases compared to the case where the expression inhibitor is not added. This decrease in the expression of the fusion gene includes the case where the fusion gene is not expressed at all.
Such an “inhibitor of fusion gene expression of TMPRSS2 gene and ERG gene” of the present invention may be an agent containing the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and may be an agent consisting only of the PI polyamide of the present invention. It may be an agent containing other pharmaceutically acceptable ingredients.
PI polyamide contained as an active ingredient is all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the TMPRSS2 gene and / or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 contained in the ERG gene or Particularly preferred is a PI polyamide that recognizes and binds part of it.
本発明の「ＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、ＥＺＨ２遺伝子の発現を抑制する剤のことをいう。
ＥＺＨ２遺伝子は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子が発現することにより、ＥＲＧ遺伝子が過剰発現したことことに伴って、発現量が増加する遺伝子であり、アンドロゲン非依存的に前立腺癌細胞の増殖に作用することが示唆されている。
ここで、「発現抑制」とは、例えば、前立腺癌細胞等の「ＥＺＨ２遺伝子の発現」が起こる細胞に本発明の該発現抑制剤を付与した場合に、本発明の該発現抑制剤を付与しない場合と比べて、ＥＺＨ２遺伝子の発現が低下する状態のことをいう。このＥＺＨ２遺伝子の発現の低下には、ＥＺＨ２遺伝子がまったく発現しない場合も含まれる。
このような本発明の「ＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
The “EZH2 gene expression inhibitor” of the present invention refers to an agent containing the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and an agent that suppresses the expression of the EZH2 gene.
The EZH2 gene is a gene whose expression level increases due to the overexpression of the ERG gene due to the expression of the fusion gene of the TMPRSS2 gene and the ERG gene, and proliferation of prostate cancer cells independent of androgen It has been suggested to act on
Here, “expression suppression” means that, for example, when the expression inhibitor of the present invention is applied to cells in which “expression of EZH2 gene” occurs, such as prostate cancer cells, the expression inhibitor of the present invention is not applied. Compared to the case, it refers to a state in which the expression of the EZH2 gene decreases. The decrease in the expression of the EZH2 gene includes a case where the EZH2 gene is not expressed at all.
Such an “EZH2 gene expression inhibitor” of the present invention may be an agent containing the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and even an agent comprising only the PI polyamide of the present invention is pharmaceutically acceptable. An agent containing components and the like may be used.
本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、前立腺癌の予防、前立腺癌の治療、または前立腺癌の予防および治療に有用な剤のことをいう。
このような本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
このような本発明の剤は、前立腺癌を発症する可能性が高いヒトに発症前に投与したり、前立腺癌を発症した後に、癌の進行を抑制したり、癌を完寛させたりすることを目的として投与することができる。
The “prophylactic and / or therapeutic agent for prostate cancer” of the present invention is an agent comprising the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and for the prevention of prostate cancer, the treatment of prostate cancer, or the prevention and treatment of prostate cancer. It refers to useful agents.
Such a “prophylactic and / or therapeutic agent for prostate cancer” of the present invention may be an agent containing the PI polyamide of the present invention as an active ingredient, and may be an agent comprising only the PI polyamide of the present invention or other pharmaceutically. It may be an agent containing an acceptable component.
Such an agent of the present invention is administered to humans who are highly likely to develop prostate cancer before the onset, suppresses the progression of cancer after the onset of prostate cancer, or makes the cancer fully tolerated. Can be administered for the purpose.
以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a test example are given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（Ｂｒｅａｋ ｆｕｓｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）（配列表配列番号１）の全部または一部に結合するように、次の（１）〜（４）の４つのＰＩポリアミドをそれぞれ設計した。
また、これらとの比較のために、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）も設計した。
<Preparation of PI polyamide>
1. Design of PI polyamide 4 of the following (1) to (4) so as to bind to all or a part of a common base sequence (Break fusion sites) (SEQ ID NO: 1) present in the TMPRSS2 gene and the ERG gene Each of the PI polyamides was designed.
For comparison with these, PI polyamide (control) that does not bind to all or a part of the common base sequence (SEQ ID NO: 1) present in the TMPRSS2 gene and the ERG gene was also designed.
