JP5917741B2 - Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines - Google Patents

Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines Download PDF

Info

Publication number
JP5917741B2
JP5917741B2 JP2015052989A JP2015052989A JP5917741B2 JP 5917741 B2 JP5917741 B2 JP 5917741B2 JP 2015052989 A JP2015052989 A JP 2015052989A JP 2015052989 A JP2015052989 A JP 2015052989A JP 5917741 B2 JP5917741 B2 JP 5917741B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
activated
conjugate
polysaccharide
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2015052989A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2015145390A (en
Inventor
アンドリュー リース
アンドリュー リース
Original Assignee
フィナ バイオソリューションズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
フィナ バイオソリューションズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by フィナ バイオソリューションズ リミテッド ライアビリティ カンパニー, フィナ バイオソリューションズ リミテッド ライアビリティ カンパニー filed Critical フィナ バイオソリューションズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
Publication of JP2015145390A publication Critical patent/JP2015145390A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP5917741B2 publication Critical patent/JP5917741B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/08—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/18—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker

Description

関連出願の参照
本出願は、2009年12月17日に出願された同じ名称の米国特許仮出願第61／287,593号の優先権を主張するものであり、当該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。 This application claims priority from US Provisional Application No. 61 / 287,593, filed Dec. 17, 2009, which is hereby incorporated by reference in its entirety. It is incorporated herein.

背景
1.本発明の分野
本発明は、タンパク質を炭水化物にコンジュゲートする試薬および方法、特に、ワクチンの製造において使用されるプロセスおよび化学薬品、ならびに当該プロセスによって製造されるワクチンを対象とする。 background
1. Field of the Invention The present invention is directed to reagents and methods for conjugating proteins to carbohydrates, particularly processes and chemicals used in the manufacture of vaccines, and vaccines produced by such processes.

2.背景の説明
炭水化物に共有結合しているタンパク質を含有するワクチンは、当該炭水化物部分に対する免疫反応を著しく良好に誘導することが分かっている。「コンジュゲート」として知られるこのようなワクチンの例は、次の菌に対して使用可能である：ヘモフィルス・インフルエンザb型菌（Haemophilus influenzae type b）（例えば、ActHib、Hiberix）、髄膜炎菌（Neisseria meningiditis）A型、C型、W型、およびY型（例えば、Menactra）、ならびに肺炎球菌（S. pneumoniae）（例えば、Prevnar、Synflorix）。タンパク質を炭水化物に連結させるために、直接またはスペーサーを介してタンパク質と反応し得るよう、一般に後者を活性化する必要がある（Dick, W.E. JrおよびBeurret, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens. A survey and consideration of design and preparation factors、Conjugate Vaccines (Eds Cruse, J.M.およびLewis, R.E.). Karger, Basel, 1989.（非特許文献1））。活性化の手段の1つは、炭水化物の酸化によってアルデヒドを生成させ、次いで、当該アルデヒドを還元的アミン化によってタンパク質上のリシンに結合させる方法である。他の場合では、最初にタンパク質をヒドラジドまたはアミノオキシ基によって官能化し、続いて、炭水化物上のアルデヒドと反応させる（Lees, A. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of protein-polysaccharide (PS) conjugate vaccines、米国特許出願公開第2005／0169941号（特許文献1）；当該特許は、参照により本明細書に組み入れられる）。多糖を活性化するための別の方法は、臭化シアンの使用により多糖上にシアノ−エステルを形成し、続いてそれを、スペーサー分子、例えば、アジピン酸ジヒドラジド等と反応させる。次に、当該官能化された多糖をタンパク質と反応させる。多糖をシアノ化するための改良された方法では、1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジンテトラフルオロボレート（CDAP）を使用する（Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents、米国特許第5,651,971号（特許文献2）；同第5,693,326号（特許文献3）；および同第5,849,301号（特許文献4））。CDAPにより、タンパク質を多糖に直接結合させることが可能となる。CDAPはさらに、スペーサーを用いて多糖を官能化するためにも使用することができ、続いて、当該多糖は、タンパク質に連結される。ヒドラジドまたはアミノオキシにより官能化されたタンパク質はさらに、CDAP活性化多糖に連結させることも可能である（米国特許第5,849,301号（特許文献4）；当該特許は、参照により本明細書に組み入れられる）。 2. Background Description Vaccines containing proteins covalently linked to carbohydrates have been found to induce significantly better immune responses against the carbohydrate moieties. Examples of such vaccines known as “conjugates” can be used against the following bacteria: Haemophilus influenzae type b (eg, ActHib, Hiberix), Neisseria meningitidis (Neisseria meningiditis) types A, C, W, and Y (eg Menactra), and S. pneumoniae (eg Prevnar, Synflorix). In order to link a protein to a carbohydrate, it is generally necessary to activate the latter so that it can react with the protein either directly or through a spacer (Dick, WE Jr and Beurret, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens. A survey and consideration of design and preparation factors, Conjugate Vaccines (Eds Cruse, JM and Lewis, RE). Karger, Basel, 1989. (Non-patent Document 1)). One means of activation is a method in which an aldehyde is generated by oxidation of a carbohydrate and then the aldehyde is coupled to lysine on the protein by reductive amination. In other cases, proteins are first functionalized with hydrazide or aminooxy groups and then reacted with aldehydes on carbohydrates (Lees, A. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of protein-polysaccharide (PS) conjugate vaccines, US Patent Application Publication No. 2005/0169941 (Patent Document 1), which is incorporated herein by reference). Another method for activating a polysaccharide forms a cyano-ester on the polysaccharide by the use of cyanogen bromide, which is subsequently reacted with a spacer molecule, such as adipic acid dihydrazide and the like. Next, the functionalized polysaccharide is reacted with a protein. An improved method for cyanating polysaccharides uses 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) (Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents, USA Patent No. 5,651,971 (Patent Literature 2); No. 5,693,326 (Patent Literature 3); and No. 5,849,301 (Patent Literature 4)). CDAP allows proteins to be bound directly to polysaccharides. CDAP can also be used to functionalize a polysaccharide with a spacer, which is then linked to a protein. Proteins functionalized with hydrazide or aminooxy can also be linked to CDAP-activated polysaccharides (US Pat. No. 5,849,301, which is incorporated herein by reference). .

米国特許出願公開第2005／0169941号US Patent Application Publication No. 2005/0169941 米国特許第5,651,971号U.S. Pat.No. 5,651,971 米国特許第5,693,326号U.S. Pat.No. 5,693,326 米国特許第5,849,301号U.S. Pat.No. 5,849,301

Dick, W.E. JrおよびBeurret, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens. A survey and consideration of design and preparation factors、Conjugate Vaccines (Eds Cruse, J.M.およびLewis, R.E.). Karger, Basel, 1989.Dick, W.E.Jr and Beurret, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens.A survey and consideration of design and preparation factors, Conjugate Vaccines (Eds Cruse, J.M. and Lewis, R.E.). Karger, Basel, 1989.

本発明は、ワクチンの製造における現在の戦略および設計に関連する問題および欠点を克服するものであり、ならびに、特にワクチン製造のためのタンパク質コンジュゲート化の新規のツールおよび方法を提供する。   The present invention overcomes the problems and disadvantages associated with current strategies and designs in vaccine production and provides new tools and methods for protein conjugation, particularly for vaccine production.

本発明の一態様は、化合物、例えば、1-CBT、1-CI、CPPT、もしくは2-CPO、またはそれらの機能的誘導体または改変物等と化学化合物と混合して、活性化された化学化合物を生成する工程と、当該活性化された化合物を第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程とを含む、炭水化物をコンジュゲート化するプロセスを対象とする。好ましくは、当該化学化合物は、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである。同様に好ましくは、当該第二の化合物は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、これらは、抗原分子であり得る。コンジュゲート化は、直接的なものであっても、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものであってもよい。当該プロセスは、好ましくは、当該コンジュゲートよりも低い分子量を有する成分を、例えば、透析ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む。結果として得られたコンジュゲートは、好ましくは、ワクチンまたは診断剤である。当該プロセスは、活性化された化合物と第二の化合物との間に連結化合物を組み込む工程をさらに含んでいてもよい。好ましくは、当該プロセスの工程とリンカーの組み込みは一緒に実施されるが、それぞれを独立して実施してもよい。   One embodiment of the present invention is a compound obtained by mixing a chemical compound with a chemical compound such as 1-CBT, 1-CI, CPPT, or 2-CPO, or a functional derivative or modification thereof, and the like. Is directed to a process for conjugating carbohydrates comprising the steps of: producing an activated compound with a second compound to produce a conjugate. Preferably, the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof. Equally preferably, the second compound is a peptide, polypeptide or protein, which can be an antigen molecule. Conjugation may be direct or indirect with the addition of functional groups that facilitate conjugation. The process preferably further comprises removing components having a lower molecular weight than the conjugate, for example by diafiltration, chromatography, or a combination thereof. The resulting conjugate is preferably a vaccine or diagnostic agent. The process may further comprise incorporating a linking compound between the activated compound and the second compound. Preferably, the process steps and linker incorporation are performed together, but each may be performed independently.

本発明の別の態様は、本発明のプロセスによって製造されたワクチンを対象とする。好ましくは、当該ワクチンは薬学的に許容される担体をさらに含み、当該担体は、これらに限定されるわけではないが、水、生理食塩水、アルコール、糖、多糖、油、またはそれらの組み合わせを含み得る。   Another aspect of the present invention is directed to a vaccine produced by the process of the present invention. Preferably, the vaccine further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, which is not limited to water, saline, alcohol, sugar, polysaccharide, oil, or combinations thereof. May be included.

本発明の他の態様および利点については、一部は以下の説明において述べられ、一部はこの説明から明かとなり得、または本発明の実施から教示され得る。
[本発明1001]
1−シアノ−4−ピロリジノピリジニウムテトラフルオロボレート（CPPT）と化学化合物を混合して、活性化された化学化合物を生成する工程；および
該活性化された化合物を第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程
を含む、炭水化物をコンジュゲート化する方法。
[本発明1002]
化学化合物が、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第二の化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第二の化合物が抗原分子である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
コンジュゲート化が、直接的なものであるか、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
コンジュゲートより低い分子量の成分を、透析、ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
コンジュゲートが、ワクチンまたは診断剤である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記工程が一緒に実施される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
活性化された化合物と第二の化合物との間に連結化合物を組み込む工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
本発明1001の方法によって製造されたワクチンまたは診断剤。
[本発明1011]
1−シアノイミダゾール（1-CI）と化学化合物を混合して、活性化された化学化合物を生成する工程；および
該活性化された化合物を第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程
を含む、化学化合物をコンジュゲート化する方法。
[本発明1012]
化学化合物が、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
第二の化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
第二の化合物が抗原分子である、本発明1011の方法。
[本発明1015]
コンジュゲート化が、直接的なものであるか、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものである、本発明1011の方法。
[本発明1016]
コンジュゲートより低い分子量の成分を、透析、ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1017]
コンジュゲートが、ワクチンまたは診断剤である、本発明1011の方法。
[本発明1018]
前記工程が一緒に実施される、本発明1011の方法。
[本発明1019]
活性化された化合物と第二の化合物との間に連結化合物を組み込む工程をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1020]
本発明1011の方法によって製造されたワクチンまたは診断剤。
[本発明1021]
1−シアノベンゾトリアゾール（1−CBT）と化学化合物を混合して、活性化された化学化合物を生成する工程；および
該活性化された化合物を第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程
を含む、化学化合物をコンジュゲート化する方法。
[本発明1022]
化学化合物が、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
第二の化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、本発明1021の方法。
[本発明1024]
第二の化合物が抗原分子である、本発明1021の方法。
[本発明1025]
コンジュゲート化が、直接的なものであるか、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものである、本発明1021の方法。
[本発明1026]
コンジュゲートより低い分子量の成分を、透析、ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1027]
コンジュゲートが、ワクチンまたは診断剤である、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記工程が一緒に実施される、本発明1021の方法。
[本発明1029]
活性化された化合物と第二の化合物との間に連結化合物を組み込む工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1030]
本発明1021の方法によって製造されたワクチンまたは診断剤。
[本発明1031]
2−シアノピリダジン−3(2H)オン（2-CPO）と化学化合物を混合して、活性化された化学化合物を生成する工程；および
該活性化された化合物を第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程
を含む、化学化合物をコンジュゲート化する方法。
[本発明1032]
化学化合物が、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
第二の化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、本発明1031の方法。
[本発明1034]
第二の化合物が抗原分子である、本発明1031の方法。
[本発明1035]
コンジュゲート化が、直接的なものであるか、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものである、本発明1031の方法。
[本発明1036]
コンジュゲートより低い分子量の成分を、透析、ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1037]
コンジュゲートが、ワクチンまたは診断剤である、本発明1031の方法。
[本発明1038]
前記工程が一緒に実施される、本発明1031の方法。
[本発明1039]
活性化された化合物と第二の化合物との間に連結化合物を組み込む工程をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1040]
本発明1031の方法によって製造されたワクチンまたは診断剤。 Other aspects and advantages of the invention will be set forth in part in the description which follows, and in part will be apparent from the description, or may be learned from practice of the invention.
[Invention 1001]
Mixing 1-cyano-4-pyrrolidinopyridinium tetrafluoroborate (CPPT) and a chemical compound to produce an activated chemical compound; and mixing the activated compound with a second compound A method for conjugating carbohydrates comprising the step of producing a conjugate.
[Invention 1002]
The method of the present invention 1001, wherein the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof.
[Invention 1003]
The method of 1001 of this invention wherein the second compound is a peptide, polypeptide or protein.
[Invention 1004]
The method of 1001 of this invention wherein the second compound is an antigen molecule.
[Invention 1005]
The method of the invention 1001, wherein conjugation is direct or indirect with the addition of functional groups that facilitate conjugation.
[Invention 1006]
The method of the present invention 1001, further comprising the step of removing components of lower molecular weight than the conjugate by dialysis, filtration, chromatography, or a combination thereof.
[Invention 1007]
The method of the present invention 1001, wherein the conjugate is a vaccine or diagnostic agent.
[Invention 1008]
The method of the present invention 1001, wherein the steps are performed together.
[Invention 1009]
The method of the present invention 1001, further comprising the step of incorporating a linking compound between the activated compound and the second compound.
[Invention 1010]
A vaccine or diagnostic agent produced by the method of the present invention 1001.
[Invention 1011]
Mixing 1-cyanoimidazole (1-CI) with a chemical compound to produce an activated chemical compound; and mixing the activated compound with a second compound to produce a conjugate. A method of conjugating a chemical compound.
[Invention 1012]
The method of the present invention 1011 wherein the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof.
[Invention 1013]
The method of 1011 of this invention wherein the second compound is a peptide, polypeptide or protein.
[Invention 1014]
The method of the present invention 1011 wherein the second compound is an antigen molecule.
[Invention 1015]
The method of the present invention 1011 wherein conjugation is direct or indirect with the addition of a functional group that facilitates conjugation.
[Invention 1016]
The method of the present invention 1011 further comprising the step of removing components of lower molecular weight than the conjugate by dialysis, filtration, chromatography, or a combination thereof.
[Invention 1017]
The method of the present invention 1011 wherein the conjugate is a vaccine or diagnostic agent.
[Invention 1018]
The method of the present invention 1011, wherein the steps are performed together.
[Invention 1019]
The method of the present invention 1011 further comprising the step of incorporating a linking compound between the activated compound and the second compound.
[Invention 1020]
A vaccine or diagnostic agent produced by the method of the present invention 1011.
[Invention 1021]
Mixing 1-cyanobenzotriazole (1-CBT) with a chemical compound to form an activated chemical compound; and mixing the activated compound with a second compound to form a conjugate. A method of conjugating a chemical compound comprising a step.
[Invention 1022]
The method of the present invention 1021 wherein the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof.
[Invention 1023]
The method of the present invention 1021 wherein the second compound is a peptide, polypeptide, or protein.
[Invention 1024]
The method of the present invention 1021 wherein the second compound is an antigen molecule.
[Invention 1025]
The method of the present invention 1021, wherein conjugation is direct or indirect with the addition of a functional group that facilitates conjugation.
[Invention 1026]
The method of the present invention 1021, further comprising the step of removing components of lower molecular weight than the conjugate by dialysis, filtration, chromatography, or a combination thereof.
[Invention 1027]
The method of the present invention 1021 wherein the conjugate is a vaccine or diagnostic agent.
[Invention 1028]
The method of the present invention 1021, wherein the steps are performed together.
[Invention 1029]
The method of the present invention 1021, further comprising the step of incorporating a linking compound between the activated compound and the second compound.
[Invention 1030]
A vaccine or diagnostic agent produced by the method of the present invention 1021.
[Invention 1031]
Mixing 2-cyanopyridazine-3 (2H) one (2-CPO) with a chemical compound to produce an activated chemical compound; and mixing the activated compound with a second compound A method of conjugating a chemical compound comprising the step of producing a conjugate.
[Invention 1032]
The method of Invention 1031 wherein the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or combination thereof.
[Invention 1033]
The method of the invention 1031 wherein the second compound is a peptide, polypeptide, or protein.
[Invention 1034]
The method of the present invention 1031 wherein the second compound is an antigen molecule.
[Invention 1035]
The method of invention 1031, wherein conjugation is direct or indirect with the addition of a functional group that facilitates conjugation.
[Invention 1036]
The method of Invention 1031 further comprising the step of removing components of lower molecular weight than the conjugate by dialysis, filtration, chromatography, or a combination thereof.
[Invention 1037]
The method of the present invention 1031 wherein the conjugate is a vaccine or diagnostic agent.
[Invention 1038]
The method of the present invention 1031, wherein the steps are performed together.
[Invention 1039]
The method of invention 1031 further comprising the step of incorporating a linking compound between the activated compound and the second compound.
[Invention 1040]
A vaccine or diagnostic agent produced by the method of the present invention 1031.

Superdex200カラム（1×30cm）ゲルろ過カラムにおいて実施したBSA／CDAP／デキストランおよびBSA／CPPT／デキストランのクロマトグラムを重ね合わせたもの。Superposition of BSA / CDAP / dextran and BSA / CPPT / dextran chromatograms performed on a Superdex200 column (1 × 30 cm) gel filtration column. 1-CIを使用して官能化した多糖に対する間接的な結合のSEC HPLC分析。SEC HPLC analysis of indirect binding to polysaccharides functionalized using 1-CI. Superdex200によるCRM（1-CI／Ps6A）コンジュゲートのクロマトグラム。Chromatogram of CRM (1-CI / Ps6A) conjugate by Superdex200. Superdex200画分のSEC HPLC分析。SEC HPLC analysis of Superdex200 fraction. CPPT（1−シアノ−4−ピロリジノピリジニウムテトラフルオロボレート；CPIPとも呼ばれる）、1-CBT（1−シアノベンゾトリアゾール）、1-CI（1−シアノイミダゾール）、および2-CPO（2−シアノピリダジン−3(2H)オン）の化学構造。CPPT (1-cyano-4-pyrrolidinopyridinium tetrafluoroborate; also called CPIP), 1-CBT (1-cyanobenzotriazole), 1-CI (1-cyanoimidazole), and 2-CPO (2-cyanopyridazine) Chemical structure of −3 (2H) on).

本発明の説明
本発明の一態様は、CPPT、1−CBT、1-CI、もしくは2-CPO、またはこれらの化合物の機能的誘導体または保存的改変物を化学化合物と混合して、活性化された化学化合物を生成する工程を含む、化学化合物をコンジュゲート化するプロセスを対象とする。当該活性化された化合物は、第二の化合物と混合されて、コンジュゲートを生成する。これらの工程は、独立してまたは一緒に実施してもよく、ならびに当該2つの間にリンカーとして別の化合物を組み込んでもよい。好ましくは、当該活性化された化合物は、リンカー分子と混合され、続いて第二の化合物と反応してコンジュゲートを生成する。好ましいリンカーとしては、ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、ヒドラジン、アジピン酸ジヒドラジド、または1,6−ジアミノオキシヘキサンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。 DESCRIPTION OF THE INVENTION One embodiment of the present invention is activated by mixing CPPT, 1-CBT, 1-CI, or 2-CPO, or a functional derivative or conservative modification of these compounds with a chemical compound. Directed to a process for conjugating a chemical compound, comprising the step of producing a chemical compound. The activated compound is mixed with a second compound to produce a conjugate. These steps may be performed independently or together, and another compound may be incorporated as a linker between the two. Preferably, the activated compound is mixed with a linker molecule and subsequently reacted with a second compound to form a conjugate. Preferred linkers include, but are not limited to, hexanediamine, ethylenediamine, hydrazine, adipic acid dihydrazide, or 1,6-diaminooxyhexane.

コンジュゲート化は、直接的または間接的なものであってもよく、これは、コンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴わないこと、または伴うことを意味する。好ましくは、当該化学化合物は、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせである。好ましくは、当該第二の化合物は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、より好ましくは、当該第二の化合物は、診断剤としてのワクチンの調製のための抗原分子である。   Conjugation may be direct or indirect, meaning that it involves no or with the addition of a functional group that facilitates conjugation. Preferably, the chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof. Preferably the second compound is a peptide, polypeptide or protein, more preferably the second compound is an antigen molecule for the preparation of a vaccine as a diagnostic agent.

本発明は、多糖がタンパク質に直接またはスペーサーを介して共有結合し得るように、水性溶液または部分的水性溶液中において当該多糖をシアノ化するための新規の試薬を提供する。実施例は、当該方法が広く適用可能であることを示す、様々な多糖およびタンパク質を用いたこれらの試薬の使用を例証するものである。   The present invention provides a novel reagent for cyanating a polysaccharide in aqueous or partially aqueous solution so that the polysaccharide can be covalently attached to the protein directly or through a spacer. The examples illustrate the use of these reagents with various polysaccharides and proteins, indicating that the method is widely applicable.

炭水化物、多糖、およびオリゴ糖は、本出願において互換的に使用される。当該方法は、天然または合成の炭水化物を用いることができる。   Carbohydrates, polysaccharides, and oligosaccharides are used interchangeably in this application. The method can use natural or synthetic carbohydrates.

タンパク質は、天然、遺伝子組換え、または合成の材料を意味し得る。それは、ペプチドを含み得る。活性化された炭水化物に直接的にまたは間接的に連結するための第二の部分として、タンパク質以外の他の分子を使用することができる。   Protein may refer to natural, genetically modified, or synthetic material. It can include a peptide. Other molecules other than proteins can be used as the second moiety to link directly or indirectly to the activated carbohydrate.

直接的なコンジュゲート化は、追加的な官能基を導入することなく、活性化された炭水化物にタンパク質を連結させることを意味する。間接的なコンジュゲート化は、コンジュゲート化を促進するために使用される官能基の追加を意味する。例えば、炭水化物はアミンによって官能化することができ、続いて、これをブロモアセチル基と反応させる。次いで、ブロモアセチル化された炭水化物を、チオール化されたタンパク質と反応させる（Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2nded, 2008）。「官能化」という用語は、一般的に、例えばコンジュゲート化を促進するため官能性を付与するために、基を化学的に結合させることを意味する。例としては、ヒドラジドまたはアミノオキシ基によるタンパク質の官能化、ならびにアミノ基による炭水化物の官能化が挙げられる。 Direct conjugation means linking the protein to the activated carbohydrate without introducing additional functional groups. Indirect conjugation means the addition of functional groups that are used to facilitate conjugation. For example, carbohydrates can be functionalized with amines, which are subsequently reacted with bromoacetyl groups. Then, bromo acetylated carbohydrate is reacted with thiolated protein (Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2 nd ed, 2008). The term “functionalization” generally means chemically conjugating groups, for example to impart functionality to facilitate conjugation. Examples include protein functionalization with hydrazide or aminooxy groups, and carbohydrate functionalization with amino groups.

方法および試薬
炭水化物に対するタンパク質の結合ではその分子量が増加し、これは、分析サイズ排除クロマトグラフィ（SEC HPLC）を使用してモニターすることができる。より早く溶出する材料ほど、より高い分子量を有しており、タンパク質は、一般的に、280nmにおけるその吸光度によってモニターされる。したがって、より早い時間への吸光度のシフトは、分子量の増加の表れであり、従ってコンジュゲート化を示している。SEC HPLCのために、Empowerソフトウェアを備えるWaters 600システムにおいて、BioSep G4000 SECカラム（Phenomenex社）または同様のカラムを使用した。 Methods and Reagents Protein binding to carbohydrate increases its molecular weight, which can be monitored using analytical size exclusion chromatography (SEC HPLC). The earlier eluting material has a higher molecular weight and the protein is generally monitored by its absorbance at 280 nm. Thus, the shift in absorbance to an earlier time is an indication of an increase in molecular weight, thus indicating conjugation. For SEC HPLC, a BioSep G4000 SEC column (Phenomenex) or similar column was used in a Waters 600 system with Empower software.

アミンおよびヒドラジドは、概して、「Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid」 Qi XY, Keyhani NO, Lee YC. Anal Biochem.1988 Nov 15;175(1):139-44（当該文献は、参照により本明細書に組み入れられる）、およびVidal and Franci, J Immun. Meth 86:155, 1986に記載されているように、TNBSを使用してアッセイした。   Amine and hydrazide are generally “Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their combination with trinitrobenzenesulfonic acid” Qi XY, Keyhani NO, Lee YC. Anal Biochem. 1988 Nov 15; 175 (1): 139-44 , Incorporated herein by reference), and assayed using TNBS as described in Vidal and Franci, J Immun. Meth 86: 155, 1986.

タンパク質濃度は、280nmでのその吸光係数および吸光度から特定した。炭水化物は、Monsigny M.らの方法（Anal Biochem. 175(2):525-30, 1988；当該文献は、参照により本明細書に組み入れられる）によってアッセイした。   The protein concentration was determined from its extinction coefficient and absorbance at 280 nm. Carbohydrates were assayed by the method of Monsigny M. et al. (Anal Biochem. 175 (2): 525-30, 1988; the literature is incorporated herein by reference).

1−シアノ−4−ピロリジノピリジニウムテトラフルオロボレート（CPPT）は、Wilmington PharmaTech社のロット番号1795−1536−10によって調製し、逆相HPLCによって測定したところ、純度97％を超えていた（図5を参照のこと）。1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジンテトラフルオロボレート（CDAP）は、Merck Kga社から提供された。1−シアノ−イミダゾール（1-CI）は、Apin Chemicals社（アビンドン、イギリス）から購入した（図5を参照のこと）。1−シアノベンゼントリアゾール（1−CBT）は、Sigma Aldrich社から購入した（図5を参照のこと）。CRMおよび破傷風トキソイドは、インド（プネ）のSerum Institute社から提供された。BSAは、Amresco社（ソロン、オハイオ州）から購入した。肺炎球菌（Pneumococcal）の多糖は、インドのSerum Institute社またはATCC（マナッサス、ヴァージニア州）から得た。Hib PRPおよび髄膜炎菌多糖は、インドのSerum Institute社から得た。T2000デキストラン（GE Healthcare社）は、S400HRゲルろ過カラム（GE Healthcare社）を使用して分画して高分子量画分を調製した。N−メチル−2−ピロリドン（NMP）、ヘキサンジアミン・2HCl、およびトリエチルアミン（TEA）を含む、使用した他の試薬は、Sigma−Aldrich社製であった。アセトニトリルは、GFS Chemical社製であった。   1-Cyano-4-pyrrolidinopyridinium tetrafluoroborate (CPPT) was prepared according to lot number 1795-1536-10 from Wilmington PharmaTech and was greater than 97% purity as measured by reverse phase HPLC (FIG. 5 checking). 1-Cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) was provided by Merck Kga. 1-Cyano-imidazole (1-CI) was purchased from Apin Chemicals (Abindon, UK) (see FIG. 5). 1-Cyanobenzenetriazole (1-CBT) was purchased from Sigma Aldrich (see FIG. 5). CRM and tetanus toxoid were provided by Serum Institute of India (Pune). BSA was purchased from Amresco (Solon, Ohio). Pneumococcal polysaccharide was obtained from Serum Institute of India or ATCC (Manassas, VA). Hib PRP and meningococcal polysaccharides were obtained from Serum Institute, India. T2000 dextran (GE Healthcare) was fractionated using an S400HR gel filtration column (GE Healthcare) to prepare a high molecular weight fraction. Other reagents used were from Sigma-Aldrich, including N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), hexanediamine · 2HCl, and triethylamine (TEA). Acetonitrile was from GFS Chemical.

以下の実施例は、本発明の態様を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものとして見なされるべきではない。   The following examples are illustrative of aspects of the present invention and should not be viewed as limiting the scope of the invention.

実施例1：モデル系：モデル系として、直接的に、またはスペーサーを介して間接的に、BSAを多糖デキストランに共有結合させた
CDAPおよびCPPTを、それぞれ、アセトニトリル中において0.43Mとし、120ulを、デキストラン2mlに加えた（生理食塩水1 ml中6mg＋0.02％のアジ化ナトリウム）。30秒後、トリエチルアミン（約7ul）をそれぞれに加えて、pHを約9.8に維持した。2分後、活性化されたデキストランの1mlを取り出して、ヘキサンジアミンの0.5M溶液1mlまたはBSA溶液（10mg／ml）1mlのどちらかに加えた。4時間後、ヘキサンジアミン誘導体化されたデキストラン溶液を、頻繁に交換しながら生理食塩水で一夜かけて透析した。さらに低分子量の試薬を除去するために、当該溶液を、それぞれ約6mlにして、Corningスピンフィルタ装置（Spin−X 10kDaカットオフ）を使用して濃縮し、当該プロセスを繰り返した。第二のスピンからの濾液を、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を使用してアッセイしたところ、アミンに対して本質的に陰性であることが見出された。脱塩された濃縮水を、アミンおよびデキストランに対してアッセイした。当該BSA−デキストランコンジュゲートを、4℃で一夜かけてインキュベートし、次いで、PBSで平衡させたSuperdex200サイズ排除カラム（GE Healthcare社）で分画した。2つのコンジュゲートの溶出プロフィルを図1に示す。ボイドボリュームピークをプールして、BSAおよびデキストランに対してアッセイした（表1を参照のこと）。 Example 1: Model system: As a model system, BSA was covalently bound to polysaccharide dextran either directly or indirectly through a spacer.
CDAP and CPPT were each 0.43M in acetonitrile and 120ul was added to 2ml of dextran (6mg in 1ml saline + 0.02% sodium azide). After 30 seconds, triethylamine (about 7 ul) was added to each to maintain the pH at about 9.8. After 2 minutes, 1 ml of activated dextran was removed and added to either 1 ml of 0.5M solution of hexanediamine or 1 ml of BSA solution (10 mg / ml). After 4 hours, the hexanediamine derivatized dextran solution was dialyzed overnight against saline with frequent changes. In order to further remove low molecular weight reagents, the solution was made up to approximately 6 ml each, concentrated using a Corning spin filter device (Spin-X 10 kDa cutoff), and the process was repeated. The filtrate from the second spin was assayed using trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and found to be essentially negative for the amine. Desalted concentrated water was assayed for amine and dextran. The BSA-dextran conjugate was incubated overnight at 4 ° C. and then fractionated on a Superdex200 size exclusion column (GE Healthcare) equilibrated with PBS. The elution profile of the two conjugates is shown in FIG. Void volume peaks were pooled and assayed for BSA and dextran (see Table 1).

Figure 0005917741
Figure 0005917741

このデータは、CPPTが、CDAPと同様に、およびおそらくより良好に、デキストランを活性化することを示している。これは、CPPT活性化された多糖に対してタンパク質を直接的に結合することができるということを示している。   This data indicates that CPPT activates dextran as well as CDAP and probably better. This indicates that proteins can be bound directly to CPPT activated polysaccharides.

実施例2：CPPTを使用した、アミンによる多糖の官能化
7.5mg／mlのヘモフィルス・インフルエンザ（Hib）、髄膜炎菌A型（MenA）、および髄膜炎菌C型（MenC）莢膜多糖の溶液を調製した。それぞれの1.35mlに、アセトニトリル1 ml中100mgのCPPT 75ulを加えた。30秒の時点で、TEA 5ulを、HibおよびMenA多糖に加えた。TEA 6ulをMenC溶液に加えた。2.5分の時点で、活性化されたPS 0.6mlを、0.5Mのヘキサンジアミン0.6mlに加えた。3時間後、それぞれを生理食塩水に対して十分に透析した。 Example 2: Functionalization of polysaccharides with amines using CPPT
Solutions of 7.5 mg / ml Haemophilus influenza (Hib), Neisseria meningitidis type A (MenA), and Neisseria meningitidis type C (MenC) capsular polysaccharide were prepared. To each 1.35 ml 100 mg CPPT 75 ul in 1 ml acetonitrile was added. At 30 seconds, TEA 5ul was added to Hib and MenA polysaccharides. TEA 6ul was added to the MenC solution. At 2.5 minutes, 0.6 ml of activated PS was added to 0.6 ml of 0.5M hexanediamine. Three hours later, each was sufficiently dialyzed against physiological saline.

各溶液を、対応する多糖をMenAおよびMenCに対する基準として用いて、レゾルシノール硫酸アッセイを使用して多糖をアッセイした。Hib多糖に対する基準としてリボースを、繰り返しユニット1つあたりリボロース1モル、かつ243g／モルの繰り返しユニット分子量で使用した（表2を参照のこと）。   Each solution was assayed for polysaccharides using the resorcinol sulfate assay using the corresponding polysaccharide as a reference for MenA and MenC. Ribose was used as a standard for the Hib polysaccharide at a repeat unit molecular weight of 1 mole of ribose per repeat unit and 243 g / mol of repeat units (see Table 2).

Figure 0005917741
Figure 0005917741

この表はさらに、様々な多糖を官能化するためのCPPTの使用も例示している。   The table further illustrates the use of CPPT to functionalize various polysaccharides.

実施例3：1−シアノイミダゾールを使用した、モデル多糖であるデキストランの誘導体化
1-CI 30mgを、T2000デキストラン（GE Healthcare社）の20mg／ml溶液2mlに加えた。pHを9〜9.2に維持するために、0.2Mのトリエチルアミンを100ul分け取って5回加えた。約3分後、0.5Mのヘキサンジアミン2mlを加え、0.5MのNaOHを用いてpHを9に調節した。2時間の反応後、当該溶液を生理食塩水で徹底的に透析した。遠心分離によって当該溶液から固形分を取り除き、デキストランおよびアミンについてアッセイした。当該生成物は、アミン27個／デキストラン100kDaを含有していることが見出され、これは、1-CIを使用することにより、アミンによって多糖を官能化することができるということを示している。 Example 3: Derivatization of dextran, a model polysaccharide, using 1-cyanoimidazole
30 mg of 1-CI was added to 2 ml of a 20 mg / ml solution of T2000 dextran (GE Healthcare). To maintain the pH at 9-9.2, 100 ul of 0.2M triethylamine was added in 5 portions. After about 3 minutes, 2 ml of 0.5 M hexanediamine was added and the pH was adjusted to 9 with 0.5 M NaOH. After 2 hours of reaction, the solution was dialyzed thoroughly with physiological saline. Solids were removed from the solution by centrifugation and assayed for dextran and amine. The product was found to contain 27 amines / 100 kDa dextran, indicating that the polysaccharide can be functionalized with amines by using 1-CI. .

実施例4：1-CI（BSA−デキストラン）を使用した、モデルPSに対するモデルタンパク質の直接的な結合
13.5mg／mlの、高分子量デキストランの溶液を調製した。NMP 1 ml中1-CI100mgの溶液67.5ulを1mlに加え、30秒後、0.2MのTEAをそれぞれ100ul分け取って4回加え、その後、0.5MのNaOH約20ulを加えた。約3.5分の時点で、BSAの20mg／ml溶液0.5mlを加えた。pH9.0である0.1Mのホウ酸ナトリウムをそれぞれ100ul分け取って2回加えることにより、pHが約8.5まで上がった。4℃で2日経過した後、当該反応混合物をSEC HPLCにより分析した。図は、BSA＋1-CI活性化されたデキストランが、サイズ排除カラムから、かなり早い時期に溶出することを示しており、これは、多糖への結合による、より高い分子量を示している。 Example 4: Direct binding of model proteins to model PS using 1-CI (BSA-dextran)
A 13.5 mg / ml solution of high molecular weight dextran was prepared. 67.5 ul of 1-CI 100 mg solution in 1 ml of NMP was added to 1 ml, and 30 seconds later, 100 ul of 0.2 M TEA was divided and added 4 times, and then about 20 ul of 0.5 M NaOH was added. At about 3.5 minutes, 0.5 ml of a 20 mg / ml solution of BSA was added. By adding 100 ul each of 0.1M sodium borate at pH 9.0 and adding it twice, the pH was raised to about 8.5. After 2 days at 4 ° C., the reaction mixture was analyzed by SEC HPLC. The figure shows that BSA + 1-CI activated dextran elutes much earlier from the size exclusion column, indicating higher molecular weight due to binding to the polysaccharide.

実施例5：1-CIによる他のPSの活性化
肺炎球菌の血清型1 PS（Ps1）および6B PS（Ps6B）からの莢膜多糖を、生理食塩水1 ml中10mg＋0.02％アジ化ナトリウムで調製した。NMP 93ulに1-CI 9.3mgを懸濁させたものをPs1 1mlに加え、続いて、0.2MのTEAを100ul分け取って8回加えた。2.5分の時点で、1Mのヘキサンジアミン0.5mlを加え、続いて、0.5MのNaOHをそれぞれ100ul分け取って2回加えた。pHはおよそ9であった。NMP 1 ml中1-CI 100mgの溶液100ulを、Ps6B溶液1mlに加えた。0.2MのTEAを100ul分け取って2回加え、続いて、0.5MのNaOHをそれぞれ50ul分け取って2回加えてpHを約9.5〜10.8に維持した。2.5分の時点で、1Mのヘキサンジアミン0.5mlを、0.5MのNaOH 50ulと一緒に加えた。約3時間後、それぞれを生理食塩水に対して十分に透析した。次いで、それぞれを、多糖に対してはレゾルシノール硫酸アッセイを使用して、ならびにアミンに対してはTNBSを使用してアッセイした（表3を参照のこと）。 Example 5: Activation of other PS by 1-CI Capsular polysaccharides from S. pneumoniae serotype 1 PS (Ps1) and 6B PS (Ps6B) were added to 10 mg + 0.02% sodium azide in 1 ml saline. It was prepared with. A suspension of 9.3 mg of 1-CI in 93 ul of NMP was added to 1 ml of Ps1, and then 100 ul of 0.2 M TEA was divided and added 8 times. At 2.5 minutes, 0.5 ml of 1M hexanediamine was added, followed by 2 additions of 100ul each of 0.5M NaOH. The pH was approximately 9. 100ul of 1-CI 100mg solution in 1ml NMP was added to 1ml Ps6B solution. 100ul of 0.2M TEA was added in two portions, followed by 50ul each of 0.5M NaOH in two portions to maintain the pH at about 9.5 to 10.8. At 2.5 minutes, 0.5 ml of 1M hexanediamine was added along with 50ul of 0.5M NaOH. After about 3 hours, each was sufficiently dialyzed against physiological saline. Each was then assayed using the resorcinol sulfate assay for polysaccharides and TNBS for amines (see Table 3).

Figure 0005917741
Figure 0005917741

したがって、1-CIを使用することによって多糖を活性化および官能化することができることは明かである。   Thus, it is clear that polysaccharides can be activated and functionalized by using 1-CI.

実施例6：1-CIを使用して官能化した多糖に対する間接的結合
pH8である1MのHEPES 239ulを、実施例5において調製したPs6B−NH2 2.2ml中約9.5mgの溶液に加えた。NMP中0.1MのNHSブロモアセテート170ulを加えた。1時間後、当該溶液を、Amicon Ultra15 30 kDaカットオフスピンフィルターを使用して、10mMのNaPO4＋5mMのEDTAのpH6.8緩衝液で繰り返し洗浄することによって脱塩した。当該濃縮水の最終量は約0.7mlとなった。破傷風トキソイドを以下のようにしてチオール化した。破傷風トキソイド（35mg／ml）571ulを、1MのHEPES 64ulを添加してpH8にした。NMP中0.1MのSPDP 27ulをゆっくりと加えた。約2時間後、pHは5.7まで下がり、0.5MのDTT 33ulを加えてチオールを脱保護した。30分後、当該溶液を、10mMのNaPO4＋5mMのEDTAのpH6.8緩衝液で平衡させた1×15cm G25カラムで脱塩した。ボイドボリュームをプールし、最終濃度約62mg／mlまで濃縮した。チオール含有量は、DTNBを使用して特定した。破傷風は、約6モルのチオール／TTモルの比率を有していた。ブロモアセチル化された多糖およびチオ−ル化されたTTを次のように組み合わせた：Ps6B−BrAc 0.66ml＋pH8である1MのHEPES 73ul＋チオール化されたTT 230ul。 Example 6: Indirect attachment to a polysaccharide functionalized using 1-CI
The HEPES 239Ul of 1M is pH 8, was added to a solution of Ps6B-NH 2 2.2ml of about 9.5mg prepared in Example 5. 170ul of 0.1M NHS bromoacetate in NMP was added. After 1 hour, the solution was desalted by repeatedly washing with 10 mM NaPO 4 +5 mM EDTA pH 6.8 buffer using an Amicon Ultra15 30 kDa cut-off spin filter. The final amount of the concentrated water was about 0.7 ml. Tetanus toxoid was thiolated as follows. Tetanus toxoid (35 mg / ml) 571ul was added to 1M HEPES 64ul to pH8. Slowly add 27ul of 0.1M SPDP in NMP. After about 2 hours, the pH had dropped to 5.7 and 0.5 M DTT 33ul was added to deprotect the thiol. After 30 minutes, the solution was desalted on a 1 × 15 cm G25 column equilibrated with 10 mM NaPO 4 +5 mM EDTA pH 6.8 buffer. The void volume was pooled and concentrated to a final concentration of about 62 mg / ml. The thiol content was specified using DTNB. Tetanus had a ratio of about 6 moles of thiol / TT mole. Bromoacetylated polysaccharide and thiolated TT were combined as follows: Ps6B-BrAc 0.66 ml + pH 8 1M HEPES 73ul + thiolated TT 230ul.

当該反応を、4℃で一夜にわたって進行させ、その後、SEC HPLCによって分析した（図2）。コンジュゲートを、S400HRカラムサイズ排除（GE Healthcare社）によるゲルろ過によって分画した。高分子量の材料を含有するボイドボリューム画分をプールし、タンパク質および炭水化物についてアッセイした。当該コンジュゲートは、Ps6 1mgあたりTT約1mgを有していることが見出された。このことは、炭水化物に対するタンパク質の間接的結合に1-CIを使用することができることを示している。   The reaction was allowed to proceed overnight at 4 ° C. and then analyzed by SEC HPLC (FIG. 2). Conjugates were fractionated by gel filtration with S400HR column size exclusion (GE Healthcare). Void volume fractions containing high molecular weight material were pooled and assayed for protein and carbohydrate. The conjugate was found to have about 1 mg TT per mg Ps6. This indicates that 1-CI can be used for indirect binding of proteins to carbohydrates.

実施例7：1-CIを使用した、多糖に対するタンパク質の直接的な結合
肺炎球菌血清型6A（Ps6A）からの莢膜多糖を、10mg／mlで水に溶解させた。5本の1ml の管それぞれを80℃で2分加熱し、pH9の0.1Mのホウ酸ナトリウム1mlをそれぞれに加えた。2.5時間後、当該管を氷冷し、次いで透析した。TEA 25ulを、5mg／mlの加水分解されたPs6A 10mlに加え、ボルテックスしながら1-CI 50mgを加えた。2.5分の時点で、17.2mg／mlのCRM 30mlを加えて、pHを約9に維持した。一夜の反応の後、当該溶液を、Amicon Ultra 15 30 kDaカットオフスピン装置を使用して約1mlに濃縮した。0.5mlを、10mMのホウ酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH9、カラム速度0.5ml／分で平衡させたSuperdex 200カラム（1x30cm）に充填した。クロマトグラムを図3に示す。0.5ml画分を収集し、選択した画分をSEC HPLCで分析した。図4にSECクロマトグラムを示しており、これは、すべての画分が、コンジュゲート化されていないCRMよりも高いMWであることを示している。示されているように、画分20〜28すべてが、コンジュゲート化されていないCRMよりも早く溶出しており、これは、それぞれがより高い分子量であることを示している。 Example 7: Direct binding of protein to polysaccharide using 1-CI The capsular polysaccharide from pneumococcal serotype 6A (Ps6A) was dissolved in water at 10 mg / ml. Each of the five 1 ml tubes was heated at 80 ° C. for 2 minutes and 1 ml of 0.1M sodium borate, pH 9, was added to each. After 2.5 hours, the tube was ice-cooled and then dialyzed. 25 ul of TEA was added to 10 ml of 5 mg / ml hydrolyzed Ps6A and 50 mg of 1-CI was added while vortexing. At 2.5 minutes, 17.2 mg / ml of CRM 30 ml was added to maintain the pH at about 9. After overnight reaction, the solution was concentrated to approximately 1 ml using an Amicon Ultra 15 30 kDa cut-off spin apparatus. 0.5 ml was loaded onto a Superdex 200 column (1 × 30 cm) equilibrated with 10 mM sodium borate, 150 mM NaCl, pH 9, column speed 0.5 ml / min. The chromatogram is shown in FIG. 0.5 ml fractions were collected and selected fractions were analyzed by SEC HPLC. FIG. 4 shows the SEC chromatogram, which shows that all fractions are higher MW than unconjugated CRM. As shown, fractions 20-28 all elute faster than unconjugated CRM, indicating that each has a higher molecular weight.

実施例8：1−シアノベンゾトラゾール（1−CBT）による多糖の官能化
1−CBT 12mgを、アセトニトリル240ul＋NMP 120ulに懸濁させた。0.2M 120ulを、20mg／mlのT2000デキストラン0.5ml（デキストランは10mg）に加え、続いて1−CBT懸濁液120ulを加えた。約3分の時点で、0.5Mのアジピン酸ジヒドラジド0.5mlを加えた。2時間の反応の後、当該溶液を、2昼夜にわたって生理食塩水に対して十分に透析した。次いで、当該溶液を遠心分離し、デキストランおよびヒドラジドについてアッセイした。 Example 8: Functionalization of polysaccharides with 1-cyanobenzotrazole (1-CBT)
1-CBT 12 mg was suspended in acetonitrile 240ul + NMP 120ul. 0.2M 120ul was added to 0.5ml 20mg / ml T2000 dextran (10mg dextran) followed by 120ul 1-CBT suspension. At about 3 minutes, 0.5 ml of 0.5 M adipic acid dihydrazide was added. After a 2 hour reaction, the solution was dialyzed extensively against saline for 2 days. The solution was then centrifuged and assayed for dextran and hydrazide.

回収されたおよそ9.5mgのデキストランは、デキストラン100kDaあたり約11のヒドラジドの比率であった。ヒドラジドがデキストランに連結されていることを確認するために、TNBS標識されたヒドラジド−デキストランの一定分量を、TNBS−ヒドラジド付加体が吸着する500nmにおいてモニターしながら、SEC HPLCによって調べた。クロマトグラムは、トリニトロベンゼンが高分子量のデキストランを伴っていることを示しており、これは、ヒドラジドが実際にデキストランに連結されていることを示している。このことは、1−CBTを使用して多糖を官能化することが可能であることを示している。   Approximately 9.5 mg of dextran recovered was a ratio of about 11 hydrazides per 100 kDa dextran. To confirm that the hydrazide was linked to dextran, an aliquot of TNBS-labeled hydrazide-dextran was examined by SEC HPLC while monitoring at 500 nm where the TNBS-hydrazide adduct adsorbs. The chromatogram shows that trinitrobenzene is accompanied by high molecular weight dextran, which indicates that the hydrazide is actually linked to dextran. This indicates that 1-CBT can be used to functionalize the polysaccharide.

実施例9：1−CBTで活性化された多糖に対するタンパク質の直接的な結合
0.2MのTEA 120ulを、T2000デキストランの20mg／ml溶液500ulに加え、アセトニトリル1 ml中1−CBT 50mgの懸濁液160ulを加えた。約2分の時点で、生理食塩水1 ml中BSA 47mg溶液200ulを加えたところ、当該溶液はより粘性になった。一夜の反応の後、当該コンジュゲートをSEC HPLCによって分析した。BSAの大部分は、カラムのボイドボリュームにおいて溶出し、これは、それらが高分子量を有していたことを示している。このことは、1−CBTを使用することにより、タンパク質を多糖に対し直接結合することができるということを示している。 Example 9: Direct binding of proteins to 1-CBT activated polysaccharides
120ul of 0.2M TEA was added to 500ul of a 20mg / ml solution of T2000 dextran and 160ul of 1-CBT 50mg suspension in 1ml acetonitrile. At about 2 minutes, 200 ul of a 47 mg solution of BSA in 1 ml of physiological saline was added and the solution became more viscous. After overnight reaction, the conjugate was analyzed by SEC HPLC. Most of the BSA eluted in the void volume of the column, indicating that they had a high molecular weight. This indicates that the protein can be directly bound to the polysaccharide by using 1-CBT.

実施例10：炭水化物をシアノ化するために、選択された2−シアノピリダジン−3（2H）−オン（Kimら、Tetrahedron 61：5889,2005を参照のこと）をKimらの文献に記載されているように合成した
炭水化物を、2-CPO（X＝Cl、Y＝Cl）を使用して活性化し、次いで、タンパク質と直接反応させるか、または、例えばアミノ基により官能化する。Reagent 2a（Kimらの文献のスキーム1を参照のこと）を、アセトニトリル1 ml中100mgで作製し、炭水化物1mgに対して試薬1mgの比率で、肺炎球菌14型多糖（Ps14）の10mg／ml溶液に加える。トリエチルアミンを使用してpHを9.5まで上げ、維持する。2.5分後、当該溶液の半分を、同体積の0.5Mのヘキサンジアミンに加え、pHを約8に調節する。当該溶液のもう半分を、10mg／ml溶液における同重量の破傷風トキソイドと混合する。4℃で一夜かけてインキュベートした後、ヘキサンジアミン多糖溶液を生理食塩水で十分に透析し、次いで、アミンおよび多糖についてアッセイする。多糖100kDaあたりアミンが10の比率であることが見出される。破傷風多糖溶液を、S400HRカラム（GE Healthcare社）で分画して、コンジュゲート化されていないタンパク質を除去する。当該タンパク質および多糖の濃度を測定する。多糖1mgあたりタンパク質約0.75mgの比率であることが見出される。 Example 10: A selected 2-cyanopyridazin-3 (2H) -one (see Kim et al., Tetrahedron 61: 5889, 2005) for cyanating carbohydrates is described in Kim et al. Carbohydrates synthesized as such are activated using 2-CPO (X = Cl, Y = Cl) and then reacted directly with proteins or functionalized, for example, with amino groups. Reagent 2a (see Scheme 1 of Kim et al.) Made at 100 mg in 1 ml acetonitrile, 10 mg / ml solution of pneumococcal type 14 polysaccharide (Ps14) at a ratio of 1 mg of reagent to 1 mg of carbohydrate Add to. Triethylamine is used to raise and maintain the pH to 9.5. After 2.5 minutes, half of the solution is added to the same volume of 0.5 M hexanediamine and the pH is adjusted to about 8. The other half of the solution is mixed with the same weight of tetanus toxoid in a 10 mg / ml solution. After overnight incubation at 4 ° C., the hexanediamine polysaccharide solution is dialyzed thoroughly with saline and then assayed for amine and polysaccharide. A ratio of 10 amines per 100 kDa polysaccharide is found. The tetanus polysaccharide solution is fractionated on an S400HR column (GE Healthcare) to remove unconjugated protein. The concentration of the protein and polysaccharide is measured. A ratio of about 0.75 mg protein per mg polysaccharide is found.

本発明の他の態様および使用は、本明細書の考察および本明細書において開示される本発明の実施から当業者には明らかとなるであろう。本明細書において引用されるすべての参考文献は、すべての刊行物、米国および外国の特許および特許出願を含めて、参照により具体的かつ完全に本明細書に組み入れられる。「含む（comprising）」という用語は、いずれにおいて使用されようとも、「からなる（consisting of）」および「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」という用語を含むことが意図される。さらに、「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「含有する（containing）」という用語は、限定を意図しない。明細書および実施例は、単に例示にすぎないと見なされるべきであって、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の請求項によって示されることが意図される。   Other aspects and uses of the invention will be apparent to those skilled in the art from consideration of the specification and practice of the invention disclosed herein. All references cited herein are specifically and fully incorporated herein by reference, including all publications, US and foreign patents and patent applications. The term “comprising”, whatever used, is intended to include the terms “consisting of” and “consisting essentially of”. Furthermore, the terms “comprising”, “including”, and “containing” are not intended to be limiting. It is intended that the specification and examples be considered as exemplary only, with a true scope and spirit of the invention being indicated by the following claims.

Claims (6)

１−シアノイミダゾール（１−ＣＩ）と化学化合物を混合して、活性化された化学化合物を生成する工程；および
該活性化された化合物を抗原性の第二の化合物と混合してコンジュゲートを生成する工程
を含む、化学化合物をコンジュゲート化する方法であって、
該化学化合物が、天然または合成の炭水化物、多糖、オリゴ糖、またはそれらの組み合わせであり、
該第二の化合物が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、方法。 Mixing 1-cyanoimidazole (1-CI) with a chemical compound to produce an activated chemical compound; and mixing the activated compound with an antigenic second compound to form a conjugate. A method of conjugating a chemical compound, comprising the step of:
The chemical compound is a natural or synthetic carbohydrate, polysaccharide, oligosaccharide, or a combination thereof;
The method wherein the second compound is a peptide, polypeptide, or protein. コンジュゲート化が、直接的なものであるか、またはコンジュゲート化を促進する官能基の追加を伴う間接的なものであり、
該コンジュゲート化を促進する官能基がアミノ基、ヒドラジド基、またはアミノオキシ基である、請求項１記載の方法。 Conjugation is direct or indirect with the addition of functional groups that facilitate conjugation,
The method of claim 1, wherein the functional group that promotes conjugation is an amino group, a hydrazide group, or an aminooxy group. コンジュゲートより低い分子量の成分を、透析、ろ過、クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせによって除去する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, further comprising removing components of lower molecular weight than the conjugate by dialysis, filtration, chromatography, or a combination thereof. コンジュゲートが、ワクチンまたは診断剤である、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the conjugate is a vaccine or a diagnostic agent. 前記工程が一緒に実施される、請求項１記載の方法。   The method of claim 1, wherein the steps are performed together. 活性化された化合物を、ヘキサンジアミン、エチレンジアミン、ヒドラジン、アジピン酸ジヒドラジド、または１，６−ジアミノオキシヘキサンと混合して、活性化された化合物と抗原性の第二の化合物との間に連結基を形成する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。 The activated compound is mixed with hexanediamine, ethylenediamine, hydrazine, adipic acid dihydrazide, or 1,6-diaminooxyhexane to form a linking group between the activated compound and the antigenic second compound. The method of claim 1, further comprising the step of:
JP2015052989A 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines Active JP5917741B2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28759309P 2009-12-17 2009-12-17
US61/287,593 2009-12-17

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012544919A Division JP5892944B2 (en) 2009-12-17 2010-12-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2015145390A JP2015145390A (en) 2015-08-13
JP5917741B2 true JP5917741B2 (en) 2016-05-18

Family

ID=44306072

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012544919A Active JP5892944B2 (en) 2009-12-17 2010-12-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines
JP2015052989A Active JP5917741B2 (en) 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines
JP2015052991A Active JP5937712B2 (en) 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines
JP2015052990A Active JP5916177B2 (en) 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012544919A Active JP5892944B2 (en) 2009-12-17 2010-12-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015052991A Active JP5937712B2 (en) 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines
JP2015052990A Active JP5916177B2 (en) 2009-12-17 2015-03-17 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines

Country Status (13)

Country Link
US (4) US9044517B2 (en)
EP (1) EP2513056B1 (en)
JP (4) JP5892944B2 (en)
KR (4) KR101427862B1 (en)
CN (1) CN102892753B (en)
BR (4) BR122022002084B1 (en)
CA (4) CA2784144C (en)
DK (1) DK2513056T3 (en)
ES (1) ES2913180T3 (en)
MX (1) MX2012006961A (en)
SG (4) SG10201506160VA (en)
WO (1) WO2011084705A2 (en)
ZA (1) ZA201204279B (en)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101427862B1 (en) * 2009-12-17 2014-08-07 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the preparation of conjugate vaccines
EP2809349B1 (en) * 2012-01-30 2018-12-19 Serum Institute Of India Private Limited Immunogenic composition
CN103690944A (en) * 2013-12-27 2014-04-02 中国科学院过程工程研究所 Meningitis polysaccharide conjugate vaccine and preparing method thereof
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
US11246918B2 (en) 2017-02-03 2022-02-15 Eva Barbara Schadeck Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
JOP20200214A1 (en) * 2019-09-03 2021-03-03 Serum Institute Of India Pvt Ltd Immunogenic compositions against enteric diseases and methods for its preparation thereof
WO2021174330A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-10 Nuecology Biomedical Inc. Amphiphilic alginate-oleic acid macromolecules and process for preparation therof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US5360897A (en) 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4496538A (en) * 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4663160A (en) 1983-03-14 1987-05-05 Miles Laboratories, Inc. Vaccines for gram-negative bacteria
US4540573A (en) 1983-07-14 1985-09-10 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4678553A (en) 1986-07-11 1987-07-07 Ionics, Incorporated Renaturing reversibly denatured polypeptides and proteins by electrodialysis of solutions thereof in denaturants
US5039607A (en) 1988-05-17 1991-08-13 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for immunochromatographic analysis
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
EP1958646A1 (en) * 1992-02-11 2008-08-20 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5425946A (en) 1992-08-31 1995-06-20 North American Vaccine, Inc. Vaccines against group C Neisseria meningitidis
US5849301A (en) 1993-09-22 1998-12-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Producing immunogenic constructs using soluable carbohydrates activated via organic cyanylating reagents
ES2210262T3 (en) 1993-09-22 2004-07-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine PROCEDURE THAT ALLOWS THE ACTIVATION OF A SOLUBLE GLUCIDE WITH THE HELP OF NEW CIANILANT REAGENTS TO PRODUCE IMMUNOGEN STRUCTURES.
AU693511B2 (en) 1994-02-07 1998-07-02 Qiagen Gmbh Endotoxin reduction or removal process
WO1996017941A2 (en) * 1994-12-07 1996-06-13 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
NZ304715A (en) * 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
DE122009000055I1 (en) * 1995-03-22 2009-12-31 Jackson H M Found Military Med PREPARATION OF IMMUNOGENIC CONSTRUCTS USING SOLUBLE CARBOHYDRATES ACTIVATED BY ORGANIC CYANYLATION REAGENTS
WO1996030411A1 (en) * 1995-03-25 1996-10-03 Rhone-Poulenc Rhodia Aktiengesellschaft Process for activating polysaccharides, polysaccharides produced by this process, and use thereof
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US6309646B1 (en) 1996-05-09 2001-10-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates
US7094883B1 (en) 1996-08-02 2006-08-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibody which agglutinates E. coli having the CS4-CFA/I family protein
US6248334B1 (en) 1997-01-08 2001-06-19 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Process for preparing conjugate vaccines including free protein and the conjugate vaccines, immunogens, and immunogenic reagents produced by this process
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
ATE278418T1 (en) 1997-04-24 2004-10-15 Jackson H M Found Military Med COUPLING OF UNMODIFIED PROTEINS TO HALOACYL- OR DIHALOACYL-DERIVATIZED POLYSACCHARIDES TO PRODUCE PROTEIN-POLYSACCHARIDES VACCINES
CA2320470A1 (en) 1998-02-05 1999-08-12 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Simplified method for removing free protein during preparation of protein-polysaccharide conjugates and vaccines using restricted-access media
DE69936296D1 (en) 1998-04-10 2007-07-26 Andrew Lees CONJUGATE VACCINES FOR PREVENTING TOOTH CARIES
CA2331258C (en) 1998-06-12 2011-09-20 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Enhancement of b cell activation and immunoglobulin secretion by co-stimulation of receptors for antigen and ebv gp350/220
US7250494B2 (en) 1998-06-15 2007-07-31 Biosynexus Incorporated Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US6585973B1 (en) 1998-10-29 2003-07-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method for preparing solid phase conjugated vaccine
DE19859703B4 (en) 1998-12-23 2009-10-29 Macherey, Nagel Gmbh & Co. Handelsgesellschaft Process for purifying nucleic acids and anion exchangers for carrying out this process
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
US6214221B1 (en) 1999-02-22 2001-04-10 Henry B. Kopf Method and apparatus for purification of biological substances
DE60032120T2 (en) 1999-03-19 2007-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine against Streptococcus pneumoniae
CU22904A1 (en) 1999-08-30 2004-01-23 Univ De Ottawa OLIGOSACÁRIDOS DERIVED FROM RIBOSA- RIBITOL-PHOSPHATE, METHODS TO PREPARE THEM, IMMUNOGENS THAT UNDERSTAND THEM AND VACCINES THAT UNDERSTAND SUCH IMMUNOGENS
EP1315699B1 (en) 2000-03-22 2013-01-02 Solulink, Incorporated Hydrazine-based and carbonyl-based bifunctional crosslinking reagents
JP2004515450A (en) 2000-04-18 2004-05-27 エンドバイオロジックス， インコーポレイテッド Lipopolysaccharide conjugate vaccine for the treatment of sepsis
US20020091242A1 (en) 2000-10-11 2002-07-11 Michel Bessodes Acid-sensitive compounds, their preparation and uses
US20030119004A1 (en) 2001-12-05 2003-06-26 Wenz H. Michael Methods for quantitating nucleic acids using coupled ligation and amplification
US20030224000A1 (en) 2001-12-21 2003-12-04 Kokai-Kun John Fitzgerald Methods for blocking or alleviating staphylococcal nasal colonization by intranasal application of monoclonal antibodies
US20040052779A1 (en) 2001-12-21 2004-03-18 Stinson Jeffrey R. Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
AU2003201817A1 (en) 2002-01-04 2003-07-24 Stanford University Telomere-encoding synthetic dna nanocircles, and their use for the elongation of telomere repeats
US7452533B2 (en) 2002-03-26 2008-11-18 Biosynexus Incorporated Antimicrobial polymer conjugate containing lysostaphin and polyethylene glycol
JP2003321432A (en) * 2002-05-07 2003-11-11 Nippon Soda Co Ltd Method for producing cyano compound
WO2003097699A1 (en) 2002-05-15 2003-11-27 Zyomyx, Inc. Immobilization of glycoproteins
ATE392901T1 (en) 2002-10-30 2008-05-15 Phytrix Ag MUCUNA PRURIENS AND EXTRACTS THEREOF FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES
PL378138A1 (en) 2003-05-20 2006-03-06 Lego A/S Method and system for manipulating a digital representation of a three-dimensional object
US7981871B2 (en) 2003-12-04 2011-07-19 University Of Utah Research Foundation Modified macromolescules and associated methods of synthesis and use
AU2005209303A1 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Biosynexus, Inc. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccines conjugates
EP1784766B1 (en) 2004-08-10 2013-06-05 Gemalto SA Progressive unplugging multi-cards body
EP2305294B1 (en) 2004-09-22 2015-04-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic composition for use in vaccination against staphylococcei
KR101411425B1 (en) * 2006-03-17 2014-06-24 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 Methods for preparing complex multivalent immunogenic conjugates
US20070292404A1 (en) 2006-03-27 2007-12-20 Biosynexus Incorporated Antimicrobial polymer conjugates
TWI565713B (en) 2006-08-07 2017-01-11 哈佛大學校長及研究員協會 Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines
US8554031B2 (en) 2009-06-17 2013-10-08 University Of North Carolina At Charlotte Focusing multimodal optical microprobe devices
WO2011053971A2 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Fina Biosolutions, Llc Method for enhancing the sensitivity of antibody based assays
KR101427862B1 (en) * 2009-12-17 2014-08-07 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the preparation of conjugate vaccines
DK2560738T3 (en) 2010-04-23 2019-08-26 Serum Inst India Ltd SIMPLE PROCEDURE FOR SIMULTANEOUS REMOVAL OF CULTURAL POLLUTANTS FROM ULTRALA LEVELS
WO2013188539A2 (en) 2012-06-12 2013-12-19 Fina Biosolutions, Llc Differential functionalization of polymers with amino-oxy reagents for diagnostic assays

Also Published As

Publication number Publication date
KR101427862B1 (en) 2014-08-07
CA2784144C (en) 2017-07-11
KR20140040292A (en) 2014-04-02
CA2836140A1 (en) 2011-07-14
KR101605171B1 (en) 2016-03-21
JP5916177B2 (en) 2016-05-11
CA2836140C (en) 2016-06-21
JP2013515003A (en) 2013-05-02
ZA201204279B (en) 2013-02-27
JP5937712B2 (en) 2016-06-22
CN102892753B (en) 2016-01-20
SG181750A1 (en) 2012-07-30
JP2015145390A (en) 2015-08-13
JP5892944B2 (en) 2016-03-23
US20140316110A1 (en) 2014-10-23
JP2015145391A (en) 2015-08-13
KR20140106759A (en) 2014-09-03
KR20120104360A (en) 2012-09-20
US9259480B2 (en) 2016-02-16
EP2513056A2 (en) 2012-10-24
CA2836154C (en) 2018-07-31
CA2836153A1 (en) 2011-07-14
CA2836154A1 (en) 2011-07-14
ES2913180T3 (en) 2022-05-31
CA2836153C (en) 2016-06-21
US20120288518A1 (en) 2012-11-15
SG10201506162RA (en) 2015-09-29
MX2012006961A (en) 2012-10-03
DK2513056T3 (en) 2022-05-23
SG10201506165TA (en) 2015-09-29
US20140316111A1 (en) 2014-10-23
CN102892753A (en) 2013-01-23
KR20140106758A (en) 2014-09-03
SG10201506160VA (en) 2015-09-29
BR112012014882B1 (en) 2022-05-31
BR122022002136B1 (en) 2022-08-23
WO2011084705A2 (en) 2011-07-14
BR122022002084B1 (en) 2022-08-16
EP2513056B1 (en) 2022-05-04
CA2784144A1 (en) 2011-07-14
BR112012014882A2 (en) 2015-09-15
US9254337B2 (en) 2016-02-09
EP2513056A4 (en) 2015-10-14
US9248197B2 (en) 2016-02-02
KR101635795B1 (en) 2016-07-04
US9044517B2 (en) 2015-06-02
BR122022002139B1 (en) 2022-08-23
US20140323688A1 (en) 2014-10-30
WO2011084705A3 (en) 2012-03-01
KR101635630B1 (en) 2016-07-01
JP2015155417A (en) 2015-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5917741B2 (en) Chemical reagents for the activation of polysaccharides in the manufacture of conjugate vaccines
WO2018126229A9 (en) Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
WO2017036142A1 (en) Preparation method of group a meningococcal capsular polysaccharide conjugate vaccine
CA2512847C (en) Conjugates obtained by reductive amination of serotype 5 pneumococcus capsular polysaccharide
WO2017036143A1 (en) Group a meningococcal capsular polysaccharide conjugate vaccine and preparation method thereof
JP2023537945A (en) Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccine containing emerging serotype 24F
WO2017036141A1 (en) Preparation method and use of group a meningococcal capsular polysaccharide conjugate vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20151221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160223

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160404

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160406

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5917741

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250