JP5996707B2 - RSV specific binding molecule - Google Patents
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Description
本発明は生物学及び医学の分野に関する。 The present invention relates to the fields of biology and medicine.
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルスファミリーに属する一般的な風邪
ウイルスである。RSVは、病原性があり、伝染し易く、かつ2歳未満の児童の下気道疾患の
最も一般的な原因である。デイケアに参加している児童の最高98%が、1つのRSVシーズン
で感染する。RSV感染を有する児童の0.5%〜3.2%が入院を必要とする。米国において、1年
につきおよそ90,000件の入院及び4500件の死亡が報告された。RSVに起因する入院のため
の主要な危険因子は、早産、慢性肺疾患、先天性心臓病、易感染性免疫（compromised im
munity）、及び年齢以外は健常の児童における6週未満の年齢である。十分な栄養及び酸
素療法の形態での支持看護の他に、RSV陽性の細気管支炎の有効な治療は利用できない。
リバビリンなどの抗ウイルス療法は、RSV感染症に効果的であることが証明されていない
。1つのモノクローナル抗体であるパリビズマブ(palivizumab)（シナジス（Synagis）と
も称される) は、RSV感染症に対する予防のために登録されている。パリビズマブは、RSV
の融合タンパク質(Fタンパク質)に対する遺伝子改変された(ヒト化)モノクローナル抗体
である。RSV Fタンパク質は、ウイルス膜タンパク質であり、接着後、宿主細胞とビリオ
ンの融合の原因となる。加えて、合胞体の形成による隣接細胞の感染は、Fタンパク質に
より促進され、その機能は、該タンパク質の原型のオリゴマー構造によると考えられる。
しかしながら、パリビズマブは常に効果的とは限らない。従って、当該技術分野において
、RSVに対する代替的及び／又は補助抗体並びに治療法についての必要性が存在する。
Respiratory syncytial virus (RSV) is a common cold virus belonging to the paramyxovirus family. RSV is pathogenic, contagious, and is the most common cause of lower respiratory tract disease in children under 2 years of age. Up to 98% of children participating in day care are infected in one RSV season. 0.5% to 3.2% of children with RSV infection require hospitalization. In the United States, approximately 90,000 hospitalizations and 4500 deaths were reported per year. The main risk factors for hospitalization due to RSV are premature birth, chronic lung disease, congenital heart disease, compromised immunity (compromised im
munity), and age other than 6 weeks in healthy children. In addition to supportive nursing in the form of adequate nutrition and oxygen therapy, no effective treatment for RSV-positive bronchiolitis is available.
Antiviral therapies such as ribavirin have not proven effective for RSV infection. One monoclonal antibody, palivizumab (also called Synagis), is registered for prevention against RSV infection. Palivizumab RSV
A genetically modified (humanized) monoclonal antibody against the fusion protein (F protein). RSV F protein is a viral membrane protein that, after adhesion, causes fusion of host cells and virions. In addition, infection of adjacent cells due to syncytium formation is facilitated by F protein, and its function is thought to be due to the original oligomeric structure of the protein.
However, palivizumab is not always effective. Accordingly, there is a need in the art for alternative and / or adjunct antibodies to RSV and therapeutic methods.
本発明の目的は、RSVに対する改良された抗体又は当該抗体の機能的等価物を提供する
ことである。更なる目的は、既存のRSV特異抗体と組み合わせて、相乗効果を提供する、R
SVに対する補助抗体を提供することである。本発明のさらなる目的は、公知のRSV特異抗
体が指示されるエピトープと異なるエピトープに指示される、RSV Fタンパク質に対する
ヒト若しくはヒト化抗体又は機能的等価物を提供することである。
The object of the present invention is to provide improved antibodies to RSV or functional equivalents of such antibodies. A further objective is to provide a synergistic effect in combination with existing RSV specific antibodies, R
It is to provide an auxiliary antibody against SV. It is a further object of the present invention to provide human or humanized antibodies or functional equivalents to RSV F protein that are directed to an epitope that differs from the epitope for which known RSV specific antibodies are directed.
したがって、本発明は、呼吸器合胞体ウイルスに特異的に結合することができ、かつ以
下の構成を含む、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的な部分、誘導体及び
／又は類似体を提供する：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
本発明は、図2に示す重鎖及び軽鎖配列を有する、「AM22」と称する抗体を提供する。
特にAM22の抗原結合特性に関与するAM22のCDR配列も図2に示す。抗体AM22は、完全ヒト抗
体であり、RSVに特異的に結合でき(図3)、それゆえ、ヒト個人の予防及び／又は治療的な
使用に好ましい。
The present invention provides an antibody designated “AM22” having the heavy and light chain sequences shown in FIG.
In particular, the CDR sequence of AM22 involved in the antigen-binding properties of AM22 is also shown in FIG. Antibody AM22 is a fully human antibody and can specifically bind to RSV (FIG. 3) and is therefore preferred for prophylactic and / or therapeutic use in human individuals.
上記のように、唯一の利用可能な臨床的に使用される抗RSV抗体は、パリビズマブであ
る。これは、RSV Fタンパク質の抗原部位におけるエピトープに指示されるヒト化モノク
ローナル抗体である。ヒト化抗体は未だマウス抗体の一部を含み、免疫原性特性が完全マ
ウス抗体に比較して減弱しているものの、ヒトに適用した場合、ヒト化抗体の副作用が発
生する場合がある。しかしながら、本発明者は、RSV特異抗体を産生するヒトB細胞を得る
こと及び培養することに成功し、これにより完全ヒト配列の結果として、（仮にあったと
しても）大幅に減弱した免疫原性活性を有するヒトRSV特異抗体が提供された。実施例に
示すように、本発明による抗体は、パリビズマブに比較して、優れた特徴を有する(図1及
び表1)。本発明者は、筋注により本発明の抗体を与えられた後にRSV-Xで鼻腔内曝露した
コットンラット(Sigmodon hispidus)が、パリビズマブを与えた後にRSV-Xで曝露したコッ
トンラットよりも低い病態指数を有することを示した (図4C及び表2)。本明細書に使用さ
れる病態指数は、肺損傷についての3つの個別的マーカーを分類するスコアの合計である
。これらの3つのマーカーは、気管支及び細気管支上皮の肥大（hyperthropy）、気管支及
び細気管支を囲む炎症(（細）気管支周囲炎)、及び肺胞の炎症(肺胞炎)である。加えて、
本発明の抗体を筋注した後にRSV-X曝露したコットンラットは、パリビズマブを与えた後
にRSV-X曝露したコットンラットよりも低い肺ウイルス力価を有し(図4B)、これはTCID50(
50%の組織培養感染用量)アッセイにより測定された。それゆえ、AM22は、パリビズマブよ
りも好ましい。
As noted above, the only available clinically used anti-RSV antibody is palivizumab. This is a humanized monoclonal antibody directed to an epitope at the antigenic site of the RSV F protein. Although humanized antibodies still contain some mouse antibodies and their immunogenic properties are attenuated compared to fully mouse antibodies, side effects of humanized antibodies may occur when applied to humans. However, the inventor has succeeded in obtaining and culturing human B cells producing RSV-specific antibodies, thereby greatly reducing (if at all) immunogenicity as a result of fully human sequences. Human RSV specific antibodies with activity were provided. As shown in the Examples, the antibody according to the present invention has superior characteristics compared to palivizumab (FIG. 1 and Table 1). The inventor found that cotton rats exposed intranasally with RSV-X after receiving the antibody of the present invention by intramuscular injection (Sigmodon hispidus) were lower in pathology than cotton rats exposed with RSV-X after receiving palivizumab It was shown to have an index (Figure 4C and Table 2). As used herein, the disease state index is the sum of scores that classify three individual markers for lung injury. These three markers are hyperthropy of the bronchi and bronchiole epithelium, inflammation surrounding the bronchi and bronchioles ((thin) peribronchiolitis), and inflammation of the alveoli (alveolitis). in addition,
Cotton rats exposed to RSV-X after intramuscular injection of the antibodies of the present invention have lower lung virus titers than cotton rats exposed to palivizumab and then exposed to RSV-X (FIG.
50% tissue culture infectious dose) assay. Therefore, AM22 is preferred over palivizumab.
パリビズマブの他に、いくつかの他のRSV特異抗体が公知である。WO 2008/147196は、R
SV結合分子、すなわち、抗体D25、AM14、AM16 及びAM23の配列を開示する。本願の実施例
1において詳細に説明するように、RSV特異抗体AM22は、抗体D25、AM14、AM16及びAM23と
同じドナーから得られた。しかしながら、顕著なのは、AM22は、同じドナーから得られる
他の全ての抗体よりも効率的にRSVを認識することである。AM22のIC50値(1.15ng/ml)は、
パリビズマブ、D25、AM14、AM16又はAM23のIC50値より低い。従って、RSV関連の障害の治
療及び／又は予防のためのAM22の使用は、他のRSV特異抗体の使用に勝る利点がある。他
の抗体に比較して類似の効果を得るのにより少ないAM22抗体が必要とされている。従って
、より少ないAM22が、RSV関連の障害の治療及び／又は予防のために個人に与えられなけ
ればならない。別法として、AM22の同程度の量を用いて、他の抗体と比較して、RSV関連
の障害のより有効な治療及び／又は予防が達成される。
In addition to palivizumab, several other RSV specific antibodies are known. WO 2008/147196 is R
Disclosed are the sequences of SV binding molecules, ie antibodies D25, AM14, AM16 and AM23. Examples of the present application
As described in detail in 1, the RSV specific antibody AM22 was obtained from the same donor as antibodies D25, AM14, AM16 and AM23. However, strikingly, AM22 recognizes RSV more efficiently than all other antibodies from the same donor. The IC 50 values of AM22 (1.15ng / ml), the
Lower than the IC 50 value of palivizumab, D25, AM14, AM16 or AM23. Thus, the use of AM22 for the treatment and / or prevention of RSV-related disorders has advantages over the use of other RSV specific antibodies. Less AM22 antibody is needed to achieve a similar effect compared to other antibodies. Therefore, less AM22 must be given to individuals for the treatment and / or prevention of RSV-related disorders. Alternatively, comparable amounts of AM22 are used to achieve more effective treatment and / or prevention of RSV-related disorders compared to other antibodies.
更に、本発明によるRSV特異抗体は、先に開示されたRSV結合分子と異なるエピトープを
認識する。先に同定された抗体(WO2008/147196)に類似するAM22は、RSV Fタンパク質に結
合できる(図3A)。しかしながら、AM22は、単量体のRSV Fタンパク質に結合しない(図3B左
右のパネル)。AM22に反して、公知の抗体パリビズマブ及びAM16(WO 2008/147196及び図3B
において開示される)は、Fタンパク質の単量体形態に結合できる。重要なことに、抗原特
異的B細胞受容体(BCR)を発現するAM22 B細胞株は、組換え型のFタンパク質を認識しない(
図3C)。それゆえ、AM22は、パリビズマブ、D25、AM23及びAM16とは異なるFタンパク質の
エピトープに結合する。組換えFタンパク質が、8個のHISタグを有するイソロイシンジッ
パー三量体化モチーフ(ILZ-8xHIS)を含むベクターで発現する場合、それから、AM22は、
この三量体立体構造依存的構造を認識した(図3D)。対照的に、AM14は、Fタンパク質の単
量体形態又はILZ-8xHIS Fタンパク質のいずれも認識しなかった。それゆえ、AM22は、同
様にAM14とは異なるFタンパク質のエピトープに結合する。更に、AM22は、RSV感染Hep2細
胞に結合するD25又はパリビズマブに干渉しないことが判明した。それゆえ、AM22は、D25
、AM14、AM16、AM23及びパリビズマブに比較して、Fタンパク質の異なるエピトープに結
合する。従って、本発明によるRSV特異抗体又はその機能的等価物は、好ましくは、既に
公知であるRSV特異抗体、例えばパリビズマブ、D25、AM14、AM16及びAM23と組み合わせる
。本発明による抗体を公知のRSV特異抗体と組み合わせることにより、RSVの2以上の異な
るエピトープが、同じ療法の間、認識される。それゆえ、RSVへのより強い免疫原性反応
が得られる。更に、RSVに対するより高い抗体特異性は、公知のRSV特異抗体のうちの1つ
を本発明によるAM22抗体と組み合わせることにより、達成される。RSVに応答してより強
い免疫原性反応及びRSVに対するより高い特異性を有する当該組合せは、RSV関連障害のよ
り有効な治療及び／又は予防を結果的に生じる。最後に、AM22は、約1.15ng/mlという低
いIC50値により示されるように、パリビズマブ、D25、AM14、AM16及びAM23に比較して、F
タンパク質により強い結合能を有するので、全体的により低い抗体投与量を必要とする。
Furthermore, the RSV-specific antibody according to the invention recognizes a different epitope from the previously disclosed RSV binding molecules. AM22, similar to the previously identified antibody (WO2008 / 147196), can bind to the RSV F protein (FIG. 3A). However, AM22 does not bind to monomeric RSV F protein (Figure 3B left and right panels). Contrary to AM22, the known antibodies palivizumab and AM16 (WO 2008/147196 and FIG.
