JP5877988B2 - Molecular recognition sensor using fluorescent protein, molecular release complex and its synthesis - Google Patents
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Description
本発明は、分子認識センサー、あるいは、分子放出複合体として機能し得る、修飾された蛍光タンパク質に関する。より具体的には、シクロデキストリンが結合した蛍光タンパク質、及び、該蛍光タンパク質を製造する方法に関する。 The present invention relates to a modified fluorescent protein that can function as a molecular recognition sensor or a molecular release complex. More specifically, the present invention relates to a fluorescent protein bound with cyclodextrin and a method for producing the fluorescent protein.
細胞内における様々な現象、例えば、シグナル伝達に関与する因子群の離合集散、特定のタンパク質や小分子の細胞内局在の動態などは、時々刻々と変化しているが、このような変化が、疾患の発生などの異常な状態についてのメルクマールとして重要な意味を持つことがある。細胞内に存在する様々な小器官や細胞内因子などの動態をモニターする手段として、蛍光標識による追跡観察などが、古くから有効な方法として用いられてきた。特に、タンパク質性の蛍光因子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、その発見以来、遺伝子工学的手法による修飾が可能であるとの利点と、蛍光を発するという特徴を生かすことにより、機能的分子センサーとして利用されてきた。緑色蛍光タンパク質には、様々な色変異体が存在するため、異なる蛍光波長の色変異体使用することで、種々の生命現象を同時に観察することができる。また、他の蛍光色素（例えば、量子ドット）などと組み合わせることで、共鳴エネルギー移動を生じさせる事によりＦＲＥＴやＦＬＩＭなどの蛍光変化を利用した細胞内現象の観察も可能であることから、現在においても、利用性の高い分子ツールとなっている。 Various phenomena in the cell, such as the divergence and convergence of factors involved in signal transduction, and the dynamics of intracellular localization of specific proteins and small molecules, are constantly changing. May have important implications for Merckmar about abnormal conditions such as the occurrence of disease. As a means for monitoring the dynamics of various organelles and intracellular factors present in cells, follow-up observation using a fluorescent label has been used as an effective method for a long time. In particular, since its discovery, green fluorescent protein (GFP), a proteinaceous fluorescent factor, is a functional molecular sensor by taking advantage of the fact that it can be modified by genetic engineering techniques and the feature of emitting fluorescence. Has been used as. Since various color mutants exist in green fluorescent protein, various life phenomena can be observed simultaneously by using color mutants having different fluorescence wavelengths. In addition, in combination with other fluorescent dyes (for example, quantum dots), it is possible to observe intracellular phenomena using fluorescence changes such as FRET and FLIM by causing resonance energy transfer. Has also become a highly available molecular tool.
生体内（臓器、組織、細胞、細胞内小器官等）の現象をモニターするにことにより、特定の疾患の原因となるような生体内変動が見出された場合には、生体内の変動領域に対し、薬剤などを正確に送達する必要が生じる。このような場合に、標的指向性薬物送達システム（ＤＤＳ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を利用した薬剤投与方法が有効な場合がある。標的指向性薬物送達システムにおける担体には、送達するべき細胞あるいは生体内の特定領域を特異的に認識するための部分と薬剤を包接するための部分の両方が必要である。特定領域を特異的に認識するための部分としては、例えば、特定領域に存在するタンパク質等に対する抗体や、該タンパク質に対するレセプターなどが利用され、一方、薬剤を包接するための部分としては、シクロデキストリンなどの利用が考えられる。シクロデキストリン（ＣＤ：Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）は、Ｄ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合した、環状オリゴ糖で、環の外側は親水性を、環の内側は疎水性を示す。そのため、シクロデキストリンの環の内側には、疎水性物質を包接させることができる。このような特性に着目し、ＤＤＳのキャリアとしてのシクロデキストリンの有効利用について、さかんに研究開発が進められている。 When in vivo fluctuations that cause a specific disease are found by monitoring phenomena in the body (organs, tissues, cells, organelles, etc.) On the other hand, it is necessary to accurately deliver drugs and the like. In such a case, a drug administration method using a targeted drug delivery system (DDS) may be effective. A carrier in a targeted drug delivery system requires both a portion for specifically recognizing a cell to be delivered or a specific region in the living body and a portion for encapsulating a drug. As a part for specifically recognizing a specific region, for example, an antibody against a protein or the like existing in the specific region, a receptor for the protein, or the like is used. On the other hand, as a part for inclusion of a drug, cyclodextrin The use such as is considered. Cyclodextrin (CD: Cyclodextrin) is a cyclic oligosaccharide in which D-glucose is bonded by α (1 → 4) glucoside bond, and the outside of the ring is hydrophilic and the inside of the ring is hydrophobic. Therefore, a hydrophobic substance can be included inside the ring of cyclodextrin. Focusing on these characteristics, research and development are being conducted on the effective use of cyclodextrin as a carrier for DDS.
