JP6038685B2 - Lithium measurement method - Google Patents
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Description
本発明は、尿、血清、血漿、血液試験試料を含む生体試料や、飲料水を含む環境試料等の水溶液中のリチウム測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring lithium in an aqueous solution such as biological samples including urine, serum, plasma, blood test samples, and environmental samples including drinking water.
従来よりリチウム含有の気分安定薬は、躁うつ病、てんかん、双極性障害の治療に有効であるため多用されているが、投与に際しては血清中のリチウム濃度を適正な範囲にコントロールする必要がある。
一般的には、双極性障害(躁うつ病)の治療薬、或いは抗うつ薬とともに気分安定薬として炭酸リチウム錠(経口投与)が広く処方されている。炭酸リチウム(Li2CO3）はリチウム中毒となる血中濃度近辺まで処方しないと投与効果が現れないという特徴を有しており、治療域と中毒域とが極めて近いため、薬物血中濃度モニタリングが必要項目(ＴＤＭ)に指定されている。
Conventionally, lithium-containing mood stabilizers are widely used because they are effective in the treatment of manic depression, epilepsy, and bipolar disorder. However, when administered, it is necessary to control the lithium concentration in the serum within an appropriate range. .
In general, lithium carbonate tablets (oral administration) are widely prescribed as a treatment for bipolar disorder (manic depression) or an antidepressant as a mood stabilizer. Lithium carbonate (Li 2 CO 3 ) has the feature that the administration effect does not appear unless it is prescribed up to the blood concentration that causes lithium poisoning, and since the treatment area and the poisoning area are very close, drug blood concentration monitoring Is designated as a necessary item (TDM).
さらに詳しくは、常時、投薬患者の試料血漿内のリチウム濃度が0.6〜1.2 mEq/Lとなるように調節しなければ成らないが、これは血清中のリチウム濃度が0.6mEq以下で余り少なすぎると気分安定効果がなく、逆に、これが必要以上に投与され、その濃度が１.５ mEq/Lを超え、さらに過剰に投与されるとリチウム中毒を引き起こし、振戦、構語障害、眼振、腎障害、痙攣を含む重篤な副作用が現れる。もし潜在的にこれらの兆候が見られた際には、治療を中止し、血漿あるいは血清中のリチウム濃度を再測定し、リチウム中毒を緩和する措置を行わなければならない。
このように、リチウム塩の気分安定薬は鬱病、双極性障害、てんかん等の患者の治療等に効果があるものの、過剰投与の場合には重大な障害が生じるので、これを投与する場合は、常に血清中のリチウム濃度を0.6〜1.2 mEq/Lになるように監視することが必須事項である。
More specifically, the lithium concentration in the sample plasma of the patient should always be adjusted to 0.6-1.2 mEq / L, which is too low when the serum lithium concentration is 0.6 mEq or less. There is no mood stabilizing effect, conversely, if it is administered more than necessary, the concentration exceeds 1.5 mEq / L, and if it is excessively administered, it causes lithium poisoning, tremor, dysarthria, nystagmus, kidney Serious side effects including disability and convulsions appear. If these signs are potentially present, treatment should be discontinued and remeasured for plasma or serum lithium levels to relieve lithium poisoning.
Thus, although lithium salt mood stabilizers are effective in treating patients such as depression, bipolar disorder, epilepsy, etc., if overdosed, serious damage will occur, so when administering this, It is essential to constantly monitor the serum lithium concentration at 0.6 to 1.2 mEq / L.
このことから、従来、血清中のリチウムの定量測定が必要とされ、リチウムの比色測定を可能にさせる臨床検査用の液状試薬組成物の開発が進められている。
この先行技術として、特許文献１にはクリプタンドイノフォアを用いた生物学的検体中のリチウムの濃度を測定する試薬組成物が開示されている。
また、特許文献２には、ピロール環を持つ大環状化合物であって、ピロール環のβ位に８個の臭素(Ｂr)原子を結合させたリチウムイオンと反応する分析試薬が開示されている。
For this reason, conventionally, quantitative measurement of lithium in serum is required, and development of a liquid reagent composition for clinical tests that enables colorimetric measurement of lithium has been underway.
As this prior art,
なお、非特許文献１として、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた化合物で、リチウムイオンの検出・分離ができることが開示されている。
Non-Patent
従来のリチウム試薬組成物がいくつか知られているが、その組成が毒劇物であったり、原薬が供給不安定で高価であり、ほとんどの原薬が水に溶解しないか、或いは水に溶解すると失活し発色せず、発色反応が遅い。
これらを克服したとされる特許文献２に開示された技術は、発色法を可能としているが、発色感度が大きすぎるため検体の希釈処理が必要であり、試薬組成物の仕様がｐＨ１１以上であるため空気中のＣＯ2により変質しやすく、測定データが不安定で、更に、ｐＨ１１以上となると、もはや水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのような濃厚な水酸化物溶液しか使えないのでｐＨを一定に維持していくことができず、また、これらは劇物であるので使用者にとっても忌避的なもので取り扱いが厄介であることや、実際の保存には汎用ではなく専用容器が必要であり、これらの欠陥を補うため機械的設備が大型かつ専用機器が必要で汎用性に欠くといった問題点があった。このため、オンサイトモニタリング、ＰＯＣＴ(Point Of Care Testing)に適用させることが困難であるといった問題点もあった。
Several conventional lithium reagent compositions are known, but the composition is poisonous or deleterious, the drug substance is unstable and expensive, and most drug substances do not dissolve in water or When dissolved, it deactivates and does not develop color, and the color development reaction is slow.
The technique disclosed in
ところで、前述の特許文献１のリチウムの定量を目的とする試薬組成物は、本発明とは全く異なった化合物を使用しており、ｐＨ１２でしか使用できず、前述したように、ｐＨ１１以上となると、もはや水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのような濃厚な水酸化物溶液しか使えず、これらは劇物であるので使用者にとっても取り扱いが厄介であり、更に、これらを補うために大型の専用機器が必要で、汎用性に欠くといった問題点があった。
また、非特許文献１である小柳らの論文は、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを用いてリチウムイオンの分離・検出ができることが開示されているが、油性、且つ毒劇物であるクロロホルムを用いた溶媒抽出を行わなければ、リチウムの検出・分離はできなかった。何よりも、水溶液中のリチウムを煩雑な前処理なしに直接定量することはできず、特に、血清中のリチウムを迅速、且つ定量的に測定することはできないといった問題点があった。このように、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを用いて水溶液中のリチウムの検出は難しく、定量的に濃度を測定することは困難で今までに実現されていなかった。
By the way, the reagent composition for the purpose of quantifying lithium described in
In addition, Koyanagi et al., A
そこで、本発明者らは、血清及び血漿試験試料をテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素の全部を２８個のフッ素に置き換えた構造式
この特許におけるリチウムイオンを測定方法は、スペクトルを測定において、テトラフェニルポルフィリン金属錯体に典型的なソーレー帯（380nmから460nm近傍）と呼ばれる最大感度が得られる波長ではなく、血清検体中リチウム濃度範囲に対して最適な感度が得られる波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測光波長とすることにより、希釈操作、或いは希釈装置等の煩雑な操作、それに伴う付帯設備が不必要となるようにしている。
しかしながら、溶血している血清等の検体においては妨害因子としてヘモグロビン由来の540nm付近、560nmから650nm付近の二つの吸収ピーク（各々、βバンド、αバンド）が生じることが一般的に知られているが、このようなヘモグロビンを高濃度に含む検体と本発明の試薬組成物とを接解させた場合、本発明の測光波長である550nmとヘモグロビンのβ、αバンド由来の540nmの吸収が重複するため、実際の測定値に対して正の誤差が生じることが判った。
すなわち、（リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体由来の550nmの感度）＋（ヘモグロビン由来550nmの感度）＝ 550nmの測定感度（∴ヘモグロビン由来の正の誤差が生じる。）である。
In this patent, the method for measuring lithium ions is not the wavelength at which the maximum sensitivity called the Soray band (near 380 nm to 460 nm) typical of tetraphenylporphyrin metal complexes is obtained in measuring the spectrum, but within the range of lithium concentrations in serum samples. By using the wavelength range of 550nm, or the wavelength range from 530nm to 560nm in the vicinity to obtain the optimum sensitivity, the diluting operation or complicated operation of the diluting device is not necessary. It is trying to become.
However, it is generally known that two absorption peaks (β band and α band, respectively) around 540 nm and 560 nm to 650 nm derived from hemoglobin are generated as interference factors in specimens such as hemolyzed serum. However, when such a specimen containing hemoglobin at a high concentration is contacted with the reagent composition of the present invention, the absorption at 550 nm which is the photometric wavelength of the present invention and the absorption of 540 nm derived from the β and α bands of hemoglobin overlap. Therefore, it was found that a positive error occurs with respect to the actual measurement value.
That is, (sensitivity of 550 nm derived from lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex) + (sensitivity of 550 nm derived from hemoglobin) = measurement sensitivity of 550 nm (a positive error derived from ∴hemoglobin occurs).
上記課題を解決するために、請求項１の発明は、血清及び血漿試験試料をテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素の全部を２８個のフッ素に置き換えた構造式
前記リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体のスペクトルの波長550nm又はその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長とし、別途ヘモグロビンの600nmの感度を測定して、測定波長に含まれるヘモグロビンの550nmの感度を600nmの感度で相殺するように次の算出式を用い、
(算出式）550nmの感度＝リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体の550nm感度 ＋ ヘモグロビンの550nm感度 − ヘモグロビンの600nm感度、
リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体の本来の550nm感度を算出するようにしたことを特徴とするリチウムイオン測定方法である。
In order to solve the above-mentioned problems, the invention of
The wavelength of 550 nm of the spectrum of the lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex or a wavelength band of 530 nm to 560 nm in the vicinity thereof is used as a measurement wavelength, and the sensitivity of 600 nm of hemoglobin is separately measured, and the sensitivity of 550 nm of hemoglobin included in the measurement wavelength Using the following formula to cancel out with a sensitivity of 600 nm,
(Calculation formula) Sensitivity at 550 nm = 550 nm sensitivity of lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex + 550 nm sensitivity of hemoglobin−600 nm sensitivity of hemoglobin,
The lithium ion measurement method is characterized in that the original 550 nm sensitivity of the lithium-F28 tetraphenylporphyrin complex is calculated.