Can be bound to the monomeric form of the F protein. Importantly, the AM22 B cell line expressing antigen-specific B cell receptor (BCR) does not recognize recombinant F protein (
(Figure 3C). Therefore, AM22 binds to a different epitope of the F protein than palivizumab, D25, AM23 and AM16. If the recombinant F protein is expressed in a vector containing an isoleucine zipper trimerization motif (ILZ-8xHIS) with 8 HIS tags, then AM22
This trimeric conformation-dependent structure was recognized (FIG. 3D). In contrast, AM14 did not recognize either the monomeric form of the F protein or the ILZ-8xHIS F protein. Therefore, AM22 binds to an epitope of the F protein that is different from AM14 as well. Furthermore, AM22 was found not to interfere with D25 or palivizumab binding to RSV infected Hep2 cells. Therefore, AM22 is D25
, Binds to a different epitope of the F protein compared to AM14, AM16, AM23 and palivizumab. Therefore, the RSV-specific antibody according to the present invention or a functional equivalent thereof is preferably combined with an already known RSV-specific antibody such as palivizumab, D25, AM14, AM16 and AM23. By combining the antibodies according to the invention with known RSV-specific antibodies, two or more different epitopes of RSV are recognized during the same therapy. Therefore, a stronger immunogenic response to RSV is obtained. Furthermore, higher antibody specificity for RSV is achieved by combining one of the known RSV specific antibodies with the AM22 antibody according to the invention. Such a combination with a stronger immunogenic response in response to RSV and a higher specificity for RSV results in a more effective treatment and / or prevention of RSV-related disorders. Finally, AM22 has an F50 compared to palivizumab, D25, AM14, AM16 and AM23 as shown by the low IC 50 value of about 1.15 ng / ml.
Overall, lower antibody doses are required as it has a stronger binding capacity for proteins.
従って、一実施態様は、HEp-2細胞をRSV-A2ウイルスで感染させたインビトロ中和アッ
セイにおいて1.25ng/ml未満のIC50値を有する本発明による抗体又は機能的等価物を提供
する。前記抗体又は機能的等価物は、好ましくは1.2ng/ml未満、好ましくは0.5ng/ml〜1.
2ng/mlのIC50値を有する。加えて、本発明による抗体又は機能的等価物は、HEp-2細胞をR
SV-A2ウイルスで感染させたインビトロ中和アッセイにおいて、パリビズマブのIC50値よ
りも、好ましくは少なくとも120倍低い、より好ましくは少なくとも130倍低いIC50値を有
する。前記抗体又は機能的等価物は、好ましくは、約1.15ng/mlのIC50値を有する。それ
ゆえ、少なくとも1つの利用可能なRSV特異抗体と組み合わせて本発明によるRSV特異抗体
又はその機能的等価物を用いて、RSV関連障害のより有効な治療及び／又は予防が達成さ
れる。
Accordingly, one embodiment provides an antibody or functional equivalent according to the invention having an IC 50 value of less than 1.25 ng / ml in an in vitro neutralization assay in which HEp-2 cells are infected with RSV-A2 virus. Said antibody or functional equivalent is preferably less than 1.2 ng / ml, preferably 0.5 ng / ml to 1.
It has an IC 50 value of 2 ng / ml. In addition, the antibodies or functional equivalents according to the invention inhibit HEp-2 cells
In SV-A2 virus in vitro neutralization assay infected with, than an IC 50 value of palivizumab, preferably at least 120 fold lower, more preferably at least 130-fold lower an IC 50 value. Said antibody or functional equivalent preferably has an IC 50 value of about 1.15 ng / ml. Therefore, more effective treatment and / or prevention of RSV-related disorders is achieved using the RSV-specific antibody or functional equivalent thereof according to the present invention in combination with at least one available RSV-specific antibody.
抗体の機能的等価物は、本明細書において、抗体の機能的部分、誘導体又は類似体と定
義される。抗体の機能的等価物は、好ましくは、抗体の少なくとも1つのCDR配列を含む人
工結合合成物である。
A functional equivalent of an antibody is defined herein as a functional part, derivative or analog of the antibody. The functional equivalent of an antibody is preferably an artificially bound composition comprising at least one CDR sequence of the antibody.
抗体の機能的部分は、前記抗体と必ずしも量においてではなく種類において少なくとも
1つの同じ特性を有する部分として定義される。前記機能的部分は、必ずしも同程度とい
うわけではないが、前記抗体と同じ抗原に結合し得る。抗体の機能的部分は、好ましくは
、単ドメイン抗体、単鎖抗体、単鎖可変断片(scFv)、Fab断片、又はF(ab')2断片を含む。
The functional part of an antibody is at least in kind, not necessarily in quantity with the antibody.
Defined as a part with one and the same characteristics. The functional portion is not necessarily the same, but can bind to the same antigen as the antibody. The functional part of the antibody preferably comprises a single domain antibody, a single chain antibody, a single chain variable fragment (scFv), a Fab fragment, or an F (ab ′) 2 fragment.
抗体の機能的誘導体は、結果として生じる合成物の少なくとも1つの特性、好ましくは
抗原結合特性が必ずしも量においてではなく基本的に種類において同じあるように改変さ
れた抗体として定義される。誘導体は、様々な方法、例えば保存的アミノ酸置換で提供さ
れ、これによりアミノ酸残基は、全体的な機能にそれほど影響がないように、一般的に類
似する特性(サイズ、疎水性など)を有する別の残基により置換される。
A functional derivative of an antibody is defined as an antibody that has been modified so that at least one property of the resulting composition, preferably the antigen binding properties, is essentially the same in type, not necessarily in quantity. Derivatives are provided in a variety of ways, such as conservative amino acid substitutions, whereby amino acid residues generally have similar properties (size, hydrophobicity, etc.) so that overall function is not significantly affected. Is replaced by another residue.
当業者は、抗体の類似化合物をうまく生成することができる。これは、例えばペプチド
ライブラリ又はファージディスプレイライブラリを使用してなされる。当該類似体は、必
ずしも量においてではなく、種類において前記抗体と基本的に少なくとも1つの同じ特性
を有する。
One skilled in the art can successfully produce similar compounds of antibodies. This is done, for example, using a peptide library or a phage display library. The analogue has essentially at least one same property as the antibody in type, not necessarily in quantity.
本発明による抗体は、好ましくはヒト抗体である。ヒトにおける予防及び治療法のため
のヒト抗体の使用は、ヒト個人における非ヒト配列に対する免疫学的反応に起因する副作
用の可能性を減弱させる。別の実施態様において、本発明による抗体、機能的部分、誘導
体又は類似体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒトの超可変ドメインをヒト抗体
に組み込むことにより作成され、したがって、免疫原性特性は、完全非ヒト抗体に比較し
て、減弱する。他の好ましい実施態様において、本発明による抗体又は機能的部分、誘導
体又は類似体は、キメラ抗体である。それゆえ、関心対象の配列、例えば関心対象の結合
部位は、本発明による抗体又は機能的等価物に含ませることができる。
The antibody according to the present invention is preferably a human antibody. The use of human antibodies for prophylaxis and therapy in humans reduces the potential for side effects due to immunological responses to non-human sequences in human individuals. In another embodiment, the antibody, functional moiety, derivative or analog according to the invention is a humanized antibody. Humanized antibodies are made by incorporating non-human hypervariable domains into a human antibody, and thus the immunogenic properties are attenuated compared to fully non-human antibodies. In another preferred embodiment, the antibody or functional part, derivative or analogue according to the invention is a chimeric antibody. Thus, the sequence of interest, eg, the binding site of interest, can be included in an antibody or functional equivalent according to the present invention.
当業者に周知のように、抗体の重鎖は、免疫グロブリン分子を形成している2つのタイ
プ鎖の大きい方である。重鎖は、定常ドメイン及び可変ドメインを含み、当該可変ドメイ
ンが抗原結合に関与する。抗体の軽鎖は、免疫グロブリン分子を形成している2つのタイ
プの鎖の小さい方である。軽鎖は、定常ドメイン及び可変ドメインを含む。該可変ドメイ
ンは、重鎖の可変ドメインと共に、抗原結合に関与する。
As is well known to those skilled in the art, the heavy chain of an antibody is the larger of the two type chains that form an immunoglobulin molecule. The heavy chain comprises a constant domain and a variable domain, which variable domain is involved in antigen binding. The light chain of an antibody is the smaller of the two types of chains that form an immunoglobulin molecule. The light chain includes a constant domain and a variable domain. The variable domain, together with the variable domain of the heavy chain, is involved in antigen binding.
相補性決定領域(CDR)は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに存在する超可変領
域である。重鎖のCDR及び抗体の連結軽鎖は共に、抗原結合部位を形成する。
The complementarity determining region (CDR) is a hypervariable region present in the heavy chain variable domain and the light chain variable domain. The CDRs of the heavy chain and the linking light chain of the antibody together form an antigen binding site.
本明細書により、本発明が、図2に示すCDR配列が所望の結合特性を提供することの知見
を提供することから、当業者は、少なくとも1つの改変されたCDR配列を含む異型をうまく
生成することができる。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。AM22に比較して少な
くとも1つの改変された特性を有する異型抗体又はその機能的等価物を生成するために、
図2に示す少なくとも1つのCDR配列を改変することも可能である。好ましくは、図2に示す
CDR配列に少なくとも70%同一である CDR配列を含む抗体又は機能的等価物が提供され、そ
の結果、AM22の好ましい結合特性が少なくとも部分的に維持され又は改良されさえもする
。図2に示すCDR配列は、好ましくは、結果として生じる抗体又は機能的等価物が、AM22に
比較して、少なくとも1つの改良された特性、例えば改良された安定性及び／又は結合親
和性を含むように、改変される。好ましくは、結合特異性は（必ずしも量においてではな
く、種類において)維持される。従って、図2に示すCDR配列に少なくとも70%同一であるア
ミノ酸配列を含む異型抗体又はその機能的等価物も本発明の範囲内である。当該技術分野
におけるアミノ酸配列を改変するための様々な方法が利用可能である。例えば、所望のCD
R配列を有する重鎖又は軽鎖配列は、人工的に合成される。好ましくは、CDR配列をコード
する核酸配列は、例えばランダム突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を使用して、
変異される。
By virtue of this specification, the present invention provides the knowledge that the CDR sequences shown in FIG. 2 provide the desired binding properties, so that those skilled in the art successfully generate variants containing at least one modified CDR sequence. can do. For example, conservative amino acid substitutions are applied. In order to generate a variant antibody or functional equivalent thereof having at least one modified property compared to AM22,
It is also possible to modify at least one CDR sequence shown in FIG. Preferably, as shown in FIG.
Antibodies or functional equivalents comprising a CDR sequence that is at least 70% identical to the CDR sequence are provided, so that the preferred binding properties of AM22 are at least partially maintained or even improved. The CDR sequence shown in FIG. 2 is preferably such that the resulting antibody or functional equivalent contains at least one improved property, such as improved stability and / or binding affinity compared to AM22. As modified. Preferably, the binding specificity is maintained (in species, not necessarily in amount). Therefore, a variant antibody comprising an amino acid sequence that is at least 70% identical to the CDR sequence shown in FIG. 2 or a functional equivalent thereof is also within the scope of the present invention. Various methods for altering amino acid sequences in the art are available. For example, the desired CD
A heavy or light chain sequence having an R sequence is artificially synthesized. Preferably, the nucleic acid sequence encoding the CDR sequence is used, for example using random mutagenesis or site-directed mutagenesis,
Mutated.
抗原と抗体の間の結合の親和性定数及び特異性の測定は、本発明の抗RSV抗体を使用す
る予防方法、治療方法、診断方法及び調査方法の有効性を決定することにおいて好ましい
。「結合親和性」とは一般に、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位とその結合パートナ
ー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の合計強度をいう。特に明記しない限り、
本明細書に使用されるように、「結合親和性」は、結合対(例えば、抗体及び抗原)のメン
バー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。親和性は通常、平衡解離定
数(Kd)により表すことができ、これは比率koff/konとして算出される。例えば、Chen, Y.
らの文献, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照されたい。親和性は、当該技術分野に
おいて公知の一般的方法、例えばBiaCore、若しくはIBIS Technologies BVのIBIS-iSPR装
置(Hengelo, the Netherlands) などの表面プラスモン共鳴(SPR)アッセイ、又はKinexaな
どの液相アッセイにより測定できる。
Measurement of the affinity constant and specificity of the binding between the antigen and the antibody is preferred in determining the effectiveness of the prophylactic, therapeutic, diagnostic and research methods using the anti-RSV antibodies of the present invention. “Binding affinity” generally refers to the total strength of a non-covalent interaction between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise stated
As used herein, “binding affinity” refers to the intrinsic binding affinity that reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). Affinity can usually be represented by the equilibrium dissociation constant (Kd), which is calculated as the ratio k off / k on. For example, Chen, Y.
Et al. (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. Affinity can be determined by conventional methods known in the art, for example, surface plasmon resonance (SPR) assays such as BiaCore or IBIS Technologies BV's IBIS-iSPR instrument (Hengelo, the Netherlands), or liquid phase assays such as Kinexa. Can be measured.
好ましい実施態様によると、本発明の抗RSV抗体は、RSV Fタンパク質上のエピトープに
結合親和性を有し、1×10-2M未満、1×10-3M、1×10-4M、1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M
、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M又は1
×10-15M未満の解離定数(Kd)を含む。一実施態様において、抗RSV抗体は、10-7M未満、5
×10-8M未満、10-8M未満、5×10-9M未満、10-9M未満、5×10-10M未満、10-10M未満、5×1
0 -11 M未満、10 -11 M未満、5×10-12M未満、10-12M未満、5×10-13M未満、10-13M未満
、5×10-14M未満、10-14M未満、5×10-15M未満、又は10-15 M未満のKdを有する。
According to a preferred embodiment, the anti-RSV antibody of the present invention has binding affinity for an epitope on RSV F protein and is less than 1 × 10 −2 M, 1 × 10 −3 M, 1 × 10 −4 M, 1 × 10 -5 M, 1 × 10 -6 M, 1 × 10 -7 M
1 × 10 −8 M, 1 × 10 −9 M, 1 × 10 −10 M, 1 × 10 −11 M, 1 × 10 −12 M, 1 × 10 −13 M, 1 × 10 −14 M 1
Includes dissociation constants (K d ) less than × 10 -15 M. In one embodiment, the anti-RSV antibody is less than 10 −7 M, 5
× 10 -8 M, 10 -8 M, 5 × 10 -9 M, 10 -9 M, 5 × 10 -10 M, 10 -10 M, 5 × 1
0 -11 less M, less than 10 -11 M, less than 5 × 10 -12 M, less than 10 -12 M, less than 5 × 10 -13 M, less than 10 -13 M, 5 × 10 -14 less than M, 10 - Has a K d of less than 14 M, less than 5 × 10 −15 M, or less than 10 −15 M.