図３にＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列における共通の塩基配列、ＡＲＥの塩基配列（配列表配列番号２）および各ＰＩポリアミドの結合部位を示した。
図３において、赤色のアンダーラインで示された箇所がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列における共通の塩基配列であり、青色のアンダーラインで示された箇所がＡＲＥの塩基配列であり、緑色のアンダーラインで示された箇所が各ＰＩポリアミドの結合部位である。
また、下式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）。
FIG. 3 shows the common base sequence in the base sequences of the TMPRSS2 gene and the ERG gene, the base sequence of ARE (SEQ ID NO: 2), and the binding site of each PI polyamide.
In FIG. 3, the portion indicated by the red underline is a common base sequence in the base sequences of the TMPRSS2 gene and the ERG gene, the portion indicated by the blue underline is the ARE base sequence, and the green underline The location indicated by the line is the binding site of each PI polyamide.
Moreover, each symbol in the following formula has the following meaning (Ac: acetyl, Py: pyrrole, Im: imidazole, β: β-alanine, γ: γ-butyric acid, Dp: N, N-dimethyl-1,3- Propanediamine).
ＰＩポリアミド（１）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（１））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式１）に示されるものであり、化学式はＣ75Ｈ94Ｎ31Ｏ15、分子量は１６６９．７５であった。
PI polyamide (1)
In FIG. 3, the PI polyamide of AcPyImβImImImγPyPyPyPyβImPyPyβDp was designed so that the base sequence shown in green underline (Table 1, PI polyamide (1)) is recognized as the target base sequence in FIG. This PI polyamide was represented by the following formula (formula 1), the chemical formula was C 75 H 94 N 31 O 15 , and the molecular weight was 1669.75.
［式１］
[Formula 1]
ＰＩポリアミド（２）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ （２）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（２））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙγＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式２）に示されるものであり、の化学式はＣ76Ｈ95Ｎ30Ｏ15、分子量は１６６８．７６であった。
PI polyamide (2)
In FIG. 3, a PI polyamide of AcPyPyPyPyβPyPyγPyImβImImImβDp was designed so that the base sequence shown in green underline (Table 1, PI polyamide (2)) was recognized as the target base sequence in FIG. This PI polyamide is represented by the following formula (formula 2), the chemical formula thereof was C 76 H 95 N 30 O 15 , and the molecular weight was 1668.76.
［式２］
[Formula 2]
ＰＩポリアミド（３）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（３）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（３））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式３）に示されるものであり、化学式はＣ76Ｈ95Ｎ30Ｏ15、分子量は１６６８．７６であった。
PI polyamide (3)
In FIG. 3, a PI polyamide of AcImImImβPyImγPyPyβPyPyPyβDp was designed so that the base sequence indicated by the green underline (Table 1, PI polyamide (3)) was recognized as the target base sequence in FIG. This PI polyamide was represented by the following formula (formula 3), the chemical formula was C 76 H 95 N 30 O 15 , and the molecular weight was 1668.76.
［式３］
[Formula 3]
ＰＩポリアミド（４）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（４）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（４））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式４）に示されるものであり、化学式はＣ76Ｈ95Ｎ30Ｏ15、分子量は１６６８．７６であった。
PI polyamide (4)
In FIG. 3, a PI polyamide of AcPyPyβPyPyPyPyγImImImβPyImβDp was designed so that the base sequence indicated by the green underline (Table 1, PI polyamide (4)) was recognized as a target base sequence in FIG. This PI polyamide was represented by the following formula (formula 4), the chemical formula was C 76 H 95 N 30 O 15 , and the molecular weight was 1668.76.
［式４］
[Formula 4]
ＰＩポリアミド（コントロール）
ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）として、表１、ＰＩポリアミド（コントロール）に示した塩基配列を標的塩基配列として認識するようにＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式５）に示されるものであり、化学式はＣ73Ｈ94Ｎ29Ｏ15、分子量は１６１７．７１であった。
PI polyamide (control)
The base sequence shown in Table 1, PI polyamide (control) is used as the target base as PI polyamide (control) that does not bind to all or part of the common base sequence (SEQ ID NO: 1) present in the TMPRSS2 gene and ERG gene. A PI polyamide of AcPyPyPyImβImγPyβPyImβImβDp was designed to be recognized as a sequence. This PI polyamide was represented by the following formula (formula 5), the chemical formula was C 73 H 94 N 29 O 15 , and the molecular weight was 1617.71.