本発明のリチウム測定方法によれば、血清試験試料中のリチウム濃度をより正確に検出することができる。
すなわち、溶血している血清等の検体においては妨害因子としてヘモグロビン由来の540nm付近、560nmから650nm付近の二つの吸収ピーク（各々、βバンド、αバンド）が生じることが一般的に知られているが、このようなヘモグロビンを高濃度に含む検体と本発明の試薬組成物とを接解させた場合、本発明の測光波長である550nmとヘモグロビンのβ、αバンド由来の540nmの吸収が重複するため、実際の測定値に対して正の誤差が生じるため、ヘモグロビンの550nmと600nmの二つの感度比がほぼ同一であること、つまり、ヘモグロビンの550nmの感度＝ヘモグロビンの600nmの感度であることに注目し、ヘモグロビンの550nmの感度を600nmの感度で相殺することができることに着目した。
ここで、550nmの感度 ＝ リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体の550nm感度 ＋ ヘモグロビンの550nm感度 − ヘモグロビンの600nm感度、とすれば、ヘモグロビン由来の550nmの感度を相殺してより正しい550nmの感度、即ち、血清試験試料中のリチウム濃度をより正確に検出することができる。
According to the lithium measurement method of the present invention, the lithium concentration in the serum test sample can be detected more accurately.
That is, it is generally known that two absorption peaks (having a β band and an α band, respectively) around 540 nm and 560 nm to 650 nm derived from hemoglobin occur as interference factors in a sample such as hemolyzed serum. However, when such a specimen containing hemoglobin at a high concentration is contacted with the reagent composition of the present invention, the absorption at 550 nm which is the photometric wavelength of the present invention and the absorption of 540 nm derived from the β and α bands of hemoglobin overlap. Therefore, since a positive error occurs with respect to the actual measurement value, the two sensitivity ratios of 550 nm and 600 nm of hemoglobin are almost the same, that is, the sensitivity of 550 nm of hemoglobin = the sensitivity of 600 nm of hemoglobin. Attention was paid to the fact that the sensitivity of hemoglobin can be offset by the sensitivity of 600 nm.
Here, 550 nm sensitivity = 550 nm sensitivity of lithium F28 tetraphenylporphyrin complex + 550 nm sensitivity of hemoglobin − 600 nm sensitivity of hemoglobin, so that 550 nm sensitivity derived from hemoglobin cancels out the sensitivity of 550 nm. The lithium concentration in the serum test sample can be detected more accurately.
本発明者らは、血清及び血漿中のリチウム濃度をより簡単に定量測定できるリチウム試薬組成物を鋭意研究し、前掲の非特許文献１で製法が開示された、ピロール環を持つ大環状化合物を用い、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えてフッ素を２８個とした下記の構造式(以下、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンと称す)に着目して、本発明の測定方法に使用するリチウム試薬組成物に想到した。
ピロール環を持つ大環状化合物を利用したリチウム試薬組成物として前掲特許文献２に、ピロール環を持つ大環状化合物であってピロール環のβ位に８個の臭素(Ｂr)原子を結合させ、リチウムイオンと反応する分析試薬が開発されているが、ｐＨ１１以上のアルカリ性でなければリチウムイオンと反応しづらい。一方、前掲特許文献３にあるＦ２８テトラフェニルポルフィリンであれば、ｐＨ５からｐＨ１２でも反応するので、本発明の測定方法で使用するリチウム試薬組成物は、このＦ２８テトラフェニルポルフィリンをキレート剤として、水溶液系でのリチウムイオンの定量測定に使用でき、また、目視でも明確に判定できるようにしたものであり、先ず、このリチウム定量測定試薬組成物について説明する。
As a lithium reagent composition using a macrocyclic compound having a pyrrole ring,
生体試料や環境試料等の水溶液中のリチウムイオンが前記リチウム試薬組成物、特にテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた化合物がキレート剤(発色剤)となってリチウムキレート発色錯体を形成し、所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、未反応のキレート配位子のみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめる。この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mＥq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ mＥq/Lから１.５ meq/Lでは黄色、１.５ mＥq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視並びに比色により明瞭に検出できる。
本発明で使用する検体では、上記のリチウム試薬組成物中の、F２８テトラフェニルポルフィリンの濃度を０.１〜１.０g/Lとし、好ましくは、０.５g/Lとすれば管理域と中毒域に相当するリチウム濃度を判別する場合に最適であることも見出した。
Lithium ions in aqueous solutions such as biological samples and environmental samples are lithium chelate compounds, especially compounds in which all hydrogen bonded to carbon of tetraphenylporphyrin is replaced with fluorine as a chelating agent (color former). By forming a colored complex and irradiating or exposing to white light with a predetermined luminance, only the unreacted chelate ligand is changed to a structural isomer as a photochemical tautomer. As a result, the lithium concentration in the specimen is green at 0.5 mEq / L (= mol / L) or lower, yellow from 0.5 mEq / L to 1.5 meq / L, 1.5 mEq / L or higher. In red. This color change conveniently matches the threshold level in the control area and the poisoning area, and can be clearly detected visually and by colorimetry.
In the specimen used in the present invention, the concentration of F28 tetraphenylporphyrin in the above lithium reagent composition is 0.1 to 1.0 g / L, and preferably 0.5 g / L. It was also found that it is optimal for discriminating the lithium concentration corresponding to the region.
本発明のｐＨ調節剤について、それが、ｐＨ５.０未満の酸性側では、本発明の発色剤(キレート剤)であるＦ２８テトラフェニルポルフィリン化合物とリチウムイオンは結合しないため、呈色変化が起こらず、リチウムの定量は困難である。また、ｐＨが５〜７の間では前記発色剤とリチウムイオンは特異的に反応するが、発色速度が緩やかである。
一方、ｐＨ８〜１１では前記発色剤とリチウムイオンは速やかに反応し、且つ安定な発色錯体を得られる。ｐＨ１１を越えるアルカリ性側では、前記キレート剤、生成した発色錯体の色調の経時的な安定性が悪い。これは、空気中の二酸化炭素を吸収することによるｐＨの変動が生じやすいことに起因する。したがって、リチウム試薬組成物のｐＨ調節剤としてはｐＨを７から１２の範囲とするｐＨ調節剤、或いはｐＨ調節剤としてのｐＨ緩衝剤が必要であり、より好ましくは、ｐＨ８〜１１となるようなｐＨ調節剤、ｐＨ緩衝剤の使用が必要である。
前記ｐＨ調節剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアを含むアルカリ剤、酢酸、リン酸、くえん酸、炭酸、重炭酸、しゅう酸、塩酸、硝酸を含む酸剤、及び、これらの塩類から選択されるものを使用し、前記ｐＨ調節剤はｐＨ緩衝剤でもよく、クエン酸、炭酸、重炭酸、りん酸、コハク酸、フタル酸、塩化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、Goodの緩衝剤としてMES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS、及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。
これらの含有によって前記リチウム試薬組成物は、ｐＨ５からｐＨ１２の範囲でリチウムに対して、特異的な発色反応が可能である。
Regarding the pH adjuster of the present invention, on the acidic side of pH less than 5.0, the color changing agent (chelating agent) of the present invention, the F28 tetraphenylporphyrin compound and lithium ions do not bind, so no color change occurs. Quantification of lithium is difficult. Further, when the pH is between 5 and 7, the color former and lithium ions react specifically, but the color development rate is slow.
On the other hand, at pH 8 to 11, the color former and lithium ion react quickly and a stable color complex can be obtained. On the alkaline side exceeding pH 11, the temporal stability of the color tone of the chelating agent and the generated color complex is poor. This is due to the fact that the pH tends to fluctuate due to absorption of carbon dioxide in the air. Therefore, the pH adjuster of the lithium reagent composition requires a pH adjuster having a pH in the range of 7 to 12, or a pH buffer as a pH adjuster, and more preferably pH 8-11. It is necessary to use a pH regulator or a pH buffer.
The pH adjusting agent includes sodium hydroxide, potassium hydroxide, an alkaline agent containing ammonia, acetic acid, phosphoric acid, citric acid, carbonic acid, bicarbonate, oxalic acid, hydrochloric acid, an acid agent containing nitric acid, and salts thereof. The pH adjusting agent may be a pH buffering agent selected from citric acid, carbonic acid, bicarbonate, phosphoric acid, succinic acid, phthalic acid, ammonium chloride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, Good buffer. MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS, and these Use one selected from salts.
With these inclusions, the lithium reagent composition can perform a specific color reaction with respect to lithium in the range of pH 5 to pH 12.
本発明のリチウム試薬組成物に包含させる溶剤は、水に混合し得る有機溶剤（極性溶媒）であることが必須であるが、被検体である血清、血漿、または細胞由来の溶出液等の水溶液と均一に混合できれば、有機溶媒を主とした溶液であっても、或いは、有機溶媒が添加された水溶液であってもよい。これは、汎用型の自動分析装置、紫外可視分光光度計により検体中のリチウム濃度を測定する場合はその被検体が水溶液であるため、その試薬組成物も同様に水溶液であることが望ましいからである。
前記有機溶剤は、水に混合し得る有機溶剤（極性溶媒）であればよく、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)等から選択される。
The solvent to be included in the lithium reagent composition of the present invention must be an organic solvent (polar solvent) that can be mixed with water, but it is an aqueous solution such as serum, plasma, or cell-derived eluate that is the analyte. Can be a solution mainly composed of an organic solvent or an aqueous solution to which an organic solvent is added. This is because when the concentration of lithium in a specimen is measured with a general-purpose automatic analyzer or ultraviolet-visible spectrophotometer, the specimen is an aqueous solution, and the reagent composition is preferably an aqueous solution as well. is there.
The organic solvent may be an organic solvent (polar solvent) that can be mixed with water, and is selected from dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), and the like.
