JP6004318B2 - Antiallergic agent - Google Patents
Antiallergic agent Download PDFInfo
- Publication number
- JP6004318B2 JP6004318B2 JP2012084852A JP2012084852A JP6004318B2 JP 6004318 B2 JP6004318 B2 JP 6004318B2 JP 2012084852 A JP2012084852 A JP 2012084852A JP 2012084852 A JP2012084852 A JP 2012084852A JP 6004318 B2 JP6004318 B2 JP 6004318B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- present
- shows
- activity
- antiallergic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
本発明は、抗アレルギー剤に関する。 The present invention relates to an antiallergic agent.
アレルギーに苦しむ患者は、世界的に増加の傾向にある。その症状は、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、食物アレルギー等、多岐にわたっている。アレルギー反応は、（１）感作、（２）脱顆粒、（３）免疫反応の３つの遷延化のステージからなる。感作状態とは、免疫系が、生体が将来同じアレルゲンに接触したときに即座に反応できるように準備している状態のことである。感作の過程は、マクロファージがアレルゲンを食して断片にまで裁断し、それらの断片をＴリンパ球に提示することから始まる。引き続いて起こる過程は、Ｔ細胞がインターロイキン４を分泌し、Ｂ細胞が形質細胞に成熟する過程である。形質細胞は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）として知られるアレルゲン特異的な分子を作り出す。こうして作られたＩｇＥという抗体は、組織中の肥満（マスト）細胞又は血液中の好塩基球の表面にあるレセプターと結合する。感作後にアレルゲンが生体と接触すると、アレルゲンは肥満細胞の表面でＩｇＥと直ちに結合する。１個のアレルゲン分子が細胞表面上の２個のＩｇＥ分子と結合すると、ＩｇＥ分子と結合しているレセプター同士が会合し、その結果、細胞膜内の幾種類もの酵素が直接的、間接的に活性化する。活性化するのはチロシンキナーゼ、フォスフォリパーゼＣ、プロテインキナーゼＣ及びカルシウムイオンで、これらは情報の流れを作り、顆粒から化学伝達物質を放出させる（脱顆粒）。この情報の流れは、サイトカインとして知られる化学物質の生合成と分泌も促進させる。分子の相互作用に基づいた情報の流れは他にもあり、プロスタグランジン又はロイコトリエンといった脂質由来メディエーター（伝達物質）の分泌につながる。肥満細胞から放出される様々な化学物質は、多くのアレルギー症状の原因となる。炎症組織内の活性化肥満細胞又はその近くに位置する他の細胞から化学伝達物質が放出されると、好塩基球又は抗酸球等の細胞は血管を通り抜け、その炎症組織へと遊走する。これらの細胞の遊走が容易になるのは、放出された化学伝達物質が末梢血管中の細胞又は血管内皮の細胞にくっついている接着分子の発現又は結合活性を促進するからである。血液中の細胞は、血管内皮細胞に接着し、それらの細胞に沿って回転し、さらにそれらの細胞の間隙を通過して周りの細胞へと潜り込む。そして、自ら化学伝達物質を放出する。この化学伝達物質は、免疫活性を維持したり、組織を傷害したりする。 The number of patients suffering from allergies is increasing worldwide. Symptoms range from allergic rhinitis, bronchial asthma, food allergies and the like. An allergic reaction consists of three protracted stages: (1) sensitization, (2) degranulation, and (3) immune response. A sensitized state is a state in which the immune system is ready to react immediately when a living body contacts the same allergen in the future. The sensitization process begins with macrophages eating allergens and cutting them into fragments and presenting these fragments to T lymphocytes. The subsequent process is a process in which T cells secrete interleukin 4 and B cells mature into plasma cells. Plasma cells create an allergen-specific molecule known as immunoglobulin E (IgE). The antibody IgE thus produced binds to a receptor on the surface of mast cells in tissues or basophils in blood. When the allergen comes into contact with the body after sensitization, the allergen immediately binds to IgE on the surface of the mast cells. When one allergen molecule binds to two IgE molecules on the cell surface, receptors bound to the IgE molecule associate with each other, and as a result, several kinds of enzymes in the cell membrane are directly and indirectly activated. Turn into. It is activated by tyrosine kinases, phospholipase C, protein kinase C and calcium ions, which create a flow of information and release chemical mediators from the granules (degranulation). This flow of information also promotes biosynthesis and secretion of chemicals known as cytokines. There are other information flows based on molecular interactions, leading to the secretion of lipid-derived mediators (transmitters) such as prostaglandins or leukotrienes. Various chemical substances released from mast cells cause many allergic symptoms. When chemical mediators are released from activated mast cells in the inflamed tissue or from other cells located nearby, cells such as basophils or acidophils migrate through the blood vessels and migrate to the inflamed tissue. The migration of these cells is facilitated because the released chemical mediator promotes the expression or binding activity of adhesion molecules attached to cells in peripheral blood vessels or vascular endothelium. Cells in the blood adhere to vascular endothelial cells, rotate along these cells, and further pass through the gaps between the cells and sink into surrounding cells. And it releases its own chemical transmitter. This chemical messenger maintains immune activity and damages tissues.
前述のアレルギー症状の治療薬として、植物抽出物、例えば、南天実又はオリーブ等の抽出物を含む抗アレルギー剤が提案されている（例えば、特許文献１及び２）。これらの抗アレルギー剤は、食用植物を原料としているため、安全性が高い。しかしながら、従来の抗アレルギー剤は、効果が不十分なことがあるため、さらに有効な抗アレルギー剤の研究が続けられている。 As a therapeutic agent for the above-mentioned allergic symptoms, an antiallergic agent containing a plant extract, for example, an extract such as Nanten or Olive has been proposed (for example, Patent Documents 1 and 2). Since these antiallergic agents are made from edible plants, they are highly safe. However, since conventional antiallergic agents may have insufficient effects, research on more effective antiallergic agents continues.
そこで、本発明は、安全性が高く、従来のものよりさらにアレルギー症状の抑制効果に優れた抗アレルギー剤を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide an antiallergic agent that has high safety and is more effective in suppressing allergic symptoms than conventional ones.
前記目的を達成するために、本発明の抗アレルギー剤は、下記化学式（１）で表わされる化合物、下記化学式（２）で表わされる化合物、下記化学式（３）で表わされる化合物及び下記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩を含むことを特徴とする。
Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ１１は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ１３は、ヒドロキシ基、アルコキシ基又はオキソ基であり、
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ１５、及びＲ１６は同一でも異なっていてもよく、
Ｌは、単結合であるか、又は存在せず、
Ｌが単結合の場合、Ｒ１４は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ１７（Ｒ１７は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
Ｌが存在しない場合、Ｒ１４は、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アリールオキシ基又はアリールアルキルオキシ基であり、
Ｚ１は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ１８（Ｒ１８は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
ｍ及びｎは、それぞれ、正の整数である。
Ｒ２１は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ２１は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ２２は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ２２は同一でも異なっていてもよく、
ｐは、正の整数である。
Ｒ３１〜Ｒ３７は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ３１、２つのＲ３２、及びＲ３３〜Ｒ３７は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ３８〜Ｒ４０は、それぞれ、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ３８、３つのＲ３９、及びＲ４０は同一でも異なっていてもよく、
Ｚ２〜Ｚ４は、それぞれ、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ４１（Ｒ４１は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、同一でも異なっていてもよく、
ｓは、正の整数である。
Ｒ４２は、水素原子、アルキル基、アシル基、アリール基又はアラルキル基であり、２つのＲ４２は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ４３は、水素原子又はアルキル基であり、
Ｒ４４は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基であり、３つのＲ４４は同一でも異なっていてもよく、
Ｚ５は、酸素原子、硫黄原子又はＮ−Ｒ４５（Ｒ４５は、水素原子、アルキル基、アリール基又はハロゲン基）であり、
ｔ及びｕは、それぞれ、正の整数である。
In order to achieve the above object, the antiallergic agent of the present invention comprises a compound represented by the following chemical formula (1), a compound represented by the following chemical formula (2), a compound represented by the following chemical formula (3), and the following chemical formula (4 ), At least one compound selected from the group consisting of compounds represented by formula (1), a tautomer or stereoisomer thereof, or a salt thereof.
R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an aryl group or an aralkyl group, and two R 11 may be the same or different,
R 12 is a hydrogen atom or an alkyl group,
R 13 is a hydroxy group, an alkoxy group or an oxo group,
R 15 and R 16 are each a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group, and three R 15 and R 16 may be the same or different,
L is a single bond or absent,
When L is a single bond, R 14 is an oxygen atom, a sulfur atom or N—R 17 (R 17 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group),
When L is absent, R 14 is a hydroxy group, an alkoxy group, an acyloxy group, an aryloxy group or an arylalkyloxy group;
Z 1 is an oxygen atom, a sulfur atom or N—R 18 (R 18 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group),
m and n are each a positive integer.
R 21 is a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an aryl group or an aralkyl group, and two R 21 may be the same or different,
R 22 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group, and three R 22 may be the same or different,
p is a positive integer.
R 31 to R 37 are each a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an aryl group or an aralkyl group, and two R 31 , two R 32 , and R 33 to R 37 may be the same or different. ,
R 38 to R 40 are each a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, or a halogen group, and three R 38 , three R 39 , and R 40 may be the same or different,
Z 2 to Z 4 are each an oxygen atom, a sulfur atom or N—R 41 (R 41 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group), and may be the same or different,
s is a positive integer.
R 42 is a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an aryl group or an aralkyl group, and two R 42 may be the same or different,
R 43 is a hydrogen atom or an alkyl group,
R 44 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group, and three R 44 may be the same or different,
Z 5 is an oxygen atom, a sulfur atom or N—R 45 (R 45 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a halogen group),
t and u are each a positive integer.
本発明者らは、アレルギー症状を抑えるためには、前述の脱顆粒を阻害することが必要であるとの考えのもと、研究を行った。脱顆粒反応を抑制することができれば、ヒスタミン等の化学伝達物質を肥満細胞中に封じ込めることができ、アレルギー症状を抑えることができる。研究の結果、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物が、脱顆粒反応を抑制することを見出し、本発明に想到した。これらの４つの化合物は、例えば、後述のように、食用オリーブから抽出されるものであり、安全性が高い。 The present inventors conducted research based on the idea that it is necessary to inhibit the aforementioned degranulation in order to suppress allergic symptoms. If the degranulation reaction can be suppressed, chemical mediators such as histamine can be contained in mast cells, and allergic symptoms can be suppressed. As a result of the research, the compound represented by the chemical formula (1), the compound represented by the chemical formula (2), the compound represented by the chemical formula (3) and the compound represented by the chemical formula (4) inhibit the degranulation reaction. As a result, the present invention has been conceived. These four compounds are extracted from edible olives, for example, as described later, and have high safety.
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（１）で表わされる化合物が、下記化学式（１−１）で表わされる化合物（Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ）であることが好ましい。
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（２）で表わされる化合物が、下記化学式（２−１）で表わされる化合物（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ）であることが好ましい。
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（３）で表わされる化合物が、下記化学式（３−１）で表わされる化合物（Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ）であることが好ましい。
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（４）で表わされる化合物が、下記化学式（４−１）で表わされる化合物（３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ）であることが好ましい。
本発明の抗アレルギー剤において、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩が、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ）由来であることが好ましい。食用に適するオリーブ由来であれば、より安全性が高い。 In the antiallergic agent of the present invention, a group consisting of the compound represented by the chemical formula (1), the compound represented by the chemical formula (2), the compound represented by the chemical formula (3), and the compound represented by the chemical formula (4). It is preferable that at least one compound selected from the above, a tautomer or stereoisomer thereof, or a salt thereof is derived from olive (Olea europea). If it is derived from edible olives, it is safer.
