JP5969186B2

JP5969186B2 - GPR119 agonist and insulin secretagogue, hypoglycemic agent and diabetes treatment or prevention agent containing the same

Info

Publication number: JP5969186B2
Application number: JP2011201858A
Authority: JP
Inventors: 冷牟田　修一; 修一冷牟田; 武田　茂樹; 茂樹武田; 至小島
Original assignee: Gunma University NUC; Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Gunma University NUC; Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2031-09-15
Also published as: JP2013063913A

Description

本発明は、ＧＰＲ１１９アゴニスト（活性化剤）並びにそれを含むインスリン分泌促進剤、血糖降下剤および糖尿病の治療または予防剤に関する。 The present invention relates to a GPR119 agonist (activator) and an insulin secretion promoter, a hypoglycemic agent, and a therapeutic or preventive agent for diabetes containing the same.

ＧＰＲ１１９（Ｇタンパク質共役型受容体１１９）は、近年、ヒトゲノム解析によって見つかった新たなＧタンパク質共役受容体である。ＧＰＲ１１９アゴニストは、ｃＡＭＰ産生を促進し、インスリン分泌を促進することが知られている。ＧＰＲ１１９アゴニストとしては、［６−（４−ベンゼンスルホニル−ピペリジン−１−イル）−５−ニトロ−ピリミジン−４−イル］−（４−メタンスルホニル−フェニル）−アミン（特許文献１）、６'−［４−（２−メトキシカルボニル−アセチル）−フェノキシ］−３'−ニトロ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−［１，２'］ビピリジニル−４−カルボン酸エチルエステル（特許文献２）、３−［６−（４−メタンスルホニル−フェニルアミノ）−５−ニトロ−ピリミジン−４−イルオキシメチル］−ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（特許文献３）、４−［１−（４−メタンスルホニル−フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（特許文献４）などの置換へテロアリール誘導体が知られている（特許文献５）。
なお、ＧＰＲ１１９アゴニストが関与しないインスリン分泌促進のメカニズムとしては、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）などのインクレチンを分解するＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチターゼ−ＩＶ）の阻害が知られている（特許文献６）。 GPR119 (G protein-coupled receptor 119) is a new G protein-coupled receptor recently discovered by human genome analysis. GPR119 agonists are known to promote cAMP production and promote insulin secretion. Examples of GPR119 agonists include [6- (4-benzenesulfonyl-piperidin-1-yl) -5-nitro-pyrimidin-4-yl]-(4-methanesulfonyl-phenyl) -amine (Patent Document 1), 6 ′. -[4- (2-Methoxycarbonyl-acetyl) -phenoxy] -3'-nitro-3,4,5,6-tetrahydro-2H- [1,2 '] bipyridinyl-4-carboxylic acid ethyl ester (patent document) 2), 3- [6- (4-Methanesulfonyl-phenylamino) -5-nitro-pyrimidin-4-yloxymethyl] -pyrrolidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester (Patent Document 3), 4- [ 1- (4-Methanesulfonyl-phenyl) -1H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-yloxy] -piperidine-1-carboxylic acid tert Heteroaryl derivatives are known to substitution, such as butyl ester (patent document 4) (Patent Document 5).
In addition, inhibition of DPP-IV (dipeptidyl peptidase-IV) that degrades incretin such as GLP-1 (glucagon-like peptide-1) is known as a mechanism of insulin secretion promotion not involving a GPR119 agonist. (Patent Document 6).

特表２００６−５１６５７２号公報JP-T-2006-516572 特表２００６−５１８７６３号公報JP-T-2006-518863 特表２００７−５２８８５６号公報Special table 2007-528856 gazette 特表２００７−５３１６９８号公報Special table 2007-531698 gazette 特開２００８−１９５７３３号公報JP 2008-195733 A 特表２００８−５４０６５１号公報Special table 2008-540651 gazette

本発明は、新規なＧＰＲ１１９アゴニストを提供することを課題とする。また、本発明は、新規なＧＰＲ１１９アゴニストを、医薬、食品の成分として使用し、高血糖の治療・予防のための医薬、高血糖の改善・予防のための食品を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel GPR119 agonist. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical for treating / preventing hyperglycemia and a food for improving / preventing hyperglycemia by using a novel GPR119 agonist as a component of the pharmaceutical / food. .

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、5-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoic acid（5-HEPE）がＧＰＲ１１９アゴニストとして作用すること、さらにはインスリン分泌促進作用や血糖低下作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that 5-hydroxy-6E, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z-eicosapentaenoic acid (5-HEPE) acts as a GPR119 agonist, and further insulin secretion. It has been found that it has a promoting action and a blood glucose lowering action, and has completed the present invention.
That is, the present invention is as follows.

（１）5-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoic acid（5-HEPE）を有効成分とする、ＧＰＲ１１９アゴニスト。
（２）（１）に記載のＧＰＲ１１９アゴニストを含むインスリン分泌促進剤。
（３）（１）に記載のＧＰＲ１１９アゴニストを含む血糖降下剤。
（４）（１）に記載のＧＰＲ１１９アゴニストを含む糖尿病の治療または予防剤。 (1) GPR119 agonist containing 5-hydroxy-6E, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z-eicosapentaenoic acid (5-HEPE) as an active ingredient.
(2) An insulin secretagogue comprising the GPR119 agonist according to (1).
(3) A hypoglycemic agent comprising the GPR119 agonist according to (1).
(4) A therapeutic or prophylactic agent for diabetes comprising the GPR119 agonist according to (1).

本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、ｃＡＭＰ産生促進作用、インスリン分泌促進作用、血糖値降下作用を有する。従って、本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、ｃＡＭＰ産生促進剤、インスリン分泌促進剤、血糖値降下剤として使用できる。本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、高血糖の治療・予防のための医薬、糖尿病の合併症の治療・予防のための医薬や、循環器系疾患（高血圧、高脂血症など）の治療・予防のための医薬、高血糖改善・予防のための食品、糖尿病の合併症の改善・予防のための食品や、循環器系疾患（高血圧、高脂血症など）の改善・予防のための食品の成分として好適である。
特に、本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、摂食時などの高血糖条件下のみで、インスリン分泌促進作用を発揮し、血糖値の上昇を抑える。従って、本発明の医薬、食品は、非摂食時などの比較的低血糖条件下で、過度な低血糖を引き起こす危険性が小さく、安全性が高い。 The GPR119 agonist of the present invention has a cAMP production promoting action, an insulin secretion promoting action, and a blood glucose level lowering action. Therefore, the GPR119 agonist of the present invention can be used as a cAMP production promoter, an insulin secretion promoter, and a blood glucose level lowering agent. The GPR119 agonist of the present invention is a drug for the treatment / prevention of hyperglycemia, a drug for the treatment / prevention of complications of diabetes, and the treatment / prevention of cardiovascular diseases (hypertension, hyperlipidemia, etc.) Medicines for improving / preventing hyperglycemia, foods for improving / preventing diabetic complications, and foods for improving / preventing cardiovascular diseases (hypertension, hyperlipidemia, etc.) Suitable as a component.
In particular, the GPR119 agonist of the present invention exerts an insulin secretion promoting action and suppresses an increase in blood glucose level only under hyperglycemic conditions such as during feeding. Therefore, the medicament and food of the present invention have a low risk of causing excessive hypoglycemia under relatively low blood glucose conditions such as when not eating, and are highly safe.