［式５］
[Formula 5]
２．ＰＩポリアミドの合成
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
ＨＣＴＵ（ペプチド研究所製）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ合成した。
2. Synthesis of PI polyamide <Synthesis of pyrrole imidazole polyamide using HCTU>
HCTU (manufactured by Peptide Institute) is used as a condensation activator, as described in 1. above. PI polyamides (1) to (4) (4 types) and PI polyamide (control) designed in the above were synthesized.
１）試薬の調製
（１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，２０ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，４０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）およびＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）をそれぞれ、合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを２当量、それ以外を４当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに４５ｍｇ、それ以外のチューブには２２．５ｍｇをそれぞれ加えた。また、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックスおよび１時間静置し完全に溶解させた。
（２）合成用試薬
合成機による合成のために、表２に記載の試薬を調製して用いた。
1) Reagent preparation (1) Monomers FmocPyCOOH (Wako, 20 mg), FmocImCOOH (Wako, 40 mg), Fmoc-γ-Abu-OH (Nova Biochem, 17.5 mg) and Fmoc-β-Ala-OH (Nova Biochem, 17.5 mg) was prepared for each of the PI polyamides to be synthesized, and the required coupling amount was prepared, and 2 equivalents of FmocImCOOH and 4 equivalents were weighed with respect to the resin, and transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube. Further, 45 mg of HCTU was added to the FmocImCOOH tube, and 22.5 mg was added to the other tubes. Moreover, 500 μL of NMP (manufactured by Nacalai tesque) was added to the FmocImCOOH tube, and 250 μL was added to the other tubes, and vortexed for 1 hour to completely dissolve.
(2) Reagent for synthesis The reagents listed in Table 2 were prepared and used for synthesis by a synthesizer.
３．レジンの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットした。これにＮＭＰ１ｍＬを加え、２０分間膨潤させた。
3. Preparation of Resin 40 mg (0.04 mmol) of Fmoc-β-Ala-Wang-Resin (manufactured by Peptide Institute) was taken in Small Libra Tube (manufactured by HiPep Laboratories) and set in a peptide synthesizer. To this was added 1 mL of NMP and allowed to swell for 20 minutes.
４．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ−８；島津製作所製）にインストールした。また、先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ−８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ2ＮＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ2ＮＡｃＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙγＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ2ＮＡｃＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ2ＮＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍβ−ＲｅｓｉｎまたはＨ2ＮＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβ−Ｒｅｓｉｎまで、次の（１）〜（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。
4). Peptide synthesis (automatic)
Above 1. The DIEA prepared in (1) was installed as a condensation activator in a synthesizer (PSSM-8; manufactured by Shimadzu Corporation). Moreover, the tube containing each monomer prepared previously was arrange | positioned in the rack in a synthesis machine in order from C terminal. Set the PSSM-8 synthesis program, synthesizer is started, H 2 NAcPyImβImImImγPyPyPyβImPyPyβ-Resin, H 2 NAcPyPyPyβPyPyγPyImβImImImβ-Resin, H 2 NAcImImImβPyImγPyPyβPyPyPyβ-Resin, to H 2 NAcPyPyβPyPyPyγImImImβPyImβ-Resin or H 2 NAcPyPyPyImβImγPyβPyImβImβ-Resin, the following ( Automatic synthesis was performed by repeating the reaction cycle of 1) to (4).
反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマーおよび活性化剤を除くため、１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
Reaction cycle (1) The coupling treatment was performed in NMP for 30 minutes using the above activator.
(2) Resin washing with 1 mL NMP was repeated 5 times to remove excess monomer and activator.
(3) 1 mL of Fmoc deprotection solution (30% Piperidine / NMP) was added and reacted for 3 minutes. After removing the solution, the same cycle was repeated again.
(4) To remove the Fmoc deprotection solution, washing of the resin with 1 mL of NMP was repeated 5 times to return to (1). This cycle was repeated until the desired product was obtained.
５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移した。これにＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することにより、レジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬおよびメタノール１ｍＬで回収した。
溶媒を留去後、ＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ3ＣＮ＝１００：０〜０：１００，３０ｍｉｎ）で分取精製した。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ得た。
5. Purification The resin was removed from the synthesizer, washed and dried, and then transferred to an eppendorf tube with a screw cap. To this, 500 μL of N, N-dimethylpropanamine (manufactured by Nacalai tesque, 2 mL) was added and heated at 55 ° C. overnight with a heat block to cut out the polyamide from the resin. The reaction solution was transferred to a Libra Tube, the resin was removed by filtration, and the remaining reaction solution adhering to the resin was collected with 1 mL of NMP and 1 mL of methanol.
