JP5904484B2 - Ｉｎ−１１１封入リポソームを含む放射性医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、¹¹¹Ｉｎ封入リポソームに関する。

ＰＥＴやＳＰＥＣＴに代表される核医学画像診断は、非侵襲的にがんを診断する画像診断法の一つとして、広く用いられている。この方法は、放射性同位元素で標識された薬剤（放射性医薬品）を被験者に投与し、当該放射性医薬品から直接的又は間接的に放出されるγ線を専用のカメラで捉え、画像再構成を行う方法である。

がん画像診断に用いる放射性医薬品の一つとして、放射性同位元素で標識したリポソームが考案され、臨床応用に向けて検討が行われている。リポソームの放射性同位元素による標識は、リポソームの脂質膜に放射性同位元素の錯体を結合させる方法と、リポソーム内の水性コア内に放射性同位元素の水溶性錯体を封入する方法により行われる。これらの方法のうち、放射性同位元素の錯体を生体内において安定に維持する点で、後者の方が優れた方法であるといえる。

水性コア内に放射性同位元素の水溶性錯体を封入したリポソームとして、非特許文献１には、¹¹¹Ｉｎや⁶⁷Ｇａとニトリロトリ酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＮＴＡ）との錯体を封入したリポソームを始め、種々の放射性同位元素封入リポソームが開示されている。

非特許文献２には、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）をリポソームに封入し、¹¹¹Ｉｎとアセチルアセトンとの錯体を配位子交換反応させることにより、¹¹¹Ｉｎをリポソームに封入させて得られた、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ封入リポソームが記載されている。

非特許文献３は、Ａ２３１８７との配位子交換により得られた¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ封入リポソームに関する技術を開示するものであるが、非特許文献２によれば、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡでは腫瘍集積が認めらない一方、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ封入リポソームでは、腫瘍集積が認められたとされている。

しかしながら、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ封入リポソームは、肝臓や脾臓に取り込まれた後代謝されて¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡを放出し、そのまま肝臓や脾臓に滞留してしまうといった問題が指摘されていた。このような問題点を克服した例として、特許文献１には^99mＴｃとエチレンジシステイン（以下、ＥＣ）との錯体を封入したリポソーム（^99mＴｃ−ＥＣ錯体封入リポソーム）が開示されている。この文献において、^99mＴｃ−ＥＣ錯体封入リポソームは、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ封入リポソームと異なり肝臓や脾臓から速やかに排出され、肝臓及び脾臓からのクリアランス性能が改善された事が開示されている。

なお、リポソームに放射性同位元素の錯体を封入する方法としては、直接導入法やアクティブローディング法等の方法がこれまでに開示されているが（特許文献１、非特許文献１）、リポソーム内により多くの放射性同位元素の錯体をより短い時間で導入できる点で、アクティブローディング法の方が優れている。

国際公開第２００３／０７２１４２号パンフレット

Ｉｚｕｍｉ Ｏｇｉｈａｒａ−Ｕｍｅｄａ ａｎｄ Ｈｉｄｅｏ Ｎｉｓｈｉｇｏｒｉ，"Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｌｏｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｄａｉｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ"，ｉｎ ＭＭＬ Ｓｅｒｉｅｓ ｖｏｌ．３"Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ａｎｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｏｉｌｏｇｙ"（Ｒｅｚａ Ａｒｓｈａｄｙ Ｅｄｓ．），ＵＫ，Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ，２００１ Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂｅａｕｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ.２３，８１０−８１５ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔ．Ｐｒｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ.２４，４５−５１ Ｙｕｅｊｉｎ Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ，３５，４０４−４１４ Ｃａｒｏｌｙｎ Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ.Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２２，１６５−１７３

上述したように、^99mＴｃ−ＥＣ錯体封入リポソームは、肝臓や脾臓から速やかにクリアランスされるといった、優れた性能を有している。しかし、リポソームへの錯体の導入にはある程度の時間を有するので、十分に高い比放射能を実現するためには、より半減期の長い¹¹¹Ｉｎの錯体を用いることが望ましいといえる。また、リポソームが腫瘍に十分量集積し、かつバックグラウンドとなる血中放射活性が消失して、十分な腫瘍コントラストを得られるようになるまでに、時間がかかる。そのため、半減期６時間の^99mＴｃでは、がんの描画が難しい。したがって、半減期が長いことは、得られた画像における腫瘍のコントラストを向上させる上でも、有利である。

ところが、¹¹¹Ｉｎ錯体を封入されたリポソームであって、^99mＴｃ−ＥＣ錯体封入リポソームのように優れた肝臓及び脾臓からのクリアランス性能を有したものは、これまでに開示されていなかった。

