JP5904434B2 - 被覆hvj−e及び被覆hvj−eの製造方法 - Google Patents
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Description
大阪大学のKanedaらは、HVJ−E自体に多様な抗腫瘍活性があり、ガンの転移や再発を抑制できることを報告している。その作用メカニズムは、HVJ−Eは樹状細胞の成熟化を介して、癌特異的な細胞障害性T細胞(CTL)を誘導すると同時に、制御性T細胞の働きを解除することで、抗腫瘍免疫活性を示すと考えられている(非特許文献2、3)。
<1>ガン細胞と特異的に結合する被覆HVJ−Eであって、HVJ−Eと、このHVJ−Eの表面を覆う被覆層とを有し、この被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に2層以上積層されており、この被覆層のうちの最内層はカチオン性の層であり、かつ、最表層は、ヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層である。
<2>被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に4層以上積層されており、最表層以外のアニオン性の層は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成されている。
<3>カチオン性の層が、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかによって形成されている。
<4>カチオン性の層および/またはアニオン性の層に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤のうちのいずれかが導入されている。
本発明の被覆HVJ−Eの製造方法は、以下のことを特徴としている。
<5>ガン細胞と特異的に結合する被覆HVJ−Eの製造方法であって、以下の工程: (1)HVJ−Eとカチオン性材料とを接触させてカチオン性の層を形成する工程;および(2)HVJ−Eとアニオン性材料とを接触させてアニオン性の層を形成する工程を含み、前記工程(1)(2)を1回、または2回以上繰り返して、カチオン性の層とアニオン層が交互に2層以上積層されている被覆層を形成するとともに、この被覆層のうちの最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で形成することを特徴とする。
<6>前記工程(1)の前処理として、HVJ−Eの表面を清浄化する工程を含む。
<7>前記工程(2)のアニオン性材料は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかを分散させた溶液である。
<8>前記工程(1)のカチオン性材料は、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかを分散させた溶液である。
したがって、このヒアルロン酸をHVJ−Eの表面に安定に被覆することができれば、ガン細胞への結合特異性を向上させることができると考えられる。
また、ヒアルロン酸をビルディングブロックとして用いた場合、極めて特殊な積層挙動を示すことが知られており、これまでに、ナノ粒子表面上にヒアルロン酸を含む機能性薄膜を形成させた例は報告されていない。
そこで、本発明者は、タンパク質や細胞などの生体分子にも適用できる水系をベースとしたマイルドな条件で、HVJ−Eの表面をヒアルロン酸で被覆した、被覆HVJ−Eを製造する方法として、Layer−by−Layer(LbL;交互積層、交互吸着、交互浸漬)法に注目した。
以下、本発明の実施形態について説明する。
図1は、本発明の被覆HVJ−Eの一実施形態を例示した模式図である。
図1に示したように、本発明の被覆HVJ−Eは、略球状のHVJ−Eと、このHVJ−Eの表面を覆う被覆層11と、を有している。
カチオン性の層Aは、例えば、キトサン、キトサン塩酸塩又はポリアリルアミン塩酸塩、カチオン性を有する他の合成高分子、生体高分子、有機あるいは金属ナノ粒子などによって形成することができる。
具体的には、図2に例示される合成高分子、生体高分子、有機あるいは金属ナノ粒子を挙げることができる。(非特許文献9)。
カチオン性の層A及び/又はアニオン性の層Bに蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入することもできる。
HVJ−Eの表面にカチオン性の層A/アニオン性の層Bの多層構造を形成するために、Layer−by−Layer法(LbL法、交互吸着法、交互浸漬法とも呼ばれる。)を用いる。
図3の工程図に示したように、「HVJ−E」0.5mgを1.5mlエッペンチューブに標量し、酢酸buffer(pH5.9,150mM)1mlに分散し、遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes)した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
図4の工程図に示したように、清浄化工程を経たHVJ−Eを、500μlの酢酸buffer(pH5.9,150mM)に再分散した。ここに、500μlの2mg/mlキトサン塩酸塩溶液(CH−HCl)(溶媒:150mM,pH5.9、酢酸buffer)を加え、15分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
図5の工程図に示したように、カチオン性の層の被覆工程を経たHVJ−Eを、500μlの酢酸buffer(pH5.9,150mM)に再分散し、ここに、2mg/mlヒアルロン酸溶液(HA)(溶媒:150mM,pH5.9、酢酸buffer)を加え、15分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に合計6工程繰り返し、それぞれの工程での表面電位を、ELSを用いて測定した。(図6)
式(7)中、Aはカチオン性材料、Bはアニオン性材料を表し、nは二層のステップ数を表し、nが0.5は1層を、nが1の時は2層を表す。さらに、nが0.5の奇数倍の時はAが最表層を形成し、nが0.5の偶数倍の時はBが最表層を形成することを表す。
「HVJ−E」1.0mgを1.5mlエッペンチューブに標量し、酢酸buffer(pH5.9,150mM)1mlに分散し遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes,遠心分離はすべてこの条件)した。
遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、清浄化工程を経たHVJ−Eを、500μlの酢酸buffer(pH5.9,150mM)に再分散した。ここに、500μlの2mg/mlキトサン塩酸塩溶液(CH−HCl)(溶媒:150mM,pH5.9、酢酸buffer)に分散させたキトサン塩酸塩溶液(CH−HCl溶液)を加え、15分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、カチオン性の層の被覆工程を経たHVJ−Eを、500μlの酢酸buffer(pH5.9,150mM)に再分散した。ここに、2mg/mlヒアルロン酸(HA)溶液(150mM,pH5.9、酢酸buffer)を加え、15分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
次に、アニオン性の層の被覆工程を経たHVJ−Eを、500μlの酢酸buffer(pH5.9,150mM)に再分散を試みたが凝集が生じなかった。さらに、ここに 2mg/mlのHA溶液(溶媒:150mM,pH5.9、酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨て、500μlの酢酸bufferに再分散を試みた。しかし、凝集が生じてしまった。
「HVJ−E」0.5mgを1.5mlエッペンチューブに標量し、酢酸buffer(PH5.9,50mM,以下すべて同じ)1mlに分散し遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes,遠心分離はすべてこの条件)した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの酢酸bufferに再分散した。ここに500μlの2mg/ml「CH−HCl溶液」(50mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの酢酸bufferに再分散した。ここに2mg/ml「HA溶液」(50mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。ここに2mg/ml「HA溶液」(50mM,pH5.9,酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
次に、500μlの酢酸bufferに再分散を試みた。すると、HVJ−Eの凝集はほとんど確認されず、その割合は実施例1または比較例1と比較して低下した。イオン強度を低下させることで、静電的な遮蔽が抑制されるため粒子間の反発力が大きくなり分散性が大きく向上したと考えられる。
「HVJ−E」0.5mgを1.5mlエッペンチューブに標量し、超純水(ミリポア社製、「milli Q」)1mlに分散し、遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes,遠心分離はすべてこの条件)した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、清浄化工程を経たHVJ−Eを、100μlの超純水に再分散した。ここに400μlの2mg/mlポリアリルアミン塩酸塩(PAH)溶液(溶媒:超純水)を加え、さらに2mg/mlポリアリルアミン塩酸塩(PAH)溶液(溶媒:150mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、500μlの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの超純水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、カチオン性の層被覆工程を経たHVJ−Eを、100μlの超純水に再分散した。2mg/mlのポリスチレンスルホン酸ナトリウム(PSS)溶液(溶媒:超純水)を加え、さらに2mg/mlポリスチレンスルホン酸ナトリウム(PSS)溶液(溶媒:150mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、500μlの「milli Q」水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの超純水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に6工程繰り返し、それぞれの工程でDLSを測定した。(図7)
なお、被覆HVJ−Eのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、HVJ−Eの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
「HVJ−E」0.5mlを1.5mgエッペンチューブに標量し、超純水(ミリポア社製、「milli Q」)1mlに分散し、遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes)した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの「milli Q」水に再分散した。ここに500μlの4mg/mlポリアリルアミン塩酸塩(PAH)溶液(溶媒:150mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、500μlの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの超純水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの超純水に再分散した。ここに500μlの4mg/mlポリスチレンスルホン酸ナトリウム(PSS)溶液(溶媒:150mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、500μlの「milli Q」水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの「milli Q」水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に6工程繰り返し、それぞれの工程でDLSを測定した。(図8)
なお、被覆HVJ−Eのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、HVJ−Eの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
「HVJ−E」0.5mlを1.5mgエッペンチューブに標量し、超純水(ミリポア社製、「milli Q」)1mlに分散し、遠心分離(15000rpm,4℃以下,15minutes)した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの超純水に再分散した。ここに500μlの4mg/mlポリアリルアミン塩酸塩(PAH)(溶媒:150mM,pH5.9酢酸buffer)を加え15分間反応させた。反応後、500μlの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの超純水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、500μlの超純水に再分散した。ここに超純水中に分散させた0.1wt%のアニオン性磁性粒子を加え15分間反応させた。反応後、500μlの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、1mlの超純水に再分散し、もう1度遠心分離をおこなった。
図9に示したように、ポリアリルアミン塩酸塩/アニオン性磁性ナノ粒子で修飾されたHVJ−Eは磁石に引き付けられ再度分散可能であった。
なお、被覆HVJ−Eのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、HVJ−Eの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
A カチオン性の層
B アニオン性の層
Claims (8)
- ガン細胞と特異的に結合する被覆HVJ−Eであって、HVJ−Eと、このHVJ−Eの表面を覆う被覆層とを有し、この被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に2層以上積層されており、この被覆層のうちの最内層はカチオン性の層であり、かつ、最表層は、ヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層であり、その粒径分布が単峰性である、ことを特徴とする被覆HVJ−E。
- 被覆層は、カチオン性の層とアニオン層が交互に4層以上積層されており、最表層以外のアニオン性の層は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成されていることを特徴とする請求項1に記載の被覆HVJ−E。
- カチオン性の層が、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかによって形成されていることを特徴とする請求項1または2に記載の被覆HVJ−E。
- カチオン性の層および/またはアニオン性の層に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤のうちのいずれかが導入されていることを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の被覆HVJ−E。
- ガン細胞と特異的に結合する被覆HVJ−Eであって、その粒径分布が単峰性である被覆HVJ−Eの製造方法であって、以下の工程:
(1)HVJ−Eとカチオン性材料とを接触させてカチオン性の層を形成する工程;および
(2)HVJ−Eとアニオン性材料とを接触させてアニオン性の層を形成する工程
を含み、前記工程(1)(2)を1回、または2回以上繰り返して、カチオン性の層とアニオン層が交互に2層以上積層されている被覆層を形成するとともに、この被覆層のうちの最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で形成することを特徴とする被覆HVJ−Eの製造方法。 - 前記工程(1)の前処理として、HVJ−Eの表面を清浄化する工程を含むことを特徴とする請求項5に記載の被覆HVJ−Eの製造方法。
- 前記工程(2)のアニオン性材料は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかを分散させた溶液であることを特徴とする請求項5に記載の被覆HVJ−Eの製造方法。
- 前記工程(1)のカチオン性材料は、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかを分散させた溶液であることを特徴とする請求項5に記載の被覆HVJ−Eの製造方法。
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