After the solvent was distilled off, purification was performed by HPLC (0.1% AcOH: CH 3 CN = 100: 0 to 0: 100, 30 min). After preparative purification, it is freeze-dried and the above 1. PI polyamide (4 types) and PI polyamide (control) designed in the above were obtained.
６．ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ
上記５において生成したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）について、次の１）および２）の工程によるＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙにより、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子への結合をそれぞれ確認した。また、ＰＩポリアミド（コントロール）についても同様に、各遺伝子への結合の有無を調べた。
6). DNA Binding Assay
Regarding the PI polyamides (1) to (4) (4 types) produced in 5 above, binding to the TMPRSS2 gene and the ERG gene was confirmed by DNA binding assay according to the following steps 1) and 2). Similarly, for PI polyamide (control), the presence or absence of binding to each gene was examined.
１）ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の共通の塩基配列（配列表配列番号１）と同じ塩基配列を含むＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡにＦＩＴＣをラベルした分子（４７ｂｐ）、および同塩基配列を含むＥＲＧ オリゴＤＮＡにＦＩＴＣをラベルした分子（５９ｂｐ）を作成し、終濃度１μＭの各オリゴをアニーリングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で１００℃に熱し、その後２時間かけて段階的に３０℃まで冷却した。これにより、各オリゴＤＮＡは自己アニーリングし、ヘアピン状の２本鎖を形成する。
２）上記１）のヘアピン状の２本鎖ＤＮＡを含む溶液１５μｌに０．２ｍＭのＰＩポリアミド（１）〜（４）またはＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ５μｌ混合し、３７℃で１時間インキュベートして混合液を得た。
３）上記（２）の混合液を５−２０％ アクリルアミドゲル（ＴＢＥ バッファー）にて電気泳動しＬＡＳ ４０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）にて泳動像を観察し、泳動度の違いから結合の有無を判定した。
1) A molecule (47 bp) in which FITC is labeled on a TMPRSS2 oligo DNA containing the same base sequence as the common base sequence of the TMPRSS2 gene and ERG gene (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and FITC on the ERG oligo DNA containing the same base sequence A labeled molecule (59 bp) is prepared, and each oligo at a final concentration of 1 μM is heated to 100 ° C. in annealing buffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl), and then gradually cooled to 30 ° C. over 2 hours. did. As a result, each oligo DNA is self-annealed to form a hairpin-like double strand.
2) Mix 15 μl of the hairpin-like double-stranded DNA of 1) above with 5 μl each of 0.2 mM PI polyamide (1) to (4) or PI polyamide (control) and incubate at 37 ° C. for 1 hour. To obtain a mixed solution.
3) The mixture of (2) above was electrophoresed on a 5-20% acrylamide gel (TBE buffer), and the electrophoretic image was observed with LAS 4000 (manufactured by GE Healthcare Japan). The presence or absence was judged.
その結果、図４に示したようにＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡにおいても、ＥＲＧ オリゴＤＮＡにおいても、本発明のＰＩポリアミド（１）を加えた場合（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１））はＰＩポリアミド（コントロール）を加えた場合（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））やＰＩポリアミドを加えていない溶媒のみの場合（図４、Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比べて泳動の遅れが見られ、ＰＩポリアミド（１）がＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡおよびＥＲＧ オリゴＤＮＡのいずれにもに結合することが確認できた。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。 As a result, when the PI polyamide (1) of the present invention was added to both TMPRSS2 oligo DNA and ERG oligo DNA as shown in FIG. 4 (FIG. 4, Polyamide (1)), PI polyamide (control) was used. When added (FIG. 4, Polyamide (Control)) and when only a solvent not added with PI polyamide was used (FIG. 4, Vehicle), a delay in migration was observed, and PI polyamide (1) was treated with TMPRSS2 oligo DNA and ERG. It was confirmed to bind to any of the oligo DNAs. In the PI polyamide (2), the PI polyamide (3) and the PI polyamide (4), the same result as that of the PI polyamide (1) was obtained.
［試験例］
次の試験例１〜４により、本発明のＰＩポリアミドによる、前立腺癌細胞（ＬＭＣａＰ）に対する効果を確認した。なお、各試験例における共通の試料として、次の試料を同様に調製して使用した。
[Test example]
The following test examples 1 to 4 confirmed the effect of the PI polyamide of the present invention on prostate cancer cells (LMCaP). In addition, the following sample was similarly prepared and used as a common sample in each test example.
