JP5930146B2 - Immunostimulatory oligonucleotide and therapeutic agent comprising said immunostimulatory oligonucleotide - Google Patents
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Description
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび前記免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む治療剤に関する。 The present invention relates to an immunostimulatory oligonucleotide and a therapeutic agent comprising the immunostimulatory oligonucleotide.
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は免疫系の多くの細胞に存在し、先天性免疫反応に関連する。脊椎動物において、このファミリーはＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１と呼ばれる１１種のタンパク質からなり、それらは、細菌、真菌、寄生虫、およびウィルスからの病原体関連分子パターンを認識する。 Toll-like receptors (TLRs) are present in many cells of the immune system and are associated with innate immune responses. In vertebrates, this family consists of eleven proteins called TLR1-TLR11, which recognize pathogen-related molecular patterns from bacteria, fungi, parasites, and viruses.
ＴＬＲファミリーの中のＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチド内の非メチル化ＣｐＧモチーフ（以下ＣｐＧと記す）を認識することが知られている（非特許文献２、４）。細菌性ＤＮＡは、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるサイトカイン産生を誘導する。細菌性ＤＮＡの細胞活性化は、非メチル化されたＣｐＧを中心に含む短い配列によるとされている。 TLR9 in the TLR family is known to recognize unmethylated CpG motifs (hereinafter referred to as CpG) in bacterial DNA and synthetic oligonucleotides (Non-Patent Documents 2 and 4). Bacterial DNA induces cytokine production by macrophages and natural killer (NK) cells. Cellular activation of bacterial DNA is believed to be due to a short sequence centered on unmethylated CpG.
細菌性ＤＮＡがマクロファージを刺激して、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生を誘導することも報告されている（非特許文献３）。これらのサイトカインは、さらにＢ細胞からＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生を誘導することが知られている。また、細菌性ＤＮＡまたはＣｐＧを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドのいずれかをＢ細胞に添加することによりＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの産生を誘導することが報告されている（非特許文献５、６）。これらの結果は、ＣｐＧ含有配列がＴｈ１型の免疫応答を誘導する能力を有することを示している。 It has also been reported that bacterial DNA stimulates macrophages to induce the production of IL-12 and TNF-α (Non-patent Document 3). These cytokines are further known to induce the production of IL-12 and IFN-γ from B cells. In addition, it has been reported that the production of IL-6, IL-12, and IFN-γ is induced by adding either bacterial DNA or immunostimulatory oligonucleotides containing CpG to B cells (Non-patent literature). 5, 6). These results indicate that CpG-containing sequences have the ability to induce Th1-type immune responses.
Ｔｈ１型の免疫応答の誘導を示す免疫刺激オリゴヌクレオチドを利用した治療法が研究されている（非特許文献１）。例えば、抗原と免疫刺激ヌクレオチドの結合体、あるいはそれに類する近接体を投与する方法が見出されている。結合体の投与によって、特定の抗原に対するＴｈ２型免疫応答をダウンレギュレートしながら同じ抗原に対するＴｈ１型免疫応答を増強されることが示されている。このような処置は、アレルギー、腫瘍、自己免疫疾患などの疾患に有効であることが述べられている（非特許文献７、８、９、１６）。 Therapeutic methods using immunostimulatory oligonucleotides showing induction of Th1-type immune responses have been studied (Non-patent Document 1). For example, methods have been found to administer conjugates of antigen and immunostimulatory nucleotides, or similar proximity. It has been shown that administration of the conjugate enhances a Th1-type immune response against the same antigen while down-regulating a Th2-type immune response against a particular antigen. It is stated that such treatment is effective for diseases such as allergies, tumors, and autoimmune diseases (Non-Patent Documents 7, 8, 9, and 16).
天然のＤＮＡに存在するホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドは細胞内および細胞培地中において様々な核酸分解活性によって分解されやすい。そのため、核酸分解酵素の攻撃標的であるヌクレオチド間のホスホジエステル結合を置換することによる安定化、さらにその結果としてのＴｈ１型の免疫応答の誘導の増加の検討が行われている。頻繁に用いられている置換方法としては、ホスホジエステルからホスホロチオエートへの置換である（非特許文献１０、１１）。免疫刺激オリゴヌクレオチドのパリンドローム外のＣｐＧ配列をホスホチロオエート修飾することにより、免疫応答の誘導が増強されることも報告されている（非特許文献１２）。 Oligonucleotides having phosphodiester bonds present in natural DNA are susceptible to degradation by various nucleolytic activities in cells and in cell culture media. For this reason, studies have been conducted on stabilization by substitution of phosphodiester bonds between nucleotides, which are attack targets of nucleolytic enzymes, and further increase in induction of Th1-type immune responses as a result. A frequently used substitution method is substitution from phosphodiester to phosphorothioate (Non-patent Documents 10 and 11). It has also been reported that the induction of immune response is enhanced by modifying the CpG sequence outside the palindrome of the immunostimulatory oligonucleotide by phosphotylooate modification (Non-patent Document 12).
ＤＮＡのチオール化は核酸分解酵素に対する抵抗性を高めるが、非特異的な蛋白質吸着の起因となり、細胞毒性等の副作用を示す。またＤＮＡ結合蛋白との相互作用が弱められるため免疫刺激活性の低下を招く（非特許文献１３）。従って、チオール修飾がＣｐＧのＴｈ１型の免疫応答を低下させている可能性がある。また動物実験では、通常、チオール修飾ＣｐＧが用いられるが、致命的な副作用をもたらすことが報告されている（非特許文献１４）。 Thiolation of DNA increases resistance to nucleolytic enzymes, but causes nonspecific protein adsorption and exhibits side effects such as cytotoxicity. Moreover, since the interaction with the DNA binding protein is weakened, the immunostimulatory activity is reduced (Non-patent Document 13). Therefore, thiol modification may reduce the Th1-type immune response of CpG. In animal experiments, thiol-modified CpG is usually used, but has been reported to cause fatal side effects (Non-patent Document 14).
ホスホジエステルヌクレオチドからのみ構成されるＣｐＧを含む配列にデオキシグアニル酸の繰り返し構造（ポリＧ配列）を付加することによって、免疫応答の誘導が増強されることが報告されている（非特許文献１５）。ポリＧ配列は自然界では染色体ＤＮＡの末端部分（テロメア）に存在し、四重鎖ＤＮＡ構造を形成することがしられている。そのために、ＣｐＧを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドの末尾に付加されたポリＧにより、免疫刺激オリゴヌクレオチドが高次構造を形成し、核酸分解に対する抵抗性が高まり、免疫応答が安定に行われると考えられる。 It has been reported that induction of immune response is enhanced by adding a repeating structure of deoxyguanylic acid (poly G sequence) to a sequence containing CpG composed only of phosphodiester nucleotides (Non-patent Document 15). . Poly G sequences are present in nature at the terminal portion (telomeres) of chromosomal DNA, and form a quadruplex DNA structure. Therefore, it is considered that the immunostimulatory oligonucleotide forms a higher-order structure due to the poly G added to the end of the immunostimulatory oligonucleotide containing CpG, increases the resistance to nucleic acid degradation, and the immune response is stably performed. .
一方、ポリＧそのものはマウスＢ細胞ではＩＦＮ−γ産生を抑制することが報告されており、Ｇの付加は活性の消失・抑制にも影響することが懸念される（非特許文献１７）。 On the other hand, poly G itself has been reported to suppress IFN-γ production in mouse B cells, and it is feared that addition of G also affects the disappearance / suppression of activity (Non-patent Document 17).
ホスホジエステルヌクレオチドからのみ構成される非修飾型オリゴヌクレオチドは核酸分解酵素に対する耐性が低く、短時間で分解される。
しかし、核酸分解酵素に対する抵抗性を高めた既存のホスホチロオエート修飾ＣｐＧならびにポリＧ配列の付加では、副作用ならびに免疫刺激活性の消失・抑制といった問題がある。
本発明は、副作用が少なく、臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
Unmodified oligonucleotides composed only of phosphodiester nucleotides have low resistance to nucleolytic enzymes and are degraded in a short time.
However, the addition of existing phosphotyrosate-modified CpG and poly G sequences with increased resistance to nucleolytic enzymes has problems such as side effects and disappearance / suppression of immunostimulatory activity.
An object of the present invention is to provide an unmodified oligonucleotide having strong Th1 immunostimulatory activity with few side effects and potential for clinical application.
本発明者らはこの課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成される繰り返し単位を４以上含むオリゴヌクレオチドの中に、ヒトで高い免疫刺激活性、すなわち、ヒトにおいてＴｏｌｌ様受容体９を介した免疫応答の高い誘導活性を示すオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の構成を有する。
As a result of intensive studies to solve this problem, the present inventors have achieved high immunostimulatory activity in humans, that is, in humans, among oligonucleotides containing 4 or more repeating units composed of 5′GTCGTT3 ′. The inventors have found an oligonucleotide exhibiting a high inducing activity of immune response via Toll-like receptor 9, and have completed the present invention.
The present invention has the following configuration.
（１）一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列と、前記コア塩基配列を連結する１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなり、前記コア塩基配列を４以上含むことを特徴とする免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (1) It comprises a core base sequence represented by the general formula 5′GTCGTT3 ′ and a linked base sequence composed of one or more bases linking the core base sequence, and comprises 4 or more core base sequences. An immunostimulatory oligonucleotide.
（２）前記連結塩基配列が、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかであることを特徴とする（１）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (2) The immunostimulatory oligonucleotide according to (1), wherein the linked base sequence is any one of C, TT, and TC.
（３）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (3) The immunostimulatory oligonucleotide according to (1) or (2), wherein the base sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGGTTCGTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 1).
（４）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号２）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (4) The immunostimulatory oligonucleotide according to (1) or (2), wherein the base sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGGTTTGTGTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 2).
（５）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号３）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (5) The immunostimulatory oligonucleotide according to (1) or (2), characterized in that the base sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGGTTTGTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 3).
（６）塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号４）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド。 (6) The nucleotide sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGGTTTCGTCGTTCGTCGGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTGTGTTT-3 '(SEQ ID NO: 4), which is characterized by immunity (2)
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする治療剤。 (7) A therapeutic agent comprising the immunostimulatory oligonucleotide according to any one of (1) to (6).
（８）前記疾患又は障害がアレルギー疾患であることを特徴とする（７）に記載の治療剤。 (8) The therapeutic agent according to (7), wherein the disease or disorder is an allergic disease.
（９）前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症であることを特徴とする（８）に記載の治療剤。 (9) The therapeutic agent according to (8), wherein the allergic disease is pollen allergy.
（１）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列と、１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなる構成なので、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成される非修飾型オリゴヌクレオチドとすることができる。前記コア塩基配列を４以上含む構成により、核酸分解酵素に対して耐性を有し、分解を抑制することができる。
また、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成し、ホスホロチオエートを含まない構成なので、治療薬の成分として利用した場合でも、副作用を生じさせないようにできる。
更にまた、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、前記コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトにおける免疫刺激活性を高めることができる。
以上により、副作用が少なく、臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドを提供することができる。
また、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤を提供することができ、有益性および有用性の高い医薬品を提供することができる。
(1) Since the immunostimulatory oligonucleotide of the present invention is composed of a core base sequence represented by the general formula 5′GTCGTT3 ′ and a linked base sequence composed of one or more bases, it is composed only of phosphodiester nucleotides. It can be an unmodified oligonucleotide. The structure containing 4 or more core base sequences has resistance to nucleolytic enzymes and can suppress degradation.
Moreover, since it is comprised only from a phosphodiester nucleotide and does not contain phosphorothioate, even when it is used as a component of a therapeutic agent, side effects can be prevented.
Furthermore, since the immunostimulatory oligonucleotide of the present invention comprises 4 or more of the core base sequence, it can enhance immunostimulatory activity in humans.
As described above, it is possible to provide an unmodified oligonucleotide having strong Th1 immunostimulatory activity with few side effects and having potential for clinical application.
Moreover, the delivery complex and immunostimulant which contain the immunostimulatory oligonucleotide of this invention as an active ingredient can be provided, and a pharmaceutical with high usefulness and usefulness can be provided.
（２）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、前記連結塩基配列が、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかである構成なので、容易にかつ安定な免疫刺激オリゴヌクレオチドとすることができる。 (2) Since the immunostimulatory oligonucleotide of the present invention has a structure in which the linking base sequence is any one of C, TT, and TC, it can be easily and stably made an immunostimulatory oligonucleotide.
（３）〜（６）本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、配列番号１から４のいずれかで示される塩基配列である構成なので、ヒトに対して免疫刺激活性を有する、オリゴヌクレオチドを提供することができる。 (3) to (6) Since the immunostimulatory oligonucleotide of the present invention has a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4, an oligonucleotide having immunostimulatory activity for humans is provided. Can do.
（７）本発明の治療剤は、先に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む構成なので、免疫系が正常に機能していない疾患または障害、あるいは免疫機能を増強させることが有効である疾患または障害を効果的に処置、予防もしくは改善することができる。
また、本発明の治療剤は、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド、またはこれらを有効成分として含有する送達複合体をアジュバントとして含むワクチンとすることができる。
以上により、本発明の治療剤は、有益性および有用性高い医薬品として利用できる。
(7) Since the therapeutic agent of the present invention comprises the immunostimulatory oligonucleotide described above, a disease or disorder where the immune system is not functioning normally, or a disease or disorder where it is effective to enhance immune function Can be effectively treated, prevented or improved.
Moreover, the therapeutic agent of this invention can be used as the vaccine which contains the immunostimulatory oligonucleotide of this invention, or the delivery complex containing these as an active ingredient as an adjuvant.
As described above, the therapeutic agent of the present invention can be used as a highly useful and useful pharmaceutical product.
（８）本発明の治療剤は、前記疾患又は障害がアレルギー疾患である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチド、および免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤が、アレルギー疾患に対する免疫機能をより増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果をより高めることができる。 (8) When the disease or disorder is an allergic disease, the therapeutic agent of the present invention is an immunostimulatory oligonucleotide according to an embodiment of the present invention, a delivery complex containing the immunostimulatory oligonucleotide as an active ingredient, The immunostimulant can further enhance the immune function against allergic diseases, and can further enhance the effect of its treatment, prevention or improvement.
（９）本発明の治療剤は、前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび免疫刺激オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する送達複合体や免疫刺激剤が、花粉アレルギー症に対する免疫機能を更に増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果を更に高めることができる。 (9) When the allergic disease is pollen allergy, the therapeutic agent of the present invention is a delivery complex or immunity containing the immunostimulatory oligonucleotide according to the embodiment of the present invention and the immunostimulatory oligonucleotide as active ingredients. The stimulant can further enhance the immune function against pollen allergy, and can further enhance the effect of its treatment, prevention or improvement.
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む治療剤について説明する。 Hereinafter, an immunostimulatory oligonucleotide which is an embodiment of the present invention and a therapeutic agent containing the oligonucleotide will be described with reference to the accompanying drawings.
（本発明の実施形態）
＜免疫刺激オリゴヌクレオチド＞
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、一般式５’ＧＴＣＧＴＴ３’で表されるコア塩基配列（繰り返し単位）と、前記コア塩基配列を連結する１以上の塩基からなる連結塩基配列とからなり、前記コア塩基配列を４以上含む。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成されるコア塩基配列を４以上含むことにより、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。また、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高い。
(Embodiment of the present invention)
<Immunostimulatory oligonucleotide>
An immunostimulatory oligonucleotide according to an embodiment of the present invention includes a core base sequence (repeating unit) represented by the general formula 5′GTCGTT3 ′ and a linked base sequence composed of one or more bases linking the core base sequence. And contains 4 or more of the core base sequence.
By containing 4 or more core base sequences composed of 5′GTCGTT3 ′, it has high immunostimulatory activity against humans and mice. Moreover, it is not degraded in serum having nucleolytic activity in 12 hours, and the stability in serum is high.
なお、本実施形態において、免疫刺激オリゴヌクレオチドがヒトに対して免疫刺激活性を有するとは、ヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株ＨＥＫ２９３細胞に、ヒトＴＬＲ９の構造遺伝子を組み込み、ヒトＴＬＲ９が恒常的に発現するようにした２９３−ｈＴＬＲ９細胞において、転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を誘導する作用のことを示す。 In the present embodiment, the immunostimulatory oligonucleotide has immunostimulatory activity against humans. The human TLR9 cell line HEK293 cells established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of adenovirus The effect | action which induces the activation of transcription factor NF-kB in the 293-hTLR9 cell which integrated the structural gene and was made to express human TLR9 constitutively is shown.
前記連結塩基配列は、Ｃ、ＴＴ又はＴＣのいずれかであることが好ましい。連結塩基配列をＣ、ＴＴ又はＴＣのいずれかとすることにより、コア塩基配列を容易に連結できるとともに、免疫刺激活性に悪影響を与えない。 The linking base sequence is preferably C, TT or TC. By setting the linking base sequence to any one of C, TT, and TC, the core base sequence can be easily linked and the immunostimulatory activity is not adversely affected.
また、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、安定性の高いホスホジエステルヌクレオチドのみから構成される非修飾型オリゴヌクレオチドとする構成であり、核酸分解酵素に対して耐性を有し、分解を抑制することができる。
更にまた、ホスホジエステルヌクレオチドのみから構成し、ホスホロチオエートを含まない構成なので、治療薬の成分として利用した場合でも、副作用を生じさせないようにできる。
In addition, the immunostimulatory oligonucleotide according to the embodiment of the present invention has a configuration in which it is an unmodified oligonucleotide composed only of highly stable phosphodiester nucleotides, has resistance to nucleolytic enzymes, and is degraded. Can be suppressed.
Furthermore, since it is composed only of phosphodiester nucleotides and does not contain phosphorothioate, side effects can be prevented even when used as a component of a therapeutic agent.
なお、一般に、生理活性を有する核酸において、少数の塩基が置換し、欠失し及び／又
は挿入された場合であっても、もとの核酸の生理活性が維持される場合があることは当業者において広く知られているところである。
In general, in a nucleic acid having physiological activity, even if a small number of bases are substituted, deleted, and / or inserted, the physiological activity of the original nucleic acid may be maintained. It is widely known by contractors.
従って、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が置換されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。 Therefore, as long as it contains 4 or more core base sequences, 1 to 4 bases may be substituted in other core base sequences and linked base sequences. Even in this case, since it has a structure containing 4 or more core base sequences, it has high immunostimulatory activity against humans and mice.
また、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が欠失されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。 Moreover, as long as it contains 4 or more core base sequences, 1 to 4 bases may be deleted in other core base sequences and linked base sequences. Even in this case, since it has a structure containing 4 or more core base sequences, it has high immunostimulatory activity against humans and mice.
また、コア塩基配列を４以上含んでいれば、他のコア塩基配列及び連結塩基配列において、１個ないし４個の塩基が挿入されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。 Moreover, as long as it contains 4 or more core base sequences, 1 to 4 bases may be inserted in other core base sequences and linked base sequences. Even in this case, since it has a structure containing 4 or more core base sequences, it has high immunostimulatory activity against humans and mice.
このような置換、欠失及び／又は挿入の塩基数は、好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個以下であり、最も好ましくは０個である。
また、置換、欠失及び／又は挿入の部位としては、コア塩基配列を４以上含み、ヒトに対する免疫刺激活性が維持されるのであれば、何ら限定されない。
The number of bases for such substitution, deletion and / or insertion is preferably 2 or less, more preferably 1 or less, and most preferably 0.
The substitution, deletion and / or insertion site is not limited as long as it contains 4 or more core base sequences and immunostimulatory activity against humans is maintained.
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、例えば、次に示す配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドである。
配列番号１：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号２：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号３：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
配列番号４：塩基配列が５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’である免疫刺激オリゴヌクレオチド。
The immunostimulatory oligonucleotide which is an embodiment of the present invention is, for example, the immunostimulatory oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 4 shown below.
Sequence number 1: The immunostimulatory oligonucleotide whose base sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCGGTTT-3 '.
SEQ ID NO: 2: An immunostimulatory oligonucleotide having a base sequence of 5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTCGTCGTTTTGTCTT-3 ′.
Sequence number 3: The immunostimulatory oligonucleotide whose base sequence is 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 '.
SEQ ID NO: 4: An immunostimulatory oligonucleotide having a base sequence of 5′-TCGTCGTTTTGTCGTTGTGTCGTTGTGTCGTTTTGTCGTTGTGTCGTTTTGTTCGTTTGTGTGTTT-3 ′
配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、いずれも５’ＧＴＣＧＴＴ３’で構成されるコア塩基配列を４以上含み、ヒトに対して高い免疫刺激活性を有する。また、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高い。 All of the immunostimulatory oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 4 contain 4 or more core base sequences composed of 5'GTCGTT3 'and have high immunostimulatory activity against humans. Moreover, it is not degraded in serum having nucleolytic activity in 12 hours, and the stability in serum is high.
配列番号１〜４の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、コア塩基配列を４以上含んでいれば、それらの塩基配列で１個ないし４個の塩基が置換し、欠失し及び／若しくは挿入されていてもよい。この場合でも、コア塩基配列を４以上含む構成なので、ヒトおよびマウスに対して高い免疫刺激活性を有する。 If the immunostimulatory oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1-4 contain 4 or more core base sequences, 1 to 4 bases may be substituted, deleted and / or inserted in those base sequences. Good. Even in this case, since it has a structure containing 4 or more core base sequences, it has high immunostimulatory activity against humans and mice.
このような置換、欠失及び／又は挿入の塩基数は、好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個以下であり、最も好ましくは０個である。また、置換、欠失及び／又は挿入の部位としては、コア塩基配列を４以上含み、ヒトに対する免疫刺激活性が維持されるのであれば、何ら限定されない。 The number of bases for such substitution, deletion and / or insertion is preferably 2 or less, more preferably 1 or less, and most preferably 0. The substitution, deletion and / or insertion site is not limited as long as it contains 4 or more core base sequences and immunostimulatory activity against humans is maintained.
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドは、従来の技術及び核酸合成装置で合成できる。
これらの合成方法は酵素的方法又は化学的方法であり、本発明の配列より長い配列の合成を含む方法であるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
これらのオリゴヌクレオチドの合成技術、修飾技術は特許文献１、２及び非特許文献１〜１７においても用いられており、その他にも多数の報告が確認される公知の技術である。
The immunostimulatory oligonucleotide which is an embodiment of the present invention can be synthesized by conventional techniques and nucleic acid synthesizers.
These synthetic methods are enzymatic methods or chemical methods, and include methods that involve the synthesis of sequences longer than the sequences of the present invention, but are not necessarily limited thereto.
These oligonucleotide synthesis techniques and modification techniques are also used in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 1 to 17, and are other known techniques for which many reports have been confirmed.
＜治療剤＞
本発明の実施形態である治療剤（免疫刺激剤）は、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。
本発明の実施形態である治療剤は、免疫機能を増強させることができる本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含むので、免疫機能を増強させることが有効である疾患又は障害を処置、予防又は改善できる。なお、免疫機能を増強させることが有効である疾患又は障害には、免疫系が正常に機能していない疾患または障害が含まれる。
<Therapeutic agent>
The therapeutic agent (immunostimulatory agent) which is an embodiment of the present invention includes the immunostimulatory oligonucleotide which is an embodiment of the present invention.
The therapeutic agent according to the embodiment of the present invention includes the immunostimulatory oligonucleotide according to the embodiment of the present invention capable of enhancing the immune function, so that the disease or disorder for which it is effective to enhance the immune function is treated, Can be prevented or improved. In addition, the disease or disorder in which it is effective to enhance the immune function includes a disease or disorder in which the immune system does not function normally.
免疫系が正常に機能していない疾患または障害とは、アレルギー、悪性腫瘍があげられ、必ずしもこれに限定されるものではないが、好適な実施形態としては、上記疾患または障害がアレルギー疾患である。アレルギー疾患とは、花粉、ダニ、ハウスダストなどに由来する抗原物質を起因とし、鼻炎、結膜炎、皮膚炎、喘息などの炎症を症状とする疾患であるが、さらに好適な実施形態としては、上記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である。花粉アレルギーとは特にスギ花粉由来の蛋白を抗原とするアレルギーを指すが、ブタクサ、ヒノキなどの他の花粉由来物質が抗原であっても良い。 Diseases or disorders in which the immune system is not functioning normally include allergies and malignant tumors, and are not necessarily limited thereto, but in a preferred embodiment, the disease or disorder is an allergic disease. . An allergic disease is caused by an antigenic substance derived from pollen, mites, house dust, etc., and is a disease whose symptoms are inflammation such as rhinitis, conjunctivitis, dermatitis, asthma, etc. The allergic disease is pollen allergy. The pollen allergy refers to an allergy that specifically uses a protein derived from cedar pollen as an antigen, but other pollen-derived substances such as ragweed and cypress may be the antigen.
本発明の実施形態である治療剤は、前記疾患又は障害がアレルギー疾患である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドが、アレルギー疾患に対する免疫機能をより増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果をより高めることができる。 The therapeutic agent that is an embodiment of the present invention, when the disease or disorder is an allergic disease, the immunostimulatory oligonucleotide that is an embodiment of the present invention can further enhance the immune function against allergic disease, The effect of the treatment, prevention or improvement can be further enhanced.
本発明の実施形態である治療剤は、前記アレルギー疾患が花粉アレルギー症である場合には、本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドが、花粉アレルギー症に対する免疫機能を更に増強させることができ、その処置、予防又は改善の効果を更に高めることができる。 When the allergic disease is pollen allergy, the therapeutic agent according to the embodiment of the present invention can further enhance the immune function against pollen allergy, when the immunostimulatory oligonucleotide according to the embodiment of the present invention is used. The effect of the treatment, prevention or improvement can be further enhanced.
本発明の実施形態である治療剤は、医薬としての使用を目的とした送達複合体の形態で本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
送達複合体とは、例えば、免疫刺激オリゴヌクレオチドと他の物質との混合物もしくは結合体又は免疫刺激オリゴヌクレオチドを取り込ませたリポソームもしくはナノスフィアである。
送達複合体の好適な実施形態は、免疫刺激オリゴヌクレオチドを埋封したリポソームである。なお、埋封とは、リポソームの脂質膜表面との結合、脂質膜中への取り込み、あるいはリポソームの内腔への取り込みを指し示す。
しかし、送達複合体は、必ずしもこれらの形態に限定されるものではない。
The therapeutic agent that is an embodiment of the present invention may comprise the immunostimulatory oligonucleotide that is an embodiment of the present invention in the form of a delivery complex intended for use as a medicament.
The delivery complex is, for example, a mixture or conjugate of an immunostimulatory oligonucleotide and another substance, or a liposome or nanosphere incorporating an immunostimulatory oligonucleotide.
A preferred embodiment of the delivery complex is a liposome embedded with an immunostimulatory oligonucleotide. The embedding means binding of the liposome to the lipid membrane surface, uptake into the lipid membrane, or uptake of the liposome into the lumen.
However, the delivery complex is not necessarily limited to these forms.
本発明の実施形態である治療剤を用いる場合、投与経路は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、患部組織への注入、経鼻投与、経眼投与等、系咽頭投与、系肺投与、経皮投与が好ましい。
しかし、投与経路は、これらに限定されるものではない。
When the therapeutic agent according to the embodiment of the present invention is used, the administration route is subcutaneous injection, intradermal injection, intravenous injection, intramuscular injection, injection into affected tissue, nasal administration, ophthalmic administration, etc. System pulmonary administration and transdermal administration are preferred.
However, the administration route is not limited to these.
投与量は、患者の症状、治療目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、成人１日当り、オリゴヌクレオチド量として、０．１ｐＭ〜１０μＭ、好ましくは１ｐＭ〜０.１μＭ程度である。
また、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、通常、採用される剤形を製剤する周知の製剤方法により製剤される。
The dosage is appropriately selected depending on the patient's condition, therapeutic purpose, administration route, etc., but is usually about 0.1 pM to 10 μM, preferably about 1 pM to 0.1 μM as the amount of oligonucleotide per day for an adult.
In addition, the immunostimulatory oligonucleotide is usually formulated by a well-known formulation method for formulating a dosage form to be adopted.
免疫刺激オリゴヌクレオチド又は送達複合体は、ワクチンのアジュバントとしての用途をも有する。
ワクチンの使用可能な疾患は感染症である。感染症とは、ウィルス、細菌、真菌および原虫等を原因として発症する疾患である。
アジュバントとして使用する場合の投与量も、投与目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、上記と同程度の投与量でよい。
Immunostimulatory oligonucleotides or delivery complexes also have use as vaccine adjuvants.
Diseases for which vaccines can be used are infectious diseases. Infectious diseases are diseases that develop due to viruses, bacteria, fungi, protozoa, and the like.
The dose for use as an adjuvant is also appropriately selected depending on the purpose of administration, the route of administration, etc., but it may usually be the same dose as described above.
本発明の実施形態である免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびその免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む治療剤は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The immunostimulatory oligonucleotide which is an embodiment of the present invention and the therapeutic agent containing the immunostimulatory oligonucleotide are not limited to the above embodiment, and various modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention. can do. Specific examples of this embodiment are shown in the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（実施例１〜４、比較例１、２）
＜免疫刺激オリゴヌクレオチドの、２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞において、転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導＞
まず、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を４つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例１：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ；配列番号１）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を５つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例２：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ；配列番号２）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を６つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例３：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６；配列番号３）を構築した。
次に、式（５’ＧＴＣＧＴＴ３’）と一致している塩基配列を９つ含む免疫刺激オリゴヌクレオチド（実施例４：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６；配列番号４）を構築した。
(Examples 1-4, Comparative Examples 1 and 2)
<Induction of activation of transcription factor NF-kB in 293XL-hTLR9 cells by immunostimulatory oligonucleotide>
First, an immunostimulatory oligonucleotide (Example 1: PD-ODN2006-TCGTCGTT; SEQ ID NO: 1) containing four base sequences that match the formula (5′GTCGTT3 ′) was constructed.
Next, an immunostimulatory oligonucleotide (Example 2: PD-ODN2006-TCGTCGTTTTGTCGTT; SEQ ID NO: 2) containing five base sequences that match the formula (5′GTCGTT3 ′) was constructed.
Next, an immunostimulatory oligonucleotide (Example 3: PD-ODN 2006-2006; SEQ ID NO: 3) containing 6 base sequences that match the formula (5′GTCGTT3 ′) was constructed.
Next, an immunostimulatory oligonucleotide (Example 4: PD-ODN2006-2006-2006; SEQ ID NO: 4) containing nine base sequences that match the formula (5′GTCGTT3 ′) was constructed.
次に、公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドとして、ｎが３の配列（比較例１：ＰＤ−ＯＤＮ２００６；配列番号５）を用意した。ＰＤ−ＯＤＮ２００６は血清中の核酸分解酵素により容易に分解され、ヒトに対する免疫刺激活性が低いことが報告されている。
次に、公知の別の免疫刺激オリゴヌクレオチドとして、ｎが３の配列の３’末端にデオキシグアニル酸の５回繰り返し構造（ポリＧ５配列）を有する配列（比較例２：ＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５；配列番号６）を用意した。ＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５は核酸分解酵素に対して耐性を示していることが報告されている。
そしてこれらの配列の２９３ＸＬ−ｈＴＬＲ９細胞における転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導のスクリーニングを行った。
Next, as a known immunostimulatory oligonucleotide, a sequence having n of 3 (Comparative Example 1: PD-ODN2006; SEQ ID NO: 5) was prepared. It has been reported that PD-ODN2006 is easily degraded by nucleolytic enzymes in serum and has low immunostimulatory activity against humans.
Next, as another known immunostimulatory oligonucleotide, a sequence having a 5-fold deoxyguanylic acid repeat structure (poly G5 sequence) at the 3 ′ end of the sequence where n is 3 (Comparative Example 2: PD-ODN2006-G5; SEQ ID NO: 6) was prepared. PD-ODN2006-G5 has been reported to be resistant to nucleolytic enzymes.
Then, screening of activation of the transcription factor NF-kB in 293XL-hTLR9 cells of these sequences was performed.
２９３−ｈＴＬＲ９細胞（インビボジェン社）に転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を調べるためのレポーターアッセイ用プラスミドｐＮｉＦｔｙ−ｌｕｃ（インビボジェン社）ならびに遺伝子導入の標準化のためのプラスミドｐＧＬ４．７４（プロメガ社）をトランスフェクション試薬であるＬｙｏＶｅｃ（インビボジェン社）を用いて、導入した。
２４時間後、種々濃度のＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６、およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５を各々添加した。
免疫刺激オリゴヌクレオチド添加２４時間後に、２９３−ｈＴＬＲ９細胞を回収し、破砕し、細胞破砕液内のレポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現量を定量した。
Reporter assay plasmid pNiFty-luc (in vivogen) for examining activation of transcription factor NF-kB in 293-hTLR9 cells (in vivogen) and plasmid pGL4.74 (promega) for standardization of gene transfer Was introduced using LyoVec (In vivogen), which is a transfection reagent.
After 24 hours, various concentrations of PD-ODN2006-TCGTCGGT, PD-ODN2006-TCGTCGTTTTGTCGTT, PD-ODN2006-2006, PD-ODN2006-20062006, PD-ODN2006, and PD-ODN2006-G5 were added.
Twenty-four hours after the addition of the immunostimulatory oligonucleotide, 293-hTLR9 cells were collected, disrupted, and the expression level of luciferase, which is a reporter protein in the cell disruption solution, was quantified.
得られた細胞破砕液についてルシフェラーゼの発現量の定量を行った結果、図１のような結果が得られた。
オリゴヌクレオチド（０．１μＭ）を２９３／ｈＴＬＲ９細胞に処置すると、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６はＰＤ−ＯＤＮ２００６と比較して、高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導を示した。
As a result of quantifying the expression level of luciferase for the obtained cell lysate, the results shown in FIG. 1 were obtained.
When 293 / hTLR9 cells were treated with oligonucleotide (0.1 μM), PD-ODN2006-TCGTCGGT, PD-ODN2006-TCGTCGTTTTGTCGGT, PD-ODN2006-2006, PD-ODN2006-2006-2006 compared to PD-ODN2006, High induction of transcription factor NF-kB activation was shown.
さらに、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５よりも高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化の誘導を示した。
特に、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は０．０１μＭにおいても、ＰＤ−ＯＤＮ２００６およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−Ｇ５と比較して、顕著に高い転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を示した。
このことから、低濃度において、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は特に有用である。
Furthermore, PD-ODN2006-TCGTCGTTTTGTCGTT, PD-ODN2006-2006, and PD-ODN2006-2006-2006 show higher induction of activation of the transcription factor NF-kB than the known immunostimulatory oligonucleotide PD-ODN2006-G5. It was.
In particular, PD-ODN2006-2006-2006 showed significantly higher activation of the transcription factor NF-kB even at 0.01 μM compared to PD-ODN2006 and PD-ODN2006-G5.
For this reason, PD-ODN 2006-2006-2006 is particularly useful at low concentrations.
５’ＧＴＣＧＴＴ３’はＴＬＲ９のアゴニストとして機能する繰り返し配列であり、本発明の配列番号１から４で示される塩基配列においては各々のオリゴヌクレオチドに含まれる数が異なる。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’の繰り返し配列の数に応じて転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化が起こることが当然ながら予想される。
５’ＧＴＣＧＴＴ３’の各々のオリゴヌクレオチドに含まれる濃度で転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を比較した結果、図２のような結果が得られた。
ＮＦ−ｋＢの活性化は測定液中の５’ＧＴＣＧＴＴ３’繰り返し配列の量に依存しているのではなく、繰り返し配列を４回以上１以上の塩基からなる連結塩基配列で直列につなげることによる効果により獲得されていることが示された。
5′GTCGTT3 ′ is a repetitive sequence that functions as an agonist of TLR9. In the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 of the present invention, the numbers contained in each oligonucleotide are different.
It is naturally expected that the activation of the transcription factor NF-kB occurs depending on the number of 5′GTCGTT3 ′ repeat sequences.
As a result of comparing the activation of the transcription factor NF-kB at the concentration contained in each oligonucleotide of 5′GTCGTT3 ′, the results shown in FIG. 2 were obtained.
The activation of NF-kB does not depend on the amount of 5′GTCGTT3 ′ repeat sequence in the measurement solution, but the effect of connecting the repeat sequences in series with a linked base sequence consisting of one or more bases at least four times. It was shown that it was acquired by.
これらの結果から、オリゴヌクレオチド配列ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６、およびＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６において、ヒトに対して免疫刺激活性を有することが確認された。
また、その活性は既知のＰＤ−ＯＤＮ２００６と比較して高かった。特に、ＰＤ−ＯＤＮ２００６−２００６−２００６は０．０１μＭにおいても十分な免疫刺激活性を有することが確認された。
From these results, it was confirmed that the oligonucleotide sequences PD-ODN2006-TCGTCGGT, PD-ODN2006-TCGTCGTTTTGTCGTT, PD-ODN2006-2006, and PD-ODN2006-2006-2006 have immunostimulatory activity against humans. .
Moreover, the activity was high compared with known PD-ODN2006. In particular, it was confirmed that PD-ODN 2006-2006-2006 has sufficient immunostimulatory activity even at 0.01 μM.
以上、実施例１〜４において具体的に示された通り、配列番号１から４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して免疫刺激活性を有することが確認された。
また、これらのオリゴヌクレオチドは、核酸分解活性を有する血清中において１２時間では分解されず、血清中での安定性が高いことを確認した。
As described above, as specifically shown in Examples 1 to 4, it was confirmed that the oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 4 has immunostimulatory activity against humans.
Moreover, these oligonucleotides were not degraded in serum having nucleolytic activity in 12 hours, and it was confirmed that the stability in serum was high.
本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む治療剤は、副作用が少なく臨床応用の可能性を有する強力なＴｈ１免疫刺激活性を有する非修飾型オリゴヌクレオチドに関するものであり、医薬産業、特にアレルギーに係る医薬産業において利用可能性がある。 The immunostimulatory oligonucleotide of the present invention and a therapeutic agent containing the oligonucleotide are related to unmodified oligonucleotides having strong Th1 immunostimulatory activity with few side effects and potential for clinical application. In the pharmaceutical industry.
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