本発明の抗アレルギー剤は、オリーブ残渣（以下、「ポメス」と言う。）由来であることがより好ましい。ポメスとは、オリーブ果実からオリーブ果汁液及びオリーブオイルを圧搾したのちの搾りかすを意味する。これまで産業廃棄物として処理されてきたポメスを用いることで、未利用資源の有効活用につながる。 The antiallergic agent of the present invention is more preferably derived from olive residue (hereinafter referred to as “Pomez”). Pomez means a pomace after squeezing olive juice and olive oil from olive fruit. Using Pomez, which has been treated as industrial waste, leads to effective utilization of unused resources.
本発明の抗アレルギー剤において、前記オリーブは、ミッション種、マンザニロ種及びルッカ種からなる群から選択される少なくとも一種であることがさらに好ましい。 In the antiallergic agent of the present invention, the olive is more preferably at least one selected from the group consisting of mission species, manzanillo species and Lucca species.
本発明において、アレルギー（アレルギー性疾患）としては、特に制限されないが、例えば、Ｉ型アレルギー性疾患、ＩＩ型アレルギー性疾患、ＩＩＩ型アレルギー性疾患、ＩＶ型アレルギー性疾患、Ｖ型アレルギー性疾患等があげられ、好ましくは、Ｉ型アレルギー性疾患である。前記Ｉ型アレルギー性疾患としては、特に制限されないが、具体的には、例えば、蕁麻疹、花粉症、喘息、ＰＩＥ症候群、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシー等があげられる。 In the present invention, the allergy (allergic disease) is not particularly limited, and examples thereof include type I allergic disease, type II allergic disease, type III allergic disease, type IV allergic disease, type V allergic disease and the like. Preferably, it is a type I allergic disease. The type I allergic disease is not particularly limited. Specifically, for example, urticaria, hay fever, asthma, PIE syndrome, atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, food allergy, drug allergy And anaphylaxis.
本発明において、アルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基等があげられ、アルコキシ基、アリールアルキルオキシ基等のアルキル基を構造中に含む基においても同様である。本発明において、前記アルキル基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルキル基における置換基としては、特に制限されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。 In the present invention, the alkyl group is not particularly limited, and for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, an n- Examples thereof include a pentyl group, an isopentyl group, a neopentyl group, a tert-pentyl group and the like, and the same applies to a group containing an alkyl group such as an alkoxy group or an arylalkyloxy group in the structure. In the present invention, for example, one or more hydrogen atoms of the alkyl group may be substituted with an arbitrary substituent. The substituent in the alkyl group is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a halogen group, an acyl group, an acyloxy group, an alkoxy group, and a carbamoyl group.
本発明において、アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、シクロヘキサノイル基、ベンゾイル基、エトキシカルボニル基等があげられ、アシル基を構造中に含む基（アシルオキシ基等）においても同様である。 In the present invention, the acyl group is not particularly limited. For example, formyl group, acetyl group, propionyl group, isobutyryl group, valeryl group, isovaleryl group, pivaloyl group, hexanoyl group, cyclohexanoyl group, benzoyl group, ethoxycarbonyl The same applies to groups containing an acyl group in the structure (such as an acyloxy group).
本発明において、アリール基としては、特に限定されないが、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、ピリジン環、チオフェン環、ピレン環等の任意の芳香環又は複素芳香環から誘導される基等があげられる。 In the present invention, the aryl group is not particularly limited. For example, the aryl group is derived from any aromatic ring or heteroaromatic ring such as benzene ring, naphthalene ring, anthracene ring, phenanthrene ring, pyridine ring, thiophene ring, and pyrene ring. Group and the like.
本発明において、アラルキル基としては、特に限定されないが、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ジフェニルメチル基、トリチル基等があげられる。 In the present invention, the aralkyl group is not particularly limited, and examples thereof include a benzyl group, a phenethyl group, a diphenylmethyl group, and a trityl group.
本発明において、アルコキシ基としては、特に限定されないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等があげられる。本発明において、前記アルコキシ基は、例えば、その一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アルコキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。 In the present invention, the alkoxy group is not particularly limited, and examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, and a butoxy group. In the present invention, for example, one or more hydrogen atoms of the alkoxy group may be substituted with an arbitrary substituent. The substituent in the alkoxy group is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a halogen group, an acyl group, an acyloxy group, an alkoxy group, and a carbamoyl group.
本発明において、ハロゲン基としては、特に限定されないが、例えば、フルオロ基（フッ素原子）、クロロ基（塩素原子）、ブロモ基（臭素原子）及びヨード基（ヨウ素原子）等があげられる。なお、前記ハロゲン基とは、置換基としてのハロゲン原子の名称である。 In the present invention, the halogen group is not particularly limited, and examples thereof include a fluoro group (fluorine atom), a chloro group (chlorine atom), a bromo group (bromine atom), and an iodo group (iodine atom). The halogen group is the name of a halogen atom as a substituent.
本発明において、アシルオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基、ブタノイルオキシ基、３−クロロブチリルオキシ基等があげられる。本発明において、前記アシルオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アシルオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。 In the present invention, the acyloxy group is not particularly limited, and examples thereof include an acetoxy group, a propionyloxy group, a butanoyloxy group, and a 3-chlorobutyryloxy group. In the present invention, in the acyloxy group, for example, one or more hydrogen atoms may be substituted with an arbitrary substituent. The substituent in the acyloxy group is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a halogen group, an acyl group, an acyloxy group, an alkoxy group, and a carbamoyl group.
本発明において、アリールオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、フェノキシ基等があげられる。前記アリールオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アリールオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。 In the present invention, the aryloxy group is not particularly limited, and examples thereof include a phenoxy group. In the aryloxy group, for example, one or more hydrogen atoms may be substituted with an arbitrary substituent. The substituent in the aryloxy group is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a halogen group, an acyl group, an acyloxy group, an alkoxy group, and a carbamoyl group.
本発明において、アリールアルキルオキシ基としては、特に限定されないが、例えば、ベンジルオキシ基等があげられる。前記アリールアルキルオキシ基は、例えば、一つ以上の水素原子が任意の置換基に置換されていてもよい。前記アリールアルキルオキシ基における置換基としては、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルバモイル基等があげられる。 In the present invention, the arylalkyloxy group is not particularly limited, and examples thereof include a benzyloxy group. In the arylalkyloxy group, for example, one or more hydrogen atoms may be substituted with an arbitrary substituent. The substituent in the arylalkyloxy group is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxy group, a halogen group, an acyl group, an acyloxy group, an alkoxy group, and a carbamoyl group.
前記化学式（１）において、ｍは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２であり、ｎは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、１である。前記化学式（２）において、ｐは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２である。前記化学式（３）において、ｓは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２である。前記化学式（４）において、ｔは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、２であり、ｕは、１から５までの整数であることが好ましく、特に好ましくは、１である。 In the chemical formula (1), m is preferably an integer from 1 to 5, particularly preferably 2, and n is preferably an integer from 1 to 5, particularly preferably 1. It is. In the chemical formula (2), p is preferably an integer of 1 to 5, particularly preferably 2. In the chemical formula (3), s is preferably an integer of 1 to 5, particularly preferably 2. In the chemical formula (4), t is preferably an integer of 1 to 5, particularly preferably 2, and u is preferably an integer of 1 to 5, particularly preferably 1 It is.
本発明の抗アレルギー剤は、前述のとおり、前記化学式（１）で表わされる化合物、前記化学式（２）で表わされる化合物、前記化学式（３）で表わされる化合物及び前記化学式（４）で表わされる化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、又はそれらの塩を含むことを特徴とする。本発明の抗アレルギー剤は、その機能を損なわない範囲で、これらの成分以外のその他の成分を含んでもよい。前記その他の成分としては、例えば、ビタミン、ミネラル、着色料、保存料等があげられる。 As described above, the antiallergic agent of the present invention is represented by the compound represented by the chemical formula (1), the compound represented by the chemical formula (2), the compound represented by the chemical formula (3), and the chemical formula (4). It includes at least one compound selected from the group consisting of compounds, tautomers or stereoisomers thereof, or salts thereof. The antiallergic agent of the present invention may contain other components other than these components as long as the function is not impaired. Examples of the other components include vitamins, minerals, coloring agents, preservatives and the like.
本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、特に限定されず、例えば、後述の実施例に記載の方法により、オリーブ果実からポメスメタノール抽出液乾固物を分離することで製造できる。ただし、実施例に記載の方法は例示に過ぎず、本発明の抗アレルギー剤の製造方法は、これに限定されない。 The method for producing the antiallergic agent of the present invention is not particularly limited. For example, the antiallergic agent can be produced by separating the dried Pomezethanol methanol extract from olive fruit by the method described in Examples below. However, the methods described in the examples are merely illustrative, and the method for producing the antiallergic agent of the present invention is not limited thereto.
本発明の抗アレルギー剤の投与対象は、特に限定されず、ヒト；サル、ウシ、ブタ、イヌ等の非ヒト哺乳類；ニワトリ等の鳥類；魚介類等があげられる。投与方法は、特に限定されず、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。本発明の抗アレルギー剤の投与量は、特に限定されず、例えば、動物種、年齢等に応じて適宜設定できる。本発明の抗アレルギー剤をヒト成人に投与する場合、１日あたりの投与量は、本発明の抗アレルギー剤に含まれる抗アレルギー活性成分量として、例えば、０．１ｍｇ／５０ｋｇ〜１００ｍｇ／５０ｋｇであり、好ましくは、１ｍｇ／５０ｋｇ〜５０ｍｇ／５０ｋｇであり、より好ましくは、１０ｍｇ／５０ｋｇ〜２０ｍｇ／５０ｋｇである。 The administration target of the antiallergic agent of the present invention is not particularly limited, and examples include humans; non-human mammals such as monkeys, cows, pigs, and dogs; birds such as chickens; The administration method is not particularly limited, and for example, oral administration or parenteral administration may be used. Examples of the parenteral administration include intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, intraperitoneal administration, and local administration. The dose of the antiallergic agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, animal species, age and the like. When the antiallergic agent of the present invention is administered to a human adult, the daily dose is, for example, 0.1 mg / 50 kg to 100 mg / 50 kg as the amount of the antiallergic active ingredient contained in the antiallergic agent of the present invention. Yes, preferably 1 mg / 50 kg to 50 mg / 50 kg, more preferably 10 mg / 50 kg to 20 mg / 50 kg.
本発明の抗アレルギー剤の剤型は、特に限定されず、用途に応じて適宜決定できる。本発明の抗アレルギー剤を経口投与する場合、その剤型は、例えば、固体状又は液体状の経口製剤があげられ、具体的には、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、トローチ剤、液剤等があげられる。本発明の抗アレルギー剤を非経口投与する場合、その剤型は、例えば、注射用製剤、点滴製剤等の非経口製剤があげられる。本発明の抗アレルギー剤は、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤を含んでもよく、従来公知の製剤化技術等により製剤化可能である。 The dosage form of the antiallergic agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the use. When the antiallergic agent of the present invention is orally administered, the dosage form includes, for example, solid or liquid oral preparations, and specifically, tablets, coated tablets, capsules, pills, powders, fine powders Examples thereof include granules, granules, troches, and liquids. When the antiallergic agent of the present invention is administered parenterally, examples of the dosage form include parenteral preparations such as injection preparations and infusion preparations. The antiallergic agent of the present invention may contain various additives such as excipients, binders, lubricants, disintegrants, absorption enhancers, emulsifiers, stabilizers, preservatives, etc. It can be made into pharmaceutical preparations using a chemical technology.
