JP5906519B2 - Protein separation method by two-dimensional electrophoresis - Google Patents
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Description
本発明は、二次元電気泳動を用いて複数種類の蛋白質を各々の蛋白質に分離する方法に関する。 The present invention relates to a method for separating a plurality of types of proteins into respective proteins using two-dimensional electrophoresis.
主要な生命現象を担っている蛋白質発現又は翻訳後修飾等を解析する技術としてプロテオミクスが注目されている。例えば、生命現象を司るシグナル伝達系にどのような遺伝子が関わっているかを明らかにするためにｃＤＮＡマイクロアレイを用いた解析方法が開発されている。 Proteomics is attracting attention as a technique for analyzing protein expression or post-translational modifications that are responsible for major life phenomena. For example, an analysis method using a cDNA microarray has been developed in order to clarify what genes are involved in the signal transduction system that controls biological phenomena.
しかしながら、このような解析方法では、例えば転写因子というように細胞小器官に存在し、極微量の発現で機能的に働く蛋白質を検出することができないため、かかる微量の蛋白質を検出するための技術として二次元電気泳動が開発されている。 However, in such an analysis method, for example, a transcription factor is present in an organelle and cannot detect a protein that functions functionally with a very small amount of expression. Therefore, a technique for detecting such a very small amount of protein. Two-dimensional electrophoresis has been developed.
二次元電気泳動は、適宜の方法により調製した試料溶液中に混在する複数種類の蛋白質について、ｐＨ勾配等電点電気泳動用のストリップゲルを用いて各蛋白質が有する等電点の位置へ移動させることによって一次元目の分解を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の平板ゲルを用いて前記一次元の移動方向と直交する方向へ各蛋白質を、その分子量に応じてそれぞれ移動させることによって二次元目の分解を行うものである。かかる二次元電気泳動を用いることによって、試料中に混在する複数種類の蛋白質を各々高精度に分離することができる。 In two-dimensional electrophoresis, a plurality of types of proteins mixed in a sample solution prepared by an appropriate method are moved to the isoelectric point of each protein using a strip gel for pH gradient isoelectric focusing. After the first dimension decomposition, each protein is moved in the direction orthogonal to the one-dimensional movement direction by using a slab gel for SDS-PAGE to move the second dimension according to the molecular weight. Is to be decomposed. By using such two-dimensional electrophoresis, it is possible to separate each of a plurality of types of proteins mixed in a sample with high accuracy.
しかし、調節因子というように対象細胞内に極微量しか存在しない蛋白質を従来の方法によって分離する場合、前処理を行って調製した試料溶液であっても、当該試料溶液中に多量の夾雑物が混入しているため、その夾雑物によって前述した一次元目の分解が阻害され、結果として二次元目の電気泳動を行っても目的の蛋白質を分離できないという問題があった。なお、二次元電気泳動は、一次元目及び二次元目の電気泳動を行った後に蛋白質を染色して可視化するという操作手順で実施するので、夾雑物によって一次元目の分解が阻害されていたとしても二次元目の電気泳動を実施しなければならず、時間的な損害及び両電気泳動操作に要する資材の損害が甚大である。 However, when a protein such as a regulatory factor that is present in a very small amount in a target cell is separated by a conventional method, even if the sample solution is prepared by pretreatment, a large amount of contaminants is present in the sample solution. As a result of the contamination, the first-dimensional degradation described above is hindered by the contaminants, and as a result, there is a problem that the target protein cannot be separated even by performing the second-dimensional electrophoresis. In addition, since the two-dimensional electrophoresis is performed by an operation procedure in which the protein is stained and visualized after the first and second dimensions of electrophoresis, the first-dimension degradation is inhibited by the contaminants. However, the second-dimensional electrophoresis must be carried out, and the time damage and the material damage required for both electrophoresis operations are significant.
そのため、例えば後記する特許文献１には次のような方法が開示されている。
すなわち、前述した一次元目に用いるストリップゲルの濃度を２％Ｔまでの低濃度範囲になすとともに、当該ストリップゲルをナイロン系糸状体で一体的に支持させておく。そして、このゲルを用いて等電点電気泳動を行うのである。
Therefore, for example,
That is, the concentration of the strip gel used in the first dimension is set to a low concentration range of up to 2% T, and the strip gel is integrally supported by a nylon thread. Then, isoelectric focusing is performed using this gel.
このように低濃度範囲に調製されたストリップゲルを用いて一次元目の電気泳動を行った場合、試料溶液中の蛋白質のみならず夾雑物についても当該ストリップゲル中での移動が改善されるため、当該夾雑物による蛋白質の移動阻害も改善されるのである。 When the first-dimensional electrophoresis is performed using a strip gel prepared in such a low concentration range, not only the protein in the sample solution but also the impurities in the strip gel are improved. In addition, the protein migration inhibition by the impurities is also improved.
しかしながら、前述した方法にあっては、試料溶液中に混入した夾雑物のストリップゲル中での移動を改善することによって相対的に夾雑物による蛋白質の移動阻害を改善するだけであるので、混入した夾雑物が多量に存在する場合は当該夾雑物による蛋白質の移動阻害を十分に改善することはできない。また、ストリップゲルの濃度は至適な分解能を得るために、分析対象の各蛋白質の分子量を考慮した適宜の値に定める必要があるので、従来方法のように２％Ｔまでの低濃度範囲になしたストリップゲルを用いた場合、至適な分解能を得ることができない場合があるという問題もあった。 However, in the above-described method, since the migration of the contaminants mixed in the sample solution only improves the protein migration inhibition by the contaminants relatively, the contamination is mixed. When impurities are present in a large amount, inhibition of protein migration by the impurities cannot be sufficiently improved. In addition, in order to obtain the optimum resolution, it is necessary to set the concentration of the strip gel to an appropriate value in consideration of the molecular weight of each protein to be analyzed. Therefore, the concentration is as low as 2% T as in the conventional method. When the strip gel made is used, there is a problem that an optimum resolution may not be obtained.
本発明は斯かる事情に鑑みてなされたものであって、多量の夾雑物が混入している場合であっても複数種類の蛋白質から目的の蛋白質を所要の分解能で分離することができる二次元電気泳動による蛋白質の分離方法を提供する。 The present invention has been made in view of such circumstances, and is capable of separating a target protein from a plurality of types of proteins with a required resolution even when a large amount of contaminants are mixed. A method for separating proteins by electrophoresis is provided.
（１）本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法は、ストリップゲル内に複数種類の蛋白質を導入する蛋白質導入工程と、各蛋白質が導入されたストリップゲルに予め定めた定電圧を印加する定電圧印加ステップを行った後に、印加電圧を漸次上昇させてストリップゲル内の各蛋白質を泳動させる一次電気泳動工程と、前記ストリップゲルを平板ゲルの所定位置に配置し、当該平板ゲル及びストリップゲルに適宜の電力を与えてストリップゲル内の各蛋白質を平板ゲル内で泳動させる二次電気泳動工程とをこの順に行う二次元電気泳動を実施して前記各蛋白質から所要の蛋白質を分離する場合、前記一次電気泳動工程において、前記定電圧印加ステップの前に、前記定電圧より低い値であって、５０Ｖ以上３００Ｖ以下の適宜の値の第１定電圧を２時間以上印加して、前記各蛋白質の分子量より低い分子量の低分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させる第１電圧印加ステップを行い、その後、前記定電圧印加ステップにおいてストリップゲルに少なくとも３時間、４００Ｖ以上７００Ｖ以下の適宜の値の前記定電圧を印加して、前記低分子夾雑物の分子量より高い分子量の高分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させることを特徴とする。 (1) A method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention includes a protein introduction step of introducing a plurality of types of proteins into a strip gel, and applying a predetermined constant voltage to the strip gel into which each protein has been introduced. Performing a constant voltage application step, a primary electrophoresis step of causing the proteins in the strip gel to migrate by gradually increasing the applied voltage, and arranging the strip gel at a predetermined position of the flat gel, and the flat gel and the strip When separating the required protein from each protein by performing two-dimensional electrophoresis in which the gel is subjected to a secondary electrophoresis step in which a suitable power is applied to the gel and the respective proteins in the strip gel are migrated in the flat gel. in the primary electrophoresis step, before said constant voltage application step, the a value lower than the constant voltage, 50 V or more 300V following appropriate value A first constant voltage is applied for more than two hours, performing a first voltage application step of discharging the low-molecular contaminants lower molecular weight than the molecular weight of each protein from the gel strip, then gel strip in the constant voltage application step And applying a constant voltage of 400 V or more and 700 V or less for at least 3 hours to discharge a high molecular weight contaminant having a molecular weight higher than that of the low molecular weight contaminant from the strip gel .
本発明の二次元電気泳動による蛋白質の分離方法にあっては、ストリップゲル内に複数種類の蛋白質を導入する蛋白質導入工程を行い、次いで当該ストリップゲル内の各蛋白質を泳動させる一次電気泳動工程と、前記ストリップゲルを平板ゲルの所定位置に配置し、当該平板ゲル及びストリップゲルに適宜の電力を与えてストリップゲル内の各蛋白質を平板ゲル内で泳動させる二次電気泳動工程とをこの順に行う二次元電気泳動を実施して前記各蛋白質から所要の蛋白質を分離する。 In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis of the present invention, a primary electrophoresis step of performing a protein introduction step of introducing a plurality of types of proteins into a strip gel and then migrating each protein in the strip gel; And a secondary electrophoresis step in which the strip gel is disposed at a predetermined position of the slab gel, and each protein in the strip gel is migrated in the slab gel by applying appropriate power to the slab gel and the strip gel. Two-dimensional electrophoresis is performed to separate the required protein from each protein.
