JP5936223B2 - Testing for exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease - Google Patents
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Description
本発明は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)増悪感受性の検査法に関する。 The present invention relates to a test method for susceptibility to exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).
慢性閉塞性肺疾患(COPD)とは、タバコ煙を主とする有害物質を長期に吸入曝露することで生じる肺の炎症性疾患である。この疾患の患者は、呼吸機能検査で正常に復すことのない気流閉塞を示す。気流閉塞は末梢気道病変と気腫性病変が様々な割合で複合的に作用することにより起こり、進行性である(日本呼吸器学会ガイドライン、2009)。COPDは2020年には全世界の死亡原因の第三位を占めると予測されている(WHO World Health Statistics, 2008)。COPDの増悪とは、COPDを発症した患者において、呼吸困難、咳、喀痰などの症状が日常の生理的変動を超えて急激に悪化し、安定期の治療内容の変更を要する状態をいう(日本呼吸器学会ガイドライン、2009)。COPD患者が入院治療を必要とする場合、そのほとんどは急性増悪が原因であると考えられている。 Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is an inflammatory disease of the lungs caused by long-term inhalation exposure to harmful substances, mainly tobacco smoke. Patients with this disease exhibit airflow obstruction that does not return to normal on a respiratory function test. Airflow obstruction is caused by the combined action of peripheral airway lesions and emphysematous lesions in various proportions and is progressive (Japan Respiratory Society Guidelines, 2009). COPD is predicted to be the third leading cause of death worldwide by 2020 (WHO World Health Statistics, 2008). COPD exacerbation is a condition in which patients with COPD develop symptoms such as dyspnea, cough, and sputum that suddenly worsen beyond normal physiological fluctuations and require changes in treatment during the stable period (Japan) Respiratory Society Guidelines, 2009). Most patients with COPD need in-patient treatment are thought to be caused by acute exacerbations.
COPDの増悪感受性と関連する遺伝的多型はいくつか報告されている(非特許文献1〜3)が、その遺伝的多型のCOPDの増悪の予防と治療における診断的価値は確立されていない。これらの遺伝的多型は当該遺伝子がコードするタンパク質の質的又は量的な変動をもたらすが、欠損を来すものではないため増悪の指標としては利用しづらく、これらの遺伝的多型と増悪との相関をもとに臨床的に有用な検査法を生み出すには至っていない。
Several genetic polymorphisms associated with COPD exacerbation susceptibility have been reported (Non-Patent
シグレック14(Siglec-14)は自然免疫系の細胞(顆粒球、単球など)に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質である(非特許文献4及び特許文献1)。シグレック14は細胞外領域でシアル酸を含む糖鎖を認識し、膜貫通領域でアダプタータンパク質DAP12と会合する(非特許文献4)。またシグレック14は免疫細胞の活性化に関わることも報告されている(特許文献2の図3A、非特許文献5)。シグレック14とシグレック5(Siglec-5)の1〜2番目の免疫グロブリン様ドメインは互いに99%以上のアミノ酸配列相同性を示すことが知られている(非特許文献4)。一方、遺伝的多型によりシグレック14を発現しないヒト個体が比較的高い頻度で存在する(非特許文献5)。この遺伝的多型は、シグレック14遺伝子(SIGLEC14)由来の5'部分と、当該遺伝子に隣接するシグレック5遺伝子(SIGLEC5)由来の3'部分とからなる融合遺伝子シグレック14/5(SIGLEC14/5)(そのタンパク質産物のアミノ酸配列はシグレック5と同一である)が形成され、シグレック14タンパク質をコードする配列領域が失われたものである。この遺伝子多型をホモ接合性で有するヒト個体はシグレック14を発現しない。このような遺伝子多型を検出できる検出用試薬も開発されている(特許文献2)。
Siglec-14 (Siglec-14) is a membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily expressed in cells (granulocytes, monocytes, etc.) of the innate immune system (Non-patent Document 4 and Patent Document 1). Siglec 14 recognizes sugar chains containing sialic acid in the extracellular region and associates with adapter protein DAP12 in the transmembrane region (Non-patent Document 4). Siglec 14 has also been reported to be involved in immune cell activation (FIG. 3A of
シグレック14に対するアロ抗体が輸血副作用に関連する可能性が示唆されている(特許文献2、非特許文献6)。しかし、シグレック14の生体における機能は明らかではなく、その発現の有無とヒトの疾患との明確な関連性は知られていない。
It has been suggested that alloantibodies against Siglec 14 may be related to transfusion side effects (
本発明は、COPD増悪感受性の検査法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a test method for COPD exacerbation sensitivity.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、シグレック14の遺伝子型がCOPD増悪感受性と強く相関することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the genotype of Siglec 14 strongly correlates with COPD exacerbation susceptibility, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] ヒト被験体由来の生物学的試料を用いて該被験体のシグレック14の遺伝子型を決定し、慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性の指標とすることを含む、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性を検査する方法。
[2] 前記生物学的試料が、血液由来試料である、上記[1]の方法。
[3] 前記生物学的試料中のシグレック14タンパク質を検出することにより、シグレック14の遺伝子型を決定する、上記[1]又は[2]の方法。
[4] 血液由来試料中の可溶性シグレック14タンパク質を検出することにより、シグレック14の遺伝子型を決定する、上記[2]の方法。
[5] 前記生物学的試料中のゲノムDNA配列に基づいて、シグレック14の遺伝子型を決定する、上記[1]又は[2]の方法。
[6] 決定されたシグレック14の遺伝子型の野生型アレルの数を、増悪感受性の指標とする、上記[1]〜[5]の方法。
[7] 前記ヒト被験体が慢性閉塞性肺疾患を発症した患者である、上記[1]〜[6]の方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] Chronic occlusion in a human subject, comprising determining a siglec 14 genotype of the subject using a biological sample derived from a human subject and providing an index of exacerbation susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease To test the exacerbation susceptibility of congenital lung disease.
[2] The method according to [1] above, wherein the biological sample is a blood-derived sample.
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the genotype of Siglec 14 is determined by detecting Siglec 14 protein in the biological sample.
[4] The method of [2] above, wherein the genotype of Siglec 14 is determined by detecting soluble Siglec 14 protein in a blood-derived sample.
[5] The method according to [1] or [2] above, wherein the genotype of Siglec 14 is determined based on a genomic DNA sequence in the biological sample.
[6] The method of [1] to [5] above, wherein the determined number of wild-type alleles of siglec 14 genotype is used as an index of exacerbation sensitivity.
[7] The method of [1] to [6] above, wherein the human subject is a patient who has developed chronic obstructive pulmonary disease.
本発明の方法を用いればCOPD患者の増悪感受性を早期に検査することができる。 If the method of this invention is used, the exacerbation sensitivity of a COPD patient can be test | inspected at an early stage.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の増悪感受性と強く相関する遺伝的マーカー及び血清マーカーを検出することにより、増悪感受性に基づく患者の層別化を可能とする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, by detecting genetic markers and serum markers that are strongly correlated with exacerbation susceptibility of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), it is possible to stratify patients based on exacerbation susceptibility.
本発明は、被験体(好ましくはヒト被験体)のシグレック14の遺伝子型を指標としてその被験体における慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性を検査する方法に関する。より具体的には、本発明は、ヒト被験体由来の生物学的試料を用いて該被験体のシグレック14の遺伝子型を決定し、それを慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性の指標とすることを含む、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性を検査する方法に関する。 The present invention relates to a method for examining the exacerbation sensitivity of chronic obstructive pulmonary disease in a subject (preferably a human subject) using the siglec 14 genotype as an index. More specifically, the present invention uses a biological sample derived from a human subject to determine the genotype of Siglec 14 in the subject and uses it as an index of exacerbation susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease. A method for examining exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease in a human subject.
本発明は、ヒト被験体由来の生物学的試料を用いて該被験体のシグレック14の遺伝子型を決定し、それを慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性の指標とすることを含む、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性を判定するための指標となるデータを収集する方法も提供する。 The present invention includes determining the genotype of siglec 14 of a subject using a biological sample derived from the human subject and using it as an indicator of exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease. There is also provided a method of collecting data serving as an index for determining the susceptibility to exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.
本発明において、シグレック14の遺伝子型の決定とは、検査対象のヒト被験体(被験ヒト個体)のゲノム上のシグレック14遺伝子座が有するアレル(対立遺伝子)の組み合わせを決定することを意味する。シグレック14遺伝子には遺伝的多型が存在することが知られており、一部のヒトでは、シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子が融合してシグレック14/5融合遺伝子を形成し、その結果、シグレック14タンパク質は産生されない(ヌル変異型アレルへの変異)ことが分かっている。すなわち本発明において、シグレック14の遺伝子型の決定とは、具体的には、シグレック14遺伝子(野生型アレル)をホモ接合で有する遺伝子型(野生型;WT/WT)、シグレック14の野生型アレルとヌル変異型アレルとのヘテロ接合である遺伝子型(ヘテロ接合型;WT/Null)、シグレック14のヌル変異型アレルのホモ接合である遺伝子型(ヌル変異型;Null /Null)のいずれであるかを決定することをいう。 In the present invention, determining the genotype of Siglec 14 means determining the combination of alleles (alleles) possessed by the Siglec 14 locus on the genome of the human subject to be tested (test human individual). It is known that there is a genetic polymorphism in the Siglec 14 gene, and in some humans, the Siglec 14 gene and the Siglec 5 gene are fused to form a Siglec 14/5 fusion gene. It is known that 14 proteins are not produced (mutation to a null mutant allele). That is, in the present invention, determination of the genotype of siglec 14 is specifically a genotype (wild type; WT / WT) having a siglec 14 gene (wild type allele) in a homozygote, a wild type allele of siglec 14 Genotype (heterozygous type; WT / Null) that is heterozygous between a phenotype and a null mutant allele, or a genotype that is homozygous for the siglec 14 null mutant allele (null mutant type; Null / Null) It means to decide.
ここで、ゲノム上のシグレック14遺伝子(野生型アレル)は、例えば、配列番号1に示す塩基配列を有する。配列番号1の1001〜4405番目が野生型シグレック14タンパク質をコードするORFに対応するゲノム領域であり、そこにコードされている野生型シグレック14タンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。シグレック14の配列情報はGenBank等のデータベースでも公開されており、例えばヒトシグレック14の配列情報はGenBankアクセッション番号AAX47338、NP_001092082等で入手することができる。配列番号2に示すシグレック14タンパク質は、シグナルペプチド(配列番号2の1〜17番目)と成熟タンパク質(配列番号2の18〜396番目)からなり、成熟タンパク質は、免疫グロブリン様ドメイン1(配列番号2の26〜140番目)、免疫グロブリン様ドメイン2(配列番号2の149〜233番目)、リンカー(配列番号2の234〜251番目)、免疫グロブリン様ドメイン3(配列番号2の265〜326番目)、膜貫通ドメイン(配列番号2の359〜381番目)及びサイトゾル尾部(配列番号2の382〜396番目)を含む。免疫グロブリン様ドメイン1〜3を含む細胞外領域又はその部分断片は可溶性である。
Here, the Siglec 14 gene (wild type allele) on the genome has, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. The 1001 to 4405th positions of SEQ ID NO: 1 are the genomic region corresponding to the ORF encoding wild-type Siglec 14 protein, and the amino acid sequence of the wild-type Siglec 14 protein encoded therein is shown in SEQ ID NO: 2. The sequence information of Siglec 14 is also published in databases such as GenBank. For example, the sequence information of human Siglec 14 can be obtained by GenBank accession numbers AAX47338, NP_001092082, and the like. The Siglec 14 protein shown in SEQ ID NO: 2 consists of a signal peptide (
ゲノム上のシグレック5遺伝子の塩基配列の例を、配列番号3に示す。配列番号3の1001〜19105番目がシグレック5タンパク質をコードするORFに対応するゲノム領域である。そこにコードされているシグレック5タンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。なおシグレック5タンパク質のアミノ酸配列は、シグレック14/5融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である。
An example of the base sequence of
ゲノム上のシグレック14/5融合遺伝子の塩基配列の例を、配列番号5に示す。配列番号5の1001〜19105番目がシグレック14/5融合タンパク質をコードするORFに対応するゲノム領域である。シグレック14/5融合タンパク質のアミノ酸配列は、シグレック5タンパク質のアミノ酸配列と同一であり、両者は同一のタンパク質であるため、シグレック14/5融合タンパク質のアミノ酸配列も配列番号4に示すものである。
An example of the base sequence of the Siglec 14/5 fusion gene on the genome is shown in SEQ ID NO: 5. The 1001 to 19105th positions of SEQ ID NO: 5 are the genomic region corresponding to the ORF encoding the Siglec 14/5 fusion protein. Since the amino acid sequence of the Siglec 14/5 fusion protein is identical to the amino acid sequence of the
本発明の方法で検出されるゲノム上のシグレック14遺伝子(野生型アレル)は、配列番号1に示す塩基配列を有するものであってよいが、配列番号2のアミノ酸配列をコードする限り異なる塩基配列を有していてもよい。さらに、ゲノム上のシグレック14遺伝子(野生型アレル)は、配列番号2のアミノ酸配列において1〜数個(例えば2〜5個)のアミノ酸の欠失、置換又は付加の変異を引き起こす塩基変異を含むものであってもよい。 The Siglec 14 gene (wild type allele) on the genome detected by the method of the present invention may have the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but different base sequences as long as it encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. You may have. Furthermore, the Siglec 14 gene (wild type allele) on the genome contains a base mutation that causes a deletion, substitution, or addition mutation of 1 to several (for example, 2 to 5) amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a thing.
本発明で検査に供する生物学的試料は、基本的には、慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性について検査しようとするヒト被験体から採取する。検査対象のヒト被験体は、健康であっても健康でなくてもよい。一実施形態では、検査対象となるヒト被験体は、肺疾患を有する者、特に、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を発症した者が好適である。別の実施形態では、検査対象となるヒト被験体は、喫煙者であるか又は喫煙歴がある者が好適である。検査対象となるヒト被験体はまた、粉塵や大気汚染条件に長期間曝露されたか又はされている者が好適である。被験体が慢性閉塞性肺疾患を発症しているか否かは、臨床現場で用いられている通常の基準に基づいて判断すればよいが、例えば、気流制限(気管支の狭窄・閉塞などによって生じた、呼吸をする際の空気の流れの制限)が認められ、かつ気管支拡張剤投与後に行った肺機能検査で1秒率(FEV1/FVC)が0.7以下の場合に、慢性閉塞性肺疾患に罹患していると判断することができる。ここで、FEV1は、一秒量、すなわち、息をできるだけ速く吐き出したときに1秒間で吐き出すことのできる呼気量である。またFVCは、努力肺活量、すなわち、息を大きく吸い込みできるだけ速く吐き出したときの肺活量である。 The biological sample subjected to the test in the present invention is basically collected from a human subject to be tested for exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease. The human subject to be tested may be healthy or unhealthy. In one embodiment, the human subject to be tested is preferably a person with lung disease, particularly a person who has developed chronic obstructive pulmonary disease (COPD). In another embodiment, the human subject to be examined is preferably a smoker or a person who has a history of smoking. The human subject to be examined is also preferably a person who has been or has been exposed to dust or air pollution conditions for a long time. Whether a subject has developed chronic obstructive pulmonary disease can be determined based on normal criteria used in clinical practice. For example, airflow restriction (bronchoconstriction, obstruction, etc.) restriction of air flow) was observed at the time of breathing, and a second rate pulmonary function tests were performed after bronchodilator administration (when FEV 1 / FVC) is 0.7 or less, chronic obstructive pulmonary disease It can be determined that the patient is affected. Here, FEV 1 is a one-second amount, that is, an exhalation amount that can be exhaled in one second when exhaling as fast as possible. FVC is the vital capacity when forced breathing, that is, when breathing in and breathing out as fast as possible.
生物学的試料は、例えば、血液(例えば、末梢血)、血清、血漿、又は血液中の白血球等の、血液由来試料であってよいし、皮膚、粘膜(口腔粘膜、鼻内粘膜等)、骨髄、脂肪等の単離組織試料(例えば、口腔擦過試料、手術切除組織等)及びそこに含まれる細胞を含む試料、又は他の生体試料(例えば、気道洗浄液、口内洗浄液等の体内洗浄液、若しくは喀痰等)であってもよいが、これらに限定されない。本発明の検査方法に用いる生物学的試料は、一実施形態では、血液由来試料が好ましい。 The biological sample may be, for example, a blood-derived sample such as blood (eg, peripheral blood), serum, plasma, or white blood cells in blood, skin, mucosa (oral mucosa, intranasal mucosa, etc.), Isolated tissue samples such as bone marrow and fat (eg, oral abrasion samples, surgically excised tissues, etc.) and samples containing cells contained therein, or other biological samples (eg, airway washing solution, mouth washing solution such as mouth washing solution, or But not limited to these. In one embodiment, the biological sample used in the test method of the present invention is preferably a blood-derived sample.
生物学的試料を用いて被験体のシグレック14の遺伝子型を決定する方法の一例として、生物学的試料中のDNAについてシグレック14遺伝子とシグレック14/5融合遺伝子の有無を検出する方法が挙げられる。生物学的試料は上記のような任意のものであってよいが、血液由来試料、例えば血液又は血液中の白血球等が好ましい。 An example of a method for determining the genotype of a subject's Siglec 14 using a biological sample is a method for detecting the presence or absence of the Siglec 14 gene and the Siglec 14/5 fusion gene in DNA in the biological sample. . The biological sample may be any of those described above, but is preferably a blood-derived sample, such as blood or white blood cells in blood.
生物学的試料中のDNAについて検出実験を行う場合、当該生物学的試料を直接実験に供してもよいが、予め、溶血処理や、DNA抽出及び精製処理を行っておくことがより好ましい。溶血処理や、生物学的試料からのDNA抽出・精製は、常法により行うことができるが、例えば、溶血試薬を用いた溶血処理の後、遠心分離によって白血球等の細胞を分離し、それを市販のDNA抽出・精製キットを用いて処理することにより、簡便にゲノムDNAを精製することができる。 When performing a detection experiment on DNA in a biological sample, the biological sample may be directly subjected to the experiment, but it is more preferable to perform hemolysis or DNA extraction and purification in advance. Hemolysis and DNA extraction / purification from biological samples can be performed by conventional methods.For example, after hemolysis using a hemolysis reagent, cells such as leukocytes are separated by centrifugation, Genomic DNA can be easily purified by treatment with a commercially available DNA extraction / purification kit.
一実施形態では、生物学的試料中のゲノムDNA配列に基づくシグレック14の遺伝子型決定は、シグレック14遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット(シグレック14遺伝子特異的プライマーセット)と、シグレック14/5融合遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及び場合によりシグレック5遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたPCRによって行うことができる。この遺伝子型決定は、例えば、特許文献2に記載のシグレック14遺伝子のアレル検出方法に基づいて行うことができる。
In one embodiment, siglec 14 genotyping based on the genomic DNA sequence in the biological sample comprises a primer set that specifically amplifies the siglec 14 gene (Siglec 14 gene specific primer set), and a Siglec 14/5. It can be performed by PCR using a primer set that specifically amplifies the fusion gene and optionally a primer set that specifically amplifies the
シグレック14遺伝子特異的プライマーセットは、シグレック14遺伝子中の塩基配列に基づき、シグレック14/5融合遺伝子又はシグレック5遺伝子を増幅させないように設計する。その各プライマーは、シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子における保存領域の外側(保存領域より5'側及び3'側)に設計することが好ましい。シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子の保存領域は、配列番号1の塩基配列中では753番目〜2110番目に相当する。通常は、シグレック14遺伝子特異的プライマーセットのフォワードプライマーは753番目より5'末端側の領域に、リバースプライマーは2110番目より3'末端側の領域に設計する。好ましい具体的なプライマーとしては、フォワードプライマーとしては配列番号6に示す塩基配列を含むプライマー、リバースプライマーとしては配列番号7に示す塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
The siglec 14 gene specific primer set is designed so as not to amplify the siglec 14/5 fusion gene or the
シグレック5遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット(シグレック5遺伝子特異的プライマーセット)の各プライマーも、シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子における保存領域の外側(保存領域より5'側及び3'側)に設計することが好ましい。シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子の保存領域は、配列番号1の塩基配列中では753番目〜2110番目に相当し、配列番号3の塩基配列中では753番目〜2114番目に相当する。好ましい具体的なプライマーとしては、フォワードプライマーとしては配列番号8に示す塩基配列を含むプライマー、リバースプライマーとしては配列番号9に示す塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
Each primer of the primer set that specifically amplifies the
シグレック14/5融合遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットの各プライマーも同様に設計することができるが、好ましい実施形態では、シグレック14遺伝子特異的プライマーセットのフォワードプライマーと、シグレック5遺伝子特異的プライマーセットのリバースプライマーから構成されるプライマーセットを、シグレック14/5融合遺伝子特異的プライマーセットとして用いることができる。
While each primer of the primer set that specifically amplifies the Siglec 14/5 fusion gene can be designed in the same manner, in a preferred embodiment, the forward primer of the Siglec 14 gene specific primer set and the
これら各プライマーの塩基長については特に制限はないが、アニーリング温度及びアニーリングの特異性等の点から、15〜40塩基、好ましくは20〜35塩基である。 Although there is no restriction | limiting in particular about the base length of each of these primers, From points, such as annealing temperature and the specificity of annealing, it is 15-40 bases, Preferably it is 20-35 bases.
PCRは、例えば、鋳型となる生物学的試料由来のゲノムDNA、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸混合物、PCR適合バッファー、上記プライマーセットを混合して反応液を調製し、変性工程、アニーリング工程、及びDNA伸長工程を含む核酸増幅工程を複数サイクル行うことにより実施する。 For PCR, for example, genomic DNA derived from a biological sample as a template, heat-resistant DNA polymerase, deoxyribonucleoside triphosphate mixture, PCR compatible buffer, and the above primer set are mixed to prepare a reaction solution, denaturation step, annealing The nucleic acid amplification step including the step and the DNA extension step is performed by performing a plurality of cycles.
PCR反応完了後、生成したPCR反応産物(核酸増幅産物)を検出する。PCR反応液に二本鎖DNA検出試薬(例えばSYBR Greenやエチジウムブロマイドなど)を添加し、適当な光源の存在下で反応産物を検出するか、反応産物をアガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動などで分離し、二本鎖DNA検出試薬(例えばSYBR Greenやエチジウムブロマイドなど)を用いてPCR反応産物を検出することができる。 After the PCR reaction is completed, the generated PCR reaction product (nucleic acid amplification product) is detected. Add a double-stranded DNA detection reagent (such as SYBR Green or ethidium bromide) to the PCR reaction solution and detect the reaction product in the presence of an appropriate light source, or use agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis to detect the reaction product. After separation, the PCR reaction product can be detected using a double-stranded DNA detection reagent (for example, SYBR Green or ethidium bromide).
その結果、シグレック14遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物が検出されない場合は、シグレック14遺伝子の双方の野生型アレルを欠失していることが示される。さらに、シグレック14/5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物が検出されるが、シグレック5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物が検出されない場合、シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子とが融合したシグレック14/5融合遺伝子をホモ接合性で有することが示される。この場合、遺伝子型をヌル変異型と決定できる。
As a result, when the amplification product by the siglec 14 gene specific primer set is not detected, it is indicated that both wild type alleles of the siglec 14 gene are deleted. Furthermore, when an amplification product by the Siglec 14/5 gene-specific primer set is detected, but when an amplification product by the
一方、シグレック14遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物が検出される場合、シグレック14遺伝子の少なくとも一方の野生型アレルを有していることが示される。さらに、シグレック14/5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物とシグレック5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物の双方が検出される場合、シグレック14遺伝子の野生型アレルをヘテロ接合性で有し、シグレック14遺伝子はヌル変異型アレル(シグレック14/5融合遺伝子)となっていることが示される。この場合、遺伝子型は野生型アレルについてヘテロ接合型と決定できる。
On the other hand, when an amplification product by the Siglec 14 gene-specific primer set is detected, it indicates that it has at least one wild-type allele of the Siglec 14 gene. Furthermore, when both the amplification product by the Siglec 14/5 gene-specific primer set and the amplification product by the
また、シグレック14遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物が検出され、かつ、シグレック5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物も検出されるが、シグレック14/5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物は検出されない場合は、シグレック14遺伝子の野生型アレルをホモ接合性で有し、シグレック14/5融合遺伝子は存在しないことが示される。この場合、遺伝子型は野生型と決定できる。
Further, when an amplification product by the Siglec 14 gene specific primer set is detected and an amplification product by the
なおシグレック14遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物とシグレック14/5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物の検出結果だけで、シグレック14の各遺伝子型を識別することができるが、シグレック5遺伝子特異的プライマーセットによる増幅産物の検出結果を検討することで、さらにその遺伝子型の決定結果を裏付けることができる。
In addition, each siglec 14 genotype can be distinguished only by the detection result of the amplification product by the siglec 14 gene-specific primer set and the amplification product by the siglec 14/5 gene-specific primer set, but the
別の実施形態では、生物学的試料中のゲノムDNA配列に基づくシグレック14の遺伝子型決定は、シグレック14遺伝子に特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって行ってもよい。 In another embodiment, siglec 14 genotyping based on genomic DNA sequences in a biological sample may be performed by Southern blotting using a probe specific for the siglec 14 gene.
シグレック14遺伝子に特異的な核酸プローブは、シグレック14遺伝子中の塩基配列に基づき、シグレック14/5融合遺伝子又はシグレック5遺伝子にアニールしないように設計することが好ましい。具体的には、シグレック14遺伝子とシグレック5遺伝子の保存領域(配列番号1の753番目〜2110番目)を避け、かつシグレック14遺伝子に特異的な領域に設計すればよい。シグレック14遺伝子に特異的な核酸プローブは、例えば、配列番号1の2110番目より3'末端側の領域を選択して設計することができる。
The nucleic acid probe specific for the Siglec 14 gene is preferably designed so as not to anneal to the Siglec 14/5 fusion gene or the
またシグレック5遺伝子又はシグレック14/5融合遺伝子に特異的な核酸プローブを設計・作製して、シグレック14遺伝子に特異的な核酸プローブに加えて、サザンブロット法に用いることがさらに好ましい。
More preferably, a nucleic acid probe specific to the
核酸プローブの塩基長については特に制限はないが、アニーリング温度やアニーリングの特異性等を考慮すると、通常は20〜10,000塩基対程度、好ましくは20〜1,000塩基対程度である。 The base length of the nucleic acid probe is not particularly limited, but is usually about 20 to 10,000 base pairs, preferably about 20 to 1,000 base pairs, considering the annealing temperature and the specificity of annealing.
かかる核酸プローブを用いたサザンブロッティングでは、まず、例えば、ヒト被験体由来の生物学的試料から抽出したゲノムDNAを直接ナイロン膜などの薄膜に固相化するか、又は適当な方法(制限酵素等による消化など)で断片化しアガロースゲル電気泳動などにより分離した後、ナイロン膜などの薄膜に転写し固相化する。次いで、上記のシグレック14遺伝子に特異的な核酸プローブを調製し、ラベルを導入し、薄膜上のゲノムDNAとハイブリダイズさせればよい。ラベルとしては、放射性同位元素(32P、33P、35S等)、蛍光色素(Cy3やCy5等)、又はビオチンやジゴキシゲニンなどのエピトープを用いることができる。ビオチンやジゴキシゲニンなどのエピトープを導入した場合は、核酸プローブの検出に二次検出試薬(蛍光色素を結合したストレプトアビジンや抗ジゴキシゲニン抗体など)を必要とする。ハイブリダイズしなかったプローブを洗浄操作により除いた後、ハイブリダイズした核酸プローブをラベル法に応じた方法で検出すればよい。 In Southern blotting using such a nucleic acid probe, first, for example, genomic DNA extracted from a biological sample derived from a human subject is directly immobilized on a thin film such as a nylon membrane, or an appropriate method (such as a restriction enzyme). And then separated by agarose gel electrophoresis, etc., transferred to a thin film such as a nylon membrane and solid-phased. Next, a nucleic acid probe specific to the above Siglec 14 gene is prepared, a label is introduced, and it is hybridized with genomic DNA on the thin film. The label can be used epitope, such as a radioisotope (32 P, 33 P, 35 S , etc.), a fluorescent dye (Cy3 or Cy5, etc.), or biotin or digoxigenin. When an epitope such as biotin or digoxigenin is introduced, a secondary detection reagent (such as streptavidin or anti-digoxigenin antibody bound with a fluorescent dye) is required for detection of the nucleic acid probe. After removing the unhybridized probe by a washing operation, the hybridized nucleic acid probe may be detected by a method according to the label method.
別法では、シグレック14遺伝子特異的な核酸プローブを薄膜又はガラス面などに固相化し、そこに、適当な方法(機械的剪断、制限酵素等による消化など)で断片化しラベルを導入したゲノムDNAをハイブリダイズさせてもよい。ラベルとしては放射性同位元素(32P、33P、35S等)、蛍光色素(Cy3やCy5等)、或いはビオチンやジゴキシゲニンなどのエピトープを用いることができる。ビオチンやジゴキシゲニンなどのエピトープを導入した場合は、核酸プローブの検出に二次検出試薬(蛍光色素を結合したストレプトアビジンや抗ジゴキシゲニン抗体)を必要とする。ハイブリダイズしなかったプローブを洗浄操作により除いた後、ハイブリダイズしたゲノムDNAをラベル法に応じた方法で検出することができる。 In another method, Siglec 14 gene-specific nucleic acid probe is immobilized on a thin film or glass surface, and then fragmented and labeled with an appropriate method (such as mechanical shearing or digestion with restriction enzymes). May be hybridized. The label can be used epitope, such as a radioisotope (32 P, 33 P, 35 S , etc.), a fluorescent dye (Cy3 or Cy5, etc.), or biotin or digoxigenin. When an epitope such as biotin or digoxigenin is introduced, a secondary detection reagent (streptavidin or anti-digoxigenin antibody bound with a fluorescent dye) is required for detection of the nucleic acid probe. After removing the unhybridized probe by a washing operation, the hybridized genomic DNA can be detected by a method according to the label method.
サザンブロット法では、シグレック14遺伝子特異的な核酸プローブとゲノムDNAとのハイブリダイゼーションシグナルが検出できる場合、シグレック14の遺伝子型は野生型(ホモ接合)又はヘテロ接合型であることが示される。この場合、シグレック14/5融合遺伝子特異的な核酸プローブとゲノムDNAとのハイブリダイゼーションシグナルが検出されれば、シグレック14の遺伝子型はヘテロ接合型であると決定され、該シグナルが検出されなければ、野生型(ホモ接合)であると決定される。一方、シグレック14遺伝子特異的な核酸プローブとゲノムDNAとのハイブリダイゼーションシグナルが検出できない場合、シグレック14遺伝子の野生型アリルの双方が欠失し、シグレック14/5融合遺伝子がホモ接合性で存在することが示され、すなわちシグレック14の遺伝子型はヌル変異型と決定される。 In Southern blotting, when a hybridization signal between a Siglec 14 gene-specific nucleic acid probe and genomic DNA can be detected, the Siglec 14 genotype is shown to be wild-type (homozygous) or heterozygous. In this case, if a hybridization signal between a nucleic acid probe specific to the Siglec 14/5 fusion gene and genomic DNA is detected, the genotype of Siglec 14 is determined to be heterozygous, and if the signal is not detected. , Determined to be wild type (homozygous). On the other hand, when the hybridization signal between the siglec 14 gene-specific nucleic acid probe and genomic DNA cannot be detected, both wild-type alleles of the siglec 14 gene are deleted, and the siglec 14/5 fusion gene exists in a homozygous manner. That is, the genotype of Siglec 14 is determined to be a null variant.
またシグレック14の遺伝子型は、生物学的試料中のシグレック14タンパク質を検出することによっても決定できる。シグレック14タンパク質は、シグレック14を特異的に認識する抗体を用いて検出することができる。「シグレック14を特異的に認識する抗体」とは、シグレック14タンパク質に特異的に結合し、かつシグレック5タンパク質には結合しない抗体をいう。この実施形態では、シグレック14を特異的に認識する抗体を用いて、生物学的試料中のシグレック14タンパク質を検出すればよい。本発明において検出対象となる「シグレック14タンパク質」は、シグレック14遺伝子によってコードされた配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、当該タンパク質からシグナルペプチドが除去されたもの、配列番号2に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加を含む配列からなるタンパク質、配列番号2に示すアミノ酸配列の細胞外領域又はその一部である可溶性シグレック14タンパク質等を包含する。本発明において検出対象となる好ましい「シグレック14タンパク質」は、シグレック14タンパク質に特有の免疫グロブリン様ドメイン3を有する。シグレック14タンパク質は、例えば配列番号2に示すアミノ酸配列又はその一部をコードする塩基配列を有するDNAを用いて遺伝子工学的に組換え産生することができる。
The siglec 14 genotype can also be determined by detecting siglec 14 protein in a biological sample. Siglec 14 protein can be detected using an antibody that specifically recognizes Siglec 14. “An antibody that specifically recognizes Siglec 14” refers to an antibody that specifically binds to Siglec 14 protein and does not bind to
シグレック14について野生型(WT/WT)の遺伝子型を有する被験体、及びヘテロ接合型(WT/Null)の遺伝子型を有する被験体は、シグレック14タンパク質を発現する。一方、ヌル変異型(Null /Null)の遺伝子型を有する被験体は、シグレック14の野生型アレルを欠損しておりシグレック14/5融合遺伝子のみを有するため、シグレック14タンパク質を発現しない。なおシグレック14/5融合遺伝子から発現されるシグレック14/5融合タンパク質は、シグレック5タンパク質と同一のタンパク質である。したがって生物学的試料中のシグレック14タンパク質を検出することにより、シグレック14の遺伝子型を決定することができる。
A subject having a wild-type (WT / WT) genotype and a heterozygous (WT / Null) genotype of Siglec 14 expresses Siglec 14 protein. On the other hand, a subject having a null mutant (Null / Null) genotype does not express the Siglec 14 protein because it lacks the Siglec 14 wild-type allele and has only the Siglec 14/5 fusion gene. The Siglec 14/5 fusion protein expressed from the Siglec 14/5 fusion gene is the same protein as the
シグレック14を特異的に認識する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、従来公知の方法で取得することができる。例えば、シグレック14に対するポリクローナル抗体は、シグレック14タンパク質を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等の動物を免疫感作し、一定期間経過後血清を採取し、プロテインA、プロテインG、抗原タンパク質、抗原ペプチドなどを固相化したカラムなどで精製することで得ることができる。シグレック14タンパク質の一部又は全体を抗原として用いて抗体を作成した後、シグレック5タンパク質の一部(シグレック14タンパク質と高い配列相同性を示す部分を含む)又は全部と交差反応する画分を吸着などにより除去した画分を、シグレック14タンパク質を特異的に認識する抗体として調製することができる。あるいは、免疫に用いる抗原としてシグレック14タンパク質に特異的な領域を用いることにより、シグレック5タンパク質を含む他のシグレックタンパク質と交差反応しない抗体を得ることもできる。シグレック14タンパク質に特異的な領域としては、例えば、シグレック14タンパク質の細胞外領域に含まれるがシグレック5タンパク質の細胞外領域には含まれない領域が挙げられ、具体例では、配列番号2の238番〜358番の領域がシグレック14タンパク質に特異的な領域に相当する。本発明では、シグレック14タンパク質に特異的な領域、好ましくはリンカー及び/又は免疫グロブリン様ドメイン3、例えば配列番号2の238番〜358番の領域、を特異的に認識する抗体を、シグレック14を特異的に認識する抗体として好適に用いることができる。
The antibody that specifically recognizes Siglec 14 may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be obtained by a conventionally known method. For example, a polyclonal antibody against Siglec 14 immunizes animals such as mice, rats, rabbits, goats, sheep, donkeys, etc. using Siglec 14 protein, and sera are collected after a certain period of time to obtain protein A, protein G In addition, it can be obtained by purifying with a column in which an antigen protein, an antigen peptide or the like is immobilized. After preparing an antibody using part or all of Siglec 14 protein as an antigen, a fraction that cross-reacts with part or all of
また、シグレック14に対するモノクローナル抗体は、上記ポリクローナル抗体と同様の免疫感作を行い、一定期間経過後、例えば脾臓細胞を採取し、該細胞とミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたハイブリドーマをスクリーニングし、シグレック14タンパク質に対する抗体産生ハイブリドーマを取得して、その培養物又は培養上清から調製することができる。 The monoclonal antibody against Siglec 14 is immunized in the same manner as the above polyclonal antibody. After a certain period of time, for example, spleen cells are collected, the cells are fused with myeloma cells, and the resulting hybridoma is screened. Then, an antibody-producing hybridoma against Siglec 14 protein can be obtained and prepared from the culture or culture supernatant.
さらに、上記抗体の抗原結合性フラグメント(Fab、F(ab’)2など)も同様に使用することができる。 Furthermore, antigen-binding fragments (Fab, F (ab ′) 2 etc.) of the above antibody can be used in the same manner.
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれの場合も、ヒト由来の他のシグレックタンパク質(例えば、シグレック5、シグレック6)に交差反応しないことを確認することが望ましい。使用する抗体は、ラベルされたものでも、ラベルされていないものでもよい。抗体は、例えば、蛍光色素(フルオレセイン、R-フィコエリスリン、アロフィコシアニン等の検出可能な蛍光色素)やビオチン等でラベルすることができる。
In either case of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, it is desirable to confirm that it does not cross-react with other human-derived Siglec proteins (eg,
ラベルなしの抗シグレック14抗体を用いる場合は、抗体作製に用いた動物の免疫グロブリンのFc等を認識する二次抗体(蛍光色素又はビオチンなどでラベルしたもの)、ビオチンなどでラベルした抗体を用いる場合はこのラベルと特異的に結合するプローブ(蛍光色素ラベルしたストレプトアビジンなど)を二次試薬に用いて検出することができる。 When using an unlabeled anti-Siglec 14 antibody, a secondary antibody (labeled with a fluorescent dye or biotin) that recognizes the Fc of an animal immunoglobulin used for antibody production, an antibody labeled with biotin or the like is used. In some cases, a probe that specifically binds to this label (such as a fluorescent dye-labeled streptavidin) can be detected as a secondary reagent.
シグレック14を特異的に認識する抗体の好適な具体例は、後述の参考例に記載された、clone 40-1として規定されるシグレック14特異的モノクローナル抗体である。本抗体及びその作製については、Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19(8):841-846に開示されている。このclone 40-1のモノクローナル抗体は、シグレック14の細胞外領域と結合することができ、可溶性シグレック14タンパク質を認識することができる。 A preferred specific example of an antibody that specifically recognizes Siglec 14 is a Siglec 14-specific monoclonal antibody defined as clone 40-1 described in Reference Examples described later. This antibody and its production are disclosed in Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19 (8): 841-846. This clone 40-1 monoclonal antibody can bind to the extracellular region of siglec 14 and recognize soluble siglec 14 protein.
シグレック14を特異的に認識する抗体を使用した生物学的試料中のシグレック14タンパク質の検出は、例えば、ELISA法や、フローサイトメトリーによる解析により行うことができる。 Detection of Siglec 14 protein in a biological sample using an antibody that specifically recognizes Siglec 14 can be performed, for example, by ELISA or analysis by flow cytometry.
本発明の方法の好適な一実施形態では、例えばシグレック14を特異的に認識する抗体を用いて、生物学的試料、特に血液由来試料中の可溶性シグレック14タンパク質を検出することにより、試料中の可溶性シグレック14タンパク質の有無又は量を決定し、それによりシグレック14の遺伝子型を決定することができる。血液由来試料としては、全血、血清、血漿等が挙げられ、血清がより好ましい。可溶性シグレック14タンパク質とは、膜貫通ドメインよりC末端側の領域を欠損した、シグレック14タンパク質の細胞外領域又はその一部を含むタンパク質である。すなわち可溶性シグレック14タンパク質は、全長シグレック14タンパク質の免疫グロブリン様ドメイン1、2及び3並びにリンカーのうち少なくとも1つを含み、膜貫通ドメイン及びサイトゾル尾部を含まない部分タンパク質である。この可溶性シグレック14タンパク質は、生体内で、細胞膜等の生体膜に結合しておらず、血液等の生体液中に遊離形態で存在する。理論により限定されることは意図しないが、可溶性シグレック14タンパク質は、生体内で、シグレック14遺伝子からスプライシングバリアントとして又は全長シグレック14タンパク質の分解により生成されるものと考えられる。
In a preferred embodiment of the method of the present invention, for example, using an antibody that specifically recognizes Siglec 14 to detect soluble Siglec 14 protein in a biological sample, in particular a blood-derived sample, in the sample. The presence or amount of soluble Siglec 14 protein can be determined, thereby determining the Siglec 14 genotype. Examples of the blood-derived sample include whole blood, serum, plasma and the like, and serum is more preferable. Soluble Siglec 14 protein is a protein containing the extracellular region of Siglec 14 protein or a part thereof, lacking the C-terminal region from the transmembrane domain. That is, the soluble Siglec 14 protein is a partial protein containing at least one of the immunoglobulin-
血液由来試料中の可溶性シグレック14タンパク質の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、試験プレートのウェルに、シグレック5とシグレック14をともに認識する抗体を添加し、PBS等のバッファー中、室温で終夜静置して抗体を固相に結合させる(固相化)。なお抗シグレック5抗体の多くは、シグレック14と交差反応し、シグレック5とシグレック14をともに認識する抗体である(Angata T et al., FASEB J. 2006, 20(12):1964-1973)。固相化後、溶液を除去し、洗浄バッファー(例えば、0.05% Tween 20等の界面活性剤含有PBS)で各ウェルを洗浄し、希釈液(例えば、1% BSA含有PBS)を添加して室温にてブロッキングを行う。溶液を除去し、を添加し、室温で2時間静置した。洗浄バッファーで各ウェルを3回洗浄(400 μl/ウェル)し、血液由来試料(好ましくは、血清)又はその希釈サンプルを添加し、室温で数時間(例えば2時間)静置する。洗浄バッファーで各ウェルを洗浄した後、可溶性シグレック14を認識可能でありビオチン化等のラベリングがされている、シグレック14を特異的に認識する抗体(好ましくはモノクローナル抗体、例えばclone 40-1の抗体)をそこに添加し、室温で数時間(例えば、2時間)静置する。溶液を除去し、洗浄バッファーでウェルを洗浄し、ラベルの検出を行う。例えば、抗体をビオチン化した場合は、ストレプトアビジン-コンジュゲート化ホースラディッシュペルオキシダーゼと基質を添加して反応させ、反応産物を450 nmの吸光度で測定すればよい。このELISA法では、シグレック5を検出することなく、可溶性シグレック14を特異的に検出することができる。
Detection of soluble Siglec 14 protein in a blood-derived sample can be performed, for example, as follows. First, an antibody that recognizes both
従来、ヒト血中の可溶性シグレック14の存在は明らかになっていなかった。しかし本発明により、シグレック14遺伝子(野生型アレル)を有するヒト被験体の血中にはシグレック14が可溶性形態(可溶性シグレック14)で存在すること、一方、シグレック5は血中に可溶性形態ではほとんど存在しないことが示された。このため、生物学的試料中の可溶性シグレック14の検出には、シグレック14を特異的に認識する抗体だけでなくシグレック5とシグレック14をともに認識する抗体も使用することができる。なお可溶性シグレック14の検出に用いる、シグレック14を特異的に認識する抗体は、可溶性シグレック14タンパク質、すなわちシグレック14の細胞外領域又はその一部と結合(認識)することができるものであり、例えば免疫グロブリン様ドメイン3と結合(認識)することが好ましい。
Conventionally, the presence of soluble Siglec 14 in human blood has not been clarified. However, according to the present invention, siglec 14 is present in a soluble form (soluble siglec 14) in the blood of a human subject having the siglec 14 gene (wild type allele), whereas
したがって生物学的試料(好ましくは、血清等の血液由来試料)中に可溶性シグレック14タンパク質が検出される場合、その試料を採取したヒト被験体は、シグレック14遺伝子をホモ接合で有する野生型又はヘテロ接合で有するヘテロ接合型である。特に、可溶性シグレック14タンパク質がより高濃度(例えば、おおむね180ng/ml血清以上)で検出される場合は、シグレック14遺伝子について野生型であると決定でき、逆に、可溶性シグレック14タンパク質がより低濃度(例えば、おおむね1〜80ng/ml血清)で検出される場合はヘテロ接合型であると決定できる。可溶性シグレック14タンパク質が中間的な濃度(例えば、おおむね80ng/ml超、180ng/ml血清未満)である場合は、さらにゲノムDNA上のシグレック14遺伝子の検出を行うなどして、シグレック14の遺伝子型を決定することが望ましい。一方、調べた生物学的試料中にシグレック14タンパク質が検出されない場合、シグレック14の野生型アレルを両方とも欠損したヌル変異型(シグレック14/5融合遺伝子をホモ接合で有する)と決定できる。 Therefore, when soluble Siglec 14 protein is detected in a biological sample (preferably a blood-derived sample such as serum), the human subject from whom the sample was collected is wild-type or heterozygous having the Siglec 14 gene homozygous. It is a heterojunction type having a junction. In particular, if soluble Siglec 14 protein is detected at a higher concentration (eg, approximately 180 ng / ml serum or more), it can be determined that the Siglec 14 gene is wild type, and conversely, soluble Siglec 14 protein is at a lower concentration. When it is detected (for example, approximately 1 to 80 ng / ml serum), it can be determined to be heterozygous. If the soluble Siglec 14 protein is at an intermediate concentration (eg, generally more than 80 ng / ml and less than 180 ng / ml serum), the Siglec 14 genotype is further detected by detecting the Siglec 14 gene on the genomic DNA. It is desirable to determine. On the other hand, if Siglec 14 protein is not detected in the examined biological sample, it can be determined as a null mutant (having a Siglec 14/5 fusion gene in a homozygote) lacking both wild-type alleles of Siglec 14.
別の実施形態では、フローサイトメトリーにより白血球上に発現したシグレック14タンパク質を検出することにより、シグレック14の遺伝子型を決定することもできる。例えば、被験体の血液を血液凝固を防ぐ試薬(EDTA、クエン酸、ヘパリンなど)を含む採血管に採取してそれを生物学的試料とする。必要に応じて、その血液から塩化アンモニウムなどを用いた赤血球の溶血により白血球を単離するか、又はフィコールなどを用いた密度勾配遠心法などにより白血球を単離する。さらに、ヒト白血球又は全血試料にシグレック14特異的な抗体を添加し、一定時間保温した後、洗浄により結合しなかった抗体を除き、フローサイトメーターを用いて白血球上のシグレック14タンパク質の有無を検出する。この際、顆粒球又は単球上でのシグレック14タンパク質の発現を検出することが望ましい。白血球上のシグレック14タンパク質が検出される場合、その試料を採取したヒト被験体は、シグレック14遺伝子をホモ接合で有する野生型又はヘテロ接合で有するヘテロ接合型である。一方、白血球上のシグレック14タンパク質が検出されない場合、シグレック14の野生型アレルを両方とも欠損したヌル変異型(シグレック14/5融合遺伝子をホモ接合で有する)である。 In another embodiment, the siglec 14 genotype can also be determined by detecting siglec 14 protein expressed on leukocytes by flow cytometry. For example, the blood of a subject is collected in a blood collection tube containing a reagent (EDTA, citrate, heparin, etc.) that prevents blood coagulation, and used as a biological sample. If necessary, leukocytes are isolated from the blood by hemolysis of erythrocytes using ammonium chloride or the like, or leukocytes are isolated by density gradient centrifugation using Ficoll or the like. Furthermore, after adding Siglec 14-specific antibody to human leukocyte or whole blood sample, keeping it warm for a certain period of time, removing the antibody that did not bind by washing, the flow cytometer was used to determine the presence or absence of Siglec 14 protein on the leukocyte. To detect. At this time, it is desirable to detect the expression of Siglec 14 protein on granulocytes or monocytes. When Siglec 14 protein on white blood cells is detected, the human subject from which the sample was collected is either wild-type having a Siglec 14 gene in a homozygote or heterozygous having a heterozygote. On the other hand, when Siglec 14 protein on leukocytes is not detected, it is a null mutant type (having Siglec 14/5 fusion gene in a homozygous form) lacking both wild type alleles of Siglec 14.
本発明では、以上のようにして決定されたヒト被験体のシグレック14の遺伝子型を指標として、該被験体における慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性を検査することができる。すなわち、本発明による慢性閉塞性肺疾患(COPD)の増悪感受性の検査は、COPDと強く相関するバイオマーカー(遺伝的マーカー又は血清マーカー等)としてのシグレック14の遺伝子型に基づいて行われる。 In the present invention, the exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease in a subject can be examined using the siglec 14 genotype of the human subject determined as described above as an index. That is, the examination of exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) according to the present invention is performed based on the genotype of Siglec 14 as a biomarker (such as a genetic marker or a serum marker) that is strongly correlated with COPD.
ここで慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性とは、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を発症した後の増悪の生じやすさ(素因)を意味する。慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性は、限定するものではないが、例えば、慢性閉塞性肺疾患患者が1年以内に増悪を生じる割合として表すこともできる。慢性閉塞性肺疾患の増悪(急性増悪)とは、呼吸困難、咳、喀痰などの慢性閉塞性肺疾患の症状が日常の生理的変動を超えて急激に悪化し、安定期の治療内容の変更を要する状態をいう(日本呼吸器学会ガイドライン、2009)。慢性閉塞性肺疾患の増悪は、Anthonisenらの定義(Anthonisen NR et al., Ann Intern Med. 1987, 106:196-204)や、Rodriguez-Roisinの定義(Rodriguez-Roisin, R. Chest 2000, 117:398S-401S)に従って判別することができる。本発明において、「慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性が高い」ことは、慢性閉塞性肺疾患を発症した場合に増悪を生じる確率が高いことを意味する。 Here, the exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease means the ease (predisposition) of exacerbation after the onset of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The exacerbation susceptibility of chronic obstructive pulmonary disease is not limited, and can be expressed as, for example, the rate at which patients with chronic obstructive pulmonary disease develop exacerbations within one year. Chronic obstructive pulmonary disease exacerbation (acute exacerbation) refers to symptoms of chronic obstructive pulmonary disease such as dyspnea, cough, and sputum that suddenly worsen beyond daily physiological changes, and changes in treatment during stable period (Respiratory society guidelines, 2009). The exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease is defined by Anthonisen et al. (Anthonisen NR et al., Ann Intern Med. 1987, 106: 196-204) and Rodriguez-Roisin (Rodriguez-Roisin, R. Chest 2000, 117). : 398S-401S). In the present invention, “high exacerbation sensitivity of chronic obstructive pulmonary disease” means that there is a high probability that exacerbation will occur when chronic obstructive pulmonary disease develops.
本発明では、ヒト被験体がシグレック14遺伝子の野生型アレルを有すると決定された場合、このバイオマーカーと慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性との相関に基づいて、慢性閉塞性肺疾患の増悪感受性がより高いものと検査される。 In the present invention, when it is determined that the human subject has the wild type allele of the siglec 14 gene, the exacerbation sensitivity of chronic obstructive pulmonary disease is based on the correlation between this biomarker and the exacerbation sensitivity of chronic obstructive pulmonary disease. Is tested for higher.
具体的には、あるヒト被験体のシグレック14の遺伝子型が野生型であり、すなわちシグレック14遺伝子の野生型アレルをホモ接合で有していると決定された場合、その被験体における慢性閉塞性肺疾患(COPD)の増悪感受性は高いことが示される。本発明の方法において、野生型の場合のCOPDの増悪感受性(COPD増悪はAnthonisenの定義による)は、限定するものではないが、およそ22%〜53%の増悪率、好ましくはおよそ34%〜39%の増悪率である。一方、ヒト被験体のシグレック14の遺伝子型がヘテロ接合型であり、すなわちシグレック14遺伝子の野生型アレルをヘテロ接合性で有し、ヌル変異型アレル(シグレック14/5融合遺伝子)を1つ有していると決定された場合、その被験体におけるCOPDの増悪感受性は野生型と比較すれば相対的に低いがヌル変異型と比較すると相対的に高いことが示される。ヘテロ接合型の場合のCOPDの増悪感受性(同様にAnthonisenの定義による)は、限定するものではないが、およそ12%〜35%の増悪率、好ましくはおよそ18%〜21%の増悪率である。さらに、ヒト被験体のシグレック14の遺伝子型がヌル変異型であり、すなわちヌル変異型アレル(シグレック14/5融合遺伝子)をホモ接合で有すると決定された場合、その被験体におけるCOPDの増悪感受性は低いことが示される。ヌル変異型の場合のCOPDの増悪感受性(同様にAnthonisenの定義による)は、限定するものではないが、およそ2%〜20%の増悪率、好ましくはおよそ6%〜7%未満の増悪率である。ここで増悪率とは、慢性閉塞性肺疾患患者が1年以内に増悪を引き起こす割合(%)をいう。 Specifically, if it is determined that the siglec 14 genotype of a human subject is wild-type, that is, has a wild-type allele of the siglec 14 gene, it is chronic obstructive in that subject. It is shown that susceptibility to exacerbation of lung disease (COPD) is high. In the method of the present invention, the exacerbation sensitivity of COPD in the wild type (COPD exacerbation is defined by Anthonisen's definition) is not limited, but an exacerbation rate of about 22% to 53%, preferably about 34% to 39 % Exacerbation rate. On the other hand, the genotype of Siglec 14 in human subjects is heterozygous, that is, it has a wild-type allele of Siglec 14 gene heterozygous and has one null mutant allele (Siglec 14/5 fusion gene). If determined to be, the subject's COPD exacerbation sensitivity is relatively low compared to the wild type but relatively high compared to the null variant. COPD exacerbation susceptibility in heterozygous cases (also defined by Anthonisen) is, but not limited to, an exacerbation rate of approximately 12% to 35%, preferably an exacerbation rate of approximately 18% to 21%. . Furthermore, if it is determined that the genotype of Siglec 14 in a human subject is a null variant, ie, has a null variant allele (Siglec 14/5 fusion gene) homozygous, COPD exacerbation susceptibility in that subject Is shown to be low. COPD exacerbation susceptibility in the null variant (as well as defined by Anthonisen) is not limited, but with an exacerbation rate of approximately 2% to 20%, preferably approximately 6% to less than 7%. is there. Here, the exacerbation rate refers to the rate (%) in which chronic obstructive pulmonary disease patients cause exacerbations within one year.
また上記のように、シグレック14の遺伝子型の野生型アレルの数が多いほど、COPDの増悪感受性は増加する。すなわち、シグレック14の野生型アレルを有しないヌル変異型よりも、野生型アレルを1つ有するヘテロ接合型の方が、COPDが増悪しやすく、シグレック14の野生型アレルを1つ有するヘテロ接合型よりも、野生型アレルをホモ接合で2つ有する野生型の方が、COPDが増悪しやすい。したがって本発明の方法によれば、決定されたシグレック14の遺伝子型の野生型アレルの数の多さに基づいて、増悪感受性の高さが検査される。すなわち本発明では、決定されたシグレック14の遺伝子型の野生型アレルの数を増悪感受性の指標とすることができる。 Further, as described above, the greater the number of siglec 14 genotype wild-type alleles, the greater the COPD exacerbation sensitivity. That is, the heterozygous type having one wild type allele is more likely to exacerbate COPD and the heterozygous type having one wild type allele of Siglec 14 than the null mutant type having no wild type allele of Siglec 14. Rather than COPD, the wild type having two wild type alleles homozygously is more likely to deteriorate. Therefore, according to the method of the present invention, the high susceptibility to exacerbation is examined based on the determined number of wild-type alleles of the siglec 14 genotype. That is, in the present invention, the determined number of wild-type alleles of siglec 14 can be used as an index of exacerbation sensitivity.
さらには、決定したシグレック14の遺伝子型においてシグレック14の野生型アレルを有する場合には、高頻度の増悪を生じるリスクがあるものとして検査される。すなわち、シグレック14の野生型アレルをヘテロ接合で有するヘテロ接合型、及びその野生型アレルをホモ接合で有する野生型では、例えば、年間に2回以上、とりわけ年間に3回以上の高頻度の増悪を起こすリスクが高いものとして検査される。 Further, if the determined siglec 14 genotype has a wild type allele of siglec 14, it is tested as being at risk of causing a high frequency of exacerbations. That is, in the heterozygous type having the wild type allele of Siglec 14 in a heterozygote and the wild type having the wild type allele in a homozygote, for example, a high frequency exacerbation of 2 times or more, especially 3 times or more per year. Inspected for high risk of
COPDの増悪は回復に時間を要し、また増悪を繰り返すほど肺機能が急激に低下して生活の質(QOL)や予後が悪化することが知られている。本発明の方法によれば、予めヒト被験体のCOPDの増悪感受性を検査しておくことができるため、増悪を重点的に予防することが望ましいCOPD患者を選択することができて有利である。 It is known that the exacerbation of COPD takes time to recover, and as the exacerbation repeats, the lung function declines rapidly and the quality of life (QOL) and prognosis deteriorate. According to the method of the present invention, since it is possible to test the COPD exacerbation sensitivity of a human subject in advance, it is advantageous in that it is possible to select a COPD patient for which prevention of exacerbation is desired.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[参考例]シグレックタンパク質及び抗シグレック抗体の製造
(1)シグレックタンパク質の製造
ヒトシグレック14タンパク質の細胞外領域;3つの免疫グロブリン(Ig)様ドメインを含む)とヒトIgG Fc領域との融合タンパク質を既報に従って調製した(Angata T et al., FASEB J. 2006, 20(12):1964-1973、特開2006-345786号公報)。具体的には、まず、ヒトシグレック14タンパク質の完全長cDNA(GenBankアクセッション番号AY854038)をプラスミド中にクローニングし、それを鋳型DNAとして、シグレック14の細胞外領域に相当する核酸配列をPCRによりPfu DNAポリメラーゼを用いて増幅した。このPCRには以下のプライマーを使用した:HsSig5/14 Expr F(5'-ccctctagagccaccATGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCCC-3'(配列番号10); "tctaga"はXbaI部位である)及びHsSig14 Fc R(5'-atcGGAAGAGGAGCTTCTCTGCACA-3'(配列番号11); 5'末端の配列"atc"はEcoR V部位の半配列である)(両プライマー配列中、大文字はシグレック14のcDNA配列に一致する塩基を表す)。得られたPCR産物をXbaIで切断し、ヒトIgG Fc領域コード配列を含むプラスミドEK-Fc/pcDNA3.1(-)のXbaI-EcoR V部位にクローニングし、インサートの配列を確認した。EK-Fc/pcDNA3.1(-)は、pcDNA3.1(-)(Invitrogen社)のEcoRVとEcoRIサイトの間にFLAGタグ/エンテロキナーゼ認識配列をコードする領域及びヒトIgG1のヒンジ領域からC末端(Fc)までをコードするゲノム由来DNA断片を挿入したベクターである。FLAGタグ/エンテロキナーゼ認識配列をコードする領域の5'上流に読み枠が合うようにEK-Fc/pcDNA3.1(-)にcDNA断片を挿入する事により、挿入したcDNA断片(ここではシグレック14の上記細胞外領域をコードするインサート)由来のポリペプチドとFLAGタグ/エンテロキナーゼ認識配列、ヒトIgGのヒンジ領域及びFc領域が融合された可溶性タンパク質を発現するための組換え発現ベクターを得ることができる。
[Reference Example] Manufacture of siglec protein and anti-Siglec antibody (1) Manufacture of siglec protein Fusion of extracellular region of human siglec 14 protein; including three immunoglobulin (Ig) -like domains) and human IgG Fc region The protein was prepared according to previous reports (Angata T et al., FASEB J. 2006, 20 (12): 1964-1973, JP 2006-345786). Specifically, first, a full-length cDNA of human Siglec 14 protein (GenBank accession number AY854038) was cloned into a plasmid, and using it as a template DNA, a nucleic acid sequence corresponding to the extracellular region of Siglec 14 was obtained by PCR using Pfu. Amplified using DNA polymerase. The following primers were used for this PCR: HsSig5 / 14 Expr F (5'-ccctctagagccaccATGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCCC-3 '(SEQ ID NO: 10); "tctaga" is the XbaI site) and HsSig14 Fc R (5'-atcGGAAGAGGAGCTTCTCTGCACA-3 '(SEQ ID NO: 11); the sequence “atc” at the 5 ′ end is a half sequence of the EcoR V site) (in both primer sequences, capital letters represent bases that match the cDNA sequence of Siglec 14). The obtained PCR product was cleaved with XbaI and cloned into the XbaI-EcoR V site of the plasmid EK-Fc / pcDNA3.1 (−) containing the human IgG Fc region coding sequence, and the sequence of the insert was confirmed. EK-Fc / pcDNA3.1 (-) is a C-terminal from the hinge region of human IgG1 and the region encoding the FLAG tag / enterokinase recognition sequence between the EcoRV and EcoRI sites of pcDNA3.1 (-) (Invitrogen) (Fc) is a vector inserted with a genome-derived DNA fragment encoding up to (Fc). By inserting the cDNA fragment into EK-Fc / pcDNA3.1 (−) so that the reading frame fits 5 ′ upstream of the region encoding the FLAG tag / enterokinase recognition sequence, the inserted cDNA fragment (here, Siglec 14) To obtain a recombinant expression vector for expressing a soluble protein in which a polypeptide derived from the above-mentioned extracellular region) and a FLAG tag / enterokinase recognition sequence, the hinge region of human IgG, and the Fc region are fused. it can.
得られた組換え発現ベクターを、リポフェクトアミン2000を用いて293細胞に導入した。次いで培地を、2%低IgG-FBS(HyClone, Logan, UT, USA)を含むOpti-MEM(Invitrogen)に交換し、6日間培養した。回収した培地を遠心分離して培養上清を採取し、産生した組換えタンパク質(上記シグレック14細胞外領域+Fcの融合タンパク質;Siglec-14-Fc)を、プロテインAセファロースへの吸着、0.1 Mグリシン-HClバッファー(pH 3.0)による抽出及び1/10量の1M Tris-HClバッファー(pH 8.0)での中和により、培養上清から精製した。 The resulting recombinant expression vector was introduced into 293 cells using Lipofectamine 2000. The medium was then replaced with Opti-MEM (Invitrogen) containing 2% low IgG-FBS (HyClone, Logan, UT, USA) and cultured for 6 days. The collected medium is centrifuged to collect the culture supernatant, and the produced recombinant protein (Siglec 14 extracellular region + Fc fusion protein; Siglec-14-Fc) is adsorbed to protein A sepharose, 0.1 M glycine. The culture supernatant was purified by extraction with -HCl buffer (pH 3.0) and neutralization with 1/10 volume of 1M Tris-HCl buffer (pH 8.0).
また上記と同様の方法で、ヒトシグレック5タンパク質の細胞外領域(3つの免疫グロブリン(Ig)様ドメインを含む、ヒトシグレック14の上記細胞外領域と対応する領域)とヒトIgG Fc領域との融合タンパク質(Siglec-5-Fc)を作製し、精製した。
In the same manner as described above, the fusion of the extracellular region of
(2)抗シグレック14抗体の作成
次いで、このようにして得られた、シグレック14の細胞外領域とIgG Fc領域との融合タンパク質(Siglec-14-Fc)を用いて、シグレック14を特異的に認識する抗体を既報に従って作製した(Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19(8):841-846)。
(2) Preparation of anti-Siglec 14 antibody Next, using the thus obtained fusion protein (Siglec-14-Fc) of the extracellular region of Siglec 14 and the IgG Fc region, Siglec 14 was specifically produced. Recognizing antibodies were prepared according to previous reports (Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19 (8): 841-846).
具体的には、BALB/cマウスを、上記で精製した組換え融合タンパク質Siglec-14-Fcを用いて繰り返し免疫した後、その脾臓を採取し、ポリエチレングリコールを用いて脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を常法により融合した。得られたハイブリドーマクローンを、シグレック14又はシグレック5完全長タンパク質発現ベクターを導入したCOS-7細胞を用いたフローサイトメトリーにより、シグレック14又はシグレック5に対する反応性についてスクリーニングした。次いで、シグレック14又はシグレック5を安定的に発現するTHP-1細胞を用いたフローサイトメトリーにより、さらにシグレック14又はシグレック5に対する反応性についてスクリーニングした。このようにして、シグレック14を特異的に認識しシグレック5を認識しない抗体を産生するハイブリドーマクローン(Clone 40-1)を作製した。このハイブリドーマクローンclone 40-1の無血清培養上清をプロテインGセファロース(登録商標)(GE Healthcare)への吸着に供することによって、シグレック14特異的モノクローナル抗体を精製した。このシグレック14特異的モノクローナル抗体(clone 40-1)は、シグレック14の細胞外領域の免疫グロブリン様ドメイン3に結合する抗体である。
Specifically, BALB / c mice were repeatedly immunized with the recombinant fusion protein Siglec-14-Fc purified above, and then their spleens were collected, and spleen cells and mouse-derived myeloma cells using polyethylene glycol Were fused by a conventional method. The resulting hybridoma clones were screened for reactivity to Siglec 14 or
なお、シグレック14とシグレック5の両方を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体(Clone 194128)は、R&D Systems社(Minneapolis, MN, USA)から市販品を購入して後述の実施例で用いた。
A mouse monoclonal antibody (Clone 194128) that specifically recognizes both Siglec 14 and
[実施例1]シグレック14遺伝子(SIGLEC14)の遺伝的多型とCOPD増悪の相関
日本医科大学呼吸ケアクリニックに来訪した外来患者のうち、以下の条件を満たす方に研究への参加意思の有無を訊ねた:(1)現在又は過去に喫煙歴があること、(2)咳嗽、喀痰、呼吸困難があること。研究参加の意志表示をした患者からはインフォームドコンセントを得た。肺機能検査は肺機能検査システムCHESTAC(Chest株式会社)を用いて行い、常法に従って気管支拡張薬投与後の1秒率(FEV1/FVC)が0.7以下の患者を慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者と診断した。COPD患者に対しては1年間にわたり毎月フォローアップを行い、増悪に関する質問を含む問診を行った。問診では、Anthonisenらの定義(Anthonisen NR et al., Ann Intern Med. 1987, 106:196-204)による細菌性の増悪の有無、及びRodriguez-Roisinの定義(Rodriguez-Roisin, R. Chest 2000, 117:398S-401S)によるより軽度な増悪を含む増悪の頻度の両方について質問した。
[Example 1] Correlation between genetic polymorphism of Siglec 14 gene (SIGLEC14) and exacerbation of COPD Among outpatients visiting the Nippon Medical University Respiratory Care Clinic, whether or not they are willing to participate in the study Kneeling: (1) A current or past smoking history, (2) Cough, sputum, difficulty breathing. Informed consent was obtained from patients who indicated their intention to participate in the study. Pulmonary function tests are performed using the pulmonary function test system CHESTAC (Chest Co., Ltd.), and patients with a 1-second rate (FEV 1 / FVC) after administration of bronchodilators of 0.7 or less according to conventional methods are treated with chronic obstructive pulmonary disease (COPD ) Diagnosed as patient. Patients with COPD were followed up monthly for one year, and were interviewed with questions about exacerbations. In the interview, the presence or absence of bacterial exacerbation by the definition of Anthonisen et al. (Anthonisen NR et al., Ann Intern Med. 1987, 106: 196-204) and the definition of Rodriguez-Roisin (Rodriguez-Roisin, R. Chest 2000, 117: 398S-401S) was asked about both the frequency of exacerbations, including milder exacerbations.
一方、患者の末梢血より常法に従いDNAを採取し、シグレック14遺伝的多型の解析を既報に準じて行った(Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19(8):841-6;特開2010-35551号公報)。具体的には、患者から同意のもと末梢血約10 mlを採取し、ACK溶血液(150 mM塩化アンモニウム、10 mM炭酸水素カリウム、0.1 mMエチレンジアミン四酢酸)を用いて赤血球を溶血させた。この液から遠心操作により白血球を得た。得られた白血球(5 x 106細胞)からDNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社)を用いてゲノムDNAを精製した。このゲノムDNAを鋳型として、PCRを実施した。PCRに用いた反応液(20μl)の組成は以下の通り:ゲノムDNA 100 ng、プライマー各0.3μM、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各0.2 mM、耐熱性DNAポリメラーゼExpand High Fidelity enzyme(ロシュ・ダイアグノスティクス)0.5ユニット、塩化マグネシウム1.5 mM、1 x Expand High Fidelity Buffer(ロシュ・ダイアグノスティクス)。
On the other hand, DNA was collected from the peripheral blood of patients according to a conventional method, and analysis of Siglec 14 genetic polymorphism was performed according to the previous report (Yamanaka M et al., Glycobiology. 2009, 19 (8): 841-6; JP 2010-35551 A). Specifically, about 10 ml of peripheral blood was collected from the patient with consent, and erythrocytes were hemolyzed using ACK hemolyzed blood (150 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid). White blood cells were obtained from this solution by centrifugation. Genomic DNA was purified from the obtained white blood cells (5 × 10 6 cells) using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). PCR was performed using this genomic DNA as a template. The composition of the reaction solution (20 μl) used for PCR was as follows:
PCRの反応サイクルは、94℃で2分の後、(94℃で15秒;56℃で30秒;72℃で90秒)を10サイクル、続いて(94℃で15秒;56℃で30秒;72℃で90秒+各サイクル5秒ずつ延長)を20サイクル、続いて72℃で7分とした。 The PCR reaction cycle is 2 minutes at 94 ° C followed by 10 cycles (94 ° C for 15 seconds; 56 ° C for 30 seconds; 72 ° C for 90 seconds) followed by (94 ° C for 15 seconds; 56 ° C for 30 seconds). Seconds; 90 seconds at 72 ° C. + extended by 5 seconds for each cycle) for 20 cycles, followed by 7 minutes at 72 ° C.
PCRには、シグレック14遺伝子、シグレック5遺伝子及びシグレック14/5融合遺伝子を、それぞれ特異的に増幅する以下に示すプライマーセットを用いた。
For PCR, the following primer sets that specifically amplify each of the Siglec 14 gene,
シグレック14遺伝子増幅用プライマーセット
フォワードプライマー(14F):5'-AGGATTTATTCTCCCATCTCGCT-3'(配列番号6)
リバースプライマー(14R):5'-GATGCTGATGGCGAGGTTCTG-3'(配列番号7)
シグレック5遺伝子増幅用プライマーセット
フォワードプライマー(5F):5'-GTGGTTCTGACATCTCACCTCATC-3'(配列番号8)
リバースプライマー(5R):5'-CCTGAAGATGGTGATGGTCTG-3'(配列番号9)
シグレック14/5融合遺伝子増幅用プライマーセット
フォワードプライマー(14F):5'-AGGATTTATTCTCCCATCTCGCT-3'(配列番号6)
リバースプライマー(5R):5'-CCTGAAGATGGTGATGGTCTG-3'(配列番号9)
Siglec 14 gene amplification primer set Forward primer (14F): 5'-AGGATTTATTCTCCCATCTCGCT-3 '(SEQ ID NO: 6)
Reverse primer (14R): 5'-GATGCTGATGGCGAGGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
Reverse primer (5R): 5'-CCTGAAGATGGTGATGGTCTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
Siglec 14/5 fusion gene amplification primer set Forward primer (14F): 5'-AGGATTTATTCTCCCATCTCGCT-3 '(SEQ ID NO: 6)
Reverse primer (5R): 5'-CCTGAAGATGGTGATGGTCTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
続いて、上記で得られたPCR反応産物を、1%アガロースゲルを用いてTAEバッファー(40 mMトリス、40 mM酢酸、0.1 mMエチレンジアミン四酢酸)中で電気泳動し(各レーン10μl)、増幅産物を分離した。エチジウムブロマイドでゲルを染色し、紫外線ランプで照射してDNAを検出し、撮影した。 Subsequently, the PCR reaction product obtained above was electrophoresed in TAE buffer (40 mM Tris, 40 mM acetic acid, 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid) using a 1% agarose gel (10 μl of each lane), and the amplified product. Separated. The gel was stained with ethidium bromide, and irradiated with an ultraviolet lamp to detect DNA and photographed.
プライマー対5F+5Rはシグレック5遺伝子の一部を、プライマー対14F+14Rはシグレック14遺伝子の一部を特異的に増幅する。プライマー対14F+5Rはシグレック14/5融合遺伝子が存在する場合にはこの遺伝子の約1.7 kbの領域を増幅する。同じプライマー対を用いて野生型アリルから、本実験で用いた反応条件下でこの産物は生じない。
The primer pair 5F + 5R specifically amplifies a part of the
この結果、プライマー対5F+5Rによるシグレック5遺伝子の増幅とプライマー対14F+14Rによるシグレック14遺伝子の増幅の双方が検出されたがプライマー対14F+5Rによるシグレック14/5融合遺伝子の増幅が検出されなかった患者を野生型(WT/WT)と決定した。またプライマー対5F+5Rによるシグレック5遺伝子の増幅とプライマー対14F+14Rによるシグレック14遺伝子の増幅の双方が検出されず、プライマー対14F+5Rによるシグレック14/5融合遺伝子の増幅が検出された患者をヌル変異型(SIGLEC14 null;Null/Null)と決定した。さらに、プライマー対5F+5Rによるシグレック5遺伝子の増幅、プライマー対14F+14Rによるシグレック14遺伝子の増幅、及びプライマー対14F+5Rによるシグレック14/5融合遺伝子の増幅の全てが検出された患者をヘテロ接合型(WT/Null)と決定した。
As a result, both the
さらに、シグレック14遺伝子多型とCOPD増悪との相関を調べるため、JMP genomics software ver 3.1を使用して統計的解析を行った。Anthonisenらの定義による増悪の有無にシグレック14の遺伝子型が及ぼす影響の解析にはロジスティック回帰分析を用いた。Rodriguez-Roisinの定義による増悪の頻度にシグレック14の遺伝子型が及ぼす影響の解析にはポアソン回帰分析を用いた。尤度を最大化する一般化線形モデルを採用した。年齢と性別を共変数とし、増悪頻度に影響があるとされる喫煙状況、吸入ステロイドの使用の有無、気管支拡張薬投与後の1秒量対予測値(FEV1 % predicted)を共変数として解析を行った。 Furthermore, in order to investigate the correlation between the Siglec 14 gene polymorphism and COPD exacerbation, statistical analysis was performed using JMP genomics software ver 3.1. Logistic regression analysis was used to analyze the effect of siglec 14 genotype on the presence or absence of exacerbations as defined by Anthonisen et al. Poisson regression analysis was used to analyze the effect of siglec 14 genotype on the frequency of exacerbations defined by Rodriguez-Roisin. A generalized linear model that maximizes the likelihood is adopted. Analyzes were made using age and gender as covariates, and smoking status, which is considered to have an effect on the frequency of exacerbations, whether or not inhaled steroids are used, and the amount of 1 second after bronchodilator administration versus predicted value (FEV1% predicted). went.
結果を図1〜2及び表1〜2に示す。図1及びにはシグレック14の遺伝子型毎の、Anthonisenらの定義によるCOPDの細菌性増悪の有無の割合を示した。また図2には、シグレック14の遺伝子型毎の、Rodriguez-Roisinの定義によるCOPD増悪の各頻度の割合を示した。 A result is shown to FIGS. 1-2 and Tables 1-2. FIG. 1 and FIG. 1 show the ratio of presence or absence of bacterial deterioration of COPD according to the definition of Anthonisen et al. FIG. 2 shows the ratio of each frequency of COPD exacerbation according to the Rodriguez-Roisin definition for each siglec 14 genotype.
シグレック14の野生型アリルの数と、増悪の有無(図1)、増悪の頻度(図2)との間にはいずれも正の相関が認められ(ヌル変異型[野生型アリル数:0]<ヘテロ接合型[野生型アリル数:1]<野生型[野生型アリル数:2])、いずれも統計的に有意であった(それぞれp = 0.0015およびp = 0.0002)。この結果から、シグレック14遺伝子の野生型アリルの数が多くなるほど、増悪感受性が高くなることが示された(図1及び2)。例えば、野生型アリルをホモ接合で有する野生型(WT/WT)の患者は35〜45%程度の割合で増悪を経験したのに対し、野生型アリルを持たずSIGLEC14-nullアリルのホモ接合であるヌル変異型(Null/Null)の患者でのCOPD増悪割合は10%未満と低く、増悪感受性は顕著に低かった。さらに、野生型アリルの数が多いほど、増悪頻度が特に高い(2回以上、とりわけ3回以上)患者が出現し、すなわち野生型アリルの数が多い場合にはCOPD増悪頻度が特に高くなるリスクがあることも示された(図2)。 A positive correlation was found between the number of wild-type alleles of Siglec 14 and the presence or absence of exacerbation (FIG. 1) and the frequency of exacerbation (FIG. 2) (null mutant type [number of wild-type alleles: 0] <Heterozygous [number of wild-type alleles: 1] <wild-type [number of wild-type alleles: 2]), both were statistically significant (p = 0.015 and p = 0.0002, respectively). From this result, it was shown that the exacerbation susceptibility increases as the number of wild-type alleles of the siglec 14 gene increases (FIGS. 1 and 2). For example, wild-type (WT / WT) patients with wild-type alleles homozygous experienced exacerbations at a rate of about 35-45%, whereas SIGLEC14-null alleles were homozygous without wild-type alleles. The COPD exacerbation rate in patients with a null variant (Null / Null) was low, less than 10%, and the exacerbation sensitivity was significantly lower. In addition, the more wild type alleles, the more frequently patients are exacerbated (more than 2 times, especially more than 3 times), that is, the risk of COPD exacerbations being particularly high when the number of wild type alleles is large. It was also shown that there was (FIG. 2).
この結果から、シグレック14遺伝子型を解析することにより、COPD患者の増悪感受性を予測し、患者を層別化できることが示された。 From this result, it was shown that by analyzing the Siglec 14 genotype, the exacerbation susceptibility of COPD patients can be predicted and the patients can be stratified.
[実施例2]シグレック14を特異的に検出するELISAの開発
参考例で作製したシグレック14を特異的に認識する抗体(clone 40-1)1 mgを、市販のタンパク質ビオチン化キット(Biotin Protein Labeling Kit, ロシュ・ダイアグノスティクス)を用いてビオチン化し、検出用抗体とした。
[Example 2] Development of ELISA that specifically detects siglec 14 1 mg of antibody (clone 40-1) that specifically recognizes siglec 14 prepared in the reference example was added to a commercially available protein biotinylation kit (Biotin Protein Labeling). Kit, Roche Diagnostics), and biotinylated to obtain a detection antibody.
96ウェルプレートの各ウェルに、シグレック5とシグレック14をともに認識する抗体(clone 194128, R&D Systems)を添加(0.1 μg抗体/100 μl PBS/ウェル)し、室温で終夜静置して抗体を固相化した。この溶液を除去し、洗浄バッファー(0.05% Tween 20含有PBS)で各ウェルを3回洗浄(400 μl/ウェル)し、希釈液(1% BSA含有PBS, 300 μl/ウェル)を添加して室温にて1時間ブロッキングを行った。この溶液を除去し、希釈液で段階希釈した標準試料(Siglec-14-Fc及びSiglec-5-Fc)を添加し、室温で2時間静置した。洗浄バッファーで各ウェルを3回洗浄(400 μl/ウェル)し、上記で調製したビオチン化抗シグレック14抗体を添加(0.05 μg抗体/100 μl 1% BSA含有PBS/ウェル)し、室温で2時間静置した。この溶液を除去し、洗浄バッファーで各ウェルを3回洗浄(400 μl/ウェル)し、ストレプトアビジン-コンジュゲート化ホースラディッシュペルオキシダーゼ(希釈液で1:1000希釈、100 μl/ウェル)を添加し、室温で20分静置した。この溶液を除き、洗浄バッファーで各ウェルを3回洗浄(400 μl/ウェル)し、基質(SureBlue Reserve, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)を添加(100 μl/ウェル)し、10〜15分インキュベートし、1N塩酸を添加(100 μl/ウェル)して反応を止め、450 nmの吸光度を測定した。
An antibody (clone 194128, R & D Systems) that recognizes both
結果を図3に示す。このELISAにおいて、Siglec-14-Fcは1.56〜100 ng/mlの範囲で定量的に測定できたのに対し、Siglec-5-Fcは検出されなかった。すなわち、このELISAを用いることにより、類似するシグレック5を検出することなく、シグレック14を特異的に検出し定量することができることが示された。なお基質添加後のインキュベーション時間を変えることにより、増感及び減感が可能であった。
The results are shown in FIG. In this ELISA, Siglec-14-Fc could be quantitatively measured in the range of 1.56 to 100 ng / ml, whereas Siglec-5-Fc was not detected. That is, it was shown that by using this ELISA, Siglec 14 can be specifically detected and quantified without detecting
[実施例3]シグレック14の遺伝的多型と可溶性シグレック14の血中濃度の相関
上記実施例と同様にインフォームドコンセントを得た患者から採血を行い、血清及びゲノムDNAを得た。各患者のシグレック14の遺伝的多型(遺伝子型)の解析を実施例1と同様の手順で行った。
[Example 3] Correlation between genetic polymorphism of siglec 14 and blood concentration of soluble siglec 14 In the same manner as in the above example, blood was collected from a patient who obtained informed consent, and serum and genomic DNA were obtained. Each patient's siglec 14 genetic polymorphism (genotype) was analyzed in the same manner as in Example 1.
血清は希釈液(1% BSA含有PBS)を用いて20倍に希釈し、これを被験サンプルとして、実施例2に記載したシグレック14を特異的に検出するELISAを実施した。また、同血清を希釈液を用いて200倍に希釈し、市販のシグレック5と14をともに検出できる抗体を用いたELISAキット(R&D Systems)を使用してシグレック5及びシグレック14の総濃度も測定した。
Serum was diluted 20-fold with a diluent (PBS containing 1% BSA), and this was used as a test sample, and ELISA for specifically detecting Siglec 14 described in Example 2 was performed. In addition, the serum is diluted 200-fold with a diluent, and the total concentration of
結果を図4に示す。黒い棒グラフはシグレック14特異的に検出するELISA、白い棒グラフはシグレック5と14をともに検出するELISAを用いて、同一セットの試料を測定した結果である。試料1〜19はシグレック14の遺伝子型がヌル変異型(Null/Null)の患者、試料20〜37はヘテロ接合型(WT/Null)の患者、試料38〜53は野生型(WT/WT)の患者に由来する血清である。
The results are shown in FIG. The black bar graph is the result of measuring the same set of samples using an ELISA that specifically detects Siglec 14 and the white bar graph is the ELISA that detects both
図4に示すように、シグレック14特異的に検出するELISAを用いて測定した結果、シグレック14遺伝子型がWT/WT及びWT/Nullの患者からは、可溶性シグレック14が検出されたが、Null/Nullの患者からは検出されなかった。したがってNull/Nullとそれ以外の遺伝子型を血清中の可溶性シグレック14タンパク質の有無に基づいて鑑別することが可能である。さらに、シグレック14遺伝子型がWT/WTの患者の血清中可溶性シグレック14濃度はWT/Nullのそれと比較して高い傾向が認められ、シグレック14の野生型アレルの数に応じて血中の可溶性シグレック14濃度が高くなることが示された。 As shown in FIG. 4, as a result of measurement using an ELISA that specifically detects siglec 14, soluble siglec 14 was detected from patients with siglec 14 genotypes of WT / WT and WT / Null. It was not detected in Null patients. Therefore, it is possible to differentiate between Null / Null and other genotypes based on the presence or absence of soluble Siglec 14 protein in serum. Furthermore, the concentration of soluble Siglec 14 in the serum of patients with Siglec 14 genotype WT / WT tends to be higher than that of WT / Null, and soluble Siglec in the blood depends on the number of wild-type alleles of Siglec 14. 14 concentration was shown to be higher.
なお、シグレック5とシグレック14をともに検出するELISAを用いて測定した結果、Null/Nullの患者の血清からは可溶性シグレック5/シグレック14はごく微量しか検出されなかった。すなわち、血中に可溶性形態で存在するのはほとんどシグレック14であり、シグレック5は血中に存在しないか、存在してもごく微量であることが示された。
In addition, as a result of measuring using ELISA which detects both
本発明は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の増悪感受性と強く相関する遺伝的マーカー及び血清マーカー等を検出することにより、増悪感受性に基づく患者の層別化と個別化治療を可能とすることができる。増悪感受性の検査・判定結果に基づいてCOPD患者の適切な層別化やモニタリングを行うことにより、患者のQOL及び予後の改善、並びに医療資源の有効利用につなげることができる。 The present invention enables stratification and individualized treatment of patients based on exacerbation sensitivity by detecting genetic markers and serum markers that are strongly correlated with exacerbation susceptibility of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). be able to. Appropriate stratification and monitoring of COPD patients based on the exacerbation susceptibility test / judgment results can lead to improved patient QOL and prognosis, and effective use of medical resources.
配列番号6〜11:プライマー SEQ ID NOs: 6-11: primers
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