本発明は、以下の構成を含む、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分
、誘導体及び／又は類似体を更に提供する：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
好ましくは、本発明による抗体又は機能的等価物は、図2に示すCDR配列のうちの少なく
とも1つに少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%
、より好ましくは少なくとも90%同一であるCDR配列を含む。最も好ましくは、本発明によ
る抗体又は機能的等価物は、図2に示すCDR配列のうちの少なくとも1つに少なくとも95%同
一であるCDR配列を含む。上記の特に好ましい抗体AM22には、図2に示すCDR配列からなるC
DR配列を含む。それゆえ、本発明による特に好ましい実施態様は、RSVに特異的に結合で
き、かつ以下の構成を含む、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的等価物を
提供する：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
More preferably comprises CDR sequences that are at least 90% identical. Most preferably, an antibody or functional equivalent according to the present invention comprises a CDR sequence that is at least 95% identical to at least one of the CDR sequences shown in FIG. The particularly preferred antibody AM22 is a C comprising the CDR sequence shown in FIG.
Contains the DR sequence. Therefore, a particularly preferred embodiment according to the present invention provides an isolated synthetic or recombinant antibody or functional equivalent thereof that can specifically bind to RSV and comprises the following configuration:
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
一実施態様において、図2に示す重鎖CDR1及びCDR2配列及び軽鎖CDR1及びCDR2配列、又
は該配列に少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、
より好ましくは少なくとも85%同一である配列を含む抗体又は機能的等価物が提供される
。従って、配列
換え抗体又はその機能的部分、その誘導体及び／又は類似体が更に提供される。前記抗体
又は機能的等価物は、好ましくは、上記重鎖CDR配列及び軽鎖CDR配列に少なくとも75%、
より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくと
も90%、最も好ましくは少なくとも95%同一であるCDR配列を含む。好ましくは、前記抗体
又は機能的等価物は、配列
3配列並びに上記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む抗体又は機能的等価物も提供される
。
In one embodiment, the heavy chain CDR1 and CDR2 and light chain CDR1 and CDR2 sequences shown in FIG. 2, or at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80% in the sequences,
More preferably, antibodies or functional equivalents comprising sequences that are at least 85% identical are provided. Therefore, the array
More preferably it comprises CDR sequences that are at least 80% identical, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% identical. Preferably said antibody or functional equivalent is a sequence
Also provided are antibodies or functional equivalents comprising the three sequences and the light chain CDR1, CDR2 and CDR3 sequences described above.
任意に、前記少なくとも1つのヒトCDR配列は、好ましくは結合効率又は安定性を改良す
るために、最適化される。これは例えば、突然変異誘発実験を行い、その後好ましくは結
果として生じる合成物の安定性及び／又は結合効率を試験し、改良された抗体又は機能的
等価物を選択することにより最適化される。
Optionally, the at least one human CDR sequence is preferably optimized to improve binding efficiency or stability. This is optimized, for example, by performing mutagenesis experiments and then preferably testing the stability and / or binding efficiency of the resulting composition and selecting improved antibodies or functional equivalents.
CDR配列を最適化する他に、フレームワーク領域のうちの少なくとも1つにおける少なく
とも1つの配列を最適化することは、しばしば有利である。これは、好ましくは結合効率
又は安定性を改良するために最適化される。フレームワーク配列は、例えば、当該フレー
ムワーク配列をコードする核酸分子を変異させ好ましくは結果として生じる抗体（又はそ
の機能的部分）の特徴を試験したことにより最適化される。それゆえ、改良された抗体又
は機能的部分を得ることが可能である。従って、図2に示す重鎖配列に少なくとも70%の配
列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む単離された合成若しくは組換え抗体又はその機
能的部分、誘導体及び／又は類似体も提供される。当該重鎖配列は、抗体AM22により証明
されたように、所望の結合特性を提供する。更に、図2に図示する軽鎖配列に少なくとも7
0%の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列も、抗体AM22により証明されたように、所望の
結合特性を提供する。従って、配列
若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体が更に提供される。
In addition to optimizing CDR sequences, it is often advantageous to optimize at least one sequence in at least one of the framework regions. This is preferably optimized to improve coupling efficiency or stability. A framework sequence is optimized, for example, by mutating a nucleic acid molecule encoding the framework sequence and preferably testing the characteristics of the resulting antibody (or functional portion thereof). It is therefore possible to obtain improved antibodies or functional parts. Accordingly, also provided is an isolated synthetic or recombinant antibody or functional portion, derivative and / or analog thereof comprising a heavy chain amino acid sequence having at least 70% sequence identity to the heavy chain sequence shown in FIG. . The heavy chain sequence provides the desired binding properties as demonstrated by antibody AM22. In addition, the light chain sequence depicted in FIG.
A light chain amino acid sequence with 0% sequence identity also provides the desired binding properties, as demonstrated by antibody AM22. Therefore, the array
本発明による単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又
は類似体は、好ましくは、図2に示す重鎖配列及び／又は軽鎖配列に少なくとも75%、より
好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90
%、最も好ましくは少なくとも95%同一である重鎖配列及び／又は軽鎖配列を含む。相同性
が高いほど、前記抗体又は機能的等価物は、より密接に抗体AM22に似る。本発明による単
離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体は、好ま
しくは、AM22の重鎖及び軽鎖に似ている重鎖並びに軽鎖を含む。従って、図2に示す重鎖
配列及び軽鎖配列にそれぞれ少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好まし
くは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一
である重鎖配列及び軽鎖配列を含む、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的
部分、誘導体及び／又は類似体が更に提供される。一実施態様において、図2に示す重鎖
配列及び図2に示す軽鎖配列を有する抗体又は機能的等価物が提供される。
Isolated synthetic or recombinant antibodies or functional parts, derivatives and / or analogues thereof according to the invention are preferably at least 75%, more preferably at least 75% heavy chain and / or light chain sequences as shown in FIG. At least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%
%, Most preferably at least 95% identical heavy and / or light chain sequences. The higher the homology, the more closely the antibody or functional equivalent resembles antibody AM22. Isolated synthetic or recombinant antibodies according to the invention or functional parts, derivatives and / or analogues thereof preferably comprise heavy and light chains resembling the heavy and light chains of AM22. Accordingly, the heavy and light chain sequences shown in FIG. 2 are each at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% heavy. Further provided is an isolated synthetic or recombinant antibody or functional portion, derivative and / or analogue thereof comprising a chain sequence and a light chain sequence. In one embodiment, an antibody or functional equivalent having the heavy chain sequence shown in FIG. 2 and the light chain sequence shown in FIG. 2 is provided.
一実施態様は、図2に示す重鎖配列からなる重鎖配列を含む、及び／又は図2に示す軽鎖
配列からなる軽鎖配列を含む、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、
誘導体及び／又は類似体を提供する。別法として、当業者に周知であるように、短縮され
ているが、関心対象の結合特性を維持する重鎖又は軽鎖配列を生成することができる。好
ましくは、原型の重鎖又は軽鎖に比較して、より短い定常領域を有する当該短縮された重
鎖又は軽鎖が産生される。好ましくは、可変ドメインは維持される。例えば、図2に示す
重鎖配列又は軽鎖配列に基づき、Fab断片又はF(ab')2断片又は単ドメイン抗体又は単鎖抗
体又はナノボディ又はユニボディ又はscFv断片が産生される。従って、図2に示す配列の
少なくとも機能的な部分を含む抗体の機能的部分も提供される。前記機能的部分は、少な
くとも20アミノ酸長を有し、かつ、図2に示す重鎖CDR1配列に少なくとも70%同一である配
列、及び図2に示す重鎖CDR2配列に少なくとも70%同一である配列、及び図2に示す重鎖CDR
3配列に少なくとも70%同一である配列、及び図2に示す軽鎖CDR1配列に少なくとも70%同一
である配列、及び図2に示す軽鎖CDR2配列に少なくとも70%同一である配列、及び図2に示
す軽鎖CDR3配列に少なくとも70%同一である配列からなる群から選択される少なくとも1つ
の配列を含む。
One embodiment comprises an isolated synthetic or recombinant antibody or function thereof comprising a heavy chain sequence consisting of the heavy chain sequence shown in FIG. 2 and / or comprising a light chain sequence consisting of the light chain sequence shown in FIG. Target part,
Derivatives and / or analogs are provided. Alternatively, heavy or light chain sequences can be generated that are shortened but maintain the binding properties of interest, as is well known to those skilled in the art. Preferably, the shortened heavy or light chain is produced with a shorter constant region compared to the original heavy or light chain. Preferably, the variable domain is maintained. For example, Fab fragments or F (ab ′) 2 fragments or single domain antibodies or single chain antibodies or Nanobodies or Unibodies or scFv fragments are produced based on the heavy chain sequence or light chain sequence shown in FIG. Accordingly, a functional portion of an antibody comprising at least a functional portion of the sequence shown in FIG. 2 is also provided. The functional portion has a length of at least 20 amino acids and is at least 70% identical to the heavy chain CDR1 sequence shown in FIG. 2, and a sequence that is at least 70% identical to the heavy chain CDR2 sequence shown in FIG. And the heavy chain CDR shown in FIG.
A sequence that is at least 70% identical to the three sequences, and a sequence that is at least 70% identical to the light chain CDR1 sequence shown in FIG. 2, and a sequence that is at least 70% identical to the light chain CDR2 sequence shown in FIG. 2, and FIG. At least one sequence selected from the group consisting of sequences that are at least 70% identical to the light chain CDR3 sequence shown in FIG.
先に記載したように、本発明による抗体及び機能的等価物は、RSV Fタンパク質三量体
の固有エピトープを認識する。それゆえ、このエピトープを特異的に認識する抗体及び機
能的等価物が提供される。前記固有エピトープを特異的に認識する抗体又はその機能的等
価物は、好ましくは、既に公知であるRSV特異抗体、例えばパリビズマブ、D25、AM14、AM
16及びAM23と組み合わせる。前記固有エピトープを特異的に認識する本発明による抗体又
は機能的等価物を公知のRSV特異抗体と組み合わせることにより、RSVの2以上の異なるエ
ピトープは、同じ療法の間、認識される。それゆえ、RSVに応答してのより強い免疫原性
反応、及び／又は RSVに対するより高い抗体特異性は、RSVに応答してのより強い免疫原
性反応及びRSVに対するより高い特異性で達成され、当該組合せは、RSV関連障害のより有
効な治療及び／又は予防を結果的に生じるであろう。
As described above, the antibodies and functional equivalents according to the present invention recognize the unique epitope of the RSV F protein trimer. Therefore, antibodies and functional equivalents that specifically recognize this epitope are provided. An antibody that specifically recognizes the unique epitope or a functional equivalent thereof is preferably an RSV-specific antibody that is already known, such as palivizumab, D25, AM14, AM
Combine with 16 and AM23. By combining an antibody or functional equivalent according to the invention that specifically recognizes the unique epitope with a known RSV-specific antibody, two or more different epitopes of RSV are recognized during the same therapy. Therefore, a stronger immunogenic response in response to RSV and / or higher antibody specificity to RSV is achieved with a stronger immunogenic response in response to RSV and higher specificity to RSV. The combination will result in a more effective treatment and / or prevention of RSV-related disorders.
従って、本発明は、以下の構成を含む抗体により認識されるエピトープに特異的に結合
することができる、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び
／又は類似体を提供する：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
特に好ましい実施態様において、本発明は、以下の構成を含むAM22抗体により認識され
るエピトープに特異的に結合することができる、単離された合成若しくは組換え抗体又は
その機能的部分、誘導体及び／又は類似体を提供する：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
本発明のさらなる実施態様は、エフェクター機能を改変する特定の抗体定常領域(Fc)の
修飾を意図する。例えば、Fc領域を含むタンパク質の血清半減期は、FcRnのためのFc領域
の結合親和性を増加させることにより、増加される。本明細書で使用される用語「抗体半
減期」は、その投与後における抗体分子の平均生存時間の測定値である、抗体の薬物動態
学的特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清(すなわち、循環半減期) において、
又は他の組織において測定される、患者の体(若しくは他の哺乳類)又はその特定の区画か
らの免疫グロブリンの既知量の50パーセントを除去するのに必要とされる時間を表現し得
る。半減期は、1つの免疫グロブリン又は免疫グロブリンクラスにより変化し得る。一般
に、抗体半減期の増加は、投与される抗体の循環における平均滞留時間(MRT)の増加を結
果的に生じる。
A further embodiment of the invention contemplates modification of specific antibody constant regions (Fc) that alter effector function. For example, the serum half-life of a protein containing an Fc region is increased by increasing the binding affinity of the Fc region for FcRn. The term “antibody half-life” as used herein refers to the pharmacokinetic properties of an antibody, which is a measure of the average survival time of an antibody molecule after its administration. Antibody half-life is, for example, in serum (i.e. circulating half-life)
Alternatively, it may represent the time required to remove 50 percent of the known amount of immunoglobulin from the patient's body (or other mammal) or its particular compartment, as measured in other tissues. Half-life can vary with one immunoglobulin or immunoglobulin class. In general, an increase in antibody half-life results in an increase in mean residence time (MRT) in the circulation of the administered antibody.