本発明で使用する試薬組成物において、実際の製品では安定剤を混入させるが、本発明では安定剤として界面活性剤を使用している。この界面活性剤はＦ２８テトラフェニルポルフィリンの分散性を高め、さらに、発色反応時における試料由来の懸濁を防止させる作用があるので、これらの作用を得るために安定剤を混入することが必要である。
これらの安定剤は、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤であり、非イオン性界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸モノエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(商標登録：TritonX-100 ) 、p−ノニルフェノキシポリグリシドール及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。
好ましい非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100(登録商標)等) 、p-ノニルフェノキシポリグリシドールなどである。
In the reagent composition used in the present invention, a stabilizer is mixed in an actual product, but in the present invention, a surfactant is used as a stabilizer. This surfactant has the effect of enhancing the dispersibility of F28 tetraphenylporphyrin and preventing suspension from the sample during the color development reaction, so it is necessary to incorporate a stabilizer to obtain these effects. is there.
These stabilizers are nonionic surfactants or anionic surfactants, and nonionic surfactants include sorbitan fatty acid esters, pentaerythritol fatty acid partial esters, propylene glycol monofatty acid esters, glycerin fatty acid monoesters. , Polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene fatty acid partial ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid partial ester, polyoxyethylene fatty acid ester, fatty acid diethanolamide, fatty acid monoethanol Amides, polyoxyethylene fatty acid amides, polyoxyethylene octyl phenyl ether (trademark registration: TritonX-100), p-nonylphenoxypolyglycidol And those selected from these salts are used.
Preferred nonionic surfactants include polyoxyethylene octyl phenyl ether (such as Triton X-100 (registered trademark)), p-nonylphenoxypolyglycidol and the like.
また、安定剤としての陰イオン性界面活性剤は、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンフェニルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩等がある。代表的なものとして、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステルナトリウム及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。 Examples of the anionic surfactant as a stabilizer include an alkyl sulfate ester salt, a polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt, a polyoxyethylene phenyl ether sulfate ester salt, an alkylbenzene sulfonate, and an alkane sulfonate. Representative examples include sodium dodecyl sulfate, sodium dodecyl benzene sulfonate, sodium polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate, and salts thereof.
本発明のリチウム試薬組成物は、試料中に共存するリチウムイオン以外のイオンによりリチウム濃度の測定が妨害されるのを回避し、或いは試薬組成物の酸化を抑制し、その保存安定性を付与するためにマスキング剤を1種類、あるいは複数の種類を含有させてもよい。もっとも、リチウム以外のイオンが少ないのであれば、必ずしも包含する必要がない。
これらリチウム試薬組成物に加えるマスキング剤としては、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン（TPEN）、ピリジン、２,２-ビピリジン、プロピレンジアミン、 ジエチレントリアミン、ジエチレントリアミン−N,N,N',N",N"-五酢酸（DTPA）、トリエチレンテトラアミン、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N",N"',N"'-六酢酸（TTHA）、１,１０-フェナントロリン、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、O,O'-ビス(2-アミノフェニル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸（BAPTA）、N,N-ビス(2-ハイドロキシエチル)グリシン（Glycine）、トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸（CyDTA）、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、N-(2-ハイドロキシル)イミノ二酢酸（HIDA）、イミノ二酢酸（IDA）、ニトリロ三酢酸（NTA）、 ニトリロトリスメチルりん酸（NTPO）及び、これらの塩類から選択されるものを使用する。好ましくは、トリエタノールアミンが最適である。
The lithium reagent composition of the present invention avoids interfering with the measurement of lithium concentration by ions other than lithium ions coexisting in the sample, or suppresses oxidation of the reagent composition and imparts its storage stability. Therefore, one type or a plurality of types of masking agents may be contained. However, if there are few ions other than lithium, it is not necessarily included.
Masking agents added to these lithium reagent compositions include triethanolamine, ethylenediamine, N, N, N ', N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN), pyridine, 2,2-bipyridine, propylenediamine , Diethylenetriamine, diethylenetriamine-N, N, N ', N ", N" -pentaacetic acid (DTPA), triethylenetetraamine, triethylenetetramine-N, N, N', N ", N"', N "' -Hexaacetic acid (TTHA), 1,10-phenanthroline, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), O, O'-bis (2-aminophenyl) ethylene glycol-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (BAPTA) , N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Glycine), trans-1,2-diaminocyclohexane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (CyDTA), O, O'-bis (2 -Aminoethyl) ethylene glycol-N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA), N- (2-hydroxyl) iminodiacetic acid (HIDA), Diacetic acid (IDA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotris methyl phosphate (NTPO) and uses those selected from these salts. Preferably, triethanolamine is optimal.
本発明のリチウム試薬組成物は、微生物による劣化を防ぐために防腐剤を包含しても良い。防腐剤は特に限定されず、例えばアジ化ナトリウム、Ｐrocline(登録商標)等を使用することができる。防腐剤の濃度も特に限定されず、アジ化ナトリウムを使用する場合、一般的に防腐剤として用いられる濃度、例えば反応溶液に対し０.１重量％程度でよい。もっとも、長期保存を目的とした製品とする場合は、防腐剤が処方されるのが普通である。 The lithium reagent composition of the present invention may include a preservative to prevent degradation by microorganisms. An antiseptic | preservative is not specifically limited, For example, sodium azide, Procline (trademark) etc. can be used. The concentration of the preservative is not particularly limited, and when sodium azide is used, it may be a concentration generally used as a preservative, for example, about 0.1% by weight with respect to the reaction solution. However, preservatives are usually prescribed for products intended for long-term storage.
また、リチウム試薬組成物の機能を長期保存可能にするために、本発明のリチウム試薬組成物の組成のうち、前記ｐＨ調節剤と、前記マスキング剤を第一試薬とし、
前記テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた構造式
Structural formula in which all hydrogen bonded to carbon of tetraphenylporphyrin is replaced with fluorine.
本発明の測定方法に使用するリチウム試薬組成物はテトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた前記構造式で表される化合物をキレート剤とし、水に混合し得る有機溶剤と、ｐＨ調節剤とを包含した水溶液であり、血清及び血漿試験試料のリチウムイオンと接触せしめることによって生成したリチウム錯体による色調の変化が出現するが、これに所定の光量の光を照射すると、更に、リチウムイオンとは未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンが鮮やかな緑色に変化し、一方、Ｆ２８ポルフィリンとリチウムイオンとの発色錯体は赤色のまま変化しない。その結果、リチウム濃度が０.０mＭから４.５mＭの範囲では鮮やかな緑色から黄色を経て赤へと呈色変化が生じることの発見を原理するもので、このときの明瞭な色調変化を目視による検出、又は比色計で簡便に検出し、血清及び血漿試験試料を混入した水溶液を被検体とすることを特徴とするリチウム測定方法である。
なお、目視によるリチウム測定方法によらず、リチウム試薬組成物によるリチウム錯体の吸光度、及びそのスペクトルを測定してもよく、同様に濃度既知のリチウム標準試料のそれを基準濃度として未知試料の定量値を算出することも可能で、特に、リチウム錯体の発色、及びそのスペクトルにおいて、波長550nm、或いはその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長としてその感度を測定し、又は、波長570nm、或いはその近傍の波長565nmから650nmの波長帯の感度を測定してリチウムの濃度を算出することも可能である。
The lithium reagent composition used in the measurement method of the present invention is an organic solvent that can be mixed with water using a compound represented by the above structural formula in which all hydrogen bonded to carbon of tetraphenylporphyrin is replaced with fluorine as a chelating agent. And an aqueous solution containing a pH adjuster, and a change in color due to the lithium complex produced by contacting with the lithium ions of the serum and plasma test sample appears, but when irradiated with a predetermined amount of light, Further, unreacted F28 tetraphenylporphyrin changes to bright green with lithium ions, while the colored complex of F28 porphyrin and lithium ions remains red. As a result, it is based on the discovery that a color change occurs from bright green to yellow through red when the lithium concentration is in the range of 0.0 mM to 4.5 mM. A lithium measurement method characterized in that an aqueous solution mixed with a serum and plasma test sample is detected or detected simply by a colorimeter and used as an analyte.
In addition, the absorbance of the lithium complex by the lithium reagent composition and its spectrum may be measured regardless of the visual lithium measurement method. Similarly, the quantitative value of the unknown sample using the standard concentration of the lithium standard sample of known concentration as the reference concentration. In particular, in the color development of the lithium complex and its spectrum, the sensitivity is measured using a wavelength band of 550 nm or a wavelength band of 530 nm to 560 nm in the vicinity thereof, or a wavelength of 570 nm, or It is also possible to calculate the lithium concentration by measuring the sensitivity in the vicinity of the wavelength band of 565 nm to 650 nm.
上記の先行技術の波長の測定方法では、血清及び血漿試験試料を前述したリチウム試薬組成物と接解し、リチウム錯体の発色、及びその吸光度、或いはそのスペクトルを測定して、そのスペクトルにおいて波長550nm、或いはその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長としてその感度を測定し、又は、波長570nm、或いはその近傍の波長565nmから650nmの波長帯の感度を測定してリチウムの定量値を算出することが好ましい。
上述した波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯はソーレー帯（波長400nmから500nmの極大吸収を生じる波長帯）を測光波長とした場合よりも検量線の直線性が良好であるので、簡単な比色計や分光光度計での濃度の演算が容易であり、色調が黄色から赤色に鮮やかに変化するので、目視による濃度レベル判定も可能である。従って、従来のリチウム濃度の測定には大型の専用機器を必要としていたが、携帯型比色計や汎用されている紫外可視分光光度計でリチウム濃度を計測することができ、ＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）キットとして構成することもできる。
In the above-described prior art wavelength measurement method, serum and plasma test samples are interpreted with the lithium reagent composition described above, and the color of the lithium complex and its absorbance, or its spectrum, are measured, and the wavelength in the spectrum is 550 nm. Measure the sensitivity using the wavelength range of 530 nm to 560 nm as the measurement wavelength, or measure the sensitivity of the wavelength range of 570 nm or 565 nm to 650 nm, and calculate the quantitative value of lithium. It is preferable to do.
