JP5999542B2 - Method for detecting molecules having ligand-like activity - Google Patents
Method for detecting molecules having ligand-like activity Download PDFInfo
- Publication number
- JP5999542B2 JP5999542B2 JP2011251881A JP2011251881A JP5999542B2 JP 5999542 B2 JP5999542 B2 JP 5999542B2 JP 2011251881 A JP2011251881 A JP 2011251881A JP 2011251881 A JP2011251881 A JP 2011251881A JP 5999542 B2 JP5999542 B2 JP 5999542B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- age
- molecule
- acid sequence
- amino acid
- rage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、AGEsまたはOxLDL等のリガンド様活性の新規検出技術および生活習慣病危険因子などの検出技術に関する。 The present invention relates to a novel detection technique for ligand-like activity such as AGEs or OxLDL, and a detection technique for lifestyle-related disease risk factors.
レクチン様酸化低密度リポタンパク質(LDL)受容体1(Lectin−like Oxidized LDL receptor:本明細書中以降、LOX−1ともいう)は、アテローム発生の原因となる酸化LDL(本明細書中以降、OxLDLともいう)のような変性LDLに対する特有のスカベンジャー受容体であり、1997年に、培養ウシ大動脈内皮細胞において初めて同定された。LOX−1は、他のスカベンジャー受容体と機能的には類似しているにもかかわらず、構造的には異なる独特の構造を有している。 Lectin-like oxidized low density lipoprotein (LDL) receptor 1 (Lectin-like Oxidized LDL receptor: hereinafter referred to as LOX-1) is an oxidized LDL (hereinafter referred to as LOX-1) that causes atherogenesis. A unique scavenger receptor for denatured LDL (also referred to as OxLDL) and was first identified in 1997 in cultured bovine aortic endothelial cells. Although LOX-1 is functionally similar to other scavenger receptors, it has a unique structure that is structurally different.
ウシLOX−1(bLOX−1)は、C型レクチンファミリーに属する273アミノ酸残基からなる分子量約50kDaの糖タンパク質であり、N末端が細胞質内にあり、C末端が細胞外に出ている細胞膜1回貫通型のII型膜タンパク質である。ヒトLOX−1(hLOX−1)はまた、C型レクチンファミリーに属する273アミノ酸残基からなる約30kDa(139位および183位の糖鎖付加により、分子量約40kDa)のII型膜タンパク質である。この受容体は、構造的には、以下の4つのドメイン:N末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびC型レクチン様ドメイン(本明細書中以降、CTLDという)からなる。このCTLDは、種間で、特に、6個のシステイン残基の位置で高度に保存されており、LOX−1のリガンドを認識するための機能的ドメインである。このCTLD中の6個のシステイン残基は、hLOX−1の分子内ジスルフィド結合に関与している。この保存されたCTLDに加えて、hLOX−1および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、Xieら(非特許文献1:Protein Expression and Prification 32:68−74(2003))によれば、CTLDが変性LDLを結合するのに十分な最小ドメインであり、たとえCTLDがグリコシル化されていなくても、変性LDLを認識および結合できることが明らかにされた。 Bovine LOX-1 (bLOX-1) is a glycoprotein consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family and having a molecular weight of about 50 kDa, the N-terminus is in the cytoplasm, and the C-terminus is outside the cell membrane. A single-penetration type II membrane protein. Human LOX-1 (hLOX-1) is also a type II membrane protein of about 30 kDa consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family (molecular weight of about 40 kDa due to addition of sugar chains at positions 139 and 183). This receptor is structurally composed of the following four domains: an N-terminal cytoplasmic domain, a hydrophobic transmembrane domain, a neck domain, and a C-type lectin-like domain (hereinafter referred to as CTLD). . This CTLD is highly conserved among species, particularly at the position of 6 cysteine residues, and is a functional domain for recognizing LOX-1 ligands. Six cysteine residues in this CTLD are involved in the intramolecular disulfide bond of hLOX-1. In addition to this conserved CTLD, neck domains in hLOX-1 and other known species have high sequence identity. According to Xie et al. (Non-patent Document 1: Protein Expression and Purification 32: 68-74 (2003)), CTLD is a minimal domain sufficient to bind denatured LDL, even if CTLD is glycosylated. It has been shown that denatured LDL can be recognized and bound without it.
これまでの研究により、LOX−1は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージおよび活性化血管平滑筋細胞において発現されており、構造的に関連性のない種々の高分子(変性LDL、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、および血小板があげられる)を認識し、生体防御機構や炎症性機転などの種々の生命現象において重要な役割を果たしていること、そしてその発現は種々の条件下で、高脂血症、糖尿病、高血糖、高血圧症、高血圧性腎硬化症、動脈硬化、虚血再灌流傷害、血管バルーン傷害後のような病態;ならびに酸化LDL、アンジオテンシンII、エンドセリン、TNF−α、後期糖化反応生成物(AGE)、TGF−β、8−イソ−プロスタグランジンF2α、ズリ応力のような刺激によって、調節されていることが分かっている(非特許文献2:Folia Pharmacol.Jpn. 127,103−107(2006))。 According to previous studies, LOX-1 is expressed not only in vascular endothelial cells but also in macrophages and activated vascular smooth muscle cells, and various structurally unrelated macromolecules (modified LDL, bacteria, aging) Erythrocytes, cells undergoing apoptosis, and platelets), and plays an important role in various biological phenomena such as biological defense mechanisms and inflammatory mechanisms, and its expression is under various conditions, Conditions such as hyperlipidemia, diabetes, hyperglycemia, hypertension, hypertensive nephrosclerosis, arteriosclerosis, ischemia-reperfusion injury, vascular balloon injury; and oxidized LDL, angiotensin II, endothelin, TNF-α, advanced glycation products (AGE), TGF-β, 8- iso - prostaglandin F 2.alpha, by stimuli such as shear stress, are adjusted Bets are known (Non-Patent Document 2:. Folia Pharmacol.Jpn 127,103-107 (2006)).
変性LDL測定に関しては、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。これまで、ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性LDLの測定には、モノクローナル抗体が用いられてきたが、特に変性LDLは分子の修飾構造は一定ではなく、意味のある分子種が明確でないなどの理由で、モノクローナル抗体による検出にも問題が多い。 Regarding the measurement of denatured LDL, it is expected to be used in various fields such as early diagnosis of diseases, evaluation of preventive effects of functional foods, evaluation of treatment effects by improving lifestyle and medication. So far, monoclonal antibodies have been used to measure denatured LDL, which is a risk factor for arteriosclerosis in human plasma. In particular, denatured LDL has a definite molecular modification structure, and the meaningful molecular species is not clear. For this reason, there are many problems in detection using monoclonal antibodies.
後期糖化反応生成物(Advanced Glycation End Products:本明細書中以降、AGEという)は、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症(あわせて三大合併症)とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。 Late Glycation End Products (hereinafter referred to as AGE in the present specification) are involved in the development and development of diabetic vascular disorders known as vascular complications that are the primary cause of impaired quality of life for diabetic patients. ing. Eye, nerve, and kidney disorders due to vascular complications are called diabetic retinopathy, neuropathy, and nephropathy (a total of three major complications), which are characteristic pathologies for diabetic patients.
AGEを認識する受容体(Receptor for AGE:本明細書中以降、RAGEという)は、1992年に、ウシ肺から同定され、AGEと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約35kDaのI型膜タンパク質(糖鎖修飾を受けた完全なRAGEは、分子量55kDa)である。RAGEの細胞外ドメインは、1つのV型イムノグロブリンドメイン、続いて、2つのC型イムノグロブリンドメイン(C1領域およびC2領域)の3つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。RAGEはまた、細胞膜1回貫通型のドメインおよび43アミノ酸の細胞内ドメインを含む。RAGEは、多様なクラスのリガンド(AGE、S100/カルグラニュリン(calgranμline)、アンホテリンおよびアミロイド−βペプチド(およびβ−シート原線維のクラス))と相互作用する。Vドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞内ドメインは、RAGE媒介性細胞内シグナル伝達に必須であることが示された(非特許文献3:Circ Res.2003;93:1159−1169)。 A receptor for recognizing AGE (Receptor for AGE: hereinafter referred to as RAGE) was identified from bovine lung in 1992 and belongs to the immunoglobulin superfamily that binds to AGE, and is a type I membrane with a molecular weight of about 35 kDa. It is a protein (complete RAGE subjected to sugar chain modification has a molecular weight of 55 kDa). The extracellular domain of RAGE has a structure in which a domain having three immunoglobulin fold structures of one V-type immunoglobulin domain and then two C-type immunoglobulin domains (C1 region and C2 region) are combined. . RAGE also contains a single-pass membrane domain and a 43 amino acid intracellular domain. RAGE interacts with various classes of ligands (AGE, S100 / calgranulin, amphoterin and amyloid-β peptides (and β-sheet fibril class)). The V domain is an essential site for ligand binding, and the intracellular domain has been shown to be essential for RAGE-mediated intracellular signal transduction (Non-patent Document 3: Circ Res. 2003; 93: 1159-1169). ).
RAGEは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。例えば、糖尿病患者の血管では、RAGEの代表的リガンドとしては、以下のAGE構造体が挙げられる:(カルボキシメチル)リジン−タンパク質付加物(インビボで存在する主なAGE)、カルボキシエチル−リジン(CEL)タンパク質付加物、ペントシジン−付加物(コラーゲンおよび基底膜の不安定化に関連した糖尿病組織において見いだされる主要なAGE架橋物質)、ピラリン、イミダゾロン、メチルグリオキサール(他の範囲のAGEの形成の前駆体)、クロスリン、フルオロリンク、プロピリジン、アルグピリミジン、ベスパーリジン、グリオキサール誘導リジンダイマー、デオキシグルコサミン誘導リジンダイマーなど。RAGEの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加している。AGE−RAGE相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、RAGEがAGEと結合した後、内皮細胞は、VCAM−1、組織因子、およびIL−6の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、RAGEは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性AGEに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる(非特許文献4:J.Clin.Invest.108:949−955(2001))。 RAGE is expressed only at low levels in normal tissues and the vascular system. However, this receptor is upregulated where the ligand accumulates. For example, in diabetic blood vessels, typical ligands for RAGE include the following AGE structures: (carboxymethyl) lysine-protein adduct (major AGE present in vivo), carboxyethyl-lysine (CEL) ) Protein adducts, pentosidine-adducts (major AGE crosslinkers found in diabetic tissues associated with collagen and basement membrane destabilization), pyralin, imidazolone, methylglyoxal (precursors for the formation of other ranges of AGEs) ), Croslin, fluorolink, propyridine, argpyrimidine, vesperlysine, glyoxal-derived lysine dimer, deoxyglucosamine-derived lysine dimer, and the like. RAGE expression is increased in endothelial cells, smooth muscle cells, and infiltrating mononuclear phagocytes in the diabetic vasculature. AGE-RAGE interactions change cellular properties important in vascular homeostasis. For example, after RAGE binds to AGE, endothelial cells increase the expression of VCAM-1, tissue factor, and IL-6, and their permeability to macromolecules. In mononuclear phagocytes, RAGE activates the expression of cytokines and growth factors and induces cell migration in response to soluble AGE, whereas chemotaxis occurs with a fixed ligand (Non-Patent Document 4: J Clin. Invest. 108: 949-955 (2001)).
本発明者らは、これまでに、LOX−1変異体−界面活性剤複合体およびRAGE変異体−界面活性剤複合体、ならびにこれらを用いて生活習慣病危険因子などを検出する方法を出願した(特許文献7)。 The present inventors have applied for a method for detecting LOX-1 mutant-surfactant complex and RAGE mutant-surfactant complex, and lifestyle-related disease risk factors using these. (Patent Document 7).
本発明者らが提出した特許文献7では、特異的分子を用いていることから、その反応特異性に依拠せざるを得ず、OxLDL様分子およびRAGE分子について網羅的な検出ができないという点があり、これを克服することが困難であった。したがって、病変の検出においても、偽陰性の可能性を極小化できないと考えられることから、これを克服することを1つの課題とする。 In Patent Document 7 submitted by the present inventors, since a specific molecule is used, it is necessary to rely on the reaction specificity, and it is impossible to comprehensively detect OxLDL-like molecules and RAGE molecules. It was difficult to overcome this. Therefore, it is considered that the possibility of false negatives cannot be minimized even in the detection of lesions. Therefore, it is an object to overcome this.
そこで、本発明では、本発明者らは、OxLDL様活性を示す分子の検出または定量方法またはAGEs様活性を示す分子の検出または定量方法として、固相に固定されたRAGE143またはその改変体あるいは固相に固定されたCTLD14またはその改変体の存在下で、サンプルに標識したAGEまたは標識したOxLDLを接触させる工程を利用することによって、網羅的検出または定量を可能にした。 Therefore, in the present invention, the present inventors, as a method for detecting or quantifying a molecule exhibiting OxLDL-like activity or a method for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGEs-like activity, RAGE143 immobilized on a solid phase or a variant thereof or a solid phase. Exhaustive detection or quantification was made possible by utilizing the step of contacting the sample with labeled AGE or labeled OxLDL in the presence of CTLD14 or a variant thereof immobilized on the phase.
したがって、本発明は、以下を提供する。
(1)AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法であって、
(A)検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、
および
(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるAGEs様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。
(2)糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、
および
(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
(3)糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる糖尿病に罹患した被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、
および
(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
(4)糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法であって、
(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、
および
(B)該固定化されたAGEもしくはその改変体に対する該RAGE分子または該AGEもしくはその改変体のリガンドの結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。
(5)前記RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体である、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(6)前記AGE分子は、Lys−AGE(グルタルアルデヒド修飾リジン修飾AGE)、グルコース修飾AGE(G−AGE)、リボース修飾AGE(R−AGE)、フルクトース修飾AGE(F−AGE)またはそれらの改変体である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(7)OxLDL様活性を示す分子の検出または定量方法であって、
(A)検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたCTLD分子の存在下で標識した変性LDLに接触させるか、または固相に固定された変性LDLの存在下で、標識したCTLD分子に接触させる工程、
および
(B)該変性LDLに対する該CTLD分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、OxLDL様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。
(8)前記CTLD分子は、CTLD14、LOX−1全長、LOX−1細胞外領域全長、CTLDまたはそれらの改変体である、項目7に記載の方法。
(9)前記変性LDLは、酸化LDL(OxLDL)、マロンジアルデヒド化LDL(MDA−LDL)、アクロレイン修飾LDL、ノネナール修飾LDL、クロトンアルデヒド(CRA)修飾LDL、4−ヒドロキシノネナール(HNE)修飾LDL、ヘキサノイル(HEL)修飾LDL、小粒子LDL、糖化LDL、アセチル化LDLまたはその改変体である、項目7または8に記載の方法。
(10)AGEs様活性を示す分子の検出または定量のためのキットであって、
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および
(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する手段
を備え、該結合の阻害の存否またはレベルは、AGEs様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。
(11)糖尿病性腎症の予備的な診断のためのキットであって、
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および
(B)該AGEに対する該RAGE分子の結合を検出する手段
を備え
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
(12)糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断のためのキットであって、
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および
(B)該AGEに対する該分子の結合を検出する手段
を備え、
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
(13)糖尿病または糖尿病性腎症の診断のためのキットであって、
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および
(B)該AGEに対する該分子の結合を検出する手段
を備え、
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。
(14)前記RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体である、項目10〜13のいずれか1項に記載のキット。
(15)前記AGE分子は、Lys−AGE(グルタルアルデヒド修飾リジン修飾AGE)、グルコース修飾AGE(G−AGE)、リボース修飾AGE(R−AGE)、フルクトース修飾AGE(F−AGE)またはそれらの改変体である、項目10〜14のいずれか1項に記載のキット。
(16)OxLDL様活性を示す分子の検出または定量のためのキットであって、
(A)固定されたCTLD分子を有する固相および標識した変性LDL、または固定された変性LDLを有する固相および標識したCTLD分子;および
(B)該変性LDLに対する該CTLD分子の結合を検出する手段
を備え、該結合の阻害の存否またはレベルは、OxLDL様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。
(17)前記CTLD分子は、CTLD14、LOX−1全長、LOX−1細胞外領域全長、CTLDまたはその改変体である、項目16に記載のキット。
(18)前記変性LDLは、酸化LDL(OxLDL)、マロンジアルデヒド化LDL(MDA−LDL)、アクロレイン修飾LDL、ノネナール修飾LDL、クロトンアルデヒド(CRA)修飾LDL、4−ヒドロキシノネナール(HNE)修飾LDL、ヘキサノイル(HEL)修飾LDL、小粒子LDL、糖化LDL、アセチル化LDLまたはその改変体である、項目16または17に記載のキット。
(19)AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病性腎症の予備的な診断マーカー。
(20)AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断マーカー。
(21)AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病または糖尿病性腎症の診断マーカー。
(22)糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用。
(23)糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用。
(24)糖尿病または糖尿病性腎症の診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、使用。
Accordingly, the present invention provides the following.
(1) A method for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity,
(A) A sample to be detected or quantified is contacted with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, or labeled in the presence of an AGE molecule immobilized on a solid phase. Contacting the RAGE molecule;
And (B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the presence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of a molecule exhibiting AGEs-like activity in the sample. The method of inclusion.
(2) A preliminary detection method for diabetic nephropathy,
(A) A sample from a subject for detection of diabetic nephropathy is contacted with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, or an AGE molecule immobilized on a solid phase Contacting with a labeled RAGE molecule in the presence of
And (B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the presence or absence of inhibition of the binding indicates that the subject will or will have future diabetic nephropathy A method comprising the steps.
(3) A preliminary detection method for diabetic nephropathy in diabetes,
(A) A sample from a subject suffering from diabetes that is subject to detection of diabetic nephropathy is contacted with an immobilized AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase or immobilized on a solid phase Contacting the labeled RAGE molecule in the presence of the labeled AGE molecule;
And (B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the presence or absence of inhibition of the binding indicates that the subject will or will have future diabetic nephropathy A method comprising the steps.
(4) A method for detecting diabetes or diabetic nephropathy,
(A) A sample from a subject for detection of diabetic nephropathy is contacted with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, or an AGE molecule immobilized on a solid phase Contacting with a labeled RAGE molecule in the presence of
And (B) detecting binding of the RAGE molecule or ligand of the AGE or variant thereof to the immobilized AGE or variant thereof, wherein the presence or level of inhibition of the binding is determined by the subject A method comprising the step of indicating that the patient is suffering from diabetes or diabetic nephropathy.
(5) The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the RAGE molecule is RAGE143, RAGE1, RAGE223, RAGE226, or a variant thereof.
(6) The AGE molecule may be Lys-AGE (glutaraldehyde-modified lysine-modified AGE), glucose-modified AGE (G-AGE), ribose-modified AGE (R-AGE), fructose-modified AGE (F-AGE), or modifications thereof 6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the method is a body.
(7) A method for detecting or quantifying a molecule exhibiting OxLDL-like activity,
(A) The sample to be detected or quantified is brought into contact with the labeled denatured LDL in the presence of CTLD molecules immobilized on the solid phase, or labeled in the presence of denatured LDL immobilized on the solid phase. Contacting the CTLD molecule;
And (B) detecting the binding of the CTLD molecule to the modified LDL, wherein the presence or level of inhibition of the binding comprises the presence or level of a molecule exhibiting OxLDL-like activity, Method.
(8) The method according to item 7, wherein the CTLD molecule is CTLD14, LOX-1 full length, LOX-1 extracellular region full length, CTLD, or a variant thereof.
(9) The modified LDL is oxidized LDL (OxLDL), malondialdehyde-modified LDL (MDA-LDL), acrolein modified LDL, nonenal modified LDL, crotonaldehyde (CRA) modified LDL, 4-hydroxynonenal (HNE) modified LDL Item 9. The method according to Item 7 or 8, which is a hexanoyl (HEL) -modified LDL, a small particle LDL, a saccharified LDL, an acetylated LDL, or a variant thereof.
(10) A kit for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity,
(A) a solid phase having a fixed RAGE molecule and a labeled AGE molecule, or a solid phase having a fixed AGE molecule and a labeled RAGE molecule; and (B) detecting binding of the RAGE molecule to the AGE molecule. A kit comprising means, wherein the presence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of molecules exhibiting AGEs-like activity.
(11) A kit for preliminary diagnosis of diabetic nephropathy,
(A) a solid phase having a immobilized RAGE molecule and a labeled AGE molecule, or a solid phase having a fixed AGE molecule and a labeled RAGE molecule; and (B) means for detecting binding of the RAGE molecule to the AGE Wherein the presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is or will likely suffer from diabetic nephropathy in the future.
(12) A kit for preliminary diagnosis of diabetic nephropathy in diabetes,
(A) a solid phase having an immobilized RAGE molecule and a labeled AGE molecule, or a solid phase having an immobilized AGE molecule and a labeled RAGE molecule; and (B) means for detecting binding of the molecule to the AGE. Prepared,
The presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is or will likely suffer from diabetic nephropathy in the future.
(13) A kit for diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy,
(A) a solid phase having an immobilized RAGE molecule and a labeled AGE molecule, or a solid phase having an immobilized AGE molecule and a labeled RAGE molecule; and (B) means for detecting binding of the molecule to the AGE. Prepared,
The presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is suffering from diabetes or diabetic nephropathy.
(14) The kit according to any one of Items 10 to 13, wherein the RAGE molecule is RAGE143, RAGE1, RAGE223, RAGE226, or a modified form thereof.
(15) The AGE molecule may be Lys-AGE (glutaraldehyde-modified lysine-modified AGE), glucose-modified AGE (G-AGE), ribose-modified AGE (R-AGE), fructose-modified AGE (F-AGE) or a modification thereof The kit according to any one of Items 10 to 14, which is a body.
(16) A kit for detecting or quantifying a molecule exhibiting OxLDL-like activity,
(A) a solid phase having immobilized CTLD molecules and labeled denatured LDL, or a solid phase having immobilized denatured LDL and labeled CTLD molecules; and (B) detecting binding of the CTLD molecules to the denatured LDL. A kit comprising means, wherein the presence or level of inhibition of binding indicates the presence or level of a molecule exhibiting OxLDL-like activity.
(17) The kit according to item 16, wherein the CTLD molecule is CTLD14, LOX-1 full length, LOX-1 extracellular region full length, CTLD or a variant thereof.
(18) The modified LDL is oxidized LDL (OxLDL), malondialdehyde-modified LDL (MDA-LDL), acrolein-modified LDL, nonenal-modified LDL, crotonaldehyde (CRA) -modified LDL, 4-hydroxynonenal (HNE) -modified LDL Item 18. The kit according to item 16 or 17, which is a hexanoyl (HEL) -modified LDL, a small particle LDL, a saccharified LDL, an acetylated LDL, or a variant thereof.
(19) A preliminary diagnostic marker for diabetic nephropathy comprising a molecule exhibiting AGE-like activity.
(20) A preliminary diagnostic marker for diabetic nephropathy in diabetes, comprising a molecule exhibiting AGE-like activity.
(21) A diagnostic marker for diabetes or diabetic nephropathy, comprising a molecule exhibiting AGE-like activity.
(22) Use of AGEs-like activity in a subject to serve as a preliminary diagnosis index of diabetic nephropathy, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value. Use to indicate that it is likely or likely to have diabetic nephropathy in the future.
(23) Use of AGEs-like activity in a subject to provide an index for preliminary diagnosis of diabetic nephropathy in diabetes, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value. Uses to indicate that the body will or will have future diabetic nephropathy.
(24) Use of AGEs-like activity in a subject for use as an index for diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value when the subject is diabetic Or use to indicate that you are suffering from diabetic nephropathy.
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。 Still further embodiments and advantages of the invention will be recognized by those of ordinary skill in the art upon reading and understanding the following detailed description as needed.
本発明のCTLD分子を用いたアッセイによって、簡便性は顕著に上がっているといえる。従来の手法が、試料添加後に3段階も別の反応を行う必要があったのが、反応は試料添加の1段階のみであって、従来の手法のように強酸などの劇薬は一切使用しないという点で安全なアッセイが提供されたとも言える。 It can be said that the convenience is remarkably improved by the assay using the CTLD molecule of the present invention. The conventional method required three separate reactions after sample addition, but the reaction is only one step of sample addition, and no powerful drugs such as strong acids are used as in the conventional method. It can be said that a safe assay was provided.
また、CTLD分子を用いたアッセイによって、網羅性に関しても顕著な効果が発揮された。すなわち、変性LDLとは構造が異なる分子でCTLD14に認識されることが示されている分子(機能は明確ではないがHsp:分子シャペロンであるheat shock protein等)にまで拡張された。また従来の手法では捕捉できなかった分子も検出可能になり、網羅性は改善された。加えて、結合は弱いものの、 AGEsもCTLD14のリガンドとして認識することができる。従来の手法では、全く別の抗体(しかも特異性が低い)を準備して別個に反応を行う必要があった、本発明の手法では変性LDLと同時にリガンド様活性を示す分子として検出可能でとなった。 In addition, the assay using CTLD molecules exhibited a significant effect on the comprehensiveness. That is, the molecule has been extended to a molecule that has a structure different from that of denatured LDL and has been shown to be recognized by CTLD14 (Hsp: heat shock protein that is a molecular chaperone, although the function is not clear). In addition, it became possible to detect molecules that could not be captured by the conventional method, and the coverage was improved. In addition, although the binding is weak, AGEs can also be recognized as a ligand for CTLD14. In the conventional technique, it was necessary to prepare a completely different antibody (and low specificity) and perform the reaction separately. In the technique of the present invention, it can be detected as a molecule exhibiting a ligand-like activity simultaneously with denatured LDL. became.
本発明のRAGE分子を用いたアッセイでも顕著な効果を奏することがわかった。変性LDLおよび血糖値の管理に使われているヘモグロビン・エー・ワン・シー(HbA1c)についても、RAGEは認識するものの、R−AGEなどのAGEs(後期糖化反応生成物)と構造が異なることから、従来の手法では同時検出は困難であった。本発明の手法では、リガンド様活性を示す分子として同時に検出が可能となった。また、Lys−AGEのような低分子リガンドも同時に検出可能となったことから、網羅性についても、本発明のRAGE分子を用いたアッセイでは改善されているといえる。 It has been found that the assay using the RAGE molecule of the present invention also has a remarkable effect. Although RAGE also recognizes denatured LDL and hemoglobin A1C (HbA1c) used for blood glucose level management, the structure differs from AGEs (late glycation reaction products) such as R-AGE. However, simultaneous detection is difficult with the conventional method. According to the method of the present invention, it has become possible to simultaneously detect as molecules showing ligand-like activity. In addition, since low molecular ligands such as Lys-AGE can be detected at the same time, it can be said that the comprehensiveness of the assay using the RAGE molecule of the present invention is improved.
血糖値上昇の後にAGE様分子が上がり、その後飲水量が増加することから、飲水量が増加することが一つの糖尿病性腎症の指標であることから、「予測診断」が可能といえる。 Since the AGE-like molecule rises after the blood glucose level rises, and then the amount of drinking water increases, an increase in the amount of drinking water is one index of diabetic nephropathy, so it can be said that “predictive diagnosis” is possible.
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。 The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Thus, it should be understood that singular articles or adjectives (eg, “a”, “an”, “the”, etc., in the English language) also include the plural concept unless otherwise stated. is there. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
(用語の定義)
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.