＜試料＞
１．ＰＩポリアミド
実施例と同様の方法によって合成したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）を使用した。
これらの各ＰＩポリアミドを蒸留水に溶解したものを、細胞を培養している培地に添加することで細胞への導入を行った。
<Sample>
1. PI polyamide PI polyamides (1) to (4) (4 types) synthesized in the same manner as in Examples and PI polyamide (control) were used.
These PI polyamides dissolved in distilled water were added to the medium in which the cells were cultured to introduce the cells into the cells.
２．前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手したヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣナンバー：ＣＲＬ−１７４）を用いた。
2. Prostate cancer cell LNCaP
Human prostate cancer cell LNCaP (ATCC number: CRL-174) obtained from ATCC (American Type Culture Collection) was used.
３．培地
（１）フェノールレッド含有培地
フェノールレッド含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ７５０９）５００ｍＬに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を５０ｍｌ添加したものをフェノールレッド含有培地として用いた。
（２）フェノールレッド非含有培地
フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ８７５８）５００ｍに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を１２．５ｍｌ添加したものをフェノールレッド非含有培地として用いた。
3. Medium (1) Phenol red-containing medium Phenol red-containing RPMI-1640 medium (manufactured by SIGMA-Aldrich, catalog number R7509) 500 mL of charcoal-treated bovine serum (FBS) added thereto is used as a phenol red-containing medium It was.
(2) Phenol red-free medium Phenol red-free RPMI-1640 medium (manufactured by SIGMA-Aldrich, catalog number R8758) 500 m added with 12.5 ml of charcoal-treated bovine serum (FBS) Used as a containing medium.
４．ＤＨＴ（デヒドロテストステロン）（和光純薬）
エタノール（ＥｔＯＨ）で、１００ｎＭに溶解したＤＨＴをアンドロゲン刺激のために用いた。
4). DHT (Dehydrotestosterone) (Wako Pure Chemical Industries)
DHT dissolved in ethanol (EtOH) at 100 nM was used for androgen stimulation.
［試験例１］
融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の検討
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＩポリアミド（１）〜（４）をそれぞれ導入した細胞における融合遺伝子の発現、およびＥＲＧ遺伝子の過剰発現の有無を検討した。比較として、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においても同様に検討した。
１）ＰＩポリアミドの導入およびｃＤＮＡの調製
各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地でＬＮＣａＰ細胞を３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。
この細胞から、アイソゲン（ニッポンジーン製）を用いてマニュアルに従って、ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。
[Test Example 1]
Examination of expression of fusion gene or ERG gene By RT-PCR, the expression of the fusion gene in cells into which PI polyamides (1) to (4) were respectively introduced and the presence or absence of overexpression of the ERG gene were examined. For comparison, the same study was performed on cells into which PI polyamide (control) was introduced.
1) Introduction of PI polyamide and preparation of cDNA Each PI polyamide was added to 1 μM or 5 μM. LNCaP cells were cultured for 3 days in the phenol red-free medium of (2). Thereafter, the above 4. Of DHT (100 nM) was added into the medium and androgen stimulation was added.
RNA was extracted from the cells using isogen (Nippon Gene) according to the manual, and then cDNA was prepared using PrimeScript (registered trademark) Reverse Transcriptase (TaKaRa).
２）ＲＴ−ＰＣＲ
上記１）で調製したｃＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、表３に示したプライマーにより、各ＰＩポリアミドを導入した前立腺癌細胞における融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の有無を調べた。このＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。
2) RT-PCR
Using the cDNAs prepared in 1) above as template DNAs, the presence or absence of expression of a fusion gene or ERG gene in prostate cancer cells into which each PI polyamide was introduced was examined using the primers shown in Table 3. In this RT-qPCR, Power SYBR (registered trademark) Green PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) was used.
その結果、図５に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図５、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）、アンドロゲン刺激を与えても、導入したＰＩポリアミドの濃度依存的にＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子（図５、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ）およびＥＲＧ遺伝子（図５、ＥＲＧ）の発現が抑制されることが確認できた。一方、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においては、いずれの遺伝子の発現も抑制されなかった（図５、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。 As a result, as shown in FIG. 5, in the cells into which the PI polyamide (1) of the present invention was introduced (FIG. 5, Polyamide (1) 1 μM, 5 μM), It was confirmed that the expression of the fusion gene (FIG. 5, TMPRSS2-ERG) and the ERG gene (FIG. 5, ERG) of the TMPRSS2 gene and the ERG gene was suppressed in a concentration-dependent manner. On the other hand, in the cells into which PI polyamide (control) was introduced, expression of any gene was not suppressed (FIG. 5, Polyamide (Control)). In the PI polyamide (2), the PI polyamide (3) and the PI polyamide (4), the same result as that of the PI polyamide (1) was obtained.