本発明の抗アレルギー剤は、飲食品に添加してもよい。本発明において、飲食品とは、一般食品、保健機能食品を含む。前記一般食品としては、特に限定されないが、例えば、穀物加工食品、野菜加工食品、果物加工食品、食肉加工食品、水産物加工食品、乳製品、飲料、健康食品等があげられる。前記穀物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、小麦粉、米粉、シリアルバー、せんべい、あられ、クッキー等があげられる。前記野菜加工食品としては、特に限定されないが、例えば、野菜ペースト、乾燥野菜、野菜スープ等があげられる。前記果物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、果物ピューレ、乾燥果物等があげられる。前記食肉加工食品としては、特に限定されないが、例えば、ハム、ベーコン、ソーセージ等があげられる。前記水産物加工食品としては、特に限定されないが、例えば、佃煮、塩干物、魚肉ソーセージ、はんぺん、かまぼこ、ちくわ等があげられる。前記乳製品としては、特に限定されないが、例えば、乳飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、チーズ等があげられる。前記飲料としては、特に限定されないが、例えば、清涼飲料、緑茶、紅茶、コーヒー等があげられる。また、前記保健機能食品は、一般に、機能性食品とも称される。前記保健機能食品としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品等があげられる。 You may add the antiallergic agent of this invention to food-drinks. In the present invention, the food and drink includes general foods and health functional foods. Although it does not specifically limit as said general food, For example, grain processed food, processed vegetable food, processed fruit food, processed meat food, processed fish food, dairy product, drink, health food etc. are mention | raise | lifted. Although it does not specifically limit as said grain processed food, For example, wheat flour, rice flour, a cereal bar, a rice cracker, hail, a cookie, etc. are mention | raise | lifted. Although it does not specifically limit as said vegetable processed food, For example, vegetable paste, dried vegetables, vegetable soup, etc. are mention | raise | lifted. Although it does not specifically limit as said fruit processed food, For example, fruit puree, dried fruit, etc. are mention | raise | lifted. The processed meat food is not particularly limited, and examples thereof include ham, bacon, sausage and the like. The marine product processed food is not particularly limited, and examples thereof include boiled boiled fish, salted and dried fish, fish sausage, rice bran, kamaboko, and chikuwa. Although it does not specifically limit as said dairy product, For example, milk drink, yogurt, ice cream, cheese etc. are mention | raise | lifted. Although it does not specifically limit as said drink, For example, a soft drink, green tea, black tea, coffee etc. are mention | raise | lifted. The health functional food is also generally referred to as functional food. Examples of the health functional food include food for specified health use, nutritional functional food, and the like.
つぎに、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、本発明は、下記の実施例に限定されない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
［オリーブ果実からの分離］
下記工程により、オリーブ果実から、ポメスメタノール抽出液乾固液及び果汁液乾固物を分離した。
（１）まず、オリーブ果実１．１５ｋｇの圧搾及びメタノール抽出により、オイルを含むポメスメタノール抽出液と、オイルを含む果汁液とに分離した。
（２）つぎに、前記オイルを含むポメスメタノール抽出液及び前記オイルを含む果汁液を、それぞれ、ヘキサンにより分液することで、ポメスメタノール抽出液及び果汁液と、オイルとに分離した。
（３）つぎに、前記ポメスメタノール抽出液及び前記果汁液を、それぞれ、減圧乾固させることで、ポメスメタノール抽出液乾固物３４．５ｇ及び果汁液乾固物（以下、被験物質と言うことがある。）を得た。
Example 1
[Separation from olive fruit]
From the olive fruit, the Pomez methanol extract dried liquid and the fruit juice dried solid were separated by the following steps.
(1) First, 1.15 kg of olive fruit was pressed and extracted with methanol to separate it into a pomezethanol methanol extract containing oil and a fruit juice containing oil.
(2) Next, the Pomezethanol methanol extract containing the oil and the fruit juice containing the oil were separated into hexane to separate the Pomezethanol extract and the juice and oil.
(3) Next, by drying the Pomezethanol methanol extract and the fruit juice liquid under reduced pressure, respectively, 34.5 g of the Pomezethanol extract dry substance and the fruit juice dry substance (hereinafter referred to as a test substance). There is.)
［抗アレルギー活性評価］
ラット好塩基球由来肥満細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を用い、好塩基球の顆粒中に豊富に存在するβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出率を脱顆粒の指標として測定することにより、被験物質の脱顆粒抑制作用の有無を評価した。β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率は、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅが糖分解酵素であることから、基質ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに作用して遊離したｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌによる黄色発色の吸光度（波長＝４０５ｎｍ）測定の結果から算出した。
[Antiallergic activity evaluation]
By using rat basophil-derived mast cells RBL-2H3 and measuring the release rate of β-hexosaminidase abundant in basophil granules as an indicator of degranulation, the presence or absence of the degranulation inhibitory effect of the test substance Evaluated. The β-hexosaminidase release rate is the absorbance of yellow color due to p-nitrotropenol released by acting on the substrate p-nitrophenyl-2-acetamide-β-D-glucopyranoside since β-hexosaminidase is a glycolytic enzyme (wavelength = 405 nm) was calculated from the measurement results.
つぎに、図１を参照して、抗アレルギー活性評価方法の詳細について説明する。抗アレルギー活性評価は、つぎの材料を用いて行った。
培地：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０％、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００Ｘ（ＧＩＢＣＯ社製）を１％含んだＤＥＭＥ（和光純薬工業（株）製）
ＰＢＳ（−）：和光純薬工業（株）製
０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液：和光純薬工業（株）製
抗体溶液：ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を培地に溶かして、５０ｎｇ／ｍＬに調製したＡｎｔｉ ＤＮＰ−ＩｇＥ溶液
抗原溶液：Ａｌｂｕｍｉｎ，ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（Ｓｉｇｍａ社製）をＭＴ Ｂｕｆｆｅｒに溶かして、２．５μｇ／ｍＬに調製したＤＮＰ−ＨＳＡ（ＤＮＰ−ｌａｂｅｌｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）溶液
ＭＴ Ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製）にＨＥＰＥＳ（（株）同仁化学研究所製）を４．７６ｇ／Ｌ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を１ｇ／Ｌとなるように加えたもの
０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ クエン酸水溶液と０．１Ｍ クエン酸ナトリウム水溶液を５１：４９の割合で混合したもの（ｐＨ ４．５）
基質溶液：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒに溶かして、３．３ｍＭになるように調製したもの
酵素反応停止液：４Ｍ グリシン水溶液と４Ｍ ＮａＯＨ水溶液とイオン交換水を５０：３２：１８の割合で混合した２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ １０．０）
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業（株）製）をＭＴ Ｂｕｆｆｅｒで０．１％に希釈したもの
被験物質溶液：被験物質を１００％ＤＭＳＯに溶かし、ＭＴ Ｂｕｆｆｅｒで適当な濃度に希釈したもの（このとき、ＤＭＳＯの最終濃度を０．１％以下となるようにした）
Next, the details of the antiallergic activity evaluation method will be described with reference to FIG. Antiallergic activity was evaluated using the following materials.
Medium: DEME (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% of Fetal Bovine Serum (manufactured by Biowest) and 1% of Antibiotic-Antitactic 100X (manufactured by GIBCO)
PBS (-): Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
0.25% trypsin EDTA solution: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Antibody solution: Anti DNP-IgE solution prepared by dissolving mouse monoclonal anti-dinitrophenol (manufactured by Sigma) in a medium to 50 ng / mL
Antigen solution: DNP-HSA (DNP-labeled human serum albumin) solution prepared by dissolving Albumin, dinitrophenyl (manufactured by Sigma) in MT Buffer to 2.5 μg / mL
MT Buffer: Tyrode's salt solution (manufactured by Sigma) with HEPES (manufactured by Dojindo Laboratories) 4.76 g / L and Bovine Serum Albumin (manufactured by Jackson ImmunoResearch) to 1 g / L Food
0.1M Citrate Buffer: A mixture of 0.1M citric acid aqueous solution and 0.1M sodium citrate aqueous solution in a ratio of 51:49 (pH 4.5)
Substrate solution: p-nitrophenyl-2-acetamide-β-D-glucopyranoside (manufactured by Sigma) dissolved in 0.1 M Citrate Buffer prepared to 3.3 mM
Enzyme reaction stop solution: 2M Glycine Buffer (pH 10.0) in which 4M glycine aqueous solution, 4M NaOH aqueous solution and ion-exchanged water are mixed at a ratio of 50:32:18
0.1% Triton X-100 solution: Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted to 0.1% with MT Buffer
Test substance solution: A test substance dissolved in 100% DMSO and diluted to an appropriate concentration with MT Buffer (at this time, the final concentration of DMSO was adjusted to 0.1% or less)
（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の継代培養）
まず、５０ｍＬ容培養フラスコで、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の培養を行った。コンフルエントになったところで継代を行った。培養フラスコから古くなった培地を取り除き、ＰＢＳ（−）を３ｍＬ入れ、フラスコ内全面を洗浄し、すぐに取り除いた。再度ＰＢＳ（−）を３ｍＬ入れ、今度は１分間細胞表面のみを洗浄し、すぐに取り除いた。ついで、培養フラスコに０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液を３ｍＬ入れ、フラスコの壁に付着している細胞を浮遊させた。この操作は、１０分以内に行った。つぎに、フラスコに新しい培地を１２ｍＬ入れ、トリプシンＥＤＴＡの働きを停止させ、５０ｍＬ容遠沈管にフラスコ内の溶液をすべて移し、２０００ｒｐｍ、８分間の条件で遠心分離を行った後、上清を除去した。つぎに、遠沈管に新しい培地を６ｍＬ入れ、ピペッティングし、１ｍＬを元のフラスコに戻し、そのフラスコに５ｍＬの新しい培地を加えてインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。
(Subculture of RBL-2H3 cells)
First, RBL-2H3 cells were cultured in a 50 mL culture flask. Passage was performed when it became confluent. The old medium was removed from the culture flask, 3 mL of PBS (-) was added, the entire surface of the flask was washed, and immediately removed. 3 mL of PBS (-) was again added, and this time, only the cell surface was washed for 1 minute and immediately removed. Next, 3 mL of a 0.25% trypsin EDTA solution was placed in the culture flask, and the cells adhering to the wall of the flask were suspended. This operation was performed within 10 minutes. Next, add 12 mL of fresh medium to the flask, stop the action of trypsin EDTA, transfer all the solution in the flask to a 50 mL centrifuge tube, centrifuge at 2000 rpm for 8 minutes, and then remove the supernatant. did. Next, 6 mL of a new medium was put into a centrifuge tube, pipetted, 1 mL was returned to the original flask, 5 mL of a new medium was added to the flask, and cultured in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
（ステップ１（Ｓ１）：２４ウェルマイクロプレートへの播種）
５０ｍＬ容培養フラスコで培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５０ｍＬ容遠沈管に培地で希釈した。希釈後の細胞液を２４ウェルマイクロプレート上のＣＬ（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ） ｗｅｌｌ（図２参照）に１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように分注し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で１晩培養した。
(Step 1 (S1): seeding in a 24-well microplate)
RBL-2H3 cells cultured in a 50 mL culture flask were diluted with a medium in a 50 mL centrifuge tube so as to be 2.5 × 10 5 cells / mL. The diluted cell solution was dispensed to a CL (Cell Lysate) well (see FIG. 2) on a 24-well microplate so as to be 1 mL / well and cultured overnight in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). .