本明細書において使用される場合、用語「受容体」とは、1個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する1個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部(細胞外の受容体)、細胞膜の中(しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている)、または完全に細胞の中(細胞内の受容体)に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡(例えば、シグナル伝達)させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。 As used herein, the term “receptor” is a biological structure comprising one or more binding domains that reversibly and specifically complex with one or more ligands. Here, this complexation has a biological structure. Receptors can be completely outside the cell (extracellular receptors), inside the cell membrane (but directing the receptor portion to the extracellular environment and cytosol), or completely inside the cell (intracellular Of the receptor). They can also function independently of cells. Receptors in the cell membrane allow cells to communicate (eg, signal transduction) with space outside their boundaries and to function in the transport of molecules and ions to the inside and outside of the cell. As used herein, a receptor may be a full length receptor or a fragment of a receptor.
本明細書において使用される場合、用語「レクチン様酸化低密度リポタンパク質(LDL)受容体1(Lectin−like Oxidized LDL receptor)」とは、LOX−1ともいわれ、(1)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号4に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(3)上記配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(5)配列番号3に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(6)上記配列番号3に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(7)上記配列番号3に示される核酸配列において1または数個のヌクレオチドの置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(8)上記配列番号3に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;および(9)上記配列番号3に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド、のうちの1つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。また、LOX−1としては、ヒトLOX−1(hLOX−1ともいう)、ウシLOX−1(b−LOX1ともいう)、ブタLOX−1、マウスLOX−1、ウサギLOX−1のような哺乳動物のLOX−1が挙げられるが、これらに限定されない。bLOX−1は、C型レクチンファミリーに属する273アミノ酸残基からなる分子量約50kDaの糖タンパク質であり、N末端が細胞質内にあり、C末端が細胞外に出ている細胞膜1回貫通型のII型膜タンパク質である。hLOX−1はまた、C型レクチンファミリーに属する273アミノ酸残基からなる約30kDaのII型膜タンパク質である。LOX−1は、構造的には、以下の4つのドメイン:N末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびC型レクチン様ドメインからなる。 As used herein, the term “lectin-like oxidized low density lipoprotein (LDL) receptor 1 (Lectin-like Oxidized LDL receptor)” is also referred to as LOX-1, and is shown in (1) SEQ ID NO: 4. (2) an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a natural LOX-1 (3) a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and exhibiting the activity of natural LOX-1; (4) An amino acid sequence having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 And a polypeptide exhibiting the activity of natural LOX-1; (5) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 3; (6) against the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes with a complementary nucleic acid sequence under stringent conditions and exhibiting the activity of natural LOX-1; (7) the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 3 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having one or several nucleotide substitutions, additions and / or deletions in the sequence and exhibiting the activity of native LOX-1; (8) SEQ ID NO: 3 above Comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity to the nucleic acid sequence shown in A polypeptide exhibiting the activity of native LOX-1; and (9) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 above, and native LOX It is one of the polypeptides that show the activity of -1. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art. Further, as LOX-1, feeding such as human LOX-1 (also referred to as hLOX-1), bovine LOX-1 (also referred to as b-LOX1), porcine LOX-1, mouse LOX-1, and rabbit LOX-1 Examples include, but are not limited to, animal LOX-1. bLOX-1 is a glycoprotein having a molecular weight of about 50 kDa consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family, the N-terminal is in the cytoplasm, and the C-terminal is a cell membrane once-penetrating type II. It is a type membrane protein. hLOX-1 is also an approximately 30 kDa type II membrane protein consisting of 273 amino acid residues belonging to the C-type lectin family. LOX-1 is structurally composed of the following four domains: an N-terminal cytoplasmic domain, a hydrophobic transmembrane domain, a neck domain, and a C-type lectin-like domain.
本明細書において使用される場合、用語「C型レクチン様ドメイン」とは、「CTLD」ともいい、C型レクチンファミリーに属するメンバーの糖鎖認識部位と相同性を有する。CTLDは、このメンバー間で、種間で非常によく保存されており、6個のシステイン残基の位置は、完全に保存されている。また、CTLDは、LOX−1のリガンドを認識するための機能的ドメインであり、この中の6個のシステイン残基は、hLOX−1の3カ所の分子内ジスルフィド結合に関与している。従って、本発明の変異LOX−1−界面活性剤複合体は、配列番号4のアミノ酸配列において、144位、155位、172位、243位、256位、264位におけるシステインが保持されていることが好ましい。同様に、本発明のCTLD−界面活性剤複合体においても、配列番号4のアミノ酸配列における144位、155位、172位、243位、256位、264位におけるシステインに対応するアミノ酸が保持されていることが好ましい。この保存されたCTLDに加えて、hLOX−1および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、hLOX−1における140位のシステインは、分子間ジスルフィド結合に関与し、hLOX−1の二量体を形成する。しかし、この140位のシステインは、変性LDLの認識に必須ではないので、発現された場合に、必ずしもこの140位のシステインが保持されている必要はなく、変異されていてもよい。さらに、hLOX−1では、183位のNと139位のNにおいて糖鎖が付加されている。糖鎖が付加されたhLOX−1の分子量は、50kDaである。通常hLOX−1はグリコシル化されているが、たとえグリコシル化されていなくても、グリコシル化された通常のhLOX−1と同様に、変性LDLを認識および結合できる。上記CTLDは、変性LDLを結合するのに必要十分な最小ドメインである。このLOX−1のC末端の4残基(LRAQ)は、リガンドの認識と取り込みに必須であり、C末端の7残基(KANLRAQ)がhLOX−1のフォールディングと輸送に必須である。hLOX−1のW150、R208、R229、R231、R248等がリガンド認識と取り込みに必須のアミノ酸である。LOX−1はまた、細胞膜から切断され、可溶性形態として放出され、健常者の血中にも存在することが報告されている。 As used herein, the term “C-type lectin-like domain” is also referred to as “CTLD” and has homology with the sugar chain recognition sites of members belonging to the C-type lectin family. CTLD is very well conserved among these members, among species, and the position of the 6 cysteine residues is completely conserved. CTLD is a functional domain for recognizing the ligand of LOX-1, and six cysteine residues among them are involved in three intramolecular disulfide bonds of hLOX-1. Therefore, in the mutant LOX-1-surfactant complex of the present invention, cysteines at positions 144, 155, 172, 243, 256, 264 are retained in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Is preferred. Similarly, in the CTLD-surfactant complex of the present invention, amino acids corresponding to cysteines at positions 144, 155, 172, 243, 256, and 264 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are retained. Preferably it is. In addition to this conserved CTLD, neck domains in hLOX-1 and other known species have high sequence identity. In addition, cysteine at position 140 in hLOX-1 is involved in an intermolecular disulfide bond and forms a dimer of hLOX-1. However, since the cysteine at position 140 is not essential for recognition of denatured LDL, it is not always necessary to retain the cysteine at position 140 when expressed, and it may be mutated. Furthermore, in hLOX-1, sugar chains are added at N at position 183 and N at position 139. The molecular weight of hLOX-1 to which a sugar chain is added is 50 kDa. Although hLOX-1 is usually glycosylated, it can recognize and bind to denatured LDL, even though it is not glycosylated, in the same way as normal glycosylated hLOX-1. The CTLD is a minimal domain necessary and sufficient to bind denatured LDL. The 4 C-terminal residues (LRaq) of LOX-1 are essential for ligand recognition and uptake, and the 7 C-terminal residues (KANLRAQ) are essential for hLOX-1 folding and transport. hLOX-1 W150, R208, R229, R231, R248 and the like are essential amino acids for ligand recognition and uptake. LOX-1 has also been reported to be cleaved from the cell membrane, released as a soluble form, and also present in the blood of healthy individuals.
本明細書において使用される場合、用語「CTLD様ポリペプチド」とは、「CTLD」、「PR(Protease−Resistant(プロテアーゼ耐性))−CTLD」、「CTLD14」(CTLD+ネックドメインのC末端側の14アミノ酸を有するポリペプチド)、「PR−CTLD14」、「CTLD+ネック」(CTLD+ネックドメインを有するポリペプチド)、または「PR−CTLD+ネック」に包含される全てのポリペプチドまたはその変異体を包含する。 As used herein, the term "CTLD-like polypeptide", "CTLD", "PR (P rotease- R esistant (protease resistance)) - CTLD ', C-terminal, the" CTLD14 "(CTLD + neck domain Polypeptide having 14 amino acids on the side), “PR-CTLD14”, “CTLD + neck” (polypeptide having CTLD + neck domain), or “PR-CTLD + neck” all polypeptides or variants thereof Include.
本明細書において使用される場合、用語「CTLD分子」とは、CTLD様ポリペプチドの他、それらの任意の複合体を含むことが理解される。したがって、CTLD分子には、LOX−1全長、LOX−1細胞外領域全長(S61〜Q273)、CTLD14(129−143)、CTLD(143−273)等も包含されることが理解される。 As used herein, the term “CTLD molecule” is understood to include CTLD-like polypeptides as well as any complexes thereof. Therefore, it is understood that CTLD molecules include LOX-1 full length, LOX-1 extracellular region full length (S61 to Q273), CTLD14 (129-143), CTLD (143-273), and the like.
本明細書において使用される場合、「複合体」とは、2以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質(例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等)であってもよい。本明細書において複合体を構成する2以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合(例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等)で結合されていてもよい。2以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。したがって、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。そのような複合体としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号2のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、LOX−1に関する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合体も使用することができる。 As used herein, “complex” means any construct comprising two or more parts. For example, when one part is a polypeptide, the other part may be a polypeptide or other substance (eg, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.). . In the present specification, two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or bonded by other bonds (for example, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). May be. When two or more parts are polypeptides, they can also be referred to as chimeric polypeptides. Therefore, in this specification, the “complex” includes a molecule formed by linking a plurality of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule. Examples of such a complex include, but are not limited to, glycolipids and glycopeptides. As used herein, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant or fragment thereof, and a nucleic acid molecule that encodes each variant or fragment as long as it has biological activity with respect to LOX-1. Can be used. Complexes containing such nucleic acid molecules can also be used.
本明細書において使用される場合、用語「CTLD」および「PR−CTLD」とは、代表的には、(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号2に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号2に示されるアミノ酸配列において90位および107位以外のアミノ酸位置で1または数個の置換、付加および/または欠失を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(4)上記配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(5)上記配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(6)配列番号1に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号1に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)配列番号1に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において90位および107位のアミノ酸は、配列番号2における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号1に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(10)上記配列番号1に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(11)上記配列番号1に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD” and “PR-CTLD” typically include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (2) SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence represented by (3); (3) other than positions 90 and 107 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several substitutions, additions and / or deletions at the amino acid position and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% sequence identity; (5) at least 80% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 1; and (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and under stringent conditions An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with the amino acid at positions 90 and 107 in the encoded amino acid sequence, retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 2 and (9) a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions and having the activity of native LOX-1; (10) shown in SEQ ID NO: 1 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence; (11) by a nucleic acid sequence having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 above Indicated by one of the polypeptides comprising the encoded amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「CTLD14」および「PR−CTLD14」とは、(1)配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号6に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号6に示されるアミノ酸配列において104位および121位以外のアミノ酸位置で1または数個の置換、付加および/または欠失を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(4)上記配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(5)上記配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(6)配列番号5に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号5に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)配列番号5に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において104位および121位のアミノ酸は、配列番号6における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号5に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(10)上記配列番号5に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(11)上記配列番号5に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD14” and “PR-CTLD14” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; (2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising a substitution, addition and / or deletion of one or several amino acids in (3); or 1 or 2 at amino acid positions other than positions 104 and 121 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 5; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and under stringent conditions Wherein the amino acids at positions 104 and 121 in the encoded amino acid sequence retain the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 6 and A polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting activity; (9) the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions in and exhibiting the activity of native LOX-1; (10) shown in SEQ ID NO: 5 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence; (11) by a nucleic acid sequence having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 above Indicated by one of the polypeptides comprising the encoded amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「CTLD+ネック」および「PR−CTLD+ネック」とは、(1)配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号8に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号8に示されるアミノ酸配列において172位および189位以外のアミノ酸位置で1または数個の置換、付加および/または欠失を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(4)上記配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(5)上記配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;(6)配列番号7に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号7に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)配列番号7に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において172位および189位位のアミノ酸は、配列番号6における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型LOX−1の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号7に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型LOX−1の活性を示すポリペプチド;(10)上記配列番号7に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(11)上記配列番号7に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “CTLD + Neck” and “PR-CTLD + Neck” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; (2) shown in SEQ ID NO: 8 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising a substitution, addition and / or deletion of one or several amino acids in the amino acid sequence; (3) in amino acid positions other than positions 172 and 189 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 above; A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native LOX-1; (4) at least 90% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 above A polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence identity; (5) at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 A polypeptide comprising an amino acid sequence having 0% sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 7; (7) a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule which hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and stringent An amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under various conditions, wherein the amino acids at positions 172 and 189 in the encoded amino acid sequence retain the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 6 and are naturally occurring A polypeptide comprising an amino acid sequence exhibiting LOX-1 activity; (9) shown in SEQ ID NO: 7 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having one or several substitutions, additions and / or deletions in said nucleic acid sequence and exhibiting the activity of native LOX-1; (10) SEQ ID NO: 7 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in (11); (11) having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 above Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
なお、上記CTLD様ポリペプチドは、天然型LOX−1の活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。 The CTLD-like polypeptide may contain an unnatural amino acid, an amino acid analog, an amino acid derivative, or the like as long as the activity of natural LOX-1 is retained.
上記に示されるCTLD様ポリペプチド−界面活性剤複合体においても、システイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与しているので、本発明のCTLD様ポリペプチドにおいて、配列番号4のアミノ酸配列の144位、155位、172位、243位、256位、264位に対応するシステインが保持されていることが好ましい。 Also in the CTLD-like polypeptide-surfactant complex shown above, cysteine residues are involved in intramolecular disulfide bonds. Therefore, in the CTLD-like polypeptide of the present invention, 144 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is used. It is preferred that cysteines corresponding to positions 155, 172, 243, 256, 264 are retained.
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。 As used herein, the term “ligand” is a binding partner for a specific receptor or family of receptors. The ligand can be an endogenous ligand for the receptor, or alternatively, a synthetic ligand for the receptor, such as a drug, drug candidate, or pharmacological means.
本明細書において使用される場合、「変性LDL」とは、LDLが体内で活性酸素、酸化的酵素、Fe3+などと接触すること、あるいは、血管内皮細胞やマクロファージなどによる細胞依存性化学変化によって発生する種々の分子修飾を有する任意のLDL改変体である。生体内に存在する変性LDLとしては、代表的には、酸化LDL(本明細書中、OxLDLといい、例としては完全酸化LDL(本明細書中F−OxLDLともいう)および部分酸化LDL(本明細書中M−OxLDLともいう)が挙げられる)、マロンジアルデヒド化LDL(MDA−LDL)、アクロレイン修飾LDL、ノネナール修飾LDL、クロトンアルデヒド(CRA)修飾LDL、4−ヒドロキシノネナール(HNE)修飾LDL、ヘキサノイル(HEL)修飾LDL、小粒子LDL(直径255nm以下のLDL)、糖化LDL、アセチル化LDLなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化LDLが異常値を示す場合、動脈硬化症、虚血性心疾患(心筋梗塞、狭心症など)、脳血管障害(脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など)、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などのような疾患が予想されるがこれらに限定されない(「今日の臨床検査 2007−2008」発行所 株式会社 南江堂、参照)。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、MDA−LDL(正常範囲:10〜80ΜL)および酸化ホスファチジルコリン(正常範囲:8.4U/mL〜17.6U/mL)が使用されている。本明細書において「OxLDL様活性を示す分子」とは、少なくとも上述のOxLDLの活性(本明細書において「OxLDL様活性」という。)の一つを有する分子をいう。そのようなOxLDL様活性としては、LOX−1に対する結合活性(リガンド活性)を挙げることができるが、それに限定されない。 As used herein, “denatured LDL” refers to contact of LDL with active oxygen, oxidative enzymes, Fe 3+, etc. in the body, or cell-dependent chemical changes caused by vascular endothelial cells, macrophages, etc. Any LDL variant with various molecular modifications that occur. As modified LDL present in a living body, typically, oxidized LDL (referred to as OxLDL in the present specification, for example, fully oxidized LDL (also referred to as F-OxLDL in the present specification) and partially oxidized LDL (present In the specification, it is also referred to as M-OxLDL), malondialdehyde-modified LDL (MDA-LDL), acrolein-modified LDL, nonenal-modified LDL, crotonaldehyde (CRA) -modified LDL, 4-hydroxynonenal (HNE) -modified LDL , Hexanoyl (HEL) -modified LDL, small particle LDL (LDL having a diameter of 255 nm or less), saccharified LDL, acetylated LDL, and the like. When oxidized LDL shows abnormal values, arteriosclerosis, ischemic heart disease (myocardial infarction, angina, etc.), cerebrovascular disorder (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, transient ischemic attack, etc.), Diseases such as aortic aneurysm, renal infarction, and hyperlipidemia are expected, but are not limited to these (see “Today's clinical test 2007-2008” publisher, Nankodo, Inc.). In a generally used test method, MDA-LDL (normal range: 10 to 80 L) and phosphatidylcholine oxide (normal range: 8.4 U / mL to 17.6 U / mL) are used as reference substances. As used herein, “a molecule exhibiting OxLDL-like activity” refers to a molecule having at least one of the above-mentioned OxLDL activities (referred to herein as “OxLDL-like activity”). Examples of such OxLDL-like activity include, but are not limited to, LOX-1 binding activity (ligand activity).
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物(Advanced Glycation End Products)」とは、AGEともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。AGEはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するAGE構造としては、カルボキシメチルリジン(CML)、カルボキエチルリジン(CEL)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もAGEであり、AGEとして実験系に汎用されている。さらに、インビトロ実験系では、BSA(ウシ血清アルブミン)に糖化処理を施したもの、例えば、R−AGE(リボースにより糖化処理をしたBSA)、F−AGE(フルクトースにより処理をしたBSA);G−AGE(グルコースにより糖化処理をしたBSA)なども汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンA1cはアマドリ転移化合物であるが、AGEに包含される。また、任意のタンパク質も、AGEに変換可能である。例えば、AGEに包含されるCMLアルブミンおよびCELアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたAGEである。このようなAGE生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するAGEとしては、:蛍光性で架橋構造を有するもの(ペントシジン、クロスリンなど)および蛍光も架橋もないもの(カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール(MG)−イミダゾロンなど)の2つに大別できる。AGEが異常値を示す場合、細小血管症(腎症、網膜症、神経症など)、大血管障害(虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ピラリン(正常範囲:血漿中23pmol/mL未満)、ペントシジン(正常範囲:血漿中0.00915〜0.0431μg/mL(ELISAで測定した場合))などが使用される(「今日の臨床検査 2007−2008」発行所 株式会社 南江堂、参照)。 As used herein, the term “advanced glycation end products” is also referred to as AGE and is a diabetic blood vessel known as a vascular complication that impairs the quality of life of diabetic patients. Involved in the onset and progression of disabilities. Reducing sugars represented by glucose react non-enzymatically with amino groups of proteins and amino acids to form glycation products such as Schiff bases or Amadori rearrangement compounds. The reaction so far is reversible and is called the first reaction. Thereafter, a late saccharification reaction product is formed through complicated and irreversible reactions such as condensation, cleavage, and cross-linking. Such a series of reactions is called glycation. AGE is also a general term for structures generated through such a process. Examples of the AGE structure present in the living body include, but are not limited to, carboxymethyllysine (CML), carboxyethyllysine (CEL), pentosidine, pyralin, imidazoline, methylglyoxal, and croslin. A product obtained by glycation of albumin, immunoglobulin, ovalbumin or the like present in plasma is also AGE, and is widely used in experimental systems as AGE. Furthermore, in the in vitro experimental system, BSA (bovine serum albumin) subjected to saccharification treatment, for example, R-AGE (BSA saccharified with ribose), F-AGE (BSA treated with fructose); G- AGE (BSA saccharified with glucose) and the like are also widely used. Hemoglobin A1c used as an index for blood glucose control is an Amadori transfer compound, but is included in AGE. Arbitrary proteins can also be converted to AGE. For example, CML albumin and CEL albumin included in AGE are both AGEs in which albumin is glycated. Such an AGE production reaction can occur in the living body either in the circulating blood, in the extracellular matrix, or in the cell. For example, AGEs present in the blood vessels of diabetic patients include: those that are fluorescent and have a cross-linked structure (such as pentosidine and croslin) and those that do not fluoresce or cross-link (such as carboxymethyllysine, pyralin, methylglyoxal (MG) -imidazolone) ). When AGE shows an abnormal value, diseases such as microangiopathy (nephropathy, retinopathy, neurosis, etc.) and macrovascular disorder (ischemic heart disease, cerebrovascular disease, obstructive arteriosclerosis) are expected. In the test method generally used, as reference substances, pyralin (normal range: less than 23 pmol / mL in plasma), pentosidine (normal range: 0.00915 to 0.0431 μg / mL in plasma (when measured by ELISA)) (See “Today's clinical test 2007-2008” publisher, Nanedo Co., Ltd.).
本明細書において「AGE分子」とは、上記AGEに含まれる任意の分子をいう。例えば、AGEとしては、Lys−AGE(グルタルアルデヒド修飾リジン修飾AGE)、グルコース修飾AGE(G−AGE)、リボース修飾AGE(R−AGE)、フルクトース修飾AGE(F−AGE)またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体を挙げることができるがそれらに限定されない。 As used herein, “AGE molecule” refers to any molecule contained in the AGE. For example, as AGE, Lys-AGE (glutaraldehyde-modified lysine-modified AGE), glucose-modified AGE (G-AGE), ribose-modified AGE (R-AGE), fructose-modified AGE (F-AGE) or a modified form thereof These complexes can be mentioned, but are not limited thereto.
本明細書において「AGEs様活性を示す分子」とは、少なくとも上述のAGEの活性(本明細書において「AGEs様活性」という。)の一つを有する分子をいう。そのようなAGEs様活性としては、RAGEに対する結合活性(リガンド活性)を挙げることができるが、それに限定されない。 In the present specification, the “molecule exhibiting AGE-like activity” refers to a molecule having at least one of the above-mentioned AGE activities (referred to herein as “AGEs-like activity”). Examples of such AGE-like activity include, but are not limited to, binding activity (ligand activity) to RAGE.
本明細書において使用される場合、用語「AGE受容体(Receptor for AGE)」とは、RAGEともいわれ、(1)配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号10に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(3)上記配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(5)配列番号9に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(6)上記配列番号9に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(7)上記配列番号9に示される核酸配列において1または数個のヌクレオチドの置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(8)上記配列番号9に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;および(9)上記配列番号9に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド、のうちの1つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。RAGEはまた、1992年に、ウシ肺から同定され、AGEと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約35kDaのI型膜タンパク質(糖鎖修飾を受けた完全なRAGEは、分子量55kDa)である。RAGEの細胞外ドメインは、1つのV型イムノグロブリンドメイン、続いて、2つのC型イムノグロブリンドメイン(C1領域およびC2領域)の、3つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。RAGEはまた、細胞膜1回貫通型のドメインおよび43アミノ酸の細胞質ドメインを含む。RAGEは、多様なクラスのリガンド(AGE、S100/カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド)と相互作用する。Vドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、RAGE媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。RAGEはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異RAGE−界面活性剤複合体は、配列番号10のアミノ酸配列における38位、99位、144位、208位、259位および301位に対応するシステイン残基を保持していることが好ましい。RAGEは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。RAGEの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、AGEが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、RAGEの発現が増加している。AGE−RAGE相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、RAGEがAGEと結合した後、血管内皮細胞は、VCAM−1、組織因子、およびIL−6の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、RAGEは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性AGEに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。 As used herein, the term “AGE receptor (Receptor for AGE)” is also referred to as RAGE, and (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; (2) SEQ ID NO: 10 above A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions in the amino acid sequence represented by (2) and exhibiting the activity of natural RAGE; (3) the amino acid represented by SEQ ID NO: A polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% sequence identity with the sequence and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) an amino acid having at least 80% sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 above A polypeptide comprising a sequence and exhibiting the activity of native RAGE; (5) shown in SEQ ID NO: 9 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule; (6) an amino acid encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 above. A polypeptide comprising a sequence and exhibiting the activity of native RAGE; (7) encoded by a nucleic acid molecule having one or several nucleotide substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 above (8) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9; And a polypeptide exhibiting the activity of natural RAGE; and (9) shown in SEQ ID NO: 9 above Comprises an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with acid sequence, and polypeptides displaying the activity of natural RAGE, it is one of. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art. RAGE is also a type I membrane protein with a molecular weight of about 35 kDa, which was identified from bovine lung in 1992 and belongs to the immunoglobulin superfamily that binds to AGE (complete RAGE with sugar chain modification has a molecular weight of 55 kDa). . The extracellular domain of RAGE has a structure in which one V-type immunoglobulin domain and then two C-type immunoglobulin domains (C1 region and C2 region) are combined with a domain having three immunoglobulin fold structures. Yes. RAGE also contains a single-pass membrane domain and a 43 amino acid cytoplasmic domain. RAGE interacts with various classes of ligands (AGE, S100 / calgranulin, amphoterin and amyloid-β peptide). The V domain is an essential site for ligand binding, and the cytoplasmic domain is essential for RAGE-mediated intracellular signaling. Since RAGE also has a disulfide bond within each domain, the mutant RAGE-surfactant complex of the present invention has positions 38, 99, 144, 208, 259 and 301 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. It is preferred to retain a cysteine residue corresponding to the position. RAGE is expressed only at low levels in normal tissues and the vascular system. However, this receptor is upregulated where the ligand accumulates. RAGE expression is increased in endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, renal mesangial cells and infiltrating mononuclear phagocytes in the diabetic vasculature. RAGE expression is also increasing in pathological sites such as arteriosclerotic lesions where AGE is accumulated. AGE-RAGE interactions change cellular properties important in vascular homeostasis. For example, after RAGE binds to AGE, vascular endothelial cells increase the expression of VCAM-1, tissue factor, and IL-6, and their permeability to macromolecules. In mononuclear phagocytes, RAGE activates the expression of cytokines and growth factors and induces cell migration in response to soluble AGEs, whereas chemotaxis occurs with fixed ligands.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE様ポリペプチド」とは、「RAGE8」、「mRAGE8」、「RAGE1」、「mRAGE1」、「RAGE2」、「mRAGE2」、「RAGE3」、「mRAGE3」、「RAGE4」、「mRAGE4」、「RAGE7」、「mRAGE7」、「RAGE143」、「mRAGE143」、「RAGE223」、「mRAGE223」、「RAGE226」および「mRAGE226」と称されるポリペプチドまたはこれらの変異体を包含する。 As used herein, the term “RAGE-like polypeptide” refers to “RAGE8”, “mRAGE8”, “RAGE1”, “mRAGE1”, “RAGE2”, “mRAGE2”, “RAGE3”, “mRAGE3”. , “RAGE4”, “mRAGE4”, “RAGE7”, “mRAGE7”, “RAGE143”, “mRAGE143”, “RAGE223”, “mRAGE223”, “RAGE226” and “mRAGE226” or their variants Includes the body.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE分子」とは、RAGE様ポリペプチドの他、それらの任意の複合体を含むことが理解される。したがって、RAGE分子には、RAGE様ポリペプチド等、例えば、RAGE(全長)、RAGE細胞外領域(配列番号10の22−332位)、RAGE143、RAGE223、RAGE226等が包含されることが理解される。 As used herein, the term “RAGE molecule” is understood to include any complex thereof as well as RAGE-like polypeptides. Therefore, it is understood that RAGE molecules include RAGE-like polypeptides, such as RAGE (full length), RAGE extracellular region (positions 22-332 of SEQ ID NO: 10), RAGE143, RAGE223, RAGE226, and the like. .