［試験例２］
細胞増殖能の評価
各ＰＩポリアミドを導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、ＭＴＳアッセイによって各細胞の増殖能を検討した。
すなわち、このＬＮＣａＰ細胞を全部で５０００細胞となるように９６ウェルプレートに播き、各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地で３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。刺激後、それぞれ２４時間、４８時間または９６時間培養した。指定された刺激時間後、各細胞にＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を１０μｌ添加して１時間インキュベートした。その後、各細胞の吸光度（４９０ｎｍ）を測定し、培養後の細胞数を調べることで、細胞増殖能を評価した。
[Test Example 2]
Evaluation of Cell Proliferation A cell into which each PI polyamide was introduced and a cell into which PI polyamide (control) was introduced as a comparison were cultured, and the proliferation ability of each cell was examined by MTS assay.
That is, the LNCaP cells were seeded in a 96-well plate so as to have a total of 5000 cells, and each PI polyamide was added to 1 μM or 5 μM. The cells were cultured in the phenol red-free medium (2) for 3 days. Thereafter, the above 4. Of DHT (100 nM) was added into the medium and androgen stimulation was added. After stimulation, the cells were cultured for 24 hours, 48 hours, or 96 hours, respectively. After the designated stimulation time, 10 μl of MTS reagent (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison WI) was added to each cell and incubated for 1 hour. Thereafter, the absorbance (490 nm) of each cell was measured, and the cell proliferation ability was evaluated by examining the number of cells after culture.
その結果、図６に示したように、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に対し、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞（図６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）では、９６時間培養した段階で有意に増殖が抑制されることが確認できた（図６、＊：ｐ＜０．０５）。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。 As a result, as shown in FIG. 6, cells introduced with PI polyamide (1) of the present invention (FIG. 6, Polyamide (Control)) were introduced into cells introduced with PI polyamide (Control) (FIG. 6, Polyamide (Control)). 1) In 1 μM and 5 μM), it was confirmed that proliferation was significantly suppressed after 96 hours of culture (FIG. 6, * : p <0.05). In the PI polyamide (2), the PI polyamide (3) and the PI polyamide (4), the same result as that of the PI polyamide (1) was obtained.
［試験例３］
細胞遊走能の評価
各ＰＩポリアミドを導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｅｒ Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ＰＥＴ ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ アッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
すなわち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーに上記３．（１）のフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ＰＩポリアミドを５μＭとなるように添加した添加した上記３．（１）のフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０4細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌの上記３．（１）のフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ’ｓ ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の顕微鏡で観察し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。
[Test Example 3]
Evaluation of cell migration ability Cells in which each PI polyamide was introduced, and cells in which PI polyamide (control) was introduced as a comparison were cultured, and using a Cell Culture Insert and 8.0 μm pore size PET filter (manufactured by Becton Dickinson) The migration ability of each cell was examined by a cell migration assay.
That is, fibronectin (manufactured by Sigma) diluted to 10 μg / ml with PBS was allowed to act on the culture dish for 30 minutes to prepare a lower layer filter, and then the above 3. 700 μl of (1) phenol red-containing medium RPMI 1640 medium was added.
2. Each of the above-mentioned PI polyamides added to a concentration of 5 μM The LNCaP cells cultured in the phenol red-containing medium of (1) for 3 days are divided into 5 × 10 4 cells, and each cell is treated with 300 μl of the above 3. The suspension in the phenol red-containing medium (1) was added to each upper chamber. This was cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, and then the filter was peeled off.
The cells on the lower layer filter were fixed with methanol for 30 minutes, washed with PBS, and incubated with Gimsa's stain solution (manufactured by Muto Pure Chemicals) for 30 seconds. Thereafter, the cells were observed with a 200-power microscope, and the cell migration ability was evaluated by counting the number of cells.