（ステップ２（Ｓ２）：抗体添加）
培養後、培地を吸引除去し、１ｍＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳ（−）で洗浄後、抗体溶液を５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。このとき、Ｂｌａｎｋには、抗体溶液の代わりに培地を加えた。これを２時間培養することにより細胞を感作させた。
(Step 2 (S2): antibody addition)
After culturing, the medium was removed by suction, washed with 1 mL / well of PBS (−), and the antibody solution was added to 500 μL / well. At this time, a medium was added to Blank instead of the antibody solution. Cells were sensitized by culturing this for 2 hours.
（ステップ３（Ｓ３）：被験物質溶液添加）
２時間後、抗体溶液を除去し、１ｍＬ／ｗｅｌｌのＭＴ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、被験物質溶液を４９０μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。このとき、Ｂ（Ｂｌａｎｋ） ｗｅｌｌ及びＮ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ） ｗｅｌｌ（図２参照）には、被検物質溶液の代わりにＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを加えた。これを１０分間培養した。
(Step 3 (S3): Addition of test substance solution)
After 2 hours, the antibody solution was removed and washed twice with 1 mL / well MT Buffer, and then the test substance solution was added to 490 μL / well. At this time, MT Buffer was added to B (Blank) well and N (Negative) well (see FIG. 2) instead of the test substance solution. This was incubated for 10 minutes.
（ステップ４（Ｓ４）：抗原添加）
培養後、抗原溶液を１０μＬ／ｗｅｌｌ加えよく混合し、さらに３０分間培養した。これにより、細胞を刺激した（脱顆粒）。
(Step 4 (S4): antigen addition)
After incubation, 10 μL / well of the antigen solution was added and mixed well, followed by further incubation for 30 minutes. This stimulated the cells (degranulation).
（ステップ５（Ｓ５）：氷冷）
３０分後、インキュベーターから２４ウェルマイクロプレートを取り出し、１０分間氷冷して反応を止めた。
(Step 5 (S5): ice cooling)
After 30 minutes, the 24-well microplate was removed from the incubator and ice-cooled for 10 minutes to stop the reaction.
（ステップ６（Ｓ６）：上清分取・細胞溶解）
ＣＬ ｗｅｌｌの上清全量（５００μＬ）を、それぞれ、その真下に位置するＳ（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ） ｗｅｌｌに移し（図２参照）、ＣＬ ｗｅｌｌに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液５００μＬを加え、底面に付着している細胞を溶解させた。
(Step 6 (S6): supernatant fractionation / cell lysis)
Transfer the entire CL well supernatant (500 μL) to the S (Supernatant) well located immediately below (see FIG. 2), add 500 μL of 0.1% Triton X-100 solution to the CL well, and attach to the bottom. Cells were lysed.
（ステップ７（Ｓ７）：９６ウェルマイクロプレートへの播種）
Ｓ ｗｅｌｌから５０μＬを、及びＣＬ ｗｅｌｌから５０μＬを、それぞれ、２連で９６ウェルマイクロプレートに移し（図３参照）、５分間プレインキュベーションした。図３に示す９６ウェルマイクロプレートの各ウェルの抗体と被験物質の違いを、表１に示す
50 μL from S well and 50 μL from CL well were transferred in duplicate to a 96-well microplate (see FIG. 3) and preincubated for 5 minutes. Table 1 shows the difference between the antibody and the test substance in each well of the 96-well microplate shown in FIG.
（ステップ８（Ｓ８）：基質添加）
基質溶液をＸ ｗｅｌｌ（図３参照）のみに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加え、２５分間インキュベーションした。
(Step 8 (S8): substrate addition)
The substrate solution was added to X well (see FIG. 3) only at 100 μL / well and incubated for 25 minutes.
（ステップ９（Ｓ９）：酵素反応停止液添加）
その後、酵素反応停止液を全ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた。
(Step 9 (S9): Addition of enzyme reaction stop solution)
Thereafter, an enzyme reaction stop solution was added to all wells at 100 μL / well.
（ステップ１０：マイクロプレートリーダーによる吸光度測定）
ついで、基質溶液をＹ ｗｅｌｌ（図３参照）のみに１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように加え、マイクロプレートリーダーで吸光度（波長＝４０５ｎｍ）を測定した。Ｘ ｗｅｌｌとＹ ｗｅｌｌの溶液の色の違いを、表２に示す。得られた吸光度より、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率及びＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌの放出率を１００％としたときの相対放出率を下記式を用いて算出した。
Subsequently, the substrate solution was added to only Y well (see FIG. 3) so as to be 100 μL / well, and the absorbance (wavelength = 405 nm) was measured with a microplate reader. Table 2 shows the difference in color between the solution of X well and Y well. From the obtained absorbance, the relative release rate when the release rate of β-hexosaminidase and the release rate of negative control were taken as 100% was calculated using the following formula.
図４に、抗アレルギー活性評価の結果を示す。図示のとおり、被験物質としてポメスメタノール抽出液乾固物を用いたときのみ、その濃度が高くなるにつれてβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率が低くなっており、ポメスメタノール抽出液乾固物に抗アレルギー活性があることがわかった。 FIG. 4 shows the results of anti-allergic activity evaluation. As shown in the figure, the β-hexosaminidase release rate decreases as the concentration increases only when pometh methanol extract dry matter is used as the test substance, and pomezethanol extract dry matter has antiallergic activity. I understood it.
［ポメス各フラクションの抗アレルギー活性評価］
抗アレルギー活性の認められたポメスについて、さらに活性成分を探索するために、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７カラムにより分画して活性フラクションを明らかにした。ポメスメタノール抽出液乾固物３４．５ｇをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７カラムによって分離して得た各フラクション乾固物の重量を表３に、抗アレルギー活性評価結果を図５にそれぞれ示す。
In order to further search for active components of Pomez with anti-allergic activity, fractionation was performed using an Amberlite XAD-7 column to reveal the active fraction. Table 3 shows the weight of each fraction dried product obtained by separating 34.5 g of the dried product of Pomez methanol extract with an Amberlite XAD-7 column, and FIG. 5 shows the evaluation results of the antiallergic activity.
図５に示すとおり、Ｆｒ．１、２に抗アレルギー活性は無かったが、Ｆｒ．３〜９には抗アレルギー活性があった。Ｆｒ．６、７では１００μｇ／ｍＬ、Ｆｒ．５、８、９では３００〜５００μｇ／ｍＬ、Ｆｒ．３、４では８００μｇ／ｍＬで放出率を５０％抑制したことから、その抗アレルギー活性の強さは、Ｆｒ．６、７＞５、８、９＞３、４であることがわかった。 As shown in FIG. 1 and 2 had no antiallergic activity, but Fr. 3-9 had antiallergic activity. Fr. 6 and 7, 100 μg / mL, Fr. 5, 8 and 9, 300 to 500 μg / mL, Fr. 3 and 4, since the release rate was suppressed by 50% at 800 μg / mL, the strength of the antiallergic activity was Fr. 6, 7> 5, 8, 9> 3, 4 were found.
前記抗アレルギー活性評価におけるのと同様の材料を用いて、下記方法により、Ｆｒ．３〜９の乾固物のβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害活性試験を実施した。その結果を、表４に示す。表４に示すとおり、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害率が最も大きいものでも１０％前後しかないことがわかった。このことから、抗アレルギー活性評価中のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ遊離反応におけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ酵素活性をＦｒ．３〜９の乾固物が阻害しないことがわかった。したがって、Ｆｒ．３〜９の乾固物が肥満細胞からのβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出そのものを抑制していると判断できる。
＜β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害活性試験方法＞
前記抗アレルギー活性評価におけるのと同様にして５０ｍＬ容培養フラスコに培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に溶解した。それを遠心分離して上清をとり、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ粗酵素液とした。９６ウェルマイクロプレートの全てのウェルに粗酵素液を２５μＬずつ加え、Ｎ ｗｅｌｌ（図６６参照）にはＭＴ Ｂｕｆｆｅｒを、ｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌ（図６６参照）には被験物質溶液を２５μＬ添加し、５分間プレインキュベーションした。５分後、基質溶液をＸ ｗｅｌｌ（図６６参照）に１００μＬずつ加え、２５分間インキュベーションした。その後、酵素反応停止液を１００μＬずつ全ウェルに加え、Ｙ ｗｅｌｌ（図６６参照）に基質溶液を１００μＬずつ加えた。つぎに、吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し（波長＝４０５ｎｍ）、下記式により、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ阻害率を算出した。
<Method for testing β-hexosaminidase inhibitory activity>
RBL-2H3 cells cultured in a 50 mL culture flask in the same manner as in the evaluation of antiallergic activity were dissolved in 0.1% Triton X-100 solution so as to be 5 × 10 5 cells / mL. It was centrifuged and the supernatant was taken to obtain a β-hexosaminidase crude enzyme solution. Add 25 μL of the crude enzyme solution to all wells of a 96-well microplate, add MT Buffer to N well (see FIG. 66), and add 25 μL of the test substance solution to sample well (see FIG. 66). Incubated. After 5 minutes, 100 μL each of the substrate solution was added to X well (see FIG. 66) and incubated for 25 minutes. Thereafter, 100 μL of the enzyme reaction stop solution was added to all wells, and 100 μL of the substrate solution was added to each Y well (see FIG. 66). Next, the absorbance was measured with a microplate reader (wavelength = 405 nm), and the β-hexosaminidase inhibition rate was calculated by the following formula.
（ＨＰＬＣによる各フラクションの成分分析・同定）
図６〜８に、成分同定のために用いた下記既知成分標品のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。また、それらより得た各標品のリテンションタイム（Ｒ．Ｔ．）を表６に示す。なお、図６は、フラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）であり、図７は、ポリフェノール標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）であり、図８は、イリドイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）である。ほとんどが１種類の標品に対して、１本の主要ピークが見られたが、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎでは多くのピークが見られた。ＨＰＬＣ分析条件は、下記のとおりである。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
送液ポンプ ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０×２
検出器 ：ＪＡＳＣＯ ＭＤ２０１０Ｐｌｕｓ
波長 ：２９０ｎｍ
カラム ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ ４．６×２５０ｍｍ
流速 ：１ｍＬ／分
移動相原液 ：酢酸：アセトニトリル：超純水：リン酸＝４０：５０：８．５：1．５
移動相溶媒 ：Ａ 移動相原液を１．５％リン酸水溶液で２０倍に希釈
Ｂ 移動相原液を１．５％リン酸水溶液で２倍に希釈
カラム温度 ：４０℃
サンプル濃度 ：５ｍｇ／ｍＬ
インジェクト容量 ：２０μＬ
グラジエントタイムプログラム：表５
6 to 8 show HPLC chromatograms (wavelength = 290 nm) of the following known component preparations used for component identification. Table 6 shows the retention times (RT) of the samples obtained from them. 6 is an HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm) of a flavonoid standard group, FIG. 7 is an HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm) of a polyphenol standard group, and FIG. 8 is an iridoid standard group. Is an HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm). In most cases, one main peak was observed for one type of standard, but many peaks were observed in Silymarin and Oleuropein. The HPLC analysis conditions are as follows.