本明細書において使用される場合、用語「RAGE8」および「mRAGE8」とは、(1)配列番号12に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号12に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号12に示されるアミノ酸配列において、92位および95位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号12に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号12に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号11に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号11に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号11に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号11に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位および95位のアミノ酸配列は、配列番号12における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号11に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号11に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE8” and “mRAGE8” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) 1 or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above (5) at least 80% sequence homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 above (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 11; (7) a nucleic acid complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with the sequence under stringent conditions; (8) one or several substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above; (9) a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above. A peptide comprising amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence; A polypeptide which retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 12 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above And (11) one of the polypeptides comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 above. Indicated by one. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE1」および「mRAGE1」とは、(1)配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号14に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号14に示されるアミノ酸配列において、92位、95位、206位および250位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号14に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号14に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号13に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号13に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号13に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号13に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において92位、95位、206位および250位のアミノ酸配列は、配列番号14における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号13に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号13に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE1” and “mRAGE1” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence containing several substitutions, additions and / or deletions; (3) amino acid positions other than positions 92, 95, 206 and 250 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions, and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) at least 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 above A polypeptide comprising a variant having the sequence identity of: (5) less than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 above A polypeptide comprising a variant having a sequence homology of 80%; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 13; (7) the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having addition and / or deletion; (9) hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 above Amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule, wherein the amino acid sequence is at position 92 A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 14 and exhibits the activity of native RAGE; (10) at least a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having 90% sequence identity; and (11) encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 above. Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE2」および「mRAGE2」とは、(1)配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号16に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号16に示されるアミノ酸配列において、92位、95位および206位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号16に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号16に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号15に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号15に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号15に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号15に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位、95位および206位のアミノ酸配列は、配列番号16における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号15に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号15に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE2” and “mRAGE2” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, 1 or 2 at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (4) at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 15; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 above. A polypeptide having a position of 92 and 95 in the encoded amino acid sequence. And the amino acid sequence at positions 206 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 16 and exhibits the activity of natural RAGE; (10) at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having sex; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 above. Indicated by one of the peptides. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE3」および「mRAGE3」とは、(1)配列番号18に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号18に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号18に示されるアミノ酸配列において、92位、95位および206位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(374)上記配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号17に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号17に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号17に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号17に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位、95位および206位のアミノ酸配列は、配列番号18における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号17に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号17に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE3” and “mRAGE3” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence containing several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, 1 or 2 at amino acid positions other than positions 92, 95 and 206 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (374) at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 above (5) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 and at least 8 A polypeptide comprising a variant having% sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 17; (7) against the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a complementary nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions or additions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 above And / or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) a nucleic acid molecule that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 under stringent conditions A polypeptide encoded by the amino acid sequence at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence And the amino acid sequence at positions 206 retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 18 and exhibits the activity of native RAGE; (10) at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having sex; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 above. Indicated by one of the peptides. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE4」および「mRAGE4」とは、(1)配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号20に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号20に示されるアミノ酸配列において、14位、17位、128位および172位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号20に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号20に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号19に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号19に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号19に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号19に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において14位、17位、128位および172位のアミノ酸配列は、配列番号20における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号19に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号19に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE4” and “mRAGE4” are (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence containing several substitutions, additions and / or deletions; (3) amino acid positions other than positions 14, 17, 128 and 172 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 above. A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, additions and / or deletions, and exhibiting the activity of native RAGE; (4) at least 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 above A polypeptide comprising a variant having the sequence identity of: (5) less than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 above (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 19; (7) a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to said nucleotide sequence; (8) one or several substitutions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having additions and / or deletions; (9) hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 above A polypeptide encoded by a nucleic acid molecule, wherein the polypeptide is at position 14 in the encoded amino acid sequence. A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 20 and shows the activity of native RAGE, wherein the amino acid sequence at positions 17, 128, and 172; (10) at least the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having 90% sequence identity; and (11) encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 above. Indicated by one of the polypeptides comprising the amino acid sequence. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE7」および「mRAGE7」とは、(1)配列番号22に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号22に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号22に示されるアミノ酸配列において、92位および95位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号22に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号22に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号21に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号21に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号21に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号21に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位および95位のアミノ酸配列は、配列番号22における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号21に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号21に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE7” and “mRAGE7” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 above A polypeptide comprising a variant; (5) at least 80% sequence homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 above. (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 21; (7) a nucleic acid complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with the sequence under stringent conditions; (8) one or several substitutions, additions and / or deletions in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 above; (9) a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 above. A peptide comprising amino acids at positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence; A polypeptide which retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 22 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid molecule having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by: and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 above Indicated by one. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE143」および「mRAGE143」とは、(1)配列番号24に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号24に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号24に示されるアミノ酸配列において、92位および95位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号24に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号24に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号23に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号23に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号23に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号23に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位および95位のアミノ酸配列は、配列番号24における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号23に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号23に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE143” and “mRAGE143” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 above A polypeptide comprising a variant; (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 above A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 23; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 under stringent conditions A polypeptide wherein the positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 24 and exhibits natural RAGE activity; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23 above Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本発明において、RAGE143を使用することが好ましくありうる。理論に束縛されることは望まないが、RAGE143は、RAGE1同様の認識活性を有し、かつ、分子としての安定性が優れているからである。RAGE1、RAGE223,RAGE226なども使用することができるが、保存中に分解が生じやすく、実験期間中に反応性が変化する可能性があることから、分解を進行させない任意の方法を用いて使用することが好ましく、あるいは長時間のアッセイにおいてはRAGE143が好ましくありうる。RAGE143に限らず、RAGE1、RAGE223,RAGE226などでも同様の結果は得られることが理解される。 In the present invention, it may be preferable to use RAGE143. Although not wishing to be bound by theory, RAGE143 has the same recognition activity as RAGE1 and is excellent in molecular stability. RAGE1, RAGE223, RAGE226, etc. can also be used. However, since decomposition is likely to occur during storage and reactivity may change during the experiment, it is used using any method that does not allow degradation to proceed. Preferably, RAGE143 may be preferred for long-term assays. It is understood that similar results can be obtained not only with RAGE 143 but also with RAGE1, RAGE223, RAGE226, and the like.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE223」および「mRAGE223」とは、(1)配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号26に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号26に示されるアミノ酸配列において、92位および95位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号26に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号26に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号25に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号25に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号25に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号25に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位および95位のアミノ酸配列は、配列番号26における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号25に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号25に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE223” and “mRAGE223” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 A polypeptide comprising an amino acid sequence containing amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of natural RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 25; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 above. A polypeptide wherein the positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 26 and exhibits natural RAGE activity; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 above. Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
本明細書において使用される場合、用語「RAGE226」および「mRAGE226」とは、(1)配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;(2)上記配列番号28に示されるアミノ酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド;(3)上記配列番号28に示されるアミノ酸配列において、92位および95位以外のアミノ酸位置で1または数個のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型RAGEの活性を示すポリペプチド;(4)上記配列番号28に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド;(5)上記配列番号28に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド;(6)配列番号27に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(7)上記配列番号27に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(8)上記配列番号27に示される核酸配列において1または数個の置換、付加および/または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(9)上記配列番号27に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において92位および95位のアミノ酸配列は、配列番号28における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型RAGEの活性を示す、ポリペプチド;(10)上記配列番号27に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および(11)上記配列番号27に示される核酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの1つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるBLAST(NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行))を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。 As used herein, the terms “RAGE226” and “mRAGE226” include (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28; (2) 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 above. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence comprising several substitutions, additions and / or deletions; (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, one or several amino acids at amino acid positions other than positions 92 and 95 A polypeptide comprising an amino acid sequence comprising amino acid substitutions, additions and / or deletions and exhibiting the activity of native RAGE; (4) having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 above (5) at least 80% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 A polypeptide comprising a variant having sequence homology; (6) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 27; (7) complementary to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a specific nucleic acid sequence; (8) one or several substitutions, additions and / or in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 above Or a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having a deletion; (9) encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 above. A polypeptide wherein the positions 92 and 95 in the encoded amino acid sequence A polypeptide that retains the corresponding amino acid in SEQ ID NO: 28 and exhibits the activity of native RAGE; (10) a nucleic acid having at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 above A polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by the molecule; and (11) a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid molecule having at least 80% sequence homology with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 above. Indicated by one of the following. The above-mentioned identity or homology is calculated using BLAST (NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.5.12)) as a sequence analysis tool and using default parameters. Stringent conditions vary depending on the sequence, and determination of such conditions is within the skill of those in the art.
なお、上記RAGE様ポリペプチドは、天然型RAGEの活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。 The RAGE-like polypeptide may contain an unnatural amino acid, an amino acid analog, an amino acid derivative, or the like as long as the activity of the natural RAGE is retained.
上記のRAGE様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは重要であるので、配列番号10のアミノ酸配列の38位、99位、144位、208位、259位および301位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。 Also in the above RAGE-like polypeptide, since it is important to form an intramolecular disulfide bond, it corresponds to positions 38, 99, 144, 208, 259 and 301 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. Cysteine is preferably retained.
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド(例えば、非天然アミノ酸などを含む)、ペプチド様化合物(例えば、ペプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包含される。 As used herein, “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is done.
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。 In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural as long as it satisfies the object of the present invention.
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。 As used herein, “amino acid derivative” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such amino acid derivatives and amino acid analogs are well known in the art. As used herein, it is understood that amino acid derivatives and amino acid analogs can be used alternatively as long as they can provide the same biological function as an amino acid.
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のL−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はL体であるが、D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。 As used herein, “natural amino acid” means an L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, γ-carboxyglutamic acid, arginine, ornithine , And lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、3−アミノ−2−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのD体またはL体およびD−フェニルアラニンが挙げられる。 As used herein, “unnatural amino acid” means an amino acid that is not normally found naturally in proteins. Examples of non-natural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homo-arginine D-form or L-form and D-phenylalanine.
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、2−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。 As used herein, “amino acid analog” refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and / or function of an amino acid. Examples of amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like. Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。 Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9(2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。 In this specification, the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters using BLAST, which is a sequence analysis tool. The identity search can be performed using, for example, NCBI BLAST 2.2.9 (issued 2004.12). In the present specification, the identity value usually refers to a value when the BLAST is used and aligned under default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is the identity value. When identity is evaluated in a plurality of areas, the highest value among them is set as the identity value.
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。例えば、LOX−1においては、232位および249位におけるアミノ酸であり、RAGEにおいては、114位、117位、228位、272位におけるアミノ酸である。 As used herein, a “corresponding” amino acid has, or is predicted to have, in a certain protein molecule or polypeptide molecule, the same action as a predetermined amino acid in a protein or polypeptide as a reference for comparison. An amino acid. For example, in LOX-1, the amino acids are at positions 232 and 249, and in RAGE, the amino acids are at positions 114, 117, 228, and 272.
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子(例えば、LOX−1)に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物(マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物(例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど)の配列データベースを検索することによって見出すことができる。 In the present specification, the “corresponding” gene refers to a gene having, or expected to have, the same action as that of a predetermined gene in a species as a reference for comparison in a certain species. When there are a plurality of genes having the same, those having the same origin evolutionarily. Thus, a gene corresponding to a gene (eg, LOX-1) can be an ortholog of that gene. Therefore, genes corresponding to human genes can be found in other animals (mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.). Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Thus, for example, the corresponding gene in an animal is the sequence of that animal (eg, mouse, rat, pig, rabbit, guinea pig, cow, sheep, etc.) using the sequence of the gene serving as the reference for the corresponding gene as a query sequence. It can be found by searching the database.
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトLOX−1の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。 As used herein, “heterologous” refers to nucleotide or amino acid sequences that are different or non-corresponding sequences, or sequences from different species. For example, the human nucleotide or amino acid sequence is heterologous to the mouse nucleotide or amino acid sequence, and the human LOX-1 nucleic acid or amino acid sequence is heterologous to the human albumin nucleotide or amino acid sequence. It is.
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド(長さがn)に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15,20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ(例えば、11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個(または例えば上下10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも1つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。 As used herein, “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, the lengths of polypeptides and polynucleotides can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the above numbers are not absolute, and the upper limit is not limited as long as they have the same function. Alternatively, the above-mentioned number as the lower limit is intended to include the upper and lower numbers (or, for example, up and down 10%) of the number. In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the value. The length of a fragment useful herein can be determined by whether or not at least one of the functions of a full-length protein that serves as a reference for the fragment is retained.
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、LOX−1が変性LDLを認識する機能、RAGEがAGEを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子(例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など)が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能(例えば、転写促進活性)を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。2つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、2分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。 As used herein, “biological function” refers to a specific function that a gene, nucleic acid molecule or polypeptide may have in vivo when referring to a gene or a nucleic acid molecule or polypeptide related thereto. Examples of the antibody include, but are not limited to, generation of specific antibodies, enzyme activity, and imparting resistance. Examples of the present invention include, but are not limited to, a function that LOX-1 recognizes denatured LDL and a function that RAGE recognizes AGE. As used herein, a biological function can be exerted by “biological activity”. As used herein, “biological activity” refers to activity that a certain factor (eg, polynucleotide, protein, etc.) may have in vivo, and exhibits various functions (eg, transcription promoting activity). For example, an activity in which another molecule is activated or inactivated by interaction with one molecule. When two factors interact, their biological activity depends on the binding between the two molecules and the resulting biological change, eg, when one molecule is precipitated with an antibody, the other When molecules also coprecipitate, the two molecules are considered bound. Therefore, seeing such coprecipitation is one method of judgment. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art.
したがって、「活性」は、結合(直接的または間接的のいずれか)を示すかまたは明らかにするか;応答に影響する(すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する)、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。 Thus, “activity” indicates or reveals binding (either direct or indirect); affects the response (ie, has a measurable effect in response to some exposure or stimulus); Refers to various measurable indicators, such as the affinity of a compound that directly binds to a polypeptide or polynucleotide of the invention, or the amount of protein upstream or downstream after some stimulation or event or other Similar measures of function are mentioned.
本明細書において「相互作用」とは、2つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力(例えば、分子間力(ファンデルワールス力)、水素結合、疎水性相互作用など)を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした2つの物質は、会合または結合している状態にある。 In this specification, the term “interaction” refers to two substances. Force (for example, intermolecular force (van der Waals force), hydrogen bond, hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Usually, two interacting substances are in an associated or bound state.
本明細書中で使用される用語「結合」は、2つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用(結合)は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。 The term “binding” as used herein means a physical or chemical interaction between two proteins or compounds or related proteins or compounds, or a combination thereof. Bonds include ionic bonds, non-ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and the like. A physical interaction (binding) can be direct or indirect, where indirect is through or due to the effect of another protein or compound. Direct binding refers to an interaction that does not occur through or due to the effects of another protein or compound and does not involve other substantial chemical intermediates.
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子(特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子)に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。2種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の(特に、同一性が30%未満の)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に(例えば、統計学的に有意に)高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 As used herein, a first substance or factor “specifically interacts” with a second substance or factor means that the first substance or factor has a second Interacting with a higher affinity than a substance or factor other than a substance or factor (especially another substance or factor present in a sample containing a second substance or factor). Specific interactions for a substance or factor include, for example, when both nucleic acid and protein are involved, such as hybridization in nucleic acids, antigen-antibody reactions in proteins, ligand-receptor reactions, enzyme-substrate reactions, etc. Examples include, but are not limited to, protein-lipid interactions, nucleic acid-lipid interactions, and the like, such as reactions with transcription factor binding sites. Thus, when both a substance or factor is a nucleic acid, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the first substance or factor has the second substance Or having at least a part of complementarity to the factor. Further, for example, when both substances or factors are proteins, the fact that the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor includes, for example, interaction by antigen-antibody reaction, receptor- Examples include, but are not limited to, interaction by a ligand reaction and enzyme-substrate interaction. When two substances or factors include proteins and nucleic acids, the first substance or factor “specifically interacts” with the second substance or factor means that the transcription factor and the transcription factor Interaction between the binding region of the nucleic acid molecule to be included. Therefore, in the present specification, a “factor that specifically interacts” with a biological agent such as a polynucleotide or a polypeptide means an affinity for the biological agent such as the polynucleotide or the polypeptide, The affinity for other unrelated (especially less than 30% identity) polynucleotides or polypeptides is typically equivalent or higher, preferably significantly (eg, statistically significant) ) Includes the expensive. Such affinity can be measured, for example, by hybridization assays, binding assays, and the like.
本明細書中で使用される「接触(させる)」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ(例えば、遺伝子チップ)などに化合物を置くことが挙げられる。 As used herein, “contacting” means bringing a compound into physical proximity, either directly or indirectly, to a polypeptide or polynucleotide of the present invention. . The polypeptide or polynucleotide can be present in many buffers, salts, solutions, and the like. Contact includes placing the compound in, for example, a beaker, microtiter plate, cell culture flask or microarray (eg, gene chip) containing a polypeptide encoding a nucleic acid molecule or fragment thereof.
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮(truncated)改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子(allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ(homolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性(好ましくは、60%以上の相同性、より好ましくは、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の相同性)を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ(ortholog)」とは、オルソロガス遺伝子(orthologous gene)ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが,ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ(遺伝子重複で生じた遺伝子)である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。 In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. An allele refers to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant having an allelic relationship with a certain gene. “Species homologue or homolog” means homology (preferably at least 60% homology, more preferably at least 80%, at a certain amino acid level or nucleotide level within a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. “Ortholog” is also called an orthologous gene, which is a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family with multiple gene structures as an example, the human and mouse α-hemoglobin genes are orthologs, but the human α- and β-hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Since orthologs are useful for the estimation of molecular phylogenetic trees, orthologs may also be useful in the present invention.
本明細書において「保存的(に改変された)改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、DNAポリメラーゼ、Klenowフラグメント、DNAリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法(特定部位指向突然変異法;Mark Zoller and Michael Smith,Methods in Enzymology,100,468−500(1983))が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の1つの種である「サイレント改変(変異)」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン(通常メチオニンのための唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除く)が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。 As used herein, “conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. An array. Such base sequence modification methods include restriction enzyme digestion, DNA polymerase, Klenow fragment, DNA ligase treatment and other ligation treatments, site-specific base substitution methods using synthetic oligonucleotides (specification) Site-directed mutagenesis; Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)), but other modifications may also be made by methods usually used in the field of molecular biology. it can. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent modifications (mutations)” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the art, each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan), produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of the polypeptide.
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのDNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するDNAにおいて行われ得る。 Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure, such as, for example, the binding site of a ligand molecule, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in proteins that still retain their original properties after substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or in the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.
このような核酸は、周知のPCR法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。 Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている(Kyte.JおよびDoolittle,R.F.J.Mol.Biol.157(1):105−132,1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子(例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原など)との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);およびアルギニン(−4.5))である。 In designing such modifications, the hydrophobicity index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ. Mol. Biol. 157 ( 1): 105-132, 1982). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 .8); Glycine (−0.4); Threonine (−0.7); Serine (−0.8); Tryptophan (−0.9); Tyrosine (−1.3); Proline (−1.6) ); Histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) And arginine (-4.5)).
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質(例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±2以内であることが好ましく、±1以内であることがより好ましく、および±0.5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第4、554、101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);およびトリプトファン(−3.4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±2以内であることが好ましく、±1以内であることがより好ましく、および±0.5以内であることがさらにより好ましい。 It is known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in ligand binding capacity). It is well known. In such amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline ( Alanine (−0.5); histidine (−0.5); cysteine (−1.0); methionine (−1.3); valine (−1.5); leucine (−0.5 ± 1); -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または/および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換:アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびスレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。 In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid is similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and isoleucine; However, it is not limited to these.
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから1つ以上、例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化(例えば、アセチル化)などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。 As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain. Deletion of amino acids means deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および/または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および/または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能(例えば、AGEの認識能など)が保持される限り、この核酸分子の5’末端もしくは3’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、1つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能(例えば、AGEの認識能など)が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの20%以内、15%以内、10%以内、5%以内、または150個以下、100個以下、50個以下、25個以下などであり得る。 As used herein, “substitution, addition and / or deletion” of a polypeptide or polynucleotide refers to an amino acid or a substitute thereof, or a nucleotide or a substitute thereof, respectively, relative to the original polypeptide or polynucleotide. , Replacing, adding, or removing. Such substitution, addition and / or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. These changes in the reference nucleic acid molecule or polypeptide can occur at the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleic acid molecule as long as the desired function (eg, AGE recognition ability, etc.) is retained, or It can occur at the amino-terminal or carboxy-terminal site of the amino acid sequence representing this polypeptide, or can occur anywhere between those terminal sites and is interspersed individually between residues in the reference sequence. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such number is a function (for example, AGE recognition ability, etc.) intended in a variant having the substitution, addition or deletion. As long as it is). For example, such a number can be one or several, and preferably within 20%, within 15%, within 10%, within 5%, or less than 150, less than 100, less than 100, It can be 50 or less, 25 or less, and the like.
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質(例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する)をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグ配列は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、mycタグ、Hisタグ、HA、Aviタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “tag sequence” refers to a substance for sorting molecules by a specific recognition mechanism such as a receptor-ligand, more specifically, to bind a specific substance. A substance (for example, having a relationship such as biotin-avidin or biotin-streptavidin) that serves as a binding partner. Thus, for example, a specific substance to which a tag sequence is bound can be selected by contacting the substrate to which the binding partner of the tag sequence is bound. Such tag sequences are well known in the art. Representative tag sequences include, but are not limited to, myc tag, His tag, HA, Avi tag and the like.
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質(例えば、変性LDL、AGEなど)を検出できるあらゆる因子をいう。 As used herein, the term “detection agent” broadly refers to any agent capable of detecting a target substance (eg, denatured LDL, AGE, etc.).
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子(例えば水晶発振子、表面弾性波素子)を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)のような機構を使用する場合、一般に、固相(基材)としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “solid phase” refers to a material used interchangeably herein with “substrate” and “substrate” from which the device of the present invention is constructed. A planar support to which molecules such as antibodies can be immobilized. In the present invention, when detecting using the principle of surface plasmon resonance, the solid phase is preferably a glass substrate base material having a metal thin film containing gold, silver or aluminum on one side. In the present invention, when detecting using the principle of the crystal oscillator microbalance, a frequency conversion element (for example, a crystal oscillator or a surface acoustic wave element) is used as a solid phase, and the receptor is directly coupled. One side of the quartz plate is coated with silicone, and the other side is provided with a gold electrode as a solid phase. In the present invention, when a mechanism such as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is used, a microtiter plate is generally used as the solid phase (substrate). The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials. Suitable substrates include beads, gold particles, plates (eg, microtiter plates), test tubes, chips, magnetic particles, membranes, fibers, glass slides, metal films, filters, tubes, balls, diamond-like carbon coated stainless steel. However, it is not limited to these.
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属(合金も含まれる)、天然および合成のポリマー(例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン)以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、PVDF膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。 As such a material for use as a solid phase and a substrate, any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicone, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (also alloys) Natural) and synthetic polymers (including, but not limited to) polystyrene, cellulose, amylose, chitosan, dextran, and nylon. The substrate may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin Organic materials such as polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. In the present invention, a membrane used for blotting such as a nylon membrane, a nitrocellulose membrane, and a PVDF membrane can also be used. When analyzing a high-density material, it is preferable to use a material having hardness such as glass. A preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above.
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび/または受容体マイクロチップと呼ぶ。 In this specification, “chip” refers to a micro integrated circuit that has various functions and is a part of a system. In the present specification, the solid phase on which the receptor is immobilized is referred to as a receptor chip and / or a receptor microchip.
本明細書において使用される場合、用語「乾燥形態」とは、本発明で使用される成分を含む検出剤、デバイス、診断剤などにおいて、実質的に水分含量が低下している状態であることをいう。一般的には、「乾燥状態」は、風乾、減圧乾燥などの当該分野で周知の技術を用いて容易に達成することができる。 As used herein, the term “dry form” means a state in which the water content is substantially reduced in a detection agent, device, diagnostic agent or the like containing the components used in the present invention. Say. In general, the “dry state” can be easily achieved by using techniques well known in the art such as air drying and drying under reduced pressure.
(一般技術)
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecμlar Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecμlar Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecμlar Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecμlar Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecμlar Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecμlar Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecμlar Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecμlar Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecμlar Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecμlar Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications: Protocols for Functional Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
(General technology)
Molecular biological techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Sambrook J. et al. et al. (1989). Molecμlar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F .; M.M. (1987). Current Protocols in Molecule Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F .; M.M. (1989). Short Protocols in Molecule Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecule Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M .; A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1992). Short Protocols in Molecule Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecule Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F .; M.M. (1995). Short Protocols in Molecule Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecule Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M .; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1999). Short Protocols in Molecule Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecule Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky. J. et al. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, “Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis”, Yodosha, 1997, etc., which are related in this specification (may be all) Is incorporated by reference.
人工的に合成した遺伝子を作製するためのDNA合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approac,IRL Press;Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。 For DNA synthesis technology and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, M. et al. J. et al. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRLPpress; Gait, M .; J. et al. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F .; (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac, IRL Press; Adams, R .; L. etal. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G .; M.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G .; T.A. (I996). Bioconjugate Technologies, Academic Press, etc., which are incorporated herein by reference in the relevant part.
本発明において用いられる配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。 The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and fragments and variants thereof used in the present invention can be produced using genetic engineering techniques.
本明細書において使用される場合、用語「標識」とは、特定の物質を検出するために、この物質に結合することが既知の物質に付加される分子をいう。標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “label” refers to a molecule that is attached to a substance that is known to bind to that substance in order to detect that substance. Examples of labels include, but are not limited to, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels, and the like.
本明細書において使用される場合、用語「リフォールディング」とは、異常な折り畳みを有するためにその本来有する機能を失っているポリペプチドの異常な構造を解きほぐし、界面活性剤により再凝集を防ぎつつ、サイクロアミロースの包接能を活用してそのポリペプチドの本来の正しい構造に再折りたたみすることをいう。 As used herein, the term “refolding” is used to unravel the abnormal structure of a polypeptide that has lost its original function due to abnormal folding, while preventing reaggregation with a surfactant. This refers to refolding to the original correct structure of the polypeptide by utilizing the inclusion ability of cycloamylose.
本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、液体に溶解すると、溶液の表面張力を著しく減少させる物質をいう。界面活性剤は、溶液の中で臨海ミセル濃度を超えると、ミセルコロイドを形成する。界面活性剤は、親水性基と親油性基とを有するために、両親媒性化合物であり、二相界面で方向配位をして安定な層をなす。界面活性剤は、長鎖脂肪酸塩やドデシル硫酸ナトリウム(SDS)のような陰イオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤、さらに両性界面活性剤、TritonTMシリーズおよびTweenTMシリーズのような非イオン性界面活性剤に分けられる。適切な界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。 As used herein, the term “surfactant” refers to a substance that, when dissolved in a liquid, significantly reduces the surface tension of the solution. A surfactant forms a micelle colloid when it exceeds the sea micelle concentration in the solution. Since the surfactant has a hydrophilic group and a lipophilic group, it is an amphiphilic compound, and forms a stable layer by directional coordination at the two-phase interface. Surfactants include anionic surfactants such as long chain fatty acid salts and sodium dodecyl sulfate (SDS), cationic surfactants such as cetyltrimethylammonium bromide, amphoteric surfactants, Triton TM series and It is divided into nonionic surfactants such as the Tween TM series. Suitable surfactants include, but are not limited to, polyoxyethylene surfactants and ionic surfactants.
(好ましい実施形態の説明)
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
(Description of Preferred Embodiment)
The description of the preferred embodiment is described below, but it should be understood that this embodiment is an illustration of the present invention and that the scope of the present invention is not limited to such a preferred embodiment. It should be understood that those skilled in the art can easily make modifications, changes and the like within the scope of the present invention with reference to the following preferred embodiments.
