JP5947630B2 - 細胞解析装置および解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、正常の細胞とがん化した細胞を正確に識別するための細胞解析装置および解析方法に関するものである。

従来から、病理標本の作成が行われた後に細胞検査士や病理医によって組織切片による病理診断が行われている。標本の作成や、細胞検査士および病理医による診断には熟練した技術が必要であり、さらに、技術の差により診断結果に違いが生じる虞もある。また、組織を摘出してから診断を行うまでには、組織を固定、切片を作成、染色といった手技が必要であり、細胞検査士、病理医等を一定時間拘束することになる。このため、診断までの手技を自動化することが求められている。

また、腫瘍の部位や術式によっては、手術中に摘出した組織が腫瘍であるのか正常組織であるのかを判別することも必要であり、この判別には細胞診断や凍結切片による迅速診断が行われているが、通常の病理診断と比較して、より高度な技術と診断精度が要求される。したがって、術中に摘出した組織が腫瘍（がん細胞）であるのか否かの診断を自動でより客観的に且つ迅速に行う装置が開発されれば、病理医にとって非常に有用である。

そこで、例えば、特許文献１において、単離・細胞核染色された細胞を計測して蛍光強度のヒストグラムを取得し、ヒストグラムのデータから正常細胞よりも蛍光強度の強い領域に分布する強領域細胞数を求め、この強領域細胞数とヒストグラムに基づいてがんの悪性度を判定する細胞解析装置及び細胞解析方法を提案している。

特開２０１２−０４７５９４号公報

上記特許文献１の細胞解析装置及び細胞解析方法によれば、ヒストグラムとその蛍光強度の強い領域に分布する細胞数に基づいてがんの悪性度を判定することができる。しかし、がん化した細胞の認識判定は、さらに迅速かつ高精度であることが求められる。

そこで、本発明は、このような課題を鑑みてなされたものであり、より高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することが可能な細胞解析装置および細胞解析方法の提供を目的とするものである。

上記課題を解決するために、本発明の細胞解析装置は、細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得部と、前記ヒストグラム取得部によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す解析制御手段とを備え、前記解析制御手段は、前記周波数解析の結果に基づいてがん細胞の有無を判定することを特徴とするものである。

また、本発明の細胞解析装置において、前記周波数解析とは、高速フーリエ変換であることが好ましい。

また、本発明の細胞解析装置において、前記解析制御手段は、前記周波数解析の結果から得られた波形の曲線下面積（ＡＵＣ）を、所定の閾値と比較することによって前記がん細胞の有無を判定することが好ましい。

また、本発明の細胞解析装置において、前記解析制御手段は、前記周波数解析によって得られた波形が、空間周波数において振動しているか否かによって前記がん細胞の有無を判定することが好ましい。

また、本発明の細胞解析装置において、前記解析制御手段は、前記周波数解析によって得られた波形が、空間周波数の低い領域において周波数の高い方向に急速減衰するか否かによって前記がん細胞の有無を判定することが好ましい。

また、本発明の細胞解析装置において、前記解析制御手段は、前記周波数解析の結果から得られた波形の曲線下面積と所定の閾値との比較、空間周波数における振動の有無、空間周波数の低い領域における周波数の高い方向への急速減衰の有無を総合的に判断して、前記がん細胞の有無を判定することが好ましい。

また、本発明の細胞解析装置において、前記所定の閾値とは、生体の正常な細胞から得られた前記曲線下面積の値であることが好ましい。

また、本発明の細胞解析方法において、細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得工程と、前記ヒストグラム取得工程によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す周波数解析工程と、前記周波数解析の結果に基づいてがん細胞の有無を判定する判定工程とを有することを特徴とするものである。

また、本発明の細胞解析方法において、前記周波数解析とは、高速フーリエ変換であることが好ましい。

本発明によれば、染色された正常細胞およびがん細胞の蛍光強度を示すヒストグラムに対して周波数解析を施しその解析結果に基づいてがん細胞有無の判断を行っているので、正常細胞とがん細胞との差異が明確になって、より高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することができる。

本発明に係る細胞解析装置の一実施形態を含む細胞解析システムの構成図である。 細胞単離器具の一例を示す分解斜視図である。 フローサイトメータによる蛍光強度のヒストグラムの一例を示す図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）はヒストグラムを周波数解析した図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）はヒストグラムを周波数解析した図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）はヒストグラムを周波数解析した図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）は（ａ）の縦軸細胞数を規格化したものを示し、（ｃ）は（ｂ）のヒストグラムを周波数解析した図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）は（ａ）の縦軸細胞数を規格化したものを示し、（ｃ）は（ｂ）のヒストグラムを周波数解析した図である。 がん細胞の解析処理結果の一例を示すものであり、（ａ）はヒストグラムを示し、（ｂ）は（ａ）の縦軸細胞数を規格化したものを示し、（ｃ）は（ｂ）のヒストグラムを周波数解析した図である。 （ａ）はＦＦＴパターンのＡＵＣ（曲線下面積）とＲｉｐｐｌｅ（振動）の測定データを示した表であり、（ｂ）は（ａ）のデータに基づく診断結果を示した表である。

以下、本発明に係る細胞解析装置および細胞解析方法の実施形態を添付図面に基づいて説明する。
図１は、細胞の解析を行うための細胞解析システム１を示す。細胞解析システム１は、細胞解析装置２と、細胞前処理装置３と、細胞前処理装置３にセットされる細胞単離器具４（図２参照）を備えている。細胞解析装置２は、フローサイトメータ５と、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）６を備えている。

細胞単離器具４は、解析の対象である組織が注入される筒状容器である。細胞単離器具４は、試薬を入れる容器３０に挿入された状態で細胞前処理装置３にセットされる。また、細胞前処理装置３は、ノズルによって細胞処理薬とリン酸緩衝液と組織を細胞単離器具４に出し入れするピペッティングの処理を行う装置である。

フローサイトメータ５（ヒストグラム取得部の一例）は、フローサイトメトリ（Flow Cytometry）に用いられる装置である。フローサイトメトリとは、微細な粒子を流体中に分散させ、その流体（懸濁液）を流して個々の粒子を光学的に分析する手法のことをいう。微粒子を選択的に回収することもできる。この形態においてフローサイトメータ５は、細胞核染色された細胞の数を計測しその結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得する。

ＰＣ６は、フローサイトメータ５によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す装置である。以下、ＰＣ６のことを解析制御手段６ともいう。ここで、周波数解析とは、例えば、ＦＦＴ（高速フーリエ変換：Fast Fourier Transform）、ＭＥＭ（最大エントロピー法：Maximum Entropy Method）、ＡＲ（自己回帰：Auto Regressive）モデル、ＡＲＭＡ（自己回帰−移動平均：Auto Regressive−Moving Average）モデル、ＳＴＦＴ（短時間フーリエ変換：Short Time Fourier Transform）、Wavelet変換、Wigner分布等のことをいう。
なお、フローサイトメータ５とＰＣ６とは、それぞれ別の装置とせずにフローサイトメータ５にＰＣ６の機能を持たせる構成としてもよい。

図２は、細胞単離器具４を分解した状態を示す図である。細胞単離器具４は、ピペット部材２０と、容器３０を備えて構成されている。何れも細胞毒性のない樹脂材料等により形成されている。

ピペット部材２０は、本体２１と、フィルタ２２（濾過部材）と、蓋体２３を備えている。

本体２１は、先端部２１ａが先細り形状とされた中空の円筒状部材である。本体２１の先端（下端）には開口２１ｂが形成され、上端面２１ｃには開口２１ｄが形成されている。開口２１ｂと開口２１ｄは、本体２１の内部に形成された通路によって連通されている。

本体２１の上端部には、保持部材２５が設けられている。保持部材２５は大径部２５ａと小径部２５ｂを有し、大径部２５ａと小径部２５ｂの境界には段部２５ｃが画成されている。大径部２５ａは上端面２１ｃを含んでいる。

フィルタ２２は、細胞毒性のない材料により形成され、単離された細胞（裸核化された細胞）を含む液体が通過可能な程度の目開きを有する。本実施形態では、フィルタ２２として目開き５０μｍのナイロンメッシュが用いられ、蓋体２３の下端面の開口２３ｅを覆うように蓋体２３に接着または溶着されている。

蓋体２３は、大径部２３ａと小径部２３ｂを有する円筒状の部材であり、大径部２３ａと小径部２３ｂの境界には段部２３ｃが画成されている。大径部２３ａを含む上端面には開口２３ｄが形成され、小径部２３ｂを含む下端面には開口２３ｅが形成されている。開口２３ｄと開口２３ｅは、蓋体２３の内部に形成された通路により連通されている。

フィルタ２２および蓋体２３の小径部２３ｂが、開口２１ｄに挿入されて本体２１に装着される。蓋体２３の段部２３ｃは、本体２１の上端面２１ｃに接着または溶着される。この状態において、本体２１の通路と蓋体２３の通路とがフィルタ２２を介して連通する。

容器３０は、上端面３０ａに開口３０ｂを有し、下端部が丸底の円筒状の部材である。容器３０は透明であり、中空の内部空間３０ｃが視認可能とされている。内部空間３０ｃは開口３０ｂに連通している。

組織および細胞処理液を内部空間３０ｃに収容した容器３０にピペット部材２０が装着される。容器３０の上端面３０ａが保持部材２５の段部２５ｃに当接するまで、ピペット部材２０の本体２１が容器３０の開口３０ｂから内部空間３０ｃへ挿入される。本体２１の先端（開口２１ｂ）は、容器３０の中心軸Ｃ１上に配置され、内部空間３０ｃの底と一定の間隔をおいて対向する。本体２１の先端と内部空間３０ｃの底との間には、投入された組織が位置する。本体２１の先端部２１ａは、投入された細胞処理液に浸かった状態になる。

界面活性剤、ＲＮＡ（リボ核酸）除去剤、および蛍光染料色素を含んだ試薬３１が、乾燥あるいは凍結乾燥された状態で内部空間３０ｃの底に収容されている。細胞単離処理に供される組織および細胞処理液（液体）を内部空間３０ｃに投入すると、試薬３１が細胞処理液中に溶解する。細胞処理液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）等の浸透圧が生体と同じであるものが望ましい。後述する撹拌による細胞単離処理と並行して、界面活性剤による組織細胞の裸核化、ＲＮＡ除去剤によるＲＮＡ除去、および蛍光染料色素による裸核化されたＤＮＡ細胞核の染色を遂行することができる。これにより細胞前処理装置３に回収された後、フローサイトメータ５等による測定が可能な状態になり、迅速な診断を実現できる。

次に、以上のように構成された細胞単離器具４を用い、細胞前処理装置３によって行う細胞単離処理の内容について以下に説明する。

先ず、細胞前処理装置３に設けられた上下にスライドする蓋１２を開けて、容器３０の底部を位置決孔１３に挿入して容器３０を支持するとともに、細胞単離器具４の上端部を細胞前処理装置３が備えるノズル１４の下端部に接続する。具体的には、ノズル１４内の通路と蓋体２３内の通路とが、適宜の係合構造を介して気密液密的に連通される。細胞前処理装置３の蓋１２を閉めると、以下のような手順で細胞の単離処理の動作が開始される。

詳細は図示を省略するが、細胞前処理装置３はノズル１４に接続されたポンプ機構を備えている。続いて、細胞前処理装置３の制御部は、ユーザによって設定された撹拌条件（撹拌強さ、繰り返し回数、継続時間等）に基づいてポンプ機構を制御し、加圧状態と減圧状態とを形成する。加圧状態においては、ノズル１４から空気が吹き出し、減圧状態においては、ノズル１４から空気が吸入される。

加圧状態と減圧状態を繰り返すピペッティング処理により、ノズル１４に接続されたピペット部材２０を通じて容器３０内の組織および細胞処理液（試薬３１を含む）を撹拌することができる。

細胞前処理装置３が減圧状態を形成している状態では、ピペット部材２０には所定の吸引力が作用し、容器３０内の細胞処理液はピペット部材２０に吸い上げられる。細胞処理液の一部は通路を上昇し、組織はピペット部材２０の先端（開口２１ｂ）に吸着される。このとき、ピペット部材２０の先端との衝突によって組織の一部が粉砕される。

細胞前処理装置３が加圧状態を形成している状態では、ピペット部材２０には所定の圧力が加わり、通路内の細胞処理液は開口２１ｂから噴射されて容器３０の内部空間３０ｃに戻される。このとき開口２１ｂに吸着していた組織は、噴射の衝撃で組織の一部を粉砕されつつ細胞処理液内に戻される。

上記の吸い込みと噴き出しを繰り返し行なうことにより、組織は次第に細かく粉砕され、ミンスされた状態になる。一定時間の撹拌処理を行なうことにより、単離された細胞を含んだ懸濁液を得ることができる。この処理において、細胞の核を壊しその中の染色体を蛍光に反応するように色付けする。蛍光色素はＤＮＡの二重螺旋の中に入り込むためＤＮＡの大きさによって入り込む色素の量が異なる。通常、がん細胞の染色体は正常細胞の染色体よりも大きいため、色付け処理によって含まれる色素の量はがん細胞の方が多くなる。

単離された細胞は病理解析に供されるが、懸濁液中には単離細胞以外にもミンスされた不要な組織片が浮遊している。したがって、単離された細胞のみを解析に供するために、単離細胞よりも大きな組織片を濾過する工程が必要となる。そこで、細胞前処理装置３は、細胞単離器具４をノズル１４に接続したまま、撹拌処理時に作用させた吸引力よりも大きな吸引力をピペット部材２０に作用させる。

これにより容器３０内の懸濁液は、ピペット部材２０に吸い込まれて通路内を上昇する。細胞前処理装置３が吸引を継続すると、懸濁液はフィルタ２２に到達する。懸濁液がフィルタ２２を通過することによって不要な組織片が濾過され、所望の単離細胞を含む細胞浮遊液が得られる。さらに吸引動作を継続することにより、細胞浮遊液が細胞前処理装置３に回収され、フローサイトメータ５による蛍光分析等の解析処理に供される。

次に、フローサイトメータ５によって処理される、蛍光強度を示すヒストグラムの取得（ヒストグラム取得工程）について以下に説明する。
フローサイトメータ５は、細胞浮遊液を用いて、単離・細胞核染色された細胞を計測し、イベント毎の蛍光信号のピーク値と積分値とから関連する変量の関係を平面上に表示したスキャッタグラム（図示省略）を得る。このスキャッタグラムに適切なゲート処理を施し、シングル細胞と思われるイベントから蛍光強度の積分値のヒストグラムを得る。このヒストグラムは、ＰＣ６の表示部（例えば、ＬＣＤ）に表示される。このように、フローサイトメータ５は、細胞核染色された細胞（細胞数）を計測する計測部及び当該計測部の計測結果を用いて蛍光強度のヒストグラムを取得するヒストグラム取得部として機能する。

図３に、取得されたヒストグラムの一例を示す。フローサイトメータ５に細胞浮遊液を流し、それにレーザ光を当てる。各細胞は色付け処理によって蛍光色素を含んでいるのでそれぞれ光の吸収率が相違し、レーザ光に対する蛍光強度が相違している。ヒストグラムの横軸は、蛍光強度、すなわちＤＮＡに含まれる色素の量、つまりＤＮＡの大きさを示しており、正常のＤＮＡが幾つ含まれているか、またがん化したＤＮＡが幾つ含まれているかによってヒストグラムの波形が相違してくる。

図３において、Ｐ１は、Ｇ０／Ｇ１期細胞群によるピークであり、Ｐ２はＤＮＡ量が正常とは異なる腫瘍細胞を指すＤＮＡ Aneuploidyの細胞群によるピークであり、Ｐ３はＧ２／Ｍ期細胞群によるピークである。フローサイトメータ５により得られた蛍光強度のヒストグラムに係るデータは、細胞解析装置２を構成するＰＣ（解析制御手段）６へ送信される。

次に、解析制御手段６によって処理される周波数解析（周波数解析工程）およびがん細胞の判定（判定工程）について以下に説明する。
解析制御手段６は、フローサイトメータ５によって取得されたヒストグラムのデータを周波数解析する機能を有している。そして、解析制御手段６は、周波数解析の結果に基づいて、解析対象の組織にがん細胞が含まれているか否かを判定するがん細胞判定処理を行なう機能を有している。

図４から図６に、がん化した細胞の特徴的な３タイプ（アニュプロイディ（Aneuploidy）、スプレッド（Spread）、アティピカル（Atypical））のヒストグラムを示す。各図において上段の（ａ）図がヒストグラム表示であり、下段の（ｂ）図が各ヒストグラムを周波数解析した波形を示している。なお、ここでは周波数解析として高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を施している。

まず、図４は、（ａ）図において、ライン４１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン４２が、がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラムである。がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラム４２には、２つのピークが現れており、その内の一つがＧ２／Ｍ期に現れている。測定サンプル数は正常（Normal）細胞およびがん（Cancer）細胞ともに１０００個であった。なお、図４から図６においては、正常細胞とがん細胞の特性の比較、および各図同士間の比較を容易にするため縦軸のレンジを規格化して同一にしている。

また、図４（ｂ）において、ライン４３が、正常細胞のヒストグラム４１をＦＦＴ処理したものであり、ライン４４が、がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラム４２をＦＦＴ処理したものである。ライン４４のＦＦＴパターンには、明らかな複数の振動（Ripple）が現れている。また、ライン４３とライン４４のＡＵＣ（曲線下面積：Area Under the Curve）を比較すると、５２（Normal AUC）と３５（Aneuploidy AUC）であり、がん（Aneuploidy）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。

続いて、図５は、（ａ）図において、ライン５１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン５２が、がん（Spread）細胞のヒストグラムである。がん（Spread）細胞のヒストグラム５２には、Ｓ期に比較的多くの細胞が現れている。測定サンプル数は正常（Normal）細胞が１０００個、がん（Cancer）細胞が１７３８個であった。なお、図４と同様に縦軸のレンジは規格化して同一にしている。

また、図５（ｂ）において、ライン５３が、正常細胞のヒストグラム５１をＦＦＴ処理したものであり、ライン５４が、がん（Spread）細胞のヒストグラム５２をＦＦＴ処理したものである。ライン５４のＦＦＴパターンには、低い空間周波数（図の左側）において周波数の高い方向への急速減衰５５が現れている。また、ライン５３とライン５４のＡＵＣを比較すると、５２（Normal AUC）と２９（Spread AUC）であり、がん（Spread）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。

続いて、図６は、（ａ）図において、ライン６１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン６２が、がん（Atypical）細胞のヒストグラムである。がん（Atypical）細胞のヒストグラム６２には、Ｇ０／Ｇ１期にピークが現れている。ただし、このピークの形状はDiploidyのヒストグラムとは相違する形状を有している。測定サンプル数は正常（Normal）細胞が１０００個、がん（Cancer）細胞が２０００個であった。なお、図４と同様に縦軸のレンジは規格化して同一にしている。

また、図６（ｂ）において、ライン６３が、正常細胞のヒストグラム６１をＦＦＴ処理したものであり、ライン６４が、がん（Atypical）細胞のヒストグラム６２をＦＦＴ処理したものである。ライン６３とライン６４のＡＵＣを比較すると、５２（Normal AUC）と２６（Atypical AUC）であり、がん（Atypical）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。

次に、進行結腸直腸がんの患者（２６人）から治療のため摘出した組織について、本発明に係る細胞解析方法によって行った細胞解析の結果を以下に示す。

図７から図９は、細胞解析を行った２６サンプルの中の、上述した特徴的３タイプ（Aneuploidy、Spread、Atypical）のヒストグラムとＦＦＴパターンを示す。各図において上段の（ａ）図が、正常細胞（上側）とがん細胞（下側）のヒストグラムを示し、中段の（ｂ）図が、（ａ）図のヒストグラムを縦軸に関して規格化したヒストグラムを示し、下段の（ｃ）図が、各ヒストグラムをＦＦＴ処理したものを示している。

まず、図７は、Aneuploidy型のがん患者から摘出した組織の細胞解析結果である。（ａ）図において、ライン７１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン７２が、がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラムである。横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をとっている。（ｂ）図は、（ａ）図に示される２つのヒストグラムを同一のグラフ上に表示したものであり、ライン７３が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン７４が、がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラムである。なお、容易に比較可能とするために縦軸の細胞数を規格化して統一した。（ｃ）図は、（ｂ）図に示されるヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものであり、ライン７５が、正常細胞のＦＦＴパターンであり、ライン７６が、がん（Aneuploidy）細胞のＦＦＴパターンである。

（ｂ）図に示されるように、がん（Aneuploidy）細胞のヒストグラム７４には、２つのピークが現れており、これをＦＦＴ処理したＦＦＴパターン７６（（ｃ）図）には、空間周波数において明らかな複数の振動（Ripple）が現れている。また、ＦＦＴパターン７５と７６のＡＵＣ（曲線下面積）は、２８（Normal AUC）と２１（Aneuploidy AUC）であり、がん（Aneuploidy）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。このように、ヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものを比較すると、ＦＦＴのパターンとそのＡＵＣにおいて顕著な相違が現れる。

続いて、図８は、Spread型のがん患者から摘出した組織の細胞解析結果である。（ａ）図において、ライン８１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン８２が、がん（Spread）細胞のヒストグラムである。（ｂ）図は、（ａ）図に示される２つのヒストグラムを同一のグラフ上に表示したものであり、ライン８３が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン８４が、がん（Spread）細胞のヒストグラムである。（ｃ）図は、（ｂ）図に示されるヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものであり、ライン８５が、正常細胞のＦＦＴパターンであり、ライン８６が、がん（Spread）細胞のＦＦＴパターンである。

（ｃ）図に示されるように、がん（Spread）細胞のヒストグラム８４をＦＦＴ処理したＦＦＴパターン８６には、低い空間周波数の領域（グラフ左側）において周波数の高い方向への急速減衰８７（破線内）が現れている。また、ＦＦＴパターン８５と８６のＡＵＣは、２４（Normal AUC）と２１（Spread AUC）であり、がん（Spread）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。このように、ヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものを比較すると、ＦＦＴのパターンとそのＡＵＣにおいて顕著な相違が現れる。

続いて、図９は、Atypical型のがん患者から摘出した組織の細胞解析結果である。（ａ）図において、ライン９１が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン９２が、がん（Atypical）細胞のヒストグラムである。（ｂ）図は、（ａ）図に示される２つのヒストグラムを同一のグラフ上に表示したものであり、ライン９３が、正常細胞のヒストグラムであり、ライン９４が、がん（Atypical）細胞のヒストグラムである。（ｃ）図は、（ｂ）図に示されるヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものであり、ライン９５が、正常細胞のＦＦＴパターンであり、ライン９６が、がん（Atypical）細胞のＦＦＴパターンである。

（ｃ）図に示されるように、ＦＦＴパターン９５と９６のＡＵＣは、２９（Normal AUC）と１７（Atypical AUC）であり、がん（Atypical）細胞のＡＵＣの方が小さい値を示している。このように、ヒストグラムにＦＦＴ処理を施したものを比較すると、ＦＦＴパターンのＡＵＣにおいて顕著な相違が現れる。

図１０（ａ）および（ｂ）は、上記結腸直腸がんの患者（２６人）についてのＦＦＴパターンのＡＵＣ（曲線下面積）とＲｉｐｐｌｅ（振動）の測定データおよびそのデータに基づく診断結果を示した表である。

図１０（ａ）において、１列目のCase１〜２６は患者（２６人）を示している。２列目のAUC Normalは患者（生体）から摘出した組織について正常細胞のヒストグラムをＦＦＴ処理したＦＦＴパターンの曲線下面積を示し、３列目のAUC Cancerは生体から摘出した組織についてがん細胞のヒストグラムをＦＦＴ処理したＦＦＴパターンの曲線下面積を示している。４列目のRipple Normalは正常細胞のヒストグラムをＦＦＴ処理したＦＦＴパターンが振動しているかを、５列目のRipple Cancerはがん細胞のヒストグラムをＦＦＴ処理したＦＦＴパターンが振動しているかを示している。

２列目のAUC Normalに示されるように、正常細胞のＡＵＣの最大値（max）は５３であり、最小値（min）は１５であった。また、３列目のAUC Cancerに示されるように、がん細胞のＡＵＣの最大値（max）は３２であり、最小値（min）は１０であった。これらの結果から、測定した細胞のＡＵＣが、正常細胞のＡＵＣの最小値である１５よりも小さい値を示した場合には、その細胞はがん細胞であると判定した。また、測定した細胞のＡＵＣが、がん細胞のＡＵＣの最大値である３２よりも大きい値を示した場合には、その細胞は正常細胞であると判定した。なお、正常細胞のＡＵＣの最小値１５、がん細胞のＡＵＣの最大値３２は、請求の範囲に記載した所定の閾値の一例である。

そして、このＡＵＣ値による判定結果を４列目および５列目のRipple Normal およびRipple Cancerの欄において、正常細胞である診断を“−”と表記し、がん細胞である診断を“Ｖ”と表記した。４列目のRipple Normalの欄においてCase2、4、5、7、9、12、13、15、17〜23が“−”である。すなわち、１５／２６についてはＡＵＣ値による診断によって正常細胞であると判定できる。また、５列目のRipple Cancerの欄においてCase10〜12、25、26が“Ｖ”である。すなわち、５／２６についてはＡＵＣ値による診断によってがん細胞であると判定できる。

続いて、ＦＦＴパターンの曲線下面積が１５≦ＡＵＣ≦３２のCaseについては、ＡＵＣのみでは判定できないためＦＦＴパターンの振動（Ripple）の有無によって以下のように判定する。すなわち、ＦＦＴパターンの曲線下面積とＦＦＴパターンの振動（Ripple）の有無とを組み合わせて総合的にがん細胞か否かを判断する。

４列目のRipple Normalの欄において１５≦ＡＵＣ≦３２に含まれるのは、Case1、3、6、8、10、11、14、16、24〜26の１１のCaseである。また、５列目のRipple Cancerの欄において１５≦ＡＵＣ≦３２に含まれるのは、Case1〜9、13〜24の２１のCaseである。このうち、ＦＦＴパターンに振動（Ripple）が無いものは“○”と表記し、ＦＦＴパターンに振動（Ripple）が１つ有るものは“１”と表記し、ＦＦＴパターンに振動（Ripple）が多数有るものは“×”と表記した。

４列目のRipple Normalの欄においてCase3、6、8、24、25が“○”（５／２６）であり、Case1、10、11、14、16が“１”（５／２６）であり、Case26が“×”（１／２６）であった。また、５列目のRipple Cancerの欄においてCase4、14が“○”（２／２６）であり、Case6、17、18、20が“１”（４／２６）であり、Case1〜3、5、7〜9、13、15、16、19、21〜24が“×”（１５／２６）であった。

図１０（ｂ）において、Case1〜26の上記判定に基づく診断結果を正しい（TRUE）、誤り（ERROR）、未最終診断（Suspicion）の３区分に分類する。

（ａ）図の４列目および５列目のRipple Normal およびRipple Cancerの表記において、“−”と“○”を正常、“１”をがんの疑い有り、“Ｖ”と“×”をがんと診断すると、生体（２６人）から摘出した正常細胞に対しては、２０／２６を正しい（TRUE）、１／２６を誤り（ERROR）、５／２６を未最終診断（Suspicion）という診断結果を得ることができた。また、生体（２６人）から摘出したがん細胞に対しては、２０／２６を正しい（TRUE）、２／２６を誤り（ERROR）、４／２６を未最終診断（Suspicion）という診断結果を得ることができた。すなわち、正常細胞に対しては１／２６（３．８％）の確率でがん細胞であると診断することが確かめられた。また、がん細胞に対しては２／２６（７．７％）の確率で正常細胞であると診断することが確かめられた。

以上のことから、本発明の細胞診断装置およびその診断方法は以下の作用効果を有する。
染色された正常細胞およびがん細胞の蛍光強度を示すヒストグラムに対して周波数解析（ＦＦＴ処理）を施し正常細胞とがん細胞の差異・特徴をＦＦＴパターンによって明確にする。本発明は、この解析結果に基づいてがん細胞の有無の判断を行っているので、確実で高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することができる。これにより摘出した組織から細胞の分離とその染色に約６分、染色した細胞からヒストグラムおよびそのＦＦＴパターンを取得するのに約４分、すなわち僅か約１０分でがん細胞の有無を判断することができる。

摂取されたがん細胞の種類によってヒストグラムの波形の現れ方が相違する（Aneuploidy型、Spread型、Atypical型）。ヒストグラムにＦＦＴをかけることにより、その特徴が顕著に現れる。したがって、本発明は、ヒストグラムを周波数解析し、その結果から得られた波形の曲線下面積（ＡＵＣ）を所定の閾値（例えば、正常細胞から取得したＡＵＣ値）と比較してがん細胞の有無を判定しているので、より確実で高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することができる。

また、ヒストグラムを周波数解析して得られた波形が、空間周波数において振動しているか否かによってがん細胞の有無を判定しているので、さらに確実で高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することができる。例えば、Aneuploidy型のがん細胞をより明確に診断することが可能になる。

また、ヒストグラムを周波数解析して得られた波形が、空間周波数の低い領域において周波数の高い方向への急速減衰を有しているか否かによってがん細胞の有無を判定しているので、さらに確実で高精度かつ迅速にがん化した細胞を識別することができる。例えば、Spread型、Atypical型のがん細胞をより明確に診断することが可能になる。

なお、図１０の例では、ＦＦＴパターンの曲線下面積の大小とＦＦＴパターンの振動（Ripple）の有無とを組み合わせて総合的にがん細胞か否かを判断したが、さらに、ＦＦＴパターンの低い空間周波数の領域における周波数の高い方向への急速減衰の有無も含めて総合的に、がん細胞であるか否かを診断することで、診断の精度を向上させることが可能となる。

また、本発明によるヒストグラムおよびその周波数解析結果に基づく判定方法は、これまでに取得した解析サンプルデータに基づいて新たな患者の診断を行うことが可能であるため、新たに正常細胞を切除摘出することなく解析対象の組織にがん細胞が含まれているか否かを迅速かつ正確に識別することが可能になる。そして、この細胞解析は、乳がん、リンパ節、胆管、線種等に応用することも可能である。

１：細胞解析システム、２：細胞解析装置、３：細胞前処理装置、４：細胞単離器具、５：フローサイトメータ、６：ＰＣ（解析制御手段）、２０：容器、２１：筒体、３１：底蓋部

Claims (8)

1. 細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得部と、
   前記ヒストグラム取得部によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す解析制御手段と、
   を備え、
   前記解析制御手段は、前記周波数解析の結果から得られた波形の曲線下面積を、所定の閾値と比較することによって前記がん細胞の有無を判定することを特徴とする細胞解析装置。
2. 細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得部と、
   前記ヒストグラム取得部によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す解析制御手段と、
   を備え、
   前記解析制御手段は、前記周波数解析によって得られた波形が、空間周波数において振動しているか否かによって前記がん細胞の有無を判定することを特徴とする細胞解析装置。
3. 細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得部と、
   前記ヒストグラム取得部によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す解析制御手段と、
   を備え、
   前記解析制御手段は、前記周波数解析によって得られた波形が、空間周波数の低い領域において周波数の高い方向に急速減衰するか否かによって前記がん細胞の有無を判定することを特徴とする細胞解析装置。
4. 細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得部と、
   前記ヒストグラム取得部によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す解析制御手段と、
   を備え、
   前記解析制御手段は、前記周波数解析の結果から得られた波形の曲線下面積と所定の閾値との比較、空間周波数における振動の有無、空間周波数の低い領域における周波数の高い方向への急速減衰の有無を総合的に判断して、前記がん細胞の有無を判定することを特徴とする細胞解析装置。
5. 前記周波数解析とは、高速フーリエ変換であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の細胞解析装置。
6. 前記所定の閾値とは、生体の正常な細胞から得られた前記曲線下面積の値であることを特徴とする請求項１に記載の細胞解析装置。
7. 細胞核染色された細胞数を計測し、当該計測の結果を用いて蛍光強度を示すヒストグラムを取得するヒストグラム取得工程と、
   前記ヒストグラム取得工程によって取得されたヒストグラムのデータに対して周波数解析を施す周波数解析工程と、
   前記周波数解析の結果に基づいてがん細胞の有無を判定する判定工程と、
   を有し、
   前記判定工程では、前記周波数解析の結果から得られた波形の曲線下面積を、所定の閾値と比較することによって前記がん細胞の有無を判定することを特徴とする細胞解析方法。
8. 前記周波数解析とは、高速フーリエ変換であることを特徴とする請求項７に記載の細胞解析方法。

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