<HPLC analysis conditions>
Liquid feed pump: JASCO PU-980 × 2
Detector: JASCO MD2010Plus
Wavelength: 290 nm
Column: COSMOSIL 5C 18 -ARII 4.6 × 250mm
Flow rate: 1 mL / min Mobile phase stock solution: Acetic acid: Acetonitrile: Ultrapure water: Phosphoric acid = 40: 50: 8.5: 1.5
Mobile phase solvent: A The mobile phase stock solution was diluted 20 times with 1.5% phosphoric acid aqueous solution.
B Dilute mobile phase stock solution with 1.5% aqueous phosphoric acid solution twice. Column temperature: 40 ° C
Sample concentration: 5 mg / mL
Inject volume: 20 μL
Gradient time program: Table 5
＜既知成分標品＞
Ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社製）
Ｃａｔｅｃｈｉｎ（ナカライテスク（株）製）
Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ（東京化成工業（株）製）
Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｙｒｉｎｇｉｃ ａｃｉｄ、ｏ−ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｆｌａｖａｎｏｎｅ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｒｕｔｉｎ、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ、Ｃａｔｅｃｈｏｌ（和光純薬工業（株）製）
Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ社製）
Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ（ＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
Ｄｉｏｓｍｉｎ、Ａｐｉｇｅｎｉｎ、Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ、Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ、Ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｒｈｏｉｆｏｌｉｎ、（＋）−Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（Ｅｘｔｒａｔｈｅｓｅ社製）
<Known component preparation>
Apigenin-7-O-glucoside (AppliChem)
Catchin (manufactured by Nacalai Tesque)
Ferric acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Gallic acid, Syringic acid, o-coumatic acid, Flavanone, Luteolin, Quercetin, Rutin, Caffeic acid, Catechol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Rosmarinic acid (manufactured by Sigma)
Hesperidin, Silymarin (manufactured by LKT Laboratories)
Diosmin, Apigenin, Eriodictyol, Hesperetin, Homoeriodictyol, Isorhamnetin, Kaempferol, Luteolin-7-O-glucoside, Naringenin, Naringenin-7-O-glucoside, Rhoifolin, (+) - Taxifolin, Hydroxytyrosol, Curcumin, Verbascoside, Oleuropein (Extrathese Inc. Made)
図９に、Ｆｒ．３及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、ＡのピークがＦｒ．３の主成分であることがわかった。そして、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＲ．Ｔ．が一致した（９．０分）。図１０に、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ａのピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２３５、２７９ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．３の主成分は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌであると同定された。 In FIG. 3 shows the HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm) of Hydroxytyol. As shown in the figure, the peak of A is Fr. 3 was found to be the main component. And the peak of A and the R. of Hydroxytyol. T.A. Matched (9.0 minutes). FIG. 10 shows the peak of A and the absorption spectrum of Hydrotyrosol. As shown in the figure, the peak of A and the absorption spectrum of Hydroxytyol, the maximum absorption wavelength (235, 279 nm) coincided. From these results, Fr. The main component of 3 was identified as Hydroxytyol.
図１１に、Ｆｒ．４、５及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、Ｆｒ．４、５にはＢに共通した大きなピークが見られた。そして、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅのＲ．Ｔ．が一致した（２０．８分）。図１２に、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ｆｒ．４、５のＢのピーク及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２３５、３３１ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．４、５の主成分は、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅであると同定された。 In FIG. The HPLC chromatograms (wavelength = 290 nm) of 4, 5 and Verbascoside are shown. As shown, Fr. A large peak common to B was observed in 4 and 5. And Fr. 4, 5 B peaks and Verbascoside R.P. T.A. Matched (20.8 minutes). In FIG. The peaks of 4 and 5 B and the absorption spectrum of Verbascoside are shown. As shown, Fr. The peaks of 4, 5 and B, the shape of the absorption spectrum of Verbascoside, and the maximum absorption wavelength (235, 331 nm) coincided. From these results, Fr. The main components of 4, 5 were identified as Verbascoside.
図１３に、Ｆｒ．６、７のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、３４．４分に共通のピークが見られた。図１４に、Ｆｒ．６、７の３４．４分のピークの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、極大吸収波長は、２４３、２７９ｎｍであった。今回用いた標品の中には、Ｆｒ．６、７の３４．４分のピークとＲ．Ｔ．及び吸収スペクトルが一致するものは無かった。 In FIG. 6 and 7 show HPLC chromatograms (wavelength = 290 nm). As shown in the figure, a common peak was observed at 34.4 minutes. In FIG. 6 and 7 show absorption spectra of peaks at 34.4 minutes. As illustrated, the maximum absorption wavelength was 243 and 279 nm. Among the samples used this time, Fr. 6 and 7 peak at 34.4 minutes and R.P. T.A. There was no match between the absorption spectra.
図１５に、Ｆｒ．８、９及びフラボノイド標品群のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図示のとおり、Ｆｒ．８、９にはＣに共通した大きなピークが見られた。そして、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎのＲ．Ｔ．が一致した（３０．２分）。図１６に、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎの吸収スペクトルを示す。図示のとおり、Ｆｒ．８、９のＣのピーク及びＬｕｔｅｏｌｉｎの吸収スペクトルの形、極大吸収波長（２４３、２７９ｎｍ）が一致した。これらの結果から、Ｆｒ．８、９の主成分は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎであると同定された。 In FIG. The HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm) of 8, 9 and the flavonoid preparation group is shown. As shown, Fr. In 8 and 9, large peaks common to C were observed. And Fr. 8 and 9 C peaks and Luthelin R.I. T.A. Matched (30.2 min). In FIG. 8 and 9 C peaks and luteolin absorption spectra are shown. As shown, Fr. The peaks of 8 and 9 C, the shape of absorption spectrum of Luteolin, and the maximum absorption wavelength (243, 279 nm) coincided. From these results, Fr. The main components of 8 and 9 were identified as luteolin.
図１７に、カラム分離する前のポメスメタノール抽出液乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図示のとおり、ポメス中には、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ及びＬｕｔｅｏｌｉｎという３つの既知成分と、１つの未知成分（Ｒ．Ｔ．＝３４．４分）が含まれていることがわかった。表７に、ポメスメタノール抽出液乾固物のＨＰＬＣ分析による成分同定結果をまとめた。表７に示すとおり、ポメスメタノール抽出液乾固物には、既知成分としてＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（オリーブ果実１．１５ｋｇあたり３３４ｍｇ）及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ（オリーブ果実１．１５ｋｇあたり１１７ｍｇ）が多く含まれていることがわかった。なお、ポメス含有既知成分の含有量の算出には、図６７〜６９に示すＨＰＬＣ検量線を用いた。図６７は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）であり、図６８は、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）であり、図６９は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ標品を用いて作成したＨＰＬＣ検量線（波長＝２９０ｎｍ）である。
［Ｆｒ．７含有未知成分の構造解析］
Ｆｒ．７から未知成分を分取しやすいようにＨＰＬＣ分析条件を下記のように変更することで、図１８に示すように未知成分のＲ．Ｔ．が速くなるようにし、下記ＨＰＬＣ分取条件により、図１９に示すようにＦｒ．７−１〜７−３に分離した。なお、図１８において、上の図がＨＰＬＣ条件変更前の結果であり、下の図が、ＨＰＬＣ条件変更後の結果である。図２０に、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３のＨＰＬＣ分析結果を示す。図示のとおり、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−２が同じＲ．Ｔ．に大きなピークを示しており、Ｆｒ．７からＦｒ．７−２に未知成分を分取できたことが確認された。図２１に、Ｆｒ．７及びＦｒ．７−１〜７−３の抗アレルギー活性評価の結果を示す。図示のとおり、Ｆｒ．７−１、７−３には抗アレルギー活性は無かった。一方、Ｆｒ．７−２の濃度が７０μｇ／ｍＬのときに放出率が５０％以下に低下しており、Ｆｒ．７−２には抗アレルギー活性が認められた。これらの結果から、Ｆｒ．７−２に分取された未知成分が、Ｆｒ．７の抗アレルギー活性の中心成分であることが確認された。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
送液ポンプ ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０×２
検出器 ：ＪＡＳＣＯ ＭＤ２０１０Ｐｌｕｓ
波長 ：２９０ｎｍ
カラム ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ ４．６×２５０ｍｍ
流速 ：１ｍＬ／分
移動相原液 ：酢酸：アセトニトリル：超純水：ＴＦＡ＝４０：５０：９．５：０．５
移動相溶媒 ：Ａ 移動相原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で２０倍に希釈
Ｂ 移動相原液を０．５％ＴＦＡ水溶液で２倍に希釈
カラム温度 ：４０℃
サンプル濃度 ：１００ｍｇ／ｍＬ
インジェクト容量 ：５０μＬ
グラジエントタイムプログラム：表８
送液ポンプ ：ＪＡＳＣＯ ＰＵ−９８０
検出器 ：ＪＡＳＣＯ ８７５ＵＶ
波長 ：２９０ｎｍ
カラム ：ＤＥＶＥＬＯＳＩＬ ＯＤＳ−８ １０×２５０ｍｍ
流速 ：１ｍＬ／分
移動相溶媒 ：Ａ ２０％アセトニトリル−１６％酢酸水溶液
Ｂ ２５％アセトニトリル−２０％酢酸水溶液
カラム温度 ：４０℃
インジェクト重量 ：５０ｍｇ
タイムプログラム ：表９
Fr. 7 by changing the HPLC analysis conditions as follows so that the unknown component can be easily separated, as shown in FIG. T.A. As shown in FIG. 19, the Fr. Separated into 7-1 to 7-3. In FIG. 18, the upper diagram shows the results before the HPLC condition change, and the lower diagram shows the results after the HPLC condition change. In FIG. 7 and Fr. The HPLC analysis result of 7-1 to 7-3 is shown. As shown, Fr. 7 and Fr. 7-2 is the same R.I. T.A. Shows a large peak, and Fr. 7 to Fr. It was confirmed that the unknown component could be fractionated in 7-2. In FIG. 7 and Fr. The result of the antiallergic activity evaluation of 7-1 to 7-3 is shown. As shown, Fr. 7-1 and 7-3 had no antiallergic activity. On the other hand, Fr. When the concentration of 7-2 was 70 μg / mL, the release rate decreased to 50% or less. 7-2 showed antiallergic activity. From these results, Fr. The unknown component sorted into 7-2 is Fr. 7 was confirmed to be the central component of antiallergic activity.
<HPLC analysis conditions>
Liquid feed pump: JASCO PU-980 × 2
Detector: JASCO MD2010Plus
Wavelength: 290 nm
Column: COSMOSIL 5C 18 -ARII 4.6 × 250mm
Flow rate: 1 mL / min Mobile phase stock solution: Acetic acid: Acetonitrile: Ultrapure water: TFA = 40: 50: 9.5: 0.5
Mobile phase solvent: A Dilute mobile phase stock solution 20 times with 0.5% TFA aqueous solution
B: Diluting mobile phase stock solution with 0.5% TFA aqueous solution 2 times Column temperature: 40 ° C
Sample concentration: 100 mg / mL
Inject volume: 50 μL
Gradient time program: Table 8
Liquid feed pump: JASCO PU-980
Detector: JASCO 875UV
Wavelength: 290 nm
Column: DEVELOSIL ODS-8 10 × 250 mm
Flow rate: 1 mL / min Mobile phase solvent: A 20% acetonitrile-16% acetic acid aqueous solution
B 25% acetonitrile-20% acetic acid aqueous solution column temperature: 40 ° C
Inject weight: 50mg
Time program: Table 9
（未知成分の５０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液による分解）
図２２に、Ｆｒ．７乾固物、室温（１８℃）で５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２９０ｎｍ）を示す。図２２において、上の図が、Ｆｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、真ん中の図が、５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、下の図が、ＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌのＨＰＬＣクロマトグラムである。図示のとおり、Ｆｒ．７乾固物を５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬すると、Ｒ．Ｔ．８．９３分に新たなピークが検出されることがわかった。図２３に、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピーク及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルを示す。図２３において、上の図が、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピークの吸収スペクトルであり、下の図が、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌの吸収スペクトルである。これらの結果から、Ｒ．Ｔ．８．９３分のピークの成分は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌと同定された。図２４に、Ｆｒ．７乾固物及び５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラム（波長＝２５０ｎｍ）を示す。図２４において、上の図が、Ｆｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムであり、下の図が、５０％ＴＦＡ水溶液に２４時間浸漬した後のＦｒ．７乾固物のＨＰＬＣクロマトグラムである。図示のとおり、ＴＦＡ水溶液と反応させることにより、波長＝２５０ｎｍでＲ．Ｔ．２２．３７分に新たなピークが検出されることがわかった。Ｆｒ．７乾固物を５０％ＴＦＡ水溶液に浸漬させると、抗アレルギー活性に関与する未知成分の量が減り、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ及び波長＝２５０ｎｍでＲ．Ｔ．２２．３７分のピークの成分の量が増えることから、未知成分の構造にはＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ骨格が含まれており、酸による加水分解反応により、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌとそれ以外の部分に分解されたと考えられた。
(Decomposition of unknown component with 50% TFA (trifluoroacetic acid) aqueous solution)
In FIG. 7 Frozen product after immersion in 50% TFA aqueous solution at room temperature (18 ° C.) for 24 hours. 7 shows the HPLC chromatogram (wavelength = 290 nm) of the dried product and Hydrotyrosol. In FIG. 22, the upper diagram shows Fr. 7 is a HPLC chromatogram of the dried product, and the middle figure shows Fr. after soaking in 50% TFA aqueous solution for 24 hours. 7 is the HPLC chromatogram of the dried product, and the figure below is the HPLC chromatogram of Hydrotyrosol. As shown, Fr. 7 When the dried product was immersed in a 50% TFA aqueous solution for 24 hours, T.A. It was found that a new peak was detected at 8.93 minutes. In FIG. T.A. A peak at 8.93 minutes and an absorption spectrum of Hydrotyrosol are shown. In FIG. T.A. It is the absorption spectrum of the peak at 8.93 minutes, and the lower figure is the absorption spectrum of Hydrotyrosol. From these results, R.I. T.A. The peak component at 8.93 minutes was identified as Hydroxytyol. In FIG. 7 After 24 hours of immersion in a dried product and 50% TFA aqueous solution, Fr. 7 shows the HPLC chromatogram (wavelength = 250 nm) of the dried product. In FIG. 24, the upper diagram shows Fr. 7 is a HPLC chromatogram of the dried product, and the lower figure shows the Fr. after immersion in a 50% TFA aqueous solution for 24 hours. 7 is an HPLC chromatogram of 7 dried product. As shown in the figure, by reacting with an aqueous TFA solution, R.D. T.A. It was found that a new peak was detected at 22.37 minutes. Fr. 7 When the dried product was immersed in a 50% TFA aqueous solution, the amount of unknown components involved in antiallergic activity was reduced, and Hydroxytyol and wavelength = 250 nm. T.A. Since the amount of the peak component at 22.37 minutes increased, the structure of the unknown component contained a Hydroxytyrosol skeleton, and it was considered that it was decomposed into Hydroxytyrosol and other portions by hydrolysis with an acid.
（ＮＭＲ、ＭＳによる未知成分の構造解析）
分取用ＨＰＬＣにより５０ｍｇのＦｒ．７から２０ｍｇの未知成分を単離した。図２５に、単離した未知成分の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。図２６には、さらに、単離した未知成分のＤＥＰＴ（ＤＥＰＴ４５°、ＤＥＰＴ９０°、ＤＥＰＴ１３５°）スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）をあわせて示す。図示のとおり、１３Ｃ−ＮＭＲの結果から、未知成分の全炭素数は１９個であることがわかった。また、ＤＥＰＴの結果から、各炭素の級数がわかった。図２７に、単離した未知成分の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図２８に、単離した未知成分の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。また、図２９に、単離した未知成分のＣ−Ｈ ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示し、炭素と水素の結合を表１０にまとめた。未知成分の全炭素に結合している全水素数は２０個であることがわかり、炭素の級数との関係も一致した。図３０に、単離した未知成分のＨ−Ｈ ＣＯＳＹスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図３１に、単離した未知成分のＨ−Ｈ ＣＯＳＹ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。これらから、４−５位間、５−６位間、６−１１位間、４−８位間、８−８位間、１’−２’位間に相関性が見られ、これらはそれぞれ隣接していると考えられた。図３２に、単離した未知成分のＨＭＢＣスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を、図３３に、ＨＭＢＣ結果からの相関性を、図３４及び３５に、単離した未知成分のＨＭＢＣ拡大スペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３）を示す。図示のとおり、２−６位間、５−８位間、５−６位間、５−１１位間、６−１１位間、１’−２’位間、２’−４’位間、２’−８’位間、４’−８’位間については両方向に相関性が見られ、これらはそれぞれ近接していると考えられた。２→３位間、２→４位間、２→７位間、５→３位間、５→４位間、６→４位間、６→１０位間、８→３位間、８→４位間、８→９位間、１２→７位間、１’→３’位間、２’→３’位間、４’→５’位間、４’→６’位間、７’→３’位間、７’→６’位間、７’→８’位間、８’→６’位間については一方向からではあるが相関性が見られ、これらもそれぞれ近接していると考えられた。ＴＦＡ水溶液により、未知成分が分解されＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌが出てきたことと、これまでのＮＭＲ測定結果を総合して、未知成分は、ＩＵＰＡＣ名：４−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］−５−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｍｅｔｈｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒの化学式（３）で表わされる構造（Ｃ１９Ｈ２２Ｏ８、分子量３７８）であると考えられた。図３６〜４８に、デカップリングの結果を示す。図３６は、１１位照射デカップリングの結果であり、図３７は、１１位照射デカップリング時の６位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図３８は、２’位照射デカップリングの結果であり、図３９は、２’位照射デカップリング時の１’位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４０は、４位照射デカップリングの結果であり、図４１は、４位照射デカップリング時の５、８位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４２は、１’位照射デカップリングの結果であり、図４３は、１’位照射デカップリング時の２’位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４４は、６位照射デカップリングの結果であり、図４５は、６位照射デカップリング時の１１位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルであり、図４６は、６位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図４７は、１０位照射デカップリングの結果であり、図４８は、１０位照射デカップリング時の５位の１Ｈ−ＮＭＲ拡大スペクトルである。図示のとおり、１１位を照射すると６位が、２’位を照射すると１’位が、４位を照射すると５位と８位が、１’位を照射すると２位が、６位を照射すると５位と１１位が、１０位を照射すると５位が、それぞれスペクトルが変化したので、４−５位間、６−１１間、４−８位間、１’−２’位間、６−５位間、５−１０位間の隣接が証明された。図４９に、単離した未知成分のＭＳスペクトルを示す。図示のとおり、未知成分の分子量は３７８であることがわかった。これとＮＭＲの結果とを総合して、未知成分は、４−［２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］−５−ｆｏｒｍｙｌ−６−ｍｅｔｈｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒと同定された。この物質は、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎから糖が外れた構成をしているので、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅと呼ぶことができる。なお、ＮＭＲ、ＭＳは、下記条件にて実施した。
＜ＮＭＲ＞
装置：日本電子（株）製「ＪＮＭ−ＥＣＡ型核磁気共鳴装置」
データ処理装置：日本電子（株）製「Ｗｉｎ Ａｌｐｈａ ＮＭＲオペレーション」
溶媒：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ（Ｉｓｏｔｅｃ社製）
標準物質：ＴＭＳ（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＳｉｌａｎｅ）
周波数：６００ＭＨｚ
＜ＭＳ＞
装置：日本電子（株）製「ＪＭＳ−ＳＸ１０２ＡＱＱ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ」
データ処理装置：日本電子（株）製「ＪＭＳ−ＤＡ５０００」
イオン化法：ＥＩ
イオン化電圧：７０ｅＶ
分解能：１０００（低分解能）
標準物質：ＰＦＫ（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｋｅｒｏｓｅｎｅ）
50 mg Fr. 7 to 20 mg of unknown component was isolated. FIG. 25 shows the 13 C-NMR spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component. FIG. 26 further shows the DEPT (DEPT 45 °, DEPT 90 °, DEPT 135 °) spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component. As shown in the figure, it was found from the result of 13 C-NMR that the total number of carbon atoms of the unknown component was 19. Moreover, the series of each carbon was found from the result of DEPT. FIG. 27 shows the 1 H-NMR spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component, and FIG. 28 shows the 1 H-NMR enlarged spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component. In addition, FIG. 29 shows the C—H COSY spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component, and the carbon and hydrogen bonds are summarized in Table 10. It was found that the total number of hydrogen atoms bonded to all the carbons of the unknown component was 20, and the relationship with the carbon series was also consistent. FIG. 30 shows the H—H COSY spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component, and FIG. 31 shows the H—H COSY expanded spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component. From these, there is a correlation between positions 4-5, 5-6, 6-11, 4-8, 8-8, 1'-2 ', It was considered adjacent. FIG. 32 shows the HMBC spectrum (solvent: CDCl 3 ) of the isolated unknown component, FIG. 33 shows the correlation from the HMBC results, and FIGS. 34 and 35 show the HMBC expanded spectrum (solvent: CDCl 3 ). As shown, between 2-6, 5-8, 5-6, 5-11, 6-11, 1'-2 ', 2'-4', Between the 2′-8 ′ positions and between the 4′-8 ′ positions, a correlation was observed in both directions, and these were considered to be close to each other. Between 2 → 3rd, 2 → 4th, 2 → 7th, 5 → 3rd, 5 → 4th, 6 → 4th, 6 → 10th, 8 → 3rd, 8 → Between 4th place, 8 → 9th place, 12 → 7th place, 1 '→ 3' place, 2 '→ 3' place, 4 '→ 5' place, 4 '→ 6' place, 7 'place → 3 ', 7' → 6 ', 7' → 8 ', and 8' → 6 'are correlated from one direction, but they are close to each other. It was considered. The unknown component was decomposed by the aqueous solution of TFA and Hydroxytyrosol was produced, and the NMR measurement results so far were combined, and the unknown component was IUPAC name: 4- [2- (3,4-Dihydroxy-phenyl)- Ethoxycarbonylmethyl] -5-formyl-6-methyl-5,6-dihydro-4H-pyran-3-carboxylic acid methyl ester (C 19 H 22 O 8 , molecular weight 378) represented by the chemical formula (3) it was thought. 36 to 48 show the result of decoupling. FIG. 36 shows the result of 11-position irradiation decoupling, and FIG. 37 shows the 1 H-NMR expanded spectrum of 6-position during 11-position irradiation decoupling. FIG. 38 shows the result of 2′-position irradiation decoupling, and FIG. 39 is a 1 H-NMR expanded spectrum at the 1′-position during 2′-position irradiation decoupling. FIG. 40 shows the result of 4-position irradiation decoupling, and FIG. 41 is the 1 H-NMR expanded spectrum of the 5th and 8th positions during the 4-position irradiation decoupling. FIG. 42 shows the result of the 1′-position irradiation decoupling, and FIG. 43 shows the 1 H-NMR expanded spectrum at the 2′-position during the 1′-position irradiation decoupling. 44 shows the results of 6-position irradiation decoupling, FIG. 45 shows the 1 H-NMR expanded spectrum at the 11-position during 6-position irradiation decoupling, and FIG. 46 shows the 5-position at the 6-position irradiation decoupling. Is a 1 H-NMR expanded spectrum of FIG. 47 shows the result of 10-position irradiation decoupling, and FIG. 48 shows the 1 H-NMR expanded spectrum of the 5-position during 10-position irradiation decoupling. As shown in the figure, irradiation of the 11th position irradiates the 6th position, irradiation of the 2 'position irradiates the 1' position, irradiation of the 4th position, 5th and 8th positions, irradiation of the 1 'position, the 2nd position irradiates the 6th position. Then, when the 5th and 11th positions were irradiated with the 10th position, the spectrum of the 5th position was changed. Therefore, between the 4th and 5th positions, between the 6th and 11th positions, between the 4th and 8th positions, between the 1'-2 'positions, 6th The adjacency between the 5th and 5th positions was proved. FIG. 49 shows the MS spectrum of the isolated unknown component. As shown in the figure, it was found that the molecular weight of the unknown component was 378. By combining this and the NMR results, the unknown component was 4- [2- (3,4-Dihydroxy-phenyl) -ethylcarboxylic methyl] -5-formyl-6-methyl-5,6-dihydro-4H-pyran. It was identified as -3-carboxylic acid methyl ester. Since this substance has a structure in which the sugar is removed from the oleopein, it can be called oleopein aglycone. NMR and MS were performed under the following conditions.