(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)
1つの局面において、本発明は、AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法であって、(A)検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、および(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるAGEs様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法を提供する。
(Method for detecting or quantifying molecules exhibiting AGE-like activity)
In one aspect, the present invention provides a method for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity, wherein (A) a sample to be detected or quantified is labeled in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase. Contacting with a labeled RAGE molecule in the presence of an AGE molecule immobilized on a solid phase, or (B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule. Thus, the presence or level of inhibition of binding provides a method comprising the step of indicating the presence or level of a molecule exhibiting AGEs-like activity in the sample.
この方法において、受容体分子であるRAGE分子またはそのリガンドであるAGE分子のいずれかを固相に固定し、他方の存在の元で、検出または定量の対象となるサンプルをアッセイしたところ、従来得られなかった感度の上昇、AGEs様活性を示す分子のスクリーニングの網羅性の上昇という効果が得られた。 In this method, either a receptor molecule RAGE molecule or its ligand AGE molecule is immobilized on a solid phase, and a sample to be detected or quantified in the presence of the other is assayed. The effect of the increase in the sensitivity which was not able to be obtained, and the increase in the comprehensiveness of the screening of the molecule | numerator which shows AGEs-like activity was acquired.
本発明の実施形態では、使用される固相としては、固定される分子、例えば、RAGE分子、AGE分子が固定されうる限り任意のものを利用することができる。1つの実施形態では、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)のような機構を使用する場合、一般に、固相(基材)としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。その材料としては、例えば、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。固相への固定方法は、当該分野において任意の公知の方法で実施することができる。例えば、好ましくは、固相表面上のシラノール基(SiOH)を介した結合反応、素材のマトリックスによる疎水性結合および修飾官能基によるイオン結合、マトリックスに含まれている芳香族環を介した結合反応を用いることができる。固相への固定後は、その固相は、乾燥させてもよく、湿潤状態で利用しても良い。乾燥させることによって保存がしやすくなる。 In the embodiment of the present invention, any solid phase can be used as long as a molecule to be immobilized, for example, a RAGE molecule or an AGE molecule can be immobilized. In one embodiment, when using a mechanism such as an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), a microtiter plate is generally used as the solid phase (substrate). The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials. Examples of the material include polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile. Use organic materials such as polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc. Can do. The immobilization method to the solid phase can be carried out by any known method in the art. For example, preferably, a bonding reaction via a silanol group (SiOH) on a solid surface, a hydrophobic bond by a matrix of a material and an ionic bond by a modified functional group, a bonding reaction via an aromatic ring contained in the matrix Can be used. After fixation on the solid phase, the solid phase may be dried or used in a wet state. It becomes easy to preserve by drying.
本発明において、本発明のサンプルをAGE分子またはRAGE分子に接触させる手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、両者を溶液中で混合すること、あるいはその後インキュベートすることなど手法を用いることができるがこれらに限定されない。 In the present invention, any technique known in the art can be used as a technique for bringing the sample of the present invention into contact with an AGE molecule or a RAGE molecule. For example, both of them are mixed in a solution, or then incubated. However, it is not limited to these methods.
本発明において、AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、いずれかの分子を標識(例えば、蛍光標識)した場合に、その標識を検出する任意の手法を利用することができることが理解される。ここで、上記結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるAGEs様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示すものである。 In the present invention, as a technique for detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, any technique known in the art can be used. For example, when any molecule is labeled (for example, fluorescent labeling) It will be appreciated that any technique for detecting the label can be utilized. Here, the presence / absence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of a molecule exhibiting AGE-like activity in the sample.
本発明において、AGE分子に対する該RAGE分子の結合の定量は、上記検出において、数値化する任意の手法によって、実現することができる。このような定量は相対的(レベル)でもよく、絶対量で表示してもよい。例えば、そのような手法としては、既知量のAGE分子およびRAGE分子について、検出対象となる標識の強度をプロットし、検量線を作成し、サンプルの検出データから外挿する手法が挙げられるがそれに限定されない。 In the present invention, the quantification of the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule can be realized by any method for quantifying in the above detection. Such quantification may be relative (level) or displayed as an absolute amount. For example, as such a technique, for known amounts of AGE molecules and RAGE molecules, the intensity of the label to be detected is plotted, a calibration curve is created, and extrapolated from the sample detection data. It is not limited.
1つの実施形態では、本発明において用いられるRAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体でありうる。1つの好ましい実施形態では、RAGE143が用いられる。長期保存に対して安定性が高いからであるが、これに限定されない。 In one embodiment, the RAGE molecule used in the present invention can be RAGE143, RAGE1, RAGE223, RAGE226 or a variant thereof. In one preferred embodiment, RAGE 143 is used. Although it is because stability is long with respect to long-term storage, it is not limited to this.
1つの実施形態では、本発明において用いられるAGE分子は、Lys−AGE(グルタルアルデヒド修飾リジン修飾AGE)、グルコース修飾AGE(G−AGE)、リボース修飾AGE(R−AGE)、フルクトース修飾AGE(F−AGE)またはそれらの改変体でありうる。 In one embodiment, the AGE molecule used in the present invention is Lys-AGE (glutaraldehyde modified lysine modified AGE), glucose modified AGE (G-AGE), ribose modified AGE (R-AGE), fructose modified AGE (F -AGE) or variants thereof.
(糖尿病性腎症の予備的な検出方法)
別の局面において、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な検出方法(または、予測方法もしくは予備的診断方法)であって、(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、および(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、RAGE分子またはAGE分子を用いて被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示すことが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
(Preliminary detection method for diabetic nephropathy)
In another aspect, the present invention provides a preliminary detection method (or a prediction method or a preliminary diagnosis method) for diabetic nephropathy, wherein (A) the subject is a target for detection of diabetic nephropathy. Contacting the sample with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, or contacting a labeled RAGE molecule in the presence of an AGE molecule immobilized on a solid phase; and B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject will or will have future diabetic nephropathy A method comprising: Thus, it has not been shown in the past that RAGE molecules or AGE molecules have been used to show that a subject will or will have diabetic nephropathy in the future, and significant progress has been made in the diagnostic field. It can be said that
ここで、本発明の糖尿病性腎症の予備的な検出方法(または、予測方法もしくは予備的診断方法)において、AGE分子およびRAGE分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 Here, in the preliminary detection method (or prediction method or preliminary diagnosis method) of diabetic nephropathy of the present invention, detection of AGE molecules and RAGE molecules, contact, binding, calculation of the level of binding, etc. It will be appreciated that any of the embodiments described in Methods for detecting or quantifying molecules exhibiting AGE-like activity may be utilized.
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出の方法の対象となる生物(例えば、ヒトをいう。 In the present specification, the “subject” refers to an organism (for example, a human) that is a target of the diagnosis or detection method of the present invention.
本明細書において「サンプル」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、体液(血液、唾液、尿、涙液等)が含まれる。好ましくは血液、尿、涙液を使用する。 As used herein, “sample” refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, body fluids (blood, saliva, urine, tears, etc.). Preferably blood, urine or tears are used.
結合の阻害の存否またはレベルから、被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を判定する手法は以下のとおりである。被験体の病状にかかわらず、これからサンプルを調製する。RAGEの存在下で標識したAGE分子サンプルを37℃で1時間反応させた際に、標識下AGE分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識AGE結合量(標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度)を100%とし、結合を阻害する程度が大きい程、AGE様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。 A method for determining whether or not a subject will suffer from diabetic nephropathy in the future based on the presence or absence or the level of inhibition of binding is as follows. Samples are prepared from this regardless of the condition of the subject. When a labeled AGE molecule sample is reacted at 37 ° C. for 1 hour in the presence of RAGE, the activity of inhibiting the binding of the labeled AGE molecule is quantified. The amount of labeled AGE binding when a buffer solution is added instead of the sample (when the label is a fluorescent label, the fluorescence intensity measured by a fluorometer) is 100%, and the greater the degree of inhibition of binding, the more AGE-like It is determined that the abundance of molecules showing activity is high and the possibility of being affected is high.
(糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法)
別の局面において、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法(または、予測方法もしくは予備的診断方法)であって、(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる糖尿病に罹患した被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、および(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、RAGE分子またはAGE分子を用いて糖尿病に罹患した被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示すことが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
(Preliminary detection method of diabetic nephropathy in diabetes)
In another aspect, the present invention relates to a preliminary detection method (or a prediction method or a preliminary diagnosis method) of diabetic nephropathy in diabetes, and (A) Diabetes targeted for detection of diabetic nephropathy A sample from a subject suffering from is contacted with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, or a labeled RAGE molecule in the presence of an AGE molecule immobilized on a solid phase. And (B) detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the presence or absence of inhibition of the binding is determined by whether the subject will suffer from diabetic nephropathy in the future or A method is provided that includes a step that indicates a possibility. Thus, it has not been shown in the past that a subject suffering from diabetes using RAGE molecule or AGE molecule has or will show the possibility of having diabetic nephropathy in the future. It can be said that it shows remarkable progress.
ここで、本発明の糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法(または、予測方法もしくは予備的診断方法)において、AGE分子およびRAGE分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 Here, in the preliminary detection method (or prediction method or preliminary diagnosis method) of diabetic nephropathy in diabetes of the present invention, detection of AGE molecule and RAGE molecule, contact, binding, calculation of binding level, etc. It is understood that any of the embodiments described in (Methods for detecting or quantifying molecules exhibiting AGE-like activity) can be utilized.
結合の阻害の存否またはレベルから、糖尿病に罹患した被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を判定する手法は以下のとおりである。糖尿病に罹患した被験体からサンプルを調製する。RAGEの存在下で標識したAGE分子サンプルを37℃で1時間反応させた際に、標識下AGE分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識AGE結合量(標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度)を100%とし、結合を阻害する程度が大きい程、AGE様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。 A method for determining whether or not a subject suffering from diabetes will suffer from or is likely to suffer from diabetic nephropathy based on the presence or absence or the level of binding inhibition is as follows. Samples are prepared from subjects with diabetes. When a labeled AGE molecule sample is reacted at 37 ° C. for 1 hour in the presence of RAGE, the activity of inhibiting the binding of the labeled AGE molecule is quantified. The amount of labeled AGE binding when a buffer solution is added instead of the sample (when the label is a fluorescent label, the fluorescence intensity measured by a fluorometer) is 100%, and the greater the degree of inhibition of binding, the more AGE-like It is determined that the abundance of molecules showing activity is high and the possibility of being affected is high.
(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)
別の局面において、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法(または、診断方法)であって、(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させるか、または固相に固定されたAGE分子の存在下で、標識したRAGE分子に接触させる工程、および(B)該固定化されたAGEもしくはその改変体に対する該RAGE分子または該AGEもしくはその改変体のリガンドの結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、RAGE分子またはAGE分子を用いて糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを診断することができることが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
(Detection method of diabetes or diabetic nephropathy)
In another aspect, the present invention relates to a detection method (or diagnostic method) for diabetes or diabetic nephropathy, in which (A) a sample from a subject to be detected for diabetic nephropathy is used as a solid phase. Contacting with the labeled AGE molecule in the presence of the RAGE molecule immobilized on, or contacting with the labeled RAGE molecule in the presence of the AGE molecule immobilized on the solid phase, and (B) the immobilized Detecting the binding of the RAGE molecule or a ligand of the AGE or a variant thereof to an AGE or variant thereof, wherein the presence or level of inhibition of the binding is determined by the subject having diabetes or diabetic nephropathy A method is provided comprising the step of indicating that the patient is afflicted. Thus, it has been shown that RAGE molecules or AGE molecules can be used to diagnose having diabetes or diabetic nephropathy, and has made remarkable progress in the diagnostic field. It can be said to be a thing.
ここで、本発明の糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法において、AGE分子およびRAGE分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 Here, in the method for detecting diabetes or diabetic nephropathy of the present invention, AGE molecules and RAGE molecules, contact, detection of binding, calculation of the level of binding, etc. (method of detecting or quantifying molecules exhibiting AGEs-like activity) It is understood that any of the embodiments described in can be utilized.
結合の阻害の存否またはレベルから、被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを判定する手法は以下のとおりである。糖尿病または糖尿病性腎症に罹患している疑いのあるあるいは検査の対象となる被験体からサンプルを調製する。RAGEの存在下で標識したAGE分子サンプルを37℃で1時間反応させた際に、標識下AGE分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識AGE結合量(標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度)を100%とし、結合を阻害する程度が大きい程、AGE様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。 A technique for determining that a subject is suffering from diabetes or diabetic nephropathy based on the presence or absence or level of inhibition of binding is as follows. Samples are prepared from a subject suspected of having or suffering from diabetes or diabetic nephropathy. When a labeled AGE molecule sample is reacted at 37 ° C. for 1 hour in the presence of RAGE, the activity of inhibiting the binding of the labeled AGE molecule is quantified. The amount of labeled AGE binding when a buffer solution is added instead of the sample (when the label is a fluorescent label, the fluorescence intensity measured by a fluorometer) is 100%, and the greater the degree of inhibition of binding, the more AGE-like It is determined that the abundance of molecules showing activity is high and the possibility of being affected is high.
(OxLDL様活性を示す分子の検出または定量方法)
1つの局面において、本発明は、OxLDL様活性を示す分子の検出または定量方法であって、(A)検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたCTLD分子の存在下で標識した変性LDLに接触させるか、または固相に固定された変性LDLの存在下で、標識したCTLD分子に接触させる工程、および(B)該変性LDLに対する該CTLD分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、OxLDL様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法を提供する。
(Method for detecting or quantifying molecules exhibiting OxLDL-like activity)
In one aspect, the present invention provides a method for detecting or quantifying a molecule exhibiting OxLDL-like activity, wherein (A) a sample to be detected or quantified is labeled in the presence of a CTLD molecule immobilized on a solid phase. Contacting with the denatured LDL or contacting with the labeled CTLD molecule in the presence of the denatured LDL immobilized on the solid phase, and (B) detecting the binding of the CTLD molecule to the denatured LDL. Thus, the presence or level of inhibition of binding provides a method comprising the step of indicating the presence or level of a molecule exhibiting OxLDL-like activity.
この方法において、受容体分子であるCTLD分子またはそのリガンドである変性LDLのいずれかを固相に固定し、他方の存在の元で、検出または定量の対象となるサンプルをアッセイしたところ、従来得られなかった感度の上昇、OxLDL様活性を示す分子のスクリーニングの網羅性の上昇という効果が得られた。 In this method, either a CTLD molecule as a receptor molecule or a denatured LDL as a ligand thereof is immobilized on a solid phase, and a sample to be detected or quantified is assayed in the presence of the other. The effect of the increase in the sensitivity which was not able to be obtained, and the increase in the comprehensiveness of the screening of the molecule | numerator which shows OxLDL-like activity was acquired.
本発明の実施形態では、使用される固相としては、固定される分子、例えば、CTLD分子、変性LDLが固定されうる限り任意のものを利用することができる。1つの実施形態では、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)のような機構を使用する場合、一般に、固相(基材)としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。その材料としては、例えば、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。 In the embodiment of the present invention, any solid phase can be used as long as a molecule to be immobilized, for example, a CTLD molecule or a modified LDL can be immobilized. In one embodiment, when using a mechanism such as an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), a microtiter plate is generally used as the solid phase (substrate). The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials. Examples of the material include polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile. Use organic materials such as polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc. Can do.
固相への固定方法は、当該分野において任意の公知の方法で実施することができる。例えば、好ましくは、固相表面上のシラノール基(SiOH)による結合、素材のマトリックスによる疎水性結合および修飾官能基によるイオン結合、マトリックスに含まれている芳香族環を介した結合を用いることができる。固相への固定後は、その固相は、乾燥させてもよく、湿潤状態で利用しても良い。乾燥させることによって保存がしやすくなる。 The immobilization method to the solid phase can be carried out by any known method in the art. For example, it is preferable to use a bond by a silanol group (SiOH) on a solid surface, a hydrophobic bond by a matrix of a material and an ionic bond by a modified functional group, or a bond through an aromatic ring contained in the matrix. it can. After fixation on the solid phase, the solid phase may be dried or used in a wet state. It becomes easy to preserve by drying.
本発明において、本発明のサンプルをCTLD分子または変性LDLに接触させる手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、両者を溶液中で混合すること、あるいはその後インキュベートすることなど手法を用いることができるがこれらに限定されない。 In the present invention, as a method of bringing the sample of the present invention into contact with a CTLD molecule or denatured LDL, any method known in the art can be used. For example, both of them are mixed in a solution, or then incubated. However, it is not limited to these methods.
本発明において、CTLD分子に対する変性LDLの結合を検出する手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、いずれかの分子を標識(例えば、蛍光標識)した場合に、その標識を検出する任意の手法を利用することができることが理解される。ここで、上記結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるOxLDL様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示すものである。 In the present invention, as a technique for detecting the binding of denatured LDL to a CTLD molecule, any technique known in the art can be used. For example, when any molecule is labeled (for example, a fluorescent label), It will be appreciated that any technique for detecting the label can be utilized. Here, the presence / absence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of a molecule exhibiting OxLDL-like activity in the sample.
本発明において、CTLD分子に対する変性LDLの結合の定量は、上記検出において、数値化する任意の手法によって、実現することができる。このような定量は相対的(レベル)でもよく、絶対量で表示してもよい。例えば、そのような手法としては、既知量のCTLD分子および変性LDLについて、検出対象となる標識の強度をプロットし、検量線を作成し、サンプルの検出データから外挿する手法が挙げられるがそれに限定されない。 In the present invention, the quantification of the binding of denatured LDL to CTLD molecules can be realized by any method of quantifying in the above detection. Such quantification may be relative (level) or displayed as an absolute amount. For example, as such a technique, for known amounts of CTLD molecules and denatured LDL, the intensity of the label to be detected is plotted, a calibration curve is created, and extrapolated from the sample detection data. It is not limited.
1つの実施形態において、本発明において用いられるCTLD分子は、CTLD14、LOX−1全長、LOX−1細胞外領域全長またはそれらの改変体でありうる。好ましくは、CTLD14を用いることができる。長期保存に対して安定性が高いからであるが、これに限定されない。 In one embodiment, the CTLD molecule used in the present invention may be CTLD14, LOX-1 full length, LOX-1 full length extracellular region or a variant thereof. Preferably, CTLD14 can be used. Although it is because stability is long with respect to long-term storage, it is not limited to this.
1つの実施形態では、本発明において用いられる変性LDLは、酸化LDL(OxLDL)、マロンジアルデヒド化LDL(MDA−LDL)、アクロレイン修飾LDL、ノネナール修飾LDL、クロトンアルデヒド(CRA)修飾LDL、4−ヒドロキシノネナール(HNE)修飾LDL、ヘキサノイル(HEL)修飾LDL、小粒子LDL、糖化LDL、アセチル化LDLまたはその改変体でありうる。 In one embodiment, the modified LDL used in the present invention is oxidized LDL (OxLDL), malondialdehyded LDL (MDA-LDL), acrolein modified LDL, nonenal modified LDL, crotonaldehyde (CRA) modified LDL, 4- It may be hydroxynonenal (HNE) modified LDL, hexanoyl (HEL) modified LDL, small particle LDL, saccharified LDL, acetylated LDL or a variant thereof.
(AGEs様活性を示す分子の検出または定量のためのキット)
1つの局面において、本発明は、AGEs様活性を示す分子の検出または定量のためのキットを提供する。このキットは、(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する手段を備える。このキットにおいて、該結合の阻害の存否またはレベルは、AGEs様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す。本発明のキットにおいて使用されうるRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
(Kit for detection or quantification of molecules exhibiting AGE-like activity)
In one aspect, the present invention provides kits for the detection or quantification of molecules that exhibit AGEs-like activity. The kit comprises (A) a solid phase and labeled AGE molecule having an immobilized RAGE molecule, or a solid phase and labeled RAGE molecule having an immobilized AGE molecule; and (B) the RAGE molecule to the AGE molecule. Means for detecting binding are provided. In this kit, the presence or absence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of molecules exhibiting AGEs-like activity. The RAGE molecule, solid phase, AGE molecule, label, contact, binding detection technique or means that can be used in the kit of the present invention, the calculation of the level of binding, etc. (the method for detecting or quantifying molecules exhibiting AGE-like activity) It will be understood that any of the embodiments described in FIG.
(糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットまたはマーカー)
別の局面において、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な検出または診断(または、予測)のためのキットを提供する。ここで、このキットは(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および(B)該AGEに対する該RAGE分子の結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。本発明のキットにおいて使用されうるRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
(Kit or marker for detection or diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy)
In another aspect, the present invention provides a kit for preliminary detection or diagnosis (or prediction) of diabetic nephropathy. Wherein the kit comprises (A) a solid phase and labeled AGE molecule having an immobilized RAGE molecule, or a solid phase and labeled RAGE molecule having an immobilized AGE molecule; and (B) the RAGE molecule to the AGE The presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is or will be suffering from diabetic nephropathy in the future. The RAGE molecule, solid phase, AGE molecule, label, contact, binding detection technique or means that can be used in the kit of the present invention, the calculation of the level of binding, etc. (detection or quantification method of molecules exhibiting AGEs-like activity) It is understood that any of the embodiments described in (Methods for detecting diabetes or diabetic nephropathy) can be utilized.
別の局面において、本発明は、AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病性腎症の予備的な診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。AGEs様活性またはAGEs様活性を示す分子は、本発明のAGE分子またはRAGE分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるAGEs様活性、AGEs様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 In another aspect, the present invention provides a preliminary diagnostic marker for diabetic nephropathy comprising a molecule that exhibits AGE-like activity. Alternatively, the present invention is the use of AGEs-like activity in a subject to serve as a preliminary diagnostic indicator of diabetic nephropathy, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value, Uses are provided that indicate that a subject will or will likely suffer from diabetic nephropathy in the future. Here, when the diagnostic marker of the present invention is measured, the fact that the AGE-like activity is higher than the standard value indicates that the subject will suffer from or may have diabetic nephropathy in the future. Molecules that exhibit AGEs-like activity or AGEs-like activity can be measured using a technique using the AGE molecule or RAGE molecule of the present invention. AGEs-like activity, molecules exhibiting AGEs-like activity that can be used in the diagnostic markers or uses of the present invention, and RAGE molecules, solid phases, AGE molecules, labels, contacts, binding detection techniques or means, etc. As for the calculation of the level of the above, it is possible to use any of the embodiments described in (Method for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity), (Method for detecting diabetes or diabetic nephropathy) and other columns. Understood.
別の局面において、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出または診断(または、予測)のためのキットを提供する。このキットは、(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および(B)該AGEに対する該分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。本発明のこのキットにおいて使用されうるRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 In another aspect, the present invention provides a kit for preliminary detection or diagnosis (or prediction) of diabetic nephropathy in diabetes. The kit includes (A) a solid phase and labeled AGE molecule having an immobilized RAGE molecule, or a solid phase and labeled RAGE molecule having an immobilized AGE molecule; and (B) binding of the molecule to the AGE. Means for detecting are provided. Here, the presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is or will likely suffer from diabetic nephropathy in the future. The RAGE molecule, solid phase, AGE molecule, label, contact, binding detection technique or means, etc. that can be used in this kit of the present invention include the calculation of the level of binding, etc. (detection or quantification of molecules showing AGEs-like activity) It is understood that any embodiment described in (Method), (Method of Detecting Diabetes or Diabetic Nephropathy) can be utilized.
別の局面において、本発明は、AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。AGEs様活性またはAGEs様活性を示す分子は、本発明のAGE分子またはRAGE分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるAGEs様活性、AGEs様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病における糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 In another aspect, the present invention provides a preliminary diagnostic marker for diabetic nephropathy in diabetes comprising a molecule that exhibits AGE-like activity. Alternatively, the present invention is the use of AGEs-like activity in a subject to serve as a preliminary diagnostic indicator of diabetic nephropathy in diabetes, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value. The use is provided wherein the subject is or will likely suffer from diabetic nephropathy in the future. Here, when the diagnostic marker of the present invention is measured, the fact that the AGE-like activity is higher than the standard value indicates that the subject will suffer from or may have diabetic nephropathy in the future. Molecules that exhibit AGEs-like activity or AGEs-like activity can be measured using a technique using the AGE molecule or RAGE molecule of the present invention. AGEs-like activity, molecules exhibiting AGEs-like activity that can be used in the diagnostic markers or uses of the present invention, and RAGE molecules, solid phases, AGE molecules, labels, contacts, binding detection techniques or means, etc. As for the calculation of the level of the above, any of the embodiments described in (Method of detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity), (Method of detecting diabetes or diabetic nephropathy in diabetes) and other columns may be used. It is understood.
別の局面において、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットを提供する。ここでこのキットは、(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子、または固定されたAGE分子を有する固相および標識したRAGE分子;および(B)該AGEに対する該分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す。本発明のこのキットにおいて使用されうるRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。 In another aspect, the present invention provides a kit for the detection or diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy. Wherein the kit comprises (A) a solid phase and labeled AGE molecule having an immobilized RAGE molecule, or a solid phase and labeled RAGE molecule having an immobilized AGE molecule; and (B) the molecule of said molecule against the AGE. Means for detecting binding are provided. Here, the presence or level of inhibition of the binding indicates that the subject is suffering from diabetes or diabetic nephropathy. The RAGE molecule, solid phase, AGE molecule, label, contact, binding detection technique or means, etc. that can be used in this kit of the present invention include the calculation of the level of binding, etc. (detection or quantification of molecules showing AGEs-like activity) It is understood that any embodiment described in (Method), (Method of Detecting Diabetes or Diabetic Nephropathy) can be utilized.
別の局面において、本発明は、AGEs様活性を示す分子を含む、糖尿病または糖尿病性腎症の診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の診断の指標とするための、被験体中のAGEs様活性の使用であって、該AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、AGEs様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す。AGEs様活性またはAGEs様活性を示す分子は、本発明のAGE分子またはRAGE分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるAGEs様活性、AGEs様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するRAGE分子、固相、AGE分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(AGEs様活性を示す分子の検出または定量方法)、(糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法)ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
In another aspect, the present invention provides a diagnostic marker for diabetes or diabetic nephropathy comprising a molecule that exhibits AGEs-like activity. Alternatively, the present invention relates to the use of AGEs-like activity in a subject to serve as an index for diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy, wherein the AGEs-like activity is higher than a standard value. Uses are provided that indicate that the body is suffering from diabetes or diabetic nephropathy. Here, when the diagnostic marker of the present invention is measured, the fact that the AGEs-like activity is higher than the standard value indicates that the subject suffers from diabetes or diabetic nephropathy. Molecules that exhibit AGEs-like activity or AGEs-like activity can be measured using a technique using the AGE molecule or RAGE molecule of the present invention. AGEs-like activity, molecules exhibiting AGEs-like activity that can be used in the diagnostic markers or uses of the present invention, and RAGE molecules, solid phases, AGE molecules, labels, contacts, binding detection techniques or means, etc. As for the calculation of the level of the above, it is possible to use any of the embodiments described in (Method for detecting or quantifying a molecule exhibiting AGE-like activity), (Method for detecting diabetes or diabetic nephropathy) and other columns. Understood.