このとき、一次電気泳動工程において、予め定めた定電圧をストリップゲルに印加する定電圧印加ステップを行う前に第１電圧印加ステップを行う。この第１電圧印加ステップにあっては、定電圧印加ステップで印加する定電圧より低い値であって、５０Ｖ以上３００Ｖ以下の適宜の値の第１定電圧をストリップゲルに印加して、ストリップゲルに導入された各蛋白質の分子量より低い分子量の低分子夾雑物を当該ストリップゲルから排出させる。なお、第１定電圧をストリップゲルに印加する時間は２時間以上に設定するとよい。 At this time, in the primary electrophoresis step, the first voltage application step is performed before the constant voltage application step of applying a predetermined constant voltage to the strip gel. In the first voltage application step, a first constant voltage having a value lower than the constant voltage applied in the constant voltage application step and having an appropriate value of 50 V or more and 300 V or less is applied to the strip gel. A low-molecular-weight contaminant having a molecular weight lower than that of each protein introduced in is discharged from the strip gel. The time for applying the first constant voltage to the strip gel is preferably set to 2 hours or more.
本発明者が鋭意検討した結果、このように比較的低い第１定電圧をストリップゲルに印加することによって、例えば塩類というように分子量が蛋白質の分子量より低い低分子夾雑物を移動させることができ、蛋白質に影響を及ぼすことなくストリップゲルから当該低分子夾雑物を排出・除去できることが判明した。そこで、各蛋白質を含む試料を比較的多量にストリップゲル内に吸収させることによって多量の夾雑物が混入している場合であっても、第１電圧印加ステップを行うことによって、ストリップゲル内の蛋白質に影響を及ぼす事無く夾雑物の量を低減することができ、従って試料溶液に含まれる各蛋白質を比較的高い分解能で分離することができる。 As a result of intensive studies by the present inventor, by applying such a relatively low first constant voltage to the strip gel, it is possible to move low molecular contaminants having a molecular weight lower than that of the protein, such as salts. It has been found that the low-molecular contaminants can be discharged and removed from the strip gel without affecting the protein. Therefore, even if a large amount of contaminants are mixed by absorbing a relatively large amount of the sample containing each protein in the strip gel, the protein in the strip gel can be obtained by performing the first voltage application step. The amount of contaminants can be reduced without affecting the amount of protein, and therefore each protein contained in the sample solution can be separated with a relatively high resolution.
ここで、第１定電圧は５０Ｖ以上３００Ｖ以下の適宜の値である。 Here, the first constant voltage Ru appropriate value der of 50V or 300V or less.
第１定電圧が５０Ｖ未満である場合は、低分子量の夾雑物を十分に除去することができず、また当該電圧が３００Ｖを超えた場合は、低分子量の夾雑物に加えて比較的高い分子量の夾雑物も一緒に移動してしまうため、同時に多量の夾雑物が移動することとなり、ストリップゲル内に夾雑物による塊が生じて等電点電気泳動に支障を来す虞がある。一方、第１定電圧が５０Ｖ以上３００Ｖ以下である場合、低分子夾雑物を選択的に移動させることができるので、塊を生じさせることなくスムーズに移動除去させることができる。 When the first constant voltage is less than 50 V, low molecular weight impurities cannot be sufficiently removed, and when the voltage exceeds 300 V, a relatively high molecular weight is added in addition to the low molecular weight impurities. As a result, a large amount of contaminants move at the same time, which may cause a lump of contaminants in the strip gel and hinder isoelectric focusing. On the other hand, when the first constant voltage is 50 V or more and 300 V or less, the low-molecular contaminants can be selectively moved, so that they can be moved and removed smoothly without causing lumps.
また、前記定電圧印加ステップにおいてストリップゲルに少なくとも３時間、４００Ｖ以上７００Ｖ以下の適宜の値の前記定電圧を印加して、前記低分子夾雑物の分子量より高い分子量の高分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させることも特徴である。 In the constant voltage application step, an appropriate value of 400 V to 700 V is applied to the strip gel for at least 3 hours, so that the high molecular weight contaminants higher than the molecular weight of the low molecular contaminants are removed from the strip gel. Rukoto drained from the gel is also a feature.
すなわち、一次電気泳動工程の定電圧印加ステップにおいて、ストリップゲルに少なくとも３時間、４００Ｖ以上７００Ｖ以下の適宜の値の前記定電圧を印加して、前記低分子夾雑物の分子量より高い分子量の高分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させるのである。 That is, in the constant voltage application step of the primary electrophoresis step, a polymer having a molecular weight higher than the molecular weight of the low molecular contaminant is applied to the strip gel by applying the constant voltage of 400 V to 700 V for at least 3 hours. contaminants are of Ru is discharged from the gel strip.
更に本発明者が検討した結果、前記定電圧印加ステップでストリップゲルに少なくとも３時間、前記定電圧を印加することによって、例えば核酸又は不溶性蛋白質というように、目的とする蛋白質の分子量より高い分子量の高分子夾雑物を、蛋白質の電気泳動に悪影響を及ぼさない程度まで十分に排出させ得ることが判明した。そこで、予め第１定電圧をストリップゲルに印加して低分子夾雑物を排出・除去しておくことによって、高分子夾雑物と低分子夾雑物とが絡み合って夾雑物の排出を妨げるといった不都合が生じることを防止しておき、その後、前記定電圧をストリップゲルに少なくとも３時間印加することによって、高分子夾雑物を移動させて当該高分子夾雑物をストリップゲルから排出・除去する。このとき、印加する定電圧は４００Ｖ以上７００Ｖ以下の適宜の値に設定する。定電圧が４００Ｖ未満である場合は、高分子夾雑物を十分に排出・除去することができず、また当該定電圧が７００Ｖを超えた場合は、ストリップゲル内に導入された蛋白質の泳動に悪影響を及ぼす虞がある。一方、印加する電圧が４００Ｖ以上７００Ｖ以下である場合は、ストリップゲル内の蛋白質の泳動に悪影響を及ぼすことなく、高分子夾雑物を十分に移動除去することができる。 Further, as a result of investigation by the present inventor, by applying the constant voltage to the strip gel for at least 3 hours in the constant voltage application step, a molecular weight higher than the molecular weight of the target protein, such as a nucleic acid or an insoluble protein, is obtained. It has been found that polymer contaminants can be discharged sufficiently to such an extent that they do not adversely affect protein electrophoresis. Therefore, by applying a first constant voltage to the strip gel in advance to discharge and remove the low molecular contaminants, the high molecular contaminants and the low molecular contaminants are entangled to prevent the contaminants from being discharged. Then, by applying the constant voltage to the strip gel for at least 3 hours, the polymer contaminants are moved and discharged / removed from the strip gel. At this time, the constant voltage to be applied is set to an appropriate value of not less than 400V and not more than 700V. When the constant voltage is less than 400V, the polymer contaminants cannot be discharged and removed sufficiently, and when the constant voltage exceeds 700V, the migration of the protein introduced into the strip gel is adversely affected. There is a risk of affecting. On the other hand, when the applied voltage is 400 V or more and 700 V or less, the polymer contaminants can be sufficiently moved and removed without adversely affecting the migration of the protein in the strip gel.
これによって、多量の夾雑物が混入している場合であっても、ストリップゲル内の蛋白質に影響を及ぼす事無く夾雑物の量を更に低減することができ、従って試料溶液に含まれる各蛋白質をより高い分解能で分離することができる。 As a result, even when a large amount of contaminants are mixed, the amount of contaminants can be further reduced without affecting the proteins in the strip gel, and thus each protein contained in the sample solution can be reduced. Separation can be performed with higher resolution.
（２）本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法は、前記一次電気泳動工程において、前記定電圧印加ステップを行った後に、印加電圧を１０００Ｖ程度まで、５時間以上１５時間以下の時間で漸次上昇させ、その後、更に印加電圧を８０００Ｖ程度まで、３時間程度の時間で漸次上昇させることを特徴とする。本発明の二次元電気泳動による蛋白質の分離方法にあっては、電圧を漸次上昇させる操作を２段階に分けて実施するが、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させる１段目に要する時間を５時間以上１５時間以下、好ましくは７時間以上１０時間以下に設定する。これによって、蛋白質の電気泳動初期段階の泳動速度を相対的に遅くすることができるため、等電点が異なり分子量が大きい蛋白質同士、又は分子量が大きい蛋白質と等電点が異なり分子量が小さい蛋白質とが互いに絡み合うことなく、自己が有する等電点に従って移動することができる。ここで、微量蛋白質を分離すべく可及的に多量の蛋白質をストリップゲル内に導入するが、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を５時間未満に設定した場合は、電圧の上昇率が大きいため、等電点が異なり分子量が大きい蛋白質同士、又は分子量が大きい蛋白質と等電点が異なり分子量が小さい蛋白質とが互いに絡み合うことがあり、ストリップゲル内の複数種類の蛋白質の泳動に支障を来す虞がある。また、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を１５時間を超える値に設定した場合は、１段目の電気泳動に長時間を要し、等電点電気泳動の作業効率を著しく低下させる。一方、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を５時間以上１５時間以下に設定した場合は、電圧の上昇率が比較的小さいため、蛋白質の電気泳動初期段階の泳動速度を相対的に遅くすることができ、前述した如きストリップゲル内で蛋白質同士が絡み合うというような現象が可及的に防止される。また、１段目の電気泳動に要する時間を必要な時間内にすることができ、等電点電気泳動の作業効率の低下を可及的に抑制することができる。更に、前記時間を７時間以上１０時間以下に設定した場合、等電点電気泳動の作業効率の低下をより至適に抑制しつつ、複数種類の蛋白質を自己が有する等電点に従って個々に泳動させることができる。このようにして、蛋白質の等電点電気泳動の１段階目が終了すると、更に電圧を漸次上昇させて３時程度の後に８０００Ｖ程度になす。前述した如く、蛋白質の電気泳動初期段階において等電点が異なる複数種類の蛋白質が互いに絡み合うことなくストリップゲル内を移動し始めているので、２段目に電圧を漸次上昇させるに要する時間は従来と同じ程度に設定した場合であっても、各蛋白質は互いに絡み合うことなく自己が有する等電点に従って移動することができる。 (2) In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention, after the constant voltage application step is performed in the primary electrophoresis step, the applied voltage is increased to about 1000 V for a period of 5 hours to 15 hours. And then the applied voltage is further increased to about 8000 V in about 3 hours . In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention, the operation of gradually increasing the voltage is performed in two stages. The time required for the first stage of gradually increasing the voltage to about 1000 V is 5 hours. It is set to not less than 15 hours, preferably not less than 7 hours and not more than 10 hours. As a result, the electrophoresis speed of the protein at the initial stage of electrophoresis can be relatively slowed, so that proteins with different isoelectric points and large molecular weights, or proteins with large molecular weights and different isoelectric points and proteins with small molecular weights Can move according to their isoelectric points without being entangled with each other. Here, as much protein as possible is introduced into the strip gel in order to separate a minute amount of protein, but if the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to less than 5 hours, the voltage rises. Because the rate is large, proteins with different isoelectric points and high molecular weights, or proteins with high molecular weights and proteins with different isoelectric points and low molecular weights may be entangled with each other, and migration of multiple types of proteins in the strip gel There is a risk of hindrance. In addition, if the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to a value exceeding 15 hours, the first stage electrophoresis takes a long time, and the work efficiency of isoelectric focusing is significantly reduced. Let On the other hand, when the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to 5 hours or more and 15 hours or less, the rate of increase in voltage is relatively small, so that the electrophoresis speed at the initial stage of protein electrophoresis is relatively low. It can be slowed, and the phenomenon that the proteins are entangled in the strip gel as described above is prevented as much as possible. In addition, the time required for the first stage electrophoresis can be made within the required time, and a reduction in the work efficiency of isoelectric focusing can be suppressed as much as possible. Furthermore, when the time is set to 7 hours or more and 10 hours or less, the plurality of types of proteins can be individually migrated according to their own isoelectric point while optimally suppressing a decrease in the working efficiency of isoelectric focusing. Can be made. In this way, when the first stage of protein isoelectric focusing is completed, the voltage is gradually increased to about 8000 V after about 3 o'clock. As described above, at the initial stage of protein electrophoresis, a plurality of types of proteins having different isoelectric points start to move in the strip gel without being entangled with each other. Even when set to the same degree, each protein can move according to its own isoelectric point without being entangled with each other.
（３）本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法は、前記蛋白質導入工程は、複数種類の蛋白質を含む試料溶液に乾燥状態のストリップゲルを接触させて試料溶液をストリップゲルに吸収させ、次いで該ストリップゲルの周囲に適宜の緩衝液を供給した後、前記ストリップゲルに所定の定電圧を印加することによって行うことを特徴とする。 ( 3 ) In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention, in the protein introduction step, a dry strip gel is brought into contact with a sample solution containing a plurality of types of proteins so that the sample solution is absorbed by the strip gel. Then, after supplying an appropriate buffer solution around the strip gel, a predetermined constant voltage is applied to the strip gel.
本発明の二次元電気泳動による蛋白質の分離方法にあっては、前述した蛋白質導入工程は、複数種類の蛋白質を含む試料溶液に乾燥状態のストリップゲルを接触させて試料溶液をストリップゲルに吸収させ、次いでこのストリップゲルの周囲に適宜の緩衝液を供給した後、前記ストリップゲルに所定の定電圧を印加することによって行うのである。 In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention, the above-described protein introduction step comprises contacting a sample strip containing a plurality of types of proteins with a dry strip gel to absorb the sample solution into the strip gel. Then, after supplying an appropriate buffer solution around the strip gel, a predetermined constant voltage is applied to the strip gel.
複数種類の蛋白質を含む試料溶液に乾燥状態のストリップゲルを接触させると、当該ストリップゲルは試料溶液の水分を吸収して膨潤するが、これにともなって試料溶液中の各蛋白質がストリップゲル内へ導入されて行く。しかし、当該蛋白質はストリップゲルの表面又は表面近傍に極在する状態になっている。そこで、試料溶液をストリップゲルに十分吸収させた後、ストリップゲルの周囲に適宜の緩衝液を供給して当該ストリップゲルを膨潤させるとともに、ストリップゲルに比較的低い所定の電圧を印加することによって、表面近傍に極在する蛋白質をストリップゲルの内部へ電気的に導入・拡散させる。 When a dried strip gel is brought into contact with a sample solution containing multiple types of proteins, the strip gel absorbs the moisture of the sample solution and swells. With this, each protein in the sample solution enters the strip gel. Going to be introduced. However, the protein is in a state of being extremely present on or near the surface of the strip gel. Therefore, after sufficiently absorbing the sample solution in the strip gel, by supplying an appropriate buffer around the strip gel to swell the strip gel, and by applying a relatively low predetermined voltage to the strip gel, Proteins present in the vicinity of the surface are electrically introduced and diffused into the strip gel.
これによって、試料溶液中の各蛋白質の略全量をその分子量に拘わらずストリップゲル内へ導入させることができるため、極微量の蛋白質であっても確実にストリップゲル内に導入され、当該ストリップゲルによる分離、ひいては二次元電気泳動による分離が可能となる。 As a result, almost the entire amount of each protein in the sample solution can be introduced into the strip gel regardless of its molecular weight, so even a very small amount of protein is reliably introduced into the strip gel. Separation, and hence separation by two-dimensional electrophoresis, becomes possible.
（４）本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法は、前記定電圧は５０Ｖ以上１２０Ｖ以下の適宜の値であることを特徴とする。 ( 4 ) The protein separation method by two-dimensional electrophoresis according to the present invention is characterized in that the constant voltage is an appropriate value of 50 V or more and 120 V or less.
本発明の二次元電気泳動による蛋白質の分離方法にあっては、前述した定電圧印加ステップにおいてストリップゲルに印加する定電圧は５０Ｖ以上１２０Ｖ以下の適宜の値に設定する。 In the method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis of the present invention, the constant voltage applied to the strip gel in the above-described constant voltage application step is set to an appropriate value of 50V or more and 120V or less.
定電圧印加ステップにおいてストリップゲルに印加する定電圧が５０Ｖ未満である場合は、比較的分子量が大きい蛋白質をストリップゲル内へ導入し辛くなり、当該定電圧が１２０Ｖを超えた場合は、蛋白質がストリップゲル内へ急激に導入されることにより一次電気泳動に支障を来す虞がある。一方、前記定電圧が５０Ｖ以上１２０Ｖ以下である場合は、試料溶液に含まれる略全ての蛋白質をストリップゲル内へ適当な速度で導入することができるため、試料溶液に含まれる蛋白質を漏れなく、高分解能で二次元電気泳動させることができる。 If the constant voltage applied to the strip gel in the constant voltage application step is less than 50 V, it is difficult to introduce a protein having a relatively large molecular weight into the strip gel. If the constant voltage exceeds 120 V, the protein is stripped. If it is rapidly introduced into the gel, there is a risk of hindering primary electrophoresis. On the other hand, when the constant voltage is 50 V or more and 120 V or less, almost all the proteins contained in the sample solution can be introduced into the strip gel at an appropriate rate, so that the proteins contained in the sample solution are not leaked, Two-dimensional electrophoresis can be performed with high resolution.
本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法について詳述する。
図１は本発明方法を時系列的に説明するフローチャートである。
図１に示した如く、一次元目である一次電気泳動に供するための試料溶液を調製する（ステップＳ１）。
The method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to the present invention will be described in detail.
FIG. 1 is a flowchart for explaining the method of the present invention in time series.
As shown in FIG. 1, a sample solution for use in the first-order primary electrophoresis is prepared (step S1).
試料溶液の調製は目的とする蛋白質を可溶化することによって行う。目的とする蛋白質及びその蛋白質を含む対象細胞の種類によって可溶化までの処理は異なるが、基本的には対象細胞を採取し、得られた細胞を適宜緩衝液中で物理的及び／又は化学的に破壊することによって目的の蛋白質を可溶化させる。なお、必要に応じて採取した対象細胞を適当な培養基中で培養し、対象細胞の数を増大させてから破壊してもよい。また、緩衝液には蛋白質の抽出率を向上させるために、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００といった界面活性剤、及び／又は蛋白質分解酵素、リン酸分解酵素といった目的蛋白質を分解する酵素の阻害剤等を必要に応じて添加しておく。 The sample solution is prepared by solubilizing the target protein. The process up to solubilization differs depending on the target protein and the type of target cell containing the protein, but basically the target cell is collected and the obtained cell is physically and / or chemically stored in a suitable buffer. The protein of interest is solubilized by disrupting it. If necessary, the target cells collected may be cultured in an appropriate culture medium to increase the number of target cells and then destroyed. In addition, in order to improve the extraction rate of the protein, the buffer solution contains a surfactant such as SDS or Triton X-100 and / or an inhibitor of an enzyme that degrades the target protein such as a proteolytic enzyme or a phosphorolytic enzyme. Add as needed.
このようにして得られた溶液中には細胞残渣、核酸、糖類及び塩類等の夾雑物が含まれているため、遠心分離又は濾過等によって細胞残渣といった沈殿物を除去する操作、溶媒沈殿又は塩析によって蛋白質を沈殿回収する操作、脱塩操作等を適宜行う前処理を必要に応じて実施して試料溶液を得る。 Since the solution thus obtained contains impurities such as cell residues, nucleic acids, saccharides and salts, an operation for removing precipitates such as cell residues by centrifugation or filtration, solvent precipitation or salt A sample solution is obtained by performing a pretreatment as needed, such as an operation for precipitating and recovering the protein by analysis, a desalting operation, etc.
次に、図１に示したように一次電気泳動たる等電点電気泳動に供すべく、前述した如く調製した試料溶液中の蛋白質をストリップゲル内に導入させる（ステップＳ２）。なお、ストリップゲルは適宜市販のものを用いることができるが、後述する二次元目の電気泳動に使用するゲルの幅に対応した長さのものを用いる。 Next, the protein in the sample solution prepared as described above is introduced into the strip gel to be subjected to isoelectric focusing as primary electrophoresis as shown in FIG. 1 (step S2). A commercially available strip gel can be used as appropriate, but a strip gel having a length corresponding to the width of the gel used for the second-dimensional electrophoresis described later is used.
図２は図１に示した蛋白質の導入手順を説明するフローチャートである。
試料溶液中の蛋白質をストリップゲル内に導入させるには例えば次のようにして行う。すなわち、等電点電気泳動を行う泳動槽にストリップゲルを配設すべく設けられた溝内に前記試料溶液を適宜量注入しておき、該溝内に乾燥状態のストリップゲルを気泡が混入しないように挿入する。試料溶液に接触されたストリップゲルは試料溶液の水分を吸収して膨潤するが、これにともなって試料溶液中の蛋白質がストリップゲル内へ吸収されて行く（ステップＳ２１）。
FIG. 2 is a flowchart for explaining the protein introduction procedure shown in FIG.
For example, the protein in the sample solution is introduced into the strip gel as follows. That is, an appropriate amount of the sample solution is injected into a groove provided to dispose a strip gel in an electrophoresis tank for performing isoelectric focusing, and air bubbles do not enter the dried strip gel into the groove. Insert like so. The strip gel in contact with the sample solution absorbs the moisture of the sample solution and swells, and with this, the protein in the sample solution is absorbed into the strip gel (step S21).
次いで、前記泳動槽に適宜の緩衝液を供給して（ステップＳ２２）、ストリップゲルを平衡状態になるまで膨潤させるが、緩衝液の供給後、ストリップゲルの両端部間に５０Ｖ以上１２０Ｖ以下、好ましくは９０Ｖ以上１１０Ｖ以下の適宜の値の定電圧を印加する（ステップＳ２３）ことによって、試料溶液中の蛋白質を電気的にストリップゲル内へ導入させる。 Next, an appropriate buffer solution is supplied to the electrophoresis tank (step S22), and the strip gel is swollen until it reaches an equilibrium state. After the buffer solution is supplied, 50 V or more and 120 V or less, preferably between both ends of the strip gel. Applies a constant voltage of an appropriate value of 90 V or more and 110 V or less (step S23), thereby electrically introducing the protein in the sample solution into the strip gel.
なお、定電圧を印加する時間はストリップゲルの長さに応じて適宜設定すればよいが、例えばストリップゲルの長さが７ｃｍである場合は１２時間程度であり、ストリップゲルの長さが２４ｃｍである場合は１８時間程度である。 The time for applying the constant voltage may be set as appropriate according to the length of the strip gel. For example, when the length of the strip gel is 7 cm, it is about 12 hours, and the length of the strip gel is 24 cm. In some cases, it takes about 18 hours.
このようにストリップゲルを膨潤させる操作の間、ストリップゲルの両端部間に前述した如き比較的低い電圧を印加することによって、試料溶液中の蛋白質の略全量をその分子量に拘わらずストリップゲル内へ導入させることができ、これによって極微量の蛋白質であっても確実にストリップゲル内に導入されるため、当該ストリップゲルによる分離、ひいては二次元電気泳動による分離が可能となる。 During the operation of swelling the strip gel in this way, by applying a relatively low voltage as described above between both ends of the strip gel, almost the entire amount of the protein in the sample solution is transferred into the strip gel regardless of its molecular weight. As a result, even a very small amount of protein is surely introduced into the strip gel, so that the separation by the strip gel and the separation by two-dimensional electrophoresis become possible.
ここで、前述したストリップゲルの両端部間に印加する電圧が５０Ｖ未満である場合は、比較的分子量が大きい蛋白質をストリップゲル内へ導入し辛くなり、当該電圧が１２０Ｖを超えた場合は、蛋白質がストリップゲル内へ急激に導入されることにより等電点電気泳動に支障を来す虞がある。一方、ストリップゲルの両端部間に印加する電圧が５０Ｖ以上１２０Ｖ以下である場合は、試料溶液に含まれる略全ての蛋白質をストリップゲル内へ適当な速度で導入することができるため、試料溶液に含まれる蛋白質を漏れなく、高分解能で等電点電気泳動することができる。更に、当該電圧が９０Ｖ以上１１０Ｖ以下である場合、比較的分子量が大きい蛋白質であってもストリップゲルの膨潤時間内で無理なく十分に当該ストリップゲル内へ導入することができるため、等電点電気泳動に悪影響を及ぼす事無く、かかる蛋白質の検出感度をより向上させることができる。 Here, when the voltage applied between both ends of the strip gel is less than 50V, it is difficult to introduce a protein having a relatively large molecular weight into the strip gel, and when the voltage exceeds 120V, the protein May be hindered in isoelectric focusing by being rapidly introduced into the strip gel. On the other hand, when the voltage applied between both ends of the strip gel is 50 V or more and 120 V or less, almost all proteins contained in the sample solution can be introduced into the strip gel at an appropriate rate. Isoelectric focusing can be performed with high resolution without leakage of contained proteins. Further, when the voltage is 90 V or more and 110 V or less, even a protein having a relatively large molecular weight can be introduced into the strip gel without difficulty within the strip gel swelling time. The detection sensitivity of such proteins can be further improved without adversely affecting electrophoresis.
このようにしてストリップゲルの膨潤及びストリップゲル内への蛋白質の導入が終了すると、一次電気泳動たる等電点電気泳動を次のようなプロトコルに従って実施する（ステップＳ３）。なお、ストリップゲルの膨潤及びストリップゲル内への蛋白質の導入が終了した後、長時間に亘る等電点電気泳動中にストリップゲルが乾燥するのを防止するために、当該ストリップゲルの表面をカバーオイル（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｏｖｅｒ Ｆｌｕｉｄ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）で被覆しておく。また、等電点電気泳動中にストリップゲルの端部が乾燥することがあるが、これを防止するために、ストリップゲルの端部と電極との間に濾紙を介装させてもよい。 When the swelling of the strip gel and the introduction of the protein into the strip gel are thus completed, isoelectric focusing, which is primary electrophoresis, is performed according to the following protocol (step S3). After the completion of the swelling of the strip gel and the introduction of the protein into the strip gel, the surface of the strip gel is covered to prevent the strip gel from drying during the isoelectric focusing for a long time. It is coated with oil (for example, Immobilized Cover Fluid: manufactured by GE Healthcare UK Ltd.). In addition, the end of the strip gel may be dried during isoelectric focusing. To prevent this, a filter paper may be interposed between the end of the strip gel and the electrode.
図３は、図１に示した一次電気泳動の手順を説明するフローチャートである。
ところで、従来の等電点電気泳動の操作手順は、５００Ｖの定電圧を３０分間から１時間程度印加した後、電圧を直線的に上昇させて１時間後に１０００Ｖになし、更に電圧を直線的に上昇させて３時後に８０００Ｖになし、その電圧で２時間から４時間程度印加するというものであった。
FIG. 3 is a flowchart for explaining the procedure of primary electrophoresis shown in FIG.
By the way, in the conventional isoelectric focusing procedure, a constant voltage of 500 V is applied for about 30 minutes to 1 hour, the voltage is increased linearly to reach 1000 V after 1 hour, and the voltage is further increased linearly. The voltage was raised to 8000 V after 3 o'clock, and the voltage was applied for 2 to 4 hours.
これに対して本発明に係る等電点電気泳動にあっては、従来の如く定電圧を印加する前に、５０Ｖ以上３００Ｖ以下、好ましくは８０Ｖ以上２００Ｖ以下の適宜の値の第１定電圧を適宜時間印加してストリップゲル内に導入した各蛋白質の分子量より低い分子量の低分子夾雑物を除去する（ステップＳ３１）。 On the other hand, in the isoelectric focusing according to the present invention, before applying a constant voltage as in the prior art, an appropriate first constant voltage of 50 V to 300 V, preferably 80 V to 200 V is applied. A low molecular contaminant having a molecular weight lower than the molecular weight of each protein introduced into the strip gel by applying an appropriate time is removed (step S31).
本発明者が鋭意検討した結果、このように比較的低い電圧をストリップゲルに印加することによって、例えば塩類というように分子量が蛋白質より小さい低分子夾雑物を移動させることができるということが判明した。そのため、前述した比較的低い電圧をストリップゲルに印加することによって、ストリップゲル中の低分子夾雑物を移動させて当該低分子夾雑物をストリップゲルから排出・除去させる。なお、かかる除去操作の時間は適宜に設定すればよいが、２時間以上に設定するとよい。 As a result of intensive studies by the present inventor, it has been found that by applying a relatively low voltage to the strip gel in this way, it is possible to move low molecular contaminants having a molecular weight smaller than that of proteins, such as salts. . Therefore, by applying the above-described relatively low voltage to the strip gel, the low molecular contaminants in the strip gel are moved, and the low molecular contaminants are discharged / removed from the strip gel. In addition, what is necessary is just to set the time of this removal operation suitably, but it is good to set it to 2 hours or more.
ここで、前述した第１定電圧が５０Ｖ未満である場合は、低分子量の夾雑物を十分に除去することができず、また第１定電圧が３００Ｖを超えた場合は、低分子量の夾雑物に加えて比較的高い分子量の夾雑物も一緒に移動してしまうため、同時に多量の夾雑物が移動することとなり、ストリップゲル内に夾雑物による塊が生じて等電点電気泳動に支障を来す虞がある。一方、前述した如く第１定電圧が５０Ｖ以上３００Ｖ以下である場合、分子量が比較的小さい夾雑物を選択的に移動させることができるので、塊を生じさせることなくスムーズに移動除去させることができる。更に、第１定電圧が８０Ｖ以上２００Ｖ以下である場合、比較的短時間で高分子量の夾雑物を巻き込むことなく低分子量の夾雑物を移動除去することができるので好適である。 Here, when the above-mentioned first constant voltage is less than 50V, low molecular weight impurities cannot be sufficiently removed, and when the first constant voltage exceeds 300V, low molecular weight impurities. In addition, since relatively high molecular weight contaminants move together, a large amount of contaminants move at the same time, resulting in clumps of contaminants in the strip gel and hindering isoelectric focusing. There is a risk. On the other hand, when the first constant voltage is 50 V or more and 300 V or less as described above, contaminants having a relatively low molecular weight can be selectively moved, so that they can be moved and removed smoothly without causing lumps. . Further, when the first constant voltage is 80 V or more and 200 V or less, it is preferable because the low molecular weight impurities can be moved and removed in a relatively short time without involving the high molecular weight impurities.
このようにして低分子夾雑物を除去した後、４００Ｖ以上７００Ｖ以下、好ましくは４５０Ｖ以上６００Ｖ以下の適宜の値の定電圧を少なくとも３時間印加して比較的に高い分子量の夾雑物を除去する（ステップＳ３２）。 After removing low molecular impurities in this way, a constant voltage of an appropriate value of 400 V to 700 V, preferably 450 V to 600 V is applied for at least 3 hours to remove relatively high molecular weight contaminants ( Step S32).
本発明者が鋭意検討した結果、前述した電圧より少し高い電圧をストリップゲルに少なくとも３時間印加することによって、例えば核酸又は不溶性蛋白質というように、比較的高い分子量の高分子夾雑物をストリップゲルから、蛋白質の電気泳動に悪影響を及ぼさない程度の量まで十分に排出させ得ることが判明した。そのため、前述した定電圧をストリップゲルに少なくとも３時間印加することによって、ストリップゲル中の高分子夾雑物を移動させて当該高分子夾雑物をストリップゲルから排出・除去する。 As a result of intensive studies by the inventor, by applying a voltage slightly higher than the above-described voltage to the strip gel for at least 3 hours, a high molecular weight contaminant such as a nucleic acid or an insoluble protein can be removed from the strip gel. It was found that the protein could be sufficiently discharged to an amount that does not adversely affect the electrophoresis of the protein. Therefore, by applying the above-described constant voltage to the strip gel for at least 3 hours, the polymer contaminants in the strip gel are moved, and the polymer contaminants are discharged and removed from the strip gel.
ここで、定電圧を印加する時間が３時間未満である場合は、高分子夾雑物を蛋白質の電気泳動に悪影響を及ぼさない程度の量まで十分にストリップゲルから排出させることができない。一方、定電圧を印加する時間が３時間以上である場合は、高分子夾雑物を十分にストリップゲルから排出除去することができる。 Here, if the time for applying the constant voltage is less than 3 hours, the polymer contaminants cannot be sufficiently discharged from the strip gel to an amount that does not adversely affect the electrophoresis of the protein. On the other hand, when the time for applying the constant voltage is 3 hours or longer, the polymer contaminants can be sufficiently discharged and removed from the strip gel.
なお、かかる印加時間は印加する定電圧の値に応じて定められ、印加する定電圧の値が相対的に大きい場合は短く、逆に印加する定電圧の値が相対的に小さい場合は長くする。例えば、印加する定電圧が５００Ｖである場合、印加時間は４時間程度にするとよい。また、かかる定電圧の最長印加時間は、ストリップゲル内の各蛋白質への影響及び一次電気泳動の操作効率によって定めればよく、例えば印加する定電圧が５００Ｖである場合、８時間程度である。 The application time is determined according to the value of the constant voltage to be applied, and is shorter when the value of the constant voltage to be applied is relatively large, and is longer when the value of the constant voltage to be applied is relatively small. . For example, when the constant voltage to be applied is 500 V, the application time is preferably about 4 hours. The longest application time of the constant voltage may be determined by the influence on each protein in the strip gel and the operation efficiency of primary electrophoresis. For example, when the applied constant voltage is 500 V, it is about 8 hours.
一方、印加する定電圧が４００Ｖ未満である場合は、高分子夾雑物を十分に除去することができず、また定電圧が７００Ｖを超えた場合は、ストリップゲル内に導入された蛋白質の泳動に悪影響を及ぼす虞がある。一方、印加する定電圧が４００Ｖ以上７００Ｖ以下である場合は、ストリップゲル内の蛋白質の泳動に悪影響を及ぼすことなく、高分子夾雑物を十分に排出除去することができる。更に、定電圧が４５０Ｖ以上６００Ｖ以下の場合は、比較的短い時間内にストリップゲル内の蛋白質の泳動に悪影響を及ぼすことなく高分子夾雑物を排出除去することができるので好適である。 On the other hand, when the constant voltage to be applied is less than 400 V, the polymer contaminants cannot be sufficiently removed, and when the constant voltage exceeds 700 V, the protein introduced into the strip gel is migrated. There is a risk of adverse effects. On the other hand, when the constant voltage to be applied is 400 V or more and 700 V or less, polymer contaminants can be sufficiently discharged and removed without adversely affecting the migration of proteins in the strip gel. Furthermore, when the constant voltage is 450 V or more and 600 V or less, it is preferable because the polymer contaminants can be discharged and removed without adversely affecting the migration of the protein in the strip gel within a relatively short time.
次に、前同様、電圧を漸次上昇させる操作を２段階に分けて実施する（ステップＳ３３，Ｓ３４）が、本発明に係る等電点電気泳動にあっては、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させる１段目に要する時間を５時間以上１５時間以下、好ましくは７時間以上１０時間以下に設定する。これによって、蛋白質の電気泳動初期段階の泳動速度を相対的に遅くすることができるため、等電点が異なり分子量が大きい蛋白質同士、又は分子量が大きい蛋白質と等電点が異なり分子量が小さい蛋白質とが互いに絡み合うことなく、自己が有する等電点に従って移動することができる。 Next, as in the previous case, the operation of gradually increasing the voltage is performed in two steps (steps S33 and S34). In the isoelectric focusing according to the present invention, the voltage is gradually increased to about 1000V. The time required for the first stage is set to 5 hours to 15 hours, preferably 7 hours to 10 hours. As a result, the electrophoresis speed of the protein at the initial stage of electrophoresis can be relatively slowed, so that proteins with different isoelectric points and large molecular weights, or proteins with large molecular weights and different isoelectric points and proteins with small molecular weights Can move according to their isoelectric points without being entangled with each other.
ここで、微量蛋白質を分離すべく可及的に多量の蛋白質をストリップゲル内に導入するが、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を５時間未満に設定した場合は、電圧の上昇率が大きいため、等電点が異なり分子量が大きい蛋白質同士、又は分子量が大きい蛋白質と等電点が異なり分子量が小さい蛋白質とが互いに絡み合うことがあり、ストリップゲル内の複数種類の蛋白質の泳動に支障を来す虞がある。また、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を１５時間を超える値に設定した場合は、１段目の電気泳動に長時間を要し、等電点電気泳動の作業効率を著しく低下させる。一方、電圧を１０００Ｖ程度まで漸次上昇させるために要する時間を５時間以上１５時間以下に設定した場合は、電圧の上昇率が比較的小さいため、蛋白質の電気泳動初期段階の泳動速度を相対的に遅くすることができ、前述した如きストリップゲル内で蛋白質同士が絡み合うというような現象が可及的に防止される。また、１段目の電気泳動に要する時間を必要な時間内にすることができ、等電点電気泳動の作業効率の低下を可及的に抑制することができる。更に、前記時間を７時間以上１０時間以下に設定した場合、等電点電気泳動の作業効率の低下をより至適に抑制しつつ、複数種類の蛋白質を自己が有する等電点に従って個々に泳動させることができる。 Here, as much protein as possible is introduced into the strip gel in order to separate a minute amount of protein, but if the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to less than 5 hours, the voltage rises. Because the rate is large, proteins with different isoelectric points and high molecular weights, or proteins with high molecular weights and proteins with different isoelectric points and low molecular weights may be entangled with each other, and migration of multiple types of proteins in the strip gel There is a risk of hindrance. In addition, if the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to a value exceeding 15 hours, the first stage electrophoresis takes a long time, and the work efficiency of isoelectric focusing is significantly reduced. Let On the other hand, when the time required to gradually increase the voltage to about 1000 V is set to 5 hours or more and 15 hours or less, the rate of increase in voltage is relatively small, so that the electrophoresis speed at the initial stage of protein electrophoresis is relatively low. It can be slowed, and the phenomenon that the proteins are entangled in the strip gel as described above is prevented as much as possible. In addition, the time required for the first stage electrophoresis can be made within the required time, and a reduction in the work efficiency of isoelectric focusing can be suppressed as much as possible. Furthermore, when the time is set to 7 hours or more and 10 hours or less, the plurality of types of proteins can be individually migrated according to their own isoelectric point while optimally suppressing a decrease in the working efficiency of isoelectric focusing. Can be made.
このようにして、蛋白質の等電点電気泳動の１段階目が終了すると、更に電圧を漸次上昇させて３時程度の後に８０００Ｖ程度になす。前述した如く、蛋白質の電気泳動初期段階において等電点が異なる複数種類の蛋白質が互いに絡み合うことなくストリップゲル内を移動し始めているので、２段目に電圧を漸次上昇させるに要する時間は従来と同じ程度に設定した場合であっても、各蛋白質は互いに絡み合うことなく自己が有する等電点に従って移動することができる。 In this way, when the first stage of protein isoelectric focusing is completed, the voltage is gradually increased to about 8000 V after about 3 o'clock. As described above, at the initial stage of protein electrophoresis, a plurality of types of proteins having different isoelectric points start to move in the strip gel without being entangled with each other. Even when set to the same degree, each protein can move according to its own isoelectric point without being entangled with each other.
そして、８０００Ｖ程度の定電圧で３時間以上９時間以下程度印加することによって、電気泳動させた各蛋白質を自己が有する等電点に対応する位置に集中させる（ステップＳ３５）。 Then, by applying a constant voltage of about 8000 V for about 3 hours to 9 hours, each electrophoresed protein is concentrated at a position corresponding to its own isoelectric point (step S35).
このようにして、等電点電気泳動が終了すると、ストリップゲルを泳動槽から取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）用の平板ゲルを用いて次のようにして二次元目である二次電気泳動を実施する（ステップＳ４）。 When isoelectric focusing is completed in this way, the strip gel is taken out of the electrophoresis tank, and the second dimension is obtained as follows using a flat gel for SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). Next electrophoresis is performed (step S4).
すなわち、適宜濃度のＳＤＳを含むＳＤＳ平衡化緩衝液にストリップゲルを浸漬させることによって、当該ストリップゲル内の蛋白質にＳＤＳを結合させる平衡化処理を実施する。一方、市販又は自製によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の平板ゲルを予め調製しておき、該平板ゲルの所定辺に前記ストリップゲルを載置する。この状態で平板ゲルを予め陽極液を注入しておいた泳動槽の所定位置に配設し、陰極液を注入してから両極間に適宜の電力となるように通電して電気泳動を開始する。そして、予め定めた時間に達したタイミング、又は平板ゲル適宜位置に載せたＢＰＢが当該平板ゲルの先端まで移動したタイミング等、適宜のタイミングで電気泳動を終了する。 That is, the strip gel is immersed in an SDS equilibration buffer containing an appropriate concentration of SDS, thereby performing an equilibration process for binding SDS to the protein in the strip gel. On the other hand, a slab gel for SDS-PAGE is prepared in advance by commercially available or self-made, and the strip gel is placed on a predetermined side of the slab gel. In this state, the slab gel is placed at a predetermined position in the electrophoresis tank into which the anolyte has been previously injected, and after injecting the catholyte, electrification is started so as to obtain an appropriate power between the two electrodes to start electrophoresis. . Then, the electrophoresis is terminated at an appropriate timing such as a timing when a predetermined time is reached, or a timing when the BPB placed at an appropriate position of the slab gel moves to the tip of the slab gel.
このようなＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施することによって、等電点電気泳動によって分離した各蛋白質を等電点電気泳動の泳動方向と直交する方向へ、それぞれ分子量の大きさに従って分離する。このようにして二次元電気泳動が終了すると、例えば染色することによって分離した各蛋白質を可視化する（ステップＳ５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥされた平板ゲル内には可視化によって複数のスポットが生じるが、所要スポットを含む位置のゲル片を切り取り、得られたゲル片から蛋白質を抽出することによって目的とする蛋白質を得る（ステップＳ６）。 By carrying out such SDS-PAGE, each protein separated by isoelectric focusing is separated in a direction orthogonal to the migration direction of isoelectric focusing in accordance with the molecular weight. When the two-dimensional electrophoresis is completed in this way, each protein separated by, for example, staining is visualized (step S5). A plurality of spots are generated by visualization in the SDS-PAGE slab gel, and the target protein is obtained by cutting out the gel piece at the position including the required spot and extracting the protein from the obtained gel piece (step) S6).
このように本発明方法にあっては、一次電気泳動において比較的低い第１定電圧をストリップゲルに印加することによって、蛋白質に影響を及ぼすことなく塩類というような低分子夾雑物をストリップゲルから排出・除去できるため、目的蛋白質を含む試料を比較的多量にストリップゲル内に吸収させることによって多量の夾雑物が混入している場合であっても、目的蛋白質を比較的高い分解能で分離することができる。 Thus, in the method of the present invention, by applying a relatively low first constant voltage to the strip gel in primary electrophoresis, low molecular contaminants such as salts can be removed from the strip gel without affecting the protein. Because it can be discharged and removed, the target protein can be separated with a relatively high resolution even if a large amount of contaminants are mixed by absorbing a relatively large amount of the sample containing the target protein into the strip gel. Can do.
また、定電圧印加ステップでストリップゲルに少なくとも３時間、定電圧を印加することによって、例えば核酸又は不溶性蛋白質というような高分子夾雑物を、蛋白質の電気泳動に悪影響を及ぼさない程度まで十分にストリップゲルから排出させ得るため、ストリップゲル内の蛋白質に影響を及ぼす事無く夾雑物の量を更に低減することができ、従って試料溶液に含まれる各蛋白質をより高い分解能で分離することができる。このとき、予め第１定電圧をストリップゲルに印加して低分子夾雑物を排出・除去しておくことによって、高分子夾雑物と低分子夾雑物とが絡み合って夾雑物の排出を妨げるといった不都合が生じることが防止される。 In addition, by applying a constant voltage to the strip gel for at least 3 hours in the constant voltage application step, for example, a polymer contaminant such as a nucleic acid or an insoluble protein is sufficiently stripped to the extent that it does not adversely affect protein electrophoresis. Since it can be discharged from the gel, the amount of contaminants can be further reduced without affecting the proteins in the strip gel, and therefore each protein contained in the sample solution can be separated with higher resolution. At this time, the first constant voltage is applied to the strip gel in advance to discharge and remove the low-molecular contaminants, so that the high-molecular contaminants and the low-molecular contaminants are entangled to prevent the contaminants from being discharged. Is prevented from occurring.
更に、試料溶液をストリップゲルに十分吸収させた後、ストリップゲルの周囲に適宜の緩衝液を供給して当該ストリップゲルを膨潤させるとともに、ストリップゲルに比較的低い所定の電圧を印加することによって、表面近傍に極在する蛋白質をストリップゲルの内部へ電気的に導入・拡散させることができる。これによって、試料溶液中の各蛋白質の略全量をその分子量に拘わらずストリップゲル内へ導入させることができるため、極微量の蛋白質であっても確実にストリップゲル内に導入され、当該ストリップゲルによる分離、ひいては二次元電気泳動による分離が可能となる。 Furthermore, after the sample solution is sufficiently absorbed by the strip gel, an appropriate buffer is supplied around the strip gel to swell the strip gel, and by applying a relatively low predetermined voltage to the strip gel, Proteins present in the vicinity of the surface can be electrically introduced and diffused into the strip gel. This allows almost the entire amount of each protein in the sample solution to be introduced into the strip gel regardless of its molecular weight, so even a very small amount of protein is reliably introduced into the strip gel. Separation, and hence separation by two-dimensional electrophoresis, becomes possible.
（実施例１）
次に、本発明に係る二次元電気泳動による蛋白質の分離方法を用いて、オルガネラ蛋白質である核蛋白質を分離した結果について説明する。
(Example 1)
Next, the results of separating the nuclear protein, which is an organelle protein, using the protein separation method by two-dimensional electrophoresis according to the present invention will be described.
（試料溶液の調製）
発生１４．５日目のＩＣＲ系のマウス胎仔の終脳から神経上皮細胞を単離し、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２）存在下で５日間培養して神経幹細胞を得た。なお、培地には１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．社製）を含有するＮ２−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）を用いた。なお、培養皿にはポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ Ａｉｄｒｉｃ社製）及びフィブロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）を予め塗布しておいた。
(Preparation of sample solution)
Neuroepithelial cells were isolated from the telencephalon of ICR mouse embryos on day 14.5, and cultured for 5 days in the presence of FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) to obtain neural stem cells. Note that N2-DMEM / F12 medium (Life Technologies Inc.) containing 10 ng / ml human recombinant bFGF (PeproTech, Inc.) was used as the medium. In addition, polyornithine (manufactured by Sigma Aidric) and fibronectin (manufactured by Life Technologies Inc.) were previously applied to the culture dish.
このようにして得た神経幹細胞をピペッティング操作によって培養皿から剥離し、培地を除去することによって神経幹細胞を得、得られた神経幹細胞から核蛋白質を核蛋白質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて抽出した。この抽出液に対して２Ｄ−クリーンアップキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）を用いて沈殿操作を施して核蛋白質を含む沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を回収し、それを溶解液に溶解させて試料溶液とした。なお、溶解液には、８Ｍの尿素、４質量／容量％のＣＨＡＰＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）の組成の溶液を用いた。 The neural stem cells thus obtained are detached from the culture dish by pipetting, and the neural stem cells are obtained by removing the culture medium. From the obtained neural stem cells, a nuclear protein extraction kit (manufactured by Thermo Scientific Pierce) is obtained. Extracted using. The extract is subjected to a precipitation operation using a 2D-cleanup kit (GE Healthcare UK Ltd.) to generate a precipitate containing a nucleoprotein, and the generated precipitate is recovered and dissolved in a solution. Was used as a sample solution. In addition, the solution of the composition of 8M urea, 4 mass / volume% CHAPS (made by GE Healthcare UK Ltd.) was used for the solution.
なお、本実施例にあっては、前述した培地に蛍光色素（例えば、ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ Ｃｙ２：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）を予め添加することによって、前記試料溶液中の蛋白質を蛍光色素で標識した。 In this example, a fluorescent dye (for example, CyDye DIGE Fluor Cy2: manufactured by GE Healthcare UK Ltd.) is added to the above-described medium in advance to label the protein in the sample solution with the fluorescent dye. did.
（ストリップゲルへの蛋白質導入工程及び一次電気泳動工程）
ストリップゲルはｐＨ３−１１，ＮＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）であって全長が７ｃｍのものを用いた。また、等電点電気泳動装置はＥｔｔａｎ ＩＰＧ ｐｈｏｒ ３ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）を用いた。また、緩衝液としては８Ｍの尿素、４質量／容量％のＣＨＡＰＳ、２質量／容量％のＩＰＧ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）緩衝液、１．２質量／容量％のストリーキング軽減溶液（Ｄｅｓｔｒｅａｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）の組成の溶液を用いた。
(Protein introduction process and primary electrophoresis process in strip gel)
The strip gel was pH 3-11, NL (manufactured by GE Healthcare UK Ltd.) having a total length of 7 cm. As the isoelectric focusing apparatus, Ettan IPG for 3 Isoelectric Focusing Unit (manufactured by GE Healthcare UK Ltd.) was used. As the buffer solution, 8 M urea, 4 mass / volume% CHAPS, 2 mass / volume% IPG (Immobilized pH gradient) buffer, 1.2 mass / volume% streaking solution (GE) (GE) (Healthcare UK Ltd.) was used.
等電点電気泳動の泳動槽にはストリップゲルを挿入させるための溝が形成されており、該溝内に前記試料溶液を総蛋白質量が適宜量になるように注入した後、この溝内にストリップゲルを挿入させて試料溶液をストリップゲルに接触させる。なお、ストリップゲルに導入させる蛋白質の総量は使用するストリップゲルの長さによって定められ、本実施例では７ｃｍのストリップゲルに３０μｇの蛋白質を導入させた。なお、ストリップゲルが２４ｃｍの場合は１００μｇ〜１５０μｇ程度の蛋白質を導入させるとよい。 A groove for inserting a strip gel is formed in the electrophoresis tank for isoelectric focusing. After the sample solution is injected into the groove so that the total amount of protein becomes an appropriate amount, the groove is inserted into the groove. Insert the strip gel to bring the sample solution into contact with the strip gel. The total amount of protein introduced into the strip gel was determined by the length of the strip gel used. In this example, 30 μg of protein was introduced into a 7 cm strip gel. When the strip gel is 24 cm, it is preferable to introduce about 100 μg to 150 μg of protein.
乾燥状態のストリップゲルに接触された試料溶液が当該ストリップゲルに吸収されるのにともなって試料溶液中の蛋白質もストリップゲル内へ導入されるものの、当該蛋白質はストリップゲルの表面又は表面近傍に極在する状態になっている。そこで、試料溶液がストリップゲルに十分吸収される時間が経過した後、前記緩衝液を泳動槽内へ充填させてストリップゲルを膨潤させるとともに、泳動槽の両電極間に１００Ｖの電圧を１２時間印加することによって、表面近傍に極在する蛋白質をストリップゲルの内部へ電気的に導入・拡散させて蛋白質導入工程とした。 As the sample solution in contact with the dried strip gel is absorbed into the strip gel, the protein in the sample solution is also introduced into the strip gel. However, the protein is at the surface of the strip gel or near the surface. It is in a state that exists. Therefore, after the time required for the sample solution to be sufficiently absorbed by the strip gel, the buffer solution is filled into the electrophoresis tank to swell the strip gel, and a voltage of 100 V is applied between both electrodes of the electrophoresis tank for 12 hours. By doing so, the protein existing in the vicinity of the surface was electrically introduced and diffused into the inside of the strip gel to obtain a protein introduction step.
以降は定法に従って一次電気泳動工程を行った。すなわち、泳動槽の両電極間に３００Ｖの電圧を４時間印加した後、３００Ｖから１０００Ｖへ直線的に昇圧させ、続いて１０００Ｖから５０００Ｖへ直線的に昇圧させた。なお、一段目の昇圧に要した時間は３０分間であり、二段目の昇圧に要した時間は１時間２０分である。そして、泳動槽の両電極間に５０００Ｖの電圧を３０分間印加して一次電気泳動である等電点電気泳動を終了した。なお、試料溶液のストリップゲルへの導入及び一次電気泳動の操作中、ストリップゲルに通流される電流が５０μＡを超えないように調整した。 Thereafter, the primary electrophoresis step was performed according to a conventional method. That is, a voltage of 300 V was applied between both electrodes of the electrophoresis tank for 4 hours, and then the voltage was linearly increased from 300 V to 1000 V, and then linearly increased from 1000 V to 5000 V. The time required for the first step-up is 30 minutes, and the time required for the second step-up is 1 hour 20 minutes. And the voltage of 5000V was applied for 30 minutes between both electrodes of the electrophoresis tank, and the isoelectric focusing which is primary electrophoresis was complete | finished. During the introduction of the sample solution into the strip gel and the primary electrophoresis operation, the current passed through the strip gel was adjusted so as not to exceed 50 μA.
（二次電気泳動工程）
このようにして一次電気泳動したストリップゲルを泳動槽から取り出して二次電気泳動であるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは次のようにして行った。
(Secondary electrophoresis process)
The strip gel subjected to primary electrophoresis in this way was taken out of the electrophoresis tank and subjected to SDS-PAGE which is secondary electrophoresis. SDS-PAGE was performed as follows.
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに先立って、一次電気泳動したストリップゲルをＳＤＳ平衡化緩衝液に浸漬させることによって、当該ストリップゲル内の蛋白質にＳＤＳを結合させる平衡化処理を実施した。ここでＳＤＳ平衡化緩衝液は、基礎緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加した第１ＳＤＳ平衡化緩衝液にストリップゲルを３０分間浸漬させた後、前記基礎緩衝液に２５ｍｇ／ｍｌとなるようにヨードアセトアミドを添加した第２ＳＤＳ平衡化緩衝液にストリップゲルを１５分間浸漬させることによって行った。なお、基礎緩衝液の組成は、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、３０質量／容量％グリセロール、４質量／容量％ＳＤＳであり、これにマーカー色素としてブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）を０．００２質量／容量％となるように添加した。 First, prior to SDS-PAGE, an equilibration treatment for binding SDS to proteins in the strip gel was performed by immersing the strip gel subjected to primary electrophoresis in an SDS equilibration buffer. Here, the SDS equilibration buffer was prepared by immersing the strip gel in the first SDS equilibration buffer to which DTT (dithiothreitol) was added so as to be 10 mg / ml in the basal buffer, followed by 25 mg in the basal buffer. The strip gel was immersed for 15 minutes in a second SDS equilibration buffer to which iodoacetamide was added so as to be / ml. The composition of the basic buffer was 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M urea, 30 mass / volume% glycerol, 4 mass / volume% SDS, and bromophenol blue (BPB) as the marker dye was 0. It added so that it might become 0.002 mass / volume%.
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の平板ゲルには、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＮＴ Ｇｅｌ Ｄ（ディー・アール・シー株式会社製）を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する装置はＥｔｔａｎ ＤＡＬＴｓｉｘ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）を用いた。なお、本実施例にあっては７ｃｍ×７ｃｍの平板ゲルを用いた。この平板ゲルを予め陽極液を注入しておいた前記装置の泳動槽に配設し、この平板ゲルの上辺に前述した如く平衡化したストリップゲルを載置する。そして、２Ｗ／ｇｅｌの電力でマーカー色素が平板ゲルの先端近傍に達するまで電気泳動した。 As the slab gel for SDS-PAGE, Perfect NT Gel D (manufactured by DRC Co., Ltd.) is used, and the apparatus for performing SDS-PAGE is Etan DALTsix Electrophoresis system (manufactured by GE Healthcare UK Ltd.). It was. In this example, a 7 cm × 7 cm slab gel was used. The slab gel is placed in the electrophoresis tank of the apparatus into which the anolyte has been previously poured, and the strip gel equilibrated as described above is placed on the upper side of the slab gel. Then, electrophoresis was performed with a power of 2 W / gel until the marker dye reached the vicinity of the tip of the slab gel.
このようにして一次電気泳動の泳動方向と直交する方向へ二次電気泳動を行って二次元電気泳動が完了すると、前述したように本実施例では蛋白質を蛍光色素で標識してあるため、平板ゲル内の蛋白質をレーザースキャナ（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社製）にて可視化した。 In this way, when secondary electrophoresis is performed in a direction orthogonal to the migration direction of primary electrophoresis to complete two-dimensional electrophoresis, the protein is labeled with a fluorescent dye in this example as described above. The protein in the gel was visualized with a laser scanner (Typhoon 9400: manufactured by GE Healthcare UK Ltd.).
可視化した結果を本発明例１として図４に示す。なお、比較のため、ストリップゲルを膨潤させる際に電圧を印加しない以外は前同様に操作した結果を比較例１として図８に示す。また、本発明例１と比較例１についてそれぞれ、蛋白質導入工程及び一次電気泳動工程におけるストリップゲルへの印加電圧の値を次表に示す。 The visualization result is shown in FIG. For comparison, FIG. 8 shows the result of the same operation as before except that no voltage is applied when the strip gel is swollen. Moreover, the value of the voltage applied to the strip gel in the protein introduction step and the primary electrophoresis step is shown in the following table for Invention Example 1 and Comparative Example 1, respectively.
図４から明らかな如く、本発明例１にあっては、蛋白質導入工程において１００Ｖの電圧を１２時間印加したことによって、蛋白質のスポットが比較的良好に分離されている。これに対して図８から明らかな如く、比較例１にあっては、１２時間の蛋白質導入工程において電圧を印加していないので、蛋白質のスポットの総量が少ないのに加え、各スポットが相互に分離されずに連続的になっている。 As is clear from FIG. 4, in Example 1 of the present invention, the protein spots were separated relatively well by applying a voltage of 100 V for 12 hours in the protein introduction step. On the other hand, as apparent from FIG. 8, in Comparative Example 1, no voltage was applied in the protein introduction step for 12 hours, so that the total amount of protein spots was small, and each spot was mutually connected. It is continuous without being separated.
（実施例２）
次に、蛋白質導入工程における電圧の印加時間を１８時間にした場合について説明する。なお、本実施例にあっては、蛋白質導入工程における電圧の印加時間を１８時間にした以外は前述した実施例１と同様の操作を行った。なお、ストリップゲルの長さは７ｃｍであり、平板ゲルの寸法は７ｃｍ×７ｃｍである。
(Example 2)
Next, the case where the voltage application time in the protein introduction step is 18 hours will be described. In this example, the same operation as in Example 1 was performed except that the voltage application time in the protein introduction step was 18 hours. The length of the strip gel is 7 cm, and the dimension of the slab gel is 7 cm × 7 cm.
二次電気泳動後に可視化した結果を本発明例２として図５に示す。
図５から明らかな如く、本発明例２にあっては、蛋白質導入工程において電圧を印加する時間を１８時間になしても、蛋白質のスポットは図４に示した本発明例１と同程度に分離されていた。
The results visualized after secondary electrophoresis are shown in FIG.
As is clear from FIG. 5, in Example 2 of the present invention, even when the voltage application time is 18 hours in the protein introduction step, the protein spot is the same as that of Example 1 of the present invention shown in FIG. It was separated.
（実施例３）
次に、一次電気泳動における定電圧の印加間を本発明に係る印加時間になした場合と本発明より短い従来の印加時間になした場合とを比較した結果について説明する。
(Example 3)
Next, a result of comparison between the case where the application time according to the present invention is applied during the application of the constant voltage in primary electrophoresis and the case where the conventional application time is shorter than that of the present invention will be described.
図６は一次電気泳動における定電圧の印加間を本発明に係る印加時間になした場合の二次元電気泳動をレーザースキャンした結果を示す解析画像を表す写真であり、図９は一次電気泳動における定電圧の印加間を従来の印加時間になした場合の二次元電気泳動をレーザースキャンした結果を示す解析画像を表す写真である。前者を本発明例３とし、後者を比較例３として、両者の蛋白質導入工程及び一次電気泳動工程におけるストリップゲルへの印加電圧の値及び時間を次表に示す。なお、ストリップゲルへの印加電圧の値を次表に示したように設定した以外は、両者とも実施例１と同様の操作を行った。なお、ストリップゲルの長さは２４０ｍｍであり、平板ゲルの寸法は幅２５７ｍｍ×高さ２００ｍｍである。 FIG. 6 is a photograph showing an analysis image showing the result of laser scanning of two-dimensional electrophoresis when the application time according to the present invention is applied between constant voltage applications in primary electrophoresis, and FIG. It is a photograph showing the analysis image which shows the result of carrying out the laser scan of the two-dimensional electrophoresis when the application period of a constant voltage was made into the conventional application time. With the former as Invention Example 3 and the latter as Comparative Example 3, the values and times of voltage applied to the strip gel in the protein introduction step and the primary electrophoresis step are shown in the following table. The same operation as in Example 1 was performed except that the value of the voltage applied to the strip gel was set as shown in the following table. The length of the strip gel is 240 mm, and the size of the flat gel is 257 mm wide × 200 mm high.
上表の比較例３に示したように、従来にあっては、一次電気泳動において５００Ｖの定電圧を１時間しか印加していないため、図９に示したように、全体として蛋白質の分離能が低く、特に塩基性側の領域では全く分離されていない。これに対して前記表の本発明例３に示したように、本発明方法にあっては一次電気泳動において５００Ｖの定電圧を４時間印加しているため、図６に示したように、蛋白質の分離能が全体的に向上しており、特に塩基性側の領域において比較的良好に分離されていた。 As shown in Comparative Example 3 in the above table, in the prior art, a constant voltage of 500 V is applied for only 1 hour in primary electrophoresis, so as shown in FIG. And is not separated at all, particularly in the basic region. On the other hand, as shown in Example 3 of the above table, in the method of the present invention, a constant voltage of 500 V was applied for 4 hours in the primary electrophoresis, and therefore, as shown in FIG. The separability was generally improved, and the separation was relatively good especially in the basic region.
（実施例４）
次に、実施例３で説明した本発明方法に加えて、一次電気泳動において第１定電圧を印加した場合について説明する。
Example 4
Next, in addition to the method of the present invention described in Example 3, a case where a first constant voltage is applied in primary electrophoresis will be described.
図７は後記する本発明に係る方法で行った二次元電気泳動をレーザースキャンした結果を示す解析画像を表す写真である。本結果を本発明例４とし、その蛋白質導入工程及び一次電気泳動工程におけるストリップゲルへの印加電圧の値を次表に示す。 FIG. 7 is a photograph showing an analysis image showing the result of laser scanning of two-dimensional electrophoresis performed by the method according to the present invention described later. The result is referred to as Invention Example 4, and the values of voltage applied to the strip gel in the protein introduction step and the primary electrophoresis step are shown in the following table.
上表に示したように、本発明方法にあっては一次電気泳動において、１００Ｖの第１定電圧を２時間印加した後、５００Ｖの定電圧を４時間印加しているため、図７に示したように、蛋白質の分離能が飛躍的に向上しており、酸性側の領域から塩基性側の領域に亘って非常に多数の蛋白質のスポットが個々に分離されていた。 As shown in the above table, in the method of the present invention, in primary electrophoresis, after applying the first constant voltage of 100 V for 2 hours and then applying the constant voltage of 500 V for 4 hours, it is shown in FIG. As described above, the separation performance of the protein has been dramatically improved, and a very large number of protein spots were individually separated from the acidic region to the basic region.
Ｓ１ ステップ１
Ｓ２ ステップ２
Ｓ３ ステップ３
Ｓ４ ステップ４
Ｓ５ ステップ５
S2 Step 2
S4 Step 4
S5 Step 5
Claims (4)
前記一次電気泳動工程において、前記定電圧印加ステップの前に、前記定電圧より低い値であって、５０Ｖ以上３００Ｖ以下の適宜の値の第１定電圧を２時間以上印加して、前記各蛋白質の分子量より低い分子量の低分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させる第１電圧印加ステップを行い、
その後、前記定電圧印加ステップにおいてストリップゲルに少なくとも３時間、４００Ｖ以上７００Ｖ以下の適宜の値の前記定電圧を印加して、前記低分子夾雑物の分子量より高い分子量の高分子夾雑物を前記ストリップゲルから排出させる
ことを特徴とする二次元電気泳動による蛋白質の分離方法。 After performing a protein introduction step of introducing a plurality of types of proteins into the strip gel and a constant voltage application step of applying a predetermined constant voltage to the strip gel into which each protein has been introduced, the applied voltage is gradually increased to strip A primary electrophoresis step in which each protein in the gel is migrated, and the strip gel is disposed at a predetermined position of the slab gel, and an appropriate electric power is applied to the slab gel and the strip gel so that each protein in the strip gel When separating the required proteins from the respective proteins by performing two-dimensional electrophoresis in which the secondary electrophoresis step of electrophoresis in this order is performed,
In the primary electrophoresis step, before the constant voltage application step, a first constant voltage having a value lower than the constant voltage and an appropriate value of 50 V or more and 300 V or less is applied for 2 hours or more , Performing a first voltage application step of discharging low molecular impurities having a molecular weight lower than that of the strip gel from the strip gel ,
Thereafter, in the constant voltage application step, the strip gel is applied with a constant voltage of an appropriate value of 400 V or more and 700 V or less for at least 3 hours to remove a high molecular weight contaminant having a molecular weight higher than that of the low molecular contaminant. A method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis, wherein the protein is discharged from a gel .
請求項１又は２に記載の二次元電気泳動による蛋白質の分離方法。The method for separating proteins by two-dimensional electrophoresis according to claim 1 or 2.
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