半減期の増加は、患者に与えられる薬の量を減少させ、並びに投与頻度を減少させる。
本発明による抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第5,739,277号に
説明されるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体(特に抗体断片)に組み込むこ
とができる。本明細書に使用するように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは
、IgG分子のインビボ血清半減期を増加させる役割を果たす、IgG分子(例えば、IgG1、IgG
2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープをいう。あるいは、増加した半減期を有する本発
明の抗体は、FcとFcRn受容体との間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸
残基を修飾することにより、生成できる(例えば、米国特許6,821,505及び7,083,784を参
照されたい)。加えて、本発明の抗体の半減期は、当該技術分野において広く利用される
技術により、PEG又はアルブミンに抱合することにより、増加し得る。いくつかの実施態
様において本発明のFc異型領域を含む抗体は、天然のFc領域を含む抗体に比較して、約5%
、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約65%、
約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約125%、約150%、又はこれらを上回って
増加した半減期を有する。いくつかの実施態様において、Fc異型領域を含む抗体は、天然
のFc領域を含む抗体に比較して、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍
、又はこれらを上回る、又は2倍〜10倍、又は5倍〜25倍、又は15倍〜50倍の増加した半減
期を有する。従って、本発明は、サルベージ受容体結合エピトープ、及び／又はFcとFcRN
受容体との間の相互作用に関与するものとして同定されるアミノ酸残基の修飾、及び／又
は非天然存在型アミノ酸残基を含む、本発明による抗体、機能的部分、誘導体又は類似体
を提供する。別の好ましい実施態様は、 PEG又はアルブミンに抱合された本発明による抗
体又は機能的等価物を提供する。
Increased half-life reduces the amount of drug given to the patient as well as reduces the frequency of administration.
In order to increase the serum half-life of an antibody according to the invention, a salvage receptor binding epitope can be incorporated into the antibody (especially an antibody fragment) as described, for example, in US Pat. No. 5,739,277. As used herein, the term “salvage receptor binding epitope” refers to an IgG molecule (eg, IgG1, IgG, which serves to increase the in vivo serum half-life of an IgG molecule).
2, the IgG3 or IgG4) Fc region epitope. Alternatively, antibodies of the invention with increased half-life can be generated by modifying amino acid residues identified as being involved in the interaction between Fc and FcRn receptors (see, eg, US Pat. No. 6,821,505). And 7,083,784). In addition, the half-life of the antibodies of the present invention can be increased by conjugation to PEG or albumin by techniques widely used in the art. In some embodiments, an antibody comprising an Fc variant region of the invention has about 5% of an antibody as compared to an antibody comprising a native Fc region.
About 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 60%, about 65%,
It has an increased half-life of about 70%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 100%, about 125%, about 150%, or more. In some embodiments, the antibody comprising an Fc variant region is about 2-fold, about 3-fold, about 4-fold, about 5-fold, about 10-fold, about 20-fold compared to an antibody comprising a native Fc region. Have an increased half-life of about 50 times, or more, or 2 to 10 times, or 5 to 25 times, or 15 to 50 times. Accordingly, the present invention provides a salvage receptor binding epitope and / or Fc and FcRN.
Providing an antibody, functional moiety, derivative or analog according to the present invention comprising a modification of an amino acid residue identified as being involved in an interaction with a receptor and / or a non-naturally occurring amino acid residue To do. Another preferred embodiment provides an antibody or functional equivalent according to the invention conjugated to PEG or albumin.
一実施態様において、本発明は、本発明によるFc異型であって、該Fc領域が、Kabatら
の文献（J Immunol. 1991; 147(5):1709-19）に説明されるEU指数による番号234、235、2
36、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、2
63、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、3
13、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、3
73、378、392、416、419、421、440及び443からなる群から選択される1以上の位置での修
飾(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸削除)を含む、前記Fc異型を提供する
。任意に、Fc領域は、当業者に公知の付加的な及び／又は別の位置の非天然存在型アミノ
酸残基を含む(例えば、米国特許5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 7,083,784; 7,317,0
91; 7,217,797; 7,276,585; 7,355,008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2
007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; WO 94/29351; 及びWO 99/58572を参照され
たい)。
In one embodiment, the invention is an Fc variant according to the invention, wherein the Fc region is numbered according to the EU index as described in Kabat et al. (J Immunol. 1991; 147 (5): 1709-19). 234, 235, 2
36,237,238,239,240,241,243,244,245,247,251,252,254,255,256,262,2
63, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 3
13,316,325,326,327,328,329,330,331,332,333,334,339,341,343,370,3
Providing said Fc variant comprising a modification (eg, amino acid substitution, amino acid insertion, amino acid deletion) at one or more positions selected from the group consisting of 73, 378, 392, 416, 419, 421, 440 and 443 . Optionally, the Fc region includes additional and / or alternative positions of non-naturally occurring amino acid residues known to those skilled in the art (e.g., U.S. Patents 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 7,083,784; 7,317,0
91; 7,217,797; 7,276,585; 7,355,008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2
007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; WO 94/29351; and WO 99/58572).
特定の実施態様において、本発明は、本発明によるFc異型抗体であって、該Fc領域が25
2、254及び256からなる群から選択される1以上の位置で少なくとも1つの非天然存在型ア
ミノ酸を含む、前記Fc異型抗体を提供する。一実施態様において、非天然存在型アミノ酸
は、252Y、254T及び256Eからなる群から選択される。
In a particular embodiment, the invention is an Fc variant antibody according to the invention, wherein the Fc region is 25
The Fc variant antibody comprising at least one non-naturally occurring amino acid at one or more positions selected from the group consisting of 2,254 and 256 is provided. In one embodiment, the non-naturally occurring amino acid is selected from the group consisting of 252Y, 254T and 256E.
本発明は、従来技術の抗体に比較して改良された特性を有するRSV特異抗体及びその機
能的等価物を提供する。発明者は、現在知られているうち最も低いIC50値を有するRSV特
異抗体を生成することに成功した。当該抗体は、RSVに特異的な高い若しくは強い親和性
を有し、従って、特にRSV感染及び／又はRSV感染の副作用を妨げ（conteract）、及び／
又は少なくとも部分的に阻止することに適する。従って、一実施態様は、実施例(図1を参
照)に記載されているインビトロ中和アッセイにおいて決定されるように、1.25ng/ml未満
、好ましくは1.2ng/ml未満、より好ましくは1.19ng/ml未満、より好ましくは1.18ng/ml未
満、最も好ましくは1.1ng/ml〜1.17のIC50値を有する抗体を提供する。
The present invention provides RSV-specific antibodies and functional equivalents thereof that have improved properties compared to prior art antibodies. The inventor has succeeded in generating RSV-specific antibodies with the lowest IC 50 values currently known. The antibody has a high or strong affinity specific for RSV, and thus specifically interferes with the side effects of RSV infection and / or RSV infection, and / or
Or it is suitable for at least partially blocking. Thus, one embodiment is less than 1.25 ng / ml, preferably less than 1.2 ng / ml, more preferably 1.19 ng, as determined in the in vitro neutralization assay described in the Examples (see FIG. 1). Antibodies with IC 50 values of less than / ml, more preferably less than 1.18 ng / ml, most preferably 1.1 ng / ml to 1.17 are provided.
本発明は、少なくとも本発明による抗体又は機能的等価物の抗原結合性部分をコードす
る少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチド、より好ましくは少
なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチドの長さを有する、単
離された合成若しくは組換え核酸配列又はその機能的等価物を更に提供する。当該核酸は
、例えば、本発明による抗体を産生することができる B細胞から単離される。好ましい実
施態様は、図2に示す少なくとも15ヌクレオチドの核酸配列に少なくとも70%の配列同一性
を有する配列を含む核酸配列を提供する。本発明による核酸配列は、好ましくは、図2に
示す核酸配列の少なくとも15ヌクレオチドに少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、
より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくと
も95%の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、図2に示す前記核酸配列は、少なく
とも1つのCDRコード配列を含む。
The present invention has a length of at least 15 nucleotides, preferably at least 30 nucleotides, more preferably at least 50 nucleotides, more preferably at least 75 nucleotides encoding at least the antigen-binding portion of an antibody or functional equivalent according to the present invention. Further provided are isolated synthetic or recombinant nucleic acid sequences or functional equivalents thereof. The nucleic acid is isolated, for example, from B cells capable of producing an antibody according to the invention. A preferred embodiment provides a nucleic acid sequence comprising a sequence having at least 70% sequence identity to the nucleic acid sequence of at least 15 nucleotides shown in FIG. The nucleic acid sequence according to the invention is preferably at least 75%, preferably at least 80%, at least 15 nucleotides of the nucleic acid sequence shown in FIG.
More preferably it comprises sequences having at least 85%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% sequence identity. Preferably, the nucleic acid sequence shown in FIG. 2 comprises at least one CDR coding sequence.
好ましい一実施態様は、本発明による抗体又は機能的等価物の少なくとも1つのCDR配列
をコードする少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する単離された合成若しくは組換え核
酸配列又はその機能的等価物を提供する。前記核酸配列は、好ましくは、抗体AM22のCDR
領域に少なくとも70%の配列同一性を有する少なくとも1つのCDR配列をコードする。AM22
CDR領域をコードする核酸配列は、図2に示されている。従って、以下の配列からなる群か
ら選択される配列に少なくとも70%の配列同一性を有する配列を含む、単離された合成若
しくは組換え核酸配列又はその機能的等価物が更に提供される
It encodes at least one CDR sequence with at least 70% sequence identity in the region. AM22
The nucleic acid sequence encoding the CDR region is shown in FIG. Accordingly, there is further provided an isolated synthetic or recombinant nucleic acid sequence or functional equivalent thereof comprising a sequence having at least 70% sequence identity to a sequence selected from the group consisting of:
前記核酸配列又は機能的等価物は、好ましくは、上記核酸配列のいずれかに少なくとも
75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少
なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む。更に、図2に示すヌクレオチド配列の少な
くとも一部に少なくとも70%の配列同一性を有し、該一部が少なくとも15ヌクレオチドを
有し、かつ図2に示すCDR領域の少なくとも1つをコードする配列を含む、核酸配列又はそ
の機能的等価物が提供される。
Said nucleic acid sequence or functional equivalent is preferably at least one of the above nucleic acid sequences.
75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% of sequences having sequence identity. Further, a sequence having at least 70% sequence identity to at least a part of the nucleotide sequence shown in FIG. 2, the part having at least 15 nucleotides, and encoding at least one of the CDR regions shown in FIG. A nucleic acid sequence or functional equivalent thereof is provided.
本発明による核酸配列又はその機能的等価物は、好ましくは、 AM22 CDR領域、AM22重
鎖及び／又はAM22軽鎖に少なくとも70%の配列同一性を有する領域をコードする。それゆ
え、一実施態様は、単離された合成若しくは組換え核酸配列又はその機能的等価物であっ
て：配列
された合成若しくは組換え核酸配列又はその機能的等価物を提供する。
A nucleic acid sequence according to the invention or a functional equivalent thereof preferably encodes a region having at least 70% sequence identity to the AM22 CDR region, AM22 heavy chain and / or AM22 light chain. Thus, one embodiment is an isolated synthetic or recombinant nucleic acid sequence or functional equivalent thereof:
先に記載したように、本発明による抗体又は機能的等価物は、三量体RSV Fタンパク質
に存在する固有エピトープを認識することができる。それゆえ、本発明による核酸配列は
、好ましくは、この固有エピトープに特異的に結合することができるCDR配列をコードす
る。従って、本発明は、以下の構成を含む抗体により認識されるエピトープに特異的に結
合することができる少なくとも1つのCDR配列をコードする、単離された合成若しくは組換
え核酸配列又はその機能的等価物も提供される：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
好ましくは、前記核酸配列は、本発明による全抗体又は機能的等価物(例えば重鎖又は
軽鎖を含む)をコードする。従って、以下の構成を含む抗体により認識されるエピトープ
に特異的に結合することができる抗体又はその機能的等価物をコードする、単離された合
成若しくは組換え核酸配列又はその機能的等価物が更に提供される：
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・配列
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
・ Array
本発明の一実施態様において、核酸配列又は機能的等価物は、以下の構成を含むAM22抗
体により認識されるエピトープに特異的に結合することができ、抗体又はその機能的部分
、誘導体及び／又は類似体をコードする：
配列
Array
本発明による核酸配列又は機能的等価物は、好ましくは、1×10-2M未満、1×10-3M、1
×10-4M、1×10-5M、1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M
、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M又は1×10-15M未満の解離定数(Kd)を有する抗体又は
その機能的等価物をコードする。
The nucleic acid sequence or functional equivalent according to the invention is preferably less than 1 × 10 −2 M, 1 × 10 −3 M, 1
× 10 -4 M, 1 × 10 -5 M, 1 × 10 -6 M, 1 × 10 -7 M, 1 × 10 -8 M, 1 × 10 -9 M, 1 × 10 -10 M, 1 × 10 -11 M
An antibody having a dissociation constant (K d ) of less than 1 × 10 −12 M, 1 × 10 −13 M, 1 × 10 −14 M or 1 × 10 −15 M, or a functional equivalent thereof.