(OxLDL様活性を示す分子の検出または定量のためのキット)
別の局面において、本発明は、OxLDL様活性を示す分子の検出または定量のためのキットを提供する。このキットは、(A)固定されたCTLD分子を有する固相および標識した変性LDL、または固定された変性LDLを有する固相および標識したCTLD分子;および(B)該変性LDLに対する該CTLD分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存否またはレベルは、OxLDL様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す。本発明のこのキットにおいて使用されうる変性LDL,CTLD分子、固相、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、(OxLDL様活性を示す分子の検出または定量方法)において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
(Kit for detection or quantification of molecules exhibiting OxLDL-like activity)
In another aspect, the present invention provides kits for the detection or quantification of molecules that exhibit OxLDL-like activity. The kit comprises (A) a solid phase with labeled CTLD molecule and labeled denatured LDL, or a solid phase with labeled denatured LDL and labeled CTLD molecule; and (B) the CTLD molecule against the denatured LDL. Means for detecting binding are provided. Here, the presence or absence or level of inhibition of the binding indicates the presence or level of a molecule exhibiting OxLDL-like activity. The modified LDL, CTLD molecule, solid phase, label, contact, binding detection technique or means, etc. that can be used in this kit of the present invention include the calculation of the level of binding, etc. (detection or quantification of molecules exhibiting OxLDL-like activity) It is understood that any embodiment described in (Method) can be utilized.
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。 References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described with reference to the preferred embodiments for easy understanding. In the following, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided only for the purpose of illustration, not for the purpose of limiting the present invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described in the present specification, but is limited only by the scope of the claims.
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、食品総合研究所において規定される基準を遵守した。なお、以下に製造例を記載するが、詳細な情報は、さらに非特許文献7を参酌することができることが理解される。 The handling of the animals used in the following examples complied with the standards defined by the Food Research Institute. In addition, although a manufacture example is described below, it is understood that non-patent document 7 can be further referred to for detailed information.
(製造例1:CTLD様ポリペプチドの生成)
切断部位2箇所に変異を導入したCTLD様ポリペプチド(G232A/G249A;本例中、PR−CTLDともいう)をコードする核酸を、定法に従って生成した。定法に従って、この核酸を、シアン蛍光タンパク質(CFP)を融合させた哺乳動物用発現ベクターpECFP(Clontech,USA)に導入することによって、N末端にCFPが融合したPR−CTLDコード核酸を含むプラスミドを構築した。CHO細胞を10% FCSを補充したF12培地中、37℃において5%CO2加湿雰囲気下で培養した。1×104細胞/mlの密度で懸濁したCHO細胞400μlを、トランスフェクションを行う24時間前に、カバーガラス上に播種した。細胞を、LipofectAMINE試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、48時間インキュベートし、CHO細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、CFPの蛍光によりCTLD様ポリペプチド発現細胞が確認できた。また、リガンドである変性LDLを蛍光色素である過塩素酸1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン(DiD;Molecμlar Probes,Eugene,OR)により標識し、この変性LDLをCTLD様ポリペプチド発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
(Production Example 1: Production of CTLD-like polypeptide)
A nucleic acid encoding a CTLD-like polypeptide (G232A / G249A; also referred to as PR-CTLD in this example) having mutations introduced at two cleavage sites was produced according to a standard method. By introducing this nucleic acid into a mammalian expression vector pECFP (Clontech, USA) fused with cyan fluorescent protein (CFP) according to a standard method, a plasmid containing PR-CTLD-encoding nucleic acid fused with CFP at the N-terminus is obtained. It was constructed. CHO cells were cultured in F12 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . 400 μl of CHO cells suspended at a density of 1 × 10 4 cells / ml were seeded on a cover glass 24 hours before transfection. Cells were transfected with LipofectAMINE reagent according to the manufacturer's protocol, incubated for 48 hours and transiently expressed in CHO cells. Thereafter, the cells were observed with a fluorescence microscope, and CTLD-like polypeptide-expressing cells were confirmed by CFP fluorescence. Further, the modified LDL as a ligand is labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine (DiD; Molec μlar Probes, Eugene, OR) as a fluorescent dye. When this modified LDL was added to CTLD-like polypeptide-expressing cells, the ligand recognition ability and uptake ability could be confirmed.
これらの結果から、PR−CTLD発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性を付与するために行ったアミノ酸置換は、変性LDL認識能には何ら影響を与えていないことが示された。 From these results, PR-CTLD expressing cells showed a clear ligand uptake ability, and it was shown that the amino acid substitution performed for conferring protease resistance had no effect on the ability to recognize denatured LDL. .
さらに、このPR−CTLDのプロテアーゼ感受性を検討したところ、2u(1uは、1mgの対象タンパク質を分解可能な濃度)のトロンビンで、0.02mgのPR−CTLDを18時間処理しても分解が起こらないことが確認され、プロテアーゼ耐性CTLD様ポリペプチド(PR−CTLD)を生成することに成功した。 Furthermore, when the protease sensitivity of this PR-CTLD was examined, degradation occurred even when 0.02 mg of PR-CTLD was treated for 18 hours with 2u (1u is a concentration capable of degrading 1 mg of the target protein) thrombin. It was confirmed that there was no protease, and a protease-resistant CTLD-like polypeptide (PR-CTLD) was successfully produced.
(製造例2:タグ配列付加CTLD様ポリペプチドの生成)
製造例1において生成したCTLD様ポリペプチド(PR−CTLD)に加えて、さらに、CTLD様ポリペプチドと同様のプロテアーゼ耐性変異を導入した長さの異なるタンパク質PR−CTLD14(ネック領域の14アミノ酸を含む、LOX−1のアミノ酸129位〜273位)を作成した。PR−CTLD14のアミノ酸配列には分子間S−S結合に関与するCysが含まれる。分子間S−S結合を形成しなくても認識能はあるが、細胞上で機能を発現する際には、一定以上の分子密度をとる必要がある(Xieら、DNA and Cell Biology 23(2):111−117(2004)およびMatsunagaら、Experimental Cell Research 313:1203−1214(2007))。そこで、高密度集積に寄与し得る構造として分子間S−S結合形成が可能なPR−CTLD14もまた、変性LDLを検出するアッセイ系を構築するのに使用することができる。
(Production Example 2: Generation of tag sequence-added CTLD-like polypeptide)
In addition to the CTLD-like polypeptide (PR-CTLD) produced in Production Example 1, the protein PR-CTLD14 (including 14 amino acids in the neck region) having a different length in which a protease resistance mutation similar to that of the CTLD-like polypeptide is further introduced. , Amino acids 129 to 273 of LOX-1). The amino acid sequence of PR-CTLD14 includes Cys involved in intermolecular S—S bond. Although there is recognition ability without forming an intermolecular S—S bond, it is necessary to take a molecular density of a certain level or higher when expressing a function on a cell (Xie et al., DNA and Cell Biology 23 (2 ): 111-117 (2004) and Matsunaga et al., Experimental Cell Research 313: 1203-1214 (2007)). Accordingly, PR-CTLD14 capable of forming an intermolecular SS bond as a structure that can contribute to high-density integration can also be used to construct an assay system for detecting denatured LDL.
発現させたプロテアーゼ耐性のCTLD様ポリペプチド(PR−CTLDおよびPR−CTLD14)を検出/評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のN末側に2種類のタグ(一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE(配列番号29))、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるStreptag(AWRHPQFGG(配列番号30))またはStreptagII(WSHPQFEK(配列番号31))を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く(KD=10−15M)、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが(KD=10−7M)、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なStreptagII(WSHPQFEK(配列番号31))付加タンパク質も生成した。いずれもpET系ベクターの5’側に、タグ配列をコードする核酸配列を導入して発現用プラスミドとした(pET N−Avi、pET N−StII)。定法に従って、これらの発現ベクターそれぞれにPR−CTLDおよびPR−CTLD14を導入して、発現構築物を生成した。AviTag付加タンパク質のビオチン化のために、pET系ベクターと同一菌体内で保持可能なpAC系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているBirA遺伝子を導入し、発現用プラスミドを作製した(BirA/pAC)。 When utilizing the expressed protease-resistant CTLD-like polypeptides (PR-CTLD and PR-CTLD14) in a detection / evaluation system, it is desirable that effective modifications are applied. Therefore, two types of tags (one sequence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 29)) that undergoes biotinylation in E. coli and the other are Streptag (AWRHPQFGGG) that is a sequence directly recognized by streptavidin. (SEQ ID NO: 30)) or Streptag II (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 31)) was added.The binding of biotin and streptavidin was the strongest by non-covalent bond (KD = 10 −15 M), immobilization via streptavidin, etc. However, in order to biotinylate, it takes time and effort to add biotin to the medium and to co-express biotin ligase. (KD = 10 −7 M), tag added on gene sequence and colon A StreptagII (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 31))-added protein capable of binding to streptavidin when expressed in bacteria was also generated, and in each case, a nucleic acid sequence encoding a tag sequence was introduced into the 5 ′ side of the pET system vector. The plasmids for expression (pET N-Avi, pET N-St II) PR-CTLD and PR-CTLD14 were introduced into each of these expression vectors according to a standard method to generate an expression construct. For conversion, a BirA gene encoding biotin ligase was introduced into a pAC vector that can be maintained in the same microbial cell as the pET vector to prepare an expression plasmid (BirA / pAC).
PR−CTLDおよびPR−CTLD14はともに、分子内S−S結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてOrigami B(DE3)(Novagen,USA)を用いた。Origami B(DE3)は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のS−S結合形成を促進する性質がある。プロテアーゼ耐性CTLD様ポリペプチドにAviTagを付加する場合、AviTagおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、BirA遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン(15μg/ml)、アンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml)を添加した(いずれも最終濃度)LB培地中で37℃で培養した。StreptagIIコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン(15μg/ml)、アンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)を添加したLB培地中で37℃で培養した。PR−CTLDおよびPR−CTLD14の発現を、IPTGを添加することによって誘導した。 In both PR-CTLD and PR-CTLD14, formation of an intramolecular S—S bond is essential for structural stabilization and function. Therefore, Origami B (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host. Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. When AviTag was added to a protease resistant CTLD-like polypeptide, it was simultaneously transformed with a vector containing a nucleic acid sequence encoding AviTag and the target protein and an expression vector containing a BirA gene. The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 37 ° C. in LB medium. When transformed with an expression vector containing StreptagII-encoding nucleic acid, it was cultured at 37 ° C. in LB medium supplemented with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), and tetracycline (12.5 μg / ml). Expression of PR-CTLD and PR-CTLD14 was induced by adding IPTG.
予備実験として、PR−CTLDおよびPR−CTLD14を可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、(1)37℃、(2)25℃および(3)20℃に設定した。誘導時間は、(A)2時間、(B)4時間、(C)8時間、(D)18時間、(E)24時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を37℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、予想される分子量のタンパク質の誘導が確認されたが、100%が不溶性画分に回収された。この結果に鑑みて、誘導時間を変動させずに、誘導時の温度を25℃に下げたところ、わずかながら可溶性ポリペプチドとしての発現が確認された。さらに誘導時の温度を20℃にまで下げて、誘導時間の検討を行ったところ、可溶性ポリペプチドとして回収するためには、温度条件(3)および誘導時間(D)18時間〜(E)24時間、特に20〜24時間の誘導が適切であると結論付けられた。 As a preliminary experiment, temperature conditions and induction time for expressing PR-CTLD and PR-CTLD14 as soluble polypeptides were examined. The temperature conditions were set to (1) 37 ° C, (2) 25 ° C and (3) 20 ° C. The induction time was set to (A) 2 hours, (B) 4 hours, (C) 8 hours, (D) 18 hours, and (E) 24 hours. First, these host cells were induced at 37 ° C., and the molecular weight of the induced protein was measured. As a result, induction of the protein having the expected molecular weight was confirmed, but 100% was recovered in the insoluble fraction. In view of this result, when the induction temperature was lowered to 25 ° C. without changing the induction time, expression as a soluble polypeptide was confirmed slightly. Further, the induction time was lowered to 20 ° C. and the induction time was examined. In order to recover the soluble polypeptide, the temperature condition (3) and the induction time (D) 18 hours to (E) 24 It was concluded that induction of time, particularly 20-24 hours, was appropriate.
上記の形質転換細胞を37℃で12時間前培養した。本培養は、この前培養液を、20倍希釈になるように上記の各LB培地に添加し、25℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度(A600)が約0.5に達したときに、培養温度を20℃に下げると同時に、1mM(最終濃度)IPTGを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。AviTag付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に50μM(最終濃度)のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後20〜24時間後に12,000rpm×5分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のTBSで洗浄した。 The above transformed cells were pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours. In the main culture, this pre-cultured solution was added to each of the LB media so as to be diluted 20-fold, and swirled at 25 ° C. Based on the conditions obtained above, when the optical density (A600) of the culture solution reached about 0.5, the culture temperature was lowered to 20 ° C. and at the same time, 1 mM (final concentration) IPTG was added. Protein expression was induced. When the AviTag-added protein was produced, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and the target protein to be expressed was simultaneously biotinylated. Twenty to 24 hours after the start of induction, the cells were pelleted by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, the supernatant was discarded, and washed with an appropriate amount of TBS.
TBSに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、15,000rpm×30分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。発現された目的タンパク質の90%以上が不溶性画分に残った。目的タンパク質は、精製のためのHisタグがC末側に付加されているので、Ni−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したAviTagも精製に利用可能であり、この場合は、streptavidin Mutein matrix(Roche)に吸着後、ビオチンにより溶出させた。StrepTagIIの場合、Strep−Tactin Sepharose(IBA,US)に吸着後、desthiobiotinにより溶出させた。PR−CTLDおよびPR−CTLD14とも、1L当たりの収量は、以下の表1に示すように、0.5mg未満であった。 The bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the supernatant recovered by centrifugation at 15,000 rpm × 30 minutes was used as the soluble fraction. More than 90% of the expressed target protein remained in the insoluble fraction. Since the His protein for purification was added to the C-terminal side, the target protein was purified by eluting with imidazole after binding to Ni-agarose. AviTag added for detection can also be used for purification. In this case, it was adsorbed on streptavidin Mutein matrix (Roche) and then eluted with biotin. In the case of StrepTag II, it was adsorbed on Strep-Tactin Sepharose (IBA, US) and then eluted with dessiobiotin. For both PR-CTLD and PR-CTLD14, the yield per liter was less than 0.5 mg as shown in Table 1 below.
(製造例3:RAGE様分子)
切断部位4箇所に変異を導入したsRAGE1様ポリペプチド(R114Q/V117A/R228N/M272I;本例中、mRAGE1ともいう)を定法に従って生成した。この核酸を、定法に従って、シアン蛍光タンパク質(CFP)を融合させた哺乳動物用発現ベクターpECFP(Clontech,USA)またはpTarget(Promega)に導入することによって、N末端にCFPが融合したmRAGE1コード核酸を含むプラスミドを構築した。CHO細胞を10% FCSを補充したF12培地中、37℃において5%CO2加湿雰囲気下で培養した。1×104細胞/mlの密度で懸濁したCHO細胞400μlを、トランスフェクションを行う24時間前に、カバースリップ上に播種した。細胞を、LipofectAMINE試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、48時間インキュベートし、CHO細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、CFPの蛍光によりmRAGE1発現細胞が確認できた。また、リガンドであるリボースにより糖化処理したBSA(R−AGE,製造法は製造例8を参照。)を蛍光色素であるAlexa633(Molecμlar Probe)により標識し、この標識糖化BSA(AGE分子)をmRAGE1発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
(Production Example 3: RAGE-like molecule)
A sRAGE1-like polypeptide (R114Q / V117A / R228N / M272I; also referred to as mRAGE1 in this example) having a mutation introduced at four cleavage sites was produced according to a standard method. By introducing this nucleic acid into a mammalian expression vector pECFP (Clontech, USA) fused with cyan fluorescent protein (CFP) or pTarget (Promega) according to a standard method, an mRAGE1-encoding nucleic acid fused with CFP at the N-terminus is obtained. The containing plasmid was constructed. CHO cells were cultured in F12 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . 400 μl of CHO cells suspended at a density of 1 × 10 4 cells / ml were seeded on coverslips 24 hours before transfection. Cells were transfected with LipofectAMINE reagent according to the manufacturer's protocol, incubated for 48 hours and transiently expressed in CHO cells. Then, when this cell was observed with the fluorescence microscope, the mRAGE1 expression cell was confirmed by the fluorescence of CFP. Further, BSA (R-AGE, see Production Example 8 for the production method) saccharified with ribose as a ligand is labeled with Alexa633 (Molecula Probe) as a fluorescent dye, and this labeled glycated BSA (AGE molecule) is labeled mRAGE1. When added to the expression cells, the ability to recognize and take up the ligand was confirmed.
mRAGE1発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性の増大を狙ったアミノ酸置換は、リガンド認識能には影響を与えていないことが示された。 mRAGE1-expressing cells showed clear ligand uptake ability, and it was shown that amino acid substitution aimed at increasing protease resistance did not affect ligand recognition ability.
さらに、そのプロテアーゼ感受性を検討したところ、天然型に比べ耐性が上昇していることが示され、プロテアーゼ耐性の上がったRAGE分子の作出に成功した。 Furthermore, when the protease sensitivity was examined, it was shown that the resistance was higher than that of the natural type, and the RAGE molecule with increased protease resistance was successfully produced.
(製造例4:RAGEのリガンド認識能に必須の最小領域の決定)
本実施例では、miniRAGEを作製した。
(Production Example 4: Determination of minimum region essential for ligand recognition ability of RAGE)
In this example, miniRAGE was manufactured.
miniRAGEとして、GenBankアクセッション番号AB036432に示される配列に基づいて、以下のプライマー:
順方向プライマー(RAGE1、RAGE2、RAGE3、RAGE7、RAGE8、RAGE9、RAGE143、RAGE223およびRAGE226に共通)
5’−CTACATATGGCTCAAAACATCACAGC−3’(配列番号32)
逆方向プライマー
・RAGE1については、
5’−TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC−3’(配列番号33)
・RAGE2については、
5’−TTACTCGAGACCAGACACGGGGCTG−3’(配列番号34)
・RAGE3については、
5’−TTACTCGAGAAGCTACTGCTCCACC−3’(配列番号35)
・RAGE7については、
5’−TTACTCGAGAAACACCAGCCGTGAGT−3’(配列番号36)・RAGE8については、
5’−TTACTCGAGAAATCTGGTAGACACGG−3’(配列番号37)・RAGE9については、
5’−TTACTCGAGACTTGGTCTCCTTTCC−3’(配列番号38)
・RAGE143については
5’−TTACTCGAGTCCCCACCTTATTGGG−3’(配列番号41)、・RAGE223については、
5’−TTACTCGAGCTGTGCGCAAGGCCCG−3’(配列番号42)
・RAGE226については、
5’−TTACTCGAGACTGGATGGGGGCTGTGC−3’(配列番号43)
を設計し、RAGE4については、順方向プライマー
5’−TCGCATATGGCAATGAACAGGAATGG−3’(配列番号39)逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC−3’(配列番号40)
を設計し、RAGE2(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜250位)をコードするDNA、RAGE3(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜230位)をコードするDNA、RAGE4(天然型RAGEのアミノ酸配列101〜332位)をコードするDNA、RAGE7(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜137位)をコードするDNA、RAGE8(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜120位)をコードするDNA、RAGE9(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜112位)をコードするDNA、RAGE143(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜143位)をコードするDNA、RAGE223(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜223位)をコードするDNA、およびRAGE226(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜226位)をコードするDNAを得た。
Based on the sequence shown in GenBank accession number AB036432 as miniRAGE, the following primers:
Forward primer (common to RAGE1, RAGE2, RAGE3, RAGE7, RAGE8, RAGE9, RAGE143, RAGE223 and RAGE226)
5′-CTACATATGGCTCAAAAACATCACAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 32)
For reverse primer RAGE1
5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 33)
・ About RAGE2
5′-TTACTTCGAGACCAGACACGGGGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 34)
・ About RAGE3
5′-TTACTTCGAGAAGCTACTGCTCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 35)
・ About RAGE7
For 5′-TTACTTCGAGAAAACACCAGCCGTGAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 36) RAGE8,
For 5′-TTACTCGAGAAATCTGGATAGACGG-3 ′ (SEQ ID NO: 37) RAGE9,
5′-TTACTTCGAGAACTTGGTTCCCTTTTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 38)
-For RAGE143, 5'-TTACTCGAGTCCCCCACCTTATTGGGG-3 '(SEQ ID NO: 41),-For RAGE223,
5′-TTACTCGAGCTGTGCGCAAGGCCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 42)
・ About RAGE226
5′-TTACTCGAGACTGGATGGGGGCTGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 43)
For RAGE4, forward primer 5′-TCGCATATGGCAATGAACAGGAATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 39) reverse primer 5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGGTTGGCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 40)
DNA encoding RAGE2 (amino acid sequence 23 to 250 of natural RAGE), DNA encoding RAGE3 (amino acid sequence 23 to 230 of natural RAGE), RAGE4 (amino acid sequence 101 to natural RAGE) 332), a DNA encoding RAGE7 (amino acid sequence 23 to 137 of natural RAGE), a DNA encoding RAGE8 (amino acid sequence 23 to 120 of natural RAGE), and RAGE9 (natural RAGE). DNA encoding amino acid sequence 23 to 112), DNA encoding RAGE143 (amino acid sequence 23 to 143 of natural RAGE), DNA encoding RAGE223 (amino acid sequence 23 to 223 of natural RAGE), and RAGE226 (Natural RAGE To obtain a DNA encoding the amino acid sequence 23 to 226 position).
これらminiRAGEをコードするDNAを、制限酵素の認識配列を付加した特異的プライマーによりPCRにより増幅した後、pCR2.1(Invitrogen)をクローニング用ベクターとしてTAクローニングを行い、塩基配列を確認した。 These miniRAGE-encoding DNAs were amplified by PCR using specific primers to which a restriction enzyme recognition sequence was added, and then TA cloning was performed using pCR2.1 (Invitrogen) as a cloning vector to confirm the nucleotide sequence.
(2)タグ配列付加RAGE様ポリペプチドの生成
上記製造例において生成したRAGE様ポリペプチド(sRAGE1、mRAGE1、RAGE2〜RAGE8、RAGE143、RAGE223およびRAGE226)を検出/評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のN末側に2種類のタグ(一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE(配列番号29))、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるStreptag(AWRHPQFGG(配列番号30)またはWSHPQFEK(配列番号31))を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く(KD=10−15M)、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが(KD=10−7M)、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なStreptagII(WSHPQFEK(配列番号31))付加タンパク質も生成した。いずれもpET系ベクターの3’側にタグ配列をコードする核酸配列を導入して、発現用プラスミドとした(pET C−Avi、pET C−StII)。定法に従って、これらの発現ベクターに、mRAGEおよびminiRAGEを導入して、発現構築物を生成した。AviTag付加タンパク質のビオチン化のために、pET系ベクターと同一菌体内で保持可能なpAC系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているBirA遺伝子を導入したBirA/pACを作製した。
(2) Generation of tag sequence-added RAGE-like polypeptide RAGE-like polypeptides (sRAGE1, mRAGE1, RAGE2-RAGE8, RAGE143, RAGE223, and RAGE226) generated in the above production example are effective when used in a detection / evaluation system. It is desirable that such modification is applied. Therefore, two types of tags (one sequence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 29)) that undergoes biotinylation in E. coli and the other are Streptag (AWRHPQFGGG) that is a sequence directly recognized by streptavidin. (SEQ ID NO: 30) or WSHPQFEK (SEQ ID NO: 31)) The binding of biotin and streptavidin is the strongest non-covalent bond (KD = 10 −15 M), and development to immobilization via streptavidin, etc. However, in order to biotinylate, it takes time and effort to add biotin to the medium and to co-express biotin ligase, etc. Therefore, the binding strength is inferior (KD = 10-7 M), adding a tag on the gene sequence and expressing it in E. coli A StreptagII (WSHPQFEK (SEQ ID NO: 31))-added protein capable of binding to toavidin was also generated, and in each case, a nucleic acid sequence encoding a tag sequence was introduced into the 3 ′ side of the pET-based vector to obtain an expression plasmid ( pET C-Avi, pET C-StII) According to a conventional method, mRAGE and miniRAGE were introduced into these expression vectors to generate an expression construct.For biotinylation of AviTag addition protein, the same bacteria as the pET system vector BirA / pAC was prepared by introducing a BirA gene encoding biotin ligase into a pAC vector that can be maintained in the body.
RAGEは、CTLDと同様に、S−S結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてOrigamiB(DE3)(Novagen,USA)を用いた。Origami B(DE3)は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のS−S結合形成を促進する性質がある。RAGE様ポリペプチド(sRAGE1、mRAGE1、RAGE2〜RAGE8、RAGE143、RAGE223およびRAGE226をまとめて「RAGE様ポリペプチド」と称する)にAviTagを付加する場合、AviTagおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、BirA遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン(15μg/ml)、アンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml)を添加した(いずれも最終濃度)LB培地中で37℃で培養した。StreptagIIコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン(15μg/ml)、アンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)を添加したLB培地中で37℃で培養した。RAGE様ポリペプチドの発現を、IPTGを添加することによって誘導した。 In RAGE, as with CTLD, the formation of an SS bond is essential for structural stabilization and function. Therefore, OrigamiB (DE3) (Novagen, USA) was used as an expression host. Origami B (DE3) is a thioredoxin reductase and glutathione reductase mutant and has the property of promoting S—S bond formation of proteins expressed in the cytoplasm. When AviTag is added to a RAGE-like polypeptide (sRAGE1, mRAGE1, RAGE2-RAGE8, RAGE143, RAGE223, and RAGE226 are collectively referred to as “RAGE-like polypeptide”), a vector containing a nucleic acid sequence encoding AviTag and the polypeptide And an expression vector containing the BirA gene. The resulting transformed host cells were added with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) (all at the final concentration). The cells were cultured at 37 ° C. in LB medium. When transformed with an expression vector containing StreptagII-encoding nucleic acid, it was cultured at 37 ° C. in LB medium supplemented with kanamycin (15 μg / ml), ampicillin (50 μg / ml), and tetracycline (12.5 μg / ml). RAGE-like polypeptide expression was induced by adding IPTG.
予備実験として、RAGE様ポリペプチドを可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、(1)37℃、(2)25℃および(3)20℃に設定した。誘導時間は、(A)18時間、(B)20時間、および(C)24時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を37℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、大部分が不溶性画分に回収された。培養温度を25℃に下げるとsRAGEの場合、90%以上が可溶性ポリペプチドとして発現されたが、mRAGE1の場合は、20%程度しか可溶性ポリペプチドとして発現されなかった。各miniRAGEに関しては、欠損部分が長くなるほど可溶化率が下がる傾向が観察された。RAGE8およびRAGE9に関しては培養温度を下げても殆どが不溶性となり、可溶性ポリペプチドとして発現させるのは困難であった。上記の結果に鑑みて、培養温度を25℃に維持して、誘導時間の検討を行ったところ、誘導時間(A)18時間が適切であることが分かった。 As a preliminary experiment, the temperature conditions and induction time for expressing a RAGE-like polypeptide as a soluble polypeptide were examined. The temperature conditions were set to (1) 37 ° C, (2) 25 ° C and (3) 20 ° C. The induction time was set to (A) 18 hours, (B) 20 hours, and (C) 24 hours. First, when these host cells were induced at 37 ° C. and the molecular weight of the induced protein was measured, most of them were recovered in the insoluble fraction. When the culture temperature was lowered to 25 ° C., 90% or more was expressed as a soluble polypeptide in the case of sRAGE, but only about 20% was expressed as a soluble polypeptide in the case of mRAGE1. For each miniRAGE, a tendency was observed that the solubilization rate decreased as the deficient portion became longer. RAGE8 and RAGE9 were almost insoluble even when the culture temperature was lowered, and it was difficult to express them as soluble polypeptides. In view of the above results, when the induction time was examined while maintaining the culture temperature at 25 ° C., it was found that the induction time (A) of 18 hours was appropriate.