^１１１Ｉｎ−ＥＣ錯体は公知であるが（非特許文献４、５）、非特許文献５では、ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｌｅａｔｉｎｇとして^１１１Ｉｎ錯体を用いる技術に着目されているのみであり、^１１１Ｉｎ錯体を単独の錯体として用いることには着目されていない。また、リポソームに^１１１Ｉｎ−ＥＣを封入することは何ら開示されていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、腫瘍への高い集積性を保持し、かつ、肝臓及び脾臓からのクリアランス性能を向上させた¹¹¹Ｉｎ封入リポソームを提供する事を目的とした。

本発明者らは検討を重ねた結果、¹¹¹Ｉｎとエチレンジシステインとの錯体（¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体）を封入したリポソーム（¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム）が、腫瘍への高い集積性を保持しながら、優れた肝臓及び脾臓からのクリアランス性能を有する事を見出し、本発明を完成させた。

これまで、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体は^99mＴｃ−ＥＣ錯体と錯体構造が大きく異なるため、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体は^99mＴｃ−ＥＣ錯体において見られたような優れた肝臓や脾臓からのクリアランス性能は有さないものと考えられていた。そのため、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームを作成して体内動態を検討するといったことは、これまで試みられたことは無かった。本発明者らはこのような従来からの知見に反して検討を行い、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームであっても、肝臓及び脾臓からの優れたクリアランス性能を有している事を見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、リン脂質を用いて製造されたリポソーム中に¹¹¹Ｉｎとエチレンジシステイン（ＥＣ）との錯体を封入させた¹¹¹Ｉｎ封入リポソームを提供するものである。

また、本発明は、上記の¹¹¹Ｉｎ封入リポソームを含む、放射性医薬組成物を提供するものである。

また、本発明は、上記の¹¹¹Ｉｎ封入リポソームを含む、腫瘍用画像化剤を提供するものである。

また、本発明は、リン脂質を用いて製造されたリポソーム中に¹¹¹Ｉｎを封入させた¹¹¹Ｉｎ封入リポソームの製造方法であって、
エチレンジシステインを封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームと、
エチレンシステインよりも脂溶性が高い有機配位子を含む¹¹¹Ｉｎ錯体と、
を混合し、
前記ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジシステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに¹¹¹Ｉｎを封入させる、¹¹¹Ｉｎ封入リポソームの製造方法を提供するものである。

さらに本発明は、エチレンジシステインを封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームを有する第１の容器と、
エチレンシステインよりも脂溶性が高く、かつ、¹¹¹Ｉｎに配位結合して¹¹¹Ｉｎ錯体を形成するための有機配位子を有する第２の容器と、
を備え、
前記¹¹¹Ｉｎ錯体と、前記ＥＣ封入リポソームとを混合し、前記ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに¹¹¹Ｉｎを封入させるためのキットを提供するものである。

本発明に係る¹¹¹Ｉｎ封入リポソームは、腫瘍への高い集積性を保持し、かつ、肝臓及び脾臓からの良好なクリアランス性能を有している。本発明に係る¹¹¹Ｉｎ封入リポソームは、生体内で安定な¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体として速やかに尿中に排泄させることができる。

¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与マウス（◆）及び¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソーム投与マウス（■）における各臓器の放射能量の測定結果を示す図である。ａ）は、肝臓の結果を示す図であり、ｂ）は、脾臓の結果を示す図であり、ｃ）は腫瘍の結果を示す図であり、ｄ）は血液の結果を示す図である。 ａ）は、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与後の担がんマウスにおける、尿中及び糞中における放射能量の経時変化（◆：尿中、■：糞中）を示す図である。ｂ）は、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソーム投与後の担がんマウスにおける、尿中及び糞中における放射能量の経時変化（◆：尿中、■：糞中）を示す図である。 （ａ）は、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与２４時間後の担がんマウスにおける尿のＨＰＬＣチャートを示す図である。（ｂ）は、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体／マウス尿混液のＨＰＬＣチャートを示す図である。 ¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームを投与した担がんマウスにおけるＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を示す図である。ａ）が投与１時間後を示し、ｂ）が投与２６時間後を示す。 ¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームを投与した担がんマウスにおけるＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を示す図である。ａ）が投与１時間後を示し、ｂ）が投与２４時間後を示す。

本発明によると、リン脂質を用いて製造されたリポソームに¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体を封入した¹¹¹Ｉｎ封入リポソームが提供される。本発明の¹¹¹Ｉｎ封入リポソームは、ＥＣを封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームと、ＥＣよりも脂溶性が高い有機配位子を含む¹¹¹Ｉｎ錯体と、を混合し、ＥＣリポソーム中のエチレンジシステインと有機配位子との配位子交換により、ＥＣ封入リポソームにさらに¹¹¹Ｉｎを封入させることが好ましい。ＥＣよりも脂溶性が高い有機配位子（以下、「脂溶性リガンド」ともいう。）であれば、インキュベーション環境下において^１１１Ｉｎをリポソームの水性コア内のエチレンジシステインに受け渡し得る¹¹¹Ｉｎ錯体を形成でき、いわゆるアクティブローディング法を用いて、¹¹¹Ｉｎをリポソームに導入することができる。したがって、より短時間で、より多くの¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体をリポソーム内に封入する事ができる。

脂溶性リガンドとしては、上述したように、¹¹¹Ｉｎとの間で形成された錯体が、インキュベーション環境下において¹¹¹Ｉｎをリポソームの水性コア内のエチレンジシステインに受け渡し得る錯体となるようなものが用いられる。このようなリガンドとしては、例えば、¹¹¹Ｉｎとの錯体が、インキュベーション環境下において、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体よりも、錯体安定度定数が低くなるようなリガンドが挙げられる。好ましくは、８−ヒドロキシキノリン、トロポロン、又はアセチルアセトンを用いることができ、特に好ましくは８−ヒドロキシキノリンを用いることができる。

ＥＣ封入リポソーム、及び、脂溶性リガンドを含む¹¹¹Ｉｎ錯体を用いた配位子交換反応は、水中で、インキュベートをすることにより行うことが好ましいが、インキュベートの条件は、特に限定する必要は無く、リポソームの作成に用いたリン脂質の種類等に応じて適宜設定する事ができる。

以下に、ＥＣ封入リポソーム、及び、脂溶性リガンドを含む¹¹¹Ｉｎ錯体の好ましい態様における製造方法についてそれぞれ説明し、次いで、本発明に係る¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームの好ましい態様における製造方法について説明する。

（ＥＣ封入リポソームの製造方法）
ＥＣ封入リポソームは、当業者により通常用いられるリポソーム形成性物質を原料として、公知の方法（例えば、特許文献１明細書記載の方法）に従って製造する事ができる。以下、好ましい態様における製造方法の例を、記載する。

ＥＣ封入リポソームの製造においては、まず、リポソーム形成性物質を溶媒に溶解し、フラスコ等の容器内で溶媒を減圧下で留去して、当該容器の内壁に脂質の薄膜を形成する。

ここで、リポソーム形成性物質としては、生体内において安定なリポソームを形成する目的から、リン脂質が好ましく用いられる。リン脂質としては、リポソームの作成において当業者の間で通常用いられるものであれば、特に限定する必要は無い。例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエアノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、大豆レチシン、卵黄レシチン等を用いることができる。

リン脂質を溶解する溶媒としては、リン脂質を溶解できる種々の溶媒を用いることができる。例えば、クロロホルム、メチルクロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類等が挙げられる。好ましくは、クロロホルム、メタノール、又はこれらの混合液を用いることができる。

また、リン脂質を上記溶媒に溶解する際には、所望によりリポソームの構造を安定化するための安定化剤や、酸化防止剤を含有させても良い。安定化剤としては、リポソームの製造において通常用いられる公知の物質を用いることができ、好ましくはコレステロールを用いることができる。添加する安定化剤の量は、形成したリポソームが脆くなりすぎない量とする必要があり、例えばコレステロールの場合は、リン脂質に対してモル比にして（リン脂質：コレステロール＝）１：１以下とし、好ましくは２：１とする。

ＥＣ封入リポソームの製造においては、別に、エチレンジシステイン溶液を調製する。エチレンジシステイン溶液は、生理食塩液と等張となるように調整することが望ましい。この目的において、エチレンジシステインを溶解する液を生理食塩液としても良いが、より比重の重い他の生体認容性物質の溶液に溶解しても良い。より比重の重い他の生体認容性物質の溶液を用いることにより、後の¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームの精製工程を、遠心分離機等を用いて迅速に行うことが可能となる。比重の重い他の生体認容性物質の溶液としては、５％（ｗ／ｖ）マンニトール溶液又は１０％（ｗ／ｖ）スクロースを好ましく用いることができる

リン脂質の薄膜とエチレンジシステイン溶液が調製できたら、リン脂質の薄膜を形成したフラスコにエチレンジシステイン溶液を加えて薄膜を膨潤させ、リン脂質の相転移温度まで溶液を加温して静置することにより、懸濁液としてＥＣ封入リポソームを得る。

この懸濁液をメンブランフィルターに通液してリポソームの大きさをそろえ、ゲルろ過フィルターに付して、遊離のエチレンジシステインを除去する事により、ＥＣ封入リポソームが得られる。得られたＥＣ封入リポソームは、使用時まで生理食塩液に懸濁させておくのが望ましい。

なお、ＥＣ錯体リポソームは、平均直径５０〜１５０ｎｍの範囲で調製することが好ましく、より好ましくは平均直径８０〜１３０ｎｍに調製する。こうすることで、腫瘍への集積性を向上させることができる。

（¹¹¹Ｉｎと脂溶性リガンドとの錯体の調製）
リポソーム内への¹¹¹Ｉｎの導入に用いる脂溶性リガンドとは、エチレンジシステインよりも脂溶性の高い有機配位子であるが、具体的には、¹¹¹Ｉｎとの間で形成された錯体が、後述するインキュベーション環境下において¹¹¹Ｉｎをリポソームの水性コア内のエチレンジシステインに受け渡し得る錯体となるようなものを脂溶性リガンドとして用いることができる。これは、後のインキュベーションにおいてトランスキレーションによってリポソーム内で¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体が形成されるようにするためである。この様なリガンドとしては、好ましくは、８−ヒドロキシキノリン、トロポロン、又はアセチルアセトンを用いることができ、特に好ましくは８−ヒドロキシキノリンを用いることができる。また、インキュベーション環境下、具体的には、水中、かつ、好ましくはｐH５〜８、より好ましくはｐＨ５〜６において、ＥＣよりも¹¹¹Ｉｎに対する錯体安定度定数が小さい他の脂溶性リガンドを用いても良い。

¹¹¹Ｉｎと脂溶性リガンドとの錯体は、定法に従って調製される。例えば、所望の放射能濃度の［¹¹¹Ｉｎ］塩化インジウム（¹¹¹ＩｎＣｌ₃）を、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、又はこれらの混合液に溶解した８−ヒドロキシキノリンと混合し、さらに、必要に応じて、緩衝液を加えてｐＨを好ましくはｐH５〜８、より好ましくはｐＨ５〜６に調整し、静置することにより、得ることができる。

例えば、¹¹¹Ｉｎと８−ヒドロキシキノリンとの錯体の場合は、所望の放射能濃度の［¹¹¹Ｉｎ］塩化インジウム（¹¹¹ＩｎＣｌ₃）を、エタノール等に溶解した８−ヒドロキシキノリンと混合し、さらにｐＨ５〜６の酢酸緩衝液等を加えて静置することにより、得ることができる。

（¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ封入リポソームの調製）
好ましい態様において、¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ封入リポソームは、上記で調製した¹¹¹Ｉｎと脂溶性リガンドとの錯体と、ＥＣ封入リポソームとを混合し、一定条件下でインキュベートすることによって得ることができる。

インキュベーションに使用する溶媒としては、水、アルコール等の水溶性有機溶媒又はこれらの混合物が好ましく、水が特に好ましい。水は、塩を含んだものであってよく、ｐＨとしては、５〜８の生体内に近い条件が好ましい。また、¹¹¹Ｉｎと脂溶性リガンドとの錯体の調製で使用した溶媒、及び、ＥＣ封入リポソームを懸濁させている生理食塩液をそのまま用いることができる。ＥＣと脂溶性リガンドとの配位子交換反応を効率よく行うため、¹¹¹Ｉｎと脂溶性リガンドとの錯体と、ＥＣ封入リポソームとを混合した後に、ｐＨや濃度の調整を行ってもよい。

このときの温度は調製時に適宜設定されるが、リポソームの安定性を考慮すると、用いたリン脂質の相転移温度以下の温度とすることが好ましい。また、反応効率を上げてインキュベーション時間を短縮するためには、常温（１５〜２５℃）以上の温度を用いることが望ましい。例えば、リン脂質としてジステアロイルホスファチジルコリンを用いた場合であれば、好ましくは２５〜６０℃とすることができ、より好ましくは４０〜６０℃とすることができ、特に好ましくは４０℃とすることができる。

インキュベーション時間についても、適宜設定する事ができる。このとき、インキュベーション時間を長くするほど¹¹¹Ｉｎがより多くリポソーム内に取り込まれるが、同時に¹¹¹Ｉｎの放射能が減衰してしまうので、注意する必要がある。インキュベーション温度を４０℃とした場合であれば、２０〜４０分、例えば３０分とすれば十分である。

その後、遠心分離機等を用いて外水相の¹¹¹Ｉｎと¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソーム画分とを分離し、沈殿として得られた¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソーム画分を得る。

（¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームの使用方法）
次に、¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームの使用方法について述べる。
¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームは、ヒトなどの哺乳類への投与に適した形態で含む放射性医薬組成物として使用することができる。放射性医薬組成物は、水や生理食塩液に¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームを懸濁させたものであることが好ましい。かかる放射性医薬組成物は、緩衝剤、薬学的に許容される安定剤又は酸化防止剤などの追加成分を適宜含んでいてもよい。

こうした放射性医薬組成物は、他のＳＰＥＣＴ診断剤と同様、所望の放射能濃度に調整された液を、静脈内投与又は局所投与して、画像化剤として用いることができる。放射能量は、汎用のＳＰＥＣＴカメラによって画像化できる量であれば良い。本発明の¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームを含む放射性医薬組成物は、特に、腫瘍の画像化剤として好適であり、汎用のＳＰＥＣＴカメラを用い、定法を用いて撮像及び画像再構成を行うことによって、腫瘍診断に適した診断画像を得ることができる。

（¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームを製造するためのキット）
次に、¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームを製造するためのキットについて説明する。このキットは、
（ｉ）エチレンジシステイン（ＥＣ）を封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームを有する第１の容器、および
（ｉｉ）上記脂溶性リガンドを有する第２の容器、
を備えるものである。
このキットは、¹¹¹Ｉｎ錯体と、ＥＣ封入リポソームとを混合し、ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジステインと有機配位子との配位子交換により、ＥＣ封入リポソームにさらに¹¹¹Ｉｎを封入させるためのキットであるが、こうした¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームを製造するための一連の操作方法を記載した使用説明書を含むことがより好ましい。

第１の容器中、ＥＣ封入リポソームは、生理食塩水で懸濁させてあってもよいし、凍結乾燥させておいて、使用時に生理食塩水で懸濁させてもよい。

第２の容器中、脂溶性リガンドは、溶媒に溶解されていてもよいし、乾燥状態であってもよい。脂溶性リガンドが乾燥状態の場合は、別途、脂溶性リガンドを溶解させるための溶媒を封入した第３の容器を用意してもよい。溶媒としては、有機配位子を溶解させるものであればよく、水、アルコール等の水溶性有機溶媒、これらの混合液が挙げられる。

第２の容器は、¹¹¹Ｉｎ錯体を形成させた脂溶性リガンドを有するものであってもよいし、¹¹¹Ｉｎを含む第４の容器を用意してもよい。

上記の第１〜第４の容器は、バイアル、シリンジなどの様々な形態の容器とすることができる。これらの容器は、別々の容器にしてもよいし、単一の容器の中に別々の区画として存在していてもよい。

（実施例１）¹¹¹Ｉｎ‐ＥＣ錯体封入リポソームの調製
（エチレンジシステインの合成）
エチレンジシステイン（Ｎ，Ｎ'−ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＥＣ）の合成はＢｒｏｎｄｅａｕらの方法（Ｂｌｏｎｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．４５：４９−５２，１９６７）に準じて行った。Ｌ−チオプロリン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，東京化成工業株式会社製）のアンモニア溶液に金属ナトリウムを加え撹拌した後、塩化アンモニウムを加え室温で一晩撹拌し、生成した結晶を水に溶解し塩酸で析出させることによって得た（融点２５１−２５４℃）。

（ＥＣ封入リポソーム溶液の調製）
ナス型フラスコ内で、クロロホルムに溶解させたジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（日本油脂株式会社製）とコレステロール（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）をモル比２：１（２０μｍｏｌ：１０μｍｏｌ）で混合させた後、エバポレーターを用いて、６０℃、減圧下で溶媒を留去することにより、フラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させた。さらに、エバポレーターで4時間以上減圧下に置き、溶媒を完全に留去した。別に、エチレンジシステインを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に加え、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを少量加えて溶解し、１０ｍｍｏｌ／ＬのＥＣ溶液を調製した。調製したＥＣ溶液２ｍＬを脂質の薄膜を形成した上記フラスコに添加し、６５℃湯浴にて脂質薄膜を膨潤させ、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を懸濁液として得た。リポソーム形成装置（製品名：Ｔｈｅ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、日油リポソーム株式会社製）に、ポリカーボネート・メンブランフィルター（製品名：Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（登録商標）、Ｗｈａｔｍａｎ社製）孔径０．１μｍ２枚、０．２μｍ１枚を重ねてセットし、加圧ろ過を繰り返し、単膜リポソーム（ＳＵＶ）を得た。得られたリポソームは生理食塩水で膨潤したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０ ｆｉｎｅ（ＧＥ ヘルスケア株式会社製）を担体とするカラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ）に付し、生理食塩水で溶出して精製した。得られたリポソーム画分を４２４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、得られた沈殿を生理食塩水１．５ｍＬで再懸濁してＥＣ封入リポソーム溶液を調製した。得られたＥＣ封入リポソームの平均直径を動的光散乱（形式：Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ ＵＰＡ 日機装株式会社製、溶媒：水、測定温度２５℃、測定時間：１８０秒×３）にて測定したところ、１０４．８ｎｍであった。

（¹¹¹Ｉｎ−オキシンの調製）
¹¹¹Ｉｎ溶液（塩化インジウム（¹¹¹Ｉｎ）注、日本メジフィジックス株式会社製）６００μＬと８−ヒドロキシキノリン（和光純薬株式会社製）のエタノール溶液（５１ｍｍｏｌ／Ｌ）１５μＬを混和し、これに０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２００μＬを加え、４０℃で３０分間インキュベーションし、¹¹¹Ｉｎ−オキシン溶液を調製した。

（¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームの調製）
¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは配位子交換反応により調製した。上記で調製したＥＣ封入リポソーム溶液１．５ｍＬを、上記で調製した¹¹¹Ｉｎ−オキシン溶液（全量）に加え、４０℃で３０分インキュベーションした後、４２４，０００×ｇ、２０分間、遠心し、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム画分を沈殿として分離した。これを生理食塩水で再懸濁して¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ封入リポソームを得た。未封入の¹¹¹Ｉｎ−オキシンは上清として除去した。得られた¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームにつき、下記式（１）に従って標識率を測定したところ、８０〜９０％であった。放射能は、キューリーメータ（形式：ＩＧＣ−７、アロカ株式会社製）で測定した。

（参考例１）¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体／マウス尿混液の調製
５％（ｗ／ｖ）マンニトール溶液に少量の水酸化ナトリウムを滴下してｐＨを８とした液にＥＣを溶解し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＣ溶液を調製した。
¹¹¹Ｉｎ溶液（塩化インジウム（¹¹¹Ｉｎ）注、日本メジフィジックス株式会社製）３００ μＬと０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２００μＬを混合し、これに上記１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＣ溶液を６０μＬ加えて¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体溶液を調製した。溶液中の¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体の存在、及び、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体以外の¹¹¹Ｉｎの化学形が溶液中に存在しないことは、ＴＬＣで確認した。
別に、健常マウスを代謝ケージ内に置き、排泄された尿を採取した。採取したマウスの尿を精製水で２０倍に希釈した後、フィルター(孔径０．２μｍ）にて濾過した（以下、希釈マウス尿という）。
上で調製した¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体溶液２０μＬを希釈マウス尿２５０μＬと混合し、^１１１Ｉｎ−ＥＣ錯体／マウス尿混液とした。
なお、ＴＬＣを用いた^１１１Ｉｎ−ＥＣ錯体の分析条件は下記のとおりである。
ＴＬＣプレート：シリカゲルプレート（製品名：Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０、メルク株式会社製）
展開相：エタノール／０．４ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６）の混合液（３：１）
検出：フルオロイメージアナライザー（形式：ＦＬＡ−７０００， 富士フイルム株式会社製）

（実施例２）¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム内における¹¹¹Ｉｎの化学形分析
¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム溶液２００μＬと生理食塩水で飽和させた１−オクタノール５００μＬを混合し、５分間激しく揺とうした後、５分間静置し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ×５分）して、水相とオクタノール相に分離した。それぞれの相中の放射活性を測定し、¹¹¹Ｉｎの水相への移行を確認した。さらに、水相をＨＰＬＣによって分析し、水相内における¹¹¹Ｉｎの化学形を同定した。その結果、水相内の¹¹¹Ｉｎが、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体の形で存在している事が確認された。本実験においては、リポソーム水性コア内に存在していた¹¹¹Ｉｎは、全て水相に移行している。当該水相中の¹¹¹Ｉｎが¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体の形で存在していた事から、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームの水性コア内に存在している¹¹¹Ｉｎは、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体の形で存在していることが確認された。

なお、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体のＨＰＬＣの測定条件は、以下のとおりである。
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ナカライテスク株式会社製）
移動相：０．０１ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ：６．８）とアセトニトリルとの混合溶媒（体積比９５：５）
検出器：ガンマ線検出装置（ポジトロンスペクトロメータ）（形式：ＪＳＭ−１４０５、アロカ株式会社製）

（実施例３）Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスにおける¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームの体内動態及び排泄の観察
Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんモデルは、ｄｄＹマウス（７〜９週齢、体重３０〜４０ｇ）の肢皮下にＳａｒｃｏｍａ１８０細胞２×１０⁶個を移植して作成し、移植後８〜１２日後に実験に供した。リン脂質濃度５μｍｏｌ／ｍＬとなるように生理食塩水で希釈した¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム溶液０．２ｍＬ（０．２〜１ＭＢｑ）をＳａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスに尾静脈より投与した。投与１、６、１２、２４、４８時間後に断頭によって屠殺した後、各組織を摘出し重量測定を行い、さらに放射能をオートガンマカウンター（形式：２４８０ＷＩＺＡＲＤ^２、株式会社パーキンエルマージャパン製）で測定した。

各臓器に分布した放射能は、投与した量を１００％としたときのそれぞれの臓器１ｇあたりの放射能（％ＡＤ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ）として表した。結果を図１ａ）〜ｄ）のうち、◆で示す。ａ）は、肝臓の結果を示す図であり、ｂ）は、脾臓の結果を示す図であり、ｃ）は腫瘍の結果を示す図であり、ｄ）は血液の結果を示す図である。図１は、マウス５匹の平均を示した。

また、投与６、１８、２４時間後に、尿中及び糞中への放射能の排泄量を測定し、投与した量に対する比率で評価した。結果を図２ａ）で示す。図２ａ）中、◆が尿中における放射能量の経時変化を示し、■が糞中における放射能量の経時変化を示す。図２は、マウス３匹の平均を示した。

さらに、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム溶液投与２４時間後のマウスの尿を回収し、投与２４時間後に尿中に存在する放射能の化学形の分析を行った。採取した尿を精製水で２０倍に希釈し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＬＧ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でろ過後、ＨＰＬＣによって¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体を分析した。なお、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体のＨＰＬＣの条件は、実施例２で示したとおりである。結果を図３（ａ）に示す。なお、図３（ｂ）は、参考例１で調製した¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体／マウス尿混液を同条件で測定したＨＰＬＣチャートである。

図１ａ）及びｂ）で示されるように、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは、肝臓及び脾臓に一旦は取り込まれるものの、時間の経過に伴って速やかにクリアランスされる事が確認された。また、図１ｃ）で示されるように、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは、投与後腫瘍に取り込まれ、その後も滞留している事が確認された。

また、図２ａ）で示すように、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは、投与後２４時間にかけて、約５０％が尿中及び糞中に排泄され、そのうちほとんどが尿中に排泄されていた。この結果から、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは、速やかに尿及び糞により排泄される事が示された。

図３で示されるように、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与マウスは、尿中において、¹¹¹Ｉｎが遊離することなく、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体の状態で存在している事が確認された。

（実施例４）Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスにおけるＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームを投与した担がんマウスにおける腫瘍集積を小動物用ｎａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置（Ｂｉｏｓｃａｎ社製）を用いて画像化した。具体的には、実施例１で調製した¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ封入リポソーム（１８．５ＭＢｑ）を、実施例２と同様な方法で作製した担がんマウス（７〜９週齢、体重３０〜４０ｇ）に尾静脈から投与し、投与後１及び２６時間後に画像を収集した。４検出器を用いて、総収集方向２８、１方向につき１５０秒の収集を行い、ＯＳＥＭ法を土台とするＩｎＶｉｖｏＳｃｏｐｅソフトウエア（Ｂｉｏｓｃａｎ社）を用いて、画像再構成を行った。Ｓｕｂｓｅｔ／Ｉｔｅｒａｔｉｏｎを７／１−３，１４／４−６，２８／７−９（収集方向数２８）とし、ｖｏｘｅｌ ｓｉｚｅを０．３ｍｍ、ｆｉｌｔｅｒ ｓｉｚｅをｖｏｘｅｌ ｓｉｚｅの３５％とした。

得られたＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を、図４に示す。図４ａ）は投与１時間後の、図４ｂ）は投与２６時間後の画像を示す。図示するように、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与マウスでは、一旦は肝臓及び脾臓への集積が見られるものの、その後クリアランスされ、投与後２６時間ではほとんど肝臓及び脾臓への集積は見られず、膀胱への集積が確認された。また、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソーム投与マウスでは、投与後２６時間にかけて¹¹¹Ｉｎが腫瘍に集積している事が確認され、投与２６時間後では、腫瘍のコントラストが良好な画像が得られていた。

（比較例１）¹¹¹Ｉｎ‐ＮＴＡ錯体封入リポソームの調製
ＥＣの代わりにニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用い、上記実施例１と同様の方法を行って¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体を封入したリポソーム（¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソーム）を調製した。具体的には、ＥＣの代わりにＮＴＡを用いてＮＴＡ封入リポソーム溶液を調製し、¹¹¹Ｉｎ−オキシン溶液との配位子交換反応により、¹¹¹Ｉｎ‐ＮＴＡ錯体封入リポソームを得た。なお、ＮＴＡ封入リポソームの調製に際しては、エチレンジシステインを５％（ｗ／ｖ）マンニトール水溶液に溶解して得た溶液の代わりに、ニトリロ三酢酸を５％（ｗ／ｖ）マンニトール含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いた。

（比較例２）Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスにおける¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームの体内動態及び排泄の観察
比較例１で調製した¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームを用いた以外は実施例３と同様な方法で、Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスにおける¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームの体内動態及び排泄を観察した。

各臓器に分布した放射能は、投与した量を１００％としたときのそれぞれの臓器１ｇあたりの放射能（％ＡＤ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ）として表した。結果を図１ａ）〜ｄ）のうち、■で示す。図１は、マウス５匹の平均を示した。

また、投与６、１８、２４時間後に、尿中及び糞中への放射能の排泄量を測定し、投与した量に対する比率で評価した。結果を図２ｂ）で示す。図２ｂ）中、◆が尿中における放射能量の経時変化を示し、■が糞中における放射能量の経時変化を示す。図２は、マウス３匹の平均を示した。

図１ａ）及びｂ）で示されるように、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームでは、肝臓及び脾臓に移行した¹¹¹Ｉｎがそのまま滞留していた。また、図２に示すように、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームでは、投与後２４時間かけ、１０％程度しか尿中及び糞中に輩出されていなかった。

（比較例３）Ｓａｒｃｏｍａ１８０担がんマウスにおけるＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
実施例２記載の方法により調製した¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソームを投与した担がんマウスにおける腫瘍集積を、実施例４と同様にして画像化した。ただし、画像収集は、投与後１及び２４時間後に行った。

得られたＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を図５に示す。図５ａ）は投与１時間後の、図５ｂ）は投与２４時間後の画像を示す。図５に示すように、¹¹¹Ｉｎ−ＮＴＡ錯体封入リポソーム投与マウスでは、¹¹¹Ｉｎが投与後肝臓及び脾臓に移行し、その後も肝臓及び脾臓内に滞留している事が確認された。

以上の実施例の結果から、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームによって腫瘍が良好に描出される事、及び、¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体封入リポソームは投与後速やかに¹¹¹Ｉｎ−ＥＣ錯体として尿中排泄される事が、確認された。

本発明は、放射性医薬品の分野において、利用することができる。

Claims (7)

1. リン脂質を用いて製造されたリポソーム中に^１１１Ｉｎとエチレンジシステインとの錯体を封入させた^１１１Ｉｎ封入リポソームを含み、
   該 ^１１１ Ｉｎ封入リポソームは、
   エチレンジシステイン（ＥＣ）を封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームと、エチレンジシステインよりも脂溶性が高い有機配位子を含む ^１１１ Ｉｎ錯体とを混合し、ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジシステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに ^１１１ Ｉｎを封入させて得られた、放射性医薬組成物。
2. 前記有機配位子が、８−ヒドロキシキノリン、トロポロン及びアセチルアセトンからなる群から選択される、請求項１に記載の放射性医薬組成物。
3. 前記有機配位子が、８−ヒドロキシキノリンである、請求項１又は２に記載の放射性医薬組成物。
4. リン脂質を用いて製造されたリポソーム中に ^１１１ Ｉｎとエチレンジシステインとの錯体を封入させた ^１１１ Ｉｎ封入リポソームを含み、
   該 ^１１１ Ｉｎ封入リポソームは、
   エチレンジシステイン（ＥＣ）を封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームと、エチレンジシステインよりも脂溶性が高い有機配位子を含む ^１１１ Ｉｎ錯体とを混合し、ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジシステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに ^１１１ Ｉｎを封入させて得られた、腫瘍用画像化剤。
5. リン脂質を用いて製造されたリポソーム中に^１１１Ｉｎを封入させた^１１１Ｉｎ封入リポソームを含む放射性医薬組成物の製造方法であって、
   エチレンジシステイン（ＥＣ）を封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームと、エチレンジシステインよりも脂溶性が高い有機配位子を含む^１１１Ｉｎ錯体とを混合し、
   前記ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジシステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに^１１１Ｉｎを封入させることを含む、放射性医薬組成物の製造方法。
6. 前記有機配位子が、８−ヒドロキシキノリン、トロポロン及びアセチルアセトンからなる群から選択される、請求項５に記載の放射性医薬組成物の製造方法。
7. エチレンジシステイン（ＥＣ）を封入し、リン脂質を用いて製造されたＥＣ封入リポソームを有する第１の容器と、
   エチレンジシステインよりも脂溶性が高く、かつ、^１１１Ｉｎに配位結合して^１１１Ｉｎ錯体を形成するための有機配位子を有する第２の容器と、
   を備え、
   前記^１１１Ｉｎ錯体と、前記ＥＣ封入リポソームとを混合し、前記ＥＣ封入リポソーム中のエチレンジステインと前記有機配位子との配位子交換により、前記ＥＣ封入リポソームにさらに^１１１Ｉｎを封入させるためのキット。