本発明による核酸配列を含むベクターが更に提供される。当該ベクターは、様々な用途
に適する。例えば、治療的に有益な核酸配列を含む本発明のベクターは、予防若しくは治
療用途に適する。その必要の個人への当該ベクターの投与は、前記予防若しくは治療的な
核酸配列の発現をインビボで生じる。前記ベクターは、例えば本発明の抗体又は機能的等
価物の(商業的な)産生のために、関心対象の核酸配列のインビトロ発現を含む用途におい
ても使用できる。本発明による核酸配列を有するベクターを構築するための方法は当該技
術分野において周知である。本発明のベクターを生成するために適するベクターの非限定
的な例は、レトロウイルス及びレンチウイルスベクターである。
Further provided are vectors comprising a nucleic acid sequence according to the present invention. The vector is suitable for various uses. For example, a vector of the invention comprising a therapeutically beneficial nucleic acid sequence is suitable for prophylactic or therapeutic applications. Administration of the vector to an individual in need thereof results in expression of the prophylactic or therapeutic nucleic acid sequence in vivo. Said vectors can also be used in applications involving in vitro expression of a nucleic acid sequence of interest, for example for (commercial) production of the antibodies or functional equivalents of the invention. Methods for constructing vectors having nucleic acid sequences according to the present invention are well known in the art. Non-limiting examples of vectors suitable for generating the vectors of the present invention are retroviral and lentiviral vectors.
用語「%配列同一性」とは、本明細書において、2つの配列を整列配置してギャップを導
入した後、参照配列の残基と同一である（必要であれば最大の同一性の割合を達成する）
候補アミノ酸配列又は候補核酸配列における残基の割合として定義される。整列ための方
法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。
The term “% sequence identity” as used herein is identical to a residue of a reference sequence after aligning two sequences and introducing a gap (if necessary, the maximum percent identity). Achieve)
Defined as the percentage of residues in a candidate amino acid sequence or candidate nucleic acid sequence. Methods and computer programs for alignment are well known in the art.
本明細書に使用するように、本発明の核酸分子又は核酸配列は、好ましくは、ヌクレオ
チド、より好ましくはDNA及び／又はRNAの鎖を含む。他の一実施態様において、本発明の
核酸分子又は核酸配列は、例えば、DNA/RNAヘリックス、ペプチド核酸(PNA)、係止核酸(l
ocked nucleic acid ; LNA)及び／又はリボザイムなどの他の種類の核酸構造を含む。こ
のような他の核酸構造は、核酸配列の機能的等価物という。用語「核酸配列の機能的等価
物」は、天然ヌクレオチドと同じ機能を呈する、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド
及び／又は非ヌクレオチド構成要素（building block）を含む鎖も含む。
As used herein, the nucleic acid molecules or nucleic acid sequences of the invention preferably comprise nucleotides, more preferably DNA and / or RNA strands. In another embodiment, the nucleic acid molecule or nucleic acid sequence of the invention comprises, for example, a DNA / RNA helix, a peptide nucleic acid (PNA), a locking nucleic acid (1
ocked nucleic acid; LNA) and / or other types of nucleic acid structures such as ribozymes. Such other nucleic acid structures are referred to as functional equivalents of the nucleic acid sequence. The term “functional equivalent of a nucleic acid sequence” also includes chains comprising non-natural nucleotides, modified nucleotides and / or non-nucleotide building blocks that exhibit the same function as natural nucleotides.
本発明による核酸配列又はベクターは、RSVに特異的である抗体又は機能的等価物を生
成するために特に有用である。これは、例えば、当該核酸配列又はベクターを細胞に導入
することによりなされ、このようにして当該細胞の核酸翻訳機構はコードされた抗体又は
機能的等価物を生成する。一実施態様において、本発明による重鎖及び／又は軽鎖をコー
ドする核酸配列又はベクターは、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO(マ
ウス骨髄腫)又は293(T)細胞株などのいわゆる産生細胞で発現し、そのいくつかは、商業
的な抗体産生に適用される。前記産生細胞の増殖は、本発明による抗体又はその機能的等
価物を産生することができる産生細胞株を生じる。好ましくは、前記産生細胞株は、ヒト
における使用のための抗体を産生するのに適する。それゆえ、前記産生細胞株は、好まし
くは、病原性微生物などの病原性作用体を含まない。最も好ましくは、ヒト配列からなる
抗体又は機能的等価物は、本発明による少なくとも1つの核酸配列又はベクターを使用し
て生成される。
The nucleic acid sequences or vectors according to the invention are particularly useful for generating antibodies or functional equivalents that are specific for RSV. This is done, for example, by introducing the nucleic acid sequence or vector into the cell, and thus the nucleic acid translation machinery of the cell produces the encoded antibody or functional equivalent. In one embodiment, the nucleic acid sequence or vector encoding the heavy and / or light chain according to the present invention is a so-called production such as a Chinese hamster ovary (CHO) cell, NSO (mouse myeloma) or 293 (T) cell line. Expressed in cells, some of which apply to commercial antibody production. Proliferation of the production cell results in a production cell line capable of producing the antibody according to the invention or a functional equivalent thereof. Preferably, said production cell line is suitable for producing antibodies for use in humans. Therefore, the production cell line is preferably free of pathogenic agents such as pathogenic microorganisms. Most preferably, antibodies or functional equivalents consisting of human sequences are generated using at least one nucleic acid sequence or vector according to the invention.
従って、本発明による抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体を産生するこ
とができる単離された若しくは組換え抗体産生細胞、並びに本発明による単離された合成
若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体を産生する方法であっ
て、細胞に本発明による核酸配列又は機能的等価物又はベクターを提供する工程、及び前
記細胞に前記核酸配列又は機能的等価物又はベクターを翻訳させる工程を含み、これによ
り前記抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体を産生する前記方法も提供され
る。
Accordingly, an isolated or recombinant antibody-producing cell capable of producing an antibody according to the invention or a functional part, derivative and / or analogue thereof, and an isolated synthetic or recombinant antibody according to the invention or its A method for producing a functional part, derivative and / or analogue, comprising providing to a cell a nucleic acid sequence or functional equivalent or vector according to the present invention, and said cell to said nucleic acid sequence or functional equivalent or Also provided is the method comprising the step of translating a vector, thereby producing the antibody or a functional part, derivative and / or analogue thereof.
抗体産生細胞は、本明細書において、抗体又はその機能的等価物を産生及び／又は分泌
することができる細胞、及び／又は抗体又はその機能的等価物を産生及び／又は分泌する
ことができる細胞になることができる細胞として定義される。本発明による抗体産生細胞
は、好ましくは、商業的な抗体産生に適用される産生細胞である。好ましくは、前記産生
細胞は、ヒトにおける使用のための抗体を産生するのに適する。
An antibody-producing cell as used herein is a cell that can produce and / or secrete an antibody or functional equivalent thereof, and / or a cell that can produce and / or secrete an antibody or functional equivalent thereof Defined as a cell that can be. The antibody-producing cells according to the invention are preferably production cells that are applied for commercial antibody production. Preferably, said producer cell is suitable for producing an antibody for use in humans.
本発明による方法は、好ましくは、本発明による前記抗体又はその機能的部分、誘導体
及び／又は類似体を回収、精製、及び／又は単離する工程を更に含む。本発明により得ら
れた抗体又は機能的等価物は、好ましくは、ヒトの療法において、任意に精製、単離又は
加工工程を追加した後に、使用される。
The method according to the invention preferably further comprises the step of recovering, purifying and / or isolating said antibody according to the invention or a functional part, derivative and / or analogue thereof. The antibodies or functional equivalents obtained according to the invention are preferably used in human therapy, optionally after additional purification, isolation or processing steps.
本明細書において、ヒト抗体又は機能的等価物を含む本発明による改良された呼吸器合
胞体ウイルス特異抗体又は機能的等価物、及びそれをコードする核酸配列及びベクターが
提供されたことから、改良された予防的及び／又は治療的用途が利用可能なようになった
。RSVは、本発明による抗体又は機能的等価物により、妨げられる。従って、本発明によ
る抗体又は機能的等価物は、任意に公知の少なくとも1つの他のRSV特異抗体と組み合わせ
て、特に医薬又は予防薬としての使用に適する。好ましくは、ヒト個人が治療される場合
の有害な副作用の可能性を低減するために、ヒト配列からなる、又は多くても5%の非ヒト
配列を有する抗体又は機能的等価物が使用される。従って、医薬及び／又は予防薬として
の使用のための本発明による単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘
導体及び／若しくは類似体、又は核酸配列若しくはその機能的等価物、又はベクター、又
は細胞も本明細書に提供される。本発明による核酸又は機能的等価物又はベクターが投与
される場合、これはインサイチュウで本発明による抗体又は機能的等価物に翻訳される。
特に好ましい実施態様において、前記抗体は、抗体AM22又はその機能的等価物を含む。前
記医薬又は予防薬は、好ましくは、RSVによる感染を妨げ、又は少なくとも部分的に阻止
するために使用される。従って、RSVに関連する障害を少なくとも部分的に治療及び／又
は予防するための医薬及び／又は予防薬としての使用のための、本発明による単離された
合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体、又は核酸配
列若しくはその機能的等価物、又はベクター、又は細胞が更に提供される。当該技術分野
において公知である少なくとも1つの他のRSV特異的作用体(好ましくは抗体) と組み合わ
せてAM22を含む医薬は、当該組合せを用いることで、RSVに応答してのより強い免疫原性
反応が得られ、かつ／又は、RSVに対するより高い抗体特異性が達成されるので、特に有
利である。従って、医薬及び／又は予防薬としての使用のための、本発明による単離され
た合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体、又は核酸
配列若しくはその機能的等価物、又はベクター、又は細胞と、別の異なるRSV特異的作用
体、好ましくは抗体又はその機能的等価物との組合せが更に提供される。本発明による組
合せは、好ましくは、AM22と、パリビズマブ、D25、AM14、AM16及びAM23からなる群から
選択される抗体とを含む。先に記載したように、当該組合せは、RSV関連障害を少なくと
も部分的に治療又は予防するために特に適する。従って、RSVに関連する障害を少なくと
も部分的に治療及び／又は予防するための医薬及び／又は予防薬の製造のための本発明の
組合せの使用が更に提供される。RSV関連障害を少なくとも部分的に治療及び／又は予防
するための医薬及び／又は予防薬の製造のための、本発明による単離された合成若しくは
組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体、核酸配列若しくはその機能的
等価物、又はベクター、又は細胞の使用、並びにRSV関連障害を少なくとも部分的に治療
又は予防するための方法であって、その必要のある個人に、本発明による単離された合成
若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体の治療上有効量を与え
ることを含む前記方法も提供される。好ましい一実施態様において、少なくとも1つの他
のRSV特異的作用体、好ましくは別のRSV特異抗体との組合せが使用される。前記個人は、
好ましくは、治療前に、RSVより感染していることを診断されている。
Provided herein are improved respiratory syncytial virus specific antibodies or functional equivalents according to the present invention, including human antibodies or functional equivalents, and nucleic acid sequences and vectors encoding the same. Prophylactic and / or therapeutic uses made available. RSV is prevented by the antibody or functional equivalent according to the invention. Accordingly, an antibody or functional equivalent according to the present invention is particularly suitable for use as a pharmaceutical or prophylactic agent, optionally in combination with at least one other known RSV-specific antibody. Preferably, antibodies or functional equivalents consisting of human sequences or having at most 5% non-human sequences are used to reduce the potential for adverse side effects when human individuals are treated. . Accordingly, an isolated synthetic or recombinant antibody or functional part, derivative and / or analogue thereof, or nucleic acid sequence or functional equivalent thereof according to the present invention for use as a pharmaceutical and / or prophylactic agent, or Vectors, or cells are also provided herein. When a nucleic acid or functional equivalent or vector according to the invention is administered, it is translated in situ into an antibody or functional equivalent according to the invention.
In a particularly preferred embodiment, the antibody comprises antibody AM22 or a functional equivalent thereof. Said medicament or prophylactic agent is preferably used to prevent or at least partially block infection by RSV. Thus, an isolated synthetic or recombinant antibody according to the invention or a functional part thereof for use as a medicament and / or prophylactic for at least partially treating and / or preventing a disorder associated with RSV Further provided are derivatives and / or analogues, or nucleic acid sequences or functional equivalents thereof, vectors, or cells. A medicament comprising AM22 in combination with at least one other RSV-specific agent (preferably an antibody) known in the art can be used to produce a stronger immunogenic response in response to RSV. And / or higher antibody specificity for RSV is achieved, which is particularly advantageous. Accordingly, an isolated synthetic or recombinant antibody or functional part, derivative and / or analogue thereof, or nucleic acid sequence or functional equivalent thereof, according to the invention, for use as a medicament and / or prophylactic agent, Or a combination of a vector or cell and another different RSV-specific agent, preferably an antibody or functional equivalent thereof is further provided. The combination according to the invention preferably comprises AM22 and an antibody selected from the group consisting of palivizumab, D25, AM14, AM16 and AM23. As described above, the combination is particularly suitable for at least partially treating or preventing RSV-related disorders. Accordingly, there is further provided the use of a combination of the invention for the manufacture of a medicament and / or prophylactic agent for at least partially treating and / or preventing a disorder associated with RSV. An isolated synthetic or recombinant antibody or functional part, derivative and / or thereof according to the present invention for the manufacture of a medicament and / or prophylactic for at least partially treating and / or preventing an RSV-related disorder Use of analogs, nucleic acid sequences or functional equivalents thereof, or vectors, or cells, and methods for at least partially treating or preventing RSV-related disorders, to individuals in need thereof, according to the present invention Also provided is said method comprising providing a therapeutically effective amount of an isolated synthetic or recombinant antibody or functional part, derivative and / or analogue thereof. In a preferred embodiment, a combination with at least one other RSV-specific agent, preferably another RSV-specific antibody is used. The individual is
Preferably, the patient has been diagnosed as infected by RSV prior to treatment.
前記抗体は、好ましくは、抗体AM22又はその機能的部分を含む。前記少なくとも1つの
他のRSV特異抗体は、好ましくは、パリビズマブ、D25、AM14、AM16又はAM23である。最も
好ましくは、AM22及びD25の組合せが使用される。
Said antibody preferably comprises antibody AM22 or a functional part thereof. Said at least one other RSV-specific antibody is preferably palivizumab, D25, AM14, AM16 or AM23. Most preferably a combination of AM22 and D25 is used.