<NMR>
Apparatus: “JNM-ECA type nuclear magnetic resonance apparatus” manufactured by JEOL Ltd.
Data processing device: “Win Alpha NMR operation” manufactured by JEOL Ltd.
Solvent: Chloroform-d (Isotec)
Reference material: TMS (TetraMethylSilane)
Frequency: 600MHz
<MS>
Device: “JMS-SX102AQQ Hybrid Mass Spectrometer” manufactured by JEOL Ltd.
Data processing device: “JMS-DA5000” manufactured by JEOL Ltd.
Ionization method: EI
Ionization voltage: 70 eV
Resolution: 1000 (low resolution)
Standard substance: PFK (Perfluorokerosene)
［各成分とポリフェノール標品との抗アレルギー活性比較］
つぎに、Ｈｙｄｒｏｔｙｒｏｓｏｌ、Ｖｅｒｂａｃｓｃｏｓｉｄｅ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ及び他のポリフェノール標品につき、抗アレルギー活性の比較を行った。図５０〜５２に、比較に用いたポリフェノール標品を示す。図５０及び５１には、フラボノイドを示し、図５２には、フェノール及びイリドイドを示している。比較結果を、図５３〜６４に示す。図５３は、ポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価結果を示すグラフであり、図５４は、ヒドロキシ基の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５５は、２−３位間の結合様式の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５６は、糖の有無と抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５７は、糖の結合場所の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図５８及び５９は、３、３’、４’、５’位の違いと抗アレルギー活性の関係を示すグラフであり、図６０は、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ誘導体の抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６１は、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ及びＲｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６２は、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ及びＦｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄの抗アレルギー活性比較結果を示すグラフであり、図６３は、Ｃａｔｅｃｈｏｌを基本骨格として持つポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフであり、図６４は、活性の高いポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価の結果を示すグラフである。図５４に示すとおり、Ｆｌａｖａｎｏｎｅには抗アレルギー活性が認められず、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）には抗アレルギー活性が認められたことから、ヒドロキシル基を有していなければ、抗アレルギー活性が無いことがわかった。図５５に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性より約１００倍高いことから、フラボノイド骨格の２−３位間が二重結合になっていると抗アレルギー活性が約１００倍高くなることがわかった。図５６に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が、Ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．２６μｍｏｌ／ｍＬ）及びＲｈｏｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝１．１３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性より約４００倍高いことから、糖が結合しているフラボノイドは抗アレルギー活性が弱く、糖の結合していないフラボノイドは抗アレルギー活性が強いことがわかった。図５７に示すとおり、フラボノイド骨格の３位に糖が結合しているＲｕｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．２５０μｍｏｌ／ｍＬ）及び７位に糖が結合しているＲｈｏｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝１．１３μｍｏｌ／ｍＬ）を比較すると、Ｒｕｔｉｎの抗アレルギー活性の方が約４倍高いことから、糖の結合場所によって抗アレルギー活性の高さが変わることがわかった。図５８に示すとおり、Ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ（ＩＣ５０＝０．１５９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．１８２μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．３２１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ（ＩＣ５０＝０．０９４６μｍｏｌ／ｍＬ）、（＋）−Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．１６５μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにはさほど差は無かった。図５９に示すとおり、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３１１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ（ＩＣ５０＝０．０１０８μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３６３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにもさほど差は無かった。図５８及び５９から、３、３’、４’、５’位に結合しているものの違いと抗アレルギー活性の高さには関係が無いことがわかった。図６０に示すとおり、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（ＩＣ５０＝１．９１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｖａｂａｓｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．１７μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝０．０７２５μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（ＩＣ５０＝１．３９μｍｏｌ／ｍＬ）の４つのＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ誘導体のうち、最も抗アレルギー活性が高かったのは、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅであった。図６１に示すとおり、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．１４μｍｏｌ／ｍＬ）は、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．５４μｍｏｌ／ｍＬ）に似た構造を２つ有しているが、両者の抗アレルギー活性の高さにさほど差は無かった。図６２に示すとおり、２つのＦｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．７０μｍｏｌ／ｍＬ）を結合させた構造をしているＣｕｒｃｕｍｉｎ（ＩＣ５０＝０．０１４３μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性は、Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄよりも約１００倍高かった。図６１及び６２から、抗アレルギー活性を有する構造が２つ結合したとしても、その結合様式及び糖の有無によって、抗アレルギー活性が高くなることも変化しないこともあることがわかった。図６３に示すとおり、Ｃａｔｅｃｈｏｌ（ＩＣ５０＝１．１６μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ（ＩＣ５０＝１．９１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．５４μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．７０μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ（ＩＣ５０＝１．３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ（ＩＣ５０＝１．１７μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＩＣ５０＝１．４４μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性の高さにさほど差が無かったことから、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄの抗アレルギー活性は、Ｃａｔｅｃｈｏｌ構造に由来すると考えられた。図６４に示すとおり、使用したポリフェノール標品のうち、抗アレルギー活性の高いのは、Ａｐｉｇｅｎｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３７１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３１１μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ（ＩＣ５０＝０．０１０８μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３６３μｍｏｌ／ｍＬ）、Ｃｕｒｃｕｍｉｎ（ＩＣ５０＝０．０１４３μｍｏｌ／ｍＬ）であることがわかった。以上の結果から、抗アレルギー活性が高くなる条件は、（１）フラボノイド構造をしていること、（２）その構造の２−３位間が２重結合となっていること、（３）アグリコンであること、があげられる。使用したポリフェノール標品の抗アレルギー活性評価におけるＩＣ５０を、表１１にまとめた。表１１において、ポメス含有成分には下線を付している。表１１に示すとおり、ポメス含有成分のうち、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ（ＩＣ５０＝０．００３３９μｍｏｌ／ｍＬ）及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝０．０７２５μｍｏｌ／ｍＬ）の抗アレルギー活性が高いことがわかった。
Next, comparison of anti-allergic activity was carried out for Hydrotyrosol, Verbacsoxide, Luteolin, Europein aglycone and other polyphenol preparations. 50 to 52 show polyphenol preparations used for comparison. 50 and 51 show flavonoids, and FIG. 52 shows phenol and iridoids. The comparison results are shown in FIGS. 53 is a graph showing the anti-allergic activity evaluation results of the polyphenol preparation, FIG. 54 is a graph showing the relationship between the presence / absence of hydroxy groups and anti-allergic activity, and FIG. 55 is the binding between positions 2-3. 56 is a graph showing the relationship between the difference in style and antiallergic activity, FIG. 56 is a graph showing the relationship between the presence or absence of sugar and antiallergic activity, and FIG. 57 is the relationship between the difference in sugar binding site and antiallergic activity. 58 and 59 are graphs showing the relationship between the difference in the 3, 3 ′, 4 ′ and 5 ′ positions and the antiallergic activity, and FIG. 60 shows the comparison of the antiallergic activity results of Hydroxytyrosol derivatives. 61 is a graph showing the comparison of antiallergic activity between Caffeic acid and Rosmarinic acid, and FIG. 62 is a graph showing Curc acid. FIG. 63 is a graph showing the results of comparison of antiallergic activity between min and ferric acid, FIG. 63 is a graph showing the results of antiallergic activity evaluation of a polyphenol preparation having Catechol as a basic skeleton, and FIG. 64 is a graph showing high activity of polyphenols. It is a graph which shows the result of anti-allergic activity evaluation of a sample. As shown in FIG. 54, anti-allergic activity was not observed in Flavanone and anti-allergic activity was observed in Naringenin (IC 50 = 0.321 μmol / mL). It was found that there was no allergic activity. As shown in FIG. 55, since the antiallergic activity of Apigenin (IC 50 = 0.00371 μmol / mL) is approximately 100 times higher than that of Naringenin (IC 50 = 0.321 μmol / mL), 2 of the flavonoid skeleton It was found that the anti-allergic activity was increased about 100 times when the -3 position was a double bond. As shown in FIG. 56, the antiallergic activity of Apigenin (IC 50 = 0.00371 μmol / mL) was Apigenin-7-glucoside (IC 50 = 1.26 μmol / mL) and Rhofolin (IC 50 = 1.13 μmol / mL). Since the anti-allergic activity was about 400 times higher than that of flavonoids, it was found that flavonoids bound with sugar have weak anti-allergic activity, and flavonoids not bound with sugar have strong anti-allergic activity. As shown in FIG. 57, Rutin (IC 50 = 0.250 μmol / mL) in which sugar is bonded to the 3-position of the flavonoid skeleton and Rhoifolin (IC 50 = 1.13 μmol / mL) in which sugar is bonded to the 7-position. The antiallergic activity of Rutin was about 4 times higher, indicating that the level of antiallergic activity varies depending on the sugar binding site. As shown in FIG. 58, Homoeriodictyol (IC 50 = 0.159μmol / mL), Hesperetin (IC 50 = 0.182μmol / mL), Naringenin (IC 50 = 0.321μmol / mL), Eriodictyol (IC 50 = 0.0946μmol / ML), (+)-Taxifolin (IC 50 = 0.165 μmol / mL) did not significantly differ in the level of antiallergic activity. As shown in FIG. 59, Apigenin (IC 50 = 0.00371 μmol / mL), Isorhamnetin (IC 50 = 0.00311 μmol / mL), Kaempferol (IC 50 = 0.0108 μmol / mL), Luteolin (IC 50 = 0.00339 μmol) / ML) and Quercetin (IC 50 = 0.00363 μmol / mL) were not significantly different in the level of antiallergic activity. From FIGS. 58 and 59, it was found that there is no relationship between the difference in binding to the 3, 3 ′, 4 ′, 5 ′ positions and the level of antiallergic activity. As shown in FIG. 60, Hydroxytyrosol (IC 50 = 1.91μmol / mL), Vabascoside (IC 50 = 1.17μmol / mL), Oleuropein aglycone (IC 50 = 0.0725μmol / mL), Oleuropein (IC 50 = 1. Among the four Hydrotyrosol derivatives (39 μmol / mL), the highest antiallergic activity was Oleuropein aglycone. As shown in FIG. 61, Rosmarinic acid (IC 50 = 1.14 μmol / mL) has two structures similar to those of Caffeic acid (IC 50 = 1.54 μmol / mL). There was not much difference in height. As shown in FIG. 62, the antiallergic activity of Curcumin (IC 50 = 0.0143 μmol / mL) having a structure in which two Ferric acids (IC 50 = 1.70 μmol / mL) are combined is more effective than that of Ferulic acid. It was about 100 times higher. 61 and 62, it was found that even when two structures having anti-allergic activity are bonded, the anti-allergic activity may be increased or not changed depending on the binding mode and the presence or absence of sugar. As shown in FIG. 63, Catechol (IC 50 = 1.16 μmol / mL), Hydrotyrosol (IC 50 = 1.91 μmol / mL), Caffeic acid (IC 50 = 1.54 μmol / mL), Ferric acid (IC 50 = 1) .70 μmol / mL), Oleuropein (IC 50 = 1.39 μmol / mL), Verbascoside (IC 50 = 1.17 μmol / mL), Rosmarinic acid (IC 50 = 1.44 μmol / mL) Since there was not much difference, the anti-allergic activity of Hydroxytyrosol, Ferric acid, Oleuropein, Verbascoside, and Rosmarinic acid It was thought to be derived from the hol structure. As shown in FIG. 64, among the polyphenol preparations used, those having high antiallergic activity are Apigenin (IC 50 = 0.00371 μmol / mL), Isorhamnetin (IC 50 = 0.00311 μmol / mL), Kaempferol (IC 50 = 0.0108 μmol / mL), Luteolin (IC 50 = 0.00339 μmol / mL), Quercetin (IC 50 = 0.00363 μmol / mL), and Curcumin (IC 50 = 0.0143 μmol / mL). From the above results, the conditions for increasing the antiallergic activity are (1) a flavonoid structure, (2) a double bond between positions 2-3 of the structure, and (3) aglycone. It can be raised. The IC 50 in the antiallergic activity evaluation of the polyphenol preparation used is summarized in Table 11. In Table 11, the Pomez-containing component is underlined. As shown in Table 11, it was found that, among the pomez-containing components, luteolin (IC 50 = 0.00339 μmol / mL) and oleopein aglycone (IC 50 = 0.0725 μmol / mL) have high antiallergic activity.