図７に各ＰＩポリアミドを添加した細胞の顕微鏡写真を示した。また、各ＰＩポリアミドを添加した細胞における遊走した細胞数を図８に示した。その結果、図７および図８に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図７、８、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１））、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図７、８（Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に比べて、細胞の遊走能（浸潤能）が顕著に抑制されることが確認できた（図８、＊＊＊：ｐ＜０．００００１）。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。 FIG. 7 shows micrographs of cells to which each PI polyamide was added. In addition, the number of migrated cells in the cells to which each PI polyamide was added is shown in FIG. As a result, as shown in FIG. 7 and FIG. 8, in the cells into which the PI polyamide (1) of the present invention was introduced (FIGS. 7 and 8, Polyamide (1)), cells into which the PI polyamide (control) was introduced ( Compared to FIGS. 7 and 8 (Polyamide (Control)), it was confirmed that the cell migration ability (invasion ability) was remarkably suppressed (FIG. 8, *** : p <0.00001). In (2), PI polyamide (3) and PI polyamide (4), the same result as that of PI polyamide (1) was obtained.
［試験例４］
ＥＺＨ２遺伝子の発現量の検討
前立腺癌の進行に作用するポリコーム群タンパク質であるＥＺＨ２をコードする遺伝子についても、本発明の各ＰＩポリアミドを導入した細胞における遺伝子の発現量を検討した。比較として、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においても同様に検討した。
[Test Example 4]
Examination of expression level of EZH2 gene Regarding the gene encoding EZH2, which is a polycomb group protein that acts on the progression of prostate cancer, the expression level of the gene in the cells into which each PI polyamide of the present invention was introduced was examined. For comparison, the same study was performed on cells into which PI polyamide (control) was introduced.
１）ＰＩポリアミドの導入およびｃＤＮＡの調製
各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地でＬＮＣａＰ細胞を３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた後、さらに２日間（４８時間）培養した。
この細胞から、アイソゲン（ニッポンジーン製）を用いてマニュアルに従って、ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。
1) Introduction of PI polyamide and preparation of cDNA Each PI polyamide was added to 1 μM or 5 μM. LNCaP cells were cultured for 3 days in the phenol red-free medium of (2). Thereafter, the above 4. Of DHT (100 nM) was added to the medium, and after androgen stimulation, the cells were further cultured for 2 days (48 hours).
RNA was extracted from the cells using isogen (Nippon Gene) according to the manual, and then cDNA was prepared using PrimeScript (registered trademark) Reverse Transcriptase (TaKaRa).
２）ＲＴ−ｑＰＣＲ
上記１）で調製したｃＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、配列表配列番号１９（ＥＺＨ２ ＲＴ−ｑＰＣＲ ｆｗ、フォワードプライマー）および配列表配列番号２０（ＥＺＨ２ ＲＴ−ｑＰＣＲ ｒｅｖ、リバースプライマー）に示したプライマーにより、各ＰＩポリアミドを導入した前立腺癌細胞におけるＥＺＨ２遺伝子の発現量を調べた。このＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。
2) RT-qPCR
Using the cDNAs prepared in 1) above as template DNAs, with primers shown in SEQ ID NO: 19 (EZH2 RT-qPCR fw, forward primer) and SEQ ID NO: 20 (EZH2 RT-qPCR rev, reverse primer), The expression level of the EZH2 gene in prostate cancer cells into which each PI polyamide was introduced was examined. In this RT-qPCR, Power SYBR (registered trademark) Green PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) was used.
その結果、図９に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図９、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）、導入していない細胞（図９、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に比べてＥＺＨ２遺伝子の発現が抑制されることが確認できた。 As a result, as shown in FIG. 9, in the cells into which the PI polyamide (1) of the present invention was introduced (FIG. 9, Polyamide (1) 1 μM, 5 μM), the cells not introduced (FIG. 9, Polyamide (Control) It was confirmed that the expression of the EZH2 gene was suppressed as compared to)).
本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。また、前立腺癌に限らず、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を原因とする疾病や、ＥＺＨ２遺伝子の発現を原因とする疾病等に対し、これらの遺伝子の発現を制御できる効果的な薬剤の提供も可能となる。 By providing the PI polyamide of the present invention, it becomes easy to develop a safe and stable drug useful for the prevention and treatment of prostate cancer. In addition to prostate cancer, it is effective to control the expression of these genes against diseases caused by the expression of the fusion gene of TMPRSS2 gene and ERG gene, diseases caused by the expression of EZH2 gene, etc. Drugs can also be provided.