上記の形質転換細胞を37℃で12時間前培養した。本培養は、この前培養液を、20倍希釈になるように上記の各LB培地に添加し、25℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度(A600)が約0.5に達したときに、1mM(最終濃度)IPTGを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。AviTag付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に50μM(最終濃度)のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後18時間後に12,000rpm×5分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のTBSで洗浄した。 The above transformed cells were pre-cultured at 37 ° C. for 12 hours. In the main culture, this pre-cultured solution was added to each of the LB media so as to be diluted 20-fold, and swirled at 25 ° C. Based on the conditions obtained above, when the optical density (A600) of the culture reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG was added to induce expression of the target protein. When the AviTag-added protein was produced, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and the target protein to be expressed was simultaneously biotinylated. 18 hours after the start of induction, the cells were pelleted by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, the supernatant was discarded, and washed with an appropriate amount of TBS.
TBSに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、15,000rpm×30分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのHisタグがC末側に付加されているので、Ni−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したAviTagも精製に利用可能であり、この場合は、streptavidin Mutein matrix(Roche)に吸着後、ビオチンにより溶出させた。StrepTagIIの場合、Strep−Tactin Sepharose(IBA,US)に吸着後、desthiobiotinにより溶出させた。 The bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the supernatant recovered by centrifugation at 15,000 rpm × 30 minutes was used as the soluble fraction. Since the His protein for purification was added to the C-terminal side, the target protein was purified by eluting with imidazole after binding to Ni-agarose. AviTag added for detection can also be used for purification. In this case, it was adsorbed on streptavidin Mutein matrix (Roche) and then eluted with biotin. In the case of StrepTag II, it was adsorbed on Strep-Tactin Sepharose (IBA, US) and then eluted with dessiobiotin.
(3)RAGEのリガンド認識能に必須の最小領域の決定
上記のようにして溶出させた各MiniRAGEの発現効率、可溶性ポリペプチドとして発現する比率、収率などは以下の表2に示すとおりである。
(3) Determination of minimum region essential for ligand recognition ability of RAGE The expression efficiency of each MiniRAGE eluted as described above, the ratio expressed as a soluble polypeptide, the yield, etc. are as shown in Table 2 below. .
上記の結果から、RAGEのリガンド認識能に必須の最小領域は、RAGE8(天然型RAGEのアミノ酸配列23〜120位)であることが分かった。 From the above results, it was found that the minimum region essential for the ligand recognition ability of RAGE is RAGE8 (amino acid sequence 23 to 120 of natural RAGE).
(製造例5:LOX−1細胞外領域の調製法)
本製造例では、LOX−1細胞外領域の調製例を示す。なお、CTLD14、CTLDも同様に製造した。
(Production Example 5: Preparation method of LOX-1 extracellular region)
In this production example, a preparation example of the LOX-1 extracellular region is shown. CTLD14 and CTLD were produced in the same manner.
発現宿主をBL21(DE3)とし、100%近くを封入体として発現させた後、以下の2つの方法で調製した。 The expression host was BL21 (DE3), and after expressing nearly 100% as inclusion bodies, it was prepared by the following two methods.
1) サイクロアミロースによるリフォールディング(非特許文献7を参照。)
発現構築物とBirA遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたBL21(DE3)、若しくは発現構築物で形質転換させたBL21(DE3)をアンピシリン(50μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml、発現構築物のみの場合は添加せず)を含む(いずれも最終濃度)LB培地で37℃で培養した。培養液の濁度(A600)が約0.5に達した時に1mM(最終濃度)IPTGを添加し目的蛋白質の発現を誘導した。目的タンパク質をビオチン化させる場合は、誘導開始と同時に50μM(最終濃度)のビオチンを添加し、ビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後4時間後に、12,000rpm x 5分の遠心分離で菌体を回収し、TBSにて洗浄した。
1) Refolding with cycloamylose (see Non-Patent Document 7)
BL21 (DE3) transformed simultaneously with an expression construct and a vector containing the BirA gene, or BL21 (DE3) transformed with an expression construct was ampicillin (50 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml, expression) It was cultured at 37 ° C. in LB medium containing (not added in the case of construct alone) (both final concentrations). When the turbidity (A600) of the culture reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG was added to induce expression of the target protein. When the target protein was biotinylated, 50 μM (final concentration) of biotin was added simultaneously with the start of induction, and biotinylation was performed simultaneously. Four hours after the start of induction, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, and washed with TBS.
ついでTBSに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をTBSで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度40mMのDTTを含む6Mグアニジン塩酸塩溶液で室温にて1時間処理し、続いて70倍容量の0.1%CTAB(2mM DL−シスチンを含む)/TBS溶液を添加し、室温で1時間反応させた後、最終濃度で0.6%になるように、3%CA溶液を添加し、さらに室温で1時間反応させた。その反応溶液を15,000rpmで5分間遠心分離し、得られたた上清をリフォールディング溶液とした。精製はHisタグを使用したNi−アガロース精製によった。 Subsequently, the bacterial cells suspended in TBS were crushed with an ultrasonic crusher, and the precipitate fraction of the cell lysate was washed with TBS to obtain inclusion bodies. The inclusion bodies were treated with 6M guanidine hydrochloride solution containing DTT at a final concentration of 40 mM for 1 hour at room temperature, followed by addition of 70 volumes of 0.1% CTAB (containing 2 mM DL-cystine) / TBS solution, After reacting at room temperature for 1 hour, a 3% CA solution was added to a final concentration of 0.6%, and the reaction was further allowed to proceed at room temperature for 1 hour. The reaction solution was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the resulting supernatant was used as a refolding solution. Purification was by Ni-agarose purification using a His tag.
2)希釈透析法によるリフォールディングおよび精製(Vohra RS et al.(2007) Protein Expr. Purif. 52: 415−421を参照)
1)同様に得られた菌体を溶解緩衝液(lysis buffer)(10mM Tris,pH 7.8を含む1mg/mlリゾチーム,プロテアーゼインヒビターカクテル)に懸濁し、4℃で30分間反応させた後、10,000gで15分間遠心した。得られた沈殿(封入体)をVohraらの手法に準じてリフォールドした。
2) Refolding and purification by dilution dialysis (see Vohra RS et al. (2007) Protein Expr. Purif. 52: 415-421)
1) The cells obtained in the same manner were suspended in a lysis buffer (1 mg / ml lysozyme containing 10 mM Tris, pH 7.8, protease inhibitor cocktail), reacted at 4 ° C. for 30 minutes, Centrifuge for 15 minutes at 10,000 g. The obtained precipitate (inclusion body) was refolded according to the method of Vorah et al.
100mgの封入体を2.2.mlの緩衝液A(Buffer A)(10mM Tris−HCl,pH7.8,6Mグアニジン塩酸塩、100mM NaH2PO4)に懸濁し、4℃で2時間反応させた。100,000×gで30分遠心した上清を可溶化封入体溶液とし、His tagを利用してCOSMOGEl His−Accept(ナカライ)に結合させ、FPLC(GE Healthcare)による10−100mMのイミダゾール濃度勾配により溶出させた。タンパク質のピークフラクションを6Mグアニジン塩酸塩を含む50mMTris(pH8.0)にて透析した。透析溶液に最終濃度で100mMのDTTを添加した後、タンパク質濃度を1mg/mlに調製した。続いて、グアニジン塩酸塩濃度を段階的に低下させた緩衝液にて14時間ずつの透析を繰り返し、リフォールド精製タンパク質を得た。 Add 100 mg of inclusion body to 2.2. It was suspended in ml of buffer A (Buffer A) (10 mM Tris-HCl, pH 7.8, 6M guanidine hydrochloride, 100 mM NaH 2 PO 4 ) and reacted at 4 ° C. for 2 hours. The supernatant obtained by centrifugation at 100,000 × g for 30 minutes is used as a solubilized inclusion body solution, bound to COSMOGEl His-Accept (Nacalai) using His tag, and an imidazole concentration gradient of 10-100 mM by FPLC (GE Healthcare) Was eluted with. The protein peak fraction was dialyzed against 50 mM Tris (pH 8.0) containing 6 M guanidine hydrochloride. After adding 100 mM DTT at a final concentration to the dialysis solution, the protein concentration was adjusted to 1 mg / ml. Subsequently, dialysis was repeated for 14 hours each with a buffer solution in which the guanidine hydrochloride concentration was gradually reduced to obtain a refolded purified protein.
(製造例6:RAGE調製法)
全てのRAGE分子に該当するRAGE様ポリペプチド(RAGE関連タンパク質)は本製造例に記載のとおりの以下の2つの手法で調製した。
(Production Example 6: RAGE preparation method)
RAGE-like polypeptides (RAGE-related proteins) corresponding to all RAGE molecules were prepared by the following two methods as described in this Production Example.
1)封入体として調製し、リフォールディングする手法
製造例5と同様の手法を用いた。なお、製造例5とは発現構築物が異なるため、培養時に添加する抗生物質の記載のみアンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml)に変更して用いた。
1) Method of preparing and refolding as an inclusion body The same method as in Production Example 5 was used. Since the expression construct is different from that in Production Example 5, only the antibiotics added at the time of culturing are changed to ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), and chloramphenicol (34 μg / ml). Used.
2)可溶性タンパク質として発現させる手法(非特許文献7を参照)
製造例4に記載の情報に基づいて、発現構築物とBirA遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたOrigami B(DE3)をアンピシリン(50μg/ml)、テトラサイクリン(12.5μg/ml)、クロラムフェニコール(34μg/ml)、を含む(いずれも最終濃度)LB培地で25℃で培養した。培養液の濁度(A600)が約0.5に達した時に1mM(最終濃度)IPTGと50μM(最終濃度)のビオチンを添加し、目的タンパク質の誘導と同時にビオチン化を行った。誘導開始後18時間後に、12,000rpm×5分の遠心分離で菌体を回収し、TBSにて洗浄した。菌体をTBSに懸濁し、超音波破砕機にて破砕後、15,000rpm×30分の遠心分離し、回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質をC末側のHisタグによりNi−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させた。目的タンパク質を含むピークフラクションをTBSにて透析後、N末に付加されたビオチンによりストレプトアビジンムテインマトリクス(Streptavidin Mutein matrix)(Roche)に結合させた後、ビオチンにより溶出させ得られた目的タンパク質を精製RAGEとした。
2) Technique for expressing as a soluble protein (see Non-Patent Document 7)
Based on the information described in Production Example 4, Origami B (DE3), which was simultaneously transformed with the expression construct and the vector containing the BirA gene, was treated with ampicillin (50 μg / ml), tetracycline (12.5 μg / ml), chloram The cells were cultured at 25 ° C. in LB medium containing phenicol (34 μg / ml) (both final concentrations). When the turbidity (A600) of the culture solution reached about 0.5, 1 mM (final concentration) IPTG and 50 μM (final concentration) biotin were added, and biotinylation was performed simultaneously with the induction of the target protein. 18 hours after the start of induction, the cells were collected by centrifugation at 12,000 rpm × 5 minutes, and washed with TBS. The bacterial cells were suspended in TBS, crushed with an ultrasonic crusher, and centrifuged at 15,000 rpm × 30 minutes, and the collected supernatant was used as a soluble fraction. The target protein was bound to Ni-agarose by a C-terminal His tag and then eluted with imidazole. The peak fraction containing the target protein is dialyzed with TBS, and after binding to Streptavidin Mutein matrix (Roche) with biotin added to the N-terminal, the target protein obtained by elution with biotin is purified. RAGE.
(製造例7:酸化LDL調製法)
本製造例では、酸化LDLを調製した(非特許文献7を参照)。
(Production Example 7: Preparation of oxidized LDL)
In this production example, oxidized LDL was prepared (see Non-Patent Document 7).
調製に際して、可能なものは全て滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。ヒト血漿より調製したLDL(透析によりEDTAを除去)をPBS(−)により1mg/ml に調製し、最終濃度が5μMになるようにCuSO4を添加した。次いでこの溶液を、37℃で20時間反応させ、1mM EDTA(最終濃度)を添加して酸化反応を停止した。この溶液をTris−EDTA(50mM Tris−HCl,pH7.4,150mM NaCl,0.05%EDTA)に対して透析し、さらに無菌濾過後に0.02%NaN3(最終濃度)を添加し、酸化LDL溶液とした。 In preparation, everything possible was sterilized and operated as aseptically as possible. LDL prepared from human plasma (EDTA was removed by dialysis) was adjusted to 1 mg / ml with PBS (−), and CuSO 4 was added to a final concentration of 5 μM. The solution was then reacted at 37 ° C. for 20 hours, and 1 mM EDTA (final concentration) was added to stop the oxidation reaction. This solution was dialyzed against Tris-EDTA (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% EDTA), and after sterile filtration, 0.02% NaN 3 (final concentration) was added to oxidize. An LDL solution was obtained.
(製造例8:AGE分子である糖化ウシ血清アルブミン(BSA)調製方法)
本製造例では、AGE分子として種々の糖化BSAを調製した(非特許文献7を参照)。
(Production Example 8: Method for preparing glycated bovine serum albumin (BSA) which is an AGE molecule)
In this production example, various glycated BSAs were prepared as AGE molecules (see Non-Patent Document 7).
糖化BSAは以下のように調製した。調製に際して可能なものは全て滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。 Glycated BSA was prepared as follows. All that was possible during the preparation was sterilized and manipulated as aseptically as possible.
エタノールで洗浄したスパチュラを使用して、各糖(グルクトース4.51g、フルクトース4.51g、およびリボース3.75g)を秤量し、γ線滅菌済みのキャップ付きプラスチックチューブに入れた。各チューブに20mlの滅菌1M リン酸緩衝液(pH7.4)を無菌的に添加し、穏やかに転倒混和し溶液を混合した。最後に21mlのエンドトキシンフリーの蒸留水を添加し、0.22μmフィルタにより無菌濾過した後、12週間、遮光して37℃で反応させた。1週間に1回、無菌条件下で糖−BSA調製物80μlを取り出し、pHを確認し、さらに、反応液のpHを10N NaOH溶液(エンドトキシンフリー)でpH7.4に調製した。12週後に、滅菌PBSにて透析し、糖を完全に除去し、得られた反応液を糖化BSA(反応させた糖によって、リボース−BSA、グルコース−BSA、フルクトース−BSA)(本明細書では、それぞれ、リボース修飾AGE(リボースAGEまたはR−AGEとも称する。)、グルコース修飾AGE(グルコースAGEまたはG−AGEとも称する。)、フルクトース修飾AGE(フルクトース−AGEまたはF−AGEとも称する。)と称する。)とし、4℃で無菌的に保存した。 Each sugar (4.51 g of fructose, 4.51 g of fructose, and 3.75 g of ribose) was weighed using a spatula washed with ethanol and placed in a cap-capped plastic tube that had been γ-sterilized. 20 ml of sterile 1M phosphate buffer (pH 7.4) was aseptically added to each tube, and gently mixed by inversion to mix the solution. Finally, 21 ml of endotoxin-free distilled water was added, and the mixture was aseptically filtered through a 0.22 μm filter, and then allowed to react at 37 ° C., protected from light for 12 weeks. Once a week, 80 μl of the sugar-BSA preparation was removed under aseptic conditions, the pH was confirmed, and the pH of the reaction solution was adjusted to pH 7.4 with a 10N NaOH solution (endotoxin free). After 12 weeks, dialysis was performed with sterile PBS to completely remove sugar, and the resulting reaction solution was saccharified BSA (depending on the reacted sugar, ribose-BSA, glucose-BSA, fructose-BSA) (in this specification, These are referred to as ribose-modified AGE (also referred to as ribose AGE or R-AGE), glucose-modified AGE (also referred to as glucose AGE or G-AGE), and fructose-modified AGE (also referred to as fructose-AGE or F-AGE), respectively. And aseptically stored at 4 ° C.
(実施例1)
本実施例では、受容体であるRAGEを固定化した96穴プレートを用いて、リボース修飾AGE(R−AGE)をリガンドとして標識して用いて本発明のアッセイが機能するか確認した。
Example 1
In this example, using a 96-well plate on which the receptor RAGE was immobilized, ribose-modified AGE (R-AGE) was labeled as a ligand to confirm whether the assay of the present invention was functional.
(1)蛍光プレートリーダー測定
受容体(製造例6において製造したRAGE)を固定化した96穴プレート(ヌンク製)を調製した。
(1) Measurement of fluorescent plate reader A 96-well plate (manufactured by Nuku) on which a receptor (RAGE produced in Production Example 6) was immobilized was prepared.
この96穴プレートをプロテインフリーブロッティング緩衝液(Therm Scientific製)を用いて4℃で一晩ブロッキングした。 The 96-well plate was blocked overnight at 4 ° C. using protein-free blotting buffer (Therm Scientific).
活性測定対象分子(Sigma製のクエルセチン、上記製造例のように製造したOxLDL,G−AGE(製造例8のように調製した。),R−AGE(製造例8のように調製した。))を50μl/ウェルで、0μg/アッセイ(100%のコントロール)、0.05μg/アッセイ、0.5μg/アッセイおよび5μg/アッセイの用量で添加した。蛍光標識リガンド(水溶性色素Alexa546(Molecμlar Probes)標識R−AGE(製造例8のように調製した。))を50μl/ウェルの容量で添加し、その後37℃、60分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液(Tris緩衝生理食塩水(TBS)(Tris/Tris−HCl 10 mM;NaCl 150mM)による洗浄を5分×2回、10分×3回行った。100μlの緩衝液(TBS)を添加し蛍光プレートリーダー(Wallac ARVO SX, Perkin Elmer製)で測定した。 Molecules for activity measurement (quercetin made by Sigma, OxLDL, G-AGE produced as in the above production example (prepared as in Production Example 8), R-AGE (prepared as in Production Example 8)) Was added at 50 μl / well at doses of 0 μg / assay (100% control), 0.05 μg / assay, 0.5 μg / assay and 5 μg / assay. Reaction by adding fluorescently labeled ligand (water-soluble dye Alexa546 (Moleclar Probes) labeled R-AGE (prepared as in Production Example 8)) in a volume of 50 μl / well followed by incubation at 37 ° C. for 60 minutes. Made progress. Subsequently, washing with a buffer solution (Tris buffered saline (TBS) (Tris / Tris-HCl 10 mM; NaCl 150 mM) was performed 5 minutes × 2 times, 10 minutes × 3 times, and 100 μl of buffer solution (TBS) was added. Measurement was performed with a fluorescent plate reader (Wallac ARVO SX, manufactured by Perkin Elmer).
コントロールとして、蛍光標識モデルリガンドとして水溶性色素Alexa546(Molecμlar Probes)でラベルしたリボース修飾AGE(R−AGE)(製造例8にて調製)を使用して同様の実験を行った。なお、クエルセチン(Quercetin;Sigma製)は、糖尿病発症予防効果が報告されているフラボノイドであり、RAGE阻害剤のモデルとして使用した。 As a control, a similar experiment was performed using ribose-modified AGE (R-AGE) (prepared in Production Example 8) labeled with a water-soluble dye Alexa546 (Molecular Probes) as a fluorescently labeled model ligand. Quercetin (Quercetin; manufactured by Sigma) is a flavonoid that has been reported to be effective in preventing the onset of diabetes, and was used as a model for RAGE inhibitors.
(結果)
結果を以下の表3に示し、そのプロットを図1〜4(それぞれ、クエルセチン、OxLDL,G−AGE,R−AGE)に示す。
(result)
The results are shown in Table 3 below, and the plots are shown in FIGS. 1 to 4 (quercetin, OxLDL, G-AGE and R-AGE, respectively).
図5に蛍光標識モデルリガンドとして水溶性色素Alexa546でラベルしたリボース修飾AGE(R−AGE)を使用して行ったコントロール実験を示す。図5左に使用した細胞の位相差像を示し、図5中央にRAGE(蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現)発現細胞の蛍光を示し、図5右にリガンドを結合した細胞像を示す。図5右にある白い点が結合したリガンドである。 FIG. 5 shows a control experiment conducted using ribose-modified AGE (R-AGE) labeled with the water-soluble dye Alexa546 as a fluorescently labeled model ligand. The left phase of FIG. 5 shows the phase difference image of the cells used, the center of FIG. 5 shows the fluorescence of cells expressing RAGE (forced expression as a fusion protein with a fluorescent protein), and the right side of FIG. 5 shows the cell image with the ligand bound. The white dots on the right side of FIG.
図6に図5と同様の順で、クエルセチンの添加の場合の写真を示す。図6左に使用した細胞の位相差像を示し、図6中央にRAGE(蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現)発現細胞の蛍光を示し、図6右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図6右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。 FIG. 6 shows a photograph in the case of adding quercetin in the same order as FIG. 6 shows the phase difference image of the used cell, the center of FIG. 6 shows the fluorescence of cells expressing RAGE (forced expression as a fusion protein with a fluorescent protein), and the right side of FIG. 6 shows a cell image in which quercetin is added in addition to the ligand. Indicates. As shown in the right of FIG. 6, it was confirmed by high-sensitivity observation in the cells that the binding of the ligand was inhibited by the addition of quercetin.
図7には、図5と同様の順で、R−AGEの添加の場合の写真を示す。図7左に使用した細胞の位相差像を示し、図7中央にRAGE(蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現)発現細胞の蛍光を示し、図7右にリガンドに加えR−AGEを加えた細胞像を示す。図7右に示されるように、R−AGE添加によるリガンド結合の阻害を示す蛍光像が示される。 FIG. 7 shows a photograph in the case of adding R-AGE in the same order as in FIG. The left phase of FIG. 7 shows the phase difference image of the cells used, the center of FIG. 7 shows the fluorescence of cells expressing RAGE (forced expression as a fusion protein with a fluorescent protein), and the right side of FIG. 7 added R-AGE in addition to the ligand. A cell image is shown. As shown in FIG. 7 right, a fluorescence image showing inhibition of ligand binding by addition of R-AGE is shown.
(定量アッセイ)
次に、グルコース修飾AGE(G−AGE)(製造例8に記載のように製造したもの。)固定化プレートを使用して、Lys−AGE(グリセルアルデヒド修飾リジン:低分子AGEモデル)(0.09gのリジンを0.45gのDLグリセルアルデヒドを50mlの0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解させ、遮光条件下、37℃で1週間反応させて調製した。)、およびリボース修飾AGE(R−AGE)(製造例8に記載のように製造したもの。)をそれぞれについて、0、0.25μg/アッセイおよび2.5μg/アッセイの量で用いて定量的アッセイを行った。
(Quantitative assay)
Next, using a glucose-modified AGE (G-AGE) (produced as described in Production Example 8) immobilization plate, Lys-AGE (glyceraldehyde-modified lysine: low molecular AGE model) (0 0.09 g of lysine was prepared by dissolving 0.45 g of DL glyceraldehyde in 50 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) and reacting at 37 ° C. for 1 week under light-shielded conditions.) Quantitative assays were performed using ribose-modified AGE (R-AGE) (prepared as described in Preparative Example 8) in amounts of 0, 0.25 μg / assay and 2.5 μg / assay, respectively. .
その結果を表4に示す。 The results are shown in Table 4.
(実施例2)
本実施例では、AGE分子としてR−AGEまたはG−AGE固定化96穴プレートを用いて本発明のアッセイが機能するか確認した。
(Example 2)
In this example, whether or not the assay of the present invention functions was confirmed using R-AGE or G-AGE immobilized 96-well plates as AGE molecules.
AGE分子として、グルコース修飾AGE(G−AGE)(製造例8に記載のように製造したもの。)、またはリボース修飾AGE(R−AGE)(製造例8に記載のように製造したもの。)を固定化した96穴プレート(ヌンク製)を調製した。 As an AGE molecule, glucose-modified AGE (G-AGE) (produced as described in Production Example 8) or ribose-modified AGE (R-AGE) (produced as described in Production Example 8) A 96-well plate (manufactured by Nuku) was prepared.
この96穴プレートをプロテインフリーブロッティング緩衝液(Therm Scientific製)を用いて4℃で一晩ブロッキングした。 The 96-well plate was blocked overnight at 4 ° C. using protein-free blotting buffer (Therm Scientific).
活性測定対象分子(Lys−AGE(グルタルアルデヒド修飾リジン修飾AGE:低分子AGEモデル)(0.09gのリジンを0.45gのDLグリセルアルデヒドを50mlの0.2M リン酸緩衝液(pH7.4)に溶解させ、遮光条件下、37℃で1週間反応させて調製した。)、グルコース修飾AGE(G−AGE)、またはリボース修飾AGE(R−AGE)、を50μl/ウェルで、0μg/アッセイ(100%のコントロール)、0.25μg/アッセイおよび2.5μg/アッセイの用量で添加した。 Molecules for activity measurement (Lys-AGE (glutaraldehyde-modified lysine-modified AGE: low molecular weight AGE model)) (0.09 g of lysine, 0.45 g of DL glyceraldehyde, 50 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) And glucose-modified AGE (G-AGE) or ribose-modified AGE (R-AGE) at 50 μl / well, 0 μg / assay. (100% control), 0.25 μg / assay and 2.5 μg / assay were added.
ビオチン標識RAGE143(製造例6で調製)を50μl/ウェルの容量で添加し、その後37℃、60分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液(TBS)による洗浄を5分×2回、10分×3回行った。セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(streptavidin)を上記ウェル(100μl/ウェル)に添加し、室温で60分間反応させた。その後、緩衝液(TBS)で洗浄した。その後、発色基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を100μl/ウェル添加した。これを、室温でおよそ10分間おいて反応させ、1N 塩酸(HCl)を100μl/ウェル添加して反応を停止させた。その後450nmでの吸光度を測定した。 The reaction was allowed to proceed by adding biotin-labeled RAGE 143 (prepared in Production Example 6) in a volume of 50 μl / well followed by incubation at 37 ° C. for 60 minutes. Next, washing with a buffer solution (TBS) was performed 5 minutes × 2 times, 10 minutes × 3 times. Horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin was added to the wells (100 μl / well) and reacted at room temperature for 60 minutes. Thereafter, it was washed with a buffer solution (TBS). Thereafter, 100 μl / well of chromogenic substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) was added. This was allowed to react at room temperature for approximately 10 minutes, and the reaction was stopped by adding 100 μl / well of 1N hydrochloric acid (HCl). Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured.
その結果を以下の表5に示す。いずれも、定量的に結合が阻害されることが理解される。 The results are shown in Table 5 below. In any case, it is understood that the binding is quantitatively inhibited.
(実施例3)
本実施例では、LOX−1受容体を固定させたプレートにおいて、そのリガンドと競合させたモデルを用い、蛍光標識モデルリガンドとして脂溶性色素DiIでラベルしたアセチル化LDLを使用して、本アッセイが機能するか確認した。
(Example 3)
In this example, the assay was performed using a model in which a LOX-1 receptor was immobilized and a model that had been competed with the ligand, and acetylated LDL labeled with a lipid-soluble dye DiI as a fluorescent-labeled model ligand. I confirmed that it works.
LOX−1受容体(製造例5と同様に調製した。)を固定化した96穴プレート(ヌンク製)を調製した。 A 96-well plate (manufactured by NUNK) on which LOX-1 receptor (prepared in the same manner as in Production Example 5) was immobilized was prepared.
この96穴プレートを、ブロッキング試薬N102(日本油脂製)を用いて4℃で一晩ブロッキングした。 This 96-well plate was blocked overnight at 4 ° C. using blocking reagent N102 (manufactured by NOF Corporation).