以上のような蛍光タンパク質とシクロデキストリンの特徴をうまく利用したセンサー分子の開発が、現在、多く手がけられている。例えば、蛍光特性を有する蛍光タンパク質と疎水性物質が包接可能なシクロデキストリンとの超分子複合体などについて、生体内の状況をモニターするセンサーとして、又は、薬剤の送達に利用可能なＤＤＳキャリアとしてその利用性が検討されている。このような超分子の作製方法として、例えば、蛍光タンパク質のアミド結合を介してＣＤを結合させる方法が開示されている（非特許文献１）。この方法は、蛍光タンパク質のＣ末端部にインテインを融合させた融合体を発現させ、チオールの存在下での切断によって生じるチオエステル部分に、予めシステイン修飾を施したＣＤを結合させる方法である。この方法によれば、蛍光タンパク質の目的部位にＣＤを結合させることは可能であるが、ＣＤの修飾の他、蛍光タンパク質についてはインテインを利用してチオエステル部分を作出するなどの修飾が必要であり、煩雑な工程が必要とされる。また、ＧＦＰのＣ末端フラグメント（アミノ酸残基２１４−２３０）切り出した後、このフラグメントにＣＤ等を結合させた後、Ｎ端部分側のＧＦＰ再結合させることで、ＣＤで修飾したＧＦＰを作出する方法も開示されている（非特許文献２）。この方法においても、ＧＦＰの修飾方法が、汎用性に乏しく、かつ、効率が悪いといった問題が存在している。 Many developments of sensor molecules that take advantage of the characteristics of fluorescent proteins and cyclodextrins as described above are currently underway. For example, a supramolecular complex of a fluorescent protein having fluorescent properties and a cyclodextrin that can be encapsulated with a hydrophobic substance, etc., as a sensor for monitoring in vivo conditions or as a DDS carrier that can be used for drug delivery Its availability is being studied. As a method for producing such a supramolecule, for example, a method of binding CD via an amide bond of a fluorescent protein has been disclosed (Non-Patent Document 1). This method is a method in which a fusion in which an intein is fused to the C-terminal part of a fluorescent protein is expressed, and a cysteine ester-modified CD is bound to a thioester moiety generated by cleavage in the presence of a thiol. According to this method, it is possible to bind CD to the target site of the fluorescent protein. However, in addition to the modification of CD, it is necessary to modify the fluorescent protein such as creating a thioester moiety using intein. A complicated process is required. In addition, after excising the C-terminal fragment (amino acid residues 214-230) of GFP, CD and the like are bound to this fragment, and then GFP is rebound to the N-terminal portion side to produce GFP modified with CD. A method is also disclosed (Non-Patent Document 2). Even in this method, there is a problem that the modification method of GFP has poor versatility and is inefficient.
上述のように、従来の蛍光タンパク質をＣＤで部位特異的かつ化学量論的に修飾する方法は、工程が煩雑であること、汎用性に乏しいなどの問題点が存在していた。部位特異的かつ化学量論的でない場合、超分子複合体として機能しないケースが多い。
そこで、本発明は、蛍光タンパク質に部位特異的かつ化学量論的にＣＤを結合させるための簡便 かつ、効率的な方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、修飾により蛍光タンパク質が変性することなく、ＣＤが安定に結合した超分子複合体の提供を目的とする。
As described above, the conventional method of modifying a fluorescent protein with site-specific and stoichiometric modification using CD has problems such as complicated steps and poor versatility. If it is not site-specific and stoichiometric, it often does not function as a supramolecular complex.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a simple and efficient method for binding CD to a fluorescent protein in a site-specific and stoichiometric manner.
Another object of the present invention is to provide a supramolecular complex in which CD is stably bound without modification of the fluorescent protein due to modification.
本出願の発明者らは、蛍光タンパク質に対し、ＣＤを容易に結合させる方法について鋭意検討した結果、蛍光タンパク質のアミノ酸配列中に存在するシステイン残基を介して、ＣＤを結合させることで、簡易、迅速にＣＤ−蛍光タンパク質からなる超分子複合体の調製が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）所望のアミノ酸位置にシステイン残基を保持する蛍光タンパク質と、システイン残基と結合性を有するシクロデキストリン誘導体を反応させ、蛍光タンパク質とシクロデキストリン若しくはシクロデキストリン誘導体の複合体を作製する方法。
（２）前記システイン残基が、野生型の蛍光タンパク質のアミノ酸配列上に存在しないものであることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）前記蛍光タンパク質が、前記所望のアミノ酸位置以外に存在するシステイン残基をシステイン以外のアミノ酸に置換したものであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ又はその誘導体であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記所望のアミノ酸位置が、蛍光タンパク質のＣ末端領域、Ｎ末端領域、又はＣ末端若しくはＮ末端領域近傍のループ領域に存在することを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記システイン残基と結合性を有するシクロデキストリン誘導体が、ヨウ化シクロデキストリン、マレイミドシクロデキストリン、ハロアセトアミドシクロデキストリン、ブロモメチルシクロデキストリン、チオサルフェイトシクロデキストリン、システイニルシクロデキストリン、トシルシクロデキストリンのいずれかであることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法により作製される蛍光タンパク質及びシクロデキストリン若しくはシクロデキストリン誘導体との複合体。
（８）上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
The inventors of the present application have made extensive studies on a method for easily binding CD to a fluorescent protein, and as a result, it has been simplified by binding CD via a cysteine residue present in the amino acid sequence of the fluorescent protein. The present inventors have found that a supramolecular complex comprising a CD-fluorescent protein can be rapidly prepared, and the present invention has been completed.
That is, this invention is the following (1)-(8).
(1) A method of producing a complex of a fluorescent protein and a cyclodextrin or a cyclodextrin derivative by reacting a fluorescent protein having a cysteine residue at a desired amino acid position with a cyclodextrin derivative having a binding property to the cysteine residue.
(2) The method according to (1) above, wherein the cysteine residue does not exist on the amino acid sequence of a wild-type fluorescent protein.
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein the fluorescent protein is obtained by substituting a cysteine residue other than the desired amino acid position with an amino acid other than cysteine.
(4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the fluorescent protein is GFP or a derivative thereof.
(5) Any of (1) to (4) above, wherein the desired amino acid position is present in the C-terminal region, N-terminal region, or loop region near the C-terminal or N-terminal region of the fluorescent protein. The method of crab.
(6) Cyclodextrin derivatives having a binding property to the cysteine residue are iodinated cyclodextrin, maleimide cyclodextrin, haloacetamide cyclodextrin, bromomethylcyclodextrin, thiosulfate cyclodextrin, cysteinyl cyclodextrin, tosylcyclo The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the method is any one of dextrins.
(7) A complex of a fluorescent protein and a cyclodextrin or cyclodextrin derivative produced by the method according to any one of (1) to (6) above.
(8) A kit for carrying out the method according to any one of (1) to (7) above.
本発明で開示される方法によれば、簡易、かつ、迅速に蛍光タンパク質とＣＤの超分子複合体を作製することが可能となる。 According to the method disclosed in the present invention, a supramolecular complex of a fluorescent protein and a CD can be prepared easily and rapidly.
本発明の実施形態の１つは、所望のアミノ酸位置にシステイン残基を保持する蛍光タンパク質と、システイン残基のチオール基と結合するシクロデキストリン誘導体を反応させ、蛍光タンパク質とシクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体の複合体を作製する方法である。
本発明で使用される「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発する能力を有するタンパク質であれば如何なるものであってもよく、例えば、クラゲ由来、サンゴ由来、あるいは、イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質（例えば、配列番号５など）を挙げることができる。特に、クラゲ由来の蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Green Fluorescent Protein）（例えば、配列番号１又は配列番号２）及びその誘導体を挙げることができ、誘導体には、例えば、ＢＦＰ（例えば、配列番号３）、ＣＦＰ、ＹＦＰ（例えば、配列番号４）、ＲＦＰなどが含まれる（なお、本明細書中においては、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰにつき、ＧＦＰの「色変異体」と称する場合もある）。また、各種蛍光タンパク質及びその誘導体には、それらのホモログも含まれる。ここで、ホモログとは、各蛍光タンパク質のアミノ酸配列（例えば、緑色蛍光タンパク質の場合には、配列番号１など）と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質のことである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、該蛍光タンパク質のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、蛍光を発するタンパク質のことである。
In one embodiment of the present invention, a fluorescent protein retaining a cysteine residue at a desired amino acid position is reacted with a cyclodextrin derivative that binds to a thiol group of the cysteine residue, and the fluorescent protein and cyclodextrin or cyclodextrin derivative are reacted. This is a method for producing the composite.
The “fluorescent protein” used in the present invention may be any protein as long as it has the ability to emit fluorescence. For example, a fluorescent protein derived from jellyfish, coral, or sea anemone (for example, SEQ ID NO: 5). In particular, examples of the fluorescent protein derived from jellyfish include green fluorescent protein (GFP) (for example, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) and derivatives thereof. Examples of the derivatives include BFP (for example, SEQ ID NO: 3), CFP, YFP (for example, SEQ ID NO: 4), RFP, and the like are included (in the present specification, BFP, CFP, YFP, and RFP are referred to as “color variants” of GFP) There is also.) In addition, various fluorescent proteins and derivatives thereof include homologs thereof. Here, the homolog is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of each fluorescent protein (for example, SEQ ID NO: 1 in the case of green fluorescent protein). Here, the “protein containing substantially the same amino acid sequence” means about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80%, 81%, 82%, or more, of the amino acid sequence of the fluorescent protein. 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, most preferred Is a protein that contains an amino acid sequence having about 99% amino acid identity and fluoresces.
あるいは、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、該蛍光タンパク質のアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換され、欠失され、若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛍光を発するタンパク質のことである。 Alternatively, the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of the fluorescent protein is one or several (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10) in the amino acid sequence of the fluorescent protein. It is a protein that consists of an amino acid sequence that is substituted, deleted, or inserted, and emits fluorescence.
また、本発明の「蛍光タンパク質」は、遺伝子工学的に、あるいは、化学的に何らかの要素が付加されることで、修飾を受けていてもよい。例えば、Ｎ末端領域あるいはＣ末端領域に、任意の蛍光分子が結合されていてもよく、あるいは、細胞内のタンパク質や構造体と特異的に結合する要素（例えば、抗体や酵素、結合認識領域など）が結合されていてもよい。 In addition, the “fluorescent protein” of the present invention may be modified by adding some element in genetic engineering or chemically. For example, an arbitrary fluorescent molecule may be bound to the N-terminal region or C-terminal region, or an element that specifically binds to an intracellular protein or structure (eg, antibody, enzyme, binding recognition region, etc.) ) May be combined.
本発明で使用される「シクロデキストリン」とは、Ｄ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ等の一種である。シクロデキストリンを構成するＤ−グルコースの数は、形成されるシクロデキストリンが環状構造をとり、その空孔に物質（例えば、疎水性化合物）を包接することができる数であれば特に限定されず、その結果、「シクロデキストリン」には、シクロデキストリンの多量体も含まれる。このようなシクロデキストリンとしては、例えば、グルコースが６個結合しているα−シクロデキストリン、グルコースが７個結合しているβ−シクロデキストリン、グルコースが８個結合しているγ−シクロデキストリンなどを挙げることができる。また、「シクロデキストリン誘導体」としては、システイン残基のチオール基と好適に反応して結合し、また、タンパク質を変性させない様な温和な条件で結合反応が進む、例えば、ヨウ化シクロデキストリン、マレイミドシクロデキストリン、ハロアセトアミドシクロデキストリン、ブロモメチルシクロデキストリン、チオサルフェイトシクロデキストリン、システイニルシクロデキストリン、トシルシクロデキストリンなどが好ましい。また、これらの誘導体の他、グルコースを他の糖に変更したもの、グルコシド結合の位置がα（１→４）以外のもの、あるいは、糖に何らかの修飾が施されているものであっても、環状構造をとり、その空孔に物質を包接することができるものであれば、本発明のシクロデキストリン誘導体として使用することができる。また、「システイン残基のチオール基と好適に反応」するシクロデキストリンとは、上述のヨウ化シクロデキストリン、マレイミドシクロデキストリンなどのシクロデキストリン誘導体であってもよい。 The “cyclodextrin” used in the present invention is a kind of cyclic oligo or the like in which D-glucose is bonded by α (1 → 4) glucoside bond and has a cyclic structure. The number of D-glucose constituting the cyclodextrin is not particularly limited as long as the formed cyclodextrin has a cyclic structure and can include a substance (for example, a hydrophobic compound) in its pores. As a result, “cyclodextrin” includes cyclodextrin multimers. Examples of such cyclodextrins include α-cyclodextrin with 6 glucoses, β-cyclodextrin with 7 glucoses, γ-cyclodextrin with 8 glucoses, etc. Can be mentioned. In addition, the “cyclodextrin derivative” is preferably reacted with a thiol group of a cysteine residue and bonded, and the binding reaction proceeds under mild conditions that do not denature the protein. For example, iodinated cyclodextrin, maleimide Cyclodextrin, haloacetamide cyclodextrin, bromomethyl cyclodextrin, thiosulfate cyclodextrin, cysteinyl cyclodextrin, tosyl cyclodextrin and the like are preferable. In addition to these derivatives, even if the glucose is changed to another sugar, the position of the glucoside bond is other than α (1 → 4), or the sugar has some modification, Any cyclodextrin derivative of the present invention can be used as long as it has a cyclic structure and can enclose a substance in its pores. Further, the cyclodextrin that “reacts suitably with the thiol group of the cysteine residue” may be a cyclodextrin derivative such as the above-described iodinated cyclodextrin or maleimide cyclodextrin.
本発明の蛍光タンパク質とシクロデキストリンの複合体を作製する方法は、蛍光タンパク質のアミノ酸配列中に存在するシステイン残基に特異的にシクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体を結合する点に特徴を有し、これにより、簡便、安価、かつ、効率的な蛍光タンパク質−シクロデキストリン超分子複合体を作製することが可能となる。ここで、蛍光タンパク質のアミノ酸配列中に存在する「システイン残基」は、野生型の蛍光タンパク質中に存在するシステイン残基であってもよく、また、遺伝子工学的手法等により、所望のアミノ酸位置特異的に導入されたシステイン残基であってもよい。新たなシステイン残基の導入は、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、あるいは、所望の位置への挿入による方法のいずれであってもよい。蛍光タンパク質の所望のアミノ酸位置にシステイン残基を導入する方法は、通例の遺伝子工学的手法などを使用することで、当業者であれば容易に実施することができる。 The method for producing a complex of a fluorescent protein and a cyclodextrin according to the present invention is characterized in that cyclodextrin or a cyclodextrin derivative is specifically bound to a cysteine residue present in the amino acid sequence of the fluorescent protein. By this, it becomes possible to produce a simple, inexpensive and efficient fluorescent protein-cyclodextrin supramolecular complex. Here, the “cysteine residue” present in the amino acid sequence of the fluorescent protein may be a cysteine residue present in the wild-type fluorescent protein, and the desired amino acid position may be determined by genetic engineering techniques. It may be a specifically introduced cysteine residue. The introduction of a new cysteine residue may be either a method by substitution with an existing arbitrary amino acid or a method by insertion at a desired position. A person skilled in the art can easily implement a method for introducing a cysteine residue at a desired amino acid position of a fluorescent protein by using a conventional genetic engineering technique.
新たにシステイン残基を導入する場合、蛍光タンパク質上の導入位置は、蛍光タンパク質の蛍光発生能力を低減若しくは消失させるような影響を及ぼさない位置であれば、いずれの箇所であってもよく、また、導入する部位の数も特に限定されない。システインを導入する位置は、蛍光タンパク質−シクロデキストリン複合体の使用目的に応じて、当業者において適宜選択することができる。たとえば、シクロデキストリンを薬剤等の運搬キャリアとして使用する場合には、蛍光タンパク質の蛍光発生能力を低減若しくは消失させない位置であれば、いずれの箇所でもよく、このような箇所としては、限定はしないが、蛍光タンパク質の構造に影響を与えない箇所、例えば、ＧＦＰ（及びその色変異体）を蛍光タンパク質として使用する場合には、βバレル構造領域以外の箇所が好ましいと考えられる。また、本発明の蛍光タンパク質−シクロデキストリン複合体において、蛍光タンパク質とシクロデキストリンに包接させた蛍光色素などとの間で共鳴エネルギー移動を生じさせ、その蛍光強度の変化を追跡することで、分子センサーとして使用する場合、蛍光タンパク質がＧＦＰ（又はその色変異体）であれば、例えば、Ｎ末端領域（例えば、アミノ酸位置：１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分であればいずれの領域でもよい）若しくはＣ末端領域（例えば、アミノ酸位置：１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分であればいずれの領域でもよい）、あるいは、Ｎ末端若しくはＣ末端領域に隣接するループ領域などに蛍光色素を包接したシクロデキストリンを結合させるのが好ましい。 When a cysteine residue is newly introduced, the introduction position on the fluorescent protein may be any position as long as it does not affect or reduce the fluorescence generation ability of the fluorescent protein. The number of sites to be introduced is not particularly limited. The position at which cysteine is introduced can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the intended use of the fluorescent protein-cyclodextrin complex. For example, when cyclodextrin is used as a carrier for transporting drugs or the like, any position may be used as long as it does not reduce or eliminate the fluorescence generation ability of the fluorescent protein. When using GFP (and its color variant) as a fluorescent protein, it is considered that a part other than the β barrel structure region is preferable. Further, in the fluorescent protein-cyclodextrin complex of the present invention, a resonance energy transfer is caused between the fluorescent protein and a fluorescent dye encapsulated in the cyclodextrin, and the change in the fluorescence intensity is traced. When used as a sensor, if the fluorescent protein is GFP (or a color variant thereof), for example, the N-terminal region (for example, any region as long as it is a portion protruding from the core portion of about 10 amino acids) ) Or a C-terminal region (for example, amino acid position: any region protruding from the core portion of about 10 amino acids), or a loop region adjacent to the N-terminal or C-terminal region. It is preferred to bind the cyclodextrin in contact.
本発明の他の実施形態は、本発明の方法により調製される、蛍光タンパク質とシクロデキストリン超分子複合体である。本発明の蛍光タンパク質−シクロデキストリン複合体は、様々な用途に使用することができる。例えば、シクロデキストリン中に予め包接しておいた蛍光分子と蛍光タンパク質との間で生じるＦＲＥＴやＦＬＩＭの変化などをモニターすることで、該複合体分子が存在している細胞内領域の環境変動などを観察するためのセンター分子として使用することができる。具体的には、細胞内のある領域における標的分子の存在状況（存在量、存在濃度など）を観察する目的で使用する場合、該標的分子（例えば、ステロイドホルモンなどの疎水性分子など）がシクロデキストリンに包接されている蛍光分子と交換されることで、蛍光タンパク質−蛍光分子間で生じていたＦＲＥＴやＦＬＩＭに変動が生じることが予想される。このＦＲＥＴやＦＬＩＭの変動をモニターすれば、標的分子の存在状態を確認することが可能となる。また、蛍光タンパク質−シクロデキストリン複合体は、薬剤などを生体内の特定の部位に送達するためのデリバリー分子として使用することも可能である。例えば、送達すべき薬剤を蛍光標識しておき、薬剤がデリバリーされるべき領域でシクロデキストリンから放出されることで生じるＦＲＥＴやＦＬＩＭの変化をモニターしながら、確実な薬剤の送達を可能ならしめるような分子が考えられる。あるいは、薬剤を蛍光標識しなくてもよく、該薬剤が目的の部位に送達されると、蛍光タンパク質の蛍光が目的の部位に集積することになるため、蛍光タンパク質からの蛍光の集積の有無を確認することで、薬剤の送達が行われたかどうか確認することができる。 Another embodiment of the present invention is a fluorescent protein and cyclodextrin supramolecular complex prepared by the method of the present invention. The fluorescent protein-cyclodextrin complex of the present invention can be used for various applications. For example, by monitoring changes in FRET and FLIM that occur between fluorescent molecules pre-included in cyclodextrin and fluorescent proteins, environmental changes in the intracellular region where the complex molecule exists, etc. It can be used as a center molecule for observing. Specifically, when it is used for the purpose of observing the presence state (abundance, concentration, etc.) of a target molecule in a certain region in a cell, the target molecule (for example, a hydrophobic molecule such as a steroid hormone) is cycloid. It is expected that the FRET and FLIM generated between the fluorescent protein and the fluorescent molecule are changed by exchanging with the fluorescent molecule included in the dextrin. By monitoring the fluctuations in FRET and FLIM, it is possible to confirm the presence state of the target molecule. The fluorescent protein-cyclodextrin complex can also be used as a delivery molecule for delivering a drug or the like to a specific site in the living body. For example, the drug to be delivered should be fluorescently labeled so that reliable drug delivery is possible while monitoring changes in FRET and FLIM caused by release from cyclodextrin in the area where the drug is to be delivered New molecules are possible. Alternatively, the drug may not be fluorescently labeled, and when the drug is delivered to the target site, the fluorescence of the fluorescent protein will accumulate at the site of interest. By confirming, it is possible to confirm whether or not the drug has been delivered.
シクロデキストリンに包接される分子は、特に限定されるものではなく、使用するシクロデキストリンの空孔の大きさ等に応じて、任意に選択することが可能である。ただ、既存のシクロデキストリンを使用する場合、その空孔領域は疎水性であることから、包接される分子は疎水性であることが望ましい。シクロデキストリンの空孔に包接可能な典型的な分子としては、例えば、コレステロール、プロスタグランジン、イソフラボン、カロテノイド、ステロイド、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸及びこれらの誘導体の他、イブプロフェン、インドメタシン、アンチヒスタミン、プレドニゾロン、及びこれらに誘導体を挙げることができるが、これらの限定されるものではない。 The molecule included in the cyclodextrin is not particularly limited, and can be arbitrarily selected depending on the size of the pores of the cyclodextrin used. However, when an existing cyclodextrin is used, since the pore region is hydrophobic, it is desirable that the molecule to be included is hydrophobic. Typical molecules which can be included in the pores of cyclodextrin include, for example, cholesterol, prostaglandins, isoflavones, carotenoids, steroids, nucleic acids such as DNA and RNA and derivatives thereof, ibuprofen, indomethacin, antihistamine , Prednisolone, and derivatives thereof, but are not limited thereto.
さらに、本発明には、本発明の方法を実施するために使用可能なキットが含まれる。本発明のキットには、例えば、所望の位置に所望の数のシステイン残基が導入された蛍光タンパク質、システイン残基との結合に適したシクロデキストリン又はその誘導体の他、蛍光タンパク質とシクロデキストリンを結合させる上で必要なその他の試薬が含まれる。この場合、キットには、使用説明書などが添付されていてもよく、また、試薬などの構成成分は、その活性の低下を防ぐような工夫が施された容器中に収納されていることが望ましい。
キットに添付される使用説明書は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
さらに、本発明のキットには、前述の蛍光タンパク質の代わりに、該蛍光タンパク質を任意の宿主細胞内で発現させるための発現ベクター、宿主細胞、その他発現操作に必要な試薬等が含まれていてもよい。
Furthermore, the present invention includes kits that can be used to practice the methods of the present invention. The kit of the present invention includes, for example, a fluorescent protein in which a desired number of cysteine residues are introduced at a desired position, a cyclodextrin suitable for binding to a cysteine residue or a derivative thereof, and a fluorescent protein and cyclodextrin. Other reagents necessary for binding are included. In this case, instructions for use may be attached to the kit, and components such as reagents may be stored in a container that is devised to prevent a decrease in its activity. desirable.
Instructions attached to the kit are printed on paper or other material and / or electrical such as floppy disk, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. Alternatively, it may be supplied as an electromagnetically readable medium. Detailed instructions for use may be actually attached to the kit, or may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like.
Furthermore, the kit of the present invention contains, instead of the fluorescent protein described above, an expression vector for expressing the fluorescent protein in an arbitrary host cell, a host cell, and other reagents necessary for the expression operation. Also good.
以下に実施例を示し本発明についてより具体的に説明を行うが、本発明の範囲は、実施例の範囲に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
１．方法
１−１．蛍光タンパク質を発現させるためのプラスミドの構築
本実施例では、蛍光タンパク質としてＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を使用した。今回使用したＧＦＰは、既に発明者らが報告した方法に従って調製を行った（Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229;Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460）。このように調製したＧＦＰは、配列番号１にそのアミノ酸配列を示す。配列番号１において、Ｃ末領域の２５１番目のアミノ酸をシステインに置換しており、その他の元々存在していたシステイン（６０番目）を他のアミノ酸（セリン）に置換した。
1. Method 1-1. Construction of plasmid for expressing fluorescent protein In this example, GFP (green fluorescent protein) was used as the fluorescent protein. The GFP used this time was prepared according to the method already reported by the inventors (Biochim. Biophys. Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460). The GFP thus prepared has its amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In SEQ ID NO: 1, the 251st amino acid in the C-terminal region was substituted with cysteine, and the other originally existing cysteine (60th) was substituted with another amino acid (serine).
１−２．プラスミドの単離
まず、発現させるＧＦＰ変異体をコードするＤＮＡを含むpUV5casS52tag（Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Merck Biosciences社）に導入し、形質転換された大腸菌を常法に従って単離した。コロニーとして単離した大腸菌を３７℃のＬＢ培地（７５μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む）中で１２時間培養した。培養液の一部を１０倍に希釈し、アンピシリン（７５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、２８℃にて、４８時間培養した。培養した大腸菌を回収し、溶解試薬（Ｂ−ＰＥＲ；Thermo Fisher Scientific社）で溶解後、溶解物を１７，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を回収した。得られた上清をＮｉ＋２−ＮＴＡカラム（Qiagen社）にかけ、常法に従い、目的タンパク質の精製を行った。カラムから回収したタンパク質は、ＰＢＳ中で再構成させた後、純度とオリゴマー化の状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（但し、サンプルの熱処理は行わない）により確認した。
1-2. Isolation of plasmid First, pUV5casS52tag (Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460) containing DNA encoding the GFP mutant to be expressed was introduced into E. coli BL21 (DE3) strain (Merck Biosciences), The transformed E. coli was isolated according to a conventional method. E. coli isolated as a colony was cultured in LB medium at 37 ° C. (containing 75 μg / ml ampicillin) for 12 hours. A part of the culture solution was diluted 10-fold and cultured in LB medium containing ampicillin (75 μg / ml) at 28 ° C. for 48 hours. The cultured Escherichia coli was collected and lysed with a lysis reagent (B-PER; Thermo Fisher Scientific), and then the lysate was centrifuged at 17,000 × g for 15 minutes to collect the supernatant. The obtained supernatant was applied to a Ni + 2- NTA column (Qiagen), and the target protein was purified according to a conventional method. The protein recovered from the column was reconstituted in PBS, and the purity and oligomerization state were confirmed by SDS-PAGE (however, the sample was not heat-treated).
１−３．βシクロデキストリン（ＣＤ）のＧＦＰへの結合
５００ｍＭ ６−ｉｏｄｏ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（６−Ｉ−β−ＣＤ）溶液（ＤＭＳＯ中）の一部と４μＭのタンパク質溶液を混合し、３７℃にて、２４時間インキュベートした。反応産物はこの過程において結晶化するため、上清と沈殿物を１７，０００×ｇで数分間遠心し、分離した。得られた沈殿は、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳで２度洗浄した。洗浄した沈殿は、得られたＧＦＰ−ＣＤ複合体の蛍光特性がＣＤ結合前のＧＦＰの蛍光特性と同等であることを確認するため、１／１０に希釈したＰＢＳ中に、およそ、１μＭとなるように溶解した。
1-3. Binding of β cyclodextrin (CD) to GFP A part of 500 mM 6-iodo-β-cyclodextrin (6-I-β-CD) solution (in DMSO) and 4 μM protein solution were mixed, and at 37 ° C. Incubated for 24 hours. Since the reaction product crystallizes during this process, the supernatant and the precipitate were separated by centrifugation at 17,000 × g for several minutes. The obtained precipitate was washed twice with PBS containing 10% DMSO. The washed precipitate is approximately 1 μM in PBS diluted 1/10 to confirm that the fluorescence properties of the resulting GFP-CD complex are equivalent to the fluorescence properties of GFP before CD binding. Dissolved.
１−４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
修飾又は修飾していないＧＦＰ変異体をＰＢＳに溶解し、その濃度が〜２０ｍＭ程度になるように、遠心式濃縮限外濾過膜（Microcon YM-10;Millipore社 アミコンウルトラ（Amicon Ultra）-0.5 mL 遠心式フィルターMillipore社）を使用して調製した。濃縮したタンパク質をＣ４レジン（ZipTip C4;Milipore）で脱塩後、マトリックスプレート（１０ｍｇ／ｍＬ シナピン酸）上にスポットし、マススペクトロメーター（AXIMA-CFR;Shimazu Bioteck社）を用いて分析を行った。
1-4. MALDI-TOF-MS analysis A GFP variant modified or not modified is dissolved in PBS, and a centrifugal concentrated ultrafiltration membrane (Microcon YM-10; Millipore Amicon Ultra ( Amicon Ultra) -0.5 mL centrifugal filter Millipore). The concentrated protein was desalted with C4 resin (ZipTip C4; Milipore), spotted on a matrix plate (10 mg / mL sinapinic acid), and analyzed using a mass spectrometer (AXIMA-CFR; Shimazu Bioteck). .
２．結果
２−１．βＣＤを結合させたＧＦＰの調製
まず、βＣＤを結合させる過程で得られる中間産物及び最終産物をポリアクリルアミドの電気泳動により解析した。上清中に含まれる反応産物（図１、レーン２）、反応混合物の再構成沈殿物（図１、レーン４）、及び、修飾処理を行っていないＧＦＰ（図１、レーン１）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプルを処理する際に熱処理を行わず、半変性条件（分子の移動が確認できる程度のＳＤＳを含む条件）で泳動を行った。その結果、βＣＤと反応させた結果得られた産物は（図１、レーン４）、典型的なＧＦＰ変異体の移動度より、若干大きめの移動度を示し、これはまた、ＧＦＰ変異体のポリマー化した移動度とも異なり、βＣＤによる修飾が行われていることを示していた。
2. Result 2-1. Preparation of GFP to which βCD was bound First, an intermediate product and a final product obtained in the process of binding βCD were analyzed by polyacrylamide electrophoresis. SDS for the reaction product (FIG. 1, lane 2) contained in the supernatant, the reconstituted precipitate of the reaction mixture (FIG. 1, lane 4), and the unmodified GFP (FIG. 1, lane 1). -Performed PAGE. In SDS-PAGE, electrophoresis was performed under semi-denaturing conditions (conditions including SDS that can confirm the movement of molecules) without heat treatment when the sample was processed. As a result, the product obtained as a result of the reaction with βCD (FIG. 1, lane 4) showed a slightly higher mobility than that of a typical GFP mutant, which is also a polymer of the GFP mutant. Unlike the modified mobility, it was shown that modification by βCD was performed.
２．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる解析
得られたＣＤ結合ＧＦＰ変異体と非修飾のＧＦＰ変異体を、プロテアーゼ処理せずに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで質量分析を行った。質量分析の結果、大きく分けて３種類のピークを検出した（図３Ａ及びＢ）。最も小さいｍ／ｓ値領域に検出されたピークは、ＧＦＰ変異体のＮ末端領域に由来するものである（例えば、図３ＡのＮ１２Ｌ５、Ｎ１５Ｌ９、図３ＢのＮ５Ｌ１、Ｎ８Ｌ７など）。次に、約２５，０００〜３０，０００のｍ／ｓ値領域に検出されたピークは、欠損部分が少なく、ほぼ無傷のＧＦＰ変異体から得られたピークであり、Ｎ末端又はＣ末端領域を若干欠いたＧＦＰ変異体のピークに相当する。また、最も大きいｍ／ｓ値領域に検出されたピークは、様々な組合わせで二量体化した無傷のＧＦＰ変異体、あるいは、Ｎ末端やＣ末端を若干欠いたＧＦＰ変異体に由来するものである。
2. Analysis by MALDI-TOF MS The obtained CD-bound GFP mutant and the unmodified GFP mutant were subjected to mass spectrometry by MALDI-TOF MS without protease treatment. As a result of mass spectrometry, three types of peaks were detected (FIGS. 3A and 3B). The peak detected in the smallest m / s value region is derived from the N-terminal region of the GFP mutant (for example, N12L5, N15L9 in FIG. 3A, N5L1, N8L7 in FIG. 3B, etc.). Next, the peak detected in the m / s value region of about 25,000 to 30,000 is a peak obtained from an almost intact GFP mutant with few defects, and the N-terminal or C-terminal region is It corresponds to the peak of the GFP mutant that is slightly missing. In addition, the peak detected in the largest m / s value region is derived from an intact GFP mutant dimerized in various combinations, or a GFP mutant slightly lacking the N-terminus or C-terminus. It is.
ＣＤの結合処理を行っていないＧＦＰ変異体（図３Ａ）については、ｍ／ｓ値25789.61に位置するメインピーク（／３と／／／５で切断されたＧＦＰに相当する（図２の説明を参照のこと））及び26140.65に位置するピーク（／２と／／／４で切断されたＧＦＰに相当する）が、ほぼ無傷なＧＦＰ変異体に由来するピークである。これらのメインピークに近接するピークについては、図２の挿入図に示したが、多くの切断部位は、βバレル構造への付加領域に位置しているため、これらのピークはβバレル構造を維持する部分に由来すると考えられる。ｍ／ｓ値13141.15（Ｎ１２Ｌ５）及び12974.40（Ｎ１５Ｌ９）に位置するピークは、最も大きなループ内で分割されたＮ末端側の部分に相当する。また、ｍ／ｓ値52204.34に位置するピークは、βバレル構造を維持したままの欠損ＧＦＰ、あるいは、無傷のＧＦＰのホモ／ヘテロダイマー構造に由来する。その他のピークについては、表１を参照のこと。 The GFP mutant not subjected to CD binding treatment (FIG. 3A) corresponds to the main peak located at m / s value 25789.61 (GFP cut at / 3 and /// 5 (see explanation of FIG. 2). And the peak located at 26140.65 (corresponding to GFP cleaved at / 2 and /// 4 ) is a peak derived from an almost intact GFP variant. The peaks close to these main peaks are shown in the inset of Fig. 2, but many of the cleavage sites are located in the addition region to the β barrel structure, so these peaks maintain the β barrel structure. It is thought that it originates from the part which does. The peaks located at m / s values of 13141.15 (N12L5) and 12974.40 (N15L9) correspond to the N-terminal portion divided in the largest loop. In addition, the peak located at the m / s value 52204.34 is derived from a defective GFP while maintaining the β barrel structure or a homo / heterodimer structure of intact GFP. See Table 1 for other peaks.
また、βＣＤを結合させたＧＦＰに由来するピークについて、同様に割当を行った（図３Ｂ）。ｍ／ｓ値29181.84及び28267.99に位置するピークは、ＣＤの結合処理を行わなかったＧＦＰの場合と同様、ほぼ無傷なＧＦＰ変異体に由来するピークである。ここで、ＣＤの結合処理をしていないＧＦＰ変異体由来のピークでｍ／ｓ値26140.65に位置するピーク（Ｎ２Ｃ４）と、ＣＤの結合処理をしたＧＦＰ変異体由来のピークでｍ／ｓ値26140.65に位置するピーク（Ｎ２Ｃ３）を比較してみる。Ｎ２Ｃ３ｍ／ｓ値（28267.99）は、Ｎ２Ｃ４ｍ／ｓ値（26140.65）よりもＶＤＧＴＣＬＹのペプチドに相当する分子量の想定フラグメントイオン（約878 880.1）とβＣＤの誘導体の分子量から反応の際の水素分子を除いた（約1,260 1243.9）分とＭＳの際の誤差分だけ増加している。従って、本発明の方法により、配列番号１で示されるアミノ酸配列を持つＧＦＰ変異体の２５１番目のシステインにβＣＤが結合されたことが確認された。 Moreover, assignment was performed in the same manner with respect to the peak derived from GFP to which βCD was bound (FIG. 3B). The peaks located at m / s values 29181.84 and 28267.99 are peaks derived from an almost intact GFP mutant, as in the case of GFP that was not subjected to CD binding treatment. Here, a peak derived from a GFP mutant not subjected to CD binding treatment (N2C4) located at an m / s value of 26140.65 and a peak derived from a GFP mutant subjected to CD binding treatment have an m / s value of 26140.65. Compare the peak located at (N2C3). The N2C3 m / s value (28267.99) excludes hydrogen molecules during the reaction from the molecular weight of the assumed fragment ion (about 878 880.1) and βCD derivative corresponding to the VDGTCLY peptide rather than the N2C4 m / s value (26140.65). (About 1,260 1243.9) minutes and the error in the MS increase. Therefore, it was confirmed by the method of the present invention that βCD was bound to the 251st cysteine of the GFP mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
本発明により、蛍光タンパク質とシクロデキストリンの複合体を容易に調製することが可能になる。調製された複合体は、細胞内の分子センターあるいは薬剤のデリバリー分子としての利用が期待できる。 According to the present invention, it becomes possible to easily prepare a complex of a fluorescent protein and a cyclodextrin. The prepared complex can be expected to be used as an intracellular molecular center or a drug delivery molecule.
Claims (3)
該蛍光タンパク質がＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ若しくはＲＦＰ、又は、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ若しくはＲＦＰのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、蛍光を発するタンパク質であり、
該所望のアミノ酸位置が、βバレル構造領域以外の箇所であり、及び、
該シクロデキストリン誘導体がヨウ化シクロデキストリン、マレイミドシクロデキストリン、ハロアセトアミドシクロデキストリン、ブロモメチルシクロデキストリン、チオサルフェイトシクロデキストリン、システイニルシクロデキストリン、トシルシクロデキストリンのいずれかである、
方法。 A method of producing a complex of a fluorescent protein and a cyclodextrin or a cyclodextrin derivative by reacting a fluorescent protein having a cysteine residue at a desired amino acid position with a cyclodextrin derivative having a binding property to the cysteine residue ,
The fluorescent protein contains GFP, BFP, CFP, YFP or RFP, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of GFP, BFP, CFP, YFP or RFP, and emits fluorescence ,
The desired amino acid position is other than the β-barrel structure region, and
The cyclodextrin derivative is any of iodinated cyclodextrin, maleimide cyclodextrin, haloacetamide cyclodextrin, bromomethyl cyclodextrin, thiosulfate cyclodextrin, cysteinyl cyclodextrin, tosyl cyclodextrin,
Method.
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