Claims (4)
［式１］
［式２］
［式３］
［式４］
Lupi roll shown in one of the following formulas 1-4 - imidazole polyamide.
[Formula 1]
[Formula 2]
[Formula 3]
[Formula 4]
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012106382A JP6044923B2 (en) | 2012-05-08 | 2012-05-08 | New PI polyamide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012106382A JP6044923B2 (en) | 2012-05-08 | 2012-05-08 | New PI polyamide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013234135A JP2013234135A (en) | 2013-11-21 |
| JP6044923B2 true JP6044923B2 (en) | 2016-12-14 |
Family
ID=49760538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012106382A Expired - Fee Related JP6044923B2 (en) | 2012-05-08 | 2012-05-08 | New PI polyamide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6044923B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6044935B2 (en) * | 2013-03-11 | 2016-12-14 | 学校法人日本大学 | New PI polyamide |
| WO2022019303A1 (en) * | 2020-07-20 | 2022-01-27 | 学校法人日本大学 | PYRROLE-IMIDAZOLE POLYAMIDE, TGFβ GENE EXPRESSION INHIBITOR, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, AND METHOD FOR PRODUCING PYRROLE-IMIDAZOLE POLYAMIDE |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8835480B2 (en) * | 2007-04-23 | 2014-09-16 | California Institute Of Technology | Inhibitors for steroid response elements and related methods |
-
2012
- 2012-05-08 JP JP2012106382A patent/JP6044923B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013234135A (en) | 2013-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3018209B1 (en) | Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease | |
| JP6425142B2 (en) | Artificial match-type miRNA for gene expression regulation and its use | |
| US11904057B2 (en) | Nanoparticle-hydrogel composite for nucleic acid molecule delivery | |
| KR20150006743A (en) | Liver cancer related genes-specific siRNA, double-stranded oligo RNA molecules comprising the siRNA, and composition for the prevention or treatment of cancer comprising the same | |
| CN112543809A (en) | Combination therapy comprising C/EBP alpha sarRNA | |
| Fabbri et al. | Treatment of human airway epithelial Calu-3 cells with a peptide-nucleic acid (PNA) targeting the microRNA miR-101-3p is associated with increased expression of the cystic fibrosis Transmembrane Conductance Regulator () gene | |
| JP6044935B2 (en) | New PI polyamide | |
| JP6044923B2 (en) | New PI polyamide | |
| EP3046560B1 (en) | Stem cell modulation ii | |
| KR20150006742A (en) | Liver cancer related genes-specific siRNA, double-stranded oligo RNA molecules comprising the siRNA, and composition for the prevention or treatment of cancer comprising the same | |
| CN107602670B (en) | Polypeptide EIP-22 capable of antagonizing RNA binding activity of EWSR1 protein and application thereof | |
| Kim et al. | PDL1-binding peptide/anti-miRNA21 conjugate as a therapeutic modality for PD-L1high tumors and TAMs | |
| Wu et al. | LncRNA GAS5 promotes spermidine‑induced autophagy through the miRNA‑31‑5p/NAT8L axis in pulmonary artery endothelial cells of patients with CTEPH | |
| JP4719670B2 (en) | Method for selective inhibition of human N-myc gene by antisense and antigene peptide nucleic acid (PNA) in N-myc expressing tumor | |
| US11618901B2 (en) | Anti-miRNA carrier conjugated with a peptide binding to a cancer cell surface protein and use thereof | |
| Athyala et al. | Neocarzinostatin, aptamer conjugates for targeting EpCAM-positive tumor cells | |
| Lu et al. | Hydrogen sulfide in health and diseases: cross talk with noncoding RNAs | |
| JP5685081B2 (en) | Matrix metalloproteinase 9 gene selective expression inhibitor | |
| KR20080041037A (en) | Complex of protein transduction peptide and small interference rna and use thereof | |
| JP5520931B2 (en) | Sequence-specific expression regulator targeting MYC downstream gene, and method for determining target or target group of MYC downstream gene | |
| CN114146187B (en) | PDGFR-beta gene expression inhibitor and application thereof | |
| EP2855519B1 (en) | Modulation of tlr4-signaling pathway | |
| WO2021080020A1 (en) | Nucleic acid delivery enhancer | |
| JP2006022063A (en) | Lox-1 gene expression inhibitor | |
| WO2012002328A1 (en) | Blood hdl level increasing agent or anti-arteriosclerotic agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150501 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160622 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160719 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161102 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161107 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6044923 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |