JP5915977B2 - Method for producing frozen cell sheet - Google Patents
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Description
本発明は、凍結細胞シートの製造方法に関する。より詳しくは、低温領域の雰囲気中で細胞シートを凍結する凍結細胞シートの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a frozen cell sheet. More specifically, the present invention relates to a method for producing a frozen cell sheet in which a cell sheet is frozen in an atmosphere in a low temperature region.
細胞シートは皮膚、循環器、眼、消化器等の再生医療に広く応用されつつある（非特許文献１〜２）。しかし、細胞シートは、生きた細胞で構成されているため、移植等に使用可能な状態を保ちつつ常温で長期間保存することが困難である。このため、細胞シートを使用する予定に合わせて、細胞シートを構成する細胞を培養し、さらに細胞をシート化する等の煩雑な計画を実行しなければならない。この不便さを解消するために、細胞シートを凍結することによって、最適な状態を維持したまま長期間保存する方法の開発が望まれている。 Cell sheets are being widely applied to regenerative medicine such as skin, circulatory organs, eyes, and digestive organs (Non-Patent Documents 1 and 2). However, since the cell sheet is composed of living cells, it is difficult to store the cell sheet at room temperature for a long time while maintaining a usable state for transplantation or the like. For this reason, according to the plan which uses a cell sheet, the cell which comprises a cell sheet must be culture | cultivated, Furthermore, complicated plans, such as making a cell into a sheet, must be performed. In order to eliminate this inconvenience, it is desired to develop a method for storing for a long period of time while maintaining an optimum state by freezing the cell sheet.
従来、細胞シートを構成していない、単なる細胞を生きた状態（解凍後に増殖可能な状態）で凍結保存する方法として、緩慢凍結法とガラス化保存法の二つが知られている。
緩慢凍結法では、緩慢な冷却速度で長時間かけて細胞シートを冷却し、細胞内での氷晶の形成を抑えることによって、凍結による細胞の損傷（凍害）を避けることができるとされている。しかし、凍結が完了するまでに長い時間を必要とし、冷却速度を制御する特殊な機能を備えた高価なフリーザー等を使用する必要があった。
2. Description of the Related Art Conventionally, there are two known methods of cryopreserving cells that do not constitute a cell sheet and that are simply stored in a live state (a state that allows proliferation after thawing), a slow freezing method and a vitrification storage method.
In the slow freezing method, it is said that cell damage (freezing damage) due to freezing can be avoided by cooling the cell sheet over a long period of time at a slow cooling rate and suppressing the formation of ice crystals in the cells. . However, it took a long time to complete freezing, and it was necessary to use an expensive freezer having a special function for controlling the cooling rate.
緩慢凍結法における欠点を克服する代替方法として、近年、ガラス化保存法が広く用いられている。ガラス化保存法は、ガラス化溶液で処理した細胞を液体窒素で素早く凍結させることで、細胞内外に氷晶を形成させずに凍結する方法である。これは、ガラス化と呼ばれる現象、即ち、溶液を急速に冷却させると、本来の凝固点を素早く通過して過冷却が生じ、氷晶が形成されずに水分子の動きが止まるという現象を利用したものである。この方法は、氷晶の形成による細胞の損傷が生じない点、処理にかかる時間が短い点、及び特別な機器が不要な点において、緩慢凍結法より優れている。
細胞のガラス化保存の具体的方法は多数開発されており、ガラス化保存のための溶液に使用する、化合物等も開発されている（特許文献１〜２）。例えば、凍結保存用の化合物を６０％という高濃度とした場合、細胞に損傷をもたらすことから、フラボノイド配糖体を添加することにより、係る凍結保存用の化合物の濃度を４５％まで下げることを提案している（特許文献１）。
In recent years, vitrification preservation methods have been widely used as an alternative method to overcome the disadvantages of the slow freezing method. The vitrification preservation method is a method in which cells treated with a vitrification solution are quickly frozen with liquid nitrogen, thereby freezing without forming ice crystals inside and outside the cells. This utilizes a phenomenon called vitrification, that is, when the solution is rapidly cooled, it rapidly passes through the original freezing point and supercooling occurs, and water molecules stop moving without forming ice crystals. Is. This method is superior to the slow freezing method in that cells are not damaged by the formation of ice crystals, the time required for the treatment is short, and no special equipment is required.
A number of specific methods for vitrification preservation of cells have been developed, and compounds used for solutions for vitrification preservation have also been developed (Patent Documents 1 and 2). For example, if the concentration of the compound for cryopreservation is as high as 60%, it causes damage to the cells. Therefore, the concentration of the compound for cryopreservation can be lowered to 45% by adding a flavonoid glycoside. (Patent Document 1).
従来の緩慢凍結法及びガラス化保存法の何れにおいても、細胞の体積に比べて多量の保護溶液中に細胞を浸漬した状態で、凍結及び解凍させている。この方法を、細胞同士が寄り集まった脆弱なシート状構造を持つ細胞シートに適用した場合、細胞シートがひび割れたり破れてしまう問題（以下、この問題を凍害と呼ぶことがある。）があった。このような問題が生じた細胞シートを移植等に供することはできない。 In both the conventional slow freezing method and vitrification storage method, the cells are frozen and thawed in a state where the cells are immersed in a larger amount of the protective solution than the volume of the cells. When this method is applied to a cell sheet having a fragile sheet-like structure in which cells gather together, there is a problem that the cell sheet is cracked or torn (hereinafter, this problem may be referred to as frost damage). . A cell sheet in which such a problem has occurred cannot be used for transplantation or the like.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、凍結させてもひび割れたり破れたりせず、かつ簡便に凍結保存が可能な凍結細胞シートの製造方法の提供を課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for producing a frozen cell sheet that is not cracked or torn even when frozen and that can be easily cryopreserved.
本発明の請求項１に記載の凍結細胞シートの製造方法は、細胞浸透性の凍害保護剤を含むガラス化液で被覆され、且つ、前記凍害保護剤が細胞内部に含浸され、且つ、運搬補助膜に重ねられた細胞シートと、前記ガラス化液とを袋内に入れ、余分なガラス化液を袋から押し出すことによって、前記細胞シートを前記ガラス化液で被覆し、前記袋内において前記運搬補助膜に重ねられた細胞シートを、−２０℃〜−２６９℃の気相雰囲気中で凍結することを特徴とする。
本発明の請求項２に記載の凍結細胞シートの製造方法は、請求項１において、前記細胞浸透性の凍害保護剤の濃度が１５ｖｏｌ％以上３０ｖｏｌ％未満である第１のガラス化液に前記運搬補助膜に重ねられた細胞シートを浸漬し、次いで前記細胞浸透性の凍害保護剤の濃度が３０ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％未満である第２のガラス化液に前記運搬補助膜に重ねられた細胞シートを浸漬することによって、前記凍害保護剤を前記細胞内部に含浸させた後、前記第２のガラス化液と共に前記運搬補助膜に重ねられた細胞シートを前記袋内に入れることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載の凍結細胞シートの製造方法は、請求項２において、前記第２のガラス化液が、非細胞浸透性の凍害保護剤を含むことを特徴とする。
The method for producing a frozen cell sheet according to claim 1 of the present invention is coated with a vitrification solution containing a cell-permeable frost damage protecting agent, and the cell is impregnated with the frost damage protecting agent, and the transport aid The cell sheet overlaid on the membrane and the vitrification solution are put in a bag, and the excess vitrification solution is pushed out of the bag to coat the cell sheet with the vitrification solution, and the transport in the bag. The cell sheet stacked on the auxiliary membrane is frozen in a gas phase atmosphere of −20 ° C. to −269 ° C.
The method for producing a frozen cell sheet according to claim 2 of the present invention is the method according to claim 1 , wherein the concentration of the cell-permeable frost damage protective agent is 15 vol% or more and less than 30 vol%. The cell sheet stacked on the auxiliary membrane is immersed, and then the cell sheet superimposed on the transport auxiliary membrane in the second vitrification solution having a concentration of the cell-permeable frost damage protective agent of 30 vol% or more and less than 50 vol%. After immersing the inside of the cell with the frost damage protective agent by immersing, the cell sheet superimposed on the transport auxiliary membrane together with the second vitrification solution is placed in the bag.
The method for producing a frozen cell sheet according to claim 3 of the present invention is characterized in that, in claim 2 , the second vitrification solution contains a non-cell permeable frost damage protective agent.
本発明の凍結細胞シートの製造方法によれば、凍結の過程で細胞シートがひび割れたり破れたりすることを防止し若しくはその程度を少なくし、且つ高い細胞生存率を保持した状態で細胞シートを凍結できる。この結果、移植等の使用に適した状態の細胞シートを長期間にわたり保存できる。 According to the method for producing a frozen cell sheet of the present invention, the cell sheet is prevented from cracking or tearing during the freezing process, or the degree thereof is reduced, and the cell sheet is frozen while maintaining a high cell viability. it can. As a result, a cell sheet in a state suitable for use such as transplantation can be stored for a long period of time.
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。
＜凍結細胞シートの製造方法＞
本発明の凍結細胞シートの製造方法は、細胞浸透性の凍害保護剤を含むガラス化液で被覆された細胞シートを、−２０℃〜−２６９℃の気相雰囲気中で凍結するものである。
The present invention will be described below based on preferred embodiments with reference to the drawings.
<Method for producing frozen cell sheet>
In the method for producing a frozen cell sheet of the present invention, a cell sheet coated with a vitrification solution containing a cell-permeable frost damage protective agent is frozen in a gas phase atmosphere at -20 ° C to -269 ° C.
細胞シートをガラス化液で被覆する場合には、細胞シートを少なくとも前記細胞浸透性の凍害保護剤（以下、単に「凍害保護剤α」と呼ぶことがある。）を含む第１のガラス化液に浸漬する第１のガラス化液処理をしたのちに、前記凍害保護剤αの濃度が前記第１のガラス化液よりも高い第２のガラス化液に浸漬する第２のガラス化液処理をすることが好ましい。ここで、凍害保護剤αは、細胞シートのシート状構造形成を損なうものでなく、細胞内に浸透可能であり、細胞毒性が低く、凍結時に細胞内で氷晶（氷核）が形成されることを抑制若しくは低減できるものであれば特に限定されず、従来の細胞の凍結保存に使用されている凍害保護剤が適用できる。例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、プロパンジオール等が挙げられる。これらの中でも、氷晶形成をより一層抑制し、細胞毒性が低く、細胞シートが移植される人体への毒性が低い、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールがより好ましい。
また、凍害保護剤αは一種を単独で用いてもよいし、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
In the case where the cell sheet is coated with the vitrification solution, the first vitrification solution containing at least the cell-permeable frost damage protective agent (hereinafter sometimes simply referred to as “frost damage protection agent α”). After the first vitrification treatment to be immersed in the second vitrification treatment, the concentration of the frost damage protective agent α is immersed in the second vitrification solution higher than the first vitrification solution. It is preferable to do. Here, the frost damage protective agent α does not impair the formation of the sheet-like structure of the cell sheet, can penetrate into the cells, has low cytotoxicity, and forms ice crystals (ice nuclei) in the cells when frozen. If it can suppress or reduce this, it will not specifically limit, The frost damage protective agent currently used for the cryopreservation of the conventional cell is applicable. Examples thereof include glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide), propanediol, and the like. Among these, glycerol, ethylene glycol, and propylene glycol are more preferable because they further suppress ice crystal formation, have low cytotoxicity, and low toxicity to the human body into which the cell sheet is transplanted.
Moreover, frost damage protective agent (alpha) may be used individually by 1 type, and may be used in combination of multiple types.
前記第１のガラス化液に含まれる凍害保護剤αの濃度は、凍害保護剤αの種類や組み合わせによって適宜調整すればよく、１５ｖｏｌ％以上３０ｖｏｌ％未満であることが好ましい。上記濃度範囲の下限値以上であると、凍結過程で細胞内に氷晶が形成されることを抑制することができる。上記濃度範囲の上限値以下であると、細胞内への凍害保護剤αの急激な浸透による細胞へのダメージを防ぐことができる。
前記第２のガラス化液に含まれる凍害保護剤αの濃度は、凍害保護剤αの種類や組み合わせによって適宜調整すればよく、３０ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％未満であることが好ましい。上記濃度範囲の下限値以上であると、凍結過程で細胞内に氷晶が形成されることをより一層抑制することができる。上記濃度範囲の上限値以下であると、過度に細胞内に浸透することを防ぎ、細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）に与える影響を少なくできる。
What is necessary is just to adjust suitably the density | concentration of the frost damage protective agent (alpha) contained in a said 1st vitrification liquid with the kind and combination of the frost damage protective agent (alpha), and it is preferable that it is 15 vol% or more and less than 30 vol%. If it is at least the lower limit of the above concentration range, it is possible to suppress the formation of ice crystals in the cells during the freezing process. When the concentration is less than or equal to the upper limit of the concentration range, damage to the cells due to rapid penetration of the frost damage protective agent α into the cells can be prevented.
What is necessary is just to adjust suitably the density | concentration of the frost damage protective agent (alpha) contained in a said 2nd vitrification liquid with the kind and combination of the frost damage protective agent (alpha), and it is preferable that they are 30 vol% or more and less than 50 vol%. When the concentration is not less than the lower limit of the concentration range, it is possible to further suppress the formation of ice crystals in the cells during the freezing process. When the concentration is not more than the upper limit of the above concentration range, excessive penetration into cells can be prevented, and the influence on cell viability can be reduced.
なお、上記濃度範囲の単位「ｖｏｌ％」は「ｖ／ｖ％（容量％）」を意味する。上記濃度範囲で使用することが好ましい凍害保護剤αとしては、例えば、エチレングリコール（分子量６２）とＤＭＳＯを１：１の体積比となるように混合調製したものが挙げられる。 The unit “vol%” of the concentration range means “v / v% (volume%)”. As the frost damage protective agent α preferably used in the above concentration range, for example, a mixture prepared by mixing ethylene glycol (molecular weight 62) and DMSO so as to have a volume ratio of 1: 1 can be mentioned.
このように、細胞シートを構成する細胞内にガラス化液を浸透させる際、凍害保護剤αの濃度が比較的低い第１のガラス化液処理と、凍害保護剤αの濃度が比較的高い第２のガラス化処理とに分けて処理することにより、浸透圧差を少なくして細胞へのダメージを低減することができる。 As described above, when the vitrification solution is permeated into the cells constituting the cell sheet, the first vitrification solution treatment in which the concentration of the frost damage protective agent α is relatively low, and the concentration of the frost damage protection agent α is relatively high. By performing the treatment separately from the vitrification treatment of 2, it is possible to reduce the osmotic pressure difference and reduce the damage to the cells.
前記第２のガラス化液には、さらに非細胞浸透性の凍害保護剤（以下、単に「凍害保護剤β」と呼ぶことがある。）が含まれている方が凍害防御の観点から特に好ましい。凍害保護剤βが含まれる第２のガラス化液を使用することにより、細胞シートのひび割れを防止することがより容易となる。
また、前記凍害保護剤βは前記第１のガラス化液の粘度が高くなりすぎない範囲で含まれていてもよいが、第２のガラス化液のみに含む方が、製造工程とコストの点から有利である。前記凍害保護剤βの濃度が２５ｗｔ％以上となると、粘度が高くなりすぎて取り扱いが難しくなるばかりでなく、ガラス化液処理中細胞シートが破れることがある。
ここで、第１のガラス化液と第２のガラス化液とは、組成や各成分の濃度が異なる溶液であることから、細胞シートを前記第２のガラス化液処理する前に、前記第２のガラス化液と同じ組成のガラス化液に短時間浸漬させる濯ぎ処理をすることによって、前記第１のガラス化液処理によって細胞シートに付着した前記第１のガラス化液を希釈除去することが好ましい。この濯ぎ処理は、前記細胞シートに付着している第１のガラス化液を第２のガラス化液に持ち込むことにより、その組成が変化するのを低減すると同時に、組成や各成分の濃度が異なるガラス化液への浸漬によって、細胞シートを構成する細胞が受けるショックを和らげ、第２のガラス化液処理することの所望の目的を完結化させるために行う。
なお、ここでは便宜的に「濯ぎ処理」と「浸漬処理」とを区別して説明したが、使用するガラス化液は同じであるので、「濯ぎ処理」および「浸漬処理」は共に、「第２のガラス化液処理」に含まれる処理である。
It is particularly preferable from the viewpoint of protection against frost damage that the second vitrification solution further contains a non-cell permeable frost damage protective agent (hereinafter sometimes simply referred to as “frost damage protective agent β”). . By using the second vitrification liquid containing the frost damage protective agent β, it becomes easier to prevent the cell sheet from cracking.
In addition, the frost damage protective agent β may be included in a range in which the viscosity of the first vitrification liquid does not become too high, but the inclusion of only the second vitrification liquid in terms of manufacturing process and cost. Is advantageous. When the concentration of the frost damage protective agent β is 25 wt% or more, the viscosity becomes too high and handling becomes difficult, and the cell sheet may be broken during the vitrification treatment.
Here, since the first vitrification liquid and the second vitrification liquid are solutions having different compositions and concentrations of each component, the cell sheet is subjected to the second vitrification liquid treatment before the second vitrification liquid treatment. The first vitrification solution adhering to the cell sheet by the first vitrification treatment is diluted and removed by performing a rinsing treatment by dipping in a vitrification solution having the same composition as the vitrification solution of No. 2 Is preferred. This rinsing treatment reduces the change in the composition by bringing the first vitrification solution adhering to the cell sheet into the second vitrification solution, and at the same time, the composition and the concentration of each component are different. It is carried out in order to relieve the shock received by the cells constituting the cell sheet by dipping in the vitrification solution and to complete the desired purpose of the second vitrification solution treatment.
Here, for the sake of convenience, the “rinsing process” and the “dipping process” have been described separately. However, since the vitrification liquid to be used is the same, both the “rinsing process” and the “dipping process” are performed in the “second process”. This is a process included in the “vitrification liquid treatment”.
ここで、凍害保護剤βは、細胞内に実質的に浸透せず、細胞毒性が低く、凍結時に細胞表面を被覆するガラス化液中に氷晶が形成されることを抑制若しくは低減できるものであれば特に制限されず、従来の細胞の凍結保存に使用されている高分子の凍害保護剤が適用できる。例えば、デキストラン、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジン、不凍蛋白等は、細胞毒性が低く、細胞シートが移植される人体への毒性も低く、凍結保存や解凍時の細胞シートのひび割れや破れを防げるので好ましい。
本発明において、ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ε−ポリ−Ｄ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｄ−リジンのいずれであってもよい。
Here, the frost damage protective agent β does not substantially penetrate into cells, has low cytotoxicity, and can suppress or reduce the formation of ice crystals in the vitrification solution that coats the cell surface during freezing. There is no particular limitation as long as it is a polymer, and a polymeric frost damage protective agent used for conventional cryopreservation of cells can be applied. For example, dextran, polyethylene glycol, sucrose, trehalose, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polylysine, antifreeze protein, etc. have low cytotoxicity, low toxicity to the human body to which the cell sheet is transplanted, and cells during cryopreservation and thawing It is preferable because it prevents cracking and tearing of the sheet.
In the present invention, the polylysine may be any of ε-poly-L-lysine (PLL), ε-poly-D-lysine, α-poly-L-lysine, and α-poly-D-lysine.
これらの凍害保護剤βは高分子化合物であるが、後述する媒体に溶解することが必要であり、溶解したときに極度に粘性が高くなく、細胞シートを被覆できればよい。これらの中でもＰＬＬは氷晶形成をより一層抑制するうえ、凍結保存や解凍時の細胞シートのひび割れや破れをより防げるのでより好ましい。ＰＬＬは市販されているものでも良いが、市販されているＰＬＬのアミノ基に結合する水素原子の一部又は全部を、３−カルボキシ−１−オキソプロピル基｛−Ｃ(＝Ｏ)−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ｝又はカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に置換した置換型PLLが特に好ましい。 These frost damage protective agents β are high molecular compounds, but need to be dissolved in a medium to be described later, and it is only required that the cell sheet can be coated without being extremely high in viscosity when dissolved. Among these, PLL is more preferable because it further suppresses ice crystal formation and further prevents cracking and tearing of the cell sheet during cryopreservation and thawing. Although a commercially available PLL may be used, a part or all of the hydrogen atoms bonded to the amino group of the commercially available PLL may be converted to a 3-carboxy-1-oxopropyl group {—C (═O) —CH 2. A substituted PLL substituted with —CH 2 —COOH} or a carboxyl group (—COOH) is particularly preferred.
前記凍害保護剤βの質量平均分子量としては、ガラス化液の粘度が取扱いに支障を来たすほど高くならなければ特に限定されないが、例えば、デキストランであれば２０，０００〜６０，０００、ポリエチレングリコールであれば３０，０００〜７０，０００、スクロースであれば２００〜５００、トレハロースであれば２００〜５００、ポリビニルアルコールであれば２，０００〜２００，０００、ポリビニルピロリドンであれば２０，０００〜６０，０００、ポリリジン（ＰＬＬ）及びその誘導体であれば１，０００〜２０，０００であれば、取扱も容易であり、ガラス化液で細胞シートを十分に被覆できるため好ましい。置換型ＰＬＬの構造式中、重合度ｎは、５〜１００が好ましい。
凍害保護剤βは一種を単独で用いてもよいし、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
The mass average molecular weight of the frost damage protective agent β is not particularly limited as long as the viscosity of the vitrification solution is not so high as to hinder handling. For example, dextran is 20,000-60,000, polyethylene glycol 30,000-70,000 if present, 200-500 if sucrose, 200-500 if trehalose, 2,000-200,000 if polyvinyl alcohol, 20,000-60 if polyvinylpyrrolidone. 000, polylysine (PLL), and derivatives thereof are preferably 1,000 to 20,000 because they are easy to handle and can sufficiently cover the cell sheet with vitrification solution. In the structural formula of the substitutional PLL, the polymerization degree n is preferably 5 to 100.
One kind of frost damage protective agent β may be used alone, or a plurality of kinds may be used in combination.
第２のガラス化液に含まれる凍害保護剤βの濃度は、凍害保護剤βの種類や組み合わせによって適宜調整すればよく、例えば５〜２５ｗｔ％が好ましく、６〜２０ｗｔ％がより好ましく、７〜１５ｗｔ％がさらに好ましい。
上記濃度範囲の下限値以上であると、凍結過程で細胞表面に被覆されたガラス化液内に氷晶が形成されることをより一層抑制することができる。上記濃度範囲の上限値以下であると、過度に細胞内の水を脱水することを防ぎ、細胞の生存率に与える影響を少なくできる。なお、上記濃度範囲の単位「ｗｔ％」は「ｗ／ｗ％（重量％）」を意味する。
What is necessary is just to adjust suitably the density | concentration of the frost damage protective agent (beta) contained in a 2nd vitrification liquid with the kind and combination of frost damage protection agent (beta), for example, 5-25 wt% is preferable, 6-20 wt% is more preferable, 7- 15 wt% is more preferable.
When the concentration is not less than the lower limit of the concentration range, it is possible to further suppress the formation of ice crystals in the vitrification solution coated on the cell surface during the freezing process. When the concentration is not more than the upper limit of the above concentration range, excessive dehydration of intracellular water can be prevented, and the influence on cell viability can be reduced. The unit “wt%” of the above concentration range means “w / w% (weight%)”.
第１のガラス化液と第２のガラス化液は、少なくとも凍害保護剤αを含み、必要に応じて凍害保護剤βも含むが、細胞シートを被覆するために、これらの凍害保護剤を適度に溶解あるいは希釈するための媒体を用いるのが好ましい。前記媒体は、細胞毒性が低く、凍害保護剤αを溶解できるものであれば特に制限されず、凍害保護剤α及び凍害保護剤βを溶解できるものが好ましい。このような媒体としては、滅菌されたリン酸緩衝生理食塩水等の生理的塩類溶液や細胞培養培地等を好適な例として挙げることができる。
第２のガラス化液においては、凍害保護剤βが高分子であることから高粘度となる傾向がある。したがって、用いる媒体と凍害保護剤βを含む媒質との組み合わせ、被覆のし易さを適宜考慮する必要がある。
The first vitrification solution and the second vitrification solution contain at least a frost damage protective agent α and, if necessary, a frost damage protection agent β. However, in order to coat the cell sheet, these frost damage protection agents are appropriately used. Preferably, a medium for dissolving or diluting is used. The medium is not particularly limited as long as it has low cytotoxicity and can dissolve the frost damage protective agent α. A medium capable of dissolving the frost damage protective agent α and the frost damage protective agent β is preferable. Suitable examples of such a medium include physiological salt solutions such as sterilized phosphate buffered saline, cell culture media, and the like.
In the second vitrification liquid, since the frost damage protective agent β is a polymer, it tends to be highly viscous. Therefore, it is necessary to appropriately consider the combination of the medium to be used and the medium containing the frost damage protective agent β and the ease of coating.
本発明のガラス化液には、細胞内へ凍害保護剤αの浸透を促進するために、浸透圧調整剤を含むことが好ましい。浸透圧調整剤は、通常、細胞の浸透圧調整のために使用されるものであれば特に制限されないが、スクロース、トレハロース、グルコースが好適に利用できる。
また、前記浸透圧調整剤は前記第１のガラス化液に、第１のガラス化液処理中に過度に細胞の脱水が生じない範囲で含まれていてもよいが、第２のガラス化液のみに含む方が、製造工程とコストの点から有利である。例えば浸透圧調整剤としてスクロースを用いた場合、スクロース濃度が０．２５mol／L以下であれば過度に細胞の脱水が生じることがない。
The vitrification solution of the present invention preferably contains an osmotic pressure adjusting agent in order to promote the penetration of the frost damage protective agent α into the cells. The osmotic pressure adjusting agent is not particularly limited as long as it is usually used for adjusting the osmotic pressure of cells, but sucrose, trehalose and glucose can be suitably used.
Moreover, although the said osmotic pressure regulator may be contained in the said 1st vitrification liquid in the range which does not dehydrate a cell too much during the 1st vitrification liquid process, it is 2nd vitrification liquid. It is more advantageous to include only in terms of manufacturing process and cost. For example, when sucrose is used as the osmotic pressure adjusting agent, cell dehydration does not occur excessively if the sucrose concentration is 0.25 mol / L or less.
本発明のガラス化液には血清又は血清代替物（以下、これらを総称して「血清」と呼ぶことがある。）を含むことが好ましい。前記血清は、通常、細胞培養に使用されるものであれば特に制限されない。通常は細胞シートと同じ動物種の血清又は血清代替物を好適に用いることができる。例えば、入手が容易なウシ胎児血清等が利用できる。 The vitrification solution of the present invention preferably contains serum or a serum substitute (hereinafter, these may be collectively referred to as “serum”). The serum is not particularly limited as long as it is usually used for cell culture. Usually, serum of the same animal species as the cell sheet or a serum substitute can be suitably used. For example, easily available fetal bovine serum can be used.
第１のガラス化液は、凍結過程において細胞内に氷晶が形成されることを抑制する、若しくは氷晶が形成される程度を低減するものである。
第２のガラス化液は、第１のガラス化液中の凍害保護剤αの配合割合よりも大きい割合で凍害保護剤αを含むことが重要である。第２のガラス化液は、第１のガラス化液よりも氷晶の形成を抑制し、又は氷晶の形成の程度を低減することができる。第２のガラス化液は、さらに凍害保護剤βを含んでいても良い。凍害保護剤βを第２のガラス化液に含有させることにより、凍結過程において細胞内及び細胞表面を被覆する第２のガラス化液中に氷晶が形成されることをさらに抑制する、若しくは氷晶が形成される程度をさらに低減することができる。
第１のガラス化液及び第２のガラス化液は、凍害保護剤αと共に、さらに媒体及び血清を含むものが好ましい。媒体を含ませることにより、ガラス化液の粘度を調整しつつ凍害保護剤αの濃度を調整できる。また、血清を含ませることにより、細胞の生存率をより高められる。
また、細胞シートを第２のガラス化液で十分に被覆するためには、上述したように、細胞シートを第２のガラス化液に浸漬する前に、濯ぎ処理を行うことが好ましい。この濯ぎ処理は、第１のガラス化液に浸漬したのち、第１のガラス化液から第２のガラス化液に近い液に漸次換えながら複数回行ってもよいことはいうまでもない。
The first vitrification solution suppresses the formation of ice crystals in the cells during the freezing process or reduces the degree to which ice crystals are formed.
It is important that the second vitrification liquid contains the frost damage protective agent α in a ratio larger than the blending ratio of the frost damage protective agent α in the first vitrification liquid. The second vitrification liquid can suppress the formation of ice crystals or reduce the degree of the formation of ice crystals than the first vitrification liquid. The second vitrification liquid may further contain a frost damage protective agent β. By containing the frost damage protective agent β in the second vitrification solution, it is possible to further suppress the formation of ice crystals in the second vitrification solution that covers the cell surface and the cell surface during the freezing process, or ice. The degree to which crystals are formed can be further reduced.
It is preferable that the first vitrification solution and the second vitrification solution further contain a medium and serum together with the frost damage protective agent α. By including the medium, it is possible to adjust the concentration of the frost damage protective agent α while adjusting the viscosity of the vitrification solution. In addition, the viability of the cells can be further increased by including serum.
Further, in order to sufficiently cover the cell sheet with the second vitrification solution, as described above, it is preferable to perform a rinsing treatment before immersing the cell sheet in the second vitrification solution. It goes without saying that this rinsing treatment may be performed a plurality of times while being gradually changed from the first vitrification liquid to a liquid close to the second vitrification liquid after being immersed in the first vitrification liquid.
前記細胞シートを凍結前に予め前記ガラス化液に浸漬することによって、細胞シートを構成する細胞内に凍害保護剤αを浸透させることができる。その浸漬時間は特に制限されず、細胞シートを構成する細胞の種類や細胞シートの大きさ又は凍害保護剤αの種類によって適宜調整すればよく、例えば１分間〜６０分間とすればよい。また、この浸漬時の温度は、細胞シートを構成する細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が大きく低下しない温度であれば特に制限されず、例えば１５〜３９℃の範囲が挙げられる。
上記浸漬時間で第２のガラス化液中に細胞シートを浸漬させることにより、細胞シートを構成する細胞内に凍害保護剤αが充分に浸透して、細胞中の凍害保護剤αの濃度上昇をほぼ頭打ちにすることができる。このように凍害保護剤αを充分に浸透させることにより、凍結時に細胞シートがひび割れたり、細胞生存率が低下することを抑制することができる。
なお、細胞シートの積層枚数（シート状細胞を重ねた枚数）が多いほど、細胞シート全体に凍害保護剤αを浸透させる時間は長くなるので、前記浸漬時間を長くすることが好ましい。
By immersing the cell sheet in the vitrification solution before freezing, the frost damage protective agent α can be permeated into the cells constituting the cell sheet. The immersion time is not particularly limited, and may be appropriately adjusted according to the type of cells constituting the cell sheet, the size of the cell sheet, or the type of the frost damage protective agent α, and may be, for example, 1 minute to 60 minutes. Moreover, the temperature at the time of this immersion will not be restrict | limited especially if the survival rate (viability) of the cell which comprises a cell sheet does not fall large, For example, the range of 15-39 degreeC is mentioned.
By immersing the cell sheet in the second vitrification solution for the above immersion time, the frost damage protective agent α sufficiently penetrates into the cells constituting the cell sheet, thereby increasing the concentration of the frost damage protective agent α in the cells. It can be almost flat. Thus, by sufficiently permeating the frost damage protective agent α, it is possible to prevent the cell sheet from cracking or the cell viability from being lowered during freezing.
In addition, since the time for which the frost damage protective agent α permeates the entire cell sheet becomes longer as the number of stacked cell sheets (the number of stacked sheet-like cells) increases, it is preferable to increase the immersion time.
細胞シートを第２のガラス化液で被覆する際、前記第１のガラス化液が入った容器に所要時間細胞シートを浸漬後、前記容器内の前記第１のガラス化液を除去して、前記第２のガラス化液に置換してもよい。 When the cell sheet is coated with the second vitrification solution, after immersing the cell sheet in a container containing the first vitrification solution for a required time, the first vitrification solution in the container is removed, The second vitrification liquid may be substituted.
特許文献１〜２に記載された細胞の凍結方法のように、浸漬状態の細胞シートを液体窒素中や液体窒素蒸気雰囲気中に置いた場合、大量のガラス化液を介して細胞シートを冷却するので、細胞シートの冷却速度が充分でなく、細胞内の水をガラス化させることが困難となり、細胞の生存率が低下する。さらに、ガラス化液が凍結する速度と細胞シートが凍結する速度とが異なるため、ガラス化液が凍結する過程で細胞シートに応力が加わる結果、細胞シートにひび割れや破れを生じさせることがある。また、凍結したガラス化液にクラックが入ると、内部の細胞シートにもひび割れや破れが生じてしまう。 When the immersed cell sheet is placed in liquid nitrogen or in a liquid nitrogen vapor atmosphere as in the method for freezing cells described in Patent Documents 1 and 2, the cell sheet is cooled via a large amount of vitrification solution. Therefore, the cooling rate of the cell sheet is not sufficient, it becomes difficult to vitrify the intracellular water, and the cell survival rate decreases. Furthermore, since the vitrification rate is different from the freezing rate of the cell sheet, stress may be applied to the cell sheet in the process of freezing the vitrification solution, resulting in cracking or tearing of the cell sheet. Moreover, when a crack enters into the frozen vitrification liquid, a crack and a tear will arise also in an internal cell sheet.
これに対して本発明では、予め前記ガラス化液で被覆された細胞シートを、液体窒素蒸気等の気相低温雰囲気中において急速に凍結させる。
ここで、「ガラス化液で被覆された細胞シート」とは、細胞シートをガラス化液中から取り出したときに、細胞シート表面がガラス化液に被覆されており、露出することがない状態をいう。
本発明では細胞シートをガラス化液中から取り出したときにガラス化液で被覆されているので、遜色なく細胞シートを急速に凍結することができるため、細胞内の水をガラス化させて凍結することが容易であり、細胞の生存率を高い水準で維持できる。また、凍結したガラス化液が細胞シートに加える応力は微々たるものであり、細胞シートにひび割れや破れが生じる大きな応力が加わることを防止することができる。このため、細胞シートを無傷の状態で凍結できる。
On the other hand, in the present invention, the cell sheet previously coated with the vitrification solution is rapidly frozen in a gas phase low temperature atmosphere such as liquid nitrogen vapor.
Here, the “cell sheet coated with vitrification solution” means a state in which the cell sheet surface is covered with vitrification solution and is not exposed when the cell sheet is taken out from the vitrification solution. Say.
In the present invention, since the cell sheet is coated with the vitrification solution when taken out from the vitrification solution, the cell sheet can be rapidly frozen without inferiority, so that the intracellular water is vitrified and frozen. And the cell viability can be maintained at a high level. In addition, the stress applied to the cell sheet by the frozen vitrification solution is very small, and it is possible to prevent the cell sheet from being subjected to a large stress that causes cracking or tearing. For this reason, the cell sheet can be frozen in an intact state.
細胞シートをガラス化液で被覆された状態を維持する方法は特に制限されず、例えば、ガラス板、金属板、メッシュ状の網、不織布等の台座の上に、細胞シートを載せて、余分なガラス化液を吸い取る若しくは落とすことによって、当該細胞シートをガラス化液で被覆された状態にできる。
さらに、第２のガラス化液に凍害保護剤βが含まれている場合、第２のガラス化液の粘性があるため、細胞シートを被覆しているガラス化液が必要以上に落ちることを防ぐことができる。
The method for maintaining the state in which the cell sheet is coated with the vitrification solution is not particularly limited. For example, the cell sheet is placed on a pedestal such as a glass plate, a metal plate, a mesh net, or a nonwoven fabric, and an excess amount is obtained. By sucking or dropping the vitrification solution, the cell sheet can be coated with the vitrification solution.
Furthermore, when the second vitrification liquid contains the frost damage protective agent β, the viscosity of the second vitrification liquid prevents the vitrification liquid covering the cell sheet from dropping more than necessary. be able to.
また、細胞シートをガラス化液で被覆された状態にする別の方法として、前記第１のガラス化液に浸漬後、前記第２のガラス化液に浸漬した細胞シートを樹脂製あるいは金属薄膜性の袋に入れ、袋内に細胞シートを保持したまま、細胞シートにダメージが加わらない程度に袋を扱いて、余分なガラス化液を袋から押し出す方法が挙げられる。図１は、細胞シート１を前記第２のガラス化液２と一緒に袋３内に入れ、前記第２のガラス化液２を押し出す様子を表したものである。図１中の矢印は、前記第２のガラス化液２が袋３の外に排出されることを表す。
この方法によれば、袋が細胞シートを支持できるので、当該細胞シートの取り扱いが容易になるので好ましい。当該細胞シートを凍結する際は、当該袋と共に凍結してもよいし、当該袋から取り出して当該細胞シートだけを凍らせてもよい。
As another method for making the cell sheet covered with the vitrification solution, the cell sheet immersed in the second vitrification solution after being immersed in the first vitrification solution is made of resin or metal thin film. And a method of extruding excess vitrification solution from the bag while holding the cell sheet in the bag and handling the bag to such an extent that the cell sheet is not damaged. FIG. 1 shows a state in which a cell sheet 1 is put in a bag 3 together with the second vitrification liquid 2 and the second vitrification liquid 2 is pushed out. An arrow in FIG. 1 represents that the second vitrification liquid 2 is discharged out of the bag 3.
According to this method, since the bag can support the cell sheet, it is preferable because the cell sheet can be easily handled. When freezing the cell sheet, it may be frozen together with the bag or may be taken out of the bag and frozen only the cell sheet.
本発明によって凍結される細胞シートを構成する細胞の種類は、シート状に成形しうるものであれば特に制限されない。例えば、軟骨細胞、滑膜細胞、上皮細胞、肝細胞、筋細胞等のヒトを含む動物由来の細胞からなるシートが挙げられる。これらの細胞シートは常法により作製できる。
前記細胞シートの厚さは特に制限されず、通常使用される厚さ（例えば１μｍ〜１０００μｍ）であれば、本発明によって、ひび割れや破れが無い無傷な状態又は実用上問題ない程度のひび割れが散見される状態で、当該細胞シートを凍結できる。
The type of cells constituting the cell sheet frozen according to the present invention is not particularly limited as long as it can be formed into a sheet shape. For example, the sheet | seat which consists of cells derived from animals including humans, such as a chondrocyte, a synovial cell, an epithelial cell, a hepatocyte, a muscle cell, is mentioned. These cell sheets can be prepared by a conventional method.
The thickness of the cell sheet is not particularly limited, and if it is a commonly used thickness (for example, 1 μm to 1000 μm), according to the present invention, an intact state with no cracks or tears or cracks to the extent that there is no practical problem is scattered. In this state, the cell sheet can be frozen.
前記ガラス化液で被覆された細胞シートを凍結する方法としては、−２０℃〜−２６９℃の気相雰囲気中に細胞シートを置いて急速に凍結できる方法であれば特に制限されない。例えば、ガラス板、金属板、メッシュ状の網、不織布等の台座（支持体）の上に前記ガラス化液で被覆された細胞シートを載せて、その台座及び細胞シートを液体窒素の液面の上方１ｃｍ〜１０ｃｍ程度に保持することによって、当該細胞シートを急速に凍結する方法が好ましい。この場合、前記台座はメッシュ状の網であることがより好ましい。
細胞シートをメッシュ状の網の上に置くことによって、余分なガラス化液は網下に落ちるので細胞シートには余分なガラス化液が付いておらず、凍結に適した状態の、ガラス化液に被覆された細胞シートを容易に得ることができる。この場合、ガラス化液に浸漬された状態の細胞シートを、細胞シートが破れないように秒速約約５ｃｍ以下の速度で引き上げて取り出し、網の上に置いた後、約３〜３０秒間保持してから、凍結することが好ましい。
秒速約５ｃｍ以下の速度で引き上げることにより、細胞シートが破れることを防ぐことができる。また、約３秒以上で保持することによって余分なガラス化液を落とすことがより確実になり、約３０秒以下で保持することによってガラス化液が無くなって細胞シートの表面が露出することを防ぐことができる。
前記網は、耐凍性及び熱伝導性の高い金属製の網であることがより好ましい。液体窒素の液面からの冷気が、前記金属製網の上に載せられた細胞シートに直接伝えられるので、より急速に凍結できる。この凍結方法において、凍結温度は、液体窒素の液面と台座との距離を調整することによって、より好ましい−８０℃〜−１８０℃に制御できる。
また、液体窒素から得られる低温の冷却用のガスを前記台座に載せられた細胞シートに吹き付けることによって、当該細胞シートを前記雰囲気中で急速に凍結させる方法又は前記台座に載せられた細胞シートを冷凍庫内に置いて急速に凍結させる方法も適用可能である。
The method for freezing the cell sheet coated with the vitrification solution is not particularly limited as long as the cell sheet can be rapidly frozen by placing it in a gas phase atmosphere of −20 ° C. to −269 ° C. For example, a cell sheet coated with the vitrification solution is placed on a pedestal (support) such as a glass plate, a metal plate, a mesh net, and a nonwoven fabric, and the pedestal and the cell sheet are placed on the liquid nitrogen surface. A method of rapidly freezing the cell sheet by holding the upper part at about 1 cm to 10 cm is preferable. In this case, the pedestal is more preferably a mesh net.
By placing the cell sheet on the mesh net, the excess vitrification solution falls under the net, so the cell sheet has no excess vitrification solution and is suitable for freezing. A cell sheet coated with can be easily obtained. In this case, the cell sheet immersed in the vitrification solution is taken out at a speed of about 5 cm or less per second so as not to break the cell sheet, placed on a net, and held for about 3 to 30 seconds. After that, it is preferable to freeze.
By pulling up at a speed of about 5 cm or less per second, the cell sheet can be prevented from being torn. In addition, it is more certain that the excess vitrification liquid is dropped by holding for about 3 seconds or more, and holding for about 30 seconds or less prevents the vitrification liquid from disappearing and exposing the surface of the cell sheet. be able to.
More preferably, the net is a metal net having high freezing resistance and thermal conductivity. Since the cold air from the liquid nitrogen surface is directly transmitted to the cell sheet placed on the metal net, it can be frozen more rapidly. In this freezing method, the freezing temperature can be controlled to a more preferable -80 ° C to -180 ° C by adjusting the distance between the liquid level of the liquid nitrogen and the pedestal.
Also, a method of rapidly freezing the cell sheet in the atmosphere by blowing a low-temperature cooling gas obtained from liquid nitrogen onto the cell sheet or a cell sheet placed on the pedestal A method of rapidly freezing in a freezer is also applicable.
本明細書及び特許請求の範囲において、「凍結する」とは、細胞内に氷晶が形成されないようにガラス化することだけを意味するものではなく、細胞内に少量の氷晶が形成されるように凍らせることも意味する。細胞内に氷晶を形成しないことが、細胞の生存率を高めて細胞シートの破損を防止する観点から好ましいが、細胞内に全く氷晶を形成させないことは実用上困難であることが多い。 In the present specification and claims, “freezing” does not only mean vitrification so that ice crystals are not formed in the cells, but a small amount of ice crystals are formed in the cells. It also means freezing. It is preferable not to form ice crystals in the cells from the viewpoint of increasing the cell survival rate and preventing the cell sheet from being damaged, but it is often difficult in practice to not form ice crystals in the cells at all.
前記雰囲気を構成する冷却用のガスを得る方法は特に制限されず、例えば、液体窒素（−１９６℃）、ドライアイス（−７９℃）、液体エタン（−１７５℃）、液体ヘリウム（−２６９℃）等の冷却体から発せられる冷気又はコンプレッサーで極低温に冷却した空気を、常温の空気と適宜混合して温度調整を行うことにより得る方法が挙げられる。 The method for obtaining the cooling gas constituting the atmosphere is not particularly limited. For example, liquid nitrogen (−196 ° C.), dry ice (−79 ° C.), liquid ethane (−175 ° C.), liquid helium (−269 ° C.). ) Or the like, or air that has been cooled to a very low temperature with a compressor, is appropriately mixed with room temperature air to adjust the temperature.
前記雰囲気の温度は、−２０℃〜−２６９℃であれば特に制限されないが、低い温度であるほど細胞シートを凍結する速度が速くなり、細胞内の水をガラス化させ易くなるので好ましい。具体的には、−７０℃〜−２６９℃が好ましく、−８０℃〜−１８０℃がより好ましい。また、冷却コストと冷却効率のバランスを考慮すると、前記温度の下限値は−１８０℃が好ましい。 The temperature of the atmosphere is not particularly limited as long as it is −20 ° C. to −269 ° C., but the lower the temperature, the faster the cell sheet is frozen, and it is preferable because the intracellular water is easily vitrified. Specifically, −70 ° C. to −269 ° C. is preferable, and −80 ° C. to −180 ° C. is more preferable. In consideration of the balance between the cooling cost and the cooling efficiency, the lower limit of the temperature is preferably −180 ° C.
前記雰囲気に細胞シートを置いて凍結させる時間は、細胞を凍結できる時間以上であれば特に制限されず、通常は１秒間〜１０分間で凍結を完了できる。 The time for freezing by placing the cell sheet in the atmosphere is not particularly limited as long as it is longer than the time that the cells can be frozen. Usually, the freezing can be completed in 1 second to 10 minutes.
前記台座の厚さは薄いほど熱伝導の効率が高くなり、当該台座に載せた細胞シートをより速く凍結できるので好ましい。具体的には、前記台座の厚さは、その種類にもよるが、０．１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましく、０．１ｍｍ〜５ｍｍがより好ましく、０．１ｍｍ〜１ｍｍがさらに好ましい。
上記範囲の下限値以上であると、細胞シートの重さを十分に支えることができる。上記範囲の上限値以下であると、細胞シートをより急速に凍結できる。
The thinner the pedestal, the higher the efficiency of heat conduction, which is preferable because the cell sheet placed on the pedestal can be frozen more quickly. Specifically, the thickness of the pedestal is preferably 0.1 mm to 10 mm, more preferably 0.1 mm to 5 mm, and still more preferably 0.1 mm to 1 mm, although it depends on the type.
The weight of a cell sheet can fully be supported as it is more than the lower limit of the said range. A cell sheet can be frozen more rapidly as it is below the upper limit of the said range.
本発明の製造方法で得られた凍結細胞シートは、凍害保護剤αが細胞内部に含浸され、凍害保護剤βが細胞表面に被覆されていることが好ましい。これらの凍害保護剤が凍結細胞シートを構成する細胞の内外を保護しているので、解凍時において、温度上昇に伴う細胞へのダメージを最小限に抑え、細胞の生存率を充分に保ちつつ、細胞シートにひび割れや破れが発生するのを抑制できる。 It is preferable that the frozen cell sheet obtained by the production method of the present invention is impregnated with the frost damage protective agent α inside the cell and the frost damage protective agent β is coated on the cell surface. Because these frost damage protective agents protect the inside and outside of the cells that make up the frozen cell sheet, at the time of thawing, while minimizing damage to the cells due to temperature rise, while maintaining sufficient cell viability, It is possible to suppress the occurrence of cracks and tears in the cell sheet.
＜凍結細胞シートの解凍方法＞
本発明の凍結細胞シートの解凍方法は、本発明の凍結細胞シートの製造方法によって得られた凍結細胞シートを気相中で解凍する方法である。
前記解凍する方法としては、凍結細胞シートを気相中で解凍できる方法であれば特に制限されず、例えば加温可能な板の上に凍結された細胞シートを置いて解凍する方法、ドライヤーや赤外線ヒーター等の温風を凍結細胞シートに吹き付けて解凍する方法、室温の空気中に静置する方法等が挙げられる。
一方、本発明の凍結細胞シートを凍結した状態のままで、培養液や生理的塩類溶液中に浸漬してしまうと、当該凍結細胞シートに多くのひび割れや破れが生じてしまう場合がある。
<Method of thawing frozen cell sheet>
The method for thawing a frozen cell sheet of the present invention is a method for thawing a frozen cell sheet obtained by the method for producing a frozen cell sheet of the present invention in a gas phase.
The thawing method is not particularly limited as long as it is a method capable of thawing a frozen cell sheet in a gas phase. For example, a method of thawing a frozen cell sheet on a heatable plate, a dryer or an infrared ray Examples thereof include a method of blowing hot air from a heater or the like on a frozen cell sheet and thawing, a method of leaving in air at room temperature, and the like.
On the other hand, if the frozen cell sheet of the present invention is kept in a frozen state and immersed in a culture solution or physiological salt solution, many cracks and tears may occur in the frozen cell sheet.
凍結細胞シートを解凍する気相の温度は、１５〜３９℃が好適である。この温度の下限値以上であると、短時間で解凍することができ、解凍プロセスに伴う細胞の生存率の低下を抑制できる。上限値以下であると、細胞にヒートショック・ストレスを与えることなく解凍できる。 The gas phase temperature for thawing the frozen cell sheet is preferably 15 to 39 ° C. When the temperature is equal to or higher than the lower limit of the temperature, thawing can be performed in a short time, and a decrease in cell viability associated with the thawing process can be suppressed. If it is below the upper limit, the cells can be thawed without applying heat shock or stress.
気相中で完全に解凍した凍結細胞シートは、生理的塩類溶液又は当該細胞シートを構成する細胞に適した培養液中に浸漬し、細胞内に浸透した凍害保護剤αや細胞シートを被覆しているガラス化液を除去する濯ぎ処理を行うことが好ましく、前記濯ぎ処理は、前記培養液に浸透圧調整剤を加え、浸透圧調整剤の濃度を漸次変えながら行うことが好ましい。前記濯ぎ処理後に、細胞シートを移植等の使用に供することができる。 The frozen cell sheet completely thawed in the gas phase is immersed in a physiological salt solution or a culture solution suitable for the cells constituting the cell sheet, and coated with the frost damage protective agent α and the cell sheet that have penetrated into the cell. It is preferable to perform a rinsing treatment for removing the vitrification solution, and the rinsing treatment is preferably performed while adding an osmotic pressure adjusting agent to the culture solution and gradually changing the concentration of the osmotic pressure adjusting agent. After the rinsing treatment, the cell sheet can be used for transplantation or the like.
以下、本発明を実施例及び比較例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
＜ウサギ膝軟骨細胞シートの作製方法＞
シャーレ形状をしたＵｐ Ｃｅｌｌ ｄｉｓｈ（底面の面積約８．８ｃｍ２，株式会社セルシード製温度感受性培養皿）を使用し、ウサギ膝軟骨の細胞シートを以下のようにして作製した。
（コラーゲン処理）
Ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ １−Ａ（新田ゼラチン株式会社製豚腱由来の酸可溶性コラーゲン溶液）に０．０２Ｎ酢酸溶液を加えコラーゲン濃度が５００μｇ／ｍＬとなるよう希釈した希釈コラーゲン溶液を用いて、前記培養皿の内面にコラーゲン処理を施した。すなわち、前記培養皿中に前記希釈コラーゲン溶液を１ｍＬ滴下したのち一面に拡げた。その培養皿を３７℃で１時間保持し、培養皿内面に残った希釈コラーゲン溶液を、スポイトを用いて吸出するとともに、吸い出し切れなかった残存希釈コラーゲン溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗い流すことによってコラーゲン処理された温度感受性培養皿を作製した。
（培養液の調製）
培養液は、下記成分を混合することにより調製した。
ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）：８９ｖｏｌ％、
ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）：１０ｖｏｌ％、
抗生物質溶液（５０００単位／ｍＬペニシリンＧと５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンの混合液）：１ｖｏｌ％、
アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社製）：１００μＭ
（培養方法）
前記コラーゲン処理を施した培養皿に、前記培養液を２ｍＬ入れてから３７℃に保持し、この中に、ウサギ膝軟骨細胞（株式会社プライマリーセル製）を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種し、炭酸ガス培養装置中、温度３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％、湿度９５±５％環境下でウサギ膝軟骨細胞がシート状となるまで約２週間培養した。
なお、培養期間中は、スポイトで培養皿内の培養液を吸出し、次に新しい培養液２ｍＬを補給するという培養液交換を１週間に２回の割合で行った。このようにして得られたウサギ膝軟骨培養細胞を光学顕微鏡で観察したところ、均一なシート状細胞が形成されていることが確認された。
次に、温度感受性培養皿からシート状細胞を剥離しやすくするためにシート状細胞が形成されている培養皿を２５℃で３０分間静置したのち、培養皿内の培養液をスポイトで吸出し、細胞の乾燥を防ぐため新たな培養液を１００μＬ加えた。
これと同様の工程を経て、全３枚のシート状細胞を用意した。
（シート状細胞の積層方法）
次に、Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒ（細胞シートの運搬補助膜、株式会社セルシード製）を、ピンセットを用いて気泡が入らないようにシート状細胞上に重ね、約５分間静置した。その後、シート状細胞とＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒが密着したこと確認し、ピンセットを用いて前記シート状細胞をＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒと共に取り出し、他の１つの培養皿中のシート状細胞と前記シート状細胞とが当接するように重ね合わせ、さらに同様の手順で残りの培養皿中のシート状細胞と重ね合わせることにより、三層シート構造の細胞を得、これを培養液中で１週間培養して、ウサギ膝軟骨からなる細胞シートとした。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example demonstrate this invention further in detail, this invention is not limited at all by these examples.
<Production method of rabbit knee chondrocyte sheet>
A cell sheet of rabbit knee cartilage was prepared as follows using a Petri-shaped Up Cell dish (bottom area of about 8.8 cm 2 , temperature-sensitive culture dish manufactured by Cellseed Co., Ltd.).
(Collagen treatment)
Cell culture Type 1-A (acid-soluble collagen solution derived from porcine tendon manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was added with 0.02N acetic acid solution and diluted with a diluted collagen solution to a collagen concentration of 500 μg / mL. Collagen treatment was applied to the inner surface of the dish. That is, 1 mL of the diluted collagen solution was dropped into the culture dish and then spread over the entire surface. The culture dish is kept at 37 ° C. for 1 hour, and the diluted collagen solution remaining on the inner surface of the culture dish is sucked out using a dropper, and the remaining diluted collagen solution that has not been sucked out is washed with phosphate buffered saline (PBS). A temperature-sensitive culture dish treated with collagen was prepared by rinsing twice.
(Preparation of culture solution)
The culture solution was prepared by mixing the following components.
RPMI 1640 medium (GIBCO): 89 vol%
Fetal bovine serum (manufactured by HyClone): 10 vol%,
Antibiotic solution (mixture of 5000 units / mL penicillin G and 5 mg / mL streptomycin): 1 vol%,
Ascorbic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.): 100 μM
(Culture method)
2 mL of the culture solution was added to the collagen-treated culture dish and maintained at 37 ° C., in which rabbit knee chondrocytes (manufactured by Primary Cell Co., Ltd.) were seeded at 5 × 10 4 cells / dish, The cells were cultured in a carbon dioxide culture apparatus under a temperature of 37 ± 1 ° C., a carbon dioxide concentration of 5 ± 1%, and a humidity of 95 ± 5% for about 2 weeks until the rabbit knee chondrocytes became a sheet.
During the culture period, the culture medium was exchanged twice a week by sucking out the culture medium in the culture dish with a dropper and then replenishing with 2 mL of a new culture medium. Observation of the rabbit knee cartilage cultured cells thus obtained with an optical microscope confirmed that uniform sheet-like cells were formed.
Next, in order to make it easy to detach the sheet-like cells from the temperature-sensitive culture dish, after leaving the culture dish on which the sheet-like cells are formed at 25 ° C. for 30 minutes, the culture solution in the culture dish is sucked out with a dropper, To prevent the cells from drying, 100 μL of a new culture solution was added.
Through the same process, three sheets of cells were prepared.
(Sheet cell stacking method)
Next, Cell Shifter (cell sheet transport auxiliary membrane, manufactured by Cellseed Co., Ltd.) was stacked on the sheet-like cells so as not to contain air bubbles using tweezers and allowed to stand for about 5 minutes. After that, it is confirmed that the sheet-like cell and the cell shifter are in close contact, and the sheet-like cell is taken out together with the cell shifter using tweezers so that the sheet-like cell in the other one culture dish comes into contact with the sheet-like cell. And then overlaying the sheet-like cells in the remaining culture dish by the same procedure to obtain a cell with a three-layer sheet structure, which is cultured in the culture medium for 1 week, and consists of rabbit knee cartilage A cell sheet was used.
＜ウサギ滑膜細胞との共培養によるウサギ膝軟骨細胞シートの作製方法＞
ウサギ膝軟骨細胞とウサギ滑膜細胞との共培養により、ウサギ膝軟骨細胞を以下のとおり作製した。
（培養方法）
上記培養方法において、ウサギ膝軟骨細胞に代えてウサギ滑膜細胞を使用したこと以外は同様の手順により、ウサギ滑膜細胞を培養皿に１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。
次に上記コラーゲン処理及び上記培養方法において、温度感受性培養皿に代えて温度応答性インサート（株式会社セルシード製）を使用した以外は同様の手順により、コラーゲン処理を施した温度応答性インサート内に培養液を２ｍＬ入れてから３７℃に保持し、この中に、ウサギ膝軟骨細胞（株式会社プライマリーセル製）を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種した。
その後、前記ウサギ滑膜細胞を播種した培養皿の培養液中に前記培養皿の底面から離間した位置に前記ウサギ膝軟骨細胞を播種した温度応答性インサートを配置し、炭酸ガス培養装置中、温度３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％、湿度９５±５％環境下で細胞がシート状となるまで約１週間共培養した。この状態で培養することにより、培養皿の底面のウサギ滑膜細胞と、前記温度応答性インサート上のウサギ膝軟骨細胞とは、物理的な接触は無いものの同じ培養液中で培養されているため、各細胞が細胞外に分泌する液性因子によって互いに影響を与えうる。具体的には、両細胞の成長速度（分裂速度）が速まり、シートの形成速度が速めることができた。なお、共培養期間中は、温度応答性インサート内の培養液を吸出し、次に新しい培養液２ｍＬを補給するという培養液交換を１週間に２回の割合で行った。このようにして得られた温度応答性インサート内のウサギ膝軟骨培養細胞を光学顕微鏡で観察したところ、均一なシート状細胞が形成されていることが確認された。
次に前記培養皿を炭酸ガス培養装置から取り出し、２５℃で３０分間静置した後、温度応答性インサート内の培養液をスポイトで吸出し、細胞の乾燥を防ぐため新たな培養液を温度応答性インサート内に１００μＬ加えた。
これと同様の工程を経て、全３枚のシート状のウサギ膝軟骨細胞を用意した。
（シート状細胞の積層方法）
次に、ＰＶＤＦ膜（細胞シートの運搬補助膜、株式会社セルシード製）を、ピンセットを用いてシート状細胞上に重ね、約５分間静置した。その後、シート状細胞とＰＶＤＦ膜が密着したこと確認し、ピンセットを用いて前記シート状細胞をＰＶＤＦ膜と共に取り出し、他の１つの培養皿中のシート状細胞と前記シート状細胞とが当接するように重ね合わせ、さらに同様の手順で残りの培養皿中のシート状細胞と重ね合わせることにより、三層シート構造の細胞を得、これを培養液中で１週間培養して、ウサギ膝軟骨からなる細胞シートとした。
<Method for producing rabbit knee chondrocyte sheet by co-culture with rabbit synovial cells>
Rabbit knee chondrocytes were prepared as follows by co-culture of rabbit knee chondrocytes and rabbit synoviocytes.
(Culture method)
In the above culture method, rabbit synovial cells were seeded at 1 × 10 4 cells / cm 2 in a culture dish by the same procedure except that rabbit synovial cells were used instead of rabbit knee chondrocytes.
Next, in the collagen treatment and the culture method described above, culture was carried out in the temperature-responsive insert subjected to collagen treatment by the same procedure except that a temperature-responsive insert (manufactured by Cellseed Co., Ltd.) was used instead of the temperature-sensitive culture dish. 2 mL of the solution was added and maintained at 37 ° C., and rabbit knee chondrocytes (manufactured by Primary Cell Co., Ltd.) were seeded therein at 5 × 10 4 cells / dish.
Thereafter, a temperature-responsive insert seeded with the rabbit knee chondrocytes is placed in a culture medium of the culture dish seeded with the rabbit synovial cells at a position spaced from the bottom surface of the culture dish, The cells were co-cultured in a 37 ± 1 ° C., carbon dioxide concentration of 5 ± 1%, and a humidity of 95 ± 5% for about 1 week until the cells became a sheet. By culturing in this state, the rabbit synovial cells on the bottom of the culture dish and the rabbit knee chondrocytes on the temperature-responsive insert are cultured in the same culture solution, although there is no physical contact. Each cell can affect each other by humoral factors secreted outside the cell. Specifically, the growth rate (division rate) of both cells was increased, and the sheet formation rate was increased. During the co-culture period, the culture medium was exchanged twice a week by sucking out the culture medium in the temperature-responsive insert and then supplying 2 mL of a new culture medium. When the rabbit knee cartilage cultured cells in the temperature-responsive insert thus obtained were observed with an optical microscope, it was confirmed that uniform sheet-like cells were formed.
Next, the culture dish is taken out from the carbon dioxide culture apparatus and allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes. Then, the culture medium in the temperature-responsive insert is sucked out with a dropper, and a new culture medium is temperature-responsive to prevent the cells from drying. 100 μL was added into the insert.
Through the same process, three sheets of rabbit knee chondrocytes were prepared.
(Sheet cell stacking method)
Next, a PVDF membrane (cell sheet transport auxiliary membrane, manufactured by Cellseed Co., Ltd.) was stacked on the sheet-like cells using tweezers and allowed to stand for about 5 minutes. Thereafter, it is confirmed that the sheet-like cell and the PVDF membrane are in close contact, and the sheet-like cell is taken out together with the PVDF membrane using tweezers so that the sheet-like cell in the other one culture dish and the sheet-like cell come into contact with each other. And then overlaying the sheet-like cells in the remaining culture dish by the same procedure to obtain a cell with a three-layer sheet structure, which is cultured in the culture medium for 1 week, and consists of rabbit knee cartilage A cell sheet was used.
以下では、特に区別の必要がない限り、上記ウサギ膝軟骨細胞シートの作製方法又は滑膜細胞との共培養によるウサギ膝軟骨細胞シートの作製方法により作製した、Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒ又はＰＶＤＦ膜に載置された状態のウサギ膝軟骨からなる細胞シートを、単に「細胞シート」と呼ぶ。 In the following, unless otherwise required, it is placed on a Cell Shifter or PVDF membrane prepared by the above-described method for preparing a rabbit knee chondrocyte sheet or a method for preparing a rabbit knee chondrocyte sheet by co-culture with synoviocytes. A cell sheet made of a rabbit knee cartilage in a state of stagnation is simply referred to as a “cell sheet”.
＜ガラス化液の構成成分＞
細胞浸透性の凍害保護剤αとして、エチレングリコール（分子量６２）とＤＭＳＯを１：１の体積比となるように混合調製したものを用いた。
非細胞浸透性の凍害保護剤βとして、ポリリジン（ＰＬＬ）をカルボキシル化したもの（分子量１，０００〜２０，０００、ＰＬＬのアミノ基の６５％をカルボキシル基に置換したもの）を用いた。
浸透圧調整剤として、スクロース（分子生物学用、和光純薬工業株式会社製）を用いた。
血清として、ウシ胎児血清（ＳＡＦＣ社製）を用いた。
前記凍害保護剤α、前記凍害保護剤β、前記浸透圧調整剤及び前記血清を溶解あるいは希釈する媒体（培地）として、ＴＣＭ１９９溶液を用いた。
前記ＴＣＭ１９９溶液は、以下のようにして調製した。
９．８ｇの１９９培地（日水製薬株式会社製、粉末組織培地）
を蒸留水１Ｌに溶解させ、
５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴加し、ｐＨを７．２〜７．４に調整したものに、
０．０７５ｇのペニシリンＧカリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、
０．０５ｇのストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、
４．７６６ｇのＨＥＰＥＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、
０．３５ｇの炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）
を溶解させ、孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（日本ミリポア株式会社製）を用いて加圧ろ過した。
<Constituent components of vitrification solution>
As the cell-permeable frost damage protective agent α, a mixture prepared by mixing ethylene glycol (molecular weight 62) and DMSO at a volume ratio of 1: 1 was used.
As the non-cell permeable frost damage protective agent β, polylysine (PLL) carboxylated (molecular weight 1,000 to 20,000, 65% of PLL amino groups substituted with carboxyl groups) was used.
As the osmotic pressure adjusting agent, sucrose (for molecular biology, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
As the serum, fetal bovine serum (SAFC) was used.
A TCM199 solution was used as a medium (medium) for dissolving or diluting the frost damage protective agent α, the frost damage protective agent β, the osmotic pressure adjusting agent, and the serum.
The TCM199 solution was prepared as follows.
9.8 g of 199 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., powdered tissue medium)
Is dissolved in 1 L of distilled water,
5N sodium hydroxide aqueous solution was added dropwise to adjust the pH to 7.2-7.4.
0.075 g of penicillin G potassium (manufactured by Sigma-Aldrich),
0.05 g streptomycin sulfate (manufactured by Sigma-Aldrich),
4.766 g of HEPES (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid, manufactured by Sigma-Aldrich),
0.35 g sodium hydrogen carbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Was dissolved under pressure using a membrane filter (manufactured by Nippon Millipore Co., Ltd.) having a pore diameter of 0.22 μm.
［実施例１］
（ガラス化液の調製）
第１のガラス化液Ａは、下記成分を混合することにより、調製した。
細胞浸透性の凍害保護剤α：２．００ｍＬ
血清：２．００ｍＬ
ＴＣＭ１９９溶液：６．００ｍＬ
尚、調製した第１のガラス化液Ａ中の凍害保護剤αの濃度は２０ｖｏｌ％である。
第２のガラス化液Ｂは、下記成分を混合することにより、調製した。
細胞浸透性の凍害保護剤α：４．００ｍＬ
非細胞浸透性の凍害保護剤β：１．００ｇ
浸透圧調整剤：１．７１ｇ
血清：２．００ｍＬ
ＴＣＭ１９９溶液：４．００ｍＬ
尚、調製した第２のガラス化液中Ｂの凍害保護剤βの濃度は１０ｗ/ｖ％である。
[Example 1]
(Preparation of vitrification solution)
The first vitrification liquid A was prepared by mixing the following components.
Cell-penetrating frost protection agent α: 2.00 mL
Serum: 2.00 mL
TCM199 solution: 6.00mL
In addition, the density | concentration of the frost damage protective agent (alpha) in the prepared 1st vitrification liquid A is 20 vol%.
The second vitrification liquid B was prepared by mixing the following components.
Cell-penetrating frost protection agent α: 4.00 mL
Non-cell penetrant frost damage protective agent β: 1.00 g
Osmotic pressure regulator: 1.71 g
Serum: 2.00 mL
TCM199 solution: 4.00mL
In addition, the density | concentration of the frost damage protective agent (beta) of B in the prepared 2nd vitrification liquid is 10 w / v%.
（細胞シートのガラス化液被覆）
上記第１のガラス化液Ａ（５ｍＬ）をシャーレ形状のプラスチックディッシュ（底面の面積約８．８ｃｍ２）に入れたものを２つ用意した。
同様に、上記第２のガラス化液Ｂ（５ｍＬ）をシャーレ形状のプラスチックディッシュ（底面の面積約８．８ｃｍ２）に入れたものを２つ用意した。
ウサギ膝軟骨細胞シートの作製方法によって作製したウサギ膝軟骨の細胞シート（面積約８ｃｍ２）を、Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒと共に前記培養皿から取り出し、前記プラスチックディッシュに入れた前記第１のガラス化液Ａ中に、２５℃で５分間浸漬して、細胞シートに付着している培養液を希釈した。
次に前記細胞シートを、別途用意した前記プラスチックディッシュに入れたガラス化液Ａ中にＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒと共に移して２５℃で１５分間浸漬して、第１のガラス化液処理をした。
その後、前記細胞シートをプラスチックディッシュに入れた第２のガラス化液Ｂ中にＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒと共に移して４℃で５分間浸漬して、細胞シートに付着している第１のガラス化液Ａを希釈除去した。
その後、別途用意したプラスチックディッシュに入れた第２のガラス化液Ｂ中にＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒと共に移して４℃で２０分間浸漬して、第２のガラス化液処理をした。
この細胞シートをメッシュ状の金属製網の上にＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒが網に面するように載せ、余分なガラス化液を金属製網の下に落として除去し、第２のガラス化液で被覆された細胞シートを得た。
(Cell sheet vitrification coating)
Two pieces prepared by putting the first vitrification liquid A (5 mL) in a petri dish-shaped plastic dish (the area of the bottom surface of about 8.8 cm 2 ) were prepared.
Similarly, two pieces of the above-mentioned second vitrification solution B (5 mL) were prepared in a petri dish-shaped plastic dish (bottom surface area approximately 8.8 cm 2 ).
A rabbit knee cartilage cell sheet (area: about 8 cm 2 ) prepared by the method for preparing a rabbit knee chondrocyte sheet was taken out of the culture dish together with Cell Shifter and placed in the first vitrification solution A placed in the plastic dish. The culture solution adhering to the cell sheet was diluted by immersing at 25 ° C. for 5 minutes.
Next, the cell sheet was transferred together with Cell Shifter into a vitrification solution A placed in the separately prepared plastic dish, and immersed at 25 ° C. for 15 minutes to perform a first vitrification solution treatment.
Thereafter, the cell sheet is transferred to a second vitrification solution B in a plastic dish together with a cell shifter and immersed at 4 ° C. for 5 minutes to dilute the first vitrification solution A adhering to the cell sheet. Removed.
Then, it moved with Cell Shifter in the 2nd vitrification liquid B put into the plastic dish prepared separately, and was immersed for 20 minutes at 4 ° C, and performed the 2nd vitrification liquid treatment.
This cell sheet is placed on a mesh-like metal net so that the cell shifter faces the net, and the excess vitrification solution is dropped under the metal net to be removed and coated with a second vitrification solution. A cell sheet was obtained.
（凍結）
続いて、この金属製網を前記細胞シートごと液体窒素５００ｍＬが入った容積１Ｌ容器内、液体窒素の液面から約１ｃｍの高さで１分間保持した。このときの液体窒素の液面から約１ｃｍの高さの温度を熱電対を用いて測定したところ、約−１３５〜−１０５℃の範囲であった。
この結果、液体窒素の冷気によって細胞シートを急速にガラス化させ、凍結細胞シートを得ることができた。この凍結過程において、細胞シートにひび割れや破れは生じなかった。（図２）
(Freezing)
Then, this metal net | network was hold | maintained for 1 minute at the height of about 1 cm from the liquid level of liquid nitrogen in a 1 L container with a volume of 500 mL of liquid nitrogen containing the said cell sheet. When the temperature of about 1 cm from the liquid surface of the liquid nitrogen at this time was measured using a thermocouple, it was in the range of about −135 to −105 ° C.
As a result, the cell sheet was vitrified rapidly with cold liquid nitrogen, and a frozen cell sheet could be obtained. During this freezing process, the cell sheet was not cracked or torn. (Figure 2)
［実施例２］
下記成分を混合することにより調製した融解後濯ぎ液ａ（１０ｍＬ）をシャーレ形状のプラスチックディッシュ（底面の面積約８．８ｃｍ２）に入れたものを用意した。
・浸透圧調整剤：３．４２ｇ
・血清：２．００ｍＬ
・ＴＣＭ１９９溶液：８．００ｍＬ
下記成分を混合することにより調製した融解後濯ぎ液ｂ（１０ｍＬ）をシャーレ形状のプラスチックディッシュ（底面の面積約８．８ｃｍ２）に入れたものを用意した。
・浸透圧調整剤：１．７１ｇ
・血清：２．００ｍＬ
・ＴＣＭ１９９溶液：８．００ｍＬ
下記成分を混合することにより調製した融解後濯ぎ液ｃ（１０ｍＬ）をシャーレ形状のプラスチックディッシュ（底面の面積約８．８ｃｍ２）に入れたものを用意した。
・血清：２．００ｍＬ
・ＴＣＭ１９９溶液：８．００ｍＬ
実施例１で得られた凍結細胞シートを、金属製網ごと３８．５℃に加温したステンレス製加温プレート上に移し、約３８℃の空気中で１分間静置して急速に解凍した。その後プラスチックディッシュに入れた前記融解後濯ぎ液ａに、金属製網に載せた状態の細胞シートを浸し、ピンセットを用いてゆっくりと動かすことにより、細胞シートを被覆していたガラス化液を除去した。その後、細胞シートを前記プラスチックディッシュに入れた前記融解後濯ぎ液ｂに移し、３分間浸した後、同じ要領でプラスチックディッシュに入れた前記融解後濯ぎ液ｃに５分間、さらに別途用意したプラスチックディッシュに入れた前記融解後濯ぎ液ｃに５分間浸し、段階的にガラス化液の濯ぎ処理を行った。この濯ぎ処理を終えた細胞シートにひび割れや破れは生じなかった。
なお、凍結以後の細胞シートには常にCell Shifter又はPVDF膜が付いた状態で処理を行った。
[Example 2]
A thawing rinse solution a (10 mL) prepared by mixing the following components was placed in a petri dish-shaped plastic dish (bottom area of about 8.8 cm 2 ).
・ Osmotic pressure regulator: 3.42 g
・ Serum: 2.00 mL
-TCM199 solution: 8.00mL
A thawing rinse b (10 mL) prepared by mixing the following components was put in a petri dish-shaped plastic dish (bottom area of about 8.8 cm 2 ).
・ Osmotic pressure regulator: 1.71 g
・ Serum: 2.00 mL
-TCM199 solution: 8.00mL
A melted rinsing solution c (10 mL) prepared by mixing the following components was placed in a petri dish-shaped plastic dish (bottom area of about 8.8 cm 2 ).
・ Serum: 2.00 mL
-TCM199 solution: 8.00mL
The frozen cell sheet obtained in Example 1 was transferred onto a stainless steel heating plate heated to 38.5 ° C. together with the metal mesh, and left to stand in air at about 38 ° C. for 1 minute to rapidly thaw. . Thereafter, the cell sheet in a state of being placed on a metal net was immersed in the rinsing solution a after melting in a plastic dish, and the vitreous solution that had covered the cell sheet was removed by slowly moving it using tweezers. . Thereafter, the cell sheet is transferred to the thawing rinsing solution b in the plastic dish, soaked for 3 minutes, and then further prepared in the rinsing rinsing solution c in the plastic dish in the same manner for 5 minutes. The glass melt was immersed in the rinse solution c after melting for 5 minutes, and the vitrification solution was rinsed stepwise. The cell sheet after the rinsing process did not crack or tear.
The cell sheet after freezing was always treated with a Cell Shifter or PVDF membrane attached.
得られた細胞シート内の細胞の生存率を調べるため、濯ぎ処理を終えた細胞シートを、さらにリン酸緩衝生理食塩水で２回濯ぎ、融解後濯ぎ液を除去し、さらにピンセットを用いて細胞シートをＣｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒから剥離させ、それをコラゲナーゼ（新田ゼラチン株式会社製）を培養液に２ｍｇ／ｍＬとなるよう混合したコラゲナーゼ溶液に入れて細胞シートを構成する細胞同士を分散させ、その溶液約１ｍｌを、ほぼ同量のトリパンブルーの０．３（ｗ／ｖ）％ＰＢＳ溶液を用いて染色し、常法により細胞生存率を調べたところ、細胞生存率は９０％以上であった。 In order to examine the viability of the cells in the obtained cell sheet, the rinsed cell sheet was further rinsed twice with phosphate buffered saline, the rinsing solution was removed after thawing, and the cells were further removed using tweezers. The sheet is peeled off from the cell shifter, and it is placed in a collagenase solution in which collagenase (Nitta Gelatin Co., Ltd.) is mixed with the culture solution so as to be 2 mg / mL, and the cells constituting the cell sheet are dispersed. 1 ml was stained with approximately the same amount of a trypan blue 0.3 (w / v)% PBS solution, and the cell viability was examined by a conventional method. The cell viability was 90% or more.
実施例１及び２の再現性を調べるために、同様の方法で、６枚の細胞シートの凍結及び解凍をしたところ、凍結過程及び解凍過程で細胞シートにひび割れや破れは生じず、その細胞生存率は何れも９０％以上であった。
また、上記共培養法によって作製したウサギ膝軟骨の細胞シートを用いて、同様に細胞シートの凍結及び解凍を行った場合でも、図２(a)に示すように凍結過程及び解凍過程で細胞シートにひび割れや破れは生じなかった。
In order to examine the reproducibility of Examples 1 and 2, when 6 cell sheets were frozen and thawed in the same manner, the cell sheets were not cracked or torn during the freezing and thawing processes, and the cell survival. All the rates were 90% or more.
Moreover, even when the cell sheet of the rabbit knee cartilage prepared by the above co-culture method is similarly used for freezing and thawing, the cell sheet is frozen and thawed as shown in FIG. 2 (a). There were no cracks or tears.
［比較例１］
実施例１と同様の方法でガラス化液で被覆された細胞シートを、Cell Shifter又はPVDF膜が付いた状態で金属製網の上に置き、液体窒素の液中に投入して、１分間保持した後、取り出した。得られた細胞シートには図３に示すようにひび割れや破れが生じていた。この細胞シートを実施例２と同様の方法で解凍したところ、細胞シートには多数のひび割れや割れが生じており、移植等に使用できない破損状態であった。
凍結時に、液体窒素が沸騰したことによる大量の気泡によって、金属製網へ沸騰の振動が伝わったことから、細胞シートへ物理的な応力が加わって破損したと考えられる。
[Comparative Example 1]
A cell sheet coated with a vitrification solution by the same method as in Example 1 is placed on a metal net with a Cell Shifter or PVDF membrane attached, placed in a liquid nitrogen solution, and held for 1 minute. And then removed. The obtained cell sheet was cracked or torn as shown in FIG. When this cell sheet was thawed by the same method as in Example 2, the cell sheet had many cracks and cracks, and was in a damaged state that could not be used for transplantation or the like.
When freezing, the vibration of boiling was transmitted to the metal net by a large amount of bubbles due to the boiling of liquid nitrogen, and it was thought that the cell sheet was damaged due to physical stress.
［比較例２］
実施例１と同様の方法で得られた、Cell Shifter又はPVDF膜が付いた状態の凍結細胞シートを、凍結した状態のままで前記プラスチックディッシュに入れた前記融解後濯ぎ液ａ（３７℃）中に投入して解凍した。得られた細胞シートにはひび割れや破れが生じており、移植等に使用できない状態であった。
[Comparative Example 2]
In the post-thaw rinsing solution a (37 ° C.), the frozen cell sheet with the Cell Shifter or PVDF membrane obtained in the same manner as in Example 1 was placed in the plastic dish in a frozen state. And thawed. The obtained cell sheet was cracked or torn and was in a state where it could not be used for transplantation or the like.
［実施例３］
第２のガラス化液Ｃは、下記成分を混合することにより、調製した。
細胞浸透性の凍害保護剤α：４．００ｍＬ
浸透圧調整剤：１．７１ｇ
血清：２．００ｍＬ
ＴＣＭ１９９溶液：４．００ｍＬ
尚、調製した第２のガラス化液Ｃ中の凍害保護剤αの濃度は４０ｖｏｌ％である。
第２のガラス化液Ｂに代えて、第２のガラス化液Ｃを用いた以外は実施例１と同様の方法で、細胞シートをガラス化させた。この凍結過程において、細胞シートには細かいひび割れが少し観察された。
[Example 3]
The second vitrification liquid C was prepared by mixing the following components.
Cell-penetrating frost protection agent α: 4.00 mL
Osmotic pressure regulator: 1.71 g
Serum: 2.00 mL
TCM199 solution: 4.00mL
In addition, the density | concentration of the frost damage protective agent (alpha) in the prepared 2nd vitrification liquid C is 40 vol%.
The cell sheet was vitrified in the same manner as in Example 1 except that the second vitrification liquid C was used instead of the second vitrification liquid B. During this freezing process, small cracks were observed in the cell sheet.
［実施例４］
実施例３で得られた、Cell Shifter又はPVDF膜が付いた状態の凍結細胞シートを、実施例２と同様の方法で解凍させた。ガラス化液の濯ぎ処理を終えた細胞シートには細かいひび割れが少し観察されたが、大きな破れは生じなかった。また、その細胞生存率は８０〜９０％以上であった。
[Example 4]
The frozen cell sheet with the Cell Shifter or PVDF membrane obtained in Example 3 was thawed by the same method as in Example 2. A small amount of fine cracks was observed in the cell sheet after rinsing with the vitrification solution, but no major tearing occurred. Moreover, the cell survival rate was 80 to 90% or more.
［参考例１］
樹脂製の透明なストロー（直径５ｍｍ、樹脂厚さ約０．５ｍｍ）内に、
細胞浸透性の凍害保護剤α：３．５０ｍＬ
ＴＣＭ１９９溶液：６．５０ｍＬ
を混合したものを調製することにより得た溶液約０．５ｍＬを吸い込み、前記溶液を吸い込んだストローを液体窒素中に投入し、１分間保持した。この結果、前記溶液は薄く白濁した状態で凍結した。また、凍結した溶液中にはひび割れが見られた。
次に、
細胞浸透性の凍害保護剤α：３．５０ｍＬ
非細胞浸透性の凍害保護剤β：０．７５ｇ
ＴＣＭ１９９溶液：６．５０ｍＬ
を混合したものを調製することにより得た溶液を、同じ要領で液体窒素中に投入し、凍結させた。この結果、前記溶液は殆ど白濁せず、ひび割れも生じずに、ガラス化状態となった。
これらの結果から、凍害保護剤βを含むガラス化液の方が、細胞シートをガラス化するためにより適していることが明らかである。
[Reference Example 1]
In a transparent straw made of resin (diameter 5 mm, resin thickness approximately 0.5 mm),
Cell penetrant frost damage protective agent α: 3.50 mL
TCM199 solution: 6.50 mL
About 0.5 mL of the solution obtained by preparing the mixture was sucked, and the straw sucked with the solution was put into liquid nitrogen and held for 1 minute. As a result, the solution was frozen in a thin and cloudy state. In addition, cracks were observed in the frozen solution.
next,
Cell penetrant frost damage protective agent α: 3.50 mL
Non-cell permeable frost damage protective agent β: 0.75 g
TCM199 solution: 6.50 mL
A solution obtained by preparing a mixture of was put into liquid nitrogen in the same manner and frozen. As a result, the solution became almost vitrified and was not vitrified, and became a vitrified state.
From these results, it is clear that the vitrification solution containing the frost damage protective agent β is more suitable for vitrifying the cell sheet.
本発明の凍結細胞シートの製造方法は、再生医療の分野等で広く利用可能である。 The method for producing a frozen cell sheet of the present invention can be widely used in the field of regenerative medicine.
１…細胞シート、２…ガラス化液、３…袋 1 ... cell sheet, 2 ... vitrification solution, 3 ... bag
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