活性測定対象分子(Sigma製のクエルセチン、上記製造例のように製造したOxLDLおよびAcLDL)を50μl/ウェルの容量(最終的に、使用量は、0、0.05μg/アッセイ、0.5μg/アッセイ、5μg/アッセイとした。)で添加した。クエルセチン(Quercetin;Sigma製)は、OxLDLによる細胞障害を抑制する効果が報告されているフラボノイドであり、LOX−1阻害剤のモデルとして使用した。 Molecules to be measured for activity (quercetin from Sigma, OxLDL and AcLDL produced as in the above production example) in a volume of 50 μl / well (final amounts used were 0, 0.05 μg / assay, 0.5 μg / assay) 5 μg / assay). Quercetin (Quercetin; manufactured by Sigma) is a flavonoid that has been reported to suppress cell damage caused by OxLDL, and was used as a model for LOX-1 inhibitors.
蛍光標識リガンドである脂溶性色素DiIでラベルしたアセチル化LDL(アセチル化LDL(Molecμlar Probe製)をPBS(−)にて透析し、無菌濾過後1ml(1mg/ml)当たり10μlのDiI/DMSO溶液(300mg/ml)を無菌的に添加し、遮光条件下で37℃、18時間反応させた。反応溶液1ml当たりに0.0834gのKBrを添加し溶解させた後、12℃で、105,000g×20時間の超遠心分離に供し、最上層画分を回収し、DiI標識AcLDLとした。)を50μl/ウェルの容量で添加し、その後37℃、60分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液(TBS)による洗浄を5分×2回、10分×3回行った。100μlの緩衝液(TBS)を添加し蛍光プレートリーダー(Wallac ARVO SX,Perkin Elmer製)で測定した。 Acetylated LDL (acetylated LDL (manufactured by Molec μlar Probe)) labeled with a fat-soluble dye DiI which is a fluorescently labeled ligand is dialyzed with PBS (−), and after sterile filtration, 10 μl of DiI / DMSO solution per 1 ml (1 mg / ml) (300 mg / ml) was added aseptically and allowed to react for 18 hours under light-shielded conditions at 37 ° C. After 0.0834 g of KBr was added and dissolved per ml of the reaction solution, 105,000 g at 12 ° C. The sample was subjected to ultracentrifugation for 20 hours, the uppermost layer fraction was collected, and DiI-labeled AcLDL was added at a volume of 50 μl / well, and the reaction was allowed to proceed by incubating at 37 ° C. for 60 minutes. It was. Next, washing with a buffer solution (TBS) was performed 5 minutes × 2 times, 10 minutes × 3 times. 100 μl of buffer solution (TBS) was added and measurement was performed with a fluorescent plate reader (Wallac ARVO SX, manufactured by Perkin Elmer).
その結果を表6に示す。そのプロットを図8〜10(それぞれ、クエルセチン、OxLDL、AcLDL)に示す。図8〜10では、各図において、縦軸には、相対結合活性(%、添加量0のときの吸光度の数値を100%とする。)を示す。左からそれぞれ、0、0.05μg/アッセイ、0.5μg/アッセイ、5μg/アッセイを用いたときの相対結合活性が示される。 The results are shown in Table 6. The plots are shown in FIGS. 8-10 (quercetin, OxLDL, AcLDL, respectively). 8 to 10, in each of the drawings, the vertical axis represents relative binding activity (%, the value of absorbance at the addition amount of 0 is 100%). From the left, relative binding activities are shown using 0, 0.05 μg / assay, 0.5 μg / assay, and 5 μg / assay, respectively.
(実施例4)
本実施例では、変性LDLの例としてOxLDLを固定させ、CTLD分子としてCTLD14を標識した例を用いて本発明が機能するか確認した。
Example 4
In this example, it was confirmed whether OxLDL was immobilized as an example of denatured LDL and CTLD14 was labeled as a CTLD molecule to confirm whether the present invention functions.
OxLDLを固定化した96穴プレート(ヌンク)を調製した。 A 96-well plate (Nunk) having OxLDL immobilized thereon was prepared.
この96穴プレートをブロッキング試薬N102(日本油脂製)を用いて4℃で一晩ブロッキングした。 This 96-well plate was blocked overnight at 4 ° C. using blocking reagent N102 (manufactured by NOF Corporation).
活性測定対象分子(製造例5で製造したOxLDL、Sigma製のクエルセチン)を50μl/ウェルの容量(最終的に、使用量は、0、0.05μg/アッセイ、0.5μ
g/アッセイ、5μg/アッセイとした。)で添加した。
A molecule for activity measurement (OxLDL produced in Production Example 5, quercetin manufactured by Sigma) in a volume of 50 μl / well (final amount used was 0, 0.05 μg / assay, 0.5 μm).
g / assay, 5 μg / assay. ).
ビオチン標識CTLD14(製造例6で調製)を50μl/ウェルの容量で添加し、その後37℃、60分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。 Biotin-labeled CTLD14 (prepared in Production Example 6) was added in a volume of 50 μl / well, and then the reaction was allowed to proceed by incubation at 37 ° C. for 60 minutes.
次いで、緩衝液(TBS)による洗浄を5分×2回、10分×3回行った。 Next, washing with a buffer solution (TBS) was performed 5 minutes × 2 times, 10 minutes × 3 times.
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識したストレプトアビジンを上記ウェル(100μl/ウェル)に添加し、室温で60分間反応させた。その後、緩衝液(TBS)で洗浄した。その後、発色基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を100μl/ウェル添加した。これを、室温でおよそ10分間おいて反応させ、1N 塩酸(HCl)を100μl/ウェル添加して反応を停止させた。その後450nmでの吸光度を測定した。 Horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin was added to the wells (100 μl / well) and allowed to react at room temperature for 60 minutes. Thereafter, it was washed with a buffer solution (TBS). Thereafter, 100 μl / well of chromogenic substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) was added. This was allowed to react at room temperature for approximately 10 minutes, and the reaction was stopped by adding 100 μl / well of 1N hydrochloric acid (HCl). Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured.
その結果を以下の表7に示し、そのプロットを図11〜12(それぞれOxLDL、クエルセチン)に示す。いずれも、定量的に結合が阻害されることが理解される。 The results are shown in Table 7 below, and the plots are shown in FIGS. 11 to 12 (OxLDL and quercetin, respectively). In any case, it is understood that the binding is quantitatively inhibited.
(実施例5)
本実施例では、CTLD分子としてCTLD14を固定させ、変性LDLの例としてOxLDLを標識した例を用いて本発明が機能するか確認した。
(Example 5)
In this example, it was confirmed whether CTLD14 was immobilized as a CTLD molecule and OxLDL was labeled as an example of denatured LDL to confirm that the present invention functions.
製造例5のように調製したCTLD14を固定化した96穴プレート(15μg/ml, 50μl/ウェル)(ヌンク製)を調製した。 A 96-well plate (15 μg / ml, 50 μl / well) (manufactured by Nuku) on which CTLD14 prepared as in Production Example 5 was immobilized was prepared.
この96穴プレートをブロッキング試薬N102(日本油脂製)を用いて4℃で一晩ブロッキングした。 This 96-well plate was blocked overnight at 4 ° C. using blocking reagent N102 (manufactured by NOF Corporation).
活性測定対象分子であるクエルセチン、クエルセチンの配糖体であるルチン(Sigma製)を50μl/ウェルの用量で添加した。 Quercetin, which is a molecule for measuring activity, and rutin (manufactured by Sigma), a glycoside of quercetin, were added at a dose of 50 μl / well.
次に、OxLDLを50μl/ウェルの用量で添加し、その後37℃、60分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液(TBS)による洗浄を5分×2回、10分×3回行った。 The reaction was then allowed to proceed by adding OxLDL at a dose of 50 μl / well followed by incubation at 37 ° C. for 60 minutes. Next, washing with a buffer solution (TBS) was performed 5 minutes × 2 times, 10 minutes × 3 times.
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識した抗ApoBを上記ウェルに100μl/ウェルで添加し、37℃で60分間反応させた。その後、緩衝液(TBS)で洗浄した(5分間×2、10分間×3)。再度緩衝液による洗浄を行って、発色基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を100μl/ウェル添加した。これを、室温でおよそ10分間おいて反応させ、1N 塩酸(HCl)を100μl/ウェル添加して反応を停止させた。その後450nmでの吸光度を測定した。 Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-ApoB was added to the well at 100 μl / well and allowed to react at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, it was washed with a buffer solution (TBS) (5 minutes × 2, 10 minutes × 3). After washing with a buffer again, 100 μl / well of chromogenic substrate 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) was added. This was allowed to react at room temperature for approximately 10 minutes, and the reaction was stopped by adding 100 μl / well of 1N hydrochloric acid (HCl). Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured.
その結果を以下の表8に示し、クエルセチンについてはそのプロットを図13に示す。クエルセチンは定量的に結合が阻害されるのに対してその配糖体であるルチンは阻害されないことが理解される。 The results are shown in Table 8 below, and the plot for quercetin is shown in FIG. It is understood that quercetin is quantitatively inhibited from binding while its glycoside rutin is not.
図14にLOX−1を蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現させた細胞を用い、OxLDLをコントロールリガンドとして用いたコントロール実験を示す。図14左に使用した細胞の位相差像を示し、図14中央にLOX−1(蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現)発現細胞の蛍光を示し、図14右にリガンドを結合した細胞像を示す。図14右にある白い点が結合したリガンドである。 FIG. 14 shows a control experiment using cells in which LOX-1 was forcibly expressed as a fusion protein with a fluorescent protein and OxLDL as a control ligand. FIG. 14 shows the phase contrast image of the cell used on the left, FIG. 14 shows the fluorescence of LOX-1 (forced expression as a fusion protein with a fluorescent protein) expressing cell in the center of FIG. Show. A white dot on the right side of FIG. 14 is a bound ligand.
図15に図14と同様の順で、クエルセチンを添加した場合の写真を示す。図15左に使用した細胞の位相差像を示し、図15中央にLOX−1(蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現)発現細胞の蛍光を示し、図15右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図15右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。 FIG. 15 shows a photograph when quercetin is added in the same order as in FIG. FIG. 15 shows the phase contrast image of the cells used on the left, FIG. 15 shows the fluorescence of the cells expressing LOX-1 (forced expression as a fusion protein with a fluorescent protein) in the center, and FIG. 15 shows the addition of quercetin in addition to the ligand. A cell image is shown. As shown in the right of FIG. 15, it was confirmed by high-sensitivity observation in cells that the binding of ligand was inhibited by the addition of quercetin.
なお、ルチンの場合、細胞上での結合阻害が検出されず、マイクロプレート上での結果と一致した。 In the case of rutin, inhibition of binding on the cells was not detected, which was consistent with the results on the microplate.
(実施例6:糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断)
本実施例では、本発明のアッセイを用いて糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断を行なうことができるか確認した。
(Example 6: Diagnosis or predictive diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy)
In this example, it was confirmed whether the assay of the present invention can be used to diagnose or predict diabetes or diabetic nephropathy.
本実施例では、糖尿病または糖尿病性腎症のモデル動物を作製し、このモデル動物から採血し、血糖値等の糖尿病および糖尿病性腎症のパラメータとなる値(例えば、腎症の症状の一つである飲水量の増加)、ならびに本発明で開発したAGEs様活性の測定を行い、これらを相関付けを行い糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断を行なうことができるかを判断した。詳細は以下のとおりである。 In this example, a model animal for diabetes or diabetic nephropathy is prepared, blood is collected from the model animal, and values such as blood glucose level and other parameters for diabetes and diabetic nephropathy (for example, one of the symptoms of nephropathy). And the AGEs-like activity developed in the present invention were measured and correlated to determine whether diabetes or diabetic nephropathy can be diagnosed or predicted. Details are as follows.
まず、糖尿病または糖尿病性腎症のモデル動物として、ストレプトゾトシン(STZ)を投与したモデルを作製した(Am J Physiol Renal Physiol (2006) 290,F214−F222, J Endocrinology (1999) 162, 189−195)。投与日をゼロ日とし、1週間程度の間隔で採血し、血糖値、腎症の症状の一つである飲水量の増加、AGEs様活性の測定を行った。 First, as a model animal for diabetes or diabetic nephropathy, a model to which streptozotocin (STZ) was administered was prepared (Am J Physiol Renal Physiol (2006) 290, F214-F222, J Endocrinology (1999) 162, 189-195). . Blood was collected at an interval of about one week with the administration day as zero day, and blood glucose level, increased water consumption, which is one of the symptoms of nephropathy, and AGEs-like activity were measured.
AGEs活性は実施例2と同様の手法で測定した。 AGE activity was measured by the same method as in Example 2.
(結果)
以下の表9〜11に血糖値およびAGEs活性の測定結果を示す。測定値(%)は、AGEs活性を示す分子がゼロの時の測定値を100%として表示した。したがって表示されるAGEs様活性は、阻害率(測定値%の低下)で評価することになる。
(result)
The measurement results of blood glucose level and AGE activity are shown in Tables 9 to 11 below. The measured value (%) was displayed with the measured value when the molecule showing AGEs activity was zero as 100%. Therefore, the displayed AGE-like activity is evaluated by the inhibition rate (decrease in measured value%).
以上の結果をまとめたものを以下の表12に示す。 A summary of the above results is shown in Table 12 below.
したがって、糖尿病の指標の一つである血糖値は、16日目には上昇が観察された。この時点で、AGEs様活性の上昇(すなわち、阻害率(測定値%)の低下)も腎症の症状(飲水量の増加を含む)も観察されなかった。糖尿病の指標の一つである血糖値の上昇が観察された22日目には、AGEs様活性の上昇が観察され始めた。22日目の時点で腎症の症状(飲水量の増加を含む)は観察されなかった。 Therefore, an increase in blood glucose level, which is one of the indicators of diabetes, was observed on the 16th day. At this point, neither an increase in AGEs-like activity (ie, a decrease in the inhibition rate (measured value%)) nor nephropathy symptoms (including an increase in water consumption) was observed. On the 22nd day when an increase in blood glucose level, which is one of the indicators of diabetes, was observed, an increase in AGE-like activity began to be observed. No symptoms of nephropathy (including increased water consumption) were observed at the 22nd day.
26日目当たりから腎症の症状の一つである飲水量の増加が観察され始めた。 From around day 26, an increase in water consumption, one of the symptoms of nephropathy, began to be observed.
したがって、AGEs様活性の上昇は、糖尿病の診断に使用しうるとともに、糖尿病性腎症の予備診断および診断に使用しうることが理解される。 Thus, it is understood that an increase in AGE-like activity can be used to diagnose diabetes and can be used for preliminary diagnosis and diagnosis of diabetic nephropathy.
(実施例7:LDLを用いたLOX−1(CTLD14)へのリガンドの結合阻害)
本実施例では、上述の実施例において用いたAcLDLについて、LOX−1(CTLD14)へのリガンドの結合阻害が、確認できることを実証する。また、血清ではなくLDLに関しても確認が取れることを実証する。
(Example 7: Inhibition of ligand binding to LOX-1 (CTLD14) using LDL)
In this example, it is demonstrated that the binding inhibition of the ligand to LOX-1 (CTLD14) can be confirmed for the AcLDL used in the above examples. It is also demonstrated that confirmation can be obtained for LDL, not serum.
(方法)
マウス:C57BL/6 雄マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー・ジャパン(横浜、日本)から4週齢で購入し、(独)農研機構・食品総合研究所内のSPF(Specific Pathogen Free)動物施設にて維持し、5週齢に達したものを用いた。6匹のマウスにAIN−93M(オリエンタル酵母)に与えコントロール群とし、16匹のマウスに高コレステロール食として高コレステロール・クリントン−シブルスキー齧歯類飼料(15.8% 脂肪、1.25%コレステロール、および、0.5% コール酸ナトリウム (D12109C, Research Diet Inc., New Brunswkc, NJ, USA)を16週間与えた。この動物実験は、「動物の愛護および管理に関する法律」、「実験動物の使用および保管ならびに苦痛の軽減に関する基準」等に基づいて作成された、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構の動物実験等の指針、ならびに独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所(以下、食品総合研究所)の動物実験委員会における審査を受け承認されたものである。
(Method)
Mice: C57BL / 6 male mice were purchased from Charles River Laboratory Japan (Yokohama, Japan) at the age of 4 weeks, and sold to SPF (Specific Pathogen Free) animal facilities within the National Institute of Agricultural Research and Food Research Institute. And those that reached 5 weeks of age were used. Six mice were given AIN-93M (oriental yeast) as a control group, and 16 mice were fed a high cholesterol Clinton-Siblesky rodent diet (15.8% fat, 1.25% cholesterol) as a high cholesterol diet. And 0.5% sodium cholate (D12109C, Research Diet Inc., New Brunswkc, NJ, USA) for 16 weeks. Guidelines for animal experiments, etc. of the National Research Institute for Agricultural and Food Sciences, and the National Institute for Agricultural Sciences for Food and Food Technology, based on the `` Standards for Use and Storage and Pain Reduction '' To the animal experiment committee of the research institute Are those that have undergone screening was approved that.
(血清脂質測定)
マウスは、イソフルラン軽麻酔のもと、全採血により屠殺した。各マウスの総コレステロール量(図16A)、HDLコレステロール量(図16B)、および、LDLコレステロール量(図16C)は、比色定量法(和光純薬、大阪、日本)により測定した。LDLは、高コレステロール食、および、正常食マウスの血清から、連続超遠心分離により分離した後、0.03mM EDTAを含むPBSで透析した。
(Serum lipid measurement)
Mice were sacrificed by whole blood collection under isoflurane light anesthesia. The total cholesterol level (FIG. 16A), HDL cholesterol level (FIG. 16B), and LDL cholesterol level (FIG. 16C) of each mouse were measured by a colorimetric method (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan). LDL was separated from the serum of a high cholesterol diet and normal diet mice by continuous ultracentrifugation, and then dialyzed against PBS containing 0.03 mM EDTA.
(マイクロプレートを用いた競合結合アッセイ)
50μlのリフォールドしたCTLD14 溶液(15μg/ml のCTLD14を含む)を96穴ウェルプレートの各ウェルに加え、14時間4℃で反応させた。タンパク質溶液を除いた後、200μlのTBSで洗浄し、続いてブロッキング溶液LN102 (NOF Corporation)200μlを加え、4℃で14時間反応しブロッキングを完了した。50μlのサンプル(TBSで希釈した血清、もしくはLDL)を各ウェルに添加し、続いて、50μlのDiI標識DiD−AcLDLを添加し、37℃で2時間反応させた。反応液を除去し、各ウェルを200μlのTBSで5回洗浄した後、100μlのTBSを添加し、蛍光プレートリーダー(Wallac Arvo SX, Perkin Elmer, Waltham MA, USA)により蛍光強度(励起波長:520nm,蛍光波長:550nm)を測定した。結果は、3回の独立した測定から得られた値を、サンプル無しのウェルから得られる蛍光強度を100%とした相対値(%)で表した(図17、A:血清、B:LDL)。
(Competitive binding assay using microplate)
50 μl of refolded CTLD14 solution (containing 15 μg / ml of CTLD14) was added to each well of a 96-well plate and allowed to react for 14 hours at 4 ° C. After removing the protein solution, the plate was washed with 200 μl of TBS, and subsequently 200 μl of blocking solution LN102 (NOF Corporation) was added, followed by reaction at 4 ° C. for 14 hours to complete blocking. 50 μl of sample (serum diluted with TBS, or LDL) was added to each well, followed by addition of 50 μl of DiI-labeled DiD-AcLDL and allowed to react at 37 ° C. for 2 hours. After removing the reaction solution and washing each well 5 times with 200 μl of TBS, 100 μl of TBS was added, and fluorescence intensity (excitation wavelength: 520 nm) was measured with a fluorescence plate reader (Wallac Arvo SX, Perkin Elmer, Waltham MA, USA). , Fluorescence wavelength: 550 nm). As a result, the value obtained from three independent measurements was expressed as a relative value (%) with the fluorescence intensity obtained from a well without a sample as 100% (FIG. 17, A: serum, B: LDL). .
(酵素結合イムノソルベントアッセイ)
正常食、もしくは、高コレステロール食群から調製したLDL 100μl(タンパク量で1〜100μg/ml)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、4℃で14時間反応させた。LDL溶液を除いた後、各ウェルを200μlのTBSで洗浄し、続いてブロッキング溶液LN102 (NOF Corporation)200μlを加え、37℃で2時間反応しブロッキングした。抗HNE−ヒスチジンモノクローナル抗体(日本油脂, Tokyo, Japan)100μl(0.5μg/ml の抗体を含む)を各ウェルに添加し、37℃で2時間反応させた。抗体溶液を除いた後、TBSで5回洗浄し、100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウス抗体(Bio Rad)を添加し、37℃で1時間反応させた後、TBSで5回洗浄した。各ウェルに基質であるTMB溶液を100μl添加し、室温で発色させ、100μlの1N HClの添加により反応を停止した後、マイクロプレートリーダー(Wallac Arvo SX, Perkin Elmer)により450nmの吸光度を測定した。結果は、3回の独立した実験の平均で示した(図18,B−2)。
(Enzyme-linked immunosorbent assay)
100 μl of LDL (1 to 100 μg / ml protein amount) prepared from a normal diet or a high cholesterol diet group was added to each well of a 96-well plate and reacted at 4 ° C. for 14 hours. After removing the LDL solution, each well was washed with 200 μl of TBS. Subsequently, 200 μl of blocking solution LN102 (NOF Corporation) was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours for blocking. Anti-HNE-histidine monoclonal antibody (Nippon Yushi, Tokyo, Japan) 100 μl (containing 0.5 μg / ml antibody) was added to each well and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After removing the antibody solution, the plate was washed 5 times with TBS, 100 μl of horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse antibody (Bio Rad) was added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then washed 5 times with TBS. . 100 μl of the substrate TMB solution was added to each well, the color was developed at room temperature, the reaction was stopped by adding 100 μl of 1N HCl, and then the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (Wallac Arvo SX, Perkin Elmer). The results are shown as an average of three independent experiments (FIG. 18, B-2).
(実施例8:糖尿病の進行状態の指標としての血清(血漿)中グルコース量)
実施例6で示したように、糖尿病発症の指標と成る血糖値は既に16日目で上昇が観察され、22日目に、AGEs様活性の上昇が観察された。しかし、腎症の症状(飲水量の増大など)は観察されなかったため、腎症の症状が出る前に、AGEs様活性が上昇することが示された。その後、経過を観察し(26日目頃から飲水量が多少は増えた)71日目に全採血を行い、腎症マーカーであるクレアチニン濃度を測定し、腎症が発症していることを確認した。同時に血清中のグルコース濃度も精密な測定法により測定した。ここで、71日目の採血の主眼は、クレアチニン量の測定であり、糖尿病発症の指標である血中のグルコース濃度は、以前から有意に高かったことが、実施例6に記載されている。
(Example 8: Serum (plasma) glucose level as an indicator of diabetes progression)
As shown in Example 6, an increase in blood glucose level as an index for the onset of diabetes was already observed on the 16th day, and an increase in AGE-like activity was observed on the 22nd day. However, no symptoms of nephropathy (such as increased water consumption) were observed, indicating that AGEs-like activity increased before nephropathy symptoms. Thereafter, the patient's progress was observed (the amount of water consumed increased slightly from around day 26), and blood was collected on day 71. The concentration of creatinine, a nephropathy marker, was measured to confirm that nephropathy had developed. did. At the same time, the glucose concentration in the serum was also measured by a precise measurement method. Here, the main focus of blood collection on day 71 is measurement of the amount of creatinine, and it is described in Example 6 that the blood glucose concentration, which is an index of the onset of diabetes, has been significantly higher than before.
本実施例では、実施例6までは、グルコース濃度を直接定量せずに血糖値計で簡便に測定していたのを、最終確認としてグルコース測定キットにより厳密に測定し、従来の簡便な測定法との相関を確認し、本発明の方法の厳密性を確認した。 In this example, up to Example 6, the glucose concentration was simply measured with a blood glucose meter without directly quantifying it, but as a final confirmation, it was strictly measured with a glucose measurement kit. The strictness of the method of the present invention was confirmed.
より詳細には、本実施例では、71日目に全採血を行い、その血清中のグルコース濃度を正確に測定するために、グルコースCII−テストワコーを用い、検量線は、製造業者の指示書に基づき作成して測定を行った。 More specifically, in this example, whole blood was collected on day 71 and glucose CII-Test Wako was used to accurately measure the glucose concentration in the serum, and the calibration curve was determined by the manufacturer's instructions. Based on the above, measurements were made.
(使用したマウス)
実施例6までに使用していたマウス(Stz処理BALB/cマウス)を使用した。
(Mouse used)
The mouse used until Example 6 (Stz-treated BALB / c mouse) was used.
(測定方法および結果)
発色試薬は、発色剤1瓶(150ml用)を緩衝液(150ml)に溶解し調製した。血清、および標準液(ブランクは蒸留水)各2μlを96穴マイクロプレートに入れ(同一試料に関して3ウェルで測定)、続いて発色試薬300μlをそれぞれのウェルに加えよく混合した。37℃で5分間置いた後に、505nmと600nmにおける吸光度を測定し、両者の差を測定値とした。標準液から検量線を作成し、検量線から試料中のグルコース濃度を求めた。図19において、これらの測定結果を横軸に、従来の血糖値計による測定値を縦軸としてプロットした結果を示す。この図では、血糖値と上記グルコース測定キットとの相関が示される。また、血清中のグルコース濃度を正確に測定した場合もコントロール群およびストレプトゾトシン投与群での結果を図20に示す。
(Measurement method and results)
The coloring reagent was prepared by dissolving one bottle of coloring agent (for 150 ml) in a buffer solution (150 ml). 2 μl each of serum and standard solution (blank is distilled water) was placed in a 96-well microplate (measured in 3 wells for the same sample), and then 300 μl of a coloring reagent was added to each well and mixed well. After 5 minutes at 37 ° C., the absorbance at 505 nm and 600 nm was measured, and the difference between the two was taken as the measured value. A calibration curve was created from the standard solution, and the glucose concentration in the sample was determined from the calibration curve. In FIG. 19, the results of plotting these measurement results on the horizontal axis and the measurement values obtained by a conventional blood glucose meter on the vertical axis are shown. In this figure, the correlation between the blood glucose level and the glucose measurement kit is shown. Also, when the glucose concentration in serum is accurately measured, the results in the control group and the streptozotocin administration group are shown in FIG.
これらの結果から、標準血清による検量線を作成から、各マウスの血清中のグルコース濃度を測定したところ、グルコースキットによる測定値と血糖値計による測定値間には相関があり(図19)、血清中のグルコース濃度を正確に測定した場合もコントロール群とストレプトゾトシン投与群での顕著な差は当然認められたが(図20)、経時的な変化を定量していた血糖値計による簡便な測定でも問題がないことが確認された。 From these results, a calibration curve with standard serum was prepared, and when the glucose concentration in the serum of each mouse was measured, there was a correlation between the measured value by the glucose kit and the measured value by the blood glucose meter (FIG. 19), Even when the glucose concentration in the serum was accurately measured, a significant difference was naturally recognized between the control group and the streptozotocin-administered group (FIG. 20), but simple measurement using a blood glucose meter that had quantified changes over time. But it was confirmed that there was no problem.
(実施例9:腎症の進行状態の指標としての血清(血漿)中クレアチニン量)
本実施例では、22日目に既にAGEs様活性が検出されていたが、その後、腎症に至ったのかを明らかにする目的で、全採血時に血清中のクレアチニン濃度の測定を行った。測定は、ラボアッセイクレアチニンTM(Jaffe法;和光純薬)を用いた。測定に際し、製造業者の指示書に基づき標準血清による検量線を作成し、サンプルのクレアチニン濃度を求めた。
(Example 9: Creatinine amount in serum (plasma) as an indicator of the progression of nephropathy)
In this example, AGEs-like activity was already detected on the 22nd day, but thereafter, for the purpose of clarifying whether nephropathy was reached, serum creatinine concentration was measured at the time of whole blood collection. The measurement was performed using a lab assay creatinine TM (Jaffe method; Wako Pure Chemical Industries). At the time of measurement, a standard curve with standard serum was prepared based on the manufacturer's instructions, and the creatinine concentration of the sample was determined.