（ポメス含有成分の抗アレルギー活性評価）
図６５に、ポメス含有成分の抗アレルギー活性評価の結果を示す。また、表１２に、ポメス含有成分の濃度（μｇ／ｍＬ）とβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性阻害率（％）との関係を示す。表１２に示すとおり、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ濃度６００（μｇ／ｍＬ）のとき、β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性阻害率が１７．４０％と最も高く、図６５より、同じ濃度のときの脱顆粒抑制率（１００（％）−β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ放出率（％））は４０％であり、少なくとも２３％は放出自体を抑制していることとなる。以上から、抗アレルギー活性評価中のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ遊離反応におけるβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ酵素活性をポメス含有成分が阻害しないことがわかった。したがって、ポメス含有成分が、肥満細胞からのβ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの放出そのものを抑制していると言える。
FIG. 65 shows the results of the antiallergic activity evaluation of the Pomez-containing component. Table 12 shows the relationship between the concentration of Pomez-containing components (μg / mL) and the β-hexosaminidase activity inhibition rate (%). As shown in Table 12, when the Verbascoside concentration is 600 (μg / mL), the β-hexosaminidase activity inhibition rate is the highest at 17.40%, and from FIG. 65, the degranulation inhibition rate (100 (%) at the same concentration is obtained. -Β-hexosaminidase release rate (%)) is 40%, and at least 23% suppresses the release itself. From the above, it was found that the Pomez-containing component does not inhibit the β-hexosaminidase enzyme activity in the p-nitrophenol release reaction during the evaluation of antiallergic activity. Therefore, it can be said that the Pomez-containing component suppresses the release of β-hexosaminidase from mast cells.
表１３に、各Ｆｒにおける各成分の含有割合を示す。また、図６５及び表１３から得られるポメスフラクション乾固物及び各成分標品の抗アレルギー活性の比較結果を、表１４〜２０に示す。表１４は、Ｆｒ．３及びＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１５は、Ｆｒ．４及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１６は、Ｆｒ．５及びＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１７は、Ｆｒ．６及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１８は、Ｆｒ．７及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表１９は、Ｆｒ．８及びＬｕｔｅｏｌｉｎ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示し、表２０は、Ｆｒ．９及びＬｕｔｅｏｌｉｎ標品の抗アレルギー活性（脱顆粒抑制活性）結果の比較を示す。表１４の放出率６０％のときのＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ濃度を見ると約３倍の違いがあるので、Ｆｒ．３の抗アレルギー活性が全てＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌによるものとは言えない。したがって、Ｆｒ．３にはＨｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ以外の抗アレルギー活性成分が含まれていると考えられた。表１５及び１６から、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅは低濃度（１０、２０μｇ／ｍＬで放出率９６％）で抗アレルギー活性を示さないはずであるのに、Ｆｒ．４、５（推定含有Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ濃度１０、２０μｇ／ｍＬで放出率５５％、４４％）では抗アレルギー活性を示していることから、Ｆｒ．４、５の主要抗アレルギー活性成分はＶｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ以外の成分であると考えられた。表１７及び１８から、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ濃度と放出率との関係がフラクション状態とＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ単体の状態で一致していることから、Ｆｒ．６、７の抗アレルギー活性は、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅによるものと言える。したがって、Ｆｒ．６、７の主要抗アレルギー活性成分はＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅであると同定された。表１９及び２０から、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ濃度と放出率との関係がフラクション状態とＬｕｔｅｏｌｉｎ単体の状態で一致していることから、Ｆｒ．８、９の抗アレルギー活性は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎによるものと言える。したがって、Ｆｒ．８、９の主要抗アレルギー活性成分はＬｕｔｅｏｌｉｎであると同定された。表２１に、ポメス含有成分のオリーブ果実中における含有量を示す。表２１に示すとおり、Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ及びＯｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅの含有量は、Ｌｕｔｅｏｌｉｎと比べて極めて多かった。
（実施例２）
実施例１と同様にしてオリーブ果実から分離した３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡにつき、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅとの抗アレルギー活性の比較を行った。その結果、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡは、ＩＣ５０＝２８．３μｇ／ｍＬであり、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅ（ＩＣ５０＝２７．４μｇ／ｍＬ）と数字上はほぼ同程度であったが、比較試験を行うと、Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ ａｇｌｙｃｏｎｅよりも抗アレルギー活性がやや強かった。
(Example 2)
In the same manner as in Example 1, 3,4-DHPEA-EDA separated from olive fruit was compared with antiallergic activity with Oleopinein aglycone. As a result, 3,4-DHPEA-EDA had an IC 50 = 28.3 μg / mL, which was almost the same as that of Olopein aglycone (IC 50 = 27.4 μg / mL). As a result, the antiallergic activity was slightly stronger than that of Oleopine Aglycone.
Claims (4)
The antiallergic agent according to claim 2 or 3 , wherein the olive is at least one selected from the group consisting of mission species, manzanillo species and Lucca species.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012084852A JP6004318B2 (en) | 2011-04-14 | 2012-04-03 | Antiallergic agent |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011089679 | 2011-04-14 | ||
| JP2011089679 | 2011-04-14 | ||
| JP2012084852A JP6004318B2 (en) | 2011-04-14 | 2012-04-03 | Antiallergic agent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012229204A JP2012229204A (en) | 2012-11-22 |
| JP6004318B2 true JP6004318B2 (en) | 2016-10-05 |
Family
ID=47431100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012084852A Expired - Fee Related JP6004318B2 (en) | 2011-04-14 | 2012-04-03 | Antiallergic agent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6004318B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG10201800502VA (en) * | 2013-08-27 | 2018-03-28 | Suntory Holdings Ltd | Clock gene expression level regulator |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5024579B2 (en) * | 2003-11-26 | 2012-09-12 | 株式会社Ｊ−オイルミルズ | Catecholamine inducer |
-
2012
- 2012-04-03 JP JP2012084852A patent/JP6004318B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012229204A (en) | 2012-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miyazaki et al. | Anthocyanins from purple sweet potato Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki suppress the development of atherosclerotic lesions and both enhancements of oxidative stress and soluble vascular cell adhesion molecule-1 in apolipoprotein E-deficient mice | |
| US20020054924A1 (en) | Novel compositions derived from cranberry and grapefruit and therapeutic uses therefor | |
| JP3892014B2 (en) | Bone formation promoter containing β-cryptoxanthin as an active ingredient | |
| KR100883992B1 (en) | Composition containing extracts of Zanthoxylum piperitum DC or compounds isolated therefrom for the prevention and treatment of cardiovascular diseases | |
| JP6004318B2 (en) | Antiallergic agent | |
| KR101062174B1 (en) | Triterpenoid compounds activating AMPK obtained from persimmon leaves and compositions for the prevention and treatment of obesity or diabetes comprising the same as an active ingredient | |
| JP6261059B2 (en) | Lifestyle-related disease-improving agent containing water extract of colored onion | |
| Suhendi | Potential Activity of Rambutan (Nepheliumlappaceum L.) Fruit Peel Extract as Antidiabetic and Antihypercholesterolemia | |
| KR101388634B1 (en) | Composition and health food comprising handelin isolated from the extract of Chrysanthemum boreale Makino for prevention and treatment of inflammatory-involved disease | |
| CN102216318A (en) | Antioxidant | |
| KR20070049811A (en) | Novel catecholic xanthone compounds, and composition containing extract of cudrania tricuspidata or catecholic xanthone compounds isolated therefrom for the prevention and treatment of cardiovascular disease | |
| JP2008031076A (en) | Adiponectin production enhancer | |
| JP2006325602A (en) | Osteogenesis promoter containing beta-cryptoxanthin as active ingredient | |
| JP4720504B2 (en) | Plant seed extract composition and method for producing the same | |
| JP5000214B2 (en) | Novel compounds and osteoclast differentiation / proliferation inhibitors | |
| JP5549008B2 (en) | Anti-allergic agent or anti-atopic inflammatory agent containing potato shochu or a substance derived therefrom | |
| JP4041843B2 (en) | Pharmaceutical composition containing quercetin 3-o- (6-o-malonyl) glucoside as an active ingredient and food containing quercetin malonyl glucoside | |
| WO2013062332A2 (en) | Vascular anti-aging composition including syringaresinol | |
| KR20050047546A (en) | Drugs, drinks or foods | |
| Fushimi et al. | Young persimmon ingestion suppresses lipid oxidation in rats | |
| JP5167462B2 (en) | Novel compounds and osteoclast differentiation / proliferation inhibitors | |
| EP2684566B1 (en) | Pharmaceutical composition for preventing and treating complications of diabetes containing a homonoia riparia extract or a fraction thereof as an active ingredient | |
| JP2015143236A (en) | Estrogenic action agent | |
| KR101791830B1 (en) | The compositions of anticancer effect of women cancers comprising wheat germ extract and preparation method thereof | |
| JPH0826989A (en) | Preventing or improving agent for allergic symptom |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150326 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160128 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160328 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160812 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160826 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6004318 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |