JP6010848B2 - Stress evaluation method, stress evaluation marker, stress load model animal creation method, and stress load model animal - Google Patents
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Description
本発明は、新規なストレスの評価方法に関する。また、本発明は、新規なストレス評価マーカーに関する。さらに、本発明は、ストレス負荷動物モデルの作成方法およびその方法により作成されるストレス負荷動物モデル等にも関する。 The present invention relates to a novel stress evaluation method. The present invention also relates to a novel stress evaluation marker. Furthermore, the present invention relates to a method for creating a stress-loaded animal model, a stress-loaded animal model created by the method, and the like.
現代社会では、将来への不安、職場や学校の人間関係、生活環境や騒音、家庭内の不和や子育てへの不安等の精神的なストレス負荷により自律神経系の失調をきたし、うつ病に代表される様々な精神疾患に至ることがある。これら精神疾患の発症には、ストレスが非常に重要な危険因子であると考えられている。近年、精神疾患の患者数が世界的に増加傾向にあり、社会的に大きな問題になっている。特にうつ病は生涯罹患率が１０％前後の頻度の高い疾患であり、その頻度は今後さらに増加することが予想される。この疾患は、患者に対して社会生活に甚大な支障をきたすばかりか、自殺に結びつくことも少なくない重大な疾患である。
これらの問題を解決するためにも、ヒトや動物のストレスおよび精神疾患を的確に診断・評価し、すみやかに治療する体制を確立することは、国民生活の向上に必須であり、社会全体の急務である。
In modern society, anxiety of the autonomic nervous system due to mental stress such as anxiety about the future, human relations at work and school, living environment and noise, family discomfort and anxiety about child rearing, and depression It can lead to various psychiatric disorders represented. Stress is considered a very important risk factor for the development of these mental disorders. In recent years, the number of patients with mental illness has been increasing worldwide, which has become a major social problem. In particular, depression is a frequent disease with a lifetime prevalence of around 10%, and the frequency is expected to increase further in the future. This disease is a serious disease that not only greatly affects the social life of patients but also often leads to suicide.
In order to solve these problems, the establishment of a system that accurately diagnoses and evaluates human and animal stress and mental illnesses and promptly treats them is essential for improving the lives of the people. It is.
精神疾患の一種であるうつ病の主な症状は、抑うつ気分、意欲低下、興味と喜びの喪失、集中力と注意力の減退、自己評価と自信の低下、罪責感と無価値感、将来への悲観、自殺念慮、睡眠障害、食欲不振などである。これらの症状には特有の特徴があり、単なる気分の落ち込みとは異なる。うつ病の症状を把握するためには、詳しく病歴を聴取し、心理行動面に表れる症状がいつからどのように出現し、社会生活や家庭生活の上でどのような支障が生じているのかを聞きとり、受診時の患者の態度や会話内容などから、諸症状を確認することが主体となる。これらを的確に把握するためには、十分に熟練した精神科専門医による長時間の問診が必要となる。得られた所見を、世界保健機構（ＷＨＯ）やアメリカ精神医学会による診断基準と照合し、診断を確定することが一般的である。
上述した従来の診断方法の大きな問題点は、診断に熟練した技能を要することである。うつ病に関する十分な知識と経験が必要であることはいうまでもないが、うつ病には該当しなくともうつ状態を呈する心理的、精神科的および身体的状態は数多い。それらとの鑑別診断も必須となる。したがって、診断には十分な研修を積んだ精神科専門医師があたらねばならない。しかし、うつ病患者は、最初に体調不良を訴え、プライマリーケア医師、特に内科医を受診することが多い。精神科的な診察に習熟していない一般医師にとって、客観的検査所見のないうつ病の診断は必ずしも容易ではない。
The main symptoms of depression, a type of mental illness, are depressed mood, reduced motivation, loss of interest and joy, reduced concentration and attention, self-evaluation and reduced confidence, guilt and worthlessness, to the future Pessimism, suicidal ideation, sleep disorder, loss of appetite. These symptoms have unique characteristics that are different from simple depression. In order to understand the symptoms of depression, we will take a detailed medical history and ask how and when symptoms appearing in psychological behavior appear and what kind of problems are occurring in social and family life. However, it is mainly to check various symptoms from the patient's attitude at the time of consultation and the content of conversation. In order to grasp these accurately, a long-term inquiry by a sufficiently skilled psychiatrist is necessary. It is common to confirm the diagnosis by collating the obtained findings with diagnostic criteria from the World Health Organization (WHO) or the American Psychiatric Association.
A major problem with the above-described conventional diagnostic method is that it requires skill in diagnosis. Needless to say, sufficient knowledge and experience about depression is necessary, but there are many psychological, psychiatric and physical conditions that can cause depression if it does not fall into depression. Differential diagnosis with them is also essential. Therefore, there must be a psychiatrist with sufficient training for diagnosis. However, depressed patients often complain of poor physical condition and often visit primary care physicians, especially physicians. Diagnosis of depression without objective test findings is not always easy for general doctors who are not familiar with psychiatric examinations.
客観的な指標を目指して、これまでにもいくつかのストレスおよび精神疾患等の検査方法が試みられている。
例えば、２０年ほど前に、一連のストレス評価の研究で対象となった生理指標は、瞬目、血圧、心拍変動、呼吸、発汗等であったが、これらの研究はストレス関連成分を直接計測することを狙ったため、複雑な要因で生じるストレスを的確に評価できる方法には至らなかった。その後、ストレス状態を評価する、精神疾患を診断あるいは評価するいくつかの方法として、例えば、体液中のクロモグラミンの濃度を定量する方法（特許文献１）、副腎又は下垂体における一酸化窒素合成酵素の活性を測定する方法（特許文献２）、唾液における副腎性性ホルモン又はその代謝物の濃度を指標にする方法（特許文献３）、グルタチオン付加ヘモグロビン量を測定する方法（特許文献４）、唾液中のコルチゾール濃度を測定する方法（特許文献５）、モノアミン類の濃度変化率を測定する方法（特許文献６）などが挙げられる。
Aiming at an objective index, some testing methods for stress and mental illness have been tried so far.
For example, about 20 years ago, the physiological indices that were the subject of a series of stress assessment studies were blink, blood pressure, heart rate variability, breathing, sweating, etc. These studies directly measured stress-related components. As a result, it has not been possible to accurately evaluate the stress caused by complicated factors. Thereafter, as a method for evaluating stress state, diagnosing or evaluating mental illness, for example, a method for quantifying the concentration of chromogramin in body fluid (Patent Document 1), nitric oxide synthase in the adrenal gland or pituitary gland (Patent document 2), method of measuring the concentration of adrenal sex hormone or its metabolite in saliva as an index (patent document 3), method of measuring glutathione-added hemoglobin amount (patent document 4), saliva Examples thereof include a method for measuring the concentration of cortisol (Patent Document 5) and a method for measuring the concentration change rate of monoamines (Patent Document 6).
しかしながら、上記検査方法の何れも、対象者のストレス疲労状態、ストレス刺激の種類等は個人差が大きく、「ストレス評価は簡便な方法かつ高精度で、個人的に持続して行うべきである」という課題が残された。
一方、うつ病においても、脳内のモノアミン系の機能的変調があり、その変調は心身相関作用を通して、神経内分泌系、神経免疫系、自律神経系に少なからぬ影響を及ぼしていることが知られている。また、最近では、脳血流や脳内モノアミン受容体の変化なども指摘されているが、いずれも感度や再現性に問題が残る。また、従来の検査は、施行と評価には膨大な時間と労力が必要であり、簡便性という観点をも考慮すると、日常診療への応用はとうてい望むことが出来ないのが現状である。
However, in any of the above inspection methods, the subject's stress fatigue state, the type of stress stimulation, etc. vary greatly from person to person, and “stress evaluation should be performed in a simple manner with high accuracy and personally sustained” The problem was left.
In depression, on the other hand, there is a functional modulation of monoamines in the brain, and this modulation is known to have a considerable impact on the neuroendocrine, neuroimmune, and autonomic nervous systems through psychosomatic correlation. ing. Recently, changes in cerebral blood flow and monoamine receptors in the brain have been pointed out, but problems remain in sensitivity and reproducibility. In addition, conventional examinations require enormous time and labor to perform and evaluate, and in view of simplicity, it is difficult to hope for application to daily medical care.
本発明者らは、上記課題を解決するために、白血球中の特定の遺伝子の発現量を定量することによって、新規なストレスの評価方法を提供することができることを見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above problems, the present inventors have found that a novel stress evaluation method can be provided by quantifying the expression level of a specific gene in leukocytes, and have completed the present invention.
本発明は、以下のとおりである。
［１］
遺伝子の発現量を指標として用い、該遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、Mogat2、Alpl、Csf1、Klra2、Cdr2、Kcnq2、Prp15、Clec4e、Dusp13、Gpr77、Znf532、Oas1k、Per2、Upp1、Oas1a、Pth、Lrg1、Dnase2b、Vegfa、Hdc、Egr1、Clec4d、Alox5、Car2、Il1r2、Il8rb、Pla2g7、Dgat2、Mcpt10、Mcpt8、Mcpt8l2、Mcpt8l3、S100a9、Rab32、Emb、Fetub、Scgb3a1、Nlrp3、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、TC603221、RGD1565432、RGD1565374、RGD1565161、RGD1565983、RGD1310507、LOC690116、LOC691993、LOC689064、CF109441、A_64_P154430、A_64_P138390、A_64_P050137、ENSRNOT00000035459、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、Hbb、およびHba-a2からなる群から選択される少なくとも１種である、ストレスの評価方法
［２］
前記遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、およびHbbからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］に記載のストレスの評価方法。
［３］
前記遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、Tspan8、Mmp9からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載のストレスの評価方法。
［４］
前記遺伝子が、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Hba-a2、Hbb、およびAlas2の８種の遺伝子からなる群から選択される、［１］に記載のストレスの評価方法。
［５］
２種以上の前記遺伝子を指標として用いる、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のストレスの評価方法。
［６］
Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、Mogat2、Alpl、Csf1、Klra2、Cdr2、Kcnq2、Prp15、Clec4e、Dusp13、Gpr77、Znf532、Oas1k、Per2、Upp1、Oas1a、Pth、Lrg1、Dnase2b、Vegfa、Hdc、Egr1、Clec4d、Alox5、Car2、Il1r2、Il8rb、Pla2g7、Dgat2、Mcpt10、Mcpt8、Mcpt8l2、Mcpt8l3、S100a9、Rab32、Emb、Fetub、Scgb3a1、Nlrp3、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、TC603221、RGD1565432、RGD1565374、RGD1565161、RGD1565983、RGD1310507、LOC690116、LOC691993、LOC689064、CF109441、A_64_P154430、A_64_P138390、A_64_P050137、ENSRNOT00000035459、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、Hbb、およびHba-a2かからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含有する、ストレス評価マーカー。
［７］
前記遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、およびHbbからなる群から選択される少なくとも１種である、［６］に記載のストレス評価マーカー。
［８］
前記遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、Tspan8、Mmp9からなる群から選択される少なくとも１種である、［６］又は［７］に記載のストレス評価マーカー。
［９］
前記遺伝子が、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Hba-a2、Hbb、およびAlas2の８種の遺伝子からなる群から選択される、［６］に記載のストレス評価マーカー。
［１０］
２種以上の前記遺伝子を含有する、［６］〜［９］のいずれか１項に記載のストレス評価マーカー。
［１１］
少なくともTspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Hba-a2、Hbb、およびAlas2の８種の遺伝子を含有する、［６］〜［１０］のいずれか１項に記載のストレス評価マーカー。
［１２］
床敷飼育した後に、金網飼育することによる、ストレス負荷モデル動物の作成方法。
［１３］
床敷飼育を５日間以上行う、［１２］に記載の作成方法。
［１４］
金網飼育を５日間以上行う、［１２］又は［１３］に記載の作成方法。
［１５］
モデル動物が、げっ歯類である、［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の作成方法。
［１６］
モデル動物が、ラット又はマウスである、［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の作成方法。
［１７］
［１２］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法により作成される、ストレス負荷モデル動物。
The present invention is as follows.
[1]
The gene expression level is used as an index, and the genes are Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc432 , Slc4a1, Wfdc15b, Plekhb1, Cd52, Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, FechB, rp1 , Alpl, Csf1, Klra2, Cdr2, Kcnq2, Prp15, Clec4e, Dusp13, Gpr77, Znf532, Oas1k, Per2, Upp1, Oas1a, Pth, Lrg1, Dnase2b, Vegfa, Hdc, Egr1, Rec1r2, Clec4d, Aloxl , Pla2g7, Dgat2, Mcpt10, Mcpt8, Mcpt8l2, Mcpt8l3, S100a9, Rab32, Emb, Fetub, Scgb3a1, Nlrp3, TC646750, ENSRNOT00000065312, ENSRNOT00000040211, ENSRNOT00000056434, RGD1311874MG, 543 , RGD1310507, LOC690116, LOC691993, LOC689064, CF109441, A_64_P154430, A_64_P13839 0, A_64_P050137, ENSRNOT00000035459, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, Hbb, and at least one selected from the group consisting of Hba-a2, stress evaluation method [2]
The genes are Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, Rsad2, Slcbb, Rsad2, Slc4, Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, Fech, Bpgm, Nlrp12, Csf3r, Osgin1, 000000646D, 000000 The stress evaluation method according to [1], which is at least one selected from the group consisting of MGC72973, TC587327, LOC688574, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, and Hbb.
[3]
[1] or The stress evaluation method according to [2].
[4]
The stress evaluation method according to [1], wherein the gene is selected from the group consisting of eight genes of Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Hba-a2, Hbb, and Alas2.
[5]
The stress evaluation method according to any one of [1] to [4], wherein two or more genes are used as an index.
[6]
Retnlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, Rsad2, F1, Sdc4b Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, Fech, Bpgm, Nlrp12, Csf3r, Osgin1, Mogat2, Kr, R1 Clec4e, Dusp13, Gpr77, Znf532, Oas1k, Per2, Upp1, Oas1a, Pth, Lrg1, Dnase2b, Vegfa, Hdc, Egr1, Clec4d, Alox5, Car2, Il1r2, Il8rb, Pla2g7, Dgat2, Mct, Mpt10 S100a9, Rab32, Emb, Fetub, Scgb3a1, Nlrp3, TC646750, ENSRNOT00000065312, ENSRNOT00000040211, ENSRNOT00000056434, RGD1311874, MGC72973, TC587327, LOC688574, TC603221, RGD1565432, RGD1565374, RGD1565161, LOC13, 156 A_64_P138390, A_64_P050137, ENSRNOT00000035459, Tspan8, Mmp9, Add2, Era A stress evaluation marker containing at least one gene selected from the group consisting of f, Aqp1, Alas2, Hbb, and Hba-a2.
[7]
The genes are Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, Rsad2, Slcbb, Rsad2, Slc4, Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, Fech, Bpgm, Nlrp12, Csf3r, Osgin1, 000000646D, 000000 The stress evaluation marker according to [6], which is at least one selected from the group consisting of MGC72973, TC587327, LOC688574, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, and Hbb.
[8]
[6] or The stress evaluation marker according to [7].
[9]
The stress evaluation marker according to [6], wherein the gene is selected from the group consisting of eight genes of Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Hba-a2, Hbb, and Alas2.
[10]
The stress evaluation marker according to any one of [6] to [9], comprising two or more kinds of the genes.
[11]
The stress evaluation marker according to any one of [6] to [10], which contains at least eight genes of Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Hba-a2, Hbb, and Alas2.
[12]
A method for creating a stress-bearing model animal by raising a wire net after raising a floor.
[13]
The production method according to [12], wherein the floor-laying is performed for 5 days or more.
[14]
The production method according to [12] or [13], wherein the wire netting is performed for 5 days or more.
[15]
The production method according to any one of [12] to [14], wherein the model animal is a rodent.
[16]
The production method according to any one of [12] to [15], wherein the model animal is a rat or a mouse.
[17]
[12]-[16] A stress model animal produced by the method according to any one of [16] to [16].
本法は、通常の採血による数ｍＬの血液をもとに解析可能であり、微侵襲的、簡便かつ日常的に行うことのできる検査方法である。 This method can be analyzed on the basis of several milliliters of blood obtained by normal blood collection, and is a test method that can be performed microinvasively, simply, and on a daily basis.
以下、本発明を実施するための形態について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment, It can implement by changing variously within the range of the summary.
本発明は、遺伝子の発現量を指標として用い、該遺伝子が、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、Mogat2、Alpl、Csf1、Klra2、Cdr2、Kcnq2、Prp15、Clec4e、Dusp13、Gpr77、Znf532、Oas1k、Per2、Upp1、Oas1a、Pth、Lrg1、Dnase2b、Vegfa、Hdc、Egr1、Clec4d、Alox5、Car2、Il1r2、Il8rb、Pla2g7、Dgat2、Mcpt10、Mcpt8、Mcpt8l2、Mcpt8l3、S100a9、Rab32、Emb、Fetub、Scgb3a1、Nlrp3、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、TC603221、RGD1565432、RGD1565374、RGD1565161、RGD1565983、RGD1310507、LOC690116、LOC691993、LOC689064、CF109441、A_64_P154430、A_64_P138390、A_64_P050137、ENSRNOT00000035459、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、Hbb、およびHba-a2からなる群から選択される少なくとも１種である、ストレスの評価方法である。 The present invention uses the expression level of a gene as an index, and the gene is Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5 , Slc43a3, Rsad2, Slc4a1, Wfdc15b, Plekhb1, Cd52, Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3bS, Cfd, Tuba3bS , Osgin1, Mogat2, Alpl, Csf1, Klra2, Cdr2, Kcnq2, Prp15, Clec4e, Dusp13, Gpr77, Znf532, Oas1k, Per2, Upp1, Oas1a, Pth, Lrg1, Dnase2b, Vegfa, Hdc, Egr1, 5 , Il1r2, Il8rb, Pla2g7, Dgat2, Mcpt10, Mcpt8, Mcpt8l2, Mcpt8l3, S100a9, Rab32, Emb, Fetub, Scgb3a1, Nlrp3, TC646750, ENSRNOT00000065312, ENSRNOT00000056411, NRTC73 , RGD1565161, RGD1565983, RGD1310507, LOC690116, LOC691993, LOC689064, CF109441, A_64_P15443 This is a stress evaluation method that is at least one selected from the group consisting of 0, A_64_P138390, A_64_P050137, ENSRNOT00000035459, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, Hbb, and Hba-a2.
本発明において、ストレスの評価をするにあたり、上記１１１種の遺伝子のうち少なくとも１種の遺伝子発現量を測定することにより、ストレス負荷の有無を測定することができるが、以下のような方法によりストレスの負荷の有無を評価することができる。
例えば、一遺伝子の発現量を測定して、ストレスの評価を行ってもよいし、複数遺伝子の発現量を同時に測定して、ストレスの評価を行ってもよい。
また、１１１種遺伝子から選択される、１種又は複数種を含むマイクロチップを用いて、遺伝子発現量を測定してもよい。
複数種の遺伝子を用いてストレスの評価を行う場合には、全ての遺伝子の発現量が増えている場合にはもちろん、発現量の亢進されている遺伝子の数が多いことをもってストレス負荷状態にあると評価することもできる。
In the present invention, when evaluating stress, the presence or absence of stress load can be measured by measuring the expression level of at least one of the above 111 genes. The presence or absence of a load can be evaluated.
For example, the stress level may be evaluated by measuring the expression level of one gene, or the stress level may be evaluated by simultaneously measuring the expression levels of a plurality of genes.
Moreover, you may measure a gene expression level using the microchip containing 1 type or multiple types selected from 111 types of genes.
When evaluating stress using multiple types of genes, not only when the expression level of all genes is increased, but also because the number of genes whose expression levels are increased is high It can also be evaluated.
本発明のストレスの評価方法により、ストレスの有無を評価することができるが、かかる評価結果に基づいて、医師などによって、ヒトにおけるうつ病などの疾患に罹っているか否かを診断することができる。すなわち、本発明のストレスの評価方法においては、医師などが診断を行う際の基礎資料となる、血中のストレスマーカーである１１１種の遺伝子について、その少なくとも１種を用いてストレスの有無を評価するのであって、ヒトの病気を診断する方法には該当しない。 According to the stress evaluation method of the present invention, the presence or absence of stress can be evaluated. Based on the evaluation result, it can be diagnosed by a doctor or the like whether or not a person has a disease such as depression. . That is, in the stress evaluation method of the present invention, the presence or absence of stress is evaluated using at least one of 111 genes that are stress markers in blood, which is a basic material for diagnosis by a doctor or the like. Therefore, it is not a method for diagnosing human illness.
ストレスの有無を評価するに当たり、かかる１１１種の遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定する。
かかる遺伝子の発現量について測定するサンプルは、特に限定されるものではないが、血液サンプルであることが好ましい。中でも、血液中の白血球における遺伝子の発現量を測定することが好ましい。
In evaluating the presence or absence of stress, the expression level of at least one of the 111 genes is measured.
The sample for measuring the expression level of such a gene is not particularly limited, but is preferably a blood sample. Among them, it is preferable to measure the gene expression level in leukocytes in blood.
遺伝子の発現量を測定し、ストレスの有無を評価するにあたっては、以下のような方法により行うことができる。
サンプル中における遺伝子の発現量の絶対量を測定して、その多寡によりストレスの有無を測定することもできるが、データベース化した遺伝子発現量と対比することにより、ストレス評価を行うこともできる。
なお、本発明においては、少なくとも１種の遺伝子の発現量を用いてストレス評価を行うが、うつ病患者やストレス負荷家畜からマーカー遺伝子群の発現量データを集め、データベース化し、そのデータベースと照合し、例えば、パターン認識技術を用いることによりストレス評価を行うこともできる。
また、個人（個体）単位でマーカー発現量を定期的に測定・記録しデータベース化し、そのデータベースと照合し、ストレス評価を行うこともできる。
In measuring the gene expression level and evaluating the presence or absence of stress, the following method can be used.
The absolute amount of the expression level of the gene in the sample can be measured, and the presence or absence of stress can be determined based on the absolute value. However, the stress evaluation can also be performed by comparing with the gene expression level stored in a database.
In the present invention, the stress evaluation is performed using the expression level of at least one gene, but the expression level data of the marker gene group is collected from a depressed patient or a stress-bearing livestock, and the database is collated. For example, stress evaluation can be performed by using a pattern recognition technique.
It is also possible to periodically measure and record the marker expression level in units of individuals (individuals), create a database, collate with the database, and perform stress evaluation.
本発明における、遺伝子の発現量の測定方法としては、発現量が亢進していることを測定するために、ｍＲＮＡの量を遺伝子の発現量として測定することもでき、また、遺伝子発現産物であるタンパクの発現変動を遺伝子の発現量として測定することもできる。 In the present invention, as a method for measuring the expression level of a gene, in order to measure that the expression level is increased, the amount of mRNA can also be measured as the expression level of a gene, and is a gene expression product. Changes in protein expression can also be measured as gene expression levels.
遺伝子の発現量を転写産物としてのｍＲＮＡの量として測定する場合には、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。 When measuring the expression level of a gene as the amount of mRNA as a transcript, a technique known for detecting and measuring the expression of a specific gene in the field according to known genetic engineering and molecular biological techniques, For example, any analysis method known in the art such as in situ hybridization, Northern blotting, dot blot, RNase protection assay, RT-PCR, Real-Time PCR can be used.
また、遺伝子の発現変動を判定するための別の方法として、遺伝子の発現産物であるタンパク質量を定量する場合には、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えばウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。
具体的には、遺伝子変動を判定するための手法としてタンパク質を定量する場合の例示として、Tspan8を例として説明すると、ＴＳＰＡＮ８タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれＴＳＰＡＮ８タンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、Tspan8遺伝子を組込んだ真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
このような抗体を使用する方法は、例えば免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができ、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ルミネッセント免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくはＲＩＡ、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡであり、さらにサンドイッチ型アッセイが挙げられる。サンドイッチ型アッセイには、同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどであってもよい。Tspan8遺伝子の発現量をＴＳＰＡＮ８タンパク質を定量することによる方法を例示して説明したが、Tspan8遺伝子以外の遺伝子についても、同様の手法により遺伝子の発現量をタンパク質の定量により測定することもできる。
In addition, as another method for determining gene expression variation, when quantifying the amount of a protein that is an expression product of a gene, the amount of a specific protein in the field according to known genetic engineering and molecular biological techniques. Any analysis method known in the art such as Western blotting, various immunohistological methods and the like can be used.
Specifically, as an example of quantifying proteins as a technique for determining gene variation, Tspan8 will be described as an example, and an antibody that specifically recognizes TSPAN8 protein can be used. The antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and includes all the whole molecules capable of binding to the epitope of TSPAN8 protein, and Fab, F (ab ′) 2, Fv fragments, and the like. For example, in the case of a polyclonal antibody, such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using a protein or a partial fragment thereof as an immunogen. Alternatively, it can be prepared by collecting a serum after introducing an expression vector for eukaryotic cells incorporating the Tspan8 gene into the muscle or skin of an animal by injection or gene gun. As the animal, mouse, rat, rabbit, goat, chicken and the like are used.
Methods using such antibodies can be performed, for example, by immunostaining, such as tissue or cell staining, immunoelectron microscopy, immunoassays, such as competitive or noncompetitive immunoassays, radioimmunoassay (RIA), fluorescence Immunoassay (FIA), luminescent immunoassay (LIA), enzyme immunoassay (EIA), ELISA, etc. can be used, and the measurement can be performed with or without BF separation. be able to. RIA, EIA, FIA, and LIA are preferable, and a sandwich type assay is also included. The sandwich type assay may be a simultaneous sandwich type assay, a forward sandwich type assay or a reverse sandwich type assay. Although the method of quantifying the TSPAN8 protein has been described by exemplifying the expression level of the Tspan8 gene, the gene expression level of a gene other than the Tspan8 gene can also be measured by protein quantification using the same technique.
本発明の評価方法においては、以上に例示した各方法の２以上を組み合わせて行うことによって、遺伝子の発現量を解析するにあたりより精度を高く判定することもできる。 In the evaluation method of the present invention, by performing a combination of two or more of the methods exemplified above, it is possible to determine with higher accuracy in analyzing the expression level of the gene.
本発明においては、１１１種の遺伝子の発現量は、血液中の白血球画分における発現量を測定することが好ましい。 In the present invention, it is preferable to measure the expression level of 111 genes in the leukocyte fraction in blood.
本発明は、別の態様として、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、Mogat2、Alpl、Csf1、Klra2、Cdr2、Kcnq2、Prp15、Clec4e、Dusp13、Gpr77、Znf532、Oas1k、Per2、Upp1、Oas1a、Pth、Lrg1、Dnase2b、Vegfa、Hdc、Egr1、Clec4d、Alox5、Car2、Il1r2、Il8rb、Pla2g7、Dgat2、Mcpt10、Mcpt8、Mcpt8l2、Mcpt8l3、S100a9、Rab32、Emb、Fetub、Scgb3a1、Nlrp3、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、TC603221、RGD1565432、RGD1565374、RGD1565161、RGD1565983、RGD1310507、LOC690116、LOC691993、LOC689064、CF109441、A_64_P154430、A_64_P138390、A_64_P050137、ENSRNOT00000035459、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、Hbb、およびHba-a2からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含有する、ストレス評価マーカーである。 The present invention, as another embodiment, Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, fsad, , Plekhb1, Cd52, Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, Fech, Bpgm, Nlrp12, Csf3, Csf3, Csf3, Csf3 , Klra2, Cdr2, Kcnq2, Prp15, Clec4e, Dusp13, Gpr77, Znf532, Oas1k, Per2, Upp1, Oas1a, Pth, Lrg1, Dnase2b, Vegfa, Hdc, Egr1, Clec4d, Alox5, Car2, I1r2g, La2, I1r2g , Mcpt10, Mcpt8, Mcpt8l2, Mcpt8l3, S100a9, Rab32, Emb, Fetub, Scgb3a1, Nlrp3, TC646750, ENSRNOT00000065312, ENSRNOT00000040211, ENSRNOT00000056434, RGD1311874, MGC72973, 1565D , LOC691993, LOC689064, CF109441, A_64_P154430, A_64_P138390, A_64_P050137, ENSRNOT0 A stress evaluation marker comprising at least one gene selected from the group consisting of 0000035459, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, Hbb, and Hba-a2.
ストレス評価マーカーとして、上記１１１種の遺伝子のうち少なくとも１種を含めば特に遺伝子が限定されるものではないが、１１１種の遺伝子それぞれを単独でマーカーとして用いてもよく、２種以上の遺伝子群をマーカーとして用いてもよい。
複数の遺伝子をマーカーとして用いることにより、より信頼性の高いストレス評価マーカーとして用いることができる。
The stress evaluation marker is not particularly limited as long as at least one of the above 111 genes is included, but each of the 111 genes may be used alone as a marker, and two or more gene groups May be used as a marker.
By using a plurality of genes as markers, it can be used as a more reliable stress evaluation marker.
本発明においては、「ストレス評価マーカー」とは、かかるマーカーの発現量を測定することにより、ストレス負荷の状態にあるか否かを判定することのできるマーカーであることを意味し、かかるマーカーとしては、１１１種の遺伝子から選択される少なくとも１種である。
ストレス評価マーカーとして、２種以上を用いる場合には、キットのように、かかるマーカーを用いてもよく、同時に測定してもよく、一方を先行してその発現量を測定し、次いで、他のマーカーの発現量を測定することにより、ストレス評価用のマーカーとして用いてもよい。
In the present invention, the term “stress evaluation marker” means a marker that can determine whether or not it is in a stress load state by measuring the expression level of such a marker. Is at least one selected from 111 genes.
When two or more kinds of stress evaluation markers are used, such markers may be used as in a kit, or they may be measured at the same time. You may use as a marker for stress evaluation by measuring the expression level of a marker.
ストレスマーカーとしては、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Schip1、Mycbpap、Aqp9、Ldhc、Degs2、Oas3、Slc22a4、Slc38a5、Slc43a3、Rsad2、Slc4a1、Wfdc15b、Plekhb1、Cd52、Anxa1、Rhd、Nrtn、Alox15、Scube1、Ube2c、Mrgprx3、Steap4、Selenbp1、Rrm2、S100a8、Cfd、Tuba3b、Slpi、Padi4、Fech、Bpgm、Nlrp12、Csf3r、Osgin1、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、RGD1311874、MGC72973、TC587327、LOC688574、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Alas2、およびHbbからなる群から選択される少なくとも１種を含有することが好ましく、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifitm6、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、TC646750、ENSRNOT00000065312、ENSRNOT00000040211、ENSRNOT00000056434、Tspan8、Mmp9からなる群から選択される少なくとも１種を含有することがより好ましく、Retnlg、Csta、Il1b、Camp、Ifit1lb、Fcar、Pglyrp1、Mmp8、Tspan8、およびMmp9からなる群から選択される少なくとも１種を含有することがさらに好ましい。
マイクロアレイのように、これら遺伝子を全てマーカーとして有していてもよく、また、その一部に遺伝子の少なくとも１種を含んでいてもよい。
Stress markers include Retlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8, Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, Rsad1, F1 , Anxa1, Rhd, Nrtn, Alox15, Scube1, Ube2c, Mrgprx3, Steap4, Selenbp1, Rrm2, S100a8, Cfd, Tuba3b, Slpi, Padi4, Fech, Bpgm, Nlrp12, Csf3r, 0000004, ENSENS1, 000000 MGC72973, TC587327, LOC688574, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Alas2, and at least one selected from the group consisting of Hbb, Retnlg, Csta, Il1b, Camp, Ifitm6, Ifit1lb, More preferably, it contains at least one selected from the group consisting of Fcar, Pglyrp1, Mmp8, TC646750, ENSRNOT00000065312, ENSRNOT00000040211, ENSRNOT00000056434, Tspan8, Mmp9, and Retnlg, Csta, Il1b, Camp, Ifit1lb, Fcar, Pglyrp1, Mmp8 , Tsp More preferably, it contains at least one selected from the group consisting of an8 and Mmp9.
Like a microarray, all of these genes may be included as markers, or at least one of the genes may be included as part of the genes.
本発明の評価方法において用いられるストレス評価マーカーである１１１種の遺伝子は、本発明のもう１つの態様であるストレス負荷モデル動物の作成方法により見出されたものである。
本発明において、ストレス負荷モデル動物の作成方法により、新規ストレス負荷モデル動物を作成し、ストレス負荷された動物における血液から白血球成分を抽出し、かかる血球成分中の遺伝子発現量を測定することにより見出された遺伝子群である。具体的には実施例に示すような実験により、ストレス検出用のマーカーとして選択された１１１種の遺伝子である。表１および表２に示す。
The 111 kinds of genes that are stress evaluation markers used in the evaluation method of the present invention have been found by the method for preparing a stress load model animal which is another aspect of the present invention.
In the present invention, a new stress load model animal is created by the method of creating a stress load model animal, a leukocyte component is extracted from blood in the stressed animal, and a gene expression level in the blood cell component is measured. This is a gene group. Specifically, 111 genes selected as stress detection markers by experiments as shown in the Examples. It shows in Table 1 and Table 2.
表１及び表２は、各遺伝子についてのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒとその機能と共に、白血球の遺伝子発現量をＤＮＡマイクロアレイ（Ｎ数＝５）で分析した結果も示すものである。 Tables 1 and 2 also show the results of analyzing the gene expression level of leukocytes using a DNA microarray (N number = 5) together with the accession number and its function for each gene.
本発明におけるストレス負荷モデル動物の作成方法は、好ましくは、げっ歯類、中でも、マウスやラットに適用することで、新規ストレス負荷モデル動物を作成することができる。
モデル動物を購入した際には、通常、輸送ストレス等がかかっていることが多い。
そこで、本発明においては、まず、モデル動物を床敷条件で飼育して、かかるストレスを解消させる。
床敷条件での飼育には、通常、５日以上飼育することにより、購入から輸送までの間にかかるストレスを解消させることができる。かかる飼育期間は、７日以上であることが好ましい。
The method for creating a stress load model animal in the present invention is preferably applied to rodents, particularly mice and rats, so that a new stress load model animal can be created.
When a model animal is purchased, there are usually many transportation stresses.
Therefore, in the present invention, first, a model animal is bred under flooring conditions to eliminate such stress.
For breeding under flooring conditions, the stress between the purchase and transportation can be eliminated by breeding for 5 days or more. Such breeding period is preferably 7 days or more.
床敷条件での飼育とは、モデル動物を、例えば、夏目製作所製のポリカーボネートケージのようなケージに、ストレス負荷をより軽減する観点で、図１に示すように、ウッドチップやおがくずなどの床材や市販の床敷などを敷いた床敷ケージで飼育することを意味する。 Breeding under flooring conditions means that a model animal is placed in a cage such as a polycarbonate cage manufactured by Natsume Seisakusho, and a floor such as wood chips and sawdust as shown in FIG. 1 from the viewpoint of further reducing the stress load. It means rearing in floor cages with timber and commercial flooring.
床敷条件で飼育することによりストレスの解消したモデル動物を、続いて、金網条件で飼育することによる、ストレス負荷モデル動物を作成することができる。
床敷条件から、金網条件下でと、飼育環境が変わることにより、ストレス負荷のかかったモデル動物を作成することができる。
金網条件での飼育には、通常、５日以上飼育することにより、ストレスから解消されたモデル動物にストレスを負荷することができる。かかる飼育期間は、７日以上であることが好ましい。金網条件での飼育は、長く行うと、モデル動物がストレス環境に順応してしまうため、好ましくは、１０日以内で飼育することが好ましい。
It is possible to create a model animal that has been stress-relieved by breeding under the flooring condition, and then a model that is stressed by breeding under the wire mesh condition.
By changing the breeding environment from a flooring condition to a wire mesh condition, a model animal with a stress load can be created.
For breeding under wire mesh conditions, it is usually possible to load a model animal that has been relieved of stress by raising it for 5 days or more. Such breeding period is preferably 7 days or more. Breeding under wire mesh conditions will allow the model animal to adapt to the stress environment if it is carried out for a long time.
金網条件での飼育とは、モデル動物を、１．２ｃｍ角程度のメッシュの開いた金網ケージで飼育することを意味する。 Breeding under wire mesh conditions means breeding the model animal in a wire mesh cage with a mesh of about 1.2 cm square.
ストレス負荷モデル動物の作成の確認については、金網条件での飼育下のモデル動物と、床敷条件で飼育を続けたコントロールとしてのモデル動物との血液サンプル中の好中球数の違いや、ストレスマーカーとして知られた遺伝子の発現量を比較することによっても確認することができる。
また、本発明により、１１１種の遺伝子マーカーが提供されているので、これら１１１種の遺伝子の発現量を比較することによっても、ストレス負荷モデル動物の作成を確認することができる。
Regarding the confirmation of the creation of a stress-bearing model animal, the difference in the number of neutrophils in the blood sample between the model animal reared under wire mesh conditions and the model animal as a control that continued to be reared under flooring conditions, It can also be confirmed by comparing the expression levels of genes known as markers.
Furthermore, since 111 gene markers are provided by the present invention, the creation of a stress-bearing model animal can also be confirmed by comparing the expression levels of these 111 genes.
本発明においては、上記ストレス負荷モデル動物の作成方法により作成されるストレス負荷モデル動物をも提供する。 In this invention, the stress load model animal produced by the production method of the said stress load model animal is also provided.
以下、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, this invention is not limited to these Examples.
［実施例１］（ストレス負荷ラットの作成）
１．試験方法
購入した近交系の雄のラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４）の輸送ストレスを排除するために、７日間、床敷ケージ内でラットを飼育した。その後、同じ飼育部屋の別の床敷ケージ又は金網ケージへ、ラットを移し飼育した（図１参照）。それぞれのケージでの飼育７日目に採血し、得られたサンプル（０．２ｍＬ）を用いてヒト用血球分析装置（ＸＴ−２０００ｉ、Ｓｙｓｍｅｘ製）で血液成分解析を行った。床敷飼育については１１匹の、金網飼育については１２匹のラットの血液中の好中球の割合（％）の測定結果およびその平均を表３に示す。図２は、血液中の好中球の割合の平均値を（％）グラフ化したものであり、縦軸は、血液中の好中球の割合を表す。
[Example 1] (Creation of stress-loaded rats)
1. Test Method In order to eliminate the transport stress of purchased inbred male rats (Fischer 344), the rats were raised in bedding cages for 7 days. Thereafter, the rats were moved to another floor cage or wire mesh cage in the same breeding room and reared (see FIG. 1). Blood samples were collected on the seventh day of breeding in each cage, and blood component analysis was performed using the obtained sample (0.2 mL) with a human blood cell analyzer (XT-2000i, manufactured by Sysmex). Table 3 shows the measurement results and averages of the percentage (%) of neutrophils in the blood of 11 rats for bedding and 12 rats for wire netting. FIG. 2 is a graph showing the average value of the percentage of neutrophils in blood (%), and the vertical axis represents the percentage of neutrophils in blood.
２．結果
ラットに対して肉体的拘束などのストレスを加えると血液中の好中球の増加が観察されることが知られている（新潟大学医学部医動物学教室のグループによって実証されてもいる：日本経済新聞1995-11-24）。また、日本補完代替医療学会誌 Vol. 1 (2004) , No. 1 pp.31-40や、臨床検査ガイド2007〜2008（文光堂出版）なども参考になる。
金網ケージ内で飼育したラットと床敷ケ−ジ内で飼育したラットとの血液成分を比較解析したところ、前者の白血球中好中球の割合は平均１５．１％であり後者は１２．１％であった。すなわち、金網飼育において、床敷飼育に比べ顕著に白血球中の好中球の割合が増加していたことから（表３および図２参照）、金網飼育により、ストレス負荷のかかったラットが得られた。
2. Results It is known that neutrophils in the blood are observed to increase when stress such as physical restraint is applied to rats (also demonstrated by a group in the Department of Medical Zoology, Niigata University School of Medicine: Japan) Keizai Shimbun 1995-11-24). In addition, the Journal of Complementary and Alternative Medicine Japan Vol. 1 (2004), No. 1 pp.31-40 and Clinical Laboratory Guide 2007-2008 (Bunkodo Publishing) are also helpful.
A comparative analysis of blood components between rats reared in a wire mesh cage and rats reared in a floor-covered cage revealed that the former leukocyte neutrophil ratio was 15.1% on average and the latter 12.1 %Met. In other words, since the ratio of neutrophils in leukocytes was significantly increased in wire mesh breeding compared to floor-laying (see Table 3 and FIG. 2), rats loaded with stress were obtained by wire mesh breeding. It was.
［実施例２］（CREB遺伝子およびIRF2遺伝子の白血球中での発現解析）
CREB（cAMP Response Element Binding protein）遺伝子およびIRF2（Interferon Regulatory Factor 2）遺伝子はうつ病やストレスと密接に関連していることが知られている。
うつ病など精神疾患を対象に、末梢血白血球遺伝子発現を指標にして病因候補遺伝子を探索した結果、うつ病患者においてCREB遺伝子、つまりCREB mRNAの発現量が上昇することが報告されている（Jun-ichi Iga, et al., : Altered HDAC5 and CREB mRNA expressions in the peripheral leukocytes of major depression, Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, Vol.31, No.3, pp.628-632, 2007）。
また、健常人にストレスを負荷した際に、末梢血白血球由来のIRF2遺伝子、つまりIRF2 mRNAの発現量が上昇することも報告されている（特開２００６−１５号公報）。
そこで、実施例１で得られた血液サンプルを用いて白血球中CREB遺伝子およびIRF2遺伝子の発現変化の有無を確認した。
[Example 2] (Expression analysis of CREB gene and IRF2 gene in leukocytes)
CREB (cAMP Response Element Binding protein) gene and IRF2 (Interferon Regulatory Factor 2) gene are known to be closely related to depression and stress.
As a result of searching for candidate genes for etiology using peripheral blood leukocyte gene expression as an index for mental disorders such as depression, it has been reported that the expression level of CREB gene, that is, CREB mRNA, increases in patients with depression (Jun -ichi Iga, et al.,: Altered HDAC5 and CREB mRNA expressions in the peripheral leukocytes of major depression, Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, Vol. 31, No. 3, pp. 628-632, 2007).
It has also been reported that the expression level of IRF2 gene derived from peripheral blood leukocytes, that is, IRF2 mRNA, increases when stress is applied to a healthy person (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-15).
Therefore, using the blood sample obtained in Example 1, the presence or absence of changes in expression of CREB gene and IRF2 gene in leukocytes was confirmed.
＜白血球の血液サンプルからの分離＞
床敷飼育したラット及び金網飼育したラットから採取した静脈血（５ｍＬ）を血液凝固阻止剤（ヘパリンナトリウム注射液、１００単位／ｍＬを５０μＬ）で処理後、６ｍＬの血球分離試薬（モノ・ポリ分離溶液、大日本住友製薬ファーマバイオメディカル）の入った試験管へ移した。遠心分離（１５００ｒｐｍ、２０ｍｉｎを連続して３回、トータル６０ｍｉｎ）を行い、白血球が含まれる白色の層を１．５ｍＬチューブへ移した。
生理食塩水を加え、遠心分離（６０００ｒｐｍ、５ｍｉｎを３回）を行って、白血球を沈殿させた。
<Separation of leukocytes from blood samples>
Venous blood (5 mL) collected from rats cultivated on the floor and wire netting was treated with a blood coagulation inhibitor (heparin sodium injection solution, 100 units / mL 50 μL), and then 6 mL of blood cell separation reagent (mono / poly separation) The solution was transferred to a test tube containing Dainippon Sumitomo Pharma Pharma Biomedical). Centrifugation (1500 rpm, 20 min three times continuously, total 60 min) was performed, and the white layer containing leukocytes was transferred to a 1.5 mL tube.
Saline was added and centrifuged (6000 rpm, 5 min 3 times) to precipitate leukocytes.
＜白血球からのＲＮＡ抽出＞
次に、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、添付説明書に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。具体的には以下のとおりである。
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴにメルカプトエタノール（Ｍ−Ｅ）を１０μＬ／ｍＬの濃度で添加した。遠心分離により沈殿させて得られた白血球サンプルにＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ（＋Ｍ−Ｅ）を７００μＬ加えた。ボルテックスミキサーにより、物理的に細胞を破壊した。さらに、シリンジに取り付けた先の尖っていない注射針（２０−Ｇ、直径０．９ｍｍ）に白血球サンプルを少なくとも５回通し、物理的に白血球を破壊した。得られたサンプルに６００μＬの７０％エタノール水溶液を添加し、ピペッティングによりよく混和した。６００μＬのサンプルを、２ｍＬチューブ中にセットしたＲＮｅａｓｙスピンカラムに適用し、８０００ × ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で１５秒間遠心分離し、上清を除去した。３５０μＬの洗浄液（ＲＷ１ ｂｕｆｆｅｒ）をＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ ｘ ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で１５秒間遠心分離し、上清を除去した。
ＤＮＡのコンタミネーションを防ぐため、１サンプルあたりＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）２０μＬとバッファーＲＤＤ１４０μＬの計１６０μＬをカラム中央に適用し、室温で１５分間静置した。３５０μＬの洗浄液（ＲＷ１ ｂｕｆｆｅｒ）をＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ ｘ ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で１５秒間遠心分離し、上清を除去した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムに５００μＬの洗浄液（ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、８０００ ｘ ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で１５秒間遠心分離し、上清を除去した。再び、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに５００μＬの洗浄液（ＲＰＥ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、８０００ ｘ ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で２分間遠心操作した。ＲＮｅａｓｙスピンカラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットした。蒸留水４０μＬを直接スピンカラム・メンブレンに添加し、８０００ ｘ ｇ（１０，０００ｒｐｍ）以上で１分間遠心操作を行ない、ＲＮＡを溶出した。新しい蒸留水４０μＬを用いて上記ステップを再度行ない、ＲＮＡを溶出した。抽出した各ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル５０μＬを濃度測定に用いた。残りのＲＮＡサンプルは−８０℃にて凍結保存した。
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡは吸光度測定にてＲＴ−ＰＣＲ解析に用いられる品質であるかどうかを確認した。
<RNA extraction from leukocytes>
Next, total RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen) according to the attached instructions. Specifically, it is as follows.
Mercaptoethanol (ME) was added to Buffer RLT at a concentration of 10 μL / mL. 700 μL of Buffer RLT (+ ME) was added to the leukocyte sample obtained by precipitation by centrifugation. Cells were physically disrupted with a vortex mixer. Further, the leukocyte sample was passed at least five times through a non-pointed injection needle (20-G, diameter 0.9 mm) attached to the syringe to physically destroy the leukocytes. To the obtained sample, 600 μL of 70% ethanol aqueous solution was added and mixed well by pipetting. 600 μL of the sample was applied to an RNeasy spin column set in a 2 mL tube, centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 15 seconds, and the supernatant was removed. 350 μL of washing solution (RW1 buffer) was added to the RNeasy spin column, and centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 15 seconds to remove the supernatant.
In order to prevent DNA contamination, a total of 160 μL of DNA degrading enzyme (DNase) 20 μL and buffer RDD 140 μL per sample was applied to the center of the column and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. 350 μL of washing solution (RW1 buffer) was added to the RNeasy spin column, and centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 15 seconds to remove the supernatant. 500 μL of a washing solution (RPE buffer) was added to the RNeasy spin column, and centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 15 seconds to remove the supernatant. Again, 500 μL of washing solution (RPE buffer) was added to the RNeasy spin column and centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 2 minutes. The RNeasy spin column was set in a new 1.5 mL tube. Distilled water (40 μL) was directly added to the spin column membrane, and centrifuged at 8000 × g (10,000 rpm) or more for 1 minute to elute RNA. The above steps were repeated with 40 μL of fresh distilled water to elute the RNA. 50 μL of each extracted total RNA sample was used for concentration measurement. The remaining RNA samples were stored frozen at -80 ° C.
The extracted total RNA was confirmed by absorbance measurement to be of a quality used for RT-PCR analysis.
＜ｔｏｔａｌ ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成＞
逆転写反応用キット（ＴＯＹＯＢＯ社製 ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ）を用いて、４２℃、２０分→９９℃、５分→４℃で逆転写反応を行った。逆転写反応用の試薬（１５ｓａｍｐｌｅ分）として、水１５０μＬ、ｂｕｆｆｅｒ ５ｘＲＴ ６０μＬ、ｄＮＴＰ ３０μＬ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） １５μＬ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ）１５μＬ、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）１５μＬ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ１５μＬ（それぞれ１μＬ（１１７．５ｎｇ））を用い、ｔｏｔａｌ ｖｏｌ． ２０μＬで実施した。
<Synthesis of cDNA from total RNA>
The reverse transcription reaction was performed at 42 ° C., 20 minutes → 99 ° C., 5 minutes → 4 ° C. using a reverse transcription reaction kit (ReverTra Ace manufactured by TOYOBO). As reagents for reverse transcription reaction (15 sample), water 150 μL, buffer 5 × RT 60 μL, dNTP 30 μL, Oligo (dT) 15 μL, RNase Inhibitor (TOYOBO) 15 μL, River Tra Ase (TOYOBO) 15 μL, T17 L .5 ng)), total vol. Performed at 20 μL.
＜ＰＣＲ法による遺伝子検出実験＞
CREB遺伝子およびIRF2遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて、白血球由来ｃＤＮＡを鋳型として、Ｅｘ Ｔａｑ(ＴａＫａＲａ社製)を使用し、下記プロトコールに従いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応液量（ｔｏｔａｌ ｖｏｌ．）は１ｓａｍｐｌｅあたり２５μｌで実施した。ＰＣＲ用反応液（３０ｓａｍｐｌｅ分）として、ＤＮＡポリメラーゼ酵素「Ｅｘ−Ｔａｑ」３．７５μＬ、１０ ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ７５μＬ、ｄＮＴＰｓ ６０μＬ、白血球由来ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃＤＮＡ ６０μＬ、滅菌水４９２μＬを用い、混合液を２３μＬずつＰＣＲ用チューブへ分注し、それぞれの遺伝子検出用のプライマーＤＮＡをそれぞれ２μＬずつ添加した。
ＰＣＲ反応は、以下の条件で実施した。
ＲＴ−ＰＣＲ解析で使用したCREB遺伝子およびIRF2遺伝子の特異的プライマーとして、CREB
Forward Primer:5’-GGCCTGCAGACATTAACCAT-3’（配列番号１）
Reverse Primer:5’-ATCCAGTCCATTTTCCACCA-3’（配列番号２）
IRF2
Forward Primer:5’-ATCTGAGCGACCTTCCAAGA-3’（配列番号３）
Reverse Primer:5’-AGGACCGCATACTCAGGAGA-3’（配列番号４）
を用いた。
ＰＣＲ反応後、４％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色で目的遺伝子の検出をした。検出にはＵＶトランスイルミネーター(ＳＣＯＰＥ−ＷＤ)を用い、遺伝子バンドの強度を測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、CREB遺伝子およびIRF2遺伝子は顕著に発現量が上昇していることが確認できた（図３参照）。CREB遺伝子およびIRF2遺伝子の発現量が上昇していることから、金網飼育により、ストレス負荷のかかったラットが得られたことが確認できた。
なお、コントロールとして用いたGAPDH遺伝子のラットGAPDH遺伝子検出用プライマー配列は以下の通りである。
Forward Primer:5’-TTCAATGGCACAGTCAAGGC-3（配列番号５）
Reverse Primer:5’-TCACCCCATTTGATGTTAGCG-3（配列番号６）
<Gene detection experiment by PCR>
PCR reaction was performed according to the following protocol using Ex Taq (manufactured by TaKaRa) using primers specific to CREB gene and IRF2 gene and using leukocyte-derived cDNA as a template. The PCR reaction solution volume (total vol.) Was 25 μl per sample. As a PCR reaction solution (30 sample), DNA polymerase enzyme “Ex-Taq” 3.75 μL, 10 × PCR buffer 75 μL, dNTPs 60 μL, leukocyte-derived template cDNA 60 μL, sterilized water 492 μL, 23 μL each of the mixed solution for PCR The mixture was dispensed into tubes, and 2 μL of each primer DNA for gene detection was added.
The PCR reaction was performed under the following conditions.
As CREB and IRF2 gene specific primers used in RT-PCR analysis, CREB
Forward Primer: 5'-GGCCTGCAGACATTAACCAT-3 '(SEQ ID NO: 1)
Reverse Primer: 5'-ATCCAGTCCATTTTCCACCA-3 '(SEQ ID NO: 2)
IRF2
Forward Primer: 5'-ATCTGAGCGACCTTCCAAGA-3 '(SEQ ID NO: 3)
Reverse Primer: 5'-AGGACCGCATACTCAGGAGA-3 '(SEQ ID NO: 4)
Was used.
After the PCR reaction, 4% agarose gel electrophoresis was performed, and the target gene was detected by ethidium bromide staining. For detection, a UV transilluminator (SCOPE-WD) was used to measure the intensity of the gene band.
As a result of RT-PCR analysis, it was confirmed that the expression levels of CREB gene and IRF2 gene were remarkably increased (see FIG. 3). Since the expression levels of the CREB gene and the IRF2 gene were increased, it was confirmed that rats subjected to stress load were obtained by wire netting.
In addition, the rat GAPDH gene detection primer sequence of the GAPDH gene used as a control is as follows.
Forward Primer: 5'-TTCAATGGCACAGTCAAGGC-3 (SEQ ID NO: 5)
Reverse Primer: 5'-TCACCCCATTTGATGTTAGCG-3 (SEQ ID NO: 6)
［実施例３］（マイクロアレイ解析）
実施例１と同様にして、ラットを飼育して、金網飼育によりストレス負荷のかかったラット５個体および床敷飼育したラット５個体を得た。金網又は床敷上での飼育７日目に血液サンプルを採取した。
実施例２と同様にして、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、添付説明書に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った（それぞれの血液サンプルに由来するｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを、以下、ストレス負荷サンプル、対照サンプルという。）。
次に、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡのラベルと増殖をＬｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。
まず、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇ、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ １．８μＬを加え、ｔｏｔａｌで３．３μＬになるようにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加えた。ＲＮＡ Ｓｐｉｋｅ Ｉｎ Ｋｉｔ（２カラー用）のＳｐｉｋｅ−ＡをＣｙ３ラベルする対照サンプルに、Ｓｐｉｋｅ−ＢをＣｙ５ラベルするストレス負荷サンプルに２μＬ加えた。６５℃で１０分間、インキュベート後、５分間、氷上に置き、熱変性させた。熱変性させたＲＮＡにｃＤＮＡマスターミックス（５ｘＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ １．０μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ０．５μＬ、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ １．２μＬ）を４．７μｌ加え、４０℃で２時間インキュベートした。チューブをウォーターバスから取り出し、７０℃で１５分間インキュベートし、反応を停止した後、氷上で５分間冷却した。
対照サンプルにＣｙａｎｉｎｅ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘを、ストレス負荷サンプルにＣｙａｎｉｎｅ５ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘを各反応チューブに加えた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎマスターミックスとして、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ０．７５μＬ、５ｘＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ３．２μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ ０．６μＬ、ＮＴＰ ｍｉｘ １．０μＬ、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ ０．２１μＬ、Ｃｙａｎｉｎｅ ３ ｏｒ ５ ＣＴＰ ０．２４μＬを１反応の必要量（Ｔｔｏｔａｌ ６．０μＬ）として用いた。４０℃のウォーターバス中で、遮光しながら２時間インキュベートした。
次に、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ラベル化ｃＲＮＡを調整した。
Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ８４μＬ、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ ３５０μＬ、エタノール ２５０μＬを順次反応チューブに加えた。７００μＬのｃＲＮＡサンプルをカラムに移し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを別のチューブに移し、カラムをコレクションチューブに戻した。５００μＬのＲＰＥ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１３０００ｒｐｍで１分間遠心した。フロースルーを別のチューブに移し、カラムをコレクションチューブに戻した。５００μＬのＲＰＥ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。カラムを１．５ｍＬチューブに移した。３０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加え、１分間静置した。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し溶出した。
次に、溶出した溶液状態のｃＲＮＡを分光光度計で濃度測定し、以下の溶液量となるようｃＲＮＡターゲット溶液の調整を行った。
以下のように２ｘｃＲＮＡターゲット溶液を調整した。１チューブあたりの反応量を示す。
Ｃｙａｎｉｎｅ３ラベル化ｃＲＮＡ ０．８２５μｇ
Ｃｙａｎｉｎｅ５ラベル化ｃＲＮＡ ０．８２５μｇ
１０ｘＢｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ １１．０μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ
Ｔｏｔａｌ ５２．８μＬ
２ｘｃＲＮＡターゲット溶液５２．８μＬに２５ｘフラグメンテーションバッファーを２．２μＬ加え、６０℃のウォーターバスで３０分間インキュベートした。
フラグメンテーションをストップさせるために、２ｘハイブリダイゼーションバッファーを５５μＬ加えた。
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｒａｔ ＧＥ ４ｘ４４ｋ ｖ３ ２ｃｏｌｏｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔ社製）に１００μＬアプライし、６５℃で約１７時間、ハイブリオーブンで攪拌しながらハイブリダイゼーションを行った。
室温のＡｇｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ洗浄バッファー１で１分間洗浄した。３７℃のＡｇｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ洗浄バッファー２で１分間洗浄した。スライドを引き上げて風乾した。乾燥後、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｃａｎｎｅｒを用いて５μｍの解像度でスキャンした。
次に、変動した遺伝子を選出するために、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｃａｎｎｅｒから出力された数値生データをＥｘｃｅｌにより解析した。
Ｃｏｎｔｒｏｌフィーチャーは、「ＣｏｎｔｒｏｌＴｙｐｅ→０」にして、全て排除した。つまり、解析に使用しないポジティブコントロール、ネガティブコントロールを排除し、解析に使用するデータのみを表示した。
なお、ｇＩｓＦｅａｔＮｏｎＵｎｉｆＯＬ（Ｇｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ（Ｃｙ３）のフィーチャーに対するＮｏｎ Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ Ｏｕｔｌｉｅｒ）、ｇＩｓＦｅａｔＰｏｐｎＯＬ（Ｇｒｅｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌ（Ｃｙ３）のフィーチャーに対するＰｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｏｕｔｌｉｅｒ）のフラグは排除し、また、バックグラウンドより充分にシグナルの高いフィーチャーを集めるために、バックグラウンド±１３ｘＳＤよりも低いシグナルフィーチャーを排除した。Ｐ値（Ｐ ｖａｌｕｅ）は０．０１以下、つまり９９％の信頼性をもって対照サンプルとの発現差があると判定されたフィーチャーのみを表示した。
[Example 3] (microarray analysis)
In the same manner as in Example 1, rats were bred to obtain 5 rats that were stressed by wire netting and 5 rats that were raised on the floor. Blood samples were collected on the seventh day of breeding on a wire mesh or flooring.
In the same manner as in Example 2, total RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen) in accordance with the attached instructions (total RNA samples derived from each blood sample, stress loaded sample, control sample) That said.)
Next, DNA microarray analysis was performed.
cDNA synthesis, cRNA labeling and propagation were performed using Low Input Quick Amp labeling Kit (manufactured by Agilent Technologies).
First, 25 ng of total RNA and 1.8 μL of T7 promoter primer were added, and Nuclease free water was added so that the total was 3.3 μL. Spike-A of RNA Spike In Kit (for 2 colors) was added to a control sample labeled with Cy3, and 2 μL of Spike-B was added to a stress-loaded sample labeled with Cy5. After incubation at 65 ° C. for 10 minutes, the mixture was placed on ice for 5 minutes and heat denatured. 4.7 μl of cDNA master mix (5 × First Strand Buffer 2.0 μL, 0.1 M DTT 1.0 μL, 10 mM dNTP mix 0.5 μL, Affinity Script 1.2 μL) was added to the heat-denatured RNA and incubated at 40 ° C. for 2 hours. . The tube was removed from the water bath and incubated at 70 ° C. for 15 minutes to stop the reaction, and then cooled on ice for 5 minutes.
Cyanine3 Transcription mix was added to each reaction tube as a control sample, and Cyanine5 Transcription mix as a stress loaded sample. As a transcription master mix, Nuclease free water 0.75 μL, 5 × Transscript buffer 3.2 μL, 0.1 M DTT 0.6 μL, NTP mix 1.0 μL, T7 RNA polymerase mix 0.21 μL, Cy4 0.25 μL Used as the required amount of reaction (Ttotal 6.0 μL). Incubation was carried out for 2 hours in a water bath at 40 ° C. while shielding from light.
Next, labeled cRNA was prepared using RNeasy mini spin columnus (Qiagen).
Nuclease free water 84 μL, RLT buffer 350 μL, and ethanol 250 μL were sequentially added to the reaction tube. 700 μL of cRNA sample was transferred to the column and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute. The flow-through was transferred to another tube and the column was returned to the collection tube. 500 μL of RPE Buffer was added and centrifuged at 13000 rpm for 1 minute. The flow-through was transferred to another tube and the column was returned to the collection tube. 500 μL of RPE Buffer was added and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute. The column was transferred to a 1.5 mL tube. 30 μL of Nuclease free water was added and allowed to stand for 1 minute. Elution was performed by centrifugation at 13,000 rpm for 1 minute.
Next, the concentration of the eluted cRNA in the solution state was measured with a spectrophotometer, and the cRNA target solution was adjusted so as to have the following solution amount.
A 2 × cRNA target solution was prepared as follows. The amount of reaction per tube is shown.
Cyanine3 labeled cRNA 0.825 μg
Cyanine5 labeled cRNA 0.825 μg
10xBlocking agent 11.0μL
Nuclease free water
Total 52.8 μL
2.2 μL of 25 × fragmentation buffer was added to 52.8 μL of 2 × cRNA target solution, and incubated in a 60 ° C. water bath for 30 minutes.
To stop fragmentation, 55 μL of 2 × hybridization buffer was added.
100 μL was applied to Microarray (Rat GE 4 × 44k v3 2color, manufactured by Agilent Technologies), and hybridization was performed at 65 ° C. for about 17 hours with stirring in a hybridization oven.
Washing was performed with Agilent gene expression wash buffer 1 at room temperature for 1 minute. Washing was performed for 1 minute with Agilent gene expression washing buffer 2 at 37 ° C. The slide was pulled up and air-dried. After drying, it was scanned at a resolution of 5 μm using an Agilent technologies microarray scanner.
Next, in order to select the fluctuating gene, the numerical raw data output from the microarray scanner was analyzed by Excel.
All Control features were excluded by setting “ControlType → 0”. That is, the positive control and negative control that are not used for analysis were excluded, and only the data used for analysis was displayed.
The flag of gIsFatNonUnifOL (Non Uniformity Operator for the feature of Green Channel (Cy3)), the gIsFatPopOLOL (Population Outlier for the feature of Green Channel (Cy3)) is excluded from the feature, and the background of the feature is higher than the feature. In addition, signal features lower than background ± 13 × SD were excluded. Only features that were determined to have an expression difference from the control sample with a P value of 0.01 or less, ie 99% confidence, were displayed.
Ｐ値はいずれも１０Ｅ−２未満であり、Retnlg遺伝子、Csta遺伝子、Il1b遺伝子、Camp遺伝子、Ifitm6遺伝子、Ifit1lb遺伝子、Fcar遺伝子、Pglyrp1遺伝子、Mmp8遺伝子、Schip1遺伝子、Mycbpap遺伝子、Aqp9遺伝子、Ldhc遺伝子、Degs2遺伝子、Oas3遺伝子、Slc22a4遺伝子、Slc38a5遺伝子、Slc43a3遺伝子、Rsad2遺伝子、Slc4a1遺伝子、Wfdc15b遺伝子、Plekhb1遺伝子、Cd52遺伝子、Anxa1遺伝子、Rhd遺伝子、Nrtn遺伝子、Alox15遺伝子、Scube1遺伝子、Ube2c遺伝子、Mrgprx3遺伝子、Steap4遺伝子、Selenbp1遺伝子、Rrm2遺伝子、S100a8遺伝子、Cfd遺伝子、Tuba3b遺伝子、Slpi遺伝子、Padi4遺伝子、Fech遺伝子、Bpgm遺伝子、Nlrp12遺伝子、Csf3r遺伝子、Osgin1遺伝子、Mogat2遺伝子、Alpl遺伝子、Csf1遺伝子、Klra2遺伝子、Cdr2遺伝子、Kcnq2遺伝子、Prp15遺伝子、Clec4e遺伝子、Dusp13遺伝子、Gpr77遺伝子、Znf532遺伝子、Oas1k遺伝子、Per2遺伝子、Upp1遺伝子、Oas1a遺伝子、Pth遺伝子、Lrg1遺伝子、Dnase2b遺伝子、Vegfa遺伝子、Hdc遺伝子、Egr1遺伝子、Clec4d遺伝子、Alox5遺伝子、Car2遺伝子、Il1r2遺伝子、Il8rb遺伝子、Pla2g7遺伝子、Dgat2遺伝子、Mcpt10遺伝子、Mcpt8遺伝子、Mcpt8l2遺伝子、Mcpt8l3遺伝子、S100a9遺伝子、Rab32遺伝子、Emb遺伝子、Fetub遺伝子、Scgb3a1遺伝子、Nlrp3遺伝子、TC646750遺伝子、ENSRNOT00000065312遺伝子、ENSRNOT00000040211遺伝子、ENSRNOT00000056434遺伝子、RGD1311874遺伝子、MGC72973遺伝子、TC587327遺伝子、LOC688574遺伝子、TC603221遺伝子、RGD1565432遺伝子、RGD1565374遺伝子、RGD1565161遺伝子、RGD1565983遺伝子、RGD1310507遺伝子、LOC690116遺伝子、LOC691993遺伝子、LOC689064遺伝子、CF109441遺伝子、A_64_P154430遺伝子、A_64_P138390遺伝子、A_64_P050137遺伝子、ENSRNOT00000035459遺伝子、Tspan8遺伝子、Mmp9遺伝子、Add2遺伝子、Eraf遺伝子、Aqp1遺伝子、Alas2遺伝子、Hbb遺伝子、およびHba-a2遺伝子において、ストレス負荷ラットにおける発現量が有意に増加していた。 P values are all less than 10E-2, Retnlg gene, Csta gene, Il1b gene, Camp gene, Ifitm6 gene, Ifit1lb gene, Fcar gene, Pglyrp1 gene, Mmp8 gene, Schip1 gene, Mycbpap gene, Aqp9 gene, Ldhc gene , Degs2 gene, Oas3 gene, Slc22a4 gene, Slc38a5 gene, Slc43a3 gene, Rsad2 gene, Slc4a1 gene, Wfdc15b gene, Plekhb1 gene, Cd52 gene, Anxa1 gene, Rhd gene, Nrtn gene, Alox15 gene, Uprc gene, Ubec gene Gene, Steap4 gene, Selenbp1 gene, Rrm2 gene, S100a8 gene, Cfd gene, Tuba3b gene, Slpi gene, Padi4 gene, Fech gene, Bpgm gene, Nlrp12 gene, Csf3r gene, Osgin1 gene, Mogat2 gene, Alpl gene, Csf1 gene, Klra2 gene, Cdr2 gene, Kcnq2 gene, Prp15 gene, Clec4e gene, Dusp13 gene, Gpr77 gene, Znf532 gene, Oas1k gene , Per2 gene, Upp1 gene, Oas1a gene, Pth gene, Lrg1 gene, Dnase2b gene, Vegfa gene, Hdc gene, Egr1 gene, Clec4d gene, Alox5 gene, Car2 gene, Il1r2 gene, Il8rb gene, Pla2g7 gene, Dgat2 gene, Mcpt10 Gene, Mcpt8 gene, Mcpt8l2 gene, Mcpt8l3 gene, S100a9 gene, Rab32 gene, Emb gene, Fetub gene, Scgb3a1 gene, Nlrp3 gene, TC646750 gene, ENSRNOT00000065312 gene, ENSRNOT00000040211 gene, ENSRNOT00000056434 gene, RGD731173 gene LOC688574 gene, TC603221 gene, RGD1565432 gene, RGD1565374 gene, RGD1565161 gene, RGD1565981 gene, RGD13598507 gene, LOC690116 gene, LOC691993 gene, LOC689064 gene, CF109441 gene, A_64_P154430 gene, A_64_P138390 gene, A_64_P050137 gene, ENSRmpgene gene, ENSRmpgene , Add2 heredity , Eraf gene, AQP1 gene, ALAS2 gene, Hbb gene, and in Hba-a2 gene expression level in stress rats was significantly increased.
５シリーズ全てにおいて発現上昇していた遺伝子は、Retnlg遺伝子、Csta遺伝子、Il1b遺伝子、Camp遺伝子、Ifitm6遺伝子、Ifit1lb遺伝子、Fcar遺伝子、Pglyrp1遺伝子、Mmp8遺伝子、TC646750遺伝子、ENSRNOT00000065312遺伝子、ENSRNOT00000040211遺伝子、ENSRNOT00000056434遺伝子、Tspan8遺伝子、およびMmp9遺伝子であった。
表５および表６にマイクロアレイ解析における測定結果の一部を例示として示す。マイクロアレイ解析においては、表１および表２において、changes in transcript levelとして、測定値の平均値としても記載しているが、かかる数値は、以下のようにして求めた値である。
Tspan8を例にかかる数値の計算方法を示すと、表５および表６に示されるように、Tspan8遺伝子の発現量の変化は、Feature Numberとして示す、25273、36630、16892、・・・のデータとして各々サンプル数に応じて測定される。
そして、まず、各サンプル毎の平均値を取る。すなわち、Tspan8のSample1のデータとしては、Tspan8のFeature Numberが25273、36630、16892、・・・であるSample1のデータの平均値を取っている。そうすることにより、Tspan8の測定結果として、Sample1〜Sample5までの各平均値としての、遺伝子発現量の変化が確認される。
ここで、Sample1〜Sample5までの全ての各平均値において、発現上昇が確認できた遺伝子が、上記５シリーズ全てにおいて発現上昇していた遺伝子である。
そして、Sample1〜Sample5として得られた遺伝子発現量の変化を総平均値として求めた値が、上記表１および表２におけるchanges in transcript levelとして示されているものである。
The genes that had increased expression in all 5 series were Retnlg gene, Csta gene, Il1b gene, Camp gene, Ifitm6 gene, Ifit1lb gene, Fcar gene, Pglyrp1 gene, Mmp8 gene, TC646750 gene, ENSRNOT00000065312 gene, ENSRNOT00000040211 gene, ENSRNOT00000056434 gene , Tspan8 gene, and Mmp9 gene.
Tables 5 and 6 show some of the measurement results in the microarray analysis as examples. In microarray analysis, in Tables 1 and 2, the changes in transcript level is also described as the average value of the measured values, but such numerical values are obtained as follows.
As shown in Tables 5 and 6, when the calculation method of numerical values according to Tspan8 is shown, the change in the expression level of Tspan8 gene is expressed as 25273, 36630, 16892,. Each is measured according to the number of samples.
First, an average value for each sample is taken. That is, as the data of Sample 1 of Tspan 8, the average value of the data of Sample 1 whose Tspan 8 Feature Number is 25273, 36630, 16892,. By doing so, the change of gene expression level as each average value from Sample 1 to Sample 5 is confirmed as the measurement result of Tspan8.
Here, in each of the average values from Sample 1 to Sample 5, the genes whose increased expression was confirmed are the genes whose expression was increased in all the above 5 series.
And the value which calculated | required as a total average value the change of the gene expression level obtained as Sample1-Sample5 is shown as said changes in transcript level in Table 1 and Table 2.
４シリーズにおいて発現上昇していた遺伝子は、Schip1遺伝子、Mycbpap遺伝子、Aqp9遺伝子、Ldhc遺伝子、Degs2遺伝子、Oas3遺伝子、Slc22a4遺伝子、Slc38a5遺伝子、Slc43a3遺伝子、Rsad2遺伝子、Slc4a1遺伝子、Wfdc15b遺伝子、Plekhb1遺伝子、Cd52遺伝子、Anxa1遺伝子、Rhd遺伝子、Nrtn遺伝子、Alox15遺伝子、Scube1遺伝子、Ube2c遺伝子、Mrgprx3遺伝子、Steap4遺伝子、Selenbp1遺伝子、Rrm2遺伝子、S100a8遺伝子、Cfd遺伝子、Tuba3b遺伝子、Slpi遺伝子、Padi4遺伝子、Fech遺伝子、Bpgm遺伝子、Nlrp12遺伝子、Csf3r遺伝子、Osgin1遺伝子、RGD1311874遺伝子、MGC72973遺伝子、TC587327遺伝子、LOC688574遺伝子、Add2遺伝子、Eraf遺伝子、Aqp1遺伝子、Alas2遺伝子、およびHbb遺伝子であった。 The genes that had increased expression in the 4 series are Schip1, Mycbpap, Aqp9, Ldhc, Degs2, Oas3, Slc22a4, Slc38a5, Slc43a3, Rsad2, Slc4a1, Wfdc15b, Plekhb1, Cd52 gene, Anxa1 gene, Rhd gene, Nrtn gene, Alox15 gene, Scube1 gene, Ube2c gene, Mrgprx3 gene, Steap4 gene, Selenbp1 gene, Rrm2 gene, S100a8 gene, Cfd gene, Tuba3b gene, Slpi gene, Padi4 gene, Fech gene Bpgm gene, Nlrp12 gene, Csf3r gene, Osgin1 gene, RGD1311874 gene, MGC72973 gene, TC587327 gene, LOC688574 gene, Add2 gene, Eraf gene, Aqp1 gene, Alas2 gene, and Hbb gene.
３シリーズにおいて発現上昇していた遺伝子は、Mogat2遺伝子、Alpl遺伝子、Csf1遺伝子、Klra2遺伝子、Cdr2遺伝子、Kcnq2遺伝子、Prp15遺伝子、Clec4e遺伝子、Dusp13遺伝子、Fcar遺伝子、Gpr77遺伝子、Znf532遺伝子、Oas1k遺伝子、Per2遺伝子、Upp1遺伝子、Oas1a遺伝子、Pth遺伝子、Lrg1遺伝子、Dnase2b遺伝子、Vegfa遺伝子、Hdc遺伝子、Egr1遺伝子、Clec4d遺伝子、Alox5遺伝子、Car2遺伝子、Il1r2遺伝子、Il8rb遺伝子、Pla2g7遺伝子、Bpgm遺伝子、Dgat2遺伝子、Mcpt10遺伝子、Mcpt8遺伝子、Mcpt8l2遺伝子、Mcpt8l3遺伝子、S100a9遺伝子、Rab32遺伝子、Emb遺伝子、Fetub遺伝子、Scgb3a1遺伝子、Nlrp3遺伝子、TC603221遺伝子、RGD1565432遺伝子、RGD1565374遺伝子、RGD1565161遺伝子、RGD1565983遺伝子、RGD1310507遺伝子、LOC690116遺伝子、LOC691993遺伝子、LOC689064遺伝子、CF109441遺伝子、A_64_P154430遺伝子、A_64_P138390遺伝子、A_64_P050137遺伝子、ENSRNOT00000035459遺伝子、およびHba-a2遺伝子であった。 The genes that were up-regulated in the 3 series were: Mogat2 gene, Alpl gene, Csf1 gene, Klra2 gene, Cdr2 gene, Kcnq2 gene, Prp15 gene, Clec4e gene, Dusp13 gene, Fcar gene, Gpr77 gene, Znf532 gene, Oas1k gene, Per2 gene, Upp1 gene, Oas1a gene, Pth gene, Lrg1 gene, Dnase2b gene, Vegfa gene, Hdc gene, Egr1 gene, Clec4d gene, Alox5 gene, Car2 gene, Il1r2 gene, Il8rb gene, Pla2g7 gene, Bpgm gene, Dgat2 gene , Mcpt10 gene, Mcpt8 gene, Mcpt8l2 gene, Mcpt8l3 gene, S100a9 gene, Rab32 gene, Emb gene, Fetub gene, Scgb3a1 gene, Nlrp3 gene, TC603221 gene, RGD1565432 gene, RGD1565374 gene, RGD15651610 gene, RGD15613 Gene, LOC691993 gene, LOC689064 gene, CF109441 gene, A_64_P154430 gene, A_64_P138390 Child, A_64_P050137 gene was ENSRNOT00000035459 gene, and Hba-a2 gene.
［実施例４］
１１１種の遺伝子の中から、無作為に、Tspan8、Mmp9、Add2、Eraf、Aqp1、Hba-a2、Hbb、およびAlas2の８種類の遺伝子を選択した。
実施例１と同様にして作成したストレス負荷ラットの血液サンプル中の、遺伝子発現量をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置（登録商標、ロシュ製）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして表２に示すようにプライマーを、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から対象遺伝子のＤＮＡ情報を取得した後、プライマーデザインソフト「Ｐｒｉｍｅｒ３」（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）にＤＮＡ情報をアプライし、いくつか候補となるプライマーセットを選択し、そのうちから、対象遺伝子のイントロンを挟むようにプライマーセットを設計した。
From 111 genes, 8 genes, Tspan8, Mmp9, Add2, Eraf, Aqp1, Hba-a2, Hbb, and Alas2 were randomly selected.
The gene expression level in a blood sample of a stress-loaded rat prepared in the same manner as in Example 1 was measured by RT-PCR using a LightCycler 480 apparatus (registered trademark, manufactured by Roche).
As primers for RT-PCR, as shown in Table 2, after obtaining DNA information of the target gene from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), primer design software “Primer3” ( DNA information was applied to http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), several candidate primer sets were selected, and from these, primer sets were designed so as to sandwich the intron of the target gene.
対照サンプルおよびストレス負荷サンプルをそれぞれ５匹測定し、平均値をとりｍＲＮＡの相対定量法により遺伝子発現量を比較した（図４参照）。図４において、左側のカラム（ｗ）は、床敷飼育でのラット（対照サンプル）の結果であり、該発現量を１としたときの、右側のカラム（ｓ）には、金網飼育でのラット（ストレス負荷サンプル）における相対発現量を示す。 Five control samples and five stress-loaded samples were measured, and the average values were taken and the gene expression levels were compared by the relative quantification method of mRNA (see FIG. 4). In FIG. 4, the left column (w) is the result of the rat (control sample) in bedding breeding, and when the expression level is 1, the right column (s) is in the wire mesh breeding. The relative expression level in a rat (stress load sample) is shown.
本発明は、ストレス評価を行うことで、当該評価結果をうつ病の診断等に用いることが出来るという産業上の利用可能性を有する。また、うつ病の早期発見を行うことが出来ると考えられる点で、産業上の利用可能性を有する。また、ストレス評価を行うことができる新規なストレスマーカーにより、人や動物のストレスの評価を的確に行うことが出来ると考えられる点で、産業上の利用可能性を有する。また、ストレス負荷モデル動物を作成することにより、人や動物の抗うつ薬等を作成することが出来る可能性があると考えられる点で、産業上の利用可能性を有する。 The present invention has industrial applicability that the evaluation result can be used for diagnosis of depression and the like by performing stress evaluation. In addition, it has industrial applicability in that it is considered that early detection of depression can be performed. Further, the present invention has industrial applicability in that it is considered that the stress of humans and animals can be accurately evaluated by a novel stress marker capable of performing stress evaluation. Moreover, it has industrial applicability in that it is considered that by creating a stress-bearing model animal, it may be possible to create an antidepressant for humans and animals.
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