(使用したマウス)
実施例6までに使用していたマウス(Stz処理BALB/cマウス)を使用した。
(Mouse used)
The mouse used until Example 6 (Stz-treated BALB / c mouse) was used.
(測定方法および結果)
50μlの試料に除タンパク試薬300μlを加え混合し、室温で10分間放置した後、2,500rpmで10分間遠心分離した。除タンパクした試料、ならびに、検量線作成用標準液100μlを96ウェルマイクロプレートに添加した(同一試料に関して3ウェルずつ)。ブランク(標準液ゼロ)として、蒸留水100μlをウェルに添加した。続いて、ピクリン酸 50μlを入れ、さらに、0.75 mol/l 水酸化ナトリウム溶液を50μl添加し、よく混合し、25〜30℃で20分間放置した。その後、30分以内に、520nmの吸光度を測定した。血清中のグルコース濃度とクレアチン濃度の個体毎の相関を示したのが図21である。コントロール群は、グルコース濃度は200mg/dl以下、クレアチン濃度は、0.4〜0.7mg/dlの範囲にあるのに対して、Stz群は、グルコース濃度が400mg/dlを越え、さらに、グルコース濃度の高い個体においては、クレアチニン量も0.7mg/dl以上の値を示す個体が多かった(図21)。さらに、コントロール群とStz群のクレアチン濃度の平均値は、Stz群の方が有意に高かった(図22)。このことから、Stz群では、糖尿病発症に引き続き、腎症も発症したと考えられる。しかし、AGEs様活性が検出された22日目では、飲水量の増加を腎症発症の最も簡便な指標として測定したところ、腎症の発症を明確に捉えることはできなかった。
(Measurement method and results)
A 50 μl sample was mixed with 300 μl of a protein removal reagent, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then centrifuged at 2,500 rpm for 10 minutes. A deproteinized sample and 100 μl of a standard solution for preparing a calibration curve were added to a 96-well microplate (3 wells for the same sample). As a blank (zero standard solution), 100 μl of distilled water was added to the well. Subsequently, 50 μl of picric acid was added, and further 50 μl of 0.75 mol / l sodium hydroxide solution was added, mixed well, and allowed to stand at 25-30 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the absorbance at 520 nm was measured within 30 minutes. FIG. 21 shows the correlation between serum glucose concentration and creatine concentration for each individual. In the control group, the glucose concentration is 200 mg / dl or less and the creatine concentration is in the range of 0.4 to 0.7 mg / dl, whereas in the Stz group, the glucose concentration exceeds 400 mg / dl. Among the individuals with high concentrations, there were many individuals in which the amount of creatinine also showed a value of 0.7 mg / dl or more (FIG. 21). Furthermore, the average value of the creatine concentration in the control group and the Stz group was significantly higher in the Stz group (FIG. 22). From this, it is considered that nephropathy also developed following the onset of diabetes in the Stz group. However, on the 22nd day when AGE-like activity was detected, an increase in the amount of drinking water was measured as the simplest index for the onset of nephropathy, and the onset of nephropathy could not be clearly captured.
したがって、22日目に既にAGEs様活性が検出されていたが、その後、腎症に至ったことが実証された。 Therefore, AGEs-like activity was already detected on the 22nd day, but it was subsequently demonstrated that nephropathy was reached.
(実施例10:時系列のデータのまとめ)
これまでの実施例に加え、血糖値または血中グルコース濃度について、これまでのデータ(0日目、16日目、22日目)に加え、同様の実験を57日目および71日目のサンプルについても行い、データも採取し、時系列に沿って纏めたものを図23〜図27に示す(したがって、本実施例において提示するデータは、実施例1〜9に記載のものと一部重複する。)。
(Example 10: Summary of time-series data)
In addition to the previous examples, in addition to the previous data (day 0, day 16 and day 22), blood glucose level or blood glucose concentration, samples of day 57 and day 71 were the same. The data collected and collected in time series are shown in FIG. 23 to FIG. 27 (the data presented in this example is therefore partially duplicated in the examples 1 to 9). To do.)
詳細には、図23〜図27は、コントロールマウスとストレプトゾトシン(Stz)投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Alexa546標識R−AGEのRAGE固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフであって、それぞれ0日目(図23)、16日目(図24)、22日目(図25)、57日目(図26)、71日目(図27)のものである。図中のAGEs様活性とは、Alexa546標識R−AGEの結合を100%阻害する濃度を100,全く阻害しない時の濃度を0として現した値であり、この値が高いほど、AGEs様活性を示す分子の含量が高いことを示す。0日目(図23参照)がStz投与開始日である。16日目(図24)には、Stz投与群の大半の個体で、血糖値の上昇が観察され、コントロール群に比べて有意に高い血糖値を示し始めており、糖尿病が既に誘導されていると考えられる。一方、AGEs様活性は、数個体で上昇が検出されたが、血糖値の顕著な上昇を示した個体とAGEs様活性の上昇を示した個体の相関は明瞭ではなかった。22日目(図25)になると、Stz群とコントロール群で血糖値の差が顕著になり、AGEs様活性の値も20以上を示す個体が増え、血糖値が高い個体ではAGEs様活性も高い傾向があるなど、発症群においてAGEs様活性が検出されている。糖尿病の発症に伴い、AGEs様活性を示す分子が生成されて来ていると考えられる。またこの段階では、飲水量の増大などの糖尿病腎症の発症を示す兆候は観察されず、腎症の兆候が現れる前に、AGEs様活性を示す分子が捉えられていると考えられる。 Specifically, FIGS. 23 to 27 show “Alexa546-labeled R-AGE binding inhibitory activity to RAGE-immobilized plate” of serum derived from control mice and mice in which diabetes was induced by administration of streptozotocin (Stz), and “ The blood glucose level or blood glucose concentration "was measured over time, and was a graph showing the correlation for each individual, on the 0th day (Fig. 23), the 16th day (Fig. 24), and the 22nd day (Fig. 25). ), 57th day (FIG. 26), and 71st day (FIG. 27). The AGEs-like activity in the figure is a value expressed with a concentration at which the binding of Alexa546-labeled R-AGE is 100% inhibited as 100, and a concentration when there is no inhibition at all. The higher this value, the more the AGEs-like activity. Indicates that the content of the indicated molecule is high. The 0th day (see FIG. 23) is the start date of Stz administration. On the 16th day (FIG. 24), an increase in blood glucose level was observed in most individuals in the Stz-administered group, and it began to show a significantly higher blood glucose level than in the control group, and diabetes was already induced. Conceivable. On the other hand, an increase in AGEs-like activity was detected in several individuals, but the correlation between individuals showing a significant increase in blood glucose level and individuals showing an increase in AGEs-like activity was not clear. On the 22nd day (FIG. 25), the difference in blood glucose level between the Stz group and the control group becomes significant, the number of individuals having an AGEs-like activity value of 20 or more increases, and in individuals with high blood glucose levels, the AGEs-like activity is also high. AGEs-like activity has been detected in the onset group such as there is a tendency. It is considered that molecules exhibiting AGEs-like activity have been generated with the onset of diabetes. At this stage, no signs of diabetic nephropathy such as increased water consumption are observed, and it is considered that molecules showing AGE-like activity are captured before signs of nephropathy appear.
57日目の採血の血清においては((図26)、Stz群で高い血清中のグルコース濃度が検出され、AGEs様活性も全般に高くなっていたが、グルコース濃度との相関は高くなかった。さらに、コントロール群のAGEs様活性も上昇しており、この回の採血結果からは糖尿病の進行に伴い、AGEs様活性を示す分子が顕著に蓄積されることが明瞭には示されなかった。 In the serum collected on day 57 ((FIG. 26)), a high glucose concentration in the serum was detected in the Stz group, and AGEs-like activity was generally high, but the correlation with the glucose concentration was not high. Furthermore, the AGEs-like activity of the control group was also increased, and this blood collection result did not clearly show that molecules exhibiting AGEs-like activity were markedly accumulated as diabetes progressed.
71日目に当たる11月25日のStz群では、高グルコース濃度を示し、コントロール群とは有意な差を示した。さらに、AGEs様活性もコントロール群よりも高く、グルコース濃度、AGEs様活性共に高い個体も多かった。図28は、71日目の血清中のクレアチニン量を測定し、AGEs様活性との相関をみたものであるが、コントロール群に対し、Stz群では、クレアチニン濃度、AGEs様活性共に高い個体が多く観察された。クレアチニンは腎症のマーカーであるから、Stz群では糖尿病の進行に伴い腎症が発症していることが確認されたといえる。また、AGEs様活性は、既に22日目から検出されており、57日目の結果はコントロール値が異常値を示しているため、誤操作の可能性と判断されることから、腎症発症よりも早い段階で検出可能であり、AGEs様活性の測定は、腎症発症を早い時期に捉えるマーカーになり得ると言える。 The Stz group on November 25, which is the 71st day, showed a high glucose concentration and a significant difference from the control group. Furthermore, AGEs-like activity was higher than that of the control group, and there were many individuals with high glucose concentration and AGEs-like activity. FIG. 28 shows the amount of creatinine in the serum on day 71, and the correlation with AGEs-like activity was observed. In contrast to the control group, the Stz group had many individuals with higher creatinine concentration and AGEs-like activity. Observed. Since creatinine is a marker of nephropathy, it can be said that nephropathy has been confirmed to develop as diabetes progresses in the Stz group. In addition, AGEs-like activity has already been detected from the 22nd day, and the result on the 57th day shows that the control value shows an abnormal value. It can be detected at an early stage, and it can be said that measurement of AGE-like activity can be a marker for detecting nephropathy onset at an early stage.
このようにコントロールマウスおよびStzマウスの血清中グルコース濃度、AGEs様活性の変化を経時的に追跡した結果、個体毎に両者の相関が示されたといえる。また、0日目から22日目までは、Stz群で血糖値、AGEs様活性が共に上昇する個体数が多いことが観察され、71日目でもその傾向は観察された。22日目の段階では、腎症発症の簡便な目安である飲水量の増大などは認められていなかったが、この時点で既にAGEs様活性の上昇がみられた。さらに、71日目では、腎症発症の指標となる血中クレアチニン量も測定したが、Stz群において、AGEs活性とクレアチニン濃度が共に高い個体が多いことも確認された。 As described above, changes in serum glucose concentration and AGEs-like activity in control mice and Stz mice were traced over time. Also, from day 0 to day 22, it was observed that there were a large number of individuals whose blood glucose level and AGE-like activity both increased in the Stz group, and that tendency was also observed on day 71. At the stage of the 22nd day, an increase in the amount of drinking water, which is a simple measure for the onset of nephropathy, was not observed, but at this point, an increase in AGE-like activity was already observed. Furthermore, on the 71st day, blood creatinine amount, which is an index of nephropathy onset, was also measured, but it was also confirmed that there were many individuals with high AGE activity and creatinine concentration in the Stz group.
以上からAGEs様活性は糖尿病または糖尿病性腎症の診断のために使用することができ、また、糖尿病性腎症の予備的な診断(予測)、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断(予測)も可能であることが実証され、診断マーカーとして有用であることが実証された。 From the above, AGEs-like activity can be used for the diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy, and is a preliminary diagnosis (prediction) of diabetic nephropathy, a preliminary diagnosis of diabetic nephropathy in diabetes ( Prediction) is also possible and proved to be useful as a diagnostic marker.
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, it is understood that the scope of this invention should be construed only by the claims. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.
CTLD様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびRAGE様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、糖尿病、動脈硬化、糖尿病性血管障害、糖尿病性腎症などの早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野で活用できる。 CTLD-like polypeptide-surfactant binding complex and RAGE-like polypeptide-surfactant binding complex are useful for early diagnosis of diabetes, arteriosclerosis, diabetic vasculopathy, diabetic nephropathy, etc. It can be used in various fields such as evaluation, life improvement and evaluation of treatment effects by medication.
配列番号1:PR−CTLDまたはCTLDをコードする核酸配列
配列番号2:PR−CTLDまたはCTLDのアミノ酸配列
配列番号3:PR−Lox−1またはLox−1をコードする核酸配列
配列番号4:PR−Lox−1またはLox−1のアミノ酸配列
配列番号5:PR−CTLD14またはCTLD14をコードする核酸配列
配列番号6:PR−CTLD14またはCTLD14のアミノ酸配列
配列番号7:Lox−1のCTLD+ネックまたはPR−CTLD+ネックをコードする核酸配列
配列番号8:Lox−1のCTLD+ネックまたはPR−CTLD+ネックのアミノ酸配列
配列番号9:RAGEまたはmRAGEをコードする核酸配列
配列番号10:RAGEまたはmRAGEのアミノ酸配列
配列番号11:RAGE8またはmRAGE8をコードする核酸配列
配列番号12:RAGE8またはmRAGE8のアミノ酸配列
配列番号13:RAGE1またはmRAGE1をコードする核酸配列
配列番号14:RAGE1またはmRAGE1のアミノ酸配列
配列番号15:RAGE2またはmRAGE2をコードする核酸配列
配列番号16:RAGE2またはmRAGE2のアミノ酸配列
配列番号17:RAGE3またはmRAGE3をコードする核酸配列
配列番号18:RAGE3またはmRAGE3のアミノ酸配列
配列番号19:RAGE4またはmRAGE4をコードする核酸配列
配列番号20:RAGE4またはmRAGE4のアミノ酸配列
配列番号21:RAGE7またはmRAGE7をコードする核酸配列
配列番号22:RAGE7またはmRAGE7のアミノ酸配列
配列番号23:RAGE143またはmRAGE143をコードする核酸配列
配列番号24:RAGE143またはmRAGE143のアミノ酸配列
配列番号25:RAGE223またはmRAGE223をコードする核酸配列
配列番号26:RAGE223またはmRAGE223のアミノ酸配列
配列番号27:RAGE226またはmRAGE226をコードする核酸配列
配列番号28:RAGE226またはmRAGE226のアミノ酸配列
配列番号29:AviTag配列 GLNDIFEAQKIEWHE
配列番号30:Streptag配列 AWRHPQFGG
配列番号31:StreptagII配列 WSHPQFEK
配列番号32:順方向プライマー(RAGE1、RAGE2、RAGE3、RAGE7、RAGE8、RAGE9、RAGE143、RAGE223およびRAGE226に共通)5’−CTACATATGGCTCAAAACATCACAGC−3’
配列番号33:RAGE1逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC−3’
配列番号34:RAGE2逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGACCAGACACGGGGCTG−3’
配列番号35:RAGE3逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAAGCTACTGCTCCACC−3’
配列番号36:RAGE7逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAAACACCAGCCGTGAGT−3’
配列番号37:RAGE8逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAAATCTGGTAGACACGG−3’
配列番号38:RAGE9逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGACTTGGTCTCCTTTCC−3’
配列番号39:RAGE4順方向プライマー
5’−TCGCATATGGCAATGAACAGGAATGG−3’
配列番号40:RAGE4逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC−3’
配列番号41:RAGE143逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGTCCCCACCTTATTGGG−3’
配列番号42:AGE223逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGCTGTGCGCAAGGCCCG−3’
配列番号43:RAGE226逆方向プライマー
5’−TTACTCGAGACTGGATGGGGGCTGTGC−3’
SEQ ID NO: 1: Nucleic acid sequence encoding PR-CTLD or CTLD SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of PR-CTLD or CTLD SEQ ID NO: 3: Nucleic acid sequence encoding PR-Lox-1 or Lox-1 SEQ ID NO: 4: PR- Lox-1 or Lox-1 amino acid sequence SEQ ID NO: 5: Nucleic acid sequence encoding PR-CTLD14 or CTLD14 SEQ ID NO: 6: PR-CTLD14 or CTLD14 amino acid sequence SEQ ID NO: 7: Lox-1 CTLD + neck or PR-CTLD + Nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 8: Lox-1 CTLD + Neck or PR-CTLD + Neck amino acid sequence SEQ ID NO: 9: Nucleic acid sequence encoding RAGE or mRAGE SEQ ID NO: 10: RAGE or mRAGE amino acid sequence SEQ ID NO: 11 RAGE Or nucleic acid sequence encoding mRAGE8 SEQ ID NO: 12: amino acid sequence of RAGE8 or mRAGE8 SEQ ID NO: 13: nucleic acid sequence encoding RAGE1 or mRAGE1 SEQ ID NO: 14: amino acid sequence of RAGE1 or mRAGE1 SEQ ID NO: 15: nucleic acid encoding RAGE2 or mRAGE2 SEQ ID NO: 16: amino acid sequence of RAGE2 or mRAGE2 SEQ ID NO: 17: nucleic acid sequence encoding RAGE3 or mRAGE3 SEQ ID NO: 18: amino acid sequence of RAGE3 or mRAGE3 SEQ ID NO: 19: nucleic acid sequence encoding RAGE4 or mRAGE4 SEQ ID NO: 20: RAGE4 Or the amino acid sequence of mRAGE4 SEQ ID NO: 21: nucleic acid sequence encoding RAGE7 or mRAGE7 SEQ ID NO: 22: RAGE7 or mRA Amino acid sequence of E7 SEQ ID NO: 23: Nucleic acid sequence encoding RAGE143 or mRAGE143 SEQ ID NO: 24: Amino acid sequence of RAGE143 or mRAGE143 SEQ ID NO: 25: Nucleic acid sequence encoding RAGE223 or mRAGE223 SEQ ID NO: 26: Amino acid sequence SEQ ID NO: RAGE223 or mRAGE223 27: Nucleic acid sequence encoding RAGE226 or mRAGE226 SEQ ID NO: 28: Amino acid sequence of RAGE226 or mRAGE226 SEQ ID NO: 29: AviTag sequence GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO: 30: Strepttag sequence AWRHPQFGG
Sequence number 31: StrepttagII arrangement | sequence WSHPQFEK
SEQ ID NO: 32: forward primer (common to RAGE1, RAGE2, RAGE3, RAGE7, RAGE8, RAGE9, RAGE143, RAGE223, and RAGE226) 5′-CTACATATGGCTCAAAACATCACAGC-3 ′
SEQ ID NO: 33: RAGE1 reverse primer 5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC-3 ′
SEQ ID NO: 34: RAGE2 reverse primer 5′-TTACTTCGAGACCAGACACGGGGCTG-3 ′
SEQ ID NO: 35: RAGE3 reverse primer 5′-TTACTTCGAGAAGCTACTGCTCCCACC-3 ′
SEQ ID NO: 36: RAGE7 reverse primer 5′-TTACTTCGAGAAACACCAGCCGTGAGT-3 ′
SEQ ID NO: 37: RAGE8 reverse primer 5′-TTACTCGAGAAATCTGGTAGACACGG-3 ′
SEQ ID NO: 38: RAGE9 reverse primer 5′-TTACTCGAGACTTGGTCTCCTTTC-3 ′
SEQ ID NO: 39: RAGE4 forward primer 5′-TCGCATATGGCAATGAACAGGAATGG-3 ′
SEQ ID NO: 40: RAGE4 reverse primer 5′-TTACTCGAGAGCCTGCAGTTGGCCC-3 ′
SEQ ID NO: 41: RAGE143 reverse primer 5′-TTACTCGAGTCCCCCACTTTATTGGGG-3 ′
SEQ ID NO: 42: AGE223 reverse primer 5′-TTACTCGAGCTGTCGCACAGCGCCG-3 ′
SEQ ID NO: 43: RAGE226 reverse primer 5′-TTACTCGAGACTGATGGGGGCTGTGC-3 ′
Claims (8)
(A)検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させる工程であって、該RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体である、工程、
および
(B)該AGE分子に対する該RAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるAGE分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。 A method for detecting or quantifying AGE molecules comprising:
(A) contacting a sample to be detected or quantified with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, wherein the RAGE molecule is RAGE143, RAGE1, RAGE223, RAGE226 or A process that is a variant thereof,
And (B) a step of detecting binding of the RAGE molecule for the AGE molecule, presence or level of inhibition of said binding indicates the presence or the level of presence of AGE content element in said sample, comprising the step, Method.
(A)糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたRAGE分子の存在下で標識したAGE分子に接触させる工程であって、該RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体である、工程、
および
(B)該固定されたRAGE分子に対する該標識したAGE分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害のレベルが正常個体と比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。 A method for detecting diabetes or diabetic nephropathy,
(A) contacting a sample from a subject to be detected for diabetic nephropathy with a labeled AGE molecule in the presence of a RAGE molecule immobilized on a solid phase, the RAGE molecule comprising RAGE143 , RAGE1, RAGE223, RAGE226 or a variant thereof,
And (B) said a fixed detecting binding of said labeled AGE molecule to R AGE molecule, high Ikoto as compared levels of inhibition of said binding is normal individuals, said subject is diabetic Or a method comprising the step of indicating that the patient is suffering from diabetic nephropathy.
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子;および
(B)固定されたRAGE分子に結合した該標識したAGE分子の標識を検出する手段であって、該標識の強度から、AGE分子に対する該RAGE分子の結合が検出される、手段
を備え、該RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体であり、該結合の阻害の存否またはレベルは、AGE分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。 A kit for the detection or quantification of AGE minute child,
(A) a solid phase having an immobilized RAGE molecule and a labeled AGE molecule; and (B) means for detecting the label of the labeled AGE molecule bound to the immobilized RAGE molecule, from the intensity of the label , binding of the RAGE molecule is detected for AGE molecule, comprising means, the RAGE molecule, RAGE143, RAGE1, RAGE223, a RAGE226 or a variant thereof, presence or level of inhibition of said binding, AGE content child A kit that indicates the presence or level of presence.
(A)固定されたRAGE分子を有する固相および標識したAGE分子;および
(B)固定されたRAGE分子に結合した該標識したAGE分子の標識を検出する手段であって、該標識の強度から、AGE分子に対する該RAGE分子の結合が検出される、手段
を備え、該RAGE分子は、RAGE143、RAGE1、RAGE223、RAGE226またはその改変体であり、該結合の阻害のレベルが正常個体と比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。 A kit for the diagnosis of diabetes or diabetic nephropathy,
(A) a solid phase having an immobilized RAGE molecule and a labeled AGE molecule; and (B) means for detecting the label of the labeled AGE molecule bound to the immobilized RAGE molecule, from the intensity of the label Means for detecting the binding of the RAGE molecule to the AGE molecule, wherein the RAGE molecule is RAGE143, RAGE1, RAGE223, RAGE226 or a variant thereof, and the level of inhibition of the binding is higher than that in a normal individual. Indicates that the subject is suffering from diabetes or diabetic nephropathy.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011251881A JP5999542B2 (en) | 2010-11-18 | 2011-11-17 | Method for detecting molecules having ligand-like activity |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010258405 | 2010-11-18 | ||
JP2010258405 | 2010-11-18 | ||
JP2011251881A JP5999542B2 (en) | 2010-11-18 | 2011-11-17 | Method for detecting molecules having ligand-like activity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012122994A JP2012122994A (en) | 2012-06-28 |
JP5999542B2 true JP5999542B2 (en) | 2016-09-28 |
Family
ID=46504552
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011251881A Active JP5999542B2 (en) | 2010-11-18 | 2011-11-17 | Method for detecting molecules having ligand-like activity |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5999542B2 (en) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016051808A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Biotinylated and oxidized ldl receptor and advanced glycation end product receptor produced using genetically modified silkworm |
JP6445861B2 (en) * | 2014-12-18 | 2018-12-26 | 国立大学法人金沢大学 | Sample pretreatment method for oxytocin detection |
JP7262102B2 (en) * | 2019-02-21 | 2023-04-21 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Assay system for detecting AGEs |
JP7479039B2 (en) * | 2019-02-21 | 2024-05-08 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Diabetes diagnostic technology |
JP2020134532A (en) * | 2019-02-21 | 2020-08-31 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Technique of diagnosing alzheimer-type dementia |
WO2021090923A1 (en) * | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | VISUAL DETECTION METHOD OF MODIFIED LDL OR STIMULATING AGEs |
JPWO2021090922A1 (en) * | 2019-11-08 | 2021-05-14 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2696097A (en) * | 1996-04-16 | 1997-11-07 | Schering Aktiengesellschaft | Advanced glycosylation end-product receptor peptides and uses therefor |
US6555651B2 (en) * | 1997-10-09 | 2003-04-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Ligand binding site of rage and uses thereof |
JP3698563B2 (en) * | 1998-09-22 | 2005-09-21 | 生化学工業株式会社 | Method and kit for measuring glycosaminoglycan |
US6753150B2 (en) * | 1998-10-05 | 2004-06-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage |
JP4143716B2 (en) * | 2002-02-08 | 2008-09-03 | 国立大学法人金沢大学 | AGE-RAGE antagonist |
JP5604782B2 (en) * | 2007-09-28 | 2014-10-15 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Receptor reconstructed product and disease test method using the same |
-
2011
- 2011-11-17 JP JP2011251881A patent/JP5999542B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2012122994A (en) | 2012-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5604782B2 (en) | Receptor reconstructed product and disease test method using the same | |
JP5999542B2 (en) | Method for detecting molecules having ligand-like activity | |
JP6617110B2 (en) | Biotinylated oxidized LDL receptor and advanced glycation end product receptor produced by transgenic silkworm | |
CN103987855B (en) | Undifferentiated cell detection method and complex carbohydrate detection method | |
JP2023115006A (en) | Method for cancer diagnosis, and diagnostic kit using nk cell activity | |
JP2015524561A (en) | Single molecule protein sequencing | |
Syed et al. | Adaptability of myosin V studied by simultaneous detection of position and orientation | |
Ohyabu et al. | Convergent solid-phase synthesis of macromolecular MUC1 models truly mimicking serum glycoprotein biomarkers of interstitial lung diseases | |
Lai et al. | The synaptotagmin 1 linker may function as an electrostatic zipper that opens for docking but closes for fusion pore opening | |
WO2013122061A1 (en) | Peptide having affinity for silicon nitride (si3n4), and use therefor | |
JP5093711B2 (en) | Molecules that recognize AGE | |
US20210349090A1 (en) | Corona nucleocapsid antigen for use in antibody-immunoassays | |
CA3008434A1 (en) | Early-stage alzheimer's disease autoantibody biomarkers, target antigens, and diagnostic uses thereof | |
JP6772074B2 (en) | Polydimethylsiloxane Affinity Peptide and Its Utilization | |
JP7479039B2 (en) | Diabetes diagnostic technology | |
JP2007057334A (en) | Detection reagent and detection method of vacuolation toxin of helicobacter pylori | |
JP2009082076A (en) | Receptor mutant, and method for detection of factor associated with lifestyle-related disease using the same | |
CA2396127A1 (en) | Gene expression in biological conditions | |
JP2020134532A (en) | Technique of diagnosing alzheimer-type dementia | |
WO2021090923A1 (en) | VISUAL DETECTION METHOD OF MODIFIED LDL OR STIMULATING AGEs | |
CN107531767A (en) | For treating and diagnosing the peptide used in type 1 diabetes | |
WO2021090922A1 (en) | METHOD FOR QUICKLY AND EASILY QUANTIZING DENATURED LDL AND STIMULATIVE AGEs | |
JP5048100B2 (en) | Peptide having binding property to adiponectin, and analysis method and analyzer using the peptide | |
JP7477141B2 (en) | Liver disease diagnostic technology | |
WO2011096440A1 (en) | Compound capable of binding to naturally occurring denatured protein, and method for screening for the compound |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150721 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150722 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150911 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160324 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160804 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160819 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5999542 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |