JP5916176B2 - Microbial contaminant concentration detection method, electrode chip and oligopeptide - Google Patents
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Description
本発明は、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカン等の微生物夾雑物の濃度検出方法ならびにそれに用いられる電極チップおよびオリゴペプチドに関するものである。 The present invention relates to a method for detecting the concentration of microbial contaminants such as endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan, and an electrode chip and an oligopeptide used therefor.
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在する物質であり、また(1→3)−β−D−グルカンは酵母やカビ等の真菌の細胞壁に存在する物質であり、発熱性等の種々の生物活性を有している。そのため、例えば透析液、注射薬、移植組織片、人工授精の受精卵の培養溶液等の医薬品や医療用具がエンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカン等の微生物夾雑物で汚染された場合、極微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらの微生物夾雑物の汚染量は厳密に管理されなければならない。しかしながら、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカン等の微生物夾雑物は環境中に普遍的に存在し、さらに耐熱性を有するために加熱除去が困難であり、混入防止管理は非常に難しい。 Endotoxin is a substance that exists in the cell wall of Gram-negative bacteria, and (1 → 3) -β-D-glucan is a substance that exists in the cell wall of fungi such as yeast and mold, and has various biological activities such as pyrogenicity. have. Therefore, for example, pharmaceuticals and medical devices such as dialysate, injectable drugs, transplanted tissue pieces, and artificial fertilized egg culture solutions were contaminated with endotoxin and microbial contaminants such as (1 → 3) -β-D-glucan. In some cases, even trace amounts can cause serious consequences and the amount of contamination of these microbial contaminants must be strictly controlled. However, microbial contaminants such as endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan are ubiquitous in the environment, and because they are heat resistant, they are difficult to remove by heating, and contamination prevention management is very difficult.
エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの検出試験には定性試験および定量試験があり、定性試験としてはゲル化法、定量試験としては比濁法、比色法、蛍光法が一般に知られている。いずれの方法においても、高精度の検出を行うには煩雑な手順や長時間を要する。そのため、簡便な操作で迅速な検出方法が求められている。 The endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan detection tests include qualitative tests and quantitative tests. The qualitative tests are generally gelation methods, and the quantitative tests are turbidimetric, colorimetric, and fluorescent methods. Are known. In either method, a complicated procedure and a long time are required to perform highly accurate detection. Therefore, a rapid detection method is required with a simple operation.
そこで、本発明者らの一部は、特許文献1に記載するように、色素が結合したペプチドを用い、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用したエンドトキシンの濃度検出方法を提案している。この方法においては、ディファレンシャルパルスボルタンメトリを適用することにより、ペプチドから遊離した色素の還元に由来する電流ピークと、ペプチドに結合した色素の還元に由来する電流ピークとを分離して得ることができ、エンドトキシンの濃度を高い精度で検出することができる。
しかしながら、ディファレンシャルパルスボルタンメトリでは、測定結果を解析し、測定電流ピークが測定対象物に由来するピークであるのか見極める必要があり、分析が複雑である。さらに、電位の走査に時間がかかるという問題もある。
また、色素が結合したペプチドを用いる場合、ペプチドから遊離した色素と、ペプチドに結合した色素とは、酸化還元電位が非常に近接しており、一般に分離が非常に困難であると考えられている。また、これらの濃度が微量であるほど、酸化還元電流を得ることは難しい。そのため、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ以外の電気化学測定法では検出が困難である。
Thus, as described in Patent Document 1, some of the present inventors have proposed an endotoxin concentration detection method using a peptide to which a dye is bound and applying differential pulse voltammetry. In this method, by applying differential pulse voltammetry, the current peak derived from the reduction of the dye released from the peptide and the current peak derived from the reduction of the dye bound to the peptide can be obtained separately. The endotoxin concentration can be detected with high accuracy.
However, in differential pulse voltammetry, it is necessary to analyze the measurement result and determine whether the measurement current peak is a peak derived from the measurement object, and the analysis is complicated. Further, there is a problem that it takes time to scan the potential.
In addition, when using a peptide to which a dye is bound, the dye released from the peptide and the dye bound to the peptide are very close in redox potential and are generally considered to be very difficult to separate. . Also, the smaller the concentration, the more difficult it is to obtain a redox current. Therefore, it is difficult to detect by electrochemical measurement methods other than differential pulse voltammetry.
上記問題を解決するために、本発明者らの一部は、非特許文献1に記載するように、パラアミノフェノールが結合したペプチドを用いた電気化学的なエンドトキシンの濃度検出方法を提案している。パラアミノフェノールが結合したペプチドを用いることにより、ディファレンシャルパルスボルタンメトリよりも簡易な電気化学測定法であるアンペロメトリによる検出が可能になる。
しかしながら、パラアミノフェノールは、その電気化学活性が分単位の速い速度で経時的に失われていき、不安定であるという問題がある。
In order to solve the above problems, some of the present inventors have proposed an electrochemical endotoxin concentration detection method using a peptide to which paraaminophenol is bound, as described in Non-Patent Document 1. . By using a peptide to which paraaminophenol is bound, detection by amperometry, which is an electrochemical measurement method simpler than differential pulse voltammetry, becomes possible.
However, paraaminophenol has a problem that its electrochemical activity is lost over time at a fast rate of minutes, and is unstable.
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度かつ安定的な検出を行うことが可能な微生物夾雑物の濃度検出方法、ならびにそれに用いる電極チップおよび新規なオリゴペプチドを提供することを主目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and a method for detecting the concentration of microbial contaminants that can easily and highly sensitively and stably detect even a very small amount of microbial contaminants, The main object is to provide an electrode chip and a novel oligopeptide used therefor.
上記目的を達成するために、本発明は、微生物夾雑物を含む被検体、ライセート試薬および下記一般式(a)で示した化合物が結合したペプチドを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記一般式(a)で示した化合物の遊離反応を生じさせる反応工程と、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程とを有することを特徴とする微生物夾雑物の濃度検出方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention comprises contacting a test substance containing a microbial contaminant, a lysate reagent, and a peptide bound with a compound represented by the following general formula (a), from the above peptide by a multi-step reaction. A reaction step for causing a free reaction of the compound represented by the general formula (a), and an electric current measured by an electrochemical reaction with respect to the mixture of the analyte, the lysate reagent, and the peptide after the free reaction. And a measurement step of quantifying microbial contaminants based on the value. A method for detecting the concentration of microbial contaminants is provided.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
本発明によれば、一般式(a)で示した化合物が結合したペプチドを用い、電気化学反応を利用することにより、ペプチドと結合した一般式(a)で示した化合物をはじめ、被検体を含む混合物に存在するその他の物質の影響を受けることなく、ペプチドから遊離して生じる一般式(a)で示した化合物の濃度を定量することができ、これにより微生物夾雑物の濃度を定量することができる。したがって、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度で検出することが可能である。また、一般式(a)で示した化合物は、その電気化学活性が安定であるため、正確かつ安定的な検出が可能となる。 According to the present invention, by using a peptide to which a compound represented by the general formula (a) is bound and utilizing an electrochemical reaction, a test compound including the compound represented by the general formula (a) bound to the peptide is used. The concentration of the compound represented by the general formula (a) generated by liberation from the peptide can be quantified without being affected by the other substances present in the mixture, and the concentration of microbial contaminants can be quantified thereby. Can do. Therefore, even a very small amount of microbial contaminants can be easily detected with high sensitivity. In addition, since the compound represented by the general formula (a) has a stable electrochemical activity, accurate and stable detection is possible.
上記発明においては、上記一般式(a)で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式(a)で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式(a)で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。 In the said invention, it is preferable that the compound shown by the said general formula (a) is paramethoxyaniline. The shorter the alkyl chain of the compound represented by the general formula (a), the higher the water solubility and the easier the enzyme recognizes the compound represented by the general formula (a). Because it increases.
上記発明においては、上記微生物夾雑物がエンドトキシンまたは(1→3)−β−D−グルカンであることが好ましい。 In the above invention, the microbial contaminant is preferably endotoxin or (1 → 3) -β-D-glucan.
また本発明においては、上記ペプチドは、一端に上記一般式(1)で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドであることが好ましい。このようなオリゴペプチドは、多段階反応により生じる活性型凝固酵素の作用を受け、容易に一般式(1)で示した化合物を放出するため、微生物夾雑物の検出精度を向上することができ、効率的な測定が可能となる。 In the present invention, the peptide is preferably an oligopeptide having one end bound to the compound represented by the general formula (1) and the other end bound to a peptide protecting group. Such an oligopeptide is subjected to the action of an active clotting enzyme generated by a multi-step reaction, and easily releases the compound represented by the general formula (1), thereby improving the detection accuracy of microbial contaminants. Efficient measurement is possible.
さらに本発明においては、上記電気化学反応による測定方法がアンペロメトリ法であることが好ましい。アンペロメトリ法は、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ法とは異なり、測定結果の測定電流ピーク解析が不要であり、微生物夾雑物の検出を簡略化することができる。 Further, in the present invention, it is preferable that the measurement method based on the electrochemical reaction is an amperometry method. Unlike the differential pulse voltammetry method, the amperometry method does not require measurement current peak analysis of measurement results, and can simplify detection of microbial contaminants.
また本発明においては、上記多段階反応および上記遊離反応時に加温することが好ましい。反応を活性化することができるからである。 Moreover, in this invention, it is preferable to heat at the said multistage reaction and the said free reaction. This is because the reaction can be activated.
また本発明は、基板と、上記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、上記収容部内に配置された電極とを有し、上記被検体を導入する導入口から上記収容部の間に一般式(1)で示した化合物が結合したペプチドが配置されていることを特徴とする電極チップを提供する。 The present invention also includes a substrate, a container formed on the substrate and capable of accommodating a specimen containing microbial contaminants, and an electrode disposed in the container, and introducing the specimen. Provided is an electrode chip characterized in that a peptide to which a compound represented by the general formula (1) is bonded is disposed between the mouth and the housing part.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
本発明によれば、電極チップに一般式(1)で示した化合物が結合したペプチドが予め配置されており、電気化学的に測定を行うため、微量の被検体であっても微生物夾雑物の濃度検出を簡易かつ迅速に高感度で行うことができ、安価に微生物夾雑物の濃度検出を行うことができる。 According to the present invention, the peptide having the compound represented by the general formula (1) bound to the electrode chip is arranged in advance, and the measurement is performed electrochemically. Concentration detection can be performed easily and quickly with high sensitivity, and the concentration of microbial contaminants can be detected at low cost.
上記発明においては、上記一般式(a)で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式(a)で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式(a)で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。 In the said invention, it is preferable that the compound shown by the said general formula (a) is paramethoxyaniline. The shorter the alkyl chain of the compound represented by the general formula (a), the higher the water solubility and the easier the enzyme recognizes the compound represented by the general formula (a). Because it increases.
また本発明の電極チップは、一端が上記収容部に接続され、他端が上記導入口に接続された流路をさらに有していてもよい。この場合、例えば流路に上記ペプチドを配置することができる。 The electrode chip of the present invention may further include a flow path having one end connected to the housing portion and the other end connected to the introduction port. In this case, for example, the peptide can be arranged in the channel.
また本発明においては、上記導入口から上記収容部の間にライセート試薬が配置されていてもよい。電極チップにライセート試薬も予め配置されている場合には、被検体のみを導入すればよく、簡単な操作で測定が可能となる。 Moreover, in this invention, the lysate reagent may be arrange | positioned between the said accommodating part from the said inlet. When the lysate reagent is also preliminarily arranged on the electrode chip, only the subject needs to be introduced, and measurement can be performed with a simple operation.
さらに本発明は、一端に一般式(1)で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合していることを特徴とするオリゴペプチドを提供する。 Furthermore, the present invention provides an oligopeptide characterized in that a compound represented by the general formula (1) is bonded to one end and a protecting group of the peptide is bonded to the other end.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
本発明のオリゴペプチドは、多段階反応により生じる活性型凝固酵素の作用を受け、容易に一般式(1)で示した化合物を放出するため、微生物夾雑物の検出精度を向上することができ、効率的な測定を実現することができる。 The oligopeptide of the present invention is subjected to the action of an active clotting enzyme generated by a multi-step reaction, and easily releases the compound represented by the general formula (1), so that the detection accuracy of microbial contaminants can be improved, Efficient measurement can be realized.
上記発明においては、上記一般式(a)で示した化合物がパラメトキシアニリンであることが好ましい。上記一般式(a)で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、酵素が上記一般式(a)で示した化合物を認識しやすくなるため、酵素との反応性が高まるからである。 In the said invention, it is preferable that the compound shown by the said general formula (a) is paramethoxyaniline. The shorter the alkyl chain of the compound represented by the general formula (a), the higher the water solubility and the easier the enzyme recognizes the compound represented by the general formula (a). Because it increases.
本発明は、極微量の微生物夾雑物であっても、簡易に高感度かつ安定的な検出を行うことが可能であるという効果を奏する。 The present invention has an effect that even a very small amount of microbial contaminants can be easily and highly sensitively and stably detected.
以下、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法ならびにそれに用いられる電極チップおよびオリゴペプチドについて詳細に説明する。 Hereinafter, the method for detecting the concentration of microbial contaminants of the present invention and the electrode chip and oligopeptide used therein will be described in detail.
A.微生物夾雑物の濃度検出方法
本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法は、微生物夾雑物を含む被検体、ライセート試薬および下記一般式(a)で示した化合物が結合したペプチドを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記一般式(a)で示した化合物の遊離反応を生じさせる反応工程と、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程とを有することを特徴とする。
A. Microbial Contaminant Concentration Detection Method The microbial contaminant concentration detection method of the present invention comprises contacting a specimen containing a microbial contaminant, a lysate reagent, and a peptide to which a compound represented by the following general formula (a) is bound. For the reaction step of causing the release reaction of the compound represented by the general formula (a) from the peptide by the step reaction, and the mixture of the analyte, the lysate reagent, and the peptide after the release reaction, And a measuring step for quantifying microbial contaminants based on a current value measured by a chemical reaction.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
以下、上記一般式(a)で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。なお、本明細書中にて、パラメトキシアニリンをpMAと略称する場合がある。 Hereinafter, paramethoxyaniline will be specifically described as the compound represented by the general formula (a). In the present specification, paramethoxyaniline may be abbreviated as pMA.
図1は、多段階反応の一例を示す模式図であり、微生物夾雑物がエンドトキシンの場合の例である。図1に例示するように、多段階反応においては、エンドトキシンを含む被検体をライセート試薬のC因子に作用させることにより、C因子から活性型C因子を、B因子から活性型B因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させ、この活性型凝固酵素により、pMAが結合したペプチドからpMAを遊離させる。 FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a multistage reaction, and is an example in the case where the microbial contaminant is endotoxin. As illustrated in FIG. 1, in a multi-step reaction, an analyte containing endotoxin is allowed to act on factor C of a lysate reagent, thereby coagulating active factor C from factor C, active factor B from factor B, and coagulation. Activated coagulase is generated one after another from the enzyme precursor, and pMA is released from the peptide to which pMA is bound by this activated coagulase.
図2は、多段階反応の他の例を示す模式図であり、微生物夾雑物が(1→3)−β−D−グルカンの場合の例である。図2に例示するように、多段階反応においては、(1→3)−β−D−グルカンを含む被検体をライセート試薬のG因子に作用させることにより、G因子から活性型G因子を、凝固酵素前駆体から活性型凝固酵素を次々に発生させ、この活性型凝固酵素により、pMAが結合したペプチドからpMAを遊離させる。 FIG. 2 is a schematic diagram showing another example of the multistage reaction, and is an example in the case where the microbial contaminant is (1 → 3) -β-D-glucan. As illustrated in FIG. 2, in a multi-step reaction, an active G-factor is converted from G-factor by allowing a sample containing (1 → 3) -β-D-glucan to act on G-factor of the lysate reagent. Active coagulase is generated one after another from the coagulase precursor, and pMA is released from the peptide to which pMA is bound by this active coagulase.
本発明においては、遊離反応後の、被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する。すなわち、反応後の被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したpMAが存在しており、特定の電位においてpMAが酸化反応する。このpMAの酸化反応に由来する電流値と、pMAの濃度、すなわちエンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度との間には相関が成り立ち、この相関を利用して、pMAの濃度を定量する。 In the present invention, microbial contaminants are quantified based on the current value measured by the electrochemical reaction with respect to the mixture of the analyte, lysate reagent and peptide after the release reaction. That is, pMA released from the peptide is present in the mixture of the analyte, lysate reagent and peptide after the reaction, and pMA undergoes an oxidation reaction at a specific potential. There is a correlation between the current value derived from the oxidation reaction of pMA and the concentration of pMA, that is, the concentration of endotoxin or (1 → 3) -β-D-glucan. Quantify the concentration.
具体的には、電極電位が酸化電位以上になると、pMAは下記式(1)のスキームに従って電子を放出し、酸化される。 Specifically, when the electrode potential becomes equal to or higher than the oxidation potential, pMA emits electrons according to the scheme of the following formula (1) and is oxidized.
このときにpMAから放出されて作用極が受け取る電子が電流として観察される。電気化学反応により測定される電流値は、pMAの濃度に比例する。エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度および多段階反応の進行には相関があるため、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度および生じたpMAの濃度、すなわち電流値にも相関が生じる。したがって、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度および電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、電流値から、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度を測定することができる。 At this time, electrons emitted from the pMA and received by the working electrode are observed as a current. The current value measured by the electrochemical reaction is proportional to the concentration of pMA. Since there is a correlation between the concentration of endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan and the progress of multi-step reaction, the concentration of endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan and the concentration of pMA produced, That is, the current value also has a correlation. Therefore, by preparing in advance a calibration curve showing the correlation between the concentration of endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan and the current value, endotoxin and (1 → 3) -β-D- The concentration of glucan can be measured.
ここで、被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したpMAの他に、ペプチドに結合したpMAも存在する。しかしながら、ペプチドから遊離したpMAとペプチドに結合したpMAとは、酸化還元電位が異なっており、その差が比較的大きい。そのため、ペプチドから遊離したpMAの酸化反応に由来する電流と、ペプチドに結合したpMAの酸化反応に由来する電流とを容易に分離して得ることができる。したがって本発明においては、pMAが結合したペプチドを用いることにより、ペプチドから遊離したpMAの濃度が極微量であっても、エンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度を高い精度で検出することができる。 Here, in the mixture of the analyte, the lysate reagent, and the peptide, in addition to pMA released from the peptide, pMA bound to the peptide is also present. However, pMA released from the peptide and pMA bound to the peptide have different redox potentials, and the difference is relatively large. Therefore, the current derived from the oxidation reaction of pMA released from the peptide and the current derived from the oxidation reaction of pMA bound to the peptide can be easily separated and obtained. Therefore, in the present invention, by using a peptide to which pMA is bound, the concentration of endotoxin or (1 → 3) -β-D-glucan can be accurately determined even if the concentration of pMA released from the peptide is extremely small. Can be detected.
また、一般に、被検体には酸素が溶存しており、酸素は特定の電位において還元反応する。そのため、還元反応に由来する電流に基づいて微生物夾雑物の濃度を測定する場合には、酸素の還元反応に由来する電流も影響することから、微生物夾雑物の濃度を精度良く検出することが困難である。特許文献1に記載されているような、色素が結合したペプチドを用いる場合には、ペプチドから遊離した色素の還元反応に由来する電流ピークに基づいてエンドトキシンの濃度を測定するため、高精度な検出は難しい。
これに対し、本発明においては、上述したように、ペプチドから遊離したpMAの酸化反応に由来する電流に基づいてエンドトキシンや(1→3)−β−D−グルカンの濃度を測定することができる。
したがって本発明においては、ペプチドと結合したpMAをはじめ、被検体を含む混合物に存在するその他の物質の影響を受けることなく、極微量の微生物夾雑物であっても高感度に検出することが可能である。
In general, oxygen is dissolved in the subject, and oxygen undergoes a reduction reaction at a specific potential. Therefore, when measuring the concentration of microbial contaminants based on the current derived from the reduction reaction, the current derived from the oxygen reduction reaction is also affected, so it is difficult to accurately detect the concentration of microbial contaminants. It is. When using a peptide to which a dye is bound as described in Patent Document 1, the concentration of endotoxin is measured based on the current peak derived from the reduction reaction of the dye released from the peptide. Is difficult.
On the other hand, in the present invention, as described above, the concentrations of endotoxin and (1 → 3) -β-D-glucan can be measured based on the current derived from the oxidation reaction of pMA released from the peptide. .
Therefore, in the present invention, even a very small amount of microbial contaminants can be detected with high sensitivity without being affected by pMA bound to the peptide and other substances present in the mixture containing the analyte. It is.
また本発明においては、電気化学測定を行うため、電極表面での反応の検出が可能となり、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度を測定することができる。したがって、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度検出が可能になるのみならず、迅速な検出が可能となる。さらに、高価なライセート試薬の使用を大幅に節減することができ、安価な微生物夾雑物の濃度検出方法の提供が可能になる。 In the present invention, since the electrochemical measurement is performed, the reaction on the electrode surface can be detected, and the concentration of microbial contaminants can be measured even with a small amount of sample. Therefore, not only a minute amount of an analyte can be detected, but also the concentration of microbial contaminants can be detected, and a rapid detection is possible. Furthermore, the use of an expensive lysate reagent can be greatly reduced, and an inexpensive method for detecting the concentration of microbial contaminants can be provided.
また本発明においては、パラメトキシアニリンが結合したペプチドを用いており、パラメトキシアニリンは、その電気化学活性が安定であるため、正確かつ安定的な検出が可能となる。特に、例えば30分以上の長時間測定で高感度検出が必要な場合には、安定性に優れた検出が可能になる。 In the present invention, a peptide to which paramethoxyaniline is bound is used, and paramethoxyaniline has a stable electrochemical activity, so that accurate and stable detection is possible. In particular, when high-sensitivity detection is required for long-time measurement of, for example, 30 minutes or more, detection with excellent stability is possible.
また本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法は、比色法のように、光により検出する方法ではないため、透明性の低い被検体や、組織液等の多成分系の被検体も測定対象にできると考えられ、実用性が極めて高い。 In addition, the method for detecting the concentration of microbial contaminants according to the present invention is not a method for detecting by light unlike the colorimetric method, and therefore, a low-transparency sample and a multi-component sample such as tissue fluid are also subject to measurement. It is thought that it can be done and is extremely practical.
このように本発明においては、医療現場で、手軽で迅速かつ高精度な微生物夾雑物の定量が可能となり、血液と直接接する医薬品や医療器具に対して、微生物夾雑物の厳重な混入防止管理を行うことができる。 As described above, in the present invention, microbial contaminants can be quantified easily, quickly and with high accuracy at a medical site, and strict contamination prevention management of microbial contaminants is performed on pharmaceuticals and medical instruments that are in direct contact with blood. It can be carried out.
本発明が適用される微生物夾雑物としては、ライセート試薬反応性物質であればよく、エンドトキシン、(1→3)−β−D−グルカンを例示することができる。 The microbial contaminant to which the present invention is applied may be a lysate reagent-reactive substance, and examples thereof include endotoxin, (1 → 3) -β-D-glucan.
以下、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法における各工程について説明する。 Hereinafter, each step in the method for detecting the concentration of microbial contaminants of the present invention will be described.
1.反応工程
本発明における反応工程では、微生物夾雑物を含む被検体と、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドとを接触させて、多段階反応により上記ペプチドからの上記パラメトキシアニリンの遊離反応を生じさせる。
1. Reaction Step In the reaction step of the present invention, a specimen containing a microbial contaminant is brought into contact with a peptide to which a lysate reagent and paramethoxyaniline are bound, and the release reaction of the paramethoxyaniline from the peptide is performed by a multistep reaction. Cause it to occur.
ライセート試薬としては、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)といわれるカブトガニの血球抽出成分により調製されたものを用いることができる。また、ライセート試薬として、生体由来成分から単離精製されたC因子、G因子、凝固酵素等や、遺伝子組換え技術によって作製された組換えC因子等を適宜使用して調製した「LALの同等物」を用いることもできる。 As the lysate reagent, one prepared from a blood cell extract component of horseshoe crab called Limulus Ambocyte Lysate (LAL) can be used. In addition, as a lysate reagent, the “LAL equivalent” prepared by appropriately using factor C, factor G, coagulase, etc. isolated and purified from biological components, recombinant factor C prepared by gene recombination technology, etc. Things "can also be used.
パラメトキシアニリンが結合したペプチドとしては、一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドを用いることができる。このようなオリゴペプチドは、例えば、X−A−pMAで示されるものを挙げることができる。ここで、Xは保護基、Aはオリゴペプチドを表す。
保護基Xは、ペプチドの保護基、例えば、t−ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンゾイル基、アセテート基等を挙げることができる。
As a peptide to which paramethoxyaniline is bound, an oligopeptide having paramethoxyaniline bound to one end and a peptide protecting group bound to the other end can be used. Examples of such oligopeptides include those represented by X-A-pMA. Here, X represents a protecting group, and A represents an oligopeptide.
Examples of the protecting group X include peptide protecting groups such as a t-butoxycarbonyl group (Boc), a benzoyl group, and an acetate group.
オリゴペプチドとしては、ライセート試薬の作用によってパラメトキシアニリンを遊離することができるものであれば特に限定されるものではない。中でも、オリゴペプチドは、アミノ酸数が2〜10、特に2〜5、さらには3〜4のものが好ましい。
例えば、トリペプチドとしては、Leu−Gly−Arg、Thr−Gly−Arg等を例示することができる。また、例えば、一般式:R1−Gly−Arg−pMAにおけるL−アミノ酸を有するトリペプチドを挙げることができる。ここで、R1はN−ブロックされたアミノ酸を表す。
また、一般式:R2−A1−A2−A3−A4−pMAにおけるテトラペプチドを挙げることができる。ここで、R2は水素、ブロックしている芳香族炭化水素またはアシル基を表し、A1はIle、ValまたはLeuから選択されるL−アミノ酸またはD−アミノ酸を表し、A2はGluまたはAspを表し、A3はAlaまたはCysを表し、A4はArgを表す。
一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドとしては、具体的には、Boc−Leu−Gly−Arg−pMA、アセテート−Ile−Glu−Ala−Arg−pMA等が挙げられる。
The oligopeptide is not particularly limited as long as it can release paramethoxyaniline by the action of a lysate reagent. Among them, oligopeptides having 2 to 10 amino acids, particularly 2 to 5, and further 3 to 4 are preferable.
For example, as a tripeptide, Leu-Gly-Arg, Thr-Gly-Arg, etc. can be illustrated. Moreover, for example, a tripeptide having an L-amino acid in the general formula: R 1 -Gly-Arg-pMA can be mentioned. Here, R 1 represents an N-blocked amino acid.
Moreover, the general formula: can be mentioned tetrapeptide in R 2 -A 1 -A 2 -A 3 -A 4 -pMA. Wherein R 2 represents hydrogen, a blocked aromatic hydrocarbon or an acyl group, A 1 represents an L-amino acid or D-amino acid selected from Ile, Val or Leu, and A 2 represents Glu or Asp A 3 represents Ala or Cys, and A 4 represents Arg.
Specific examples of oligopeptides having one end linked to paramethoxyaniline and the other end bound to a peptide protecting group include Boc-Leu-Gly-Arg-pMA, Acetate-Ile-Glu-Ala-Arg-pMA Etc.
微生物夾雑物を含む被検体と、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドとを接触させる際には、pH6.0〜9.0、中でもpH7.0〜8.5の緩衝液を併用することが好ましい。これにより、パラメトキシアニリンの遊離量を増加させることができる。緩衝液としては、例えば、Tris−Ac緩衝液、Tris−HCl緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、PIPES緩衝液等が挙げられる。 When contacting a specimen containing microbial contaminants with a peptide to which a lysate reagent and paramethoxyaniline are bound, a buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0, particularly a pH of 7.0 to 8.5 must be used in combination. Is preferred. Thereby, the release amount of paramethoxyaniline can be increased. Examples of the buffer include Tris-Ac buffer, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, and PIPES buffer.
多段階反応により生じた活性型凝固酵素によって、被検体、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドの混合物中には、パラメトキシアニリンが結合したペプチドからパラメトキシアニリンが遊離する。
多段階反応および遊離反応時には、反応を活性化するために、加温することが好ましい。多段階反応および遊離反応の反応温度としては、好ましくは20℃〜50℃の範囲内、より好ましくは25〜45℃の範囲内、特に好ましくは37℃程度である。また、反応時間は、好ましくは30分間以上、より好ましくは1時間以上、さらに好ましくは2時間以上である。これにより、充分な量の遊離したパラメトキシアニリンを得ることができる。
なお、被検体とライセート試薬とパラメトキシアニリンが結合したペプチドとの合計容量が1mm3〜200mm3の範囲内、特に1mm3〜100mm3の範囲内、さらには1mm3〜50mm3の範囲内のように少ない場合は、反応温度を30℃〜40℃程度とし、反応時間を15分間〜1時間程度とすることができる。
Paramethoxyaniline is liberated from the peptide bound to paramethoxyaniline in the mixture of the analyte, the lysate reagent and the peptide bound to paramethoxyaniline by the active coagulation enzyme generated by the multistep reaction.
In the multistage reaction and the free reaction, it is preferable to warm in order to activate the reaction. The reaction temperature for the multistage reaction and the free reaction is preferably in the range of 20 ° C to 50 ° C, more preferably in the range of 25 to 45 ° C, and particularly preferably about 37 ° C. The reaction time is preferably 30 minutes or longer, more preferably 1 hour or longer, and even more preferably 2 hours or longer. Thereby, a sufficient amount of free paramethoxyaniline can be obtained.
Note that the range the total volume of 1 mm 3 to 200 mm 3 of a peptide analyte and lysate reagent and a para-methoxyaniline was bound, in particular in the range of 1 mm 3 100 mm 3, even more in the range of 1mm 3 ~50mm 3 In such a case, the reaction temperature can be about 30 ° C. to 40 ° C., and the reaction time can be about 15 minutes to 1 hour.
2.測定工程
本発明における測定工程では、上記遊離反応後の、上記被検体、上記ライセート試薬および上記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する。すなわち、反応後の被検体、ライセート試薬およびペプチドの混合物には、ペプチドから遊離したパラメトキシアニリンが存在しており、特定の電位において、パラメトキシアニリンが酸化反応する。この酸化反応に由来する電流値と、パラメトキシアニリンの濃度、すなわち微生物夾雑物の濃度との間には相関が成り立ち、この相関を利用して、パラメトキシアニリンの濃度を定量する。
2. Measurement Step In the measurement step of the present invention, microbial contaminants are quantified based on the current value measured by an electrochemical reaction with respect to the mixture of the analyte, the lysate reagent, and the peptide after the release reaction. That is, paramethoxyaniline liberated from the peptide is present in the mixture of the analyte, lysate reagent and peptide after the reaction, and paramethoxyaniline undergoes an oxidation reaction at a specific potential. There is a correlation between the current value resulting from this oxidation reaction and the concentration of paramethoxyaniline, that is, the concentration of microbial contaminants, and the concentration of paramethoxyaniline is quantified using this correlation.
電気化学反応による測定方法としては、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量できる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばアンペロメトリ法、ボルタンメトリ法等が挙げられる。アンペロメトリ法としては、クロノアンペロメトリ法、ディファレンシャルパルスアンペロメトリ法等が例示される。ボルタンメトリ法としては、ノーマルパルスボルタンメトリ法、ディファレンシャルパルスボルタンメトリ法、サイクリックボルタンメトリ法等が例示される。中でも、測定が簡単であることから、アンペロメトリ法が好ましい。 The measurement method by electrochemical reaction is not particularly limited as long as it is a method capable of quantifying microbial contaminants based on the current value measured by electrochemical reaction, and examples thereof include an amperometry method and a voltammetry method. Examples of the amperometry method include a chronoamperometry method, a differential pulse amperometry method, and the like. Examples of the voltammetry method include a normal pulse voltammetry method, a differential pulse voltammetry method, and a cyclic voltammetry method. Of these, the amperometry method is preferable because the measurement is simple.
アンペロメトリ法による測定においては、例えば、被検体、ライセート試薬およびパラメトキシアニリンが結合したペプチドの混合物に、電極を入れ、アンペロメトリ法に基づく測定を行う。すなわち、作用極に一定電位を印加した状態で、流れる電流を測定する。電位は参照極に対して制御し、電流は作用極および対極の間を流れる。電流値が小さいとき等には、対極を設けずに、参照極に対極の役割を担わせてもよい。電圧印加時間を横軸に、電流値を縦軸にプロットしたグラフを用いることで、上記の一定電位を電極に印加開始してから一定時間経過後の電流を測定する。微生物夾雑物の濃度および一定時間経過後の電流値の相関を示した検量線を予め作成することにより、測定電流値から微生物夾雑物の濃度を算出することができる。 In the measurement by the amperometry method, for example, an electrode is placed in a mixture of a subject, a lysate reagent, and a peptide to which paramethoxyaniline is bound, and measurement based on the amperometry method is performed. That is, the flowing current is measured with a constant potential applied to the working electrode. The potential is controlled with respect to the reference electrode, and current flows between the working electrode and the counter electrode. When the current value is small, the reference electrode may be provided with the role of the counter electrode without providing the counter electrode. By using a graph in which the voltage application time is plotted on the horizontal axis and the current value is plotted on the vertical axis, the current after a certain time has elapsed since the application of the constant potential to the electrode is measured. By preparing in advance a calibration curve showing the correlation between the concentration of microbial contaminants and the current value after a lapse of a certain time, the concentration of microbial contaminants can be calculated from the measured current value.
使用する電極としては特に限定されるものではなく、電気化学測定に用いられる一般的な電極を使用することができる。例えば、作用極としては、グラッシーカーボン、カーボンペースト、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボン等の炭素電極、Au、Pt等の電気化学的に安定な貴金属を用いることができる。対極としては、Au、Pt等の電気化学的に安定な貴金属を用いることができる。参照極としては、Ag/AgCl電極等を用いることができる。
また、測定装置としては、一般に電気化学測定に使用される装置を用いることができ、例えばポテンショスタット、電流増幅器、これらと同等の機能を持つ装置を挙げることができる。
It does not specifically limit as an electrode to be used, The general electrode used for an electrochemical measurement can be used. For example, a carbon electrode such as glassy carbon, carbon paste, graphite, diamond-like carbon, or an electrochemically stable noble metal such as Au or Pt can be used as the working electrode. As the counter electrode, an electrochemically stable noble metal such as Au or Pt can be used. An Ag / AgCl electrode or the like can be used as the reference electrode.
Moreover, as a measuring apparatus, the apparatus generally used for an electrochemical measurement can be used, For example, a potentiostat, a current amplifier, and an apparatus with a function equivalent to these can be mentioned.
3.その他
上述のように、本発明の微生物夾雑物の濃度検出方法については、パラメトキシアニリンを例に挙げて説明したが、本発明においては、上述した一般式(a)で示した他の化合物についても、パラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、正確かつ安定的な検出が可能となる。
3. Others As described above, the method for detecting the concentration of microbial contaminants of the present invention has been described by taking paramethoxyaniline as an example. However, in the present invention, other compounds represented by the above general formula (a) are described. Furthermore, since it has the same electrochemical characteristics as paramethoxyaniline, it enables accurate and stable detection.
B.電極チップ
本発明の電極チップは、基板と、上記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、上記収容部内に配置された電極とを有し、上記被検体を導入する導入口から上記収容部の間に下記一般式(a)で示した化合物が結合したペプチドが配置されていることを特徴とするものである。
B. Electrode chip The electrode chip of the present invention includes a substrate, a storage portion formed on the substrate and capable of storing a specimen containing microbial contaminants, and an electrode disposed in the storage section. A peptide to which a compound represented by the following general formula (a) is bound is arranged between the introduction port for introducing the compound and the accommodating portion.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
以下、上記一般式(a)で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。 Hereinafter, paramethoxyaniline will be specifically described as the compound represented by the general formula (a).
図3(a)、(b)は、本発明の電極チップの一例を示す概略平面図および断面図であり、図3(b)は図3(a)のA−A線断面図である。図3(a)、(b)に例示する電極チップ1においては、基板2上に複数の電極3および端子4がそれぞれ配列して形成され、電極3および端子4を一対にして両者を電気的に接続する導線5が複数形成されており、導線5を覆うように絶縁層6が形成されている。また、基板2上には、複数の貫通孔12を有する上部基板11が、電極3上に貫通孔12が位置するように配置されており、貫通孔12によって収容部7が形成されている。収容部7の上部は開口しており、被検体を導入する導入口になっている。そして、収容部7内の電極3の近傍にはパラメトキシアニリンが結合したペプチド9が固定されている。この電極チップ1は、内部に電極3およびパラメトキシアニリンが結合したペプチド9が配置された収容部7を複数有している。なお、図3(a)において絶縁層は省略している。 FIGS. 3A and 3B are a schematic plan view and a cross-sectional view showing an example of the electrode chip of the present invention, and FIG. 3B is a cross-sectional view taken along the line AA in FIG. In the electrode chip 1 illustrated in FIGS. 3A and 3B, a plurality of electrodes 3 and terminals 4 are formed on the substrate 2, respectively. The electrodes 3 and the terminals 4 are paired to electrically A plurality of conducting wires 5 are formed to be connected to each other, and an insulating layer 6 is formed so as to cover the conducting wires 5. Further, an upper substrate 11 having a plurality of through holes 12 is arranged on the substrate 2 so that the through holes 12 are positioned on the electrodes 3, and the accommodating portion 7 is formed by the through holes 12. The upper part of the accommodating part 7 is opened and serves as an inlet for introducing the subject. And the peptide 9 which paramethoxyaniline couple | bonded is fixed to the vicinity of the electrode 3 in the accommodating part 7. FIG. This electrode chip 1 has a plurality of accommodating portions 7 in which an electrode 3 and a peptide 9 bonded with paramethoxyaniline are arranged. In FIG. 3A, the insulating layer is omitted.
図4(a)、(b)は、本発明の電極チップの他の例を示す概略平面図および断面図であり、図4(b)は図4(a)のB−B線断面図である。図4(a)、(b)に例示する電極チップ1においては、基板2上に作用極3a、対極3bおよび参照極3cを含む電極3ならびに端子4が形成され、作用極3a、対極3bおよび参照極3cのそれぞれと端子4とを一対にして両者を電気的に接続する導線5が形成されており、導線5を覆うように絶縁層6が形成されている。基板2上には、収容部7、流路22および導入口23を形成するための開口部を有するスペーサ25が配置されており、このスペーサ25は、スペーサ25の収容部7に相当する開口部が電極3上に位置するように、かつ端子4が露出するように配置されている。スペーサ25上には、スペーサ25の収容部7および流路22に相当する開口部を覆うように、かつ導入口23が確保されるように、上部基板21が配置されている。また、流路22にはパラメトキシアニリンが結合したペプチド9およびライセート試薬10が固定されている。なお、図4(a)において絶縁層は省略している。 4 (a) and 4 (b) are a schematic plan view and a sectional view showing another example of the electrode chip of the present invention, and FIG. 4 (b) is a sectional view taken along line BB in FIG. 4 (a). is there. In the electrode chip 1 illustrated in FIGS. 4A and 4B, the electrode 3 including the working electrode 3a, the counter electrode 3b, and the reference electrode 3c and the terminal 4 are formed on the substrate 2, and the working electrode 3a, the counter electrode 3b, and A conductive wire 5 that electrically connects the reference electrode 3c and the terminal 4 in pairs is formed, and an insulating layer 6 is formed so as to cover the conductive wire 5. On the substrate 2, a spacer 25 having openings for forming the accommodating portion 7, the flow path 22 and the introduction port 23 is disposed. The spacer 25 is an opening corresponding to the accommodating portion 7 of the spacer 25. Is disposed on the electrode 3 and the terminal 4 is exposed. On the spacer 25, the upper substrate 21 is arranged so as to cover the accommodating portion 7 of the spacer 25 and the opening corresponding to the flow path 22 and to secure the introduction port 23. In addition, peptide 9 and lysate reagent 10 to which paramethoxyaniline is bound are fixed in flow path 22. In FIG. 4A, the insulating layer is omitted.
本発明においては、電極チップにパラメトキシアニリンが結合したペプチドが予め配置されており、電気化学的に測定を行うため、電極表面での反応の検出が可能となり、微量の被検体でも微生物夾雑物の濃度を測定することができる。したがって、微量の被検体であっても、簡易かつ迅速に、高感度で安定的な検出が可能となる。さらに、高価なライセート試薬の使用を大幅に節減することができ、安価に微生物夾雑物の濃度検出を行うことができる。
また、本発明の電極チップが収容部を複数有する場合には、連続的に測定が可能であり、かつ、小型化が可能であるため、医療用現場で実用的に使用することができる。
In the present invention, a peptide having paramethoxyaniline bonded to the electrode chip is preliminarily arranged, and since the measurement is performed electrochemically, it is possible to detect the reaction on the electrode surface, and even a minute amount of the sample can be contaminated with microorganisms. Concentration can be measured. Therefore, even a very small amount of a sample can be detected easily and quickly with high sensitivity and stability. Furthermore, the use of expensive lysate reagents can be greatly reduced, and the concentration of microbial contaminants can be detected at a low cost.
In addition, when the electrode tip of the present invention has a plurality of accommodating portions, it can be continuously measured and can be miniaturized, so that it can be practically used in a medical field.
以下、本発明の電極チップにおける各構成について説明する。 Hereinafter, each structure in the electrode tip of this invention is demonstrated.
1.収容部
本発明における収容部は、基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得るものであり、その内部に電極が配置されるものである。
収容部の形状としては特に限定されるものではなく、収容部の平面視形状としては、例えば円形、楕円形、矩形等を挙げることができる。
本発明の電極チップにおいては、被検体を数μL〜数十μL程度導入して測定を行うことができることから、収容部の容量としては、1mm3〜200mm3の範囲内であることが好ましく、中でも1mm3〜100mm3の範囲内、特に1mm3〜50mm3の範囲内であることが好ましい。収容部の大きさとしては、例えば収容部の平面視形状が円形の場合には、直径が1mm〜5mm程度、深さが1mm〜10mm程度とすることができる。
1. Accommodating part The accommodating part in this invention is formed on a board | substrate, and can accommodate the test object containing a microbial contaminant, and an electrode is arrange | positioned in the inside.
The shape of the accommodating portion is not particularly limited, and examples of the shape of the accommodating portion in plan view include a circle, an ellipse, and a rectangle.
In the electrode chip of the present invention, since the measurement can be performed by introducing several μL~ several tens μL analyte, as the volume of the containing portion is preferably in a range of 1 mm 3 to 200 mm 3, Above all in the range of 1 mm 3 100 mm 3, and particularly preferably in the range of 1mm 3 ~50mm 3. As for the size of the accommodating portion, for example, when the shape of the accommodating portion in a plan view is circular, the diameter can be about 1 mm to 5 mm and the depth can be about 1 mm to 10 mm.
収容部の配置としては、被検体を収容することができ、その内部に電極を配置することができれば特に限定されるものではない。例えば図3に示すように上部が導入口となるように収容部7が配置されていてもよく、図4に示すように流路22に接続して収容部7が配置されていてもよい。
収容部の数は、1つでもよく複数でもよい。
The arrangement of the accommodating portion is not particularly limited as long as the subject can be accommodated and the electrode can be disposed inside the accommodating portion. For example, the accommodating part 7 may be arrange | positioned so that an upper part may become an inlet as shown in FIG. 3, and the accommodating part 7 may be arrange | positioned connected to the flow path 22 as shown in FIG.
The number of accommodating parts may be one or plural.
2.流路
本発明の電極チップは、一端が上記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路を有していてもよい。
流路は、上部基板の溝によって形成されていてもよく、また基板と上部基板との間にスペーサを配置することによって形成されていてもよい。
流路の幅や高さとしては、被検体を収容部に導くことができれば特に限定されるものではなく、例えば0.1mm〜5mm程度とすることができる。
2. Channel The electrode chip of the present invention may have a channel in which one end is connected to the housing portion and the other end is connected to the introduction port.
The flow path may be formed by a groove of the upper substrate, or may be formed by disposing a spacer between the substrate and the upper substrate.
The width and height of the flow path are not particularly limited as long as the subject can be guided to the accommodating portion, and can be, for example, about 0.1 mm to 5 mm.
3.パラメトキシアニリンが結合したペプチド
本発明においては、被検体を導入する導入口から収容部の間にパラメトキシアニリンが結合したペプチドが配置されている。
パラメトキシアニリンが結合したペプチドの配置としては、導入口から収容部の間までであればよく、例えば収容部内や流路等にパラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置することができる。また、パラメトキシアニリンが結合したペプチドは、基板側に配置されていてもよく、上部電極側に配置されていてもよい。
パラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置する方法としては、例えばパラメトキシアニリンを蒸留水や上述の緩衝液等に溶解させ、ディスペンサーを用いた方法やインクジェット法等にて塗布し、乾燥する方法が挙げられる。
3. Peptide to which paramethoxyaniline is bound In the present invention, a peptide to which paramethoxyaniline is bound is arranged between the introduction port for introducing the analyte and the accommodating portion.
The arrangement of the peptide to which paramethoxyaniline is bound may be from the introduction port to the accommodating portion. For example, the peptide to which paramethoxyaniline is bound can be disposed in the accommodating portion or the flow path. Moreover, the peptide which paramethoxyaniline couple | bonded may be arrange | positioned at the board | substrate side, and may be arrange | positioned at the upper electrode side.
Examples of a method for arranging a peptide to which paramethoxyaniline is bonded include, for example, a method in which paramethoxyaniline is dissolved in distilled water or the above-described buffer solution, and applied by a method using a dispenser, an ink jet method, or the like, and dried. It is done.
4.ライセート試薬
本発明においては、被検体を導入する導入口から収容部の間にライセート試薬が配置されていてもよい。
ライセート試薬の配置としては、導入口から収容部の間までであればよく、例えば収容部内や流路等にライセート試薬を配置することができる。また、ライセート試薬は、基板側に配置されていてもよく、上部電極側に配置されていてもよい。
また、ライセート試薬は、パラメトキシアニリンが結合したペプチドとは別に配置されていてもよく、パラメトキシアニリンが結合したペプチドと混合して配置されていてもよい。
ライセート試薬を配置する方法としては、上記のパラメトキシアニリンが結合したペプチドを配置する方法と同様とすることができる。
4). Lysate reagent In this invention, the lysate reagent may be arrange | positioned between the accommodating part from the inlet which introduce | transduces a test substance.
The arrangement of the lysate reagent may be from the introduction port to the storage unit. For example, the lysate reagent can be arranged in the storage unit or in the flow path. Moreover, the lysate reagent may be arrange | positioned at the board | substrate side and may be arrange | positioned at the upper electrode side.
Further, the lysate reagent may be arranged separately from the peptide to which paramethoxyaniline is bound, or may be arranged in a mixture with the peptide to which paramethoxyaniline is bound.
The method for arranging the lysate reagent can be the same as the method for arranging the peptide to which paramethoxyaniline is bound.
5.電極
本発明における電極は、上記収容部内に配置されるものである。
電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学測定に用いられる一般的な電極を使用することができる。例えば、グラッシーカーボン、カーボンペースト、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボン等の炭素電極や、Au、Pt等の電気化学的に安定な貴金属の電極を用いることができる。
基板上には、電極として、作用極のみが形成されていてもよく、作用極および対極が形成されていてもよく、作用極、対極および参照極が形成されていてもよい。
5. Electrode The electrode in this invention is arrange | positioned in the said accommodating part.
The electrode is not particularly limited, and a general electrode used for electrochemical measurement can be used. For example, carbon electrodes such as glassy carbon, carbon paste, graphite, and diamond-like carbon, and electrochemically stable noble metal electrodes such as Au and Pt can be used.
On the substrate, only a working electrode may be formed as an electrode, a working electrode and a counter electrode may be formed, or a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode may be formed.
また、基板上には、電極と電気的に接続された導線および端子を形成することができる。導線および端子の材料は、電極の材料と同様とすることができる。導線および端子の材料は、検出電流値に影響を及ぼさない導電性が確保されればよく、一般的な導電材料を使用することができるが、中でも、導電性の観点から、Au、Pt、Ag等の貴金属であることが好ましい。 In addition, conductive wires and terminals electrically connected to the electrodes can be formed on the substrate. The conductor and terminal materials can be the same as the electrode material. The conductive wire and the terminal material may be any conductive material as long as conductivity that does not affect the detected current value is secured, and from the viewpoint of conductivity, Au, Pt, Ag can be used. It is preferable that they are noble metals, such as.
電極の形成方法としては、例えば導電膜が形成された基板を用い、フォトリソグラフィー法により導電膜をパターニングする方法や、マスク蒸着法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、インクジェット法等が挙げられる。
導線および端子の形成方法は、電極の形成方法と同様とすることができる。
また、導線および端子は、電極と同時に形成してもよく、電極とは別に形成してもよい。
Examples of the electrode forming method include a method of patterning a conductive film by a photolithography method using a substrate on which a conductive film is formed, a mask vapor deposition method, a screen printing method, a gravure printing method, a flexographic printing method, an inkjet method, and the like. Can be mentioned.
The method for forming the conductor and the terminal can be the same as the method for forming the electrode.
Moreover, a conducting wire and a terminal may be formed simultaneously with an electrode, and may be formed separately from an electrode.
6.基板
本発明に用いられる基板としては、電極が形成可能であり、表面が絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えばガラス基板、樹脂基板、セラミック基板等が挙げられる。
基板の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
6). Substrate The substrate used in the present invention is not particularly limited as long as an electrode can be formed and the surface has an insulating property, and examples thereof include a glass substrate, a resin substrate, and a ceramic substrate.
The shape of the substrate is not particularly limited, and may be any shape such as a square, a rectangle, a circle, and an ellipse.
7.上部基板
本発明においては、基板上に上部基板が配置されていてもよい。
7). Upper substrate In the present invention, an upper substrate may be disposed on the substrate.
上部基板は貫通孔を有していてもよい。貫通孔を導入口とすることができる。また、図3に例示するように貫通孔によって収容部を形成することもできる。
貫通孔の大きさとしては、図3に例示するように貫通孔によって収容部を形成する場合には、収容部の大きさと同様とすることができる。また、図示しないが貫通孔が導入口であり流路に接続されている場合には、被検体を導入可能な大きさであればよい。
貫通孔の形状としては特に限定されないが、貫通孔の形成し易さから、貫通孔の平面視形状は円形、楕円形が好ましい。
The upper substrate may have a through hole. A through hole can be used as the inlet. Further, as illustrated in FIG. 3, the accommodating portion can be formed by a through hole.
The size of the through hole can be the same as the size of the housing portion when the housing portion is formed by the through hole as illustrated in FIG. Although not shown, when the through hole is an introduction port and is connected to the flow path, it may be of a size that allows the analyte to be introduced.
The shape of the through hole is not particularly limited, but the shape of the through hole in plan view is preferably a circle or an ellipse because it is easy to form the through hole.
また、上部基板の基板との対向面には、流路および収容部を形成するための溝が形成されていてもよい。流路や収容部を形成するための溝の大きさとしては、流路や収容部の大きさと同様とすることができる。 In addition, a groove for forming a flow path and a housing portion may be formed on a surface of the upper substrate facing the substrate. The size of the groove for forming the flow path and the accommodating portion can be the same as the size of the flow path and the accommodating portion.
上部基板としては、表面が絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えばガラス基板、樹脂基板等が挙げられる。
上部基板の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
The upper substrate is not particularly limited as long as the surface has insulating properties, and examples thereof include a glass substrate and a resin substrate.
The shape of the upper substrate is not particularly limited, and may be an arbitrary shape such as a square, a rectangle, a circle, or an ellipse.
上部基板は、少なくとも端子が露出するように基板上に配置される。また、上部基板の貫通孔によって収容部を形成する場合には、貫通孔が電極上に位置するように、上部基板が配置される。また、上部基板の溝によって流路および収容部を形成する場合には、溝の一部が電極上に位置するように、上部基板が配置される。
上部基板は、例えば接着剤や粘着剤を介して基板に貼付することができる。
The upper substrate is disposed on the substrate so that at least the terminals are exposed. Further, when the housing portion is formed by the through hole of the upper substrate, the upper substrate is disposed so that the through hole is positioned on the electrode. Further, when the flow path and the accommodating portion are formed by the grooves of the upper substrate, the upper substrate is disposed so that a part of the grooves is positioned on the electrode.
The upper substrate can be attached to the substrate via, for example, an adhesive or an adhesive.
8.スペーサ
本発明においては、基板と上部基板との間にスペーサが配置されていてもよい。スペーサは収容部および流路を形成するために設けられるものである。
スペーサは収容部および流路に相当する開口部を有することができる。開口部の大きさおよび形状としては、収容部および流路の大きさおよび形状と同様とすることができる。
8). Spacer In the present invention, a spacer may be disposed between the substrate and the upper substrate. The spacer is provided to form the accommodating portion and the flow path.
The spacer can have an opening corresponding to the accommodating portion and the flow path. The size and shape of the opening can be the same as the size and shape of the accommodating portion and the flow path.
スペーサとしては、絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば樹脂基板等が挙げられる。
スペーサの形状としては、特に限定されるものではなく、例えば正方形、矩形、円形、楕円形等、任意の形状とすることができる。
The spacer is not particularly limited as long as it has insulating properties, and examples thereof include a resin substrate.
The shape of the spacer is not particularly limited, and may be an arbitrary shape such as a square, a rectangle, a circle, or an ellipse.
スペーサは、少なくとも端子が露出し、スペーサの開口部が電極上に位置するように基板上に配置される。
スペーサは、例えば接着剤や粘着剤を介して基板に貼付することができる。
The spacer is disposed on the substrate so that at least the terminal is exposed and the opening of the spacer is positioned on the electrode.
The spacer can be attached to the substrate via, for example, an adhesive or an adhesive.
9.絶縁層
本発明においては、導線を覆うように絶縁層を形成することができる。絶縁層により、導線の酸化を抑制するとともに、ショートを防ぐことができる。
絶縁層の材料としては、例えば熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂等を用いることができる。
絶縁層の形成方法としては、導線を覆い、電極および端子を覆わないように絶縁層をパターン状に形成することができる方法であればよく、例えばフォトリソグラフィー法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、インクジェット法等が挙げられる。
9. Insulating layer In this invention, an insulating layer can be formed so that a conducting wire may be covered. The insulating layer can suppress oxidation of the conductive wire and prevent a short circuit.
As a material for the insulating layer, for example, a thermosetting resin, a photocurable resin, or the like can be used.
As a method for forming the insulating layer, any method can be used as long as it can form the insulating layer in a pattern so as to cover the conductive wires and not cover the electrodes and terminals. For example, a photolithography method, a screen printing method, a gravure printing method, Examples include a flexographic printing method and an inkjet method.
10.電極チップの使用方法
本発明の電極チップを用いた微生物夾雑物の濃度検出方法の一例について説明する。
まず、図3に例示するような電極チップにおいては、微生物夾雑物を含む被検体とライセート試薬とを混合した混合物を電極チップ1の導入口から導入して、収容部7に収容する。この際、pMAが結合したペプチド9は被検体とライセート試薬との混合物に溶解する。また、図4に例示するような電極チップにおいては、微生物夾雑物を含む被検体を電極チップ1の導入口23から導入し、毛細管現象により流路22に流入させ、収容部7まで移動させる。この際、pMAが結合したペプチド9およびライセート試薬10は被検体に溶解する。そして、被検体とライセート試薬とpMAが結合したペプチドとを収容部にて一定時間反応させる。
次に、アンペロメトリ法の場合には、電極に一定電位を印加する。一定時間経過後の電流を測定することにより、微生物夾雑物の濃度を算出することができる。このとき、ペプチドから遊離したpMAとペプチドに結合したpMAとは、酸化還元電位が異なっており、その差が比較的大きいため、pMAが結合したペプチドから分離して生じるpMAのみを、選択的かつ高精度に検出することができる。
10. Method for Using Electrode Tip An example of a method for detecting the concentration of microbial contaminants using the electrode tip of the present invention will be described.
First, in an electrode chip as illustrated in FIG. 3, a mixture obtained by mixing a specimen containing microbial contaminants and a lysate reagent is introduced from the introduction port of the electrode chip 1 and accommodated in the accommodating portion 7. At this time, the peptide 9 to which pMA is bound is dissolved in the mixture of the analyte and the lysate reagent. Further, in the electrode chip as illustrated in FIG. 4, a specimen containing microbial contaminants is introduced from the introduction port 23 of the electrode chip 1, flows into the flow path 22 by capillary action, and moves to the storage unit 7. At this time, peptide 9 and lysate reagent 10 to which pMA is bound are dissolved in the analyte. Then, the specimen, the lysate reagent, and the peptide to which pMA is bound are reacted in the container for a predetermined time.
Next, in the case of the amperometry method, a constant potential is applied to the electrode. By measuring the current after a certain period of time, the concentration of microbial contaminants can be calculated. At this time, pMA released from the peptide and pMA bound to the peptide have different oxidation-reduction potentials, and the difference is relatively large. Therefore, only pMA generated separately from the peptide bound to pMA is selectively and It can be detected with high accuracy.
11.その他
上述のように、本発明の電極チップについては、パラメトキシアニリンを例に挙げて説明したが、本発明においては、上述した一般式(a)で示した他の化合物についてもパラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、同様の効果を得ることができる。
11 Others As described above, the electrode tip of the present invention has been described by taking paramethoxyaniline as an example. However, in the present invention, other compounds represented by the above general formula (a) can also be paramethoxyaniline. Since it has the same electrochemical property, the same effect can be acquired.
C.オリゴペプチド
本発明のオリゴペプチドは、一端に下記一般式(a)で示した化合物が結合し、他端にペプチドの保護基が結合していることを特徴とするものである。
C. Oligopeptide The oligopeptide of the present invention is characterized in that a compound represented by the following general formula (a) is bonded to one end and a protecting group of the peptide is bonded to the other end.
(式(a)中、Rは、−O−CnH2n+1または−S−CnH2n+1であり、nは1から4までの整数である。) (In the formula (a), R is —O—C n H 2n + 1 or —S—C n H 2n + 1 , and n is an integer from 1 to 4.)
以下、上記一般式(a)で示した化合物として、具体的に、パラメトキシアニリンについて説明する。
なお、一端にパラメトキシアニリンが結合し、他端にペプチドの保護基が結合したオリゴペプチドについては、上記「A.微生物夾雑物の濃度検出方法」に記載したので、ここでの説明は省略する。
本発明のオリゴペプチドは、公知の方法に準拠して合成することができる。例えばBoc−Leu−Gly−Arg−pMAは下記のスキームに示すように合成することができる。
Hereinafter, paramethoxyaniline will be specifically described as the compound represented by the general formula (a).
The oligopeptide having one end bound to paramethoxyaniline and the other end bound to the peptide protecting group was described in the above “A. Method for detecting the concentration of microbial contaminants”, and thus the description thereof is omitted here. .
The oligopeptide of the present invention can be synthesized according to a known method. For example, Boc-Leu-Gly-Arg-pMA can be synthesized as shown in the following scheme.
なお、本発明のオリゴペプチドについては、上述のように、パラメトキシアニリンを例に挙げたて説明したが、本発明においては、上述した一般式(a)で示した他の化合物についてもパラメトキシアニリンと同様の電気化学特性を有することから、同様の効果を得ることができる。 As described above, the oligopeptide of the present invention has been described by taking paramethoxyaniline as an example. However, in the present invention, other compounds represented by the general formula (a) are also paramethoxy. Since it has the same electrochemical characteristics as aniline, the same effect can be obtained.
本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。 The present invention is not limited to the above embodiment. The above-described embodiment is an exemplification, and the present invention has any configuration that has substantially the same configuration as the technical idea described in the claims of the present invention and that exhibits the same effects. Are included in the technical scope.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
[準備]
1.試薬
本実施例で使用した試薬は以下の通りである。
[Preparation]
1. Reagents The reagents used in this example are as follows.
(1)標準エンドトキシン溶液
エンドトキシン標準品は、生化学工業社製のE.Coli O113:H10株由来USP Reference Standard Endotoxinを用いた。標準エンドトキシン溶液は、生化学工業社製のエンドスペシーES24Sに添付されているエンドトキシンフリー水を用いて調製し、使用の直前に30分間ボルテックスミキサーで激しく攪拌した。なお、エンドトキシン濃度は測定溶液中の最終濃度で示した。
(1) Standard endotoxin solution The endotoxin standard product is manufactured by Seikagaku Corporation E.I. Coli O113: USP Reference Standard Endotoxin derived from H10 strain was used. The standard endotoxin solution was prepared using endotoxin-free water attached to Endospecy ES24S manufactured by Seikagaku Corporation, and was vigorously stirred with a vortex mixer for 30 minutes immediately before use. The endotoxin concentration was shown as the final concentration in the measurement solution.
(2)ライセート試薬
ライセート試薬としては、ライセート試薬が凍結乾燥状態で1テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、生化学工業社製のエンドスペシーES24Sを用いた。
(2) Lysate reagent As the lysate reagent, Endspecy ES24S manufactured by Seikagaku Corporation, in which the lysate reagent was sealed in a dedicated test tube for each test in a lyophilized state, was used.
(3)LGR−pMAおよびpMA
合成したLGR−pMAは、大塚製薬社製の注射用水に溶解し、10mMのストック溶液として−20℃で保管した。和光純薬工業社製のpMAは、測定毎に大塚製薬社製の注射用水に溶解し、10mM溶液とした。LGR−pMAおよびpMAの希釈には生化学工業社製のエンドスペシーに添付されている緩衝液を用いた。
(3) LGR-pMA and pMA
The synthesized LGR-pMA was dissolved in water for injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. and stored at −20 ° C. as a 10 mM stock solution. The pMA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was dissolved in water for injection manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. for each measurement to make a 10 mM solution. For dilution of LGR-pMA and pMA, a buffer solution attached to Endospecy manufactured by Seikagaku Corporation was used.
2.装置および測定法
本実施例における電気化学測定法で用いた装置および測定法は以下の通りである。
2. Apparatus and Measurement Method The apparatus and measurement method used in the electrochemical measurement method in this example are as follows.
(1)測定装置
Ivium Technologies社製のポテンショスタットCompactStat
(1) Measuring device Potentiostat CompactStat made by Ivium Technologies
(2)電極
(a)96ウェルプレートを用いる測定
作用極にはBAS株式会社製の直径1mmのグラッシーカーボンディスク電極を、対極にはPt板を、参照極にはAg/AgClをそれぞれ用いた。作用極表面の状態を一定に保つため、1回の測定ごとにGC電極表面をBAS社製の0.05μmのアルミナスラリーで1分以上研磨した。
(b)電極チップを用いる測定
電極チップの電極を作用極、対極および参照極として使用し、測定を行った。あるいは、電極チップの直径1.0mmの炭素電極を作用極として使用し、Ag/AgCl参照極とPt対極を収容部へ挿入して測定を行った。
(2) Electrode (a) Measurement using a 96-well plate A 1 mm diameter glassy carbon disk electrode manufactured by BAS Co., Ltd. was used as the working electrode, a Pt plate as the counter electrode, and Ag / AgCl as the reference electrode. In order to keep the working electrode surface constant, the GC electrode surface was polished with a 0.05 μm alumina slurry manufactured by BAS for 1 minute or more for each measurement.
(B) Measurement using electrode tip Measurement was performed using the electrode of the electrode tip as a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode. Alternatively, a carbon electrode with a diameter of 1.0 mm of the electrode tip was used as a working electrode, and measurement was performed by inserting an Ag / AgCl reference electrode and a Pt counter electrode into the accommodating portion.
(3)測定法
サイクリックボルタンメトリ(CV)では走査速度を20mV/sとした。また、アンペロメトリ法では初期電位を−0.2Vに設定し、10秒間印加を行った後、電位を0.6Vにステップし、30秒間印加を行った。
(3) Measuring method In cyclic voltammetry (CV), the scanning speed was 20 mV / s. In the amperometry method, the initial potential was set to -0.2 V, and after applying for 10 seconds, the potential was stepped to 0.6 V and applied for 30 seconds.
[参考例]
溶解したpMAの安定性の評価を行った。
緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。緩衝液を用いて濃度が1mMとなるようにpMA溶液を調製した。pMA溶液をそれぞれ30分、1時間、2時間、3時間、72時間の間37℃の暗所で保存した後、96ウェルプレートでCV測定を行った。電位は0.2V→0.7V→−0.4V→0.2Vの範囲で走査した。
図5に0分、30分、1時間、2時間、3時間、72時間後のボルタモグラムを示す。0.5V付近にpMAの酸化反応由来のピークが確認され、その電流値はpMA溶液調製直後から72時間後までほぼ一定だった。この結果から、pMAが非常に安定であることがわかった。
[Reference example]
The stability of the dissolved pMA was evaluated.
As the buffer, a reagent attached to Endospecy manufactured by Seikagaku Corporation was used. A pMA solution was prepared using a buffer so that the concentration was 1 mM. The pMA solution was stored in the dark at 37 ° C. for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, and 72 hours, respectively, and then CV measurement was performed in a 96-well plate. The potential was scanned in the range of 0.2V → 0.7V → −0.4V → 0.2V.
FIG. 5 shows voltammograms after 0 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours and 72 hours. A peak derived from the oxidation reaction of pMA was confirmed at around 0.5 V, and the current value was almost constant from immediately after preparation of the pMA solution to 72 hours later. From this result, it was found that pMA is very stable.
[実施例1]
パラメトキシアニリンが結合したペプチドであるBoc−Leu−Gly−Arg−pMAは、上記「C.オリゴペプチド」に示すスキームにより合成した。なお、以下、Boc−Leu−Gly−Arg−pMAはLGR−pMAと略称する場合がある。
[Example 1]
Boc-Leu-Gly-Arg-pMA, which is a peptide to which paramethoxyaniline is bound, was synthesized according to the scheme shown in “C. Oligopeptide” above. Hereinafter, Boc-Leu-Gly-Arg-pMA may be abbreviated as LGR-pMA.
[実施例2]
1.電極チップの作製
電極チップは、下記に示す方法により作製した。
(1)導線および端子の形成
PET基材(東レ社製、ルミラー350H10)上にスクリーン印刷にてAgペーストをパターン状に塗布し、130℃で30分間焼成することで導線および端子を形成した。
(2)電極の形成
次に、上記PET基材上にスクリーン印刷によりカーボンペーストをパターン状に塗布し、120℃で15分間焼成することで作用極および対極を形成した。また、上記PET基材上にスクリーン印刷によりラサ工業製のAg/AgClペーストをパターン状に塗布し、80℃で10分間焼成することで参照極を形成した。
(3)絶縁層の形成
次に、導線を被覆する目的で、上記PET基材上にUV硬化性樹脂をスクリーン印刷によりパターン状に塗布し、ウシオ社製Deep UVランプにて100秒間露光して硬化させた。
[Example 2]
1. Production of electrode chip The electrode chip was produced by the method described below.
(1) Formation of conducting wire and terminal On a PET substrate (Toray Industries, Lumirror 350H10), Ag paste was applied in a pattern by screen printing, and baked at 130 ° C. for 30 minutes to form a conducting wire and a terminal.
(2) Formation of electrode Next, a carbon paste was applied in a pattern on the PET substrate by screen printing and baked at 120 ° C for 15 minutes to form a working electrode and a counter electrode. Further, an Ag / AgCl paste made by Lhasa Industries was applied in a pattern on the PET substrate by screen printing, and baked at 80 ° C. for 10 minutes to form a reference electrode.
(3) Formation of insulating layer Next, for the purpose of covering the conductive wire, a UV curable resin is applied to the PET base material in a pattern by screen printing, and exposed for 100 seconds with a Deep UV lamp manufactured by USHIO. Cured.
(4)流路および収容部の形成およびLGR−pMAの配置
100μm厚みのPET基材(東レ社製、A4100)の両面に25μm厚みのアクリル粘着シートをラミネーターにて貼り合わせ、積層基材とした。次いで、被検体液が通過する流路、収容部および導入口を形成すべく、GRAPHTEC社製のカッティングマシーンにて、上記積層基材を裁断し、上記積層基材の流路、収容部および導入口に相当する領域を除去することで流路、収容部および導入口に相当する開口部を形成した。
次に、流路、収容部および導入口に相当する開口部が形成された積層基材を、上記の導線、端子および電極等が形成されたPET基材にラミネーターにて貼り合わせることで積層し、高さ150μmの流路および収容部を形成した。
次に、LGR−pMAの希釈には生化学工業社製のエンドスペシーES24Sに添付されている緩衝液を用いた。LGR−pMAの希釈液をディスペンサーにて、上記絶縁層上の収容部滴下し、室温にて乾燥させた。あるいは、LGR−pMAの希釈液をディスペンサーにて、後述のスリーエムヘルスケア社製の親水カバーフィルムの収容部に相当する領域に滴下し、室温にて乾燥させた。
次に、流路および収容部に蓋をするように、上記積層基材にスリーエムヘルスケア社製の親水カバーフィルムを貼り合わせ接着させた。
(4) Formation of flow path and accommodation portion and arrangement of LGR-pMA A 25 μm thick acrylic adhesive sheet was bonded to both surfaces of a 100 μm thick PET base material (A4100, manufactured by Toray Industries, Inc.) with a laminator to form a laminated base material . Next, the laminated base material is cut with a cutting machine manufactured by GRAPHTEC in order to form a flow path, an accommodating portion and an introduction port through which the analyte liquid passes, and the flow path, the accommodating portion and the introduction of the laminated base material are cut. By removing a region corresponding to the mouth, an opening portion corresponding to the flow path, the accommodating portion, and the introduction port was formed.
Next, the laminated base material in which openings corresponding to the flow path, the accommodating part, and the introduction port are formed is laminated by laminating the above-mentioned PET base material on which the conducting wires, terminals, electrodes, etc. are formed with a laminator. A flow path and a housing part having a height of 150 μm were formed.
Next, a buffer attached to Endspecy ES24S manufactured by Seikagaku Corporation was used for dilution of LGR-pMA. A dilute solution of LGR-pMA was dropped with a dispenser on the insulating layer and dried at room temperature. Alternatively, a dilute solution of LGR-pMA was dropped with a dispenser into a region corresponding to a housing portion of a hydrophilic cover film manufactured by 3M Healthcare, which was described later, and dried at room temperature.
Next, a hydrophilic cover film manufactured by 3M Healthcare was bonded and adhered to the laminated base material so as to cover the flow path and the accommodating portion.
2.評価
作製した電極チップの評価を行った。測定試料としては、濃度1.0mMに調製したpMAおよびLGR−pMAを使用した。試料の調製には、生化学工業社製のエンドスペシーES24Sに添付されている緩衝液を使用した。
まず、電極チップにおいて、親水カバーフィルムを含まないものを用いて評価を行った。電極チップの電極部分に100μLの試料を滴下し、CV測定を行った。測定には、電極チップの作用極、対極および参照極を使用した。電位は0.2V→1.5V→−0.4V→0.2Vの範囲で、20mV/sの速度で走査した。
図6に(A)pMAおよび(B)LGR−pMAのそれぞれの場合のボルタモグラムを示す。0.4V付近にpMAの酸化反応に由来するピークが、0.95V付近にLGR−pMAの酸化反応に由来するピークが確認された。この結果から、電極チップを使用した電気化学測定が可能であることが示された。
2. Evaluation The produced electrode chip was evaluated. As measurement samples, pMA and LGR-pMA prepared at a concentration of 1.0 mM were used. For the preparation of the sample, a buffer solution attached to Endospecy ES24S manufactured by Seikagaku Corporation was used.
First, evaluation was performed using an electrode chip that did not include a hydrophilic cover film. A sample of 100 μL was dropped on the electrode portion of the electrode tip, and CV measurement was performed. For the measurement, the working electrode, the counter electrode, and the reference electrode of the electrode tip were used. The potential was scanned in the range of 0.2 V → 1.5 V → −0.4 V → 0.2 V at a speed of 20 mV / s.
FIG. 6 shows voltammograms for each of (A) pMA and (B) LGR-pMA. A peak derived from the oxidation reaction of pMA was confirmed in the vicinity of 0.4 V, and a peak derived from the oxidation reaction of LGR-pMA was confirmed in the vicinity of 0.95 V. From this result, it was shown that electrochemical measurement using an electrode tip was possible.
次に、電極チップを用いて評価を行った。導入口より試料を電極チップ内に導入し、収容部が試料で満たされたのを確認した後、CV測定を行った。測定条件は、上述と同様とした。
図7に(A)pMAおよび(B)LGR−pMAの場合のボルタモグラムを示す。0.4V付近にpMAの酸化反応に由来するピークが、1.0V付近にLGR−pMAの酸化反応に由来するピークが確認された。この結果から、電極チップを使用した電気化学測定が可能であることが示された。さらに、pMAの酸化反応に由来するピークが0.4Vであり、LGR−pMAの酸化反応に由来するピークがpMAの酸化反応に由来するピークである0.4V以上の1.0V付近に確認されたため、アンペロメトリ法によりpMAのみの酸化反応を検出することが可能であることが示された。
Next, evaluation was performed using an electrode tip. A sample was introduced into the electrode tip from the introduction port, and after confirming that the container was filled with the sample, CV measurement was performed. The measurement conditions were the same as described above.
FIG. 7 shows voltammograms for (A) pMA and (B) LGR-pMA. A peak derived from the oxidation reaction of pMA was confirmed near 0.4 V, and a peak derived from the oxidation reaction of LGR-pMA was confirmed near 1.0 V. From this result, it was shown that electrochemical measurement using an electrode tip was possible. Furthermore, the peak derived from the oxidation reaction of pMA is 0.4 V, and the peak derived from the oxidation reaction of LGR-pMA is confirmed in the vicinity of 1.0 V of 0.4 V or more which is a peak derived from the oxidation reaction of pMA. Therefore, it was shown that the oxidation reaction of only pMA can be detected by the amperometry method.
[実施例3]
LALカスケード反応を用いてエンドトキシンの濃度検出を行った。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬が入った試験管へ、LGR−pMA、緩衝液200μLおよびエンドトキシン標準溶液200μLを添加して撹拌した。37℃で最長60分間反応を行った後、混合液200μLを96ウェルプレートへ移した。エンドトキシンがC因子へ結合する反応がトリガーとなり、B因子、凝固酵素を次々に活性化してLALカスケード反応が進む。凝固酵素によりLGR−pMAから遊離したpMAを直径1mmのグラッシーカーボン電極でCV法およびアンペロメトリ法を用いて検出した。CV法は走査速度を20mV/sとし、範囲を0.2V→1.5V→−0.4V→0.2Vとした。アンペロメトリ法では−0.2Vの初期電位を10秒間印加した後、0.6Vに電位をステップして30秒間印加し、pMAの酸化反応に由来する電流を記録した。
[Example 3]
Endotoxin concentration was detected using the LAL cascade reaction.
As the lysate reagent and the buffer, a reagent attached to Endospecy manufactured by Seikagaku Corporation was used. LGR-pMA, 200 μL of buffer solution and 200 μL of endotoxin standard solution were added to a test tube containing the lysate reagent in a lyophilized state and stirred. After reaction at 37 ° C. for a maximum of 60 minutes, 200 μL of the mixed solution was transferred to a 96-well plate. A reaction in which endotoxin binds to factor C is triggered, and factor B and coagulase are activated one after another to advance the LAL cascade reaction. The pMA released from LGR-pMA by the coagulation enzyme was detected with a glassy carbon electrode having a diameter of 1 mm using the CV method and the amperometry method. In the CV method, the scanning speed was 20 mV / s, and the range was 0.2 V → 1.5 V → −0.4 V → 0.2 V. In the amperometry method, an initial potential of -0.2 V was applied for 10 seconds, then the potential was stepped to 0.6 V and applied for 30 seconds, and the current derived from the oxidation reaction of pMA was recorded.
図8に、反応時間をそれぞれ(A)0分、(B)10分、(C)20分、(D)30分、(E)40分、(F)50分、(G)60分に設定し、濃度100EU/Lのエンドトキシン標準溶液とライセート試薬とを反応させた時のボルタモグラムを示す。LALカスケード反応によってLGR−pMAから遊離するpMAの酸化反応に由来するピークが0.5V付近に確認された。その電流値は10分〜40分の範囲では時間に依存して増加し、40分以降は一定となった。
図9に、反応時間を30分に設定し、それぞれ濃度が(A)1EU/L、(B)10EU/L、(C)100EU/L、(D)1000EU/Lのエンドトキシン標準溶液とライセート試薬とを反応させた時のボルタモグラムを示す。LALカスケード反応によってLGR−pMAから遊離するpMAの酸化反応由来のピークが0.5V付近に確認された。その電流値はエンドトキシン濃度に依存して増加した。
これらの結果から、本手法により30分で10EU/Lのエンドトキシンを検出できることが分かった。さらにこれらの結果から、pMAの酸化反応由来のピーク電位はLGR−pMAの酸化反応由来のピーク電位よりも低く、アンペロメトリ法によりpMAの酸化反応のみを検出することができることが示された。
In FIG. 8, the reaction times are (A) 0 minutes, (B) 10 minutes, (C) 20 minutes, (D) 30 minutes, (E) 40 minutes, (F) 50 minutes, (G) 60 minutes, respectively. The voltammogram when the endotoxin standard solution with a concentration of 100 EU / L is reacted with the lysate reagent is shown. A peak derived from the oxidation reaction of pMA released from LGR-pMA by the LAL cascade reaction was confirmed around 0.5V. The current value increased depending on time in the range of 10 minutes to 40 minutes, and became constant after 40 minutes.
In FIG. 9, the reaction time is set to 30 minutes, and endotoxin standard solutions and lysate reagents with concentrations of (A) 1 EU / L, (B) 10 EU / L, (C) 100 EU / L, and (D) 1000 EU / L, respectively. The voltammogram when reacting with is shown. A peak derived from the oxidation reaction of pMA released from LGR-pMA by the LAL cascade reaction was confirmed around 0.5V. The current value increased depending on the endotoxin concentration.
From these results, it was found that 10 EU / L endotoxin could be detected in 30 minutes by this method. Furthermore, these results indicate that the peak potential derived from the oxidation reaction of pMA is lower than the peak potential derived from the oxidation reaction of LGR-pMA, and only the oxidation reaction of pMA can be detected by the amperometry method.
図10(a)にLAL反応を30分行った溶液に対してアンペロメトリ法による検出を行った際に得られたアンペログラムを示す。また、図10(b)に図10(a)の拡大図を示す。エンドトキシンの濃度は(A)0EU/L、(B)1EU/L、(C)10EU/L、(D)100EU/L、(E)1000EU/Lであり、1EU/L〜1000EU/Lの範囲でエンドトキシン濃度が高くなるに従って、pMAの酸化反応由来の電流値が増大することが確認された。 FIG. 10 (a) shows an amperogram obtained when the solution subjected to the LAL reaction for 30 minutes was detected by the amperometry method. FIG. 10 (b) shows an enlarged view of FIG. 10 (a). Endotoxin concentrations are (A) 0 EU / L, (B) 1 EU / L, (C) 10 EU / L, (D) 100 EU / L, (E) 1000 EU / L, and ranges from 1 EU / L to 1000 EU / L. Thus, it was confirmed that the current value derived from the oxidation reaction of pMA increased as the endotoxin concentration increased.
[比較例1]
パラニトロアニリンが結合されたペプチドとしてBoc−Leu−Gly−Arg−pNAを用いた。
LAL酵素溶液としては、C因子、B因子および凝固酵素前駆体を含むライセート試薬と、Boc−Leu−Gly−Arg−pNAとが凍結乾燥状態で1テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、生化学工業社製のエンドスペシーES−24Sセットの試薬を用いた。なお、以下、Boc−Leu−Gly−Arg−pNAをLGR−pNAと略称する場合がある。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬およびLGR−pNAが入った試験管へ、緩衝液200μLおよびエンドトキシン標準溶液200μLを添加して撹拌し、200μLを96ウェルプレートへ移した。室温で1時間または2時間反応を行った後、直径1mmのグラッシーカーボン電極を用いてディファレンシャルパルスボルタンメトリ(DPV)法による測定を行った。
[Comparative Example 1]
Boc-Leu-Gly-Arg-pNA was used as a peptide to which paranitroaniline was bound.
As the LAL enzyme solution, a lysate reagent containing factor C, factor B and a clotting enzyme precursor and Boc-Leu-Gly-Arg-pNA are sealed in a dedicated test tube in a freeze-dried state for each test. The reagent of Endspecy ES-24S set manufactured by Seikagaku Corporation was used. Hereinafter, Boc-Leu-Gly-Arg-pNA may be abbreviated as LGR-pNA.
As the lysate reagent and the buffer, a reagent attached to Endospecy manufactured by Seikagaku Corporation was used. To a test tube containing the lysate reagent and LGR-pNA in a lyophilized state, 200 μL of buffer solution and 200 μL of endotoxin standard solution were added and stirred, and 200 μL was transferred to a 96-well plate. After reacting at room temperature for 1 hour or 2 hours, measurement was performed by a differential pulse voltammetry (DPV) method using a glassy carbon electrode having a diameter of 1 mm.
図11(a)に反応時間1時間後、図11(b)に反応時間2時間後のボルタモグラムを示す。LGR−pNAおよびpNAの還元反応由来のピークがそれぞれ−0.64Vおよび−0.75V付近に観察された。LGR−pNAの還元反応由来のピークには−0.6V付近に見られる別のピークが重なっていた。エンドトキシンの濃度は、(A)0EU/L、(B)1EU/L、(C)10EU/L、(D)100EU/L、(E)1000EU/Lであり、エンドトキシンの濃度が高くなるに従って−0.64V付近のLGR−pNAの還元反応由来のピークが減少し、−0.75V付近のpNAの還元反応由来のピークが増大した。
図12に、0EU/Lの電流値を基準とした−0.75V付近のピーク電流値をシグナルに採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを示す。それぞれの点は5回の繰り返し実験の平均値であり、エラーバーは±標準偏差を示す。DPVのシグナルはエンドトキシン濃度および反応時間に依存した。本手法によって反応時間1時間では5EU/L以上のエンドトキシンの検出が可能であり、反応時間2時間では0.5EU/L以上の検出が可能であった。
しかし、上述の通りディファレンシャルパルスボルタンメトリは、測定結果の測定電流ピーク解析を行う必要があり、分析が複雑である。さらにpNAとLGR−pNAのシグナルの分離はディファレンシャルパルスボルタンメトリ以外の方法では難しい。例えば、アンペロメトリ法を用いようとした場合、pNAのほうがLGR−pNAよりも低電位で還元されるため、pNAが還元される電位を印加するとLGR−pNAも還元されてしまうため、pNAのみの検出は不可能である。
FIG. 11A shows a voltammogram after a reaction time of 1 hour, and FIG. 11B shows a voltammogram after a reaction time of 2 hours. Peaks derived from the reduction reaction of LGR-pNA and pNA were observed around −0.64 V and −0.75 V, respectively. The peak derived from the reduction reaction of LGR-pNA was overlapped with another peak seen in the vicinity of -0.6V. Endotoxin concentrations are (A) 0 EU / L, (B) 1 EU / L, (C) 10 EU / L, (D) 100 EU / L, (E) 1000 EU / L, and as endotoxin concentration increases- The peak derived from the reduction reaction of LGR-pNA near 0.64 V decreased, and the peak derived from the reduction reaction of pNA near −0.75 V increased.
FIG. 12 shows a graph in which a peak current value in the vicinity of −0.75 V based on a current value of 0 EU / L is adopted as a signal and plotted with respect to endotoxin concentration. Each point is an average value of 5 repeated experiments, and error bars indicate ± standard deviation. The DPV signal was dependent on endotoxin concentration and reaction time. By this method, endotoxin of 5 EU / L or more was detectable at a reaction time of 1 hour, and detection of 0.5 EU / L or more was possible at a reaction time of 2 hours.
However, as described above, the differential pulse voltammetry requires a measurement current peak analysis of the measurement result, and the analysis is complicated. Furthermore, separation of the signals of pNA and LGR-pNA is difficult by methods other than differential pulse voltammetry. For example, when the amperometry method is used, pNA is reduced at a lower potential than LGR-pNA. Therefore, when a potential at which pNA is reduced is applied, LGR-pNA is also reduced, so that only pNA is detected. Is impossible.
[比較例2]
パラアミノフェノールが結合したペプチドとしてBoc−Leu−Gly−Arg−pAPを用いた。なお、以下、Boc−Leu−Gly−Arg−pAPをLGR−pAPと略称する場合がある。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬が入った試験管へ、LGR−pAP、緩衝液200μLを添加しライセート試薬を溶解した。この混合液90μLおよびエンドトキシン標準溶液90μLを96ウェルプレートへ移し撹拌した。37℃で30分、1時間または2時間後、アンペロメトリ法による測定を行った。測定には直径1mmのグラッシーカーボン電極、Ag/AgCl参照極およびPt対極を使用した。
[Comparative Example 2]
Boc-Leu-Gly-Arg-pAP was used as a peptide to which paraaminophenol was bound. Hereinafter, Boc-Leu-Gly-Arg-pAP may be abbreviated as LGR-pAP.
As the lysate reagent and the buffer, a reagent attached to Endospecy manufactured by Seikagaku Corporation was used. LGR-pAP and 200 μL of buffer solution were added to a test tube containing a lysate reagent in a lyophilized state to dissolve the lysate reagent. 90 μL of this mixed solution and 90 μL of endotoxin standard solution were transferred to a 96-well plate and stirred. After 30 minutes, 1 hour, or 2 hours at 37 ° C., measurement by the amperometry method was performed. For the measurement, a glassy carbon electrode having a diameter of 1 mm, an Ag / AgCl reference electrode, and a Pt counter electrode were used.
図13にアンペロメトリ法による検出の反応2時間後のアンペログラムを示す。エンドトキシンの濃度は(A)0EU/L、(B)0.5EU/L、(C)1EU/L、(D)10EU/L、(E)100EU/L、(F)1000EU/Lであり、1EU/L〜1000EU/Lの範囲でエンドトキシン濃度が高くなるに従って、pAP由来の電流値が増大した。
図14に、電位を−0.2Vから0.3Vに切り替えてから19秒後から21秒後の電流値の平均値をシグナルとして採用し、エンドトキシン濃度に対してプロットしたグラフを示す。反応時間は(A)30分、(B)1時間、(C)2時間となっており、それぞれの点は3回の繰り返し実験の平均値、エラーバーは±標準偏差を示す。本手法から、反応時間30分では100EU/L〜2000EU/Lの範囲、1時間では1EU/L〜1000EU/Lの範囲、2時間では0.5EU/L〜1000EU/Lの範囲でエンドトキシン濃度と電流値の間に相関があることが分かった。超純粋透析液の管理等、医療現場では1EU/Lの検出法が求められていることから、本手法の場合では、検出には1時間以上の反応時間が必要となる。
FIG. 13 shows an amperogram after 2 hours of detection by the amperometry method. Endotoxin concentrations are (A) 0 EU / L, (B) 0.5 EU / L, (C) 1 EU / L, (D) 10 EU / L, (E) 100 EU / L, (F) 1000 EU / L, The current value derived from pAP increased as the endotoxin concentration increased in the range of 1 EU / L to 1000 EU / L.
FIG. 14 shows a graph in which the average value of current values after 19 seconds to 21 seconds after switching the potential from −0.2 V to 0.3 V is adopted as a signal and plotted against the endotoxin concentration. The reaction time is (A) 30 minutes, (B) 1 hour, and (C) 2 hours. Each point represents the average value of three repeated experiments, and the error bar represents ± standard deviation. From this method, the endotoxin concentration ranges from 100 EU / L to 2000 EU / L in a reaction time of 30 minutes, in the range of 1 EU / L to 1000 EU / L in 1 hour, and in the range of 0.5 EU / L to 1000 EU / L in 2 hours. It was found that there was a correlation between the current values. Since a detection method of 1 EU / L is required in the medical field such as management of ultrapure dialysate, in the case of this method, a reaction time of 1 hour or more is required for detection.
しかし、ここでpAPの電気化学活性の低下が問題となる。溶媒をリン酸緩衝液PBS(−)として、1.0mMとなるように調製したpAPを37℃、遮光条件で保存した時のpAP酸化シグナルの変化を評価した結果を図15に示す。測定にはCV法を用い、電位は20mV/sの速度で、−0.2V→0.8V→−0.8V→−0.2Vの範囲で走査した。保存時間は溶液調製時を開始とし、(A)0分、(B)30分、(C)1時間、(D)4時間であり、時間経過とともに0.2V付近に現れるpAPの酸化反応由来のピークが小さくなった。0分のときの電流値を100とすると、30分で97、1時間後および4時間後で87となり、1割以上減少する結果となった。また、時間の経過とともに0.3V付近に新たなピークが現れ始め、pAPが別物質へ変化していることが示唆された。 However, the decrease in the electrochemical activity of pAP is a problem here. FIG. 15 shows the results of evaluating changes in the pAP oxidation signal when pAP prepared to a concentration of 1.0 mM using a phosphate buffer solution PBS (−) as a solvent was stored at 37 ° C. under light-shielding conditions. The CV method was used for the measurement, and the potential was scanned in a range of −0.2 V → 0.8 V → −0.8 V → −0.2 V at a speed of 20 mV / s. The storage time starts from the time of preparation of the solution, and is (A) 0 minutes, (B) 30 minutes, (C) 1 hour, (D) 4 hours. The peak of became smaller. Assuming that the current value at 0 minutes was 100, it was 97 in 30 minutes, 87 after 1 hour, and 4 hours, resulting in a decrease of 10% or more. Moreover, a new peak began to appear around 0.3 V with the passage of time, suggesting that pAP has changed to another substance.
1 … 電極チップ
2 … 基板
3 … 電極
4 … 端子
5 … 導線
7 … 収容部
9 … パラメトキシアニリンが結合したペプチド
10 … ライセート試薬
11、21 … 上部基板
12 … 貫通孔
22 … 流路
23 … 導入口
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Electrode chip 2 ... Board | substrate 3 ... Electrode 4 ... Terminal 5 ... Conductor 7 ... Accommodating part 9 ... Peptide which paramethoxyaniline couple | bonded 10 ... Lysate reagent 11, 21 ... Upper board | substrate 12 ... Through-hole 22 ... Channel 23 ... Introduction mouth
Claims (8)
前記遊離反応後の、前記被検体、前記ライセート試薬および前記ペプチドの混合物に対して、電気化学反応により測定される電流値に基づいて微生物夾雑物を定量する測定工程と
を有することを特徴とする微生物夾雑物の濃度検出方法。 A reaction step in which a specimen containing microbial contaminants, a lysate reagent, and a peptide to which paramethoxyaniline is bound are brought into contact with each other to cause a release reaction of paramethoxyaniline from the peptide by a multistep reaction;
A measurement step of quantifying microbial contaminants based on a current value measured by an electrochemical reaction with respect to the mixture of the analyte, the lysate reagent, and the peptide after the release reaction. A method for detecting the concentration of microbial contaminants.
前記基板上に形成され、微生物夾雑物を含む被検体を収容し得る収容部と、
前記収容部内に配置された電極と
を有し、
前記被検体を導入する導入口から前記収容部の間にパラメトキシアニリンが結合したペプチドが配置されていることを特徴とする電極チップ。 A substrate,
A container formed on the substrate and capable of accommodating a specimen containing microbial contaminants;
An electrode disposed in the housing portion,
An electrode chip, wherein a peptide to which paramethoxyaniline is bonded is disposed between the introduction port for introducing the analyte and the accommodating portion.
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