The linearity of the calibration curve is better in the above-mentioned wavelength band of 550 nm or in the vicinity of the wavelength band of 530 nm to 560 nm than when the Soret band (wavelength band causing the maximum absorption of wavelengths from 400 nm to 500 nm) is set as the photometric wavelength. Therefore, it is easy to calculate the density with a simple colorimeter or spectrophotometer, and since the color tone changes vividly from yellow to red, it is possible to determine the density level visually. Therefore, the conventional lithium concentration measurement requires a large dedicated device, but the lithium concentration can be measured with a portable colorimeter or a widely used ultraviolet-visible spectrophotometer, and POCT (Point Of Care) Testing) can also be configured as a kit.
次に、実際に本発明に使用するリチウム試薬組成物の実施例１を説明する。
[ 実施例１(リチウム試薬組成試料１)]
本発明の使用するリチウム試薬組成物は、ｐＨ緩衝液としての第１試薬を作製し、発色試液として第２試薬を作製し、測定直前に両液を混合してリチウム試薬組成物を作製した。これは、両液を最初から作製しておいても良いが、長時間の保存により試薬が劣化することを避けるためである。
ここで、試薬組成物の作製方法を説明する。
先ず、主に、ｐＨ緩衝液としての第１試薬を作製するが、その組成は次のとおりである。
Next, Example 1 of the lithium reagent composition actually used in the present invention will be described.
[Example 1 (lithium reagent composition sample 1)]
In the lithium reagent composition used in the present invention, a first reagent as a pH buffer solution was prepared, a second reagent was prepared as a coloring reagent, and both solutions were mixed immediately before the measurement to prepare a lithium reagent composition. This is because both solutions may be prepared from the beginning, but the reagent is prevented from deteriorating due to long-term storage.
Here, a method for producing a reagent composition will be described.
First, a first reagent as a pH buffer solution is mainly prepared, and its composition is as follows.
[ 実施例1(リチウム試薬組成試料１）]
（１）第一試薬（安定剤・緩衝液として）
キレート剤：なし
有機溶剤：なし
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：
TritonX-100(登録商標)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル) １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン １０ ｍＭ
以上に、７重量％の塩化アンモニウムを加えてｐＨ１０に調節し精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
なお、TritonX-100(登録商標)(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)を１.０重量％としたが、少なすぎると測定時に希に濁りが発生したり、多すぎると、反応容器内で泡が発生したり、両因とも再現性に影響する可能性があるため０.１〜５.０重量％の範囲がよく、好ましくは、１.０ 重量％である。
また、マスキング剤はトリエタノールアミンを１０ｍＭ)としたが、少なすぎるとリチウムイオン以外の夾雑イオンが過剰に含まれた試料においてそのマスキング効果が低下したり、多すぎるとリチウムイオン自体をマスキングしてしまったり、測定誤差の原因になり得るため、１.０〜１００ｍＭの範囲が良く、好ましくは、１０ｍＭである
[Example 1 (lithium reagent composition sample 1)]
(1) First reagent (as stabilizer / buffer)
Chelating agent: None Organic solvent: None Stabilizer (dispersant: nonionic surfactant):
TritonX-100 (registered trademark)
(Polyoxyethylene octyl phenyl ether) 1.0% by weight
Masking agent:
In the above, 7% by weight of ammonium chloride was added to adjust the pH to 10, and 1 L with purified water was stored in a general-purpose storage container.
TritonX-100 (registered trademark) (polyoxyethylene octylphenyl ether) was adjusted to 1.0% by weight. However, if the amount is too small, turbidity is rarely generated at the time of measurement. Since it may occur or both factors may affect the reproducibility, the range of 0.1 to 5.0% by weight is good, and preferably 1.0% by weight.
The masking agent is triethanolamine (10 mM). However, if the amount is too small, the masking effect is reduced in a sample containing excessive impurities other than lithium ions, and if too large, the lithium ions themselves are masked. Since it may cause a measurement error, the range of 1.0 to 100 mM is good, preferably 10 mM.
次に、主に、発色試液としての第２試薬を作製するが、その組成は次のとおりである。
（２）第二試薬（発色試液として）
キレート剤：Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン ０.５ g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） ２０ 重量％
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100(登録商標)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル) １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン １０ｍＭ
これに、０.０５Ｍ(mol/L)になるようにＭＯＰＳ(Good緩衝剤)を加えｐＨ７.０に調節し、精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
Next, a second reagent is mainly prepared as a coloring reagent, and the composition thereof is as follows.
(2) Second reagent (as a color reagent)
Chelating agent: F28 tetraphenylporphyrin 0.5 g / L
Organic solvent: dimethyl sulfoxide (DMSO) 20% by weight
Stabilizer (dispersant: nonionic surfactant): TritonX-100 (registered trademark)
(Polyoxyethylene octyl phenyl ether) 1.0% by weight
Masking agent:
MOPS (Good buffer) was added to this so that it might become 0.05M (mol / L), it adjusted to pH 7.0, and it was made into 1L with purified water, and it stored in the general purpose storage container.
ところで、臨床検査での血清中のリチウム定量において、その濃度が広くは０.６ ｍＭ〜３ ｍＭの範囲での正確さが求められている。本発明の実施例１では、上記のリチウムの濃度範囲においては、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンの化合物の濃度を、０.１〜１.０g/Lとすれば、好ましくは、０.５g/Lとすれば正確に測定できることも見出した。
リチウム濃度が０.６ｍＭ〜３ｍＭの範囲では、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを最終的な試薬組成物での濃度を１Ｌ当たり０.１〜１.０g/Lの範囲で測定可能で、好ましくは０.５ g/Lが良い。少なすぎるとＦ２８テトラフェニルポルフィリンとリチウムイオンとの反応が十分に起こらず、多すぎると、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン由来のブランクの吸光度が増加してしまうといった不都合が生じるため、好ましくは０.５ g/Lである。
この点を、更に詳しく説明すると、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンとリチウムイオンはモル比で１：１のキレート錯体を形成する反応である。ここで、検体中のリチウム濃度が３ｍＭ含まれた検体を、本試薬組成物を用いた実施例１の条件で反応させる場合は、その反応系でのリチウム濃度は約０.０２ ｍＭとなる。従って、１:１で反応するＦ２８テトラフェニルポルフィリン濃度も反応系内で０.０２ｍＭ 以上存在していないと、検体中のリチウムを過不足なく反応させることができない。
By the way, in the determination of lithium in serum in clinical examination, the concentration is required to be accurate in the range of 0.6 mM to 3 mM. In Example 1 of the present invention, when the concentration of the compound of F28 tetraphenylporphyrin is 0.1 to 1.0 g / L in the above lithium concentration range, it is preferably 0.5 g / L. It was also found that it can be measured accurately.
When the lithium concentration is in the range of 0.6 mM to 3 mM, the concentration of F28 tetraphenylporphyrin in the final reagent composition can be measured in the range of 0.1 to 1.0 g / L, preferably 0.5. g / L is good. If the amount is too small, the reaction between F28 tetraphenylporphyrin and lithium ions does not occur sufficiently. If the amount is too large, the absorbance of the blank derived from F28 tetraphenylporphyrin increases, so 0.5 g / L.
This point will be described in more detail. In this reaction, F28 tetraphenylporphyrin and lithium ions form a chelate complex having a molar ratio of 1: 1. Here, when a sample containing 3 mM of the lithium concentration in the sample is reacted under the conditions of Example 1 using this reagent composition, the lithium concentration in the reaction system is about 0.02 mM. Therefore, if the concentration of F28 tetraphenylporphyrin that reacts 1: 1 is not more than 0.02 mM in the reaction system, lithium in the sample cannot be reacted without excess or deficiency.
一般に、キレート剤と金属イオンとの錯体形成反応（発色反応）は被反応物質（リチウム）に対して等倍〜１０倍のモル濃度のキレート剤（Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン）が必要とされており、図１のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの適量濃度の参考計算表の図に示すように、反応時のＦ２８テトラフェニルポルフィリンの濃度を等倍から１０倍となるように試薬組成物を構成することになるが、現実的に試薬組成物の添加量、検体量のいわゆる測定反応時の用量におけるパラメータは、その測光機種や目的とする閾値により若干の差があるため、その試薬組成物でのキレート剤濃度は等倍である０.１g/Lよりも５倍量である０.５g/Lの方がより広い測定条件に耐えうる。例えば、検体量の微量化技術が低い機種での測定の場合、検体量を実施例１のそれらに対して２倍〜５倍程度増量することが予想されるので、あらかじめ５倍量としての試薬組成物を０.５g/Lとしておけば不足はない。一方、キレート剤をモル比で１０倍以上仕込んでも発色反応に与える速度論的な有意性はなく、試薬ブランク値の増大が懸念されるのみであり、これを採用する利点はない。
以上のように、キレート剤とリチウムとの反応モル比の条件さえ達成できればよいので、例えば、第二試薬のキレート剤（Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン）の濃度を１.０ g/Lとした場合は反応時の第二試薬添加量を半量にすることができる。あるいは、その検体量を半減させた場合は同様にキレート剤濃度を半分量とすることもできる。
このように、本実施例１では、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンを０.５ g/Lとしたが、反応モル量を満たし、且つ試薬ブランク値を最小限にすることを考慮した結果、０.１〜１.０ g/Lの範囲が最適である。
In general, a complex formation reaction (coloring reaction) between a chelating agent and a metal ion requires a chelating agent (F28 tetraphenylporphyrin) having a molar concentration of 10 times to 10 times that of the substance to be reacted (lithium). As shown in the reference calculation table of the appropriate concentration of F28 tetraphenylporphyrin in FIG. 1, the reagent composition is configured so that the concentration of F28 tetraphenylporphyrin during the reaction is from 10 times to 10 times. In reality, the amount of reagent composition added and the amount of sample in the so-called measurement reaction dose parameters vary slightly depending on the photometric model and target threshold, so the chelating agent concentration in the reagent composition is A larger amount of 0.5 g / L can withstand a wider range of measurement conditions than 0.1 g / L of the same magnification. For example, in the case of measurement with a model having a small amount of sample, the amount of the sample is expected to be increased by about 2 to 5 times that of Example 1, so that the reagent as a 5-fold amount in advance is used. There is no shortage if the composition is 0.5 g / L. On the other hand, even if the chelating agent is charged in a molar ratio of 10 times or more, there is no kinetic significance given to the color development reaction, there is only a concern about an increase in the reagent blank value, and there is no advantage of adopting this.
As described above, it is only necessary to achieve the reaction molar ratio condition between the chelating agent and lithium. For example, when the concentration of the chelating agent (F28 tetraphenylporphyrin) of the second reagent is 1.0 g / L, the reaction is performed. The amount of the second reagent added at the time can be halved. Alternatively, when the amount of the sample is halved, the chelating agent concentration can be halved in the same manner.
As described above, in Example 1, F28 tetraphenylporphyrin was set to 0.5 g / L. As a result of considering that the reaction molar amount was satisfied and the reagent blank value was minimized, 0.1 to 0.1 was obtained. A range of 1.0 g / L is optimal.
また、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ）は５〜３０重量％としたが、少なすぎるとＦ２８テトラフェニルポルフィリンの溶液中での分散性が低下し、多すぎると試薬組成物中における有機溶媒の割合が増加してしまうため、好ましくは、２０ 重量％である。ただし、溶剤としてのＤＭＳＯ濃度を低減させたい場合は１０重量％以下としても全く差支えない。
ここで、本実施例１でのＦ２８テトラフェニルポルフィリンは、テトラフェニルポルフィリンの炭素に結合している水素を全部フッ素に置き換えた下記に示すような構造式である。
Here, F28 tetraphenylporphyrin in Example 1 has the following structural formula in which all hydrogen bonded to carbon of tetraphenylporphyrin is replaced with fluorine.
（３）上記の第一試薬と第二試薬を混合したリチウム試薬でのリチウム濃度既知試料を用いた検量線の作成を説明する。
実施例１では、試料６μLに第一試薬（緩衝液）７２０μL、第二試薬（発色試液）２４０μLを加えた。この場合に第一試薬はｐＨ１０における緩衝能があり、試験時の第一試薬、第二試薬、試料を混合した時の試験液のｐＨはほぼｐＨ＝１０となる。
このように、キレート剤としてＦ２８テトラフェニルポルフィリンを使用することにより、ｐＨ５〜１０の範囲で発色反応を達成することができるため、ｐＨ１２以下の強いｐＨ緩衝作用をもつリチウム測定試薬を構成するので、空気中のＣＯ2の吸収によるｐＨ変動を減らすことができ、結果として測定値への悪影響を回避することができる。また、これにより汎用の容器に保存可能となった。
なお、第一試薬と第二試薬は使用直前に同じ割合で混合し、混合液を試料に同様の容量で添加してもよく、この場合は、試料６μLに混合液９４０μLを加えて測定対象の試験液としてもよい。
(3) The preparation of a calibration curve using a lithium concentration known sample with a lithium reagent in which the first reagent and the second reagent are mixed will be described.
In Example 1, 720 μL of the first reagent (buffer solution) and 240 μL of the second reagent (coloring reagent) were added to 6 μL of the sample. In this case, the first reagent has a buffer capacity at
Thus, by using F28 tetraphenylporphyrin as a chelating agent, it is possible to achieve a color development reaction in the range of pH 5 to 10, so that it constitutes a lithium measuring reagent having a strong pH buffering action of pH 12 or less. PH fluctuations due to absorption of CO 2 in the air can be reduced, and as a result, adverse effects on measured values can be avoided. Moreover, it became possible to preserve | save in a general purpose container by this.
The first reagent and the second reagent may be mixed at the same ratio immediately before use, and the mixed solution may be added to the sample in the same volume. In this case, 940 μL of the mixed solution is added to 6 μL of the sample, A test solution may be used.
この混合試薬に試料を加えたｐＨ１０の試験液を、常温で１０分間反応後、紫外−可視分光光度計（日立U-3900形）を用いて試薬ブランクを対照として550nmの吸光度を測定した。その結果を図２のＬｉ濃度mg/dLと吸光度のグラフ、及び、図４のＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成における可視部のスペクトル変化のグラフである。
テトラフェニルポルフィリン金属錯体に典型的なソーレー帯（380nmから460nm近傍）と呼ばれる最大感度が得られる波長ではなく、血清検体中リチウム濃度範囲に対して最適な感度が得られる波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測光波長とすることにより、希釈操作、或いは希釈装置等の煩雑な操作、それに伴う付帯設備が不必要となる。
さらに、図３のＬｉ濃度mg/dLと吸光度のグラフ(光波長*405nm,×415nm,●550nm)に示すように、上述した波長550nm、或いは、その近傍の波長530nmから560nmの波長帯はソーレー帯を測光波長とした場合よりも検量線の直線性が良好であるので、簡単な比色計や分光光度計での濃度の演算が容易であり、色調が黄色から赤色に鮮やかに変化するので、目視による濃度レベル判定も可能である。従って、従来のリチウム濃度の測定には大型の専用機器を必要としていたが、本発明により携帯型比色計や汎用されている紫外可視分光光度計でリチウム濃度を計測することができ、ＰＯＣＴキットとして構成することもできる。
ただし、図３のグラフでは、波長●550nmは実施例１そのもの、ソーレー帯の測光波長である*405nm,×415nmは、実施例１と同様に第１試薬、第２試薬を添加したが、感度が高すぎるため、試料を５倍に希釈して測定反応を実施し、405nmと415nmの波長を使用した。図３のグラフから判るように、405nmと415nmの波長の検量線は直線にはならないが、本実施例の550nmを測光波長とした場合は、直線性が良好な検量線が得られる。
After reacting the test solution of
It is not the wavelength that gives the maximum sensitivity, which is the typical Soray band (near 380 nm to 460 nm) for tetraphenylporphyrin metal complexes, but the wavelength that gives the optimum sensitivity for the lithium concentration range in the serum sample, or its vicinity. By setting the wavelength range of 530 nm to 560 nm as the photometric wavelength, a diluting operation or a complicated operation such as a diluting device and accompanying equipment are not required.
Furthermore, as shown in the graph of Li concentration mg / dL and absorbance (light wavelength * 405 nm, × 415 nm, ● 550 nm) in FIG. 3, the above-mentioned wavelength band of 550 nm or a wavelength band of 530 nm to 560 nm in the vicinity thereof is Since the linearity of the calibration curve is better than when the band is the photometric wavelength, it is easy to calculate the density with a simple colorimeter or spectrophotometer, and the color tone changes vividly from yellow to red. Further, the density level can be determined visually. Therefore, the conventional lithium concentration measurement requires a large dedicated device, but according to the present invention, the lithium concentration can be measured with a portable colorimeter or a widely used ultraviolet-visible spectrophotometer. It can also be configured as.
However, in the graph of FIG. 3, the wavelength ● 550 nm is Example 1 itself, and the photometry wavelengths of the Soray band are * 405 nm and × 415 nm, the first reagent and the second reagent are added as in Example 1, but the sensitivity is Was too high, the sample was diluted 5 times and the measurement reaction was carried out using wavelengths of 405 nm and 415 nm. As can be seen from the graph of FIG. 3, calibration curves with wavelengths of 405 nm and 415 nm are not straight lines, but when 550 nm in this example is used as a photometric wavelength, a calibration curve with good linearity can be obtained.
また、図４に示すＦ２８テトラフェニルポルフィリン−リチウム錯体生成のスペクトル変化のグラフのように、リチウムの濃度０.６mg/dL、１.２mg/dL、１.８mg/dL、２.４mg/dL、３.０mg/dLと吸光度が直線的に増加していることが、かなり明瞭に確認できる。リチウム濃度に比例して、ポルフィリン-金属錯体に典型的な415nm（ソーレー帯）のピークと、図中に示される550nmの吸収ピークが増大し、570nmの吸収ピークが減少するので、いずれも測光波長として吸光度差を求めることが可能であるが、上述したように直線性が良好な検量線が得られることから550nmを測光波長とすることが好ましい。
もっとも、本実施例１では550nmの吸光度としたが、波長540nmから560nmの波長帯を測光範囲としても良い。これは、測定機器によっては550nmの測光フィルターがない場合があり、この場合はその近傍として感度が生じている540nmとか560nmとかを測光波長に設定すればよい。図４の実施例１でのリチウム濃度による吸光度のグラフに示すように、570nmの感度の減少もリチウム濃度に対して定量的なので、これも試薬ブランクを対照として吸光度差（ΔAbs）を求めることが可能で、測光波長として利用できる。
更に、稀に患者検体の試料によっては、波長550nmに干渉する夾雑物質が生じ、550nm波長ではデータに誤差を生じてしまう場合は、それを回避するため波長570nm、或いはその近傍の565nmから650nmの範囲から測光波長を選択し、感度の減少を吸光度差として用いてリチウム濃度を算出してもよい。
Further, as shown in the graph of the spectrum change of F28 tetraphenylporphyrin-lithium complex formation shown in FIG. 4, the lithium concentration is 0.6 mg / dL, 1.2 mg / dL, 1.8 mg / dL, 2.4 mg / dL, It can be confirmed fairly clearly that the absorbance increases linearly with 3.0 mg / dL. In proportion to the lithium concentration, the peak at 415 nm (Sorley band) typical for porphyrin-metal complexes and the absorption peak at 550 nm shown in the figure increase and the absorption peak at 570 nm decreases. As described above, it is preferable to set the photometric wavelength to 550 nm because a calibration curve with good linearity can be obtained as described above.
Of course, although the absorbance is 550 nm in the first embodiment, the wavelength range from 540 nm to 560 nm may be used as the photometric range. Depending on the measuring instrument, there may be no photometric filter of 550 nm. In this case, the photometric wavelength may be set to 540 nm or 560 nm where sensitivity is generated in the vicinity thereof. As shown in the graph of absorbance due to lithium concentration in Example 1 of FIG. 4, the decrease in sensitivity at 570 nm is also quantitative with respect to the lithium concentration. Therefore, the absorbance difference (ΔAbs) can also be obtained using the reagent blank as a control. It can be used as a photometric wavelength.
Furthermore, depending on the sample of the patient specimen, a contaminant that interferes with the wavelength of 550 nm is generated, and if the error occurs in the data at the wavelength of 550 nm, the wavelength of 570 nm, or in the vicinity of 565 nm to 650 nm, is avoided. The photometric wavelength may be selected from the range, and the lithium concentration may be calculated using the decrease in sensitivity as the absorbance difference.
また、上記のリチウム濃度測定方法による誤差の補正、及び修正方法の１つを説明する。
溶血している血清等の検体においては妨害因子としてヘモグロビン由来の540nm付近、560nmから650nm付近の二つの吸収ピーク（各々、βバンド、αバンド）が生じることが一般的に知られているが、このようなヘモグロビンを高濃度に含む検体と本発明の試薬組成物とを接解させた場合、本発明の測光波長である550nmとヘモグロビンのβ、αバンド由来の540nmの吸収が重複するため、実際の測定値に対して正の誤差が生じることが判った。
すなわち、（リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体由来の550nmの感度）＋（ヘモグロビン由来550nmの感度）＝ 550nmの測定感度（∴ヘモグロビン由来の正の誤差が生じる。）
ここで、本発明では、ヘモグロビンの550nmと600nmの二つの感度比がほぼ同一であることに注目した。即ち、ヘモグロビンの550nmの感度＝ヘモグロビンの600nmの感度であることに注目し、ヘモグロビンの550nmの感度を600nmの感度で相殺することができることに想到した。
したがって、550nmの感度 ＝ リチウム・F28テトラフェニルポルフィリン錯体の550nm感度 ＋ ヘモグロビンの550nm感度 − ヘモグロビンの600nm感度 とすれば、ヘモグロビン由来の550nmの感度を相殺して、より正しい550nmの感度を得ることができる。
In addition, one of error correction and correction methods by the above lithium concentration measurement method will be described.
In specimens such as hemolyzed serum, it is generally known that two absorption peaks (each β-band and α-band) occur around 540 nm and 560 to 650 nm derived from hemoglobin as interfering factors. When the specimen containing the hemoglobin at a high concentration and the reagent composition of the present invention are in contact with each other, the absorption of 540 nm derived from the
That is, (sensitivity of 550 nm derived from lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex) + (sensitivity of 550 nm derived from hemoglobin) = measurement sensitivity of 550 nm (positive error derived from ∴hemoglobin occurs)
Here, in the present invention, it was noted that the two sensitivity ratios of hemoglobin at 550 nm and 600 nm were almost the same. That is, it was noticed that the sensitivity of hemoglobin at 550 nm = the sensitivity of hemoglobin at 600 nm, and came up with the idea that the sensitivity of hemoglobin at 550 nm can be offset by the sensitivity of 600 nm.
Therefore, if the sensitivity of 550nm = 550nm sensitivity of lithium F28 tetraphenylporphyrin complex + 550nm sensitivity of hemoglobin-600nm sensitivity of hemoglobin, the sensitivity of 550nm derived from hemoglobin can be offset to obtain a more accurate sensitivity of 550nm. it can.
以下の実験結果から、本発明の実施例１のリチウム試薬でほぼ正確にリチウム濃度を測定できることを説明する。
[紫外-可視分光光度計（日立U-3900形）での実験結果]
図２のグラフは、紫外-可視分光光度計（日立U-3900形）での測定試験結果である。横軸Ｘに予め調剤した既知のリチウム濃度(Ｌi濃度mg/dL)、縦軸Ｙは紫外可視分光光度計による550nmの吸光度差をプロットし、直線回帰した結果である。
この図２のグラフから判ることは、得られた吸光度はリチウム濃度に比例し、直線性良好な検量線が描かれることである。
The following experimental results demonstrate that the lithium concentration can be measured almost accurately with the lithium reagent of Example 1 of the present invention.
[Experimental result of UV-visible spectrophotometer (Hitachi U-3900)]
The graph of FIG. 2 is a measurement test result with an ultraviolet-visible spectrophotometer (Hitachi U-3900 type). The abscissa X is a known lithium concentration (Li concentration mg / dL) prepared in advance, and the ordinate Y is a result of linear regression, plotting an absorbance difference at 550 nm by an ultraviolet-visible spectrophotometer.
It can be seen from the graph of FIG. 2 that the obtained absorbance is proportional to the lithium concentration, and a calibration curve with good linearity is drawn.
[血清を試料とした場合の原子吸光法（従来法）と本発明による方法との相関試験結果]
図５のグラフは、図２に説明した実施例１での測定法、同じ血清を試料とした従来の原子吸光法（従来法）でのリチウム濃度測定値との相関試験結果である。縦軸Ｙは本発明によるリチウム濃度測定値で、横軸Ｘは原子吸光法（従来法）によるリチウム濃度測定値であるが、図２に示す回帰線から両測定値は95％以上の良好な相関を示した。従って、同じ血清試料に対し本発明の試薬組成物による紫外−可視吸光光度定量法でも、正しく血清試料中のリチウムを定量できていることが示された。
[Results of correlation test between the method of the present invention and the atomic absorption method using serum as a sample]
The graph of FIG. 5 shows the results of a correlation test between the measurement method in Example 1 described in FIG. 2 and the measured value of lithium concentration in the conventional atomic absorption method (conventional method) using the same serum as a sample. The vertical axis Y is a measured value of lithium concentration according to the present invention, and the horizontal axis X is a measured value of lithium concentration by atomic absorption method (conventional method). From the regression line shown in FIG. Correlation was shown. Therefore, it was shown that lithium in the serum sample could be correctly quantified by the ultraviolet-visible spectrophotometric determination method using the reagent composition of the present invention for the same serum sample.
[管理血清を試料とした自動分析による測定値の比較]
リチウム濃度が値付けされた管理血清としてプレチノルムU(PrecinormU)(ロシュ製）、プレチパスU(PrecipathU)(ロシュ製）、パソノルムH(PathonormH)(SERO AS製）、オートノルム(Auto norm)(SERO AS製）を試料として生化学自動分析装置（日立H-7700形）にて546nm（550nmに近い波長で本機に実装されている波長）を測光波長として1ポイントエンド法により測定した。
（装置パラメータ）
試薬：0.24 mL
試料：0.005 mL
測光波長（主/副）：546 nm / 700 nm
測光時間：10 分
温度：37℃
1ポイントエンド・増加法
上記の設定条件での実験結果を図６の[表１]に示すが、本発明の実施例での測定値が、保証値に対して良好に一致しており、臨床検査用自動分析装置でも血清中リチウムを十分に測定できることが判る。
以上は、第一試薬と第二試薬を混合したリチウム試薬の２液型の実施例で説明したが、後述するマイクロプレートリーダーによるリチウム測定方法と、目視によるリチウム検出法においては、両者とも９６穴ウエルを試料容器として用いるため、実施例１を基本とした組成の１液型試料として、実施例２(リチウム試薬組成試料２)を調製して実験した。
なお、念のため実施例１のリチウム試薬組成試料１においても、被検体の分量を調製し、後述する実施例２と同じ目視によるリチウム検出方法を実験したが、白色光を照射すると、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（＝ mol/L）以下では緑色、０.５ meq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出でき、ほぼ同じ結果が得られた。詳細は実施例２と同じであるで説明は省略する。
[Comparison of measured values by automated analysis using control serum as a sample]
As control sera for which the lithium concentration was given, Precinorm U (Roche), Precipath U (Roche), Pasonorm H (SERO AS), Auto norm (SERO AS) Measured by a one-point end method using a biochemical automatic analyzer (Hitachi H-7700 type) as a photometric wavelength at 546 nm (wavelength mounted on this unit with a wavelength close to 550 nm).
(Device parameter)
Reagent: 0.24 mL
Sample: 0.005 mL
Photometric wavelength (main / sub): 546 nm / 700 nm
Metering time: 10 minutes Temperature: 37 ° C
1-point end / increase method
The experimental results under the above setting conditions are shown in [Table 1] in FIG. 6. The measured values in the examples of the present invention are in good agreement with the guaranteed values. It turns out that serum lithium can be measured sufficiently.
The above is described in the two-pack type embodiment of the lithium reagent in which the first reagent and the second reagent are mixed. However, in the lithium measurement method using a microplate reader described later and the visual lithium detection method, both are 96 holes. In order to use the well as a sample container, Example 2 (lithium reagent composition sample 2) was prepared and experimented as a one-component sample having a composition based on Example 1.
As a precaution, also in the lithium
[ 実施例２(リチウム試薬組成試料２）]
ここで、実施例２を説明するが、本実施例２の組成は実施例１と実質的に同じであるが、実施例２は、実施例１の２液型ではなく、発色液を１液型として構成しているが、これは以下の理由による。
マイクロプレートリーダー用の９６穴ウエルに分注する場合に、１液の場合では、試料と発色液のみの操作で容易に済むが、２液の場合では、試料、第１試薬、第２試薬の３種を容量の小さいウエル上で混合する操作が必要である。実施例１のような容量の大きな１mLサイズの分光光度計用のキュベット容器を使用する場合は、この操作は容易であるが、９６穴ウエルの場合はこの操作が煩雑になりやすいため、本実施例２では操作がより簡便な１液型を採用した。また、このときの試薬組成はウエルの材質であるポリスチレン樹脂に悪影響を与えないようにするため、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤を前述のように選択したものである。
図７の[表２]には、前述したように、リチウム濃度測定方法による誤差の補正、及び修正方法を採用し、実際にマイクロプレートリーダー（CORONA SH1200形）による、溶血における干渉試験の結果を示す。使用した試薬組成物、試験方法は以下の通りである。
[ 実施例２(リチウム試薬組成試料２）]
（１）発色試薬 （リチウム試薬組成物２）
キレート剤： Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン ０.１７g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド（DMSO） ５重量％
安定剤（分散剤）： ドデシル硫酸ナトリウム １ 重量％
Triton X-100 １重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン １０ g/L
エチレンジアミン四酢酸二カリウム ０.５ g/L
これに所定のｐＨ１０になるようにｐＨ緩衝剤、及びｐＨ調節剤を加え、精製水で1Lとして汎用の保存容器に保管した。
（２）試 料
１.５ mMのリチウムを含むベース血清に所定濃度の溶血ヘモグロビンとして干渉チェックＡ＋（登録商標, シスメックス製）を添加し、溶血試料を調製した。
上記の試料４μLに発色試薬２４０μLを加え、５分間反応させ、主波長550 nm、副波長600 nmとし、その吸光度をマイクロプレートリーダー（CORONA SH-1200形）で観測し標準物質の吸光度を基準にリチウム濃度を算出した。
上述したように、測光波長を550nmのみで測定した場合、溶血検体ではヘモグロビンの550nmが測定値に正の妨害を与えることから、補正方法として、550nmと600nmの二波長を測定し、550nm−600 nm として演算すると、互いに相殺され、溶血の影響がない。自動分析法の場合は、主波長550nm、副波長600 nmとパラメーターを入力すれば良い。
この図７の[表２]から判ることは、ヘモグロビンが１０００mg/dLでは、補正したものが１０２％と僅か２％の誤差であるものが、補正しないと１２５％と２５％の誤差が生じており、この本発明に開示したリチウム濃度測定方法の補正手段が極めて有効な補正方法である。
[Example 2 (lithium reagent composition sample 2)]
Here, Example 2 will be described. Although the composition of Example 2 is substantially the same as that of Example 1, Example 2 is not the two-component type of Example 1, but one color developing solution. Although it is configured as a mold, this is due to the following reasons.
When dispensing into a 96-well for a microplate reader, in the case of one solution, it is easy to operate with only the sample and the color developing solution, but in the case of two solutions, the sample, the first reagent, and the second reagent It is necessary to mix the three species on a small-capacity well. This operation is easy when using a 1 mL size spectrophotometer cuvette container having a large capacity as in Example 1, but in the case of a 96-well, this operation is likely to be complicated. In Example 2, a one-component type that is easier to operate was adopted. The reagent composition at this time is selected as described above for the surfactant and the pH buffering agent so as not to adversely affect the polystyrene resin which is the material of the well.
[Table 2] in FIG. 7 shows the results of the interference test in hemolysis using a microplate reader (CORONA SH1200 type) by using the error correction and correction methods by the lithium concentration measurement method as described above. Show. The reagent composition and test method used are as follows.
[Example 2 (lithium reagent composition sample 2)]
(1) Coloring reagent (Lithium reagent composition 2)
Chelating agent: F28 tetraphenylporphyrin 0.17 g / L
Organic solvent: Dimethyl sulfoxide (DMSO) 5% by weight
Stabilizer (dispersant):
Masking agent: Triethanolamine 10 g / L
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium 0.5 g / L
A pH buffering agent and a pH adjusting agent were added thereto so as to have a predetermined pH of 10, and 1 L of purified water was stored in a general-purpose storage container.
(2) Sample A hemolysis sample was prepared by adding interference check A + (registered trademark, manufactured by Sysmex) as hemolysis hemoglobin at a predetermined concentration to a base serum containing 1.5 mM lithium.
Add 240 μL of the coloring reagent to 4 μL of the above sample, react for 5 minutes, set the main wavelength to 550 nm and the subwavelength of 600 nm, observe the absorbance with a microplate reader (CORONA SH-1200 type), and use the absorbance of the standard as a reference The lithium concentration was calculated.
As described above, when the photometric wavelength is measured only at 550 nm, since 550 nm of hemoglobin gives a positive interference to the measured value in the hemolyzed sample, two wavelengths of 550 nm and 600 nm are measured as a correction method, and 550 nm-600 When calculated as nm, they cancel each other out and have no hemolysis effect. In the case of the automatic analysis method, the
It can be seen from [Table 2] in FIG. 7 that when the hemoglobin is 1000 mg / dL, the corrected value is 102%, which is an error of only 2%, but if it is not corrected, the error is 125% and 25%. Therefore, the correcting means of the lithium concentration measuring method disclosed in the present invention is a very effective correcting method.
[目視によるリチウム検出方法」
ここで、本発明の目視によるリチウム濃度の測定方法及び検査方法について説明する。
まず、本発明者らによる前掲の特許文献３に開示した先行技術である試験液を目視により観察した結果を図８の[表３]に示す。
前記リチウム試薬組成試料２を発色試薬として、試料４μLに発色試薬２４０μLを加え、５分間反応させ、常温で５分間反応後、その呈色を目視により観測した。試料は色調見本として所定濃度のリチウム標準液、濃度レベル別の管理血清を用いて比較した。
各、濃度域において黄色から赤へ呈色変化が確認され、管理血清の呈色は色調見本とも良い一致を示す。特別な装置を用いなくても迅速かつ簡便に血清中のリチウム濃度を判定できることが判る。
ただし、黄色から赤への呈色変化なので、管理域であるオートノルム１ｍＭの黄色、及び、危険域である模擬血清３.５ｍＭの赤色では、２５人による判定者の正解率は１００％であるが、準中毒域のパソノルムＨの１.６ｍＭ、及び、中毒域のプレチノルムＵの２.５ｍＭでの正解率は５２％と若干劣る。
[Visual lithium detection method]
Here, the visual measurement method and inspection method of the lithium concentration of the present invention will be described.
First, Table 3 in FIG. 8 shows the result of visual observation of the test solution which is the prior art disclosed in the above-mentioned
Using the lithium
In each concentration range, a color change from yellow to red was confirmed, and the color of the control serum was in good agreement with the color sample. It can be seen that the lithium concentration in serum can be determined quickly and easily without using a special apparatus.
However, since the color changes from yellow to red, the accuracy rate of 25 judges is 100% for yellow with an autonomic of 1 mM and red with a simulated serum of 3.5 mM that is a dangerous area. However, the correct answer rate at 1.6 mM of Pasonorm H in the quasi-addictive zone and 2.5 mM of pletinorum U in the addictive zone is slightly inferior to 52%.
そこで、本発明者らは、改良を重ねて本発明に想到した。
この発明の実施例は、前記先行技術で得た被検体（：試薬組成物と試料を混合した測定検体）に所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、リチウムイオンと未反応のF28テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体として構造異性体に変化せしめ、この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ meq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに都合よく合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出できることを見出した。
Therefore, the present inventors have come up with the present invention through repeated improvements.
In an embodiment of the present invention, the specimen obtained by the above-described prior art (: a measurement specimen obtained by mixing a reagent composition and a sample) is irradiated with white light having a predetermined luminance or exposed to light so that it does not react with lithium ions. Only F28 tetraphenylporphyrin is converted into a structural isomer as a photochemical tautomer. As a result, when the lithium concentration in the specimen is 0.5 mEq / L (= mol / L) or less, green, 0.5 meq From / L to 1.5 mEq / L, yellow, and above 1.5 mEq / L, red. It has been found that this color change is conveniently matched to the threshold level in the management area and the poisoning area, and can be clearly detected visually or by a colorimeter.
本発明の目視検出により試験液中のリチウム濃度レベルを判定した結果を図９の[表４]に示す。この試験結果は、管理域であるオートノルム１ｍＭの緑色、及び、危険域である模擬血清３.５ｍＭの赤色では、２５人による判定者の正解率は１００％であり、準中毒域のパソノルムＨの１.６ｍＭ、及び、中毒域のプレチノルムＵの２.５ｍＭでの正解率は９６％と良好であった。
つまり、リチウムと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみが白色光の照射により光化学互変異体が生成し緑色に変色するが、リチウム濃度が４.３ｍＭの場合は、Ｆ２８テトラフェニルポルフィリンのほとんどがリチウムイオンと反応したため、未反応化学種(生成する光化学互変異体）は僅かであり、赤色のままである。その中間のリチウムの濃度では、同様の原理で緑と赤の中間色として黄色を呈する。
このように、目視や比色計においては、呈色濃淡による濃淡検出は一般的であるが、色調自体が緑色から黄色、橙色、赤色に変化し、この色調を明瞭に検出できることは、極めて希で高性能である。
The results of determining the lithium concentration level in the test solution by visual detection according to the present invention are shown in Table 4 in FIG. This test result shows that the accuracy rate of the judge by 25 people is 100% in the autonomic 1mM green color in the control area and the mock serum 3.5mM red color in the danger area, and the quasi-addictive area Pasonorm H The correct answer rate at 1.6 mM and 2.5 mM of toxic pretinorum U was as good as 96%.
In other words, only the unreacted F28 tetraphenylporphyrin with lithium generates a photochemical tautomer upon white light irradiation and turns green. However, when the lithium concentration is 4.3 mM, most of the F28 tetraphenylporphyrin is lithium ion. The unreacted species (generated photochemical tautomers) are few and remain red. At the intermediate lithium concentration, yellow is exhibited as an intermediate color between green and red by the same principle.
In this way, in visual observation and colorimeters, it is common to detect shades by color shades, but it is extremely rare that the color tone itself changes from green to yellow, orange, red, and this color tone can be detected clearly. And high performance.
この方法を、試料調製から詳細に説明すると、図１０は、透明容器に入れた被検体を所定の輝度の白色光を照射、または露光させることにより、リチウムイオンと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化させる装置の概略図である。
図１０の被検液の照射装置において、実施例２のリチウム試薬組成試料２は前述の実施例１とほぼ同じ試薬組成物を調製し、これを分光用キュベットの透明容器の反応部１に１ｍＬを添加し、ＬＥＤ光源２により白色光を当て、図１１に示すように、光異性化反応が完了するまでに要する時間（：反応完結時間）を測定した。
ＬＥＤ光源の強さは分光キュベットの近位に設置された照度計により測定し、光異性化反応の終点（：反応完結時間）については電子吸収スペクトルの測定における400nmから600nm（：反応前のスペクトル）が、600nmから800nm（：光異性化後のスペクトル）の波長帯へのスペクトルシフトを観測することで決定した。
This method will be described in detail from sample preparation. FIG. 10 shows only an unreacted F28 tetraphenylporphyrin that is unreacted with lithium ions by irradiating a white light of a predetermined luminance or exposing a specimen placed in a transparent container. It is the schematic of the apparatus which changes into a structural isomer as a photochemical tautomer.
In the test liquid irradiation apparatus of FIG. 10, the lithium
The intensity of the LED light source is measured with a luminometer installed in the vicinity of the spectroscopic cuvette, and the end point of the photoisomerization reaction (: reaction completion time) is 400 nm to 600 nm (: spectrum before reaction) in the measurement of the electronic absorption spectrum. ) Was determined by observing a spectral shift from a wavelength band of 600 nm to 800 nm (a spectrum after photoisomerization).
この結果を図１０に示すが、４２０ルクスの照度においては反応に３分程度を要するが、１４３０ルクス以上の照度においては４０秒以内に光異性化が完了することが判った。一般的なオフィス、病院の診察室、検査室の照度は３００ルクスから７５０ルクスであることから、特殊な光源がなくても、通常の施設における通常の室内照明下で迅速に本発明の測定方法を適用することが可能であることが判る。
さらに、より速やかに反応を完結させる場合として、１４３０ルクス以上の照度を得るにはＬＥＤ光源との距離を被検液に近接させる程度でも十分に達することが可能である。
このようにして、光異性化反応に要する時間、即ち色相変化（光異性化）に要する時間における、光源の定量的指標である照度（Lux）が与える影響を検討したのが図１１のグラフである。
なお、図１０で光源部２の反応部２(透明容器)への照射角度θを任意としているのは、容器が透明であれば光が容器自体を経て透過でき、その透過光が被検体まで達することができるので、照射角度θ自体があまり影響しないことや、また、反応完了時間が次の図１１に示すように、例えば５００ルクスでも１５０secと比較的短時間でも、速やかに光化学互変異性体としての構造異性体に変換させることが可能である特徴を有するからである。また、この光化学互変異性体は暗闇に放置すると緩やかな時間を経てもとの状態に戻る。
This result is shown in FIG. 10. It was found that the reaction required about 3 minutes at an illuminance of 420 lux, but photoisomerization was completed within 40 seconds at an illuminance of 1430 lux or more. Since the illuminance of a general office, hospital examination room, and examination room is 300 lux to 750 lux, the measurement method of the present invention can be quickly performed under ordinary room lighting in a normal facility without a special light source. It can be seen that it is possible to apply.
Furthermore, as a case where the reaction is completed more quickly, it is possible to reach a sufficient distance even if the distance from the LED light source is close to the test solution in order to obtain an illuminance of 1430 lux or more.
FIG. 11 is a graph showing the effect of illuminance (Lux), which is a quantitative index of the light source, on the time required for the photoisomerization reaction, that is, the time required for hue change (photoisomerization). is there.
In FIG. 10, the irradiation angle θ to the reaction unit 2 (transparent container) of the
図１０の被検液の照射装置では、リチウムイオンと未反応のＦ２８テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめ、この結果、図１２に示すように、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色に変化した。これを図１０のグラフに示して説明するが、照射前の波長に対する４００nmから８００nmの可視光線範囲での吸収スペクトルは実線であるが、上記の白色光を３分程度照射すると破線の吸収スペクトルに変化した。この変化を目視により観測すると各々、黄橙色から緑色に変化した。
また、図１３の拡大図に示すように、リチウムイオン濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下での５００nmから６００nmの可視光線範囲での吸収スペクトルは太い破線に変わるが、１.５ mEq/L以上での吸収スペクトルは細かい点線で示され、目視により観測すると赤色である。
この原理により管理血清中のリチウム濃度を目視判定された結果が、図８の[表３]であるが、簡便且つ迅速な目視検出より、被検体中のリチウム濃度を明瞭に判定することができる。
In the test solution irradiation apparatus of FIG. 10, only lithium ions and unreacted F28 tetraphenylporphyrin are changed into structural isomers as photochemical tautomers, and as a result, as shown in FIG. When the lithium concentration was less than 0.5 mEq / L (= mol / L), the color changed to green. This will be described with reference to the graph of FIG. 10. The absorption spectrum in the visible light range of 400 nm to 800 nm with respect to the wavelength before irradiation is a solid line, but when the above white light is irradiated for about 3 minutes, the absorption spectrum indicated by the broken line is obtained. changed. When this change was observed visually, each changed from yellow-orange to green.
As shown in the enlarged view of FIG. 13, the absorption spectrum in the visible light range of 500 nm to 600 nm below 0.5 mEq / L (= mol / L) is changed to a thick broken line at the lithium ion concentration. The absorption spectrum at 1.5 mEq / L or more is indicated by a fine dotted line, and is red when observed visually.
The result of the visual determination of the lithium concentration in the control serum based on this principle is shown in [Table 3] in FIG. 8, but the lithium concentration in the subject can be clearly determined by simple and quick visual detection. .
ここで、本発明の使用するリチウム試薬組成物としては実施例１及び実施例２を説明したが、これは特許文献３で開示されるものあり、以下に示す実施例３でも前述した実施例１や実施例２と同様の結果が得られ、被検体の色の濃淡や色調を目視することにより、被検体中のリチウム濃度が測定できることを追試によって確認した。
[ 実施例３(リチウム試薬組成試料３）]
（１）第一試薬（安定剤・緩衝液として）
キレート剤：なし
有機溶剤：なし
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100(商標登録)
(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル) １.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン １０ｍＭ
以上に、０.１ＭとなるようにMOPSを加えてｐＨ８に調節し精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
Here, although Example 1 and Example 2 were demonstrated as a lithium reagent composition used for this invention, this is disclosed by
[Example 3 (lithium reagent composition sample 3)]
(1) First reagent (as stabilizer / buffer)
Chelating agent: None Organic solvent: None Stabilizer (dispersing agent: nonionic surfactant): TritonX-100 (registered trademark)
(Polyoxyethylene octyl phenyl ether) 1.0% by weight
Masking agent:
Above, MOPS was added so that it might become 0.1M, it adjusted to pH8, and it was stored in the general purpose storage container as 1L with purified water.
（２）第二試薬（発色試液として）
キレート剤：Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン ０.５ g/L
有機溶剤：ジメチルスルホキシド(DMSO） ２０ 重量％
安定剤(分散剤：非イオン性界面活性剤）：TritonX-100
(登録商標)(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル)１.０ 重量％
マスキング剤：トリエタノールアミン １０ ｍＭ
これに、０.０５ＭになるようにＭＯＰＳ（緩衝剤）を加え、ｐＨ７.０に調節し、精製水で１Lとして汎用の保存容器に保管した。
(2) Second reagent (as a color reagent)
Chelating agent: F28 tetraphenylporphyrin 0.5 g / L
Organic solvent: dimethyl sulfoxide (DMSO) 20% by weight
Stabilizer (dispersing agent: nonionic surfactant): TritonX-100
(Registered trademark) (polyoxyethylene octylphenyl ether) 1.0 wt%
Masking agent:
To this, MOPS (buffering agent) was added so as to be 0.05 M, adjusted to pH 7.0, and stored in a general-purpose storage container as 1 L with purified water.
リチウム濃度の測定には、実施例１と同様に試料 ６μLに第一試薬（緩衝液）７２０ μL、第二試薬（発色試液）２４０μLを加えて、所定時間、発色反応させた。
ここで実施例１や実施例２と同様に、前記チウム試薬組成物に被検体を混合して、所定の輝度の白色光で照射、または露光させることにより、リチウムと未反応のF28テトラフェニルポルフィリンのみを光化学互変異性体としての構造異性体に変化せしめ、この結果、被検体中のリチウム濃度において、０.５ mEq/L（= mol/L）以下では緑色、０.５ mEq/Lから１.５ mEq/Lでは黄色、１.５ mEq/L以上では赤色を呈した。この呈色変化は管理域、中毒域における閾値レベルに合致しており、目視又は比色計により明瞭に検出できた。勿論、実施例１と実施例２の関係と同様に、１液型としてもよい。
For the measurement of the lithium concentration, 720 μL of the first reagent (buffer solution) and 240 μL of the second reagent (coloring reagent) were added to 6 μL of the sample in the same manner as in Example 1, and the color reaction was carried out for a predetermined time.
Here, in the same manner as in Example 1 and Example 2, an analyte is mixed with the above-mentioned thiium reagent composition, and irradiated with white light having a predetermined luminance or exposed to light, so that F28 tetraphenylporphyrin unreacted with lithium is exposed. Is changed to a structural isomer as a photochemical tautomer. As a result, when the lithium concentration in the specimen is 0.5 mEq / L (= mol / L) or less, green, from 0.5 mEq / L The color was yellow at 1.5 mEq / L and red at 1.5 mEq / L or higher. This color change coincided with the threshold level in the management area and the poisoning area, and could be clearly detected visually or by a colorimeter. Of course, as in the relationship between the first embodiment and the second embodiment, a one-pack type may be used.
以上、本発明の各実施例では、被検体は血清試験試料で説明したが、これ以外の被検体として尿、血液、血漿試験試料を含む生体試料でもよく、勿論、工業用水、飲料水、環境試料等でも良く、水溶液中のリチウム濃度を、補正又は修正してより正確な550nmの感度、即ち、血清試験試料中のリチウム濃度を検出することができるものである。。 As described above, in each of the embodiments of the present invention, the subject is described as a serum test sample. However, other samples may be biological samples including urine, blood, and plasma test samples, and of course, industrial water, drinking water, and environment. A sample or the like may be used, and the lithium concentration in the aqueous solution can be corrected or corrected to detect a more accurate sensitivity at 550 nm, that is, the lithium concentration in the serum test sample. .
Claims (1)
前記リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体のスペクトルの波長550nm又はその近傍の波長530nmから560nmの波長帯を測定波長とし、別途ヘモグロビンの600nmの感度を測定して、測定波長に含まれるヘモグロビンの550nmの感度を600nmの感度で相殺するように次の算出式を用い、
(算出式）550nmの感度＝リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体の550nm感度 ＋ ヘモグロビンの550nm感度 − ヘモグロビンの600nm感度、
リチウム・Ｆ２８テトラフェニルポルフィリン錯体の本来の550nm感度を算出するようにしたことを特徴とするリチウムイオン測定方法。 Structural formula in which all hydrogen bonded to carbon of tetraphenylporphyrin is replaced with fluorine.
The wavelength of 550 nm of the spectrum of the lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex or a wavelength band of 530 nm to 560 nm in the vicinity thereof is used as a measurement wavelength, and the sensitivity of 600 nm of hemoglobin is separately measured, and the sensitivity of 550 nm of hemoglobin included in the measurement wavelength Using the following formula to cancel out with a sensitivity of 600 nm,
(Calculation formula) Sensitivity at 550 nm = 550 nm sensitivity of lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex + 550 nm sensitivity of hemoglobin−600 nm sensitivity of hemoglobin,
A method for measuring lithium ions, wherein the original 550 nm sensitivity of a lithium / F28 tetraphenylporphyrin complex is calculated.
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