5-HEPEのＧＰＲ１１９アゴニスト活性（ＧＰＲ１１９へのGTP-γS結合促進活性）を示す図である。It is a figure which shows GPR119 agonist activity (GTP-γS binding promotion activity to GPR119) of 5-HEPE. 5-HEPEのｃＡＭＰ産生促進効果を示す図である。It is a figure which shows the cAMP production promotion effect of 5-HEPE. 5-HEPEのインスリン分泌促進効果を示す図である。It is a figure which shows the insulin secretion promotion effect of 5-HEPE. 5-HEPEの血糖値上昇抑制効果を示す図である。It is a figure which shows the blood glucose level raise inhibitory effect of 5-HEPE.

本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、5-HEPEを有効成分として含む。5-HEPEは光学異性体を含み、異性体の混合物でもよいし、S体でもよい。また、5-HEPEは塩でもよい。
5-HEPEは合成されたものでも、5-HEPEを含む試料から単離・精製されたものでもよい。
また、5-HEPEはEPA（エイコサペンタエン酸）を酵素により酸化することによって得られるものでもよい（参考文献：Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 81, pp689-693, 1984）。ここで、酵素としてはシクロオキシゲナーゼが例示され、植物由来シクロオキシゲナーゼでもよい。 The GPR119 agonist of the present invention contains 5-HEPE as an active ingredient. 5-HEPE includes optical isomers and may be a mixture of isomers or S-isomer. 5-HEPE may be a salt.
5-HEPE may be synthesized or isolated and purified from a sample containing 5-HEPE.
5-HEPE may be obtained by oxidizing EPA (eicosapentaenoic acid) with an enzyme (reference: Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 81, pp 689-693, 1984). Here, a cyclooxygenase is illustrated as an enzyme, A plant-derived cyclooxygenase may be sufficient.

本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、インスリン分泌促進作用、血糖降下作用を有する。従って、本発明のＧＰＲ１１９アゴニストはインスリン分泌促進剤や血糖降下剤として用いることができる。 The GPR119 agonist of the present invention has an insulin secretion promoting action and a hypoglycemic action. Therefore, the GPR119 agonist of the present invention can be used as an insulin secretagogue or a hypoglycemic agent.

本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、そのままで、又は通常医薬に用いられる担体とともに製剤化することにより、ＧＰＲ１１９の不活性状態に起因するｃＡＭＰ産生の低下、インスリン分泌の低下、血糖値の上昇が引き起こす疾病の治療・予防のための医薬（以下「本発明の医薬」ともいう。）として用いることができる。このような疾病としては、例えば、糖尿病、糖尿病合併症、高血圧及び高脂血症などの循環器系疾患等が挙げられる。 The GPR119 agonist of the present invention can be formulated as it is or with a carrier that is usually used in pharmaceuticals, thereby reducing the cAMP production, the insulin secretion, and the blood glucose level caused by the inactive state of GPR119. It can be used as a medicament for treatment / prevention (hereinafter also referred to as “the medicament of the present invention”). Examples of such diseases include diabetes, diabetic complications, hypertension and circulatory diseases such as hyperlipidemia.

本発明の医薬の剤形は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。 The pharmaceutical dosage form of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the therapeutic purpose. Specific examples include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, syrups, suppositories, and injections.

本発明の医薬は、5-HEPE以外の有効成分を含有していてもよい。
また、本発明の医薬の製剤化の際、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、保存剤、矯味矯臭剤、希釈剤等を加えてもよい。 The medicament of the present invention may contain an active ingredient other than 5-HEPE.
In addition, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, preservatives, flavoring agents, diluents and the like may be added during the formulation of the medicament of the present invention.

本発明の医薬の投与方法は、経口的投与、非経口投与の何れであってもよい。また、本発明の医薬の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて決定されるが、一般的には、有効成分量として成人一日あたり1μg／ｋｇから１０００mg／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００mg／ｋｇ程度の範囲である。本発明の医薬は、5-HEPEに必要に応じて任意成分を配合することにより製造することができる。 The pharmaceutical administration method of the present invention may be either oral or parenteral. The dosage of the medicament of the present invention is determined according to the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc. Generally, the amount of active ingredient is generally about 1 μg / kg to 1000 mg / kg per day for an adult. Preferably in the range of 10 μg / kg to 100 mg / kg. The pharmaceutical of this invention can be manufactured by mix | blending arbitrary components with 5-HEPE as needed.

本発明のＧＰＲ１１９アゴニストは、通常用いられる食品原料とともに加工することにより、ＧＰＲ１１９の不活性状態、これに起因するｃＡＭＰ産生の低下、インスリン分泌の低下、血糖値の上昇が引き起こす疾病の予防・改善のための食品（以下「本発明の食品」ともいう。）として用いることができる。このような疾病としては、例えば、糖尿病、糖尿病合併症、高血圧及び高脂血症などの循環器系疾患等が挙げられる。
本発明において、「食品」には、人間が摂取する食品の他、人間以外の動物が摂取する飼料も含まれる。 The GPR119 agonist of the present invention can be processed together with commonly used food ingredients to prevent or improve diseases caused by the inactive state of GPR119, a decrease in cAMP production resulting from this, a decrease in insulin secretion, and an increase in blood glucose level. For food (hereinafter also referred to as “the food of the present invention”). Examples of such diseases include diabetes, diabetic complications, hypertension and circulatory diseases such as hyperlipidemia.
In the present invention, “food” includes foods taken by humans as well as feeds taken by animals other than humans.

本発明の食品における前記培養物又は抽出物の含有量は、食品の用途、食品の形態等に応じて決定される。例えば、5-HEPEの含有量が食品全体に対し、好ましくは０．０１〜１０質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％となるような含有量とすることができる。 The content of the culture or extract in the food of the present invention is determined according to the use of the food, the form of the food, and the like. For example, the content of 5-HEPE is preferably 0.01 to 10% by mass, more preferably 0.1 to 1% by mass, based on the whole food.

本発明の食品の形態は特に限定されない。例えば、飲料、菓子などの加工食品が挙げられる。
本発明の食品は、5-HEPE以外の健康増進成分を含有していてもよい。 The form of the food of the present invention is not particularly limited. For example, processed foods, such as a drink and confectionery, are mentioned.
The food of the present invention may contain health promoting components other than 5-HEPE.

また、本発明の食品の摂取量は、食品の用途、食品の形態等に応じて決定されるが、例えば、5-HEPEの摂取量が、成人一日あたり1μg／ｋｇから１０００mg／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００mg／ｋｇ程度の範囲となるような摂取量を目安とすることができる。本発明の食品は、5-HEPEを食品原料とともに加工することにより製造することができる。 The intake of the food of the present invention is determined according to the use of the food, the form of the food, etc. For example, the intake of 5-HEPE is about 1 μg / kg to 1000 mg / kg per adult day. An intake amount that is within a range, and preferably within a range of about 10 μg / kg to 100 mg / kg can be used as a guide. The food of the present invention can be produced by processing 5-HEPE together with food ingredients.

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the embodiments of the following examples.

１．ＧＰＲ１１９アゴニスト活性の測定
（１）試薬
5-HEPEはCayman社製の試薬（Item Number 32200）を用いた。コントロールとしてＧＰＲ１１９アゴニスト活性が知られているリゾフォスファチジルコリン（LPC）を使用した。 1. Measurement of GPR119 agonist activity (1) Reagent
For 5-HEPE, a reagent (Item Number 32200) manufactured by Cayman was used. As a control, lysophosphatidylcholine (LPC) whose GPR119 agonist activity is known was used.

（２）ＧＰＣＲアッセイ
インビトロでＧＰＲ１１９アゴニスト活性を評価した。活性評価は、［³⁵Ｓ］ＧＴＰ−γＳのバインディングアッセイにより行った。詳細な方法は、生物物理４３（１）３７−３９（２００３）に示されるとおりである。 (2) GPCR assay GPR119 agonist activity was evaluated in vitro. The activity was evaluated by a binding assay of [ ³⁵ S] GTP-γS. The detailed method is as shown in Biophysics 43 (1) 37-39 (2003).

その結果、5-HEPEに強いＧＰＲ１１９アゴニスト活性が検出された。そこで、さらに5-HEPEをヘペス緩衝液を用いて希釈し、ドーズリスポンスを確認した。図１に示すように、5-HEPEのEC₅₀は５２ｎＭであり、ＬＰＣと同オーダーのアゴニスト活性を示した。 As a result, strong GPR119 agonist activity was detected against 5-HEPE. Therefore, 5-HEPE was further diluted with Hepes buffer to confirm dose response. As shown in FIG. 1, the EC _{50 of} 5-HEPE was 52 nM, and showed agonist activity in the same order as LPC.

２．ｃＡＭＰ産生促進作用の測定
5-HEPEについてｃＡＭＰ産生促進作用を測定した。
具体的な方法は、以下のとおりである。
ＧＰＲ１１９を安定的に発現するＣＨＯ細胞を作製し、この細胞に各濃度の5-HEPE（ＤＭＳＯ溶液）を添加してｃＡＭＰ濃度を測定した。
具体的には、まず、5-HEPEのＤＭＳＯ溶液2μlをKRB(Krebs-Ringer bicarbonate、組成は下記参照) (グルコース２０ｍＭ）198μｌに溶解し、活性測定用のサンプルとした。
活性測定２日前に96wellプレートに1.0×10⁴[cells/well]になるようＣＨＯ（ＧＰＲ１１９）細胞を播種した。2日後、培地をアスピレーターで吸い、KRB (グルコース 0mM)で細胞をウォッシュした。続いて、ウェルにKRB(グルコース2.5mM)100μlを加えて、30分CO₂インキュベーター内でインキュベートした。その後、KRB(グルコース 0mM)で細胞をウォッシュした。各wellのＫＲＢを除去した後に、上記作製したサンプルを、各wellに100μlずつ添加し、37℃ CO₂インキュベーターで２時間インキュベートした。また、コントロールとしてＬＰＣを添加した。
その後、キット（Amersham cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay System RPN 225）を用いてcAMP活性の測定を行った（下記の参考文献参照）。 2. Measurement of cAMP production promoting action
The cAMP production promoting action of 5-HEPE was measured.
The specific method is as follows.
CHO cells that stably express GPR119 were prepared, and 5-HEPE (DMSO solution) of each concentration was added to the cells, and the cAMP concentration was measured.
Specifically, first, 2 μl of 5-HEPE in DMSO was dissolved in 198 μl of KRB (Krebs-Ringer bicarbonate, see below for composition) (glucose 20 mM) to obtain a sample for activity measurement.
Two days before the activity measurement, CHO (GPR119) cells were seeded on a 96-well plate at 1.0 × 10 ⁴ [cells / well]. Two days later, the medium was sucked with an aspirator and the cells were washed with KRB (glucose 0 mM). Subsequently, 100 μl of KRB (glucose 2.5 mM) was added to the well and incubated for 30 minutes in a CO ₂ incubator. Thereafter, the cells were washed with KRB (glucose 0 mM). After removing KRB in each well, 100 μl of the prepared sample was added to each well and incubated in a 37 ° C. CO ₂ incubator for 2 hours. In addition, LPC was added as a control.
Thereafter, cAMP activity was measured using a kit (Amersham cAMP Biotrak Enzyme immunoassay System RPN 225) (see the following reference).

＜KRBの組成＞
NaCl 119mM
KCl 4.74mM
CaCl₂ 2.54mM
MgCl₂ 1.19mM
KH₂PO₄ 1.19mM
NaHCO₃ 25mM
HEPES(pH 7.4) 10mM NaOHでｐＨを調整
ＢＳＡ 0.05%
＜参考文献＞
A role for intestinal endocrine cell-expressed g protein-coupled receptor 119 inglycemic control by enhancing glucagon-like Peptide-1 and glucose-dependent insulinotropic Peptide release.
Chu ZL, Carroll C, Alfonso J, Gutierrez V, He H, Lucman A, Pedraza M, Mondala H,Gao H, Bagnol D, Chen R, Jones RM, Behan DP, Leonard J.
Endocrinology. 2008 May;149(5):2038-47. <Composition of KRB>
NaCl 119mM
KCl 4.74mM
CaCl ₂ 2.54mM
MgCl ₂ 1.19mM
KH ₂ PO ₄ 1.19mM
NaHCO ₃ 25mM
HEPES (pH 7.4) Adjust pH with 10 mM NaOH BSA 0.05%
<References>
A role for intestinal endocrine cell-expressed g protein-coupled receptor 119 inglycemic control by enhancing glucagon-like Peptide-1 and glucose-dependent insulinotropic Peptide release.
Chu ZL, Carroll C, Alfonso J, Gutierrez V, He H, Lucman A, Pedraza M, Mondala H, Gao H, Bagnol D, Chen R, Jones RM, Behan DP, Leonard J.
Endocrinology. 2008 May; 149 (5): 2038-47.

その結果、図２に示すように、5-HEPEを培地に添加した場合には、ＬＰＣよりも高いｃＡＭＰ産生が検出された。これより、5-HEPEは、細胞のｃＡＭＰ産生促進作用を有することが判った。 As a result, as shown in FIG. 2, when 5-HEPE was added to the medium, cAMP production higher than that of LPC was detected. From this, it was found that 5-HEPE has a cell cAMP production promoting action.

３．インスリン分泌促進作用の測定
5-HEPEについてインスリン分泌促進作用を測定した。具体的な方法は、以下のとおりである。
測定を行う２日前に、マウスすい島細胞由来MIN6細胞を９６wellプレートに1.0×10⁴cell/wellとなるように、播種した。細胞をKRB (グルコース 0mM)でウォッシュし、KRB (グルコース 2.5mM) 100μl加え、37℃ CO₂インキュベーターで30分インキュベートした。続いて、KRB（グルコース 0mM）で細胞を２回ウォッシュした。
各wellのＫＲＢを除去した後に、各濃度の5-HEPEを含むKRB溶液（グルコース濃度は2.8mM（lowGlc）または16.7mM（highGlc））を各wellに200μlずつ添加し、37℃、CO₂インキュベーターで２時間インキュベートした。また、コントロールとしてＬＰＣを添加し、同様にインキュベートした。
続いて、シバヤギレビスインスリン-マウス（Ｈタイプ）のキットを使用し、分泌されたInsulin量を測定した。測定は、キットのプロトコールに従った（下記参照）。 3. Measurement of insulin secretion promoting effect
The insulin secretagogue action of 5-HEPE was measured. The specific method is as follows.
Two days before the measurement, mouse pancreatic islet cell-derived MIN6 cells were seeded on a 96-well plate at 1.0 × 10 ⁴ cells / well. The cells were washed with KRB (glucose 0 mM), 100 μl of KRB (glucose 2.5 mM) was added, and incubated in a 37 ° C. CO ₂ incubator for 30 minutes. Subsequently, the cells were washed twice with KRB (glucose 0 mM).
After removing KRB in each well, add 200 μl of KRB solution (glucose concentration: 2.8 mM (lowGlc) or 16.7 mM (highGlc)) containing 5-HEPE at each concentration to a 37 ° C. CO ₂ incubator. And incubated for 2 hours. Further, LPC was added as a control and incubated in the same manner.
Subsequently, the amount of secreted insulin was measured using a kit of Shibayagi Levis insulin-mouse (H type). The measurement followed the kit protocol (see below).

＜プロトコール＞
ビオチン結合抗インスリン抗体を付属の緩衝液で100倍に希釈・・・（１）
ペルオキシダーゼ・アビジン結合物を付属の緩衝液で100倍に希釈・・・（２）
付属の洗浄液をmillQで10倍に希釈・・・（３）
抗体固相化プレートを（３）で４回ウォッシュ
（１）を100μlずつ加える
サンプル希釈液又はコントロールを10μlずつ分注してよく混ぜる
室温で2時間インキュベート
抗体固相化プレートを（３）で４回ウォッシュ
（２）を100μlずつ分注して、よく混ぜる
室温で３０分インキュベート
抗体固相化プレートを（３）で４回ウォッシュ
発色液を100μlずつ分注して、よく混ぜる
室温で30分インキュベート
反応停止液を100μlずつ分注して、よく混ぜる
マイクロプレートリーダー(450nm)で吸光度測定 <Protocol>
Dilute biotin-conjugated anti-insulin antibody 100 times with attached buffer (1)
Dilute peroxidase-avidin conjugate 100-fold with the supplied buffer (2)
Dilute the supplied cleaning solution 10 times with millQ (3)
Antibody immobilization plate 4 times in (3) Wash (1) 100 μl at a time Add 100 μl of sample dilution or control 10 μl at a time and mix well 2 hours at room temperature Incubate antibody immobilization plate 4 (3) Dispense 100 μl each time of wash (2) and incubate well for 30 minutes at room temperature Incubate antibody-immobilized plate 4 times in (3) and wash well for 30 minutes at room temperature. Dispense 100 μl of reaction stop solution and mix well with a microplate reader (450 nm) to measure absorbance

その結果、図３に示すように、5-HEPEを培地に添加した場合にはグルコース濃度依存的なインスリン分泌量が認められ、その値（１５ｎＭ）もＬＰＣと同程度であった。これより、5-HEPEは、すい島細胞のインスリン分泌促進作用を有することが判った。 As a result, as shown in FIG. 3, when 5-HEPE was added to the medium, a glucose concentration-dependent insulin secretion amount was observed, and the value (15 nM) was also similar to LPC. From this, it was found that 5-HEPE has an action of promoting insulin secretion of islet cells.

４．ＳＤＴラット（糖尿病モデルラット）を用いた糖負荷試験
糖尿病モデルラット（系統名：ＳＤＴ/Ｊｃｌ９週齢 ♂、数量：５匹×３群計１５匹、微生物学的グレード：ＳＰＦ）を用いて、糖負荷試験（ＧＴＴ）を行った。ラットの飼育は以下の条件で行った。 4). Glucose tolerance test using SDT rats (diabetes model rats) Diabetes model rats (strain name: SDT / Jcl 9 weeks old cocoon, quantity: 5 animals x 3 groups, 15 animals in total, microbiological grade: SPF) A glucose tolerance test (GTT) was performed. Rats were raised under the following conditions.

＜条件＞
温度：２０〜２６℃
湿度：４５〜７０％
換気回数：１０〜１５回／時間
照明時間：明７：００〜１９：００、暗１９：００〜７：００
微生物学的グレード：ＳＰＦ
飼育ラック：オープンラック１台（ＭＡＸ３０ケージ）
飼育ケージ：クリーンケージ（２８２×４５１×１５７ｍｍ）
収容匹数：２匹×５ケージ計１０匹
飲水：給水ボトル（２５０ｃｃ）に充填後、高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０分）
給水：給水ボトル１本を週２回
床敷き：プレナーチップ（１２１℃、３０分高圧蒸気滅菌）
ケージ交換：１回／週 <Conditions>
Temperature: 20-26 ° C
Humidity: 45-70%
Ventilation frequency: 10-15 times / hour Lighting time: Bright 7: 00-19: 00, Dark 19: 00-7: 00
Microbiological grade: SPF
Rearing rack: 1 open rack (MAX30 cage)
Rearing cage: Clean cage (282 x 451 x 157 mm)
Accommodates: 2 x 5 cages Total 10: Drinking water: After filling water bottle (250cc), high pressure steam sterilization (121 ° C, 30 minutes)
Water supply: One bottle of water is laid twice a week: Planar chip (121 ° C, 30 minutes high pressure steam sterilization)
Cage exchange: 1 time / week

糖負荷試験は、以下の方法で行った。
まず、5-HEPEの０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液を１％アラビノース含有リン酸緩衝液を用いて調製し、これを糖投与２４時間前および２時間前（計２回）に、１群（５匹）に経口投与（事前投与）した。投与量は、１．５ｍｌ／回／匹であった。また、コントロールとして他の１群（５匹）に１％アラビノース含有リン酸緩衝液を同様に投与し、他の一群（５匹）にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の０．２５ｍｇ／ｍｌ溶液（１％アラビノース含有リン酸緩衝液）を投与した。
糖投与前日より１晩（１７ｈ）絶食した。糖投与は、「大塚糖液50％」（ブドウ糖液）を、２．０ｇ／ｋｇ（体重）腹腔内投与（ＩＰ）した。また、絶食前、絶食後の２回、体重を測定した。
各群のラットの尾から、絶食前、絶食後、糖投与後１５分、３０分、６０分、１２０分の計６回採血し、ロッシュ・ダイアグノスティック製「アキュチェック・アビバ」を用いて血糖値を測定し、各群ごとに各回の平均血糖値を算出した。 The glucose tolerance test was performed by the following method.
First, a 0.25 mg / ml solution of 5-HEPE was prepared using a 1% arabinose-containing phosphate buffer, and this was prepared 24 hours before and 2 hours before sugar administration (2 times in total) in one group (5 animals). ) Was orally administered (preliminary administration). The dose was 1.5 ml / dose / animal. As a control, 1% arabinose-containing phosphate buffer was similarly administered to the other group (5 mice), and the other group (5 mice) had a 0.25 mg / ml solution of eicosapentaenoic acid (EPA) ( 1% arabinose-containing phosphate buffer) was administered.
Fasted overnight (17 h) from the day before sugar administration. For sugar administration, “Otsuka sugar solution 50%” (glucose solution) was intraperitoneally administered (IP) at 2.0 g / kg (body weight). Moreover, the body weight was measured twice before fasting and after fasting.
Blood was collected from the tail of each group of rats before fasting, after fasting, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes after sugar administration, using “Accuchek Aviva” manufactured by Roche Diagnostics. The blood glucose level was measured, and the average blood glucose level was calculated for each group.

その結果、図４に示すとおり、コントロール群では糖投与後１５〜３０分の間に血糖値が急激に上昇したが、5-HEPEを事前投与した群では糖投与後の血糖値の上昇が抑制された。一方で、糖投与前、及び糖投与１２０分経過後には、5-HEPEを事前投与した群でも、コントロール群と同程度の血糖値であった。以上より、5-HEPEは、高血糖時にのみ血糖値の上昇を抑え、低血糖時には血糖値を下げないことが判った。なお、絶食前、絶食後で体重の変化は見られなかった。 As a result, as shown in FIG. 4, in the control group, the blood glucose level rapidly increased between 15 and 30 minutes after the sugar administration, but in the group pre-administered with 5-HEPE, the increase in the blood glucose level after the sugar administration was suppressed. It was done. On the other hand, the blood glucose level of the group pre-administered with 5-HEPE was similar to that of the control group before sugar administration and after 120 minutes of sugar administration. From the above, it was found that 5-HEPE suppresses the increase in blood glucose level only during hyperglycemia and does not lower the blood glucose level during hypoglycemia. There was no change in body weight before and after fasting.

本発明は、糖尿病治療薬、糖尿病食などに応用される。 The present invention is applied to antidiabetic drugs, diabetic foods and the like.

Claims

Insulin secretion promoter containing 5-hydroxy-6E, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z-eicosapentaenoic acid (5-HEPE) as an active ingredient.