呼吸器合胞体ウイルスに関連する障害を少なくとも部分的に治療又は予防するために、
本発明による抗体又は機能的等価物は、好ましくは、感染が起こる前に個人に投与される
。あるいは、本発明による抗体又は機能的等価物は、個人が既に感染した場合に投与され
る。前記抗体又は機能的等価物は、好ましくは、例えば入院した個人及び／又は易感染性
免疫を有する個人などの合併症の危険が増加した個人に投与される。また、高齢者は、RS
V感染の危険が増加する。本発明による抗体又は機能的等価物は、好ましくは、1以上の注
入を介して投与される。本明細書において先に記載したように、予防的若しくは治療的用
途で使用される本発明による抗体又は機能的等価物の用量範囲は、厳密なプロトコル要件
が存在する臨床試験におけるクリニックでの増加用量調査に基づいて設計される。典型的
用量は、体重1kgにつき0.1〜10mgである。予防的若しくは治療的用途のために、本発明に
よる抗体又は機能的等価物は、典型的には、医薬として許容し得る担体、希釈剤及び／又
は賦形剤と組み合わせられる。適切な担体の例は、例えば、キーホールリンペットヘモシ
アニン(KLH)、血清アルブミン(例えばBSA又はRSA)、及びオボアルブミンを含む。1つの好
ましい実施態様において、前記適切な担体は、例えば生理食塩水などの溶液を含む。
To at least partially treat or prevent a disorder associated with respiratory syncytial virus,
The antibody or functional equivalent according to the invention is preferably administered to the individual before the infection occurs. Alternatively, an antibody or functional equivalent according to the invention is administered when an individual has already been infected. Said antibodies or functional equivalents are preferably administered to individuals who have an increased risk of complications, such as hospitalized individuals and / or individuals with compromised immunity. In addition, the elderly
V Increased risk of infection. The antibody or functional equivalent according to the invention is preferably administered via one or more infusions. As previously described herein, the dose range of an antibody or functional equivalent according to the present invention used in prophylactic or therapeutic applications is an increasing dose in the clinic in clinical trials where strict protocol requirements exist. Designed based on research. A typical dose is 0.1-10 mg / kg body weight. For prophylactic or therapeutic uses, the antibodies or functional equivalents according to the present invention are typically combined with pharmaceutically acceptable carriers, diluents and / or excipients. Examples of suitable carriers include, for example, keyhole limpet hemocyanin (KLH), serum albumin (eg BSA or RSA), and ovalbumin. In one preferred embodiment, the suitable carrier comprises a solution such as saline.
更に別の実施態様において、本発明による抗体又は機能的等価物をコードする核酸又は
ベクターが使用される。既に記載されているように、当該核酸又はベクターの投与に応じ
て、抗体又は機能的等価物は宿主の機構により産生される。産生された抗体又は機能的等
価物は、呼吸器合胞体ウイルス感染及び／又は当該感染の副作用を少なくとも部分的に阻
止してかつ／又は妨げることができる。従って、医薬及び／又は予防薬としての使用のた
めの本発明による核酸配列又は機能的等価物又はベクターも本明細書に提供される。更に
、RSV関連障害を少なくとも部分的に治療及び／又は予防するための医薬及び／又は予防
薬の製造のための、本発明による核酸配列又は機能的等価物又はベクターの使用が提供さ
れる。
In yet another embodiment, a nucleic acid or vector encoding an antibody or functional equivalent according to the invention is used. As already described, upon administration of the nucleic acid or vector, antibodies or functional equivalents are produced by the host mechanism. The antibody or functional equivalent produced can at least partially block and / or prevent respiratory syncytial virus infection and / or the side effects of the infection. Accordingly, also provided herein are nucleic acid sequences or functional equivalents or vectors according to the present invention for use as pharmaceuticals and / or prophylactics. Further provided is the use of a nucleic acid sequence or functional equivalent or vector according to the present invention for the manufacture of a medicament and / or prophylactic agent for at least partially treating and / or preventing an RSV-related disorder.
更に、本発明による単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、誘導体及
び／若しくは類似体、又は核酸配列若しくはその機能的等価物、又はベクター、又は細胞
、並びに医薬として許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
前記医薬組成物は、好ましくは、ヒトの使用に適する。1つの好ましい実施態様において
、前記抗体は、AM22である。更なる好ましい実施態様において、前記核酸は、AM22又はそ
の機能的等価物をコードする。一実施態様において、前記医薬組成物は、少なくとも1つ
の他のRSV特異抗体、好ましくはパリビズマブ、D25、AM14、AM16及び／又はAM23を更に含
む。
Furthermore, an isolated synthetic or recombinant antibody according to the invention or a functional part, derivative and / or analogue thereof, or a nucleic acid sequence or functional equivalent thereof, or a vector or cell and a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition comprising a diluent or excipient is provided.
Said pharmaceutical composition is preferably suitable for human use. In one preferred embodiment, the antibody is AM22. In a further preferred embodiment, the nucleic acid encodes AM22 or a functional equivalent thereof. In one embodiment, the pharmaceutical composition further comprises at least one other RSV specific antibody, preferably palivizumab, D25, AM14, AM16 and / or AM23.
本発明は、以下の実施例で更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を制限す
るものではないが、本発明を単に明確化するのに役立つ。
The invention is further illustrated in the following examples. These examples do not limit the scope of the invention, but merely serve to clarify the invention.
（参照文献）
Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM, Lowman HB
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Diehl SA, Schmidlin H, Nagasawa M, van Haren SD, Kwakkenbos MJ, Yasuda E, Beau
mont T, Scheeren FA, Spits Hの文献. 「BLIMP 1のSTAT3媒介型上方制御は、BCL6下方制
御と協調してヒトのプラズマ細胞分化を制御する」J Immunol.2008;180(7):4805-15.
Jaleco AC, Stegmann AP, Heemskerk MH, Couwenberg F, Bakker AQ, Weijer K, Spits
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スループヘリックス因子Id3により阻害される」Blood.1999;94(8):2637-46.
Kabat EA, Wu TTの文献.「異なる特異性の抗体における同一のV領域アミノ酸配列及び
配列セグメント。抗体結合部位の結合へのVH及びVL遺伝子、ミニ遺伝子、及び相補性決定
領域の相対的寄与。」J Immunol.1991;147(5):1709-19.
Kwakkenbos MJ, Diehl SA, Yasuda E, Bakker AQ, Van Geelen CMM, Lukens MV, Van B
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及びBeaumont Tの文献. 「遺伝的プログラミングによる安定なモノクローナル抗体産生BC
R+ヒトメモリーB細胞の産生」Nat Med. 2009近刊.
Shvarts A, Brummelkamp TR, Scheeren F, Koh E, Daley GQ, Spits H, Bernards Rの
文献. 「老化救出スクリーンは、抗増殖p19(ARF)-p53シグナリングの阻害剤としてBCL6を
同定する」Genes Dev. 2002;16(6):681-6.
Scheeren FA, Naspetti M, Diehl S, Schotte R, Nagasawa M, Wijnands E, Gimeno R,
Vyth-Dreese FA, Blom B, Spits Hの文献. 「STAT5は、ヒトのメモリーB細胞の自己再生
能力及び分化を制御し、Bcl-6発現を制御する」Nat Immunol.2005;6(3):303-13.
Ternette N, Tippler B, Uberla K, Grunwald Tの文献. 「呼吸器合胞体ウイルスのF-
タンパク質をコードするコドン最適化DNAワクチンの免疫原性及び効率」Vaccine.2007;25
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US 5,624,821
US 5,739,277
US 6,277,375
US 6,737,056
US 6,821,505
US 7,083,784
US 7,317,091
US 7,217,797
US 7,276,585
US 7,355,008
US 2002/0147311
US 2004/0002587
US 2005/0215768
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WO 94/29351
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Kabat EA, Wu TT. “Identical V region amino acid sequences and sequence segments in antibodies of different specificities. Relative contribution of VH and VL genes, minigenes, and complementarity determining regions to binding of antibody binding sites. J Immunol. 1991; 147 (5): 1709-19.
Kwakkenbos MJ, Diehl SA, Yasuda E, Bakker AQ, Van Geelen CMM, Lukens MV, Van B
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Vyth-Dreese FA, Blom B, Spits H. “STAT5 regulates the self-renewal ability and differentiation of human memory B cells and regulates Bcl-6 expression” Nat Immunol. 2005; 6 (3): 303-13.
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US 6,737,056
US 6,821,505
US 7,083,784
US 7,317,091
US 7,217,797
US 7,276,585
US 7,355,008
US 2002/0147311
US 2004/0002587
US 2005/0215768
US 2007/0135620
US 2007/0224188
US 2008/0089892
WO 94/29351
WO 99/58572
WO 2008/147196
（図の凡例）
（実施例1）：B細胞培養、不死化及び選択。
（方法）
B細胞は、先に記載されているように不死化して培養した(Scheeren FAらの文献 (2005)
Nat Immunol 6: 303-313; Diehl SAらの文献 (2008) J Immunol 180: 4805-4815及びKwa
kkenbos MJらの文献 (2009) Nat Med 近刊)。手短にいうと、出願人は、フィコール分離
、CD22 MACSマイクロビーズ(Miltenyi Biotech)、及びその後のFACSAria(Becton Dickins
on)でのCD19+CD3-CD27+IgM-IgA-(IgGメモリー細胞)についての細胞ソートにより、B細胞
を末梢血(Sanquin、Amsterdam、Netherlands)から単離した。これらの組織の使用は、当
該機関の医学倫理委員会の承認を得ており、かつインフォームドコンセントに従った。レ
トロウイルスを形質導入されたB細胞は、組換えマウスIL-21(25ng/ml、R&D systems)で補
充したIMDMにおいて2×105細胞/mlで維持し、CD40Lを安定的に発現するγ照射を受けた(5
0Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞/ml)と36時間共培養した。BCL6及びBc
l-xLレトロウイルスの構築物は、先に記載されており(Shvarts Aらの文献 (2002) Genes
Dev 16: 681-686、及びJaleco ACらの文献 (1999) Blood 94: 2637-2646))、LZRSレトロ
ウイルスベクターにクローン化し、先に記載されているようにフェニックスパッケージン
グ細胞にトランスフェクションして、刺激したB細胞に加えた(Shvarts Aらの文献 (2002)
Genes Dev 16: 681-686、及びScheeren FAらの文献 (2005) Nat Immunol 6: 303-313)。
形質導入されたB細胞は、組換えIL-21及びCD40L-L細胞の存在下、長期にわたり、IMDMに
おいて維持した。BCL6+Bcl-xL-形質転換B細胞によって比較的高い量の分泌抗体が与えら
れたことにより、出願人は、特異抗体の分泌に基づいて抗原特異的B細胞を選択できるか
どうかを検査した。健常ドナーのBCL6+Bcl-xL形質導入メモリーB細胞は、100細胞/ウェル
で播種し、CD40L-L細胞及びIL-21で増殖した。培養の2週後、上清を回収し、マイクロ中
和実験におけるRSV中和抗体の存在について選別した。384の培養(100細胞/ウェル)のうち
、31がHEp2細胞のRSV A2感染を阻止した。D25、AM14、AM16及びAM23が限界希釈によりサ
ブクローン化された 4つの微量培養の他に、出願人は次にAM22を得た。AM22は、1.15ng/m
lのRSV-A2ウイルスに対する中央値半分最大阻害濃度(IC50)を有する(図1)。
Example 1: B cell culture, immortalization and selection.
(Method)
B cells were immortalized and cultured as previously described (Scheeren FA et al. (2005).
Nat Immunol 6: 303-313; Diehl SA et al. (2008) J Immunol 180: 4805-4815 and Kwa
Reference by kkenbos MJ et al. (2009) Nat Med. Briefly, applicants have confirmed ficoll separation, CD22 MACS microbeads (Miltenyi Biotech), and subsequent FACSAria (Becton Dickins
B) were isolated from peripheral blood (Sanquin, Amsterdam, Netherlands) by cell sorting for CD19 + CD3 − CD27 + IgM − IgA − (IgG memory cells) on). Use of these tissues was approved by the institution's medical ethics committee and was subject to informed consent. B cells transduced with retrovirus are maintained at 2 × 10 5 cells / ml in IMDM supplemented with recombinant mouse IL-21 (25 ng / ml, R & D systems) and γ-irradiated to stably express CD40L (5
0Gy) Co-cultured with mouse L cell fibroblasts (CD40L-L cells, 10 5 cells / ml) for 36 hours. BCL6 and Bc
The construction of the l-xL retrovirus has been previously described (Shvarts A et al. (2002) Genes
Dev 16: 681-686, and Jaleco AC et al. (1999) Blood 94: 2637-2646)), cloned into the LZRS retroviral vector and transfected into Phoenix packaging cells as previously described. Added to stimulated B cells (Shvarts A et al. (2002)
Genes Dev 16: 681-686, and Scheeren FA et al. (2005) Nat Immunol 6: 303-313).
Transduced B cells were maintained in IMDM for extended periods in the presence of recombinant IL-21 and CD40L-L cells. Given the relatively high amount of secreted antibody provided by BCL6 + Bcl-xL-transformed B cells, Applicants examined whether antigen-specific B cells could be selected based on the secretion of specific antibodies. Healthy donor BCL6 + Bcl-xL transduced memory B cells were seeded at 100 cells / well and grown on CD40L-L cells and IL-21. After 2 weeks of culture, supernatants were collected and screened for the presence of RSV neutralizing antibodies in microneutralization experiments. Of 384 cultures (100 cells / well), 31 blocked RSV A2 infection of HEp2 cells. In addition to the four microcultures in which D25, AM14, AM16 and AM23 were subcloned by limiting dilution, Applicants then obtained AM22. AM22 is 1.15ng / m
With a median half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) for 1 RSV-A2 virus (FIG. 1).
AM22の免疫グロブリン遺伝子座の重鎖及び軽鎖の配列を得るために、出願人は、RNeasy
（登録商標）ミニキット(Qiagen)で全RNAを単離してcDNAを作成し、PCRを実施し、重鎖及
び軽鎖可変領域をpCR2.1 TAクローニングベクター(Invitrogen)にクローン化した。逆転
写酵素又はDNAポリメラーゼ誘発突然変異を除外するために、出願人は、いくつかの独立
したクローニング実験を実施した。組換えAM22 mAbを生成するために、出願人は、AM22重
鎖及び軽鎖可変領域をインフレームでヒトIgG1及びκ定常領域と共にpcDNA3.1(Invitroge
n)ベースのベクターにクローン化し、一過的に293T細胞をトランスフェクトした。出願人
は、培養上清からプロテインAを用いて組換えAM22を精製した。
To obtain the heavy and light chain sequences of the immunoglobulin locus of AM22, Applicants
Total RNA was isolated with a (registered trademark) mini kit (Qiagen) to produce cDNA, PCR was performed, and the heavy and light chain variable regions were cloned into the pCR2.1 TA cloning vector (Invitrogen). In order to exclude reverse transcriptase or DNA polymerase-induced mutations, Applicants performed several independent cloning experiments. To generate recombinant AM22 mAbs, Applicants have submitted the AM22 heavy and light chain variable regions in-frame with human IgG1 and kappa constant regions in pcDNA3.1 (Invitroge
n) Cloned into the base vector and transiently transfected with 293T cells. Applicant purified recombinant AM22 from the culture supernatant using protein A.
（結果）
以前、出願人は、AM14、AM16、AM23及びD25と命名した4つの有力な高次構造依存的抗RS
V抗体を開発した。これらの抗体は、WO 2008/147196及びKwakkenbos MJらの文献(2009) N
at Med 近刊に記載されている。同じドナーから、出願人は、RSV A2ウイルスに対する1.1
5ng/mlのIC50から明白であるように、他の抗体に比較して、更により効率的にRSVウイル
スを認識したAM22も発見した (表1及び図1) 。AM22のVH及びVL鎖のアミノ酸配列は、この
抗体が他の抗体とは異なることを明らかにした(図2)。
(result)
Previously, applicants have identified four powerful higher-order structure-dependent anti-RSs named AM14, AM16, AM23 and D25.
V antibody was developed. These antibodies are described in WO 2008/147196 and Kwakkenbos MJ et al. (2009) N
at Med It is described in a recent publication. From the same donor, Applicant has 1.1 against RSV A2 virus
As is evident from the IC 50 of 5 ng / ml, AM22 was also found to recognize RSV virus even more efficiently compared to other antibodies (Table 1 and FIG. 1). The amino acid sequences of AM22 VH and VL chains revealed that this antibody was different from other antibodies (FIG. 2).
（実施例２）：インビトロ結合実験
AM22抗体の抗原特異性を更に測定するために、出願人は、該タンパク質がRSV F又はGタ
ンパク質を認識したか、及びどの型の立体構造を認識したかを明らかにするインビトロ結
合実験を実施した。
(Example 2): In vitro binding experiment
In order to further measure the antigen specificity of the AM22 antibody, Applicants performed in vitro binding experiments to reveal whether the protein recognized the RSV F or G protein and what type of conformation it recognized. .
（方法）
(1)RSV G又はFタンパク質のFACS染色
野生型、及びRSV-Gタンパク質(VSV-G)又はRSV-Fタンパク質(VSV-F)を発現する組換え水
疱性口内炎ウイルス(VSV)のウイルスストック（実験はWKZ (Utrecht )のM. Lukensにより
実施され、VSVウイルスはJ.S Kahn及びJ.K Roze ( Yale University School of Medicine
)により快く提供された。）は、5% FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び50μΜ 2-
メルカプトエタノールを含むDMEMで培養したBHK細胞において調製した。VSV感染は、 5%
FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン及び50μΜ 2-メルカプトエタノールを補充したイ
スコーブ（Iscove）のダルベッコ変法培地(IMDM、Gibco、Invitrogen)で培養されたEL-4
細胞で実施した。VSVウイルス異型で感染させたEL-4細胞は、組換え抗体とインキュベー
トした後、マウス抗ヒトPEで染色した(図3A)。
(Method)
(1) FACS staining of RSV G or F protein Wild-type and recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) virus stock expressing RSV-G protein (VSV-G) or RSV-F protein (VSV-F) ( The experiment was performed by M. Lukens of WKZ (Utrecht), and the VSV virus was tested by JS Kahn and JK Roze (Yale University School of Medicine
). ) 5% FCS, penicillin / streptomycin and 50 μΜ 2-
Prepared in BHK cells cultured in DMEM containing mercaptoethanol. VSV infection is 5%
EL-4 cultured in Iscove Dulbecco's Modified Medium (IMDM, Gibco, Invitrogen) supplemented with FCS, penicillin / streptomycin and 50 μΜ 2-mercaptoethanol
Performed on cells. EL-4 cells infected with a VSV virus variant were incubated with a recombinant antibody and then stained with mouse anti-human PE (FIG. 3A).
(2) RSV ELISA
プレートは、37℃で1時間又は4℃で一晩、PBS中のRSV感染したHEp-2細胞の溶解物で被
覆し、ELISA洗浄バッファ(PBS、0.5% Tween-20)で洗浄した。プレートは4%のミルク含有P
BSを用いたインキュベーションによりブロックし、その後、酵素抱合型抗IgG抗体との組
み合わせで抗RSV抗体又はポリクローナルヤギ抗RSV(Biodesign)を添加した（HRP抱合抗Ig
G(Jackson)については1:2500希釈）。TMB基質/停止溶液(Biosource)がELISAの開発のため
に使用された(図3B左側パネル)。RSV-A2感染したHEp-2細胞の溶解物に加え、RSV Long株
からのHISタグ化Fタンパク質(Ternette Nらの文献, (2007) Vaccine 25: 7271-7279に基
づきFrank Coenjaerts（UMCU, Utrecht）により快く提供された)を使用して、Ni-NTA His
Sorpプレート(Qiagen)を被覆した(図3B右側パネル)。RSV F抗体の結合は、HRP抱合型IgG
検出抗体を用いて検出された(1:2500希釈、Jackson)。別の設定において、原型B細胞クロ
ーンは、FACS解析に使用した(図3C)。B細胞は、組換えHISタグ化Fタンパク質とインキュ
ベートし、BCRへの結合は、ラベル化抗ペンタHIS抗体ALEXA Fluor 647(Qiagen)を用いて
検出した。
(2) RSV ELISA
Plates were coated with lysates of RSV-infected HEp-2 cells in PBS for 1 hour at 37 ° C or overnight at 4 ° C and washed with ELISA wash buffer (PBS, 0.5% Tween-20). Plate is 4% milk containing P
After blocking by incubation with BS, anti-RSV antibody or polyclonal goat anti-RSV (Biodesign) was added in combination with enzyme-conjugated anti-IgG antibody (HRP-conjugated anti-Ig
For G (Jackson), 1: 2500 dilution). TMB substrate / stop solution (Biosource) was used for ELISA development (Figure 3B left panel). In addition to lysates of HEV-2 cells infected with RSV-A2, HIS-tagged F protein from RSV Long strain (Ternette N et al., (2007) Vaccine 25: 7271-7279, Frank Coenjaerts (UMCU, Utrecht) Ni-NTA His using
Sorp plates (Qiagen) were coated (Figure 3B right panel). The binding of RSV F antibody is HRP-conjugated IgG
Detected with detection antibody (1: 2500 dilution, Jackson). In another setup, prototype B cell clones were used for FACS analysis (FIG. 3C). B cells were incubated with recombinant HIS-tagged F protein and binding to BCR was detected using labeled anti-pentaHIS antibody ALEXA Fluor 647 (Qiagen).
(3) RSV三量体
組換えRSV long株由来Fタンパク質に加え、出願人は、イソロイシンジッパードメイン
とそれに続く8個のHISリピート(ILZ-8×HIS)に融合した構築物にFのオープンリーディン
グフレームを挿入することにより、RSV A2 F三量体を生成した。タンパク質構築物は、29
3T細胞において一過的に発現され、BDのFix Permキットを使用する細胞内染色プロトコル
を用いて検出した(図3D)。
(3) RSV trimer In addition to the recombinant RSV long strain-derived F protein, the Applicant has applied the F open reading frame to a construct fused to the isoleucine zipper domain followed by 8 HIS repeats (ILZ-8 × HIS). RSV A2 F trimer was generated by inserting The protein construct is 29
It was transiently expressed in 3T cells and detected using an intracellular staining protocol using the BD Fix Perm kit (FIG. 3D).
（結果）
組換えVSV により発現される場合、全ての抗体は、RSV-Fタンパク質を認識した(図3A)
。更に、AM16を除いて、前記抗体はRSV感染HEp-2細胞の溶解物を認識しなかったので、認
識は、RSV-Fタンパク質の高次構造エピトープの存在に依存していた (図3B左側パネル)。
また、精製されたHISタグ化組換えRSV-F Long株タンパク質は、ダイレクトELISAで試験し
た場合、D25、AM14、AM22及びAM23によって認識されなかった(図3B右側パネル)。しかし
ながら、原型の安定なBCRを発現するB細胞株が、HISタグ化RSV-Fタンパク質のこの非精製
培養上清と共にインキュベートされる場合、出願人は、B細胞へのクローンAM16、AM23、
及び比較的弱いD25の結合を観測した (図3C)。おそらく、この非精製培養上清のタンパク
質は、BCRに結合するがHisSorpプレート上の単量体として捕捉されるだけであるRSV F三
量体の画分を含む。しかしながら、それでも、RSV-Fタンパク質の捕捉は、AM14及びAM22
B細胞株のBCRに観測されなかった(図3C)。それゆえ、AM14及びAM22は、異なるエピトープ
に結合する。おそらく、低い割合のタンパク質Fホモ三量体又は二量体が、Fタンパク質産
生細胞株の未処理の培養上清に存在した。これらのより天然型のF立体構造は、AM23及びD
25により認識されるエピトープを発現することができ、これらはELISA手順の変性条件で
失われた。興味深いことに、出願人がILZ-8×HIS配列を含むRSV三量化構築物でトランス
フェクションした293T細胞における細胞内染色を実施した場合、出願人は、AM22はRSV F
を認識するが、AM14はそれでもこのタンパク質構造を認識しなかったことを発見した (図
3D)。それゆえ、AM22は、変性条件に存在しない、それゆえ該タンパク質の単量体形態に
存在しないRSV-Fタンパク質の立体構造を認識するので、独特である。RSV Fタンパク質が
共にとどまって三量体を形成させる場合にのみ、その後、出願人はAM22抗体によってFの
結合、すなわちウイルス粒子に存在する立体構造を検出し、このようにしてAM22の高い中
和効力を説明することができる。
(result)
All antibodies recognized RSV-F protein when expressed by recombinant VSV (Figure 3A)
. Furthermore, with the exception of AM16, the antibodies did not recognize lysates of RSV-infected HEp-2 cells, so recognition was dependent on the presence of RSV-F protein conformational epitopes (Figure 3B left panel). ).
The purified HIS-tagged recombinant RSV-F Long strain protein was not recognized by D25, AM14, AM22, and AM23 when tested by direct ELISA (FIG. 3B right panel). However, when a B cell line that expresses a prototypical stable BCR is incubated with this non-purified culture supernatant of HIS-tagged RSV-F protein, Applicants have identified clones AM16, AM23,
And relatively weak D25 binding was observed (FIG. 3C). Presumably, the protein in this unpurified culture supernatant contains a fraction of RSV F trimers that bind to BCR but are only captured as monomers on HisSorp plates. However, the capture of RSV-F protein is still AM14 and AM22
It was not observed in BCR of the B cell line (FIG. 3C). Therefore, AM14 and AM22 bind to different epitopes. Perhaps a low proportion of protein F homotrimer or dimer was present in the untreated culture supernatant of the F protein producing cell line. These more natural F conformations are AM23 and D
Epitopes recognized by 25 could be expressed and these were lost under the denaturing conditions of the ELISA procedure. Interestingly, if Applicants performed intracellular staining in 293T cells transfected with RSV trimerization constructs containing ILZ-8xHIS sequences, Applicants will note that AM22 is RSV F
But AM14 still found that this protein structure was not recognized (Fig.
3D). Therefore, AM22 is unique because it recognizes the RSV-F protein conformation that is not present in denaturing conditions and therefore not present in the monomeric form of the protein. Only when the RSV F protein stays together to form a trimer, the applicant then detects F binding, ie the conformation present in the viral particle, with the AM22 antibody, thus high neutralization of AM22. Explain the efficacy.
（実施例3）：インビボ効力実験
AM22モノクローナル抗体のインビボ効力を調査するために、出願人は、コットンラット
実験を実施した。
(Example 3): In vivo efficacy experiment
In order to investigate the in vivo efficacy of the AM22 monoclonal antibody, Applicants performed a cotton rat experiment.
（方法）
病原体を有しない7〜9週齢のコットンラット(Sigmodon hispidus, Harlan Laboratorie
s, Nederland)をイソフルランで麻酔し、コントロール抗体、パリビズマブ、AM22、AM23
及びD25については2.0又は0.4mg/kgの用量で0.1mlの精製された抗体を筋注(i.m.)によっ
て与え、AM14は0.4及び0.1mg/kgで投与した。24時間後、動物を麻酔し、血清hIgGの測定
のために採血し、106のTCID50 RSV-X(100μl)の鼻腔内滴下により曝露した。5日後、動物
を屠殺し、それらの肺を回収した。肺ウイルス力価を測定し、検出で最も低い制限は2.1l
og10TCID50/gであった。オランダワクチン研究所の動物実験委員会は、コットンラットを
含む全ての手順を承認した。
(Method)
7-9 week old cotton rats (Sigmodon hispidus, Harlan Laboratorie)
s, Nederland) with isoflurane, control antibody, palivizumab, AM22, AM23
And for D25, 0.1 ml of purified antibody was given by intramuscular (im) at a dose of 2.0 or 0.4 mg / kg, and AM14 was administered at 0.4 and 0.1 mg / kg. Twenty-four hours later, the animals were anesthetized, bled for serum hIgG measurement, and exposed by intranasal instillation of 10 6 TCID 50 RSV-X (100 μl). After 5 days, the animals were sacrificed and their lungs were collected. Lung virus titer is measured and the lowest limit for detection is 2.1 l
og 10 TCID 50 / g. The Animal Care and Use Committee of the Dutch Vaccine Institute approved all procedures including cotton rats.
（結果）
AM16を除く抗RSV抗体のパネルは、コットンラットにおいて試験した。動物は、RSV-X(
主要なRSV A単離株)を鼻腔内投与する前に、2.0又は0.4mg /kgのモノクローナル抗体で予
防的に処理した。比較的低い抗体産生により、AM14抗体は、0.4及び0.1mgの/kgで投与し
た。1日目(ウイルス接種の日)及び5日目(屠殺の日)にコットンラット血清から回収された
ヒトIgGのレベルは、全ての抗体について同じ範囲であり、かつ時間内の抗体の減少は同
程度であった (図4A)。
(result)
A panel of anti-RSV antibodies except AM16 was tested in cotton rats. Animals are RSV-X (
The main RSV A isolate) was treated prophylactically with 2.0 or 0.4 mg / kg monoclonal antibody prior to intranasal administration. Due to the relatively low antibody production, AM14 antibody was administered at 0.4 and 0.1 mg / kg. The levels of human IgG recovered from cotton rat serum on day 1 (day of virus inoculation) and day 5 (day of sacrifice) are in the same range for all antibodies, and the decrease in antibodies over time is the same. (Figure 4A).
屠殺した動物の肺からのRSVウイルスの回収は、コントロール群に比較して、2.0mg/kg
の免疫グロブリンで処理した全ての動物群において、大幅に減少した(図4B)。0.4mg/kgの
パリビズマブ及びAM23で処理した動物は、顕著なウイルス複製を示したが、AM14及びD25
の群においては、6匹の動物のうちの1匹が検出可能なウイルス複製を示した。ウイルスは
、AM22で処理した動物から回収できなかった。これらの結果は、RSV Fタンパク質上の高
次構造エピトープを特異的に認識するAM22が、強力なインビボ中和能を有することを実証
した。
Recovery of RSV virus from the lungs of slaughtered animals was 2.0 mg / kg compared to the control group.
There was a significant reduction in all groups of animals treated with a single immunoglobulin (FIG. 4B). Animals treated with 0.4 mg / kg palivizumab and AM23 showed significant viral replication, but AM14 and D25
In this group, 1 out of 6 animals showed detectable virus replication. Virus could not be recovered from animals treated with AM22. These results demonstrated that AM22, which specifically recognizes conformational epitopes on the RSV F protein, has a strong in vivo neutralizing ability.
（RSV曝露したコットンラットの肺病態のアッセイ）
i.n.RSV感染後の5日目の各コットンラットから、左肺を摘出し、ホルマリンで固定した
。肺の損傷は、以下の3個の個々のマーカーについて0〜5の間で等級付けした：1)気管支
及び細気管支上皮の肥大、2 )気管支及び細気管支を囲む炎症(細気管支周囲炎)、及び3)
肺胞の炎症(肺胞炎)。1群中の全ての動物のスコアの平均合計は、病態指数 (最大スコア1
5) を生成した(図4c、表2)。RSV感染の後の肺病態は、高用量の免疫グロブリン(2mg/kg)
で処理した動物群において、著しく減少した(表3)。しかしながら、AM14、AM22及びAM23
群においてのみ、該病態は低濃度(0.4mg/kg)で著しく減少した。2mg/kgのAM22及びAM23で
処理した5匹の動物のうちの3匹において病態の完全な欠如がみられたが、0.4mg/kgでは、
AM14及びAM22群においてそれぞれ6匹の動物のうちの2匹又は1匹において完全な保護が検
出された(表3)。
(Assessment of lung pathology in cotton rats exposed to RSV)
The left lung was extracted from each cotton rat on the fifth day after inRSV infection and fixed with formalin. Lung damage was graded between 0 and 5 for the following three individual markers: 1) hypertrophy of bronchi and bronchiole epithelium, 2) inflammation surrounding bronchi and bronchioles (peribronchiolitis), And 3)
Alveolar inflammation (alveolitis). The average sum of scores for all animals in a group is the pathologic index (maximum score 1
5) was generated (Figure 4c, Table 2). Lung pathology after RSV infection is high dose immunoglobulin (2 mg / kg)
There was a significant decrease in the group of animals treated with (Table 3). However, AM14, AM22 and AM23
Only in the group the condition was significantly reduced at low concentrations (0.4 mg / kg). There was a complete absence of disease in 3 out of 5 animals treated with 2 mg / kg AM22 and AM23, but at 0.4 mg / kg,
Complete protection was detected in 2 or 1 out of 6 animals in the AM14 and AM22 groups, respectively (Table 3).
実施例1、2及び3の結果を組み合わせると、AM22が特定の利点を有することが結論付け
られる。AM22は最も低いIC50値を示し、これは、他の抗体に比較して、低量のAM22を用い
て類似の予防的又は治療的有効性が達成されることを意味する。AM22は、他の抗体とは異
なるRSV Fタンパク質のエピトープを認識し、したがって他の抗体のうちの1つと組み合わ
せて使用して、RSVへのより強い免疫原性応答及びRSVに対するより高い抗体特異性を達成
することができる。最後に、AM22を用いたコットンラットの処理は、これらのコットンラ
ットにおけるウイルス複製のほぼ完全な阻害、及び病態の潜在的な完全欠如をもたらした
。
Combining the results of Examples 1, 2, and 3, it can be concluded that AM22 has certain advantages. AM22 exhibits the lowest IC 50 value, which means that similar prophylactic or therapeutic efficacy is achieved with lower amounts of AM22 compared to other antibodies. AM22 recognizes a different epitope on RSV F protein than other antibodies, and therefore used in combination with one of the other antibodies, a stronger immunogenic response to RSV and higher antibody specificity to RSV Can be achieved. Finally, treatment of cotton rats with AM22 resulted in almost complete inhibition of viral replication in these cotton rats and a potential complete absence of pathology.
（実施例4）：RSV Fタンパク質に対するAM22の親和性
抗体の予防的、治療的及び診断的な値を確立するのには、RSV Fタンパク質とAM22との
間の結合の親和性定数及び特異性を測定するのが好ましい。これは、抗体親和性がオリゴ
マータンパク質構造について測定されなければならないので、挑戦的な特性である。通常
、親和性定数は、チップ上に捕捉された固定された作用物質に対して測定される。しかし
ながら、 チップ上に捕捉されたタンパク質Fは、AM14、AM22、AM23及びD25抗体により認
識されない。
Example 4: Affinity of AM22 for RSV F protein To establish prophylactic, therapeutic and diagnostic values for antibodies, the affinity constant and specificity of the binding between RSV F protein and AM22 Is preferably measured. This is a challenging property because antibody affinity must be measured for oligomeric protein structures. Usually, affinity constants are measured for immobilized agents captured on the chip. However, protein F captured on the chip is not recognized by AM14, AM22, AM23 and D25 antibodies.
（方法）
「結合親和性」とは一般に、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位とその結合パートナ
ー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の合計強度をいう。分子Xのそのパートナ
ーYに対する親和性は、一般に、比率koff/konとして算出される平衡解離定数(Kd)により
表すことができる。親和性は、表面プラスモン共鳴(SPR)アッセイなどの当該技術分野に
おいて公知の一般的方法により測定できる。親和性(KD)、結合速度（on-rate）(ka)及び
解離速度（off-rate）(kd)は、IBIS Technologies BV (Hengelo, the Netherlands)のIBI
S-iSPR装置を用いたSPRアッセイで測定される。簡潔にいうと、抗RSV抗体は固定され、精
製されたRSV Fタンパク質（ペンタHISを含む）は希釈され、速度及び親和性定数は、該タ
ンパク質の少なくとも3つの連続希釈物の注入で測定される。
(Method)
“Binding affinity” generally refers to the total strength of a non-covalent interaction between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by the equilibrium dissociation constant calculated as the ratio k off / k on (Kd) . Affinity can be measured by common methods known in the art, such as surface plasmon resonance (SPR) assays. Affinity (KD), binding rate (on-rate) (ka), and dissociation rate (off-rate) (kd) were measured using IBI from IBIS Technologies BV (Hengelo, the Netherlands).
It is measured by SPR assay using S-iSPR device. Briefly, anti-RSV antibody is immobilized, purified RSV F protein (including penta-HIS) is diluted, and rate and affinity constants are measured with injections of at least three serial dilutions of the protein. .
IMIS-iSPR装置における別の設定は、1) F-ペンタHISタンパク質が共役された抗ペンタ
HIS抗体を固定すること、又は2) F-ペンタHISタンパク質をチップ上に直接固定した後、
該チップ上のサンプルをAIMM抗体とインキュベートして、親和性定数を測定することであ
る。
Another setting in the IMIS-iSPR system is 1) anti-penta conjugated with F-penta HIS protein
Immobilize HIS antibody, or 2) Immediately after fixing F-pentaHIS protein on the chip,
Incubating a sample on the chip with an AIMM antibody and measuring the affinity constant.
選択された抗RSV IgGのIC50(ng/ml)値は、RSV A2ウイルスを有するHEp2細胞上の標準TC
ID50培養アッセイにより測定した。
The IC 50 (ng / ml) value of the selected anti-RSV IgG is the standard TC on HEp2 cells with RSV A2 virus
Measured by ID 50 culture assay.
示された抗体を用いたRSV感染の24時間前に処理したコットンラットの肺の累積的な病
態スコア。感染の5日後に得られた肺標本は、病理学者により、ランダムに評価した。肺
病態は、以下の3個の個々のマーカーについて0〜5のスコアで等級付けした：1)気管支及
び細気管支上皮の肥大（hyperthropy）、2)細気管支周囲炎、及び3)肺胞炎。コントロー
ルIgG1群に関する平均標準誤差(SEM)及び統計的差異を用いた平均病態スコア(最大スコア
15)は、2側ウイルコクソン検定（2-sided Wilcoxon test）で算出した。実験は、治療群
当たり4〜6匹の個々の動物を用いて2回実施した。N.A.：該当なし。
Cumulative pathology score of lungs of cotton rats treated 24 hours prior to RSV infection with the indicated antibodies. Lung specimens obtained 5 days after infection were randomly assessed by a pathologist. Lung pathology was graded with a score of 0-5 for the following three individual markers: 1) hyperthropy of bronchial and bronchiolar epithelium, 2) peribronchiolitis, and 3) alveolitis. Mean standard error (SEM) and mean disease state score using statistical difference (maximum score) for control IgG1 group
15) was calculated by the 2-sided Wilcoxon test. The experiment was performed twice with 4-6 individual animals per treatment group. NA: Not applicable.
RSV-X感染の間の5日目の肺病態に顕著な低減を有する動物の数又は肺病態の欠如を有す
る動物の数。実験は、治療群当たり4〜6匹の個々の動物を用いて2回実施した。
Number of animals with significant reduction in lung condition on day 5 during RSV-X infection or animals with lack of lung condition. The experiment was performed twice with 4-6 individual animals per treatment group.
Claims (16)
配列KLSIH（配列番号4）を含む重鎖相補性決定領域（CDR）1配列；
配列GYEGEVDEIFYAQKFQH（配列番号8）を含む重鎖CDR2配列；
配列LGVTVTEAGLGIDDY（配列番号12）を含む重鎖CDR3配列；
配列RASQIVSRNHLA（配列番号20）を含む軽鎖CDR1配列；
配列GASSRAT（配列番号24）を含む軽鎖CDR2配列；及び
配列LSSDSSI（配列番号28）を含む軽鎖CDR3配列を含み、
かつヒトIgG重鎖定常領域を含む、前記抗体又はその抗原結合部分。 An antibody or antigen-binding portion thereof capable of specifically binding to respiratory syncytial virus (RSV) F protein comprising:
A heavy chain complementarity determining region (CDR) 1 sequence comprising the sequence KLSIH (SEQ ID NO: 4);
A heavy chain CDR2 sequence comprising the sequence GYEGEVDEIFYAQKFQH (SEQ ID NO: 8);
A heavy chain CDR3 sequence comprising the sequence LGVTVTEAGLGIDDY (SEQ ID NO: 12);
A light chain CDR1 sequence comprising the sequence RASQIVSRNHLA (SEQ ID NO: 20);
A light chain CDR2 sequence comprising the sequence GASSRAT (SEQ ID NO: 24); and a light chain CDR3 sequence comprising the sequence LSSDSSI (SEQ ID NO: 28);
And the antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a human IgG heavy chain constant region.
(a)配列
(b)配列
(c)配列
(d)配列
(e)配列
(f)配列
(g)配列
(h)配列
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