JP5866598B2 - Detection method of carcinogenic promotion activity - Google Patents
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Description
本発明は、被検物質の発がんプロモーション活性を検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting carcinogenic promotion activity of a test substance.
一般に、発がんの過程は、変異原性物質によるＤＮＡの損傷で引き起こされる正常細胞の潜在性細胞への変化を含む段階（イニシエーション）と、潜在性細胞をがん細胞に発展させる段階（プロモーション）の異なる２過程からなるとされている。イニシエートされた細胞は、発がんプロモーターに繰り返し曝露されてがんに発展する。 In general, the carcinogenic process involves a stage that includes changes of normal cells into latent cells caused by DNA damage by mutagenic substances (initiation), and a stage that develops latent cells into cancer cells (promotion). It is said to consist of two different processes. Initiated cells are repeatedly exposed to tumor promoters and develop into cancer.
発がんプロモーターの検出手段を提供することはがん予防に大いに貢献するが、発がんプロモーターの多くは遺伝毒性がなく、そのため短時間で検出できる方法の確立は困難である。 Providing a means for detecting a carcinogenic promoter greatly contributes to cancer prevention, but many of the carcinogenic promoters are not genotoxic, and therefore it is difficult to establish a method capable of detecting in a short time.
例えば、特許文献１、２に記載される方法は、動物を使用し、Ａｍｅｓ試験（発がんイニシエーション試験）陽性化合物及び陰性化合物のｍＲＮＡ発現パターンとの一致度により被検化学物質の発がん性を予測する方法であるが、これは発がんプロモーション活性の予測ではない。動物を使用するため、動物愛護の点でも培養細胞を用いた代替法開発が必要である。 For example, the methods described in Patent Literatures 1 and 2 use animals, and predict the carcinogenicity of a test chemical substance based on the degree of coincidence with mRNA expression patterns of positive compounds and negative compounds of an Ames test (carcinogenesis initiation test). Although it is a method, this is not a prediction of carcinogenic promotion activity. Since animals are used, it is necessary to develop alternative methods using cultured cells in terms of animal welfare.
特許文献３には、マウス胎児由来のＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞を用いて同定した発がんプロモーター検出マーカー遺伝子が記載されている。しかしながら、細胞を発がんイニシエーターで処理後に発がんプロモーター処理を行なってマーカーを同定しているため、イニシエーター処理による遺伝子発現への影響も含んでいる可能性がある。さらに、被検物質処理時間は４８時間を要する。 Patent Document 3 describes a tumor promoter detection marker gene identified using a mouse embryo-derived Balb / c 3T3 cell. However, since the marker is identified by treating the cell with a carcinogenic initiator and then treating the tumor with a carcinogenic promoter, there is a possibility that the effect of the initiator treatment on gene expression is also included. Furthermore, the test substance processing time requires 48 hours.
Ｂｈａｓ４２細胞はＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を導入した細胞株であり（非特許文献１）、Ｂｈａｓ４２細胞の形態変化（フォーカス形成）を指標として発がんプロモーション活性を評価する形質転換試験が知られている（非特許文献２）。この試験では発がんイニシエーション処理は不要であるが、被検物質処理に１０日間を要する上、フォーカス形成の観察は被検物質処理からさらに７日後であり、長期間を要する。形態変化が指標のため自動化も困難である。 Bhas42 cells are cell lines in which v-Ha-ras gene is introduced into Balb / c 3T3 cells (Non-patent Document 1), and transformation tests for evaluating carcinogenic promotion activity using morphological changes (focus formation) of Bhas42 cells as an index. Is known (Non-Patent Document 2). In this test, a carcinogenesis initiation process is not required, but it takes 10 days for the test substance treatment, and observation of focus formation is another 7 days after the test substance process, which takes a long time. It is difficult to automate because morphological change is an indicator.
従って、本発明の目的は、任意の化学物質の発がんプロモーション活性を迅速に調べることができる新規な手段を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel means capable of quickly examining the carcinogenic promotion activity of any chemical substance.
本願発明者らは、Ｂｈａｓ４２細胞を５種類の既知発がんプロモーターで２４時間処理した時点での遺伝子発現をマイクロアレイ分析し、コントロールの溶媒処理群における遺伝子発現と対比して発現量の相対変化を調べた。その結果、Ｂｈａｓ４２形質転換試験が陽性であるプロモーターの場合には、各プロモーターごとにそれぞれ有意な発現変化を示す遺伝子群が存在することを見出し、これら遺伝子を特定した。これら遺伝子を発がんプロモーションマーカー遺伝子とし、被検物質で処理したＢｈａｓ４２細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の相対変化を指標とすれば、従来よりも短時間の被検物質処理で発がんプロモーション活性を検出できること、さらに、既知発がんプロモーターによって発現変化する遺伝子群との一致性を調べることで、被検物質がいずれの発がんプロモーターに似ているか、すなわちプロモーターの系統分類ができることを見出し、本願発明を完成した。 The present inventors performed microarray analysis of gene expression at the time when Bhas42 cells were treated with five types of known tumor promoters for 24 hours, and examined the relative change in the expression level in comparison with the gene expression in the control solvent treatment group. . As a result, in the case of a promoter having a positive Bhas42 transformation test, it was found that there is a gene group exhibiting a significant expression change for each promoter, and these genes were identified. If these genes are used as carcinogenic promotion marker genes and the relative change in the expression level of the marker gene in Bhas42 cells treated with the test substance is used as an indicator, carcinogenic promotion activity can be detected with a test substance treatment shorter than before, Furthermore, by examining the consistency with a gene group whose expression is changed by a known tumor promoter, it was found that the test substance resembles which tumor promoter, that is, the promoter system can be classified, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、被検物質で処理されたBhas42細胞における、下記遺伝子群A〜Dから少なくとも１つずつ選択される遺伝子の発現量の変化を指標として、前記被検物質の発がんプロモーション活性を検出する方法であって、(1)〜(38)、(40)〜(60)、(62)〜(80)、(82)〜(126)の遺伝子は、発現増大した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子であり、(127)〜(199)の遺伝子は、発現減少した場合に発がんプロモーション活性が検出される遺伝子である方法を提供する。
遺伝子群A:
(2)(6)(9)(12)(18)(19)(20)(22)(25)(27)(28)(32)(34)(41)(56)(57)(59)(60)(62)(63)(65)(66)(70)(73)(74)(75)(76)(77)(78)(80)(82)(86)(87)(89)(90)(93)(94)(99)(103)(105)(107)(111)(113)(114)(117)(123)(127)(128)(130)(131)(133)(134)(135)(136)(137)(138)(139)(140)(141)(142)(143)(146)(147)(149)(150)(151)(152)(154)(155)(156)(157)(158)(159)(160)(161)(164)(165)(166)(167)(168)(169)(171)(172)(173)(175)(176)(177)(178)(179)(180)(181)(182)(183)(184)(186)(187)(188)(189)(191)(193)(195)(196)(197)(199)
遺伝子群B:
(11)(16)(29)(37)(46)(47)(50)(54)(55)(58)(64)(67)(68)(69)(71)(72)(83)(85)(91)(95)(96)(101)(102)(104)(109)(110)(115)(116)(122)(125)(129)(132)(145)(151)(162)(163)(170)(184)(185)(192)(194)(198)
遺伝子群C:
(1)(3)(4)(5)(8)(10)(13)(14)(15)(17)(21)(23)(26)(30)(31)(33)(35)(36)(40)(42)(44)(45)(48)(49)(51)(52)(53)(64)(71)(79)(88)(92)(97)(100)(106)(107)(108)(112)(119)(120)(121)(124)(126)(190)(192)
遺伝子群D:
(7)(21)(24)(33)(38)(43)(84)(98)(118)(133)(144)(145)(148)(153)(156)(157)(174)(192)
ここで、前記遺伝子はそれぞれ下記の通りである。
(1) 1100001G20Rik（配列番号1）、(2) 2310002L13Rik（配列番号2）、(3) 2410066E13Rik（配列番号3）、(4) 5430417L22Rik（配列番号4）、(5) 6430527G18Rik（配列番号5）、(6) Aen（配列番号6）、(7) Aldh1a7（配列番号7）、(8) Apcdd1（配列番号8）、(9) Aspm（配列番号9）、(10) Atp2a2（配列番号10）、(11) AW112010（配列番号11）、(12) Bcat1（配列番号12）、(13) C3（配列番号13）、(14) Car5b（配列番号14）、(15) Cbs（配列番号15）、(16) Ccl11（配列番号16）、(17) Ccl9（配列番号17）、(18) Ccne2（配列番号18）、(19) Ccrn4l /// LOC100047134（配列番号19）、(20) Cdc6（配列番号20）、(21) Cebpd（配列番号21）、(22) Ces1（配列番号22）、(23) Cib2（配列番号23）、(24) Cp（配列番号24）、(25) Ctps（配列番号25）、(26) Cyr61（配列番号26）、(27) Dkc1（配列番号27）、(28) Dtl（配列番号28）、(29) Emilin1（配列番号29）、(30) Enpp3（配列番号30）、(31) Ephb2（配列番号31）、(32) Eps8 /// LOC632638（配列番号32）、(33) Errfi1（配列番号33）、(34) Exo1（配列番号34）、(35) Fam171a2（配列番号35）、(36) Fam43a（配列番号36）、(37) Fbn1（配列番号37）、(38) Fkbp5（配列番号38）、(40) Foxf1a（配列番号40）、(41) Foxm1（配列番号41）、(42) Galntl2（配列番号42）、(43) Gdpd2（配列番号43）、(44) Gdpd5（配列番号44）、(45) Gfod1（配列番号45）、(46) Gla（配列番号46）、(47) Glb1（配列番号47）、(48) Gm10638（配列番号48）、(49) Gm11428（配列番号49）、(50) Gm14446（配列番号50）、(51) Gm22（配列番号51）、(52) Gpr133（配列番号52）、(53) Grk5（配列番号53）、(54) Gsta1 /// Gsta2（配列番号54）、(55) Herc5（配列番号55）、(56) Hirip3（配列番号56）、(57) Hmga2（配列番号57）、(58) Ifi205 /// Mnda（配列番号58）、(59) Ifrd2（配列番号59）、(60) Il13ra1（配列番号60）、(62) Ivns1abp（配列番号62）、(63) Kif20b（配列番号63）、(64) Lgals2（配列番号64）、(65) LOC100045677 /// Mcm3（配列番号65）、(66) Ltbp1（配列番号66）、(67) Lum（配列番号67）、(68) Ly6e（配列番号68）、(69) Masp1（配列番号69）、(70) Matr3（配列番号70）、(71) Mmp13（配列番号71）、(72) Mpeg1（配列番号72）、(73) Mthfd1（配列番号73）、(74) Mtm1（配列番号74）、(75) Myc（配列番号75）、(76) Nolc1（配列番号76）、(77) Nop16（配列番号77）、(78) Nop56（配列番号78）、(79) Nr2f2（配列番号79）、(80) Nsl1（配列番号80）、(82) Pdss1（配列番号82）、(83) Peg3（配列番号83）、(84) Per1（配列番号84）、(85) Plekhg4（配列番号85）、(86) Pnn（配列番号86）、(87) Polr1b（配列番号87）、(88) Prelp（配列番号88）、(89) Prkg2（配列番号89）、(90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4（配列番号90）、(91) Ptgfr（配列番号91）、(92) Ptprf（配列番号92）、(93) Rrm2（配列番号93）、(94) Rrp12（配列番号94）、(95) Rsad2（配列番号95）、(96) S100b（配列番号96）、(97) S1pr3（配列番号97）、(98) Sema3g（配列番号98）、(99) Shmt2（配列番号99）、(100) Slc7a3（配列番号100）、(101) Slfn2（配列番号101）、(102) Slfn4（配列番号102）、(103) Smc2（配列番号103）、(104) Spon2（配列番号104）、(105) Srm（配列番号105）、(106) St3gal5（配列番号106）、(107) Steap1（配列番号107）、(108) Tbc1d4（配列番号108）、(109) Timp4（配列番号109）、(110) Tjp2（配列番号110）、(111) Tk1（配列番号111）、(112) Tmem41a（配列番号112）、(113) Tmem97（配列番号113）、(114) Tnfrsf12a（配列番号114）、(115) Tnfsf10（配列番号115）、(116) Trim25（配列番号116）、(117) Trp53（配列番号117）、(118) Tsc22d3（配列番号118）、(119) Tspan2（配列番号119）、(120) Ttc7b（配列番号120）、(121) Ttll1（配列番号121）、(122) Ttyh2（配列番号122）、(123) Ung（配列番号123）、(124) Vdr（配列番号124）、(125) Wwp2（配列番号125）、(126) Zc3h8（配列番号126）、(127) Adamts4（配列番号127）、(128) Agt（配列番号128）、(129) Ankrd1（配列番号129）、(130) Apod（配列番号130）、(131) Aspn（配列番号131）、(132) Atrx（配列番号132）、(133) AU015680（配列番号133）、(134) Bdh2（配列番号134）、(135) Boc（配列番号135）、(136) Btg2（配列番号136）、(137) Calml4（配列番号137）、(138) Cbr2（配列番号138）、(139) Cd1d1（配列番号139）、(140) Clu /// LOC100046120（配列番号140）、(141) Col27a1（配列番号141）、(142) Col3a1（配列番号142）、(143) Crlf1（配列番号143）、(144) Cxcl5（配列番号144）、(145) Cyr61（配列番号145）、(146) D0H4S114（配列番号146）、(147) D530037H12Rik（配列番号147）、(148) Dbp（配列番号148）、(149) Dcn（配列番号149）、(150) Dhrs3（配列番号150）、(151) Dleu2（配列番号151）、(152) Dusp1（配列番号152）、(153) Dusp5（配列番号153）、(154) Ebf1（配列番号154）、(155) Egr1（配列番号155）、(156) Egr2（配列番号156）、(157) Egr3（配列番号157）、(158) Enpp2（配列番号158）、(159) Fbxo32（配列番号159）、(160) Fmod（配列番号160）、(161) Fos（配列番号161）、(162) Gpc6（配列番号162）、(163) Hist1h1c（配列番号163）、(164) Ier2（配列番号164）、(165) Jhdm1d（配列番号165）、(166) Kdm6b（配列番号166）、(167) Lgals7（配列番号167）、(168) Lipa（配列番号168）、(169) LOC100047324 /// Sesn1（配列番号169）、(170) LOC640441 /// Thbs1（配列番号170）、(171) Matn2（配列番号171）、(172) Mmp14（配列番号172）、(173) Nr4a1（配列番号173）、(174) Per3（配列番号174）、(175) Pik3ip1（配列番号175）、(176) Plac8（配列番号176）、(177) Postn（配列番号177）、(178) Ppargc1a（配列番号178）、(179) Prelp（配列番号179）、(180) Prokr1（配列番号180）、(181) Ptgfr（配列番号181）、(182) Ptn（配列番号182）、(183) Ptplb（配列番号183）、(184) Rbms3（配列番号184）、(185) Rhobtb3（配列番号185）、(186) Scn2a1（配列番号186）、(187) Sesn3（配列番号187）、(188) Slc9a3r2（配列番号188）、(189) Sned1（配列番号189）、(190) Sorbs2（配列番号190）、(191) Sox4（配列番号191）、(192) Tpm1（配列番号192）、(193) Trp53inp2（配列番号193）、(194) Tsc22d2（配列番号194）、(195) Wbscr27（配列番号195）、(196) Ypel1（配列番号196）、(197) Ypel2（配列番号197）、(198) Zbed6（配列番号198）、(199) Zfp36（配列番号199）
That is, the present invention relates to the carcinogenic promotion activity of the test substance, using as an index the change in the expression level of a gene selected from at least one of the following gene groups A to D in Bhas42 cells treated with the test substance. The gene of (1)- (38), (40)-(60), (62)-(80), (82)- (126) The gene of (127)-(199) provides a method in which carcinogenic promotion activity is detected when expression is decreased.
Gene group A:
(2) (6) (9) (12) (18) (19) (20) (22) (25) (27) (28) (32) (34) (41) (56) (57) (59 ) (60) (62) (63) (65) (66) (70) (73) (74) (75) (76) (77) (78) (80) (82) (86) (87) ( 89) (90) (93) (94) (99) (103) (105) (107) (111) (113) (114) (117) (123) (127) (128) (130) (131) (133) (134) (135) (136) (137) (138) (139) (140) (141) (142) (143) (146) (147) (149) (150) (151) (152 ) (154) (155) (156) (157) (158) (159) (160) (161) (164) (165) (166) (167) (168) (169) (171) (172) ( 173) (175) (176) (177) (178) (179) (180) (181) (182) (183) (184) (186) (187) (188) (189) (191) (193) (195) (196) (197) (199)
Gene group B:
(11) (16) (29) (37) (46) (47) (50) (54) (55) (58) (64) (67) (68) (69) (71) (72) (83 ) (85) (91) (95) (96) (101) (102) (104) (109) (110) (115) (116) (122) (125) (129) (132) (145) ( 151) (162) (163) (170) (184) (185) (192) (194) (198)
Gene group C:
(1) (3) (4) (5) (8) (10) (13) (14) (15) (17) (21) (23) (26) (30) (31) (33) (35 ) (36) (40) (42) (44) (45) (48) (49) (51) (52) (53) (64) (71) (79) (88) (92) (97) ( 100) (106) (107) (108) (112) (119) (120) (121) (124) (126) (190) (192)
Gene group D:
(7) (21) (24) (33) (38) (43) (84) (98) (118) (133) (144) (145) (148) (153) (156) (157) (174 ) (192)
Here, the genes are as follows.
(1) 1100001G20Rik (SEQ ID NO: 1), (2) 2310002L13Rik (SEQ ID NO: 2), (3) 2410066E13Rik (SEQ ID NO: 3), (4) 5430417L22Rik (SEQ ID NO: 4), (5) 6430527G18Rik (SEQ ID NO: 5), (6) Aen (SEQ ID NO: 6), (7) Aldh1a7 (SEQ ID NO: 7), (8) Apcdd1 (SEQ ID NO: 8), (9) Aspm (SEQ ID NO: 9), (10) Atp2a2 (SEQ ID NO: 10), (11) AW112010 (SEQ ID NO: 11), (12) Bcat1 (SEQ ID NO: 12), (13) C3 (SEQ ID NO: 13), (14) Car5b (SEQ ID NO: 14), (15) Cbs (SEQ ID NO: 15), (16) Ccl11 (SEQ ID NO: 16), (17) Ccl9 (SEQ ID NO: 17), (18) Ccne2 (SEQ ID NO: 18), (19) Ccrn4l /// LOC100047134 (SEQ ID NO: 19), (20) Cdc6 (sequence) No. 20), (21) Cebpd (SEQ ID NO: 21), (22) Ces1 (SEQ ID NO: 22), (23) Cib2 (SEQ ID NO: 23), (24) Cp (SEQ ID NO: 24), (25) Ctps (sequence) No. 25), (26) Cyr61 (SEQ ID NO: 26), (27) Dkc1 (SEQ ID NO: 27), (28) Dtl (SEQ ID NO: 28), (29) Emilin1 (SEQ ID NO: 29), (30) Enpp3 ( (SEQ ID NO: 30), (31) Ephb2 (SEQ ID NO: 31), (32) Eps8 /// LOC632638 (SEQ ID NO: 32), (33) Errfi1 (SEQ ID NO: 33), (34) Exo1 (SEQ ID NO: 34), ( 35) Fam171a2 (SEQ ID NO: 35), (36) Fam43a (SEQ ID NO: 36), (37) Fbn1 (SEQ ID NO: 37), (38) Fkbp5 (SEQ ID NO: 38) , ( 40) Foxf1a (SEQ ID NO: 40), ( 41) Foxm1 (SEQ ID NO: 41), (42) Galntl2 (SEQ ID NO: 42), (43) Gdpd2 (SEQ ID NO: 43), (44) Gdpd5 (SEQ ID NO: 44), (45) Gfod1 (SEQ ID NO: 45), ( 46) Gla (SEQ ID NO: 46), (47) Glb1 (SEQ ID NO: 47), (48) Gm10638 (SEQ ID NO: 48), (49) Gm11428 (SEQ ID NO: 49), (50) Gm14446 (SEQ ID NO: 50), ( 51) Gm22 (SEQ ID NO: 51), (52) Gpr133 (SEQ ID NO: 52), (53) Grk5 (SEQ ID NO: 53), (54) Gsta1 /// Gsta2 (SEQ ID NO: 54), (55) Herc5 (SEQ ID NO: 55), (56) Hirip3 (SEQ ID NO: 56), (57) Hmga2 (SEQ ID NO: 57), (58) Ifi205 /// Mnda (SEQ ID NO: 58), (59) Ifrd2 (SEQ ID NO: 59), (60) Il13ra1 (SEQ ID NO: 60) , ( 62) Ivns1abp (SEQ ID NO: 62), (63) Kif20b (SEQ ID NO: 63), (64) Lgals2 (SEQ ID NO: 64), (65) LOC100045677 /// Mcm3 (SEQ ID NO: 65), (66) Ltbp1 (SEQ ID NO: 66), (67) Lum (SEQ ID NO: 67), (68) Ly6e (SEQ ID NO: 68), (69) Masp1 (SEQ ID NO: 69), (70) Matr3 (SEQ ID NO: 70), (71) Mmp13 (SEQ ID NO: 71), (72) Mpeg1 (SEQ ID NO: 72), (73) Mthfd1 (SEQ ID NO: 73), (74) Mtm1 (SEQ ID NO: 74), (75) Myc (SEQ ID NO: 75), (76) Nolc1 (SEQ ID NO: 76), (77) Nop16 (SEQ ID NO: 77), (78) Nop56 (SEQ ID NO: 78), (79) Nr2f2 (SEQ ID NO: 79), (80) Nsl1 (SEQ ID NO: 80) , ( 82) Pdss1 (SEQ ID NO: 82), (83) Peg3 (SEQ ID NO: 83), (84) Per1 (SEQ ID NO: 84), (85) Plekhg4 (SEQ ID NO: 85), (86) Pnn (SEQ ID NO: 86), (87) Polr1b (SEQ ID NO: 87), (88) Prelp (SEQ ID NO: 88), (89) Prkg2 (SEQ ID NO: 89), (90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4 (SEQ ID NO: 90), (91 ) Ptgfr SEQ ID NO: 91), (92) Ptprf (SEQ ID NO: 92), (93) Rrm2 (SEQ ID NO: 93), (94) Rrp12 (SEQ ID NO: 94), (95) Rsad2 (SEQ ID NO: 95), (96) S100b ( SEQ ID NO: 96), (97) S1pr3 (SEQ ID NO: 97), (98) Sema3g (SEQ ID NO: 98), (99) Shmt2 (SEQ ID NO: 99), ( 100) Slc7a3 (SEQ ID NO: 100), (101) Slfn2 ( SEQ ID NO: 101), (102) Slfn4 (SEQ ID NO: 102), (103) Smc2 (SEQ ID NO: 103), (104) Spon2 (SEQ ID NO: 104), (105) Srm (SEQ ID NO: 105), (106) St3gal5 ( SEQ ID NO: 106), (107) Steap1 (SEQ ID NO: 107), (108) Tbc1d4 (SEQ ID NO: 108), (109) Timp4 (SEQ ID NO: 109), (110) Tjp2 (SEQ ID NO: 110), (111) Tk1 ( SEQ ID NO: 111), (112) Tmem41a (SEQ ID NO: 112), (113) Tmem97 (SEQ ID NO: 113), (114) Tnfrsf12a (SEQ ID NO: 114), (115) Tnfsf10 (SEQ ID NO: 115), (116) Trim25 ( SEQ ID NO: 116), (117) Trp53 (SEQ ID NO: 117), (118) Tsc22d3 (SEQ ID NO: 118), (119) Tspan2 (SEQ ID NO: 119), (1 20) Ttc7b (SEQ ID NO: 120), (121) Ttll1 (SEQ ID NO: 121), (122) Ttyh2 (SEQ ID NO: 122), (123) Ung (SEQ ID NO: 123), (124) Vdr (SEQ ID NO: 124), ( 125) Wwp2 (SEQ ID NO: 125), (126) Zc3h8 (SEQ ID NO: 126), (127) Adamts4 (SEQ ID NO: 127), (128) Agt (SEQ ID NO: 128), (129) Ankrd1 (SEQ ID NO: 129), ( 130) Apod (SEQ ID NO: 130), (131) Aspn (SEQ ID NO: 131), (132) Atrx (SEQ ID NO: 132), (133) AU015680 (SEQ ID NO: 133), (134) Bdh2 (SEQ ID NO: 134), ( 135) Boc (SEQ ID NO: 135), (136) Btg2 (SEQ ID NO: 136), (137) Calml4 (SEQ ID NO: 137), (138) Cbr2 (SEQ ID NO: 138), (139) Cd1d1 (SEQ ID NO: 139), ( 140) Clu /// LOC100046120 (SEQ ID NO: 140), (141) Col27a1 (SEQ ID NO: 141), (142) Col3a1 (SEQ ID NO: 142), (143) Crlf1 (SEQ ID NO: 143), (144) Cxcl5 (SEQ ID NO: 144), (145) Cyr61 (SEQ ID NO: 145), (146) D0H4S114 (SEQ ID NO: 146), (147) D530037H12Rik (SEQ ID NO: 147), ( 148) Dbp (SEQ ID NO: 148), (149) Dcn (SEQ ID NO: 149), (150) Dhrs3 (SEQ ID NO: 150), (151) Dleu2 (SEQ ID NO: 151), (152) Dusp1 (SEQ ID NO: 152), ( 153) Dusp5 (SEQ ID NO: 153), (154) Ebf1 (SEQ ID NO: 154), (155) Egr1 (SEQ ID NO: 155), (156) Egr2 (SEQ ID NO: 156), (157) Egr3 (SEQ ID NO: 157), ( 158) Enpp2 (SEQ ID NO: 158), (159) Fbxo32 (SEQ ID NO: 159), (160) Fmod (SEQ ID NO: 160), (161) Fos (SEQ ID NO: 161), (162) Gpc6 (SEQ ID NO: 162), ( 163) Hist1h1c (SEQ ID NO: 163), (164) Ier2 (SEQ ID NO: 164), (165) Jhdm1d (SEQ ID NO: 165), (166) Kdm6b (SEQ ID NO: 166), (167) Lgals7 (SEQ ID NO: 167), ( 168) Lipa (SEQ ID NO: 168), (169) LOC100047324 /// Sesn1 (SEQ ID NO: 169), (170) LOC640441 /// Thbs1 (SEQ ID NO: 170), (171) Matn2 (SEQ ID NO: 171), (172) Mmp14 (SEQ ID NO: 172), (173) Nr4a1 (SEQ ID NO: 173), (174) Per3 (SEQ ID NO: 174), (175) Pik3ip1 (SEQ ID NO: 175) (176) Plac8 (SEQ ID NO: 176), (177) Postn (SEQ ID NO: 177), (178) Ppargc1a (SEQ ID NO: 178), (179) Prelp (SEQ ID NO: 179), (180) Prokr1 (SEQ ID NO: 180) (181) Ptgfr (SEQ ID NO: 181), (182) Ptn (SEQ ID NO: 182), (183) Ptplb (SEQ ID NO: 183), (184) Rbms3 (SEQ ID NO: 184), (185) Rhobtb3 (SEQ ID NO: 185) (186) Scn2a1 (SEQ ID NO: 186), (187) Sesn3 (SEQ ID NO: 187), (188) Slc9a3r2 (SEQ ID NO: 188), (189) Sned1 (SEQ ID NO: 189), (190) Sorbs2 (SEQ ID NO: 190) (191) Sox4 (SEQ ID NO: 191), (192) Tpm1 (SEQ ID NO: 192), (193) Trp53inp2 (SEQ ID NO: 193), (194) Tsc22d2 (SEQ ID NO: 194), (195) Wbscr27 (SEQ ID NO: 195) , (196) Ypel1 (SEQ ID NO: 196), (197) Ypel2 (SEQ ID NO: 197), (198) Zbed6 (SEQ ID NO: 198), (199) Zfp36 (SEQ ID NO: 199)
本発明により、従来よりも短時間で遺伝子発現の変化を指標に発がんプロモーション活性を検出できる新規な方法が提供された。Ｂｈａｓ４２細胞を用いれば、被検物質処理は２４時間と短時間でよく、また発がんイニシエーション処理は不要なため、イニシエーターの影響を排除できる。１９９の遺伝子の一部又は全てを含むマイクロアレイチップを設計すれば、簡便な発がんプロモーター検出用のチップを提供できる。また、新規ＤＮＡマイクロアレイ以外にも、発がんプロモーター検出に特化したトランスクリプトミクス（リアルタイムＰＣＲ測定用遺伝子リストおよびプライマーセットなど）、プロテオミクス（プロテインチップなど）、メタボロミクス（代謝産物リストなど）へと展開し、発がんプロモーターの検出に広く応用することも可能である。 According to the present invention, a novel method capable of detecting carcinogenic promotion activity using a change in gene expression as an index in a shorter time than before has been provided. If Bhas42 cells are used, the test substance treatment may be as short as 24 hours, and the carcinogenesis initiation process is unnecessary, so that the influence of the initiator can be eliminated. If a microarray chip containing part or all of 199 genes is designed, a simple chip for detecting a tumor promoter can be provided. In addition to new DNA microarrays, we have expanded into transcriptomics (such as gene lists and primer sets for real-time PCR measurement), proteomics (such as protein chips), and metabolomics (such as metabolite lists) specialized in carcinogenic promoter detection. It can also be widely applied to detection of carcinogenic promoters.
本発明の方法で使用する細胞は、マウス胎児由来のＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞にｖ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子を導入したＢｈａｓ４２細胞である。Ｂｈａｓ４２細胞は、非特許文献１及び２に記載されるように公知であり、当業者であれば容易に入手ないしは調製できる。培養条件も公知であり、通常、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター内で培養する。Cells used in the method of the present invention are Bhas42 cells in which a v-Ha-ras gene is introduced into a mouse fetal Balb / c 3T3 cell. Bhas42 cells are known as described in Non-Patent Documents 1 and 2, and can be easily obtained or prepared by those skilled in the art. The culture conditions are also known and are usually cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
本発明の方法では、Ｂｈａｓ４２細胞は、例えば５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＦ５Ｆ）で前培養を行なった後、同培地で７ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞密度の細胞浮遊液を調製して培養を開始する。６ｗｅｌｌプレートを用いる場合には細胞浮遊液を２ｍＬ／ｗｅｌｌ程度ずつ播種すればよい。播種から４日程度後に被検物質処理又はコントロールの溶媒処理を行なう。通常、被検物質を含む新鮮な培地に交換することで、被検物質処理が行なわれる。プロモーター活性未知の被検物質を調べる場合、ｎｇ／ｍｌ〜ｍｇ／ｍｌのオーダーで数段階の濃度で処理を行ない、サンプルを得てよい。被検物質処理から２４時間後、細胞をサンプリングし、常法によりトータルＲＮＡを抽出、このＲＮＡ試料について発現解析を行なえばよい。In the method of the present invention, Bhas42 cells are precultured in DMEM / F12 medium (DF5F) supplemented with, for example, 5% fetal bovine serum (FBS), and then have a cell density of about 7 × 10 3 cells / mL in the same medium. Prepare the cell suspension and start culturing. When a 6-well plate is used, the cell suspension may be seeded at about 2 mL / well. About 4 days after sowing, test substance treatment or control solvent treatment is performed. Usually, the test substance treatment is performed by exchanging with a fresh medium containing the test substance. When examining a test substance whose promoter activity is unknown, a sample may be obtained by performing treatment at several concentrations in the order of ng / ml to mg / ml. 24 hours after the test substance treatment, the cells are sampled, total RNA is extracted by a conventional method, and expression analysis is performed on this RNA sample.
マイクロアレイを用いて発現解析を行なう場合、使用するマイクロアレイで推奨される品質のＲＮＡ試料を調製する必要があるが、当業者であれば適宜調製できる。特に限定されないが、通常、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｉｏ ＡｎａｌｙｚｅｒにてＲＩＮ９．０以上を保証される程度の品質であれば、マイクロアレイ解析に好ましく供することができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の３’ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｋｉｔにてａＲＮＡを調製した場合、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｉｏ ＡｎａｌｙｚｅｒにてＳｍｅａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓを実行し、１０００ｎｔにピーク中心があること、１０００−４０００ｎｔのＡＵＣが全体の３５％以上を占めることがＲＮＡ試料の条件となり得るが、他社製品使用の場合はこの限りではない。 When performing expression analysis using a microarray, it is necessary to prepare an RNA sample having a quality recommended for the microarray to be used, but those skilled in the art can appropriately prepare it. Although it is not particularly limited, it can be preferably used for microarray analysis as long as the quality is such that RIN 9.0 or higher is normally guaranteed by Agilent BioAnalyzer. For example, when aRNA was prepared using Affymetrix's 3'IVT Express kit, a Smart Analysis was performed using Agilent BioAnalyzer, a peak center at 1000 nt, and an AUC of 1000-4000 nt was 35% or more of the total However, this is not the case when using products of other companies.
本発明でマーカー遺伝子として使用され得る遺伝子を表１及び表２に示す。配列表に記載されるこれら遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列であり、各ＲｅｆＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＩＤなどで検索可能な配列である。これらの遺伝子は、下記実施例において、５種類の既知発がんプロモーターのうちの少なくともいずれか１つで有意に（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）＜０．０１）発現量が変化した遺伝子である。表１の１２６遺伝子（（１）〜（１２６）の遺伝子）が、溶媒処理の対照群に対し２倍以上に発現量が増大した遺伝子であり、表２の７３遺伝子（（１２７）〜（１９９）の遺伝子）が、溶媒処理の対照群に対し０．５倍以下に発現量が減少した遺伝子である。表中、「ｍＲＮＡを増大（減少）させるプロモーター」の欄には、Ｂｈａｓ４２細胞を２４時間処理した場合に発現増大（減少）が確認された発がんプロモーターを示す（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、オカダ酸（ＯＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、プロゲステロン（ＰＲＯＧ）及び１７β−エストラジオール（ＥＤ））。 Tables 1 and 2 show genes that can be used as marker genes in the present invention. The base sequences of these genes described in the sequence listing are base sequences registered in GenBank, and can be searched by each RefSeq Transscript ID. In the following Examples, these genes are genes whose expression levels are significantly changed (False Discovery Rate (FDR) <0.01) in at least one of the five known oncogenic promoters. The 126 genes in Table 1 (the genes of (1) to (126)) are genes whose expression levels increased more than twice compared to the solvent-treated control group, and the 73 genes ((127) to (199) in Table 2 were used. )) Is a gene whose expression level is reduced by 0.5 times or less compared to the solvent-treated control group. In the table, the column “Promoter for increasing (decreasing) mRNA” indicates a tumor promoter whose expression was increased (decreased) when Bhas42 cells were treated for 24 hours (12-O-tetradecanoylphorbol). 13-acetate (TPA), okadaic acid (OA), lithocholic acid (LCA), progesterone (PROG) and 17β-estradiol (ED)).
（１）〜（１９９）の遺伝子について、発がんプロモーターごとにグループ分けすると以下の通りである。なお、ＥＤ処理で発現量の変化が認められた遺伝子は（１６１）のみであり、該遺伝子は遺伝子群Ａの減少遺伝子にも属する。 The genes (1) to (199) are grouped by carcinogenic promoter as follows. Note that the gene whose expression level was changed by ED treatment was only (161), and this gene also belongs to the reduced gene of gene group A.
遺伝子群Ａ：ＴＰＡ処理で発現量が変化する遺伝子（１０６遺伝子）
Ａ−１）発現増大する遺伝子（４８遺伝子）
（２）（６）（９）（１２）（１８）（１９）（２０）（２２）（２５）（２７）（２８）（３２）（３４）（３９）（４１）（５６）（５７）（５９）（６０）（６１）（６２）（６３）（６５）（６６）（７０）（７３）（７４）（７５）（７６）（７７）（７８）（８０）（８２）（８６）（８７）（８９）（９０）（９３）（９４）（９９）（１０３）（１０５）（１０７）（１１１）（１１３）（１１４）（１１７）（１２３）
Ａ−２）発現減少する遺伝子（５８遺伝子）
（１２７）（１２８）（１３０）（１３１）（１３３）（１３４）（１３５）（１３６）（１３７）（１３８）（１３９）（１４０）（１４１）（１４２）（１４３）（１４６）（１４７）（１４９）（１５０）（１５１）（１５２）（１５４）（１５５）（１５６）（１５７）（１５８）（１５９）（１６０）（１６１）（１６４）（１６５）（１６６）（１６７）（１６８）（１６９）（１７１）（１７２）（１７３）（１７５）（１７６）（１７７）（１７８）（１７９）（１８０）（１８１）（１８２）（１８３）（１８４）（１８６）（１８７）（１８８）（１８９）（１９１）（１９３）（１９５）（１９６）（１９７）（１９９）Gene group A: genes whose expression level changes by TPA treatment (106 genes)
A-1) Gene whose expression is increased (48 genes)
(2) (6) (9) (12) (18) (19) (20) (22) (25) (27) (28) (32) (34) (39) (41) (56) (57 ) (59) (60) (61) (62) (63) (65) (66) (70) (73) (74) (75) (76) (77) (78) (80) (82) ( 86) (87) (89) (90) (93) (94) (99) (103) (105) (107) (111) (113) (114) (117) (123)
A-2) Gene whose expression decreases (58 genes)
(127) (128) (130) (131) (133) (134) (135) (136) (137) (138) (139) (140) (141) (142) (143) (146) (147) ) (149) (150) (151) (152) (154) (155) (156) (157) (158) (159) (160) (161) (164) (165) (166) (167) ( 168) (169) (171) (172) (173) (175) (176) (177) (178) (179) (180) (181) (182) (183) (184) (186) (187) (188) (189) (191) (193) (195) (196) (197) (199)
遺伝子群Ｂ：オカダ酸処理で発現量が変化する遺伝子（４３遺伝子）
Ｂ−１）発現増大する遺伝子（３１遺伝子）
（１１）（１６）（２９）（３７）（４６）（４７）（５０）（５４）（５５）（５８）（６４）（６７）（６８）（６９）（７１）（７２）（８１）（８３）（８５）（９１）（９５）（９６）（１０１）（１０２）（１０４）（１０９）（１１０）（１１５）（１１６）（１２２）（１２５）
Ｂ−２）発現減少する遺伝子（１２遺伝子）
（１２９）（１３２）（１４５）（１５１）（１６２）（１６３）（１７０）（１８４）（１８５）（１９２）（１９４）（１９８）Gene group B: genes whose expression level is changed by okadaic acid treatment (43 genes)
B-1) Gene whose expression is increased (31 genes)
(11) (16) (29) (37) (46) (47) (50) (54) (55) (58) (64) (67) (68) (69) (71) (72) (81 ) (83) (85) (91) (95) (96) (101) (102) (104) (109) (110) (115) (116) (122) (125)
B-2) Genes whose expression decreases (12 genes)
(129) (132) (145) (151) (162) (163) (170) (184) (185) (192) (194) (198)
遺伝子群Ｃ：リトコール酸処理で発現量が変化する遺伝子（４６遺伝子）
Ｃ−１）発現増大する遺伝子（４４遺伝子）
（１）（３）（４）（５）（８）（１０）（１３）（１４）（１５）（１７）（２１）（２３）（２６）（３０）（３１）（３３）（３５）（３６）（４０）（４２）（４４）（４５）（４８）（４９）（５１）（５２）（５３）（６４）（７１）（７９）（８１）（８８）（９２）（９７）（１００）（１０６）（１０７）（１０８）（１１２）（１１９）（１２０）（１２１）（１２４）（１２６）
Ｃ−２）発現減少する遺伝子（２遺伝子）
（１９０）（１９２）Gene group C: genes whose expression level changes by lithocholic acid treatment (46 genes)
C-1) Gene whose expression increases (44 genes)
(1) (3) (4) (5) (8) (10) (13) (14) (15) (17) (21) (23) (26) (30) (31) (33) (35 ) (36) (40) (42) (44) (45) (48) (49) (51) (52) (53) (64) (71) (79) (81) (88) (92) ( 97) (100) (106) (107) (108) (112) (119) (120) (121) (124) (126)
C-2) Genes with decreased expression (2 genes)
(190) (192)
遺伝子群Ｄ：プロゲステロン処理で発現量が変化する遺伝子（１９遺伝子）
Ｄ−１）発現増大する遺伝子（１０遺伝子）
（７）（２１）（２４）（３３）（３８）（４３）（８１）（８４）（９８）（１１８）
Ｄ−２）発現減少する遺伝子（９遺伝子）
（１３３）（１４４）（１４５）（１４８）（１５３）（１５６）（１５７）（１７４）（１９２）Gene group D: genes whose expression level is changed by progesterone treatment (19 genes)
D-1) Genes with increased expression (10 genes)
(7) (21) (24) (33) (38) (43) (81) (84) (98) (118)
D-2) Genes with decreased expression (9 genes)
(133) (144) (145) (148) (153) (156) (157) (174) (192)
遺伝子群Ｅ：１７β−エストラジオール処理で発現量が変化する遺伝子（１遺伝子）
発現減少する遺伝子（１遺伝子）
（１６１）Gene group E: genes whose expression level changes by treatment with 17β-estradiol (1 gene)
Gene whose expression decreases (1 gene)
(161)
本発明の方法では、(1)〜(199)のマーカー遺伝子（ただし(39)、(61)及び(81)を除く）のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子、より具体的には、遺伝子群A〜Dから少なくとも１つずつ選択される遺伝子の発現量を測定し、コントロール処理群に対する相対変化を調べる。測定する遺伝子数は特に限定されず、例えば196遺伝子中の１０種以上、３０種以上、５０種以上、７０種以上、１００種以上、又は１５０種以上としても良く、196遺伝子の全てを測定しても良い。複数の遺伝子を測定対象とする場合、遺伝子群A〜Dのいずれか１つから測定対象の遺伝子を選択しても良いが、遺伝子群A〜Dの各群から少なくとも１つずつを選択しても良い。例えば、遺伝子群A〜Dから５以上又は１０以上の遺伝子を測定対象としても良いし、あるいは、各群から１割以上（具体的には、遺伝子群Dであれば１９遺伝子なので１遺伝子以上）、３割以上（遺伝子群Dであれば５遺伝子以上）、５割以上、又は７割以上の遺伝子を測定対象としても良い。網羅的に解析する観点では、できる限り多数のマーカー遺伝子の発現量を調べることが望ましく、また、対象とするマーカー遺伝子には、遺伝子群A〜Dの少なくとも１遺伝子ずつが含まれることが望ましい。なお、上記の遺伝子に加えて、発がんプロモーションマーカー遺伝子として有用であり得る他の遺伝子（例えば後掲の表４、表５に記載される遺伝子など）の発現量をさらに調べることは差し支えない。
In the method of the present invention, at least one gene of marker genes (excluding (39), (61) and (81) ) of (1) to (199) , more specifically, a gene group The expression level of at least one gene selected from A to D is measured, and the change relative to the control treatment group is examined. The number of genes to be measured is not particularly limited, for example, 196 or more 10 or in the gene, 30 or more, 50 or more, 70 or more, 100 or more, or may be a 150 or more, measures all 196 genes May be. When a plurality of genes are to be measured, the gene to be measured may be selected from any one of the gene groups A to D, but at least one from each group of the gene groups A to D is selected. Also good. For example, 5 or more or 10 or more genes from gene groups A to D may be measured, or 10% or more from each group (specifically, 1 gene or more since gene group D is 19 genes) 30% or more (5 genes or more in the case of gene group D), 50% or more, or 70% or more genes may be measured. From the viewpoint of comprehensive analysis, it is desirable to examine the expression levels of as many marker genes as possible, and it is desirable that the target marker genes include at least one gene of gene groups A to D. In addition to the above genes, the expression level of other genes that may be useful as carcinogenic promotion marker genes (for example, the genes described in Tables 4 and 5 below) may be further examined.
多数の遺伝子について発現量を調べる場合にはマイクロアレイを好ましく用いることができる。（１）〜（１９９）の遺伝子の全てが搭載されたマイクロアレイとしては、例えば下記実施例でも用いた市販のＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ４３０ ２．０アレイ（アフィメトリクス（株））が挙げられるが、これに限定されず、他の市販品を用いることができる。あるいは、上記の１９９遺伝子を含むアレイを適宜設計して用いても良い。なお、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ４３０ ２．０アレイに固定化されている上記（１）〜（１９９）の遺伝子に対するプローブの配列情報は、アフィメトリクス社のホームページから入手可能であり、当業者であれば下記表３に示すＩＤ番号（Ｐｒｏｂｅｓｅｔ ｎａｍｅ）で容易に特定し入手できる。配列表の配列番号２００〜４４０には、各ＩＤ番号で識別されているプローブ配列の具体例を示すが、これら具体例以外の各プローブ配列も当業者であれば容易に入手可能である。アレイ測定データの正規化（ｓｕｍｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）の手法は、用いるアレイに応じて適宜検討し、解析に最適な手法を選択して用いることができる。群間比較解析には、採用した正規化手法に適した手法を選択して用いることができる。例えば、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ４３０ ２．０アレイを用いて被検物質処理したＢｈａｓ４２細胞の遺伝子発現量を調べる場合には、下記実施例で用いた正規化手法等をそのまま用いることができる。 A microarray can be preferably used when the expression level of a large number of genes is examined. Examples of the microarray on which all of the genes of (1) to (199) are mounted include, for example, a commercially available Mouse Genome 430 2.0 array (Affymetrix Co., Ltd.) used in the following examples. Other commercially available products can be used. Alternatively, an array containing the above 199 gene may be appropriately designed and used. Probe sequence information for the genes (1) to (199) immobilized on the Mouse Genome 430 2.0 array is available from the Affymetrix website. It can be easily identified and obtained by the ID number (Probeset name) shown. Specific examples of probe sequences identified by each ID number are shown in SEQ ID NOs: 200 to 440 in the sequence listing, but probe sequences other than these specific examples can be easily obtained by those skilled in the art. The method of normalization (summation, normalization) of the array measurement data can be appropriately examined according to the array to be used, and an optimal method for analysis can be selected and used. For comparison analysis between groups, a method suitable for the employed normalization method can be selected and used. For example, when the gene expression level of Bhas42 cells treated with a test substance is examined using a Mouse Genome 430 2.0 array, the normalization method used in the following Examples can be used as it is.
被検物質処理群におけるマーカー遺伝子の発現量の相対変化を調べ、コントロール処理群に対し有意な変化（ＦＤＲ＜０．０１で、増大遺伝子の場合は２倍以上、減少遺伝子の場合は０．５倍以下）が確認できれば、発がんプロモーション活性が検出されたと判断される。複数のマーカー遺伝子を調べた場合、そのうちの１遺伝子だけでも有意な変化が確認できれば、その被検物質は発がんプロモーション活性を有すると判断でき、２以上の遺伝子で有意な変化が確認できればより確実性が増す。１９９遺伝子について発現量の相対変化を調べた場合であれば、１９９遺伝子全体との発現変化の一致率又は遺伝子群Ａ〜Ｄのうちのいずれか１群との一致率が例えば１０％程度以上、２０％程度以上、又は３０％程度以上であれば、検出結果の確実性がより高まる。例えば、下記実施例に記載されるＴＢＨＱの例では、増大１２６遺伝子のうちの２１遺伝子、減少７３遺伝子のうちの１９遺伝子で有意な変化が確認されており（後掲の表６及び表７参照）、１９９遺伝子全体との一致率が２０％（４０／１９９）、遺伝子群Ａとの一致率が３７％（３９／１０６）である。もっとも、本発明の範囲はこの具体例に限定されるものではない。 The relative change in the expression level of the marker gene in the test substance treatment group was examined, and a significant change relative to the control treatment group (FDR <0.01, more than twice for the increase gene, 0.5 for the decrease gene) If it can be confirmed, it is judged that carcinogenic promotion activity has been detected. When a plurality of marker genes are examined, if a significant change can be confirmed with only one of them, the test substance can be judged to have a carcinogenic promotion activity, and if a significant change can be confirmed with two or more genes, it is more reliable Increase. If the relative change of the expression level is examined for 199 gene, the coincidence rate of the expression change with the entire 199 gene or the coincidence rate with any one of the gene groups A to D is, for example, about 10% or more, If it is about 20% or more, or about 30% or more, the certainty of the detection result is further increased. For example, in the example of TBHQ described in the following examples, significant changes have been confirmed in 21 of the increased 126 genes and 19 of the decreased 73 genes (see Tables 6 and 7 below). ) The coincidence rate with the entire 199 gene is 20% (40/199), and the coincidence rate with the gene group A is 37% (39/106). However, the scope of the present invention is not limited to this specific example.
本発明の方法で発がんプロモーション活性が検出された場合、該物質は発がんプロモーション活性を有すると判断できる。ただし、本発明の方法で該活性が検出されない場合には、該物質は発がんプロモーション活性を有しないとは判断されず、該活性は不明と判断される。本発明の方法で発がんプロモーション活性が検出されなかった被検物質は、発がんプロモーション活性を有しない物質と、発がんプロモーション活性を有するがＢｈａｓ４２細胞形質転換試験が陰性である物質とのいずれかであり得る。本発明の方法で活性が検出されなかった被検物質については、別途異なる方法で発がんプロモーション活性を調べても良い。 When carcinogenic promotion activity is detected by the method of the present invention, it can be determined that the substance has carcinogenic promotion activity. However, when the activity is not detected by the method of the present invention, the substance is not judged to have no carcinogenic promotion activity, and the activity is judged to be unknown. The test substance for which carcinogenic promotion activity was not detected by the method of the present invention can be either a substance that does not have carcinogenic promotion activity or a substance that has carcinogenic promotion activity but a negative Bhas42 cell transformation test. . A test substance whose activity was not detected by the method of the present invention may be examined for carcinogenic promotion activity by a different method.
被検物質の発がんプロモーション活性が検出された場合には、さらに、該被検物質が発がんプロモーターとしてＴＰＡ、オカダ酸、リトコール酸、プロゲステロンのいずれに近いかを調べることもできる。被検物質で発現量が増大又は減少した遺伝子を、上記の遺伝子群Ａ〜Ｄと対比し、遺伝子の一致性を調べる。その一致性の度合いに基づいて、被検物質をＴＰＡ型（Ａ群）、オカダ酸型（Ｂ群）、リトコール酸型（Ｃ群）、プロゲステロン型（Ｄ群）のいずれかに分類することが可能である。Ａ〜Ｄの各群で遺伝子数は異なるので、一致性は、例えば各群の遺伝子の何％と一致したかによって評価することができる。特に限定されないが、いずれかの群との一致率が１０％程度以上、例えば２０％程度以上、又は３０％程度以上であれば、その群が表す型に分類できる。複数の群との一致率が高い場合には、その被検物質は複数の型に分類され得る。例えば、Ａ群及びＢ群との一致率が高い場合、その被検物質をＴＰＡ／オカダ酸型と分類してよい。下記実施例のＴＢＨＱの例では、Ａ群との一致率が３７％と非常に高く、ＴＢＨＱをＴＰＡ型に分類することができる。 When the carcinogenic promotion activity of the test substance is detected, it can be further examined whether the test substance is close to TPA, okadaic acid, lithocholic acid, or progesterone as a carcinogenic promoter. The gene whose expression level is increased or decreased in the test substance is compared with the above gene groups A to D, and the consistency of the genes is examined. Based on the degree of coincidence, the test substance may be classified into one of TPA type (Group A), okadaic acid type (Group B), lithocholic acid type (Group C), and progesterone type (Group D). Is possible. Since the number of genes is different in each of the groups A to D, the coincidence can be evaluated by, for example, what percentage of the genes in each group match. Although not particularly limited, if the coincidence rate with any group is about 10% or more, for example, about 20% or more, or about 30% or more, it can be classified into the type represented by that group. When the coincidence rate with a plurality of groups is high, the test substance can be classified into a plurality of types. For example, when the coincidence rate between the A group and the B group is high, the test substance may be classified as a TPA / okadaic acid type. In the example of TBHQ in the following example, the coincidence rate with Group A is as high as 37%, and TBHQ can be classified into TPA type.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１．ＤＮＡマイクロアレイによるｍＲＮＡ発現量測定
１）細胞試料液の調製
Ｂｈａｓ４２細胞は、実験ごとに新たに保存細胞株を解凍し、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＦ５Ｆ）で前培養を行ったものを用いた。同培地を用いてＢｈａｓ４２細胞の７ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞浮遊液を調製し、６ｗｅｌｌプレートに２ｍＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。細胞播種４日後に発がんプロモーター処理又はコントロールの溶媒処理を行なった。発がんプロモーターとして、既知の発がんプロモーターである１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、オカダ酸（ＯＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、プロゲステロン（ＰＲＯＧ）及び１７β−エストラジオール（ＥＤ）を用いた。各プロモーターについてＤＭＳＯ溶液を調製し（ＴＰＡは５μｇ／ｍＬ、ＯＡは６μｇ／ｍＬ、ＬＣＡは１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＲＯＧ及びＥＤは３μｍｏｌ／ｍＬ）、各ＤＭＳＯ溶液をＤＦ５Ｆに０．１％添加した培地で培地交換を行ない、発がんプロモーター処理群とした（培地中の終濃度は、ＴＰＡ；５ｎｇ／ｍＬ、ＯＡ；６ｎｇ／ｍＬ、ＬＣＡ；１０μｇ／ｍＬ、ＰＲＯＧ及びＥＤ；３ｎｍｏｌ／ｍＬ）。溶媒対照群については、ＤＭＳＯ（０．１％）を添加したＤＦ５Ｆで培地交換を行った。２４時間後に細胞観察とＲＮＡ抽出用細胞試料液の調製を行ない、試料液を−８０℃で保存した。各群の細胞試料液は、細胞解凍から完全繰り返し実験３回分（ｎ＝３）で調製した。1. Measurement of mRNA expression level by DNA microarray 1) Preparation of cell sample solution Bhas42 cells were previously thawed in DMEM / F12 medium (DF5F) supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS) after thawing a newly stored cell line for each experiment. What was cultured was used. Using the same medium, 7 × 10 3 cells / mL cell suspension of Bhas42 cells was prepared and seeded at 2 mL / well on 6-well plates. On day 4 after cell seeding, tumor promoter treatment or control solvent treatment was performed. As the tumor promoter, 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA), okadaic acid (OA), lithocholic acid (LCA), progesterone (PROG) and 17β-estradiol (ED) which are known carcinogenic promoters are used. Using. Prepare a DMSO solution for each promoter (TPA is 5 μg / mL, OA is 6 μg / mL, LCA is 10 mg / mL, PROG and ED are 3 μmol / mL), and each DMSO solution is added in 0.1% to DF5F. The medium was exchanged to obtain a carcinogenic promoter treatment group (final concentrations in the medium were TPA; 5 ng / mL, OA; 6 ng / mL, LCA; 10 μg / mL, PROG and ED; 3 nmol / mL). For the solvent control group, the medium was exchanged with DF5F supplemented with DMSO (0.1%). After 24 hours, cell observation and preparation of a cell sample solution for RNA extraction were performed, and the sample solution was stored at -80 ° C. The cell sample solution of each group was prepared in three repeated experiments (n = 3) from cell thawing.
また、各プロモーター物質について、公知のＢｈａｓ４２細胞形質転換試験（非特許文献２：Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２００４ ５５７（２）：１９１−２０２）および結果判定（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ２００５ ３３：６１９−６３９）を行なった。上記の通りにＢｈａｓ４２細胞を準備し、各プロモーター処理は播種後４日から１４日まで１０日間行なった。播種後７日、１１日に培地交換を行なった。播種後１４日でプロモーター物質を含まない新鮮な培地に交換し、播種後２１日まで培養後、細胞をメタノールで固定、ギムザ染色して形質転換細胞（フォーカス）をカウントした。その結果、ＴＰＡ、ＯＡ、ＬＣＡ、ＰＲＯＧはフォーカス形成頻度（ｆｏｃｉ／ｗｅｌｌ）が溶媒対照群に対して有意（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行い、片側 ｐ＜０．０５）かつ２倍以上に増大する濃度群が存在し、Ｂｈａｓ４２形質転換活性が陽性であった。ＥＤはフォーカス形成頻度（ｆｏｃｉ／ｗｅｌｌ）が溶媒対照群に対して有意に増大する濃度群も、２倍以上に増大する濃度群も存在しないため、Ｂｈａｓ４２形質転換活性は陰性であった。 Each promoter substance was subjected to a known Bhas42 cell transformation test (Non-patent Document 2: Mutation Research 2004 557 (2): 191-202) and result determination (Alternatives to Laboratory Animals 2005 33: 619-639). Bhas42 cells were prepared as described above, and each promoter treatment was performed for 10 days from 4 to 14 days after seeding. The medium was changed on the 7th and 11th days after seeding. On day 14 after seeding, the medium was replaced with a fresh medium not containing a promoter substance. After culturing until day 21 after seeding, the cells were fixed with methanol, stained with Giemsa, and transformed cells (focus) were counted. As a result, TPA, OA, LCA, and PROG had a concentration group in which the focus formation frequency (foci / well) was significantly higher than that of the solvent control group (Donett test, one side p <0.05) and increased more than twice. Present and positive for Bhas42 transformation activity. Since there was no concentration group in which the focus formation frequency (foci / well) significantly increased as compared with the solvent control group, and ED did not have a concentration group that increased more than twice, Bhas42 transformation activity was negative.
２）ＲＮＡ試料の抽出精製
凍結保存した細胞試料液を解凍し、クロロホルム分配およびイソプロパノール沈殿によりトータルＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、キアゲン社のプロトコールに従いトータルＲＮＡを精製した。得られたトータルＲＮＡ試料について、ＲＮＡ濃度測定およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザによりクオリティー評価を行った。2) Extraction and purification of RNA sample Thaw the cryopreserved cell sample solution, extract the total RNA by chloroform partition and isopropanol precipitation, and use RNeasy (registered trademark) Mini kit (QIAGEN) according to the protocol of Qiagen. RNA was purified. The obtained total RNA sample was subjected to RNA concentration measurement and quality evaluation using an Agilent 2100 bioanalyzer.
３）ＤＮＡマイクロアレイ分析用ＲＮＡ試料の調製および分析
精製後のトータルＲＮＡについて、３’ＩＶＴ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（アフィメトリクス（株））を用いて、ｃＤＮＡに逆転写後、ラベル化ａＲＮＡを調製し、精製した後、フラグメンテーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ，ａｎｄ ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（アフィメトリクス（株））の試薬と混合し、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０アレイ（アフィメトリクス（株））に注入後、４５℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。3) Preparation and analysis of RNA sample for DNA microarray analysis After purification, total RNA after purification was reverse-transcribed to cDNA using 3'IVT Express Kit (Affymetrix Co., Ltd.), and labeled aRNA was prepared and purified. Fragmentation was performed. The mixture was mixed with a reagent of GeneChip Hybridization, Wash, and stain Kit (Affymetrix Co., Ltd.) and injected into the Mouse Genome 430 2.0 array (Affymetrix Co., Ltd.), followed by hybridization at 45 ° C. for 16 hours.
ハイブリダイゼーションの終了後、アレイの中の溶液を除去し、同キットを用いてＦｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（アフィメトリクス（株））で洗浄および染色後、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００（アフィメトリクス（株））を用いてマイクロアレイ分析を行った。 After completion of hybridization, the solution in the array was removed, washed and stained with Fluidics Station 450 (Affymetrix) using the same kit, and then microarray analysis using Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix). Went.
２．マイクロアレイ測定結果の解析およびマーカー遺伝の選出
ＤＮＡマイクロアレイ分析により得られたデータ（ＣＥＬデータ）に対し、はじめに採用する正規化（ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）手法の検討を行った。ＤＦＷ、ＭＡＳ５、ＲＭＡおよびｑＦＡＲＭＳによる正規化を、「Ｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）により実行し、階層的クラスター解析を行った。その結果、既知発がんプロモーター処理群と溶媒対照群との間で異なるクラスターを形成する正規化手法としてｑＦＡＲＭＳを選択した。2. Analysis of microarray measurement results and selection of marker inheritance For the data (CEL data) obtained by DNA microarray analysis, the normalization (summarization, normalization) method adopted first was examined. Normalization by DFW, MAS5, RMA and qFARMS was performed with “R” (http://www.r-project.org/) to perform hierarchical cluster analysis. As a result, qFARMS was selected as a normalization method for forming different clusters between the known tumor promoter treatment group and the solvent control group.
続いて、ｑＦＡＲＭＳにより正規化したデータに対し、統計法としてＲａｎｋ ｐｒｏｄｕｃｔｓを実行し、解析結果をＥｘｃｅｌファイルに変換した。 Subsequently, Rank products were executed as a statistical method on the data normalized by qFARMS, and the analysis result was converted into an Excel file.
５種の各既知発がんプロモーター処理により有意に発現変動したＧｅｎｅ（遺伝子）を抽出するために、Ｒａｎｋ ｐｒｏｄｕｃｔｓ実行により得られたデータのＦａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）をオートフィルターにより昇順に並べなおし、０．０５未満のｐｒｏｂｅ ｓｅｔｓ（プローブセット）を抽出した。一部の遺伝子については一つの遺伝子が複数のプローブセットによりコードされる場合があることから、抽出されたプローブセットについて、Ｇｅｎｅ Ｔｉｔｌｅ（遺伝子名）または、Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ（遺伝子略名）の重複を削除し、溶媒対照群に対して既知発がんプロモーター処理群で有意にｍＲＮＡ量が増大または減少した遺伝子名を抽出した（増大：１６６８遺伝子、減少：１２３８遺伝子）。これらの遺伝子を下記表４及び表５に示す。 In order to extract Genes (genes) whose expression was significantly changed by treatment with each of the five known carcinogenic promoters, the False Discovery Rate (FDR) of the data obtained by the execution of Rank products was rearranged in ascending order by an autofilter. Less than 05 probe sets were extracted. For some genes, a single gene may be encoded by multiple probe sets. Remove duplicates of Gene Title (gene name) or Gene Symbol (gene abbreviation) for the extracted probe set. Then, gene names in which the mRNA amount was significantly increased or decreased in the known tumor promoter treatment group with respect to the solvent control group were extracted (increase: 1668 genes, decrease: 1238 genes). These genes are shown in Tables 4 and 5 below.
それらの有意に増大または減少した遺伝子から、さらに、有意性の高い遺伝子を選出する目的で、増大または減少のそれぞれについて、ＦＤＲ０．０１未満のプローブセットを抽出した。それらのプローブセットについて、ＭＡＳ５の正規化データにおいて、発がんプロモーター処理群でシグナル強度比が２倍以上に増大し、シグナル強度が３００以上のプローブセットを抽出した。続いて、遺伝子名または遺伝子略名の重複を削除することにより、増大遺伝子（１２６遺伝子）を選出した（上掲の表１）。同様に有意（ＦＤＲ０．０１未満）に減少したプローブセットについて、シグナル強度比が発がんプロモーター処理群において０．５倍 From these significantly increased or decreased genes, a probe set having an FDR of less than 0.01 was extracted for each increase or decrease in order to further select highly significant genes. For those probe sets, in the normalized data of MAS5, a probe set having a signal intensity ratio increased more than twice in the tumor promoter treatment group and a signal intensity of 300 or more was extracted. Subsequently, increased genes (126 genes) were selected by deleting duplicate gene names or gene abbreviations (Table 1 above). Similarly, for the probe set significantly decreased (less than FDR 0.01), the signal intensity ratio is 0.5 times in the tumor promoter treatment group
以下に減少し、溶媒対照群のシグナル強度が３００以上のプローブセットを抽出した。遺伝子名または遺伝子略名の重複を削除することにより、減少遺伝子（７３遺伝子）を選出した（上掲の表２）。A probe set having a signal intensity of 300 or more in the solvent control group was extracted. Reduced genes (73 genes) were selected by deleting duplicate gene names or gene abbreviations (Table 2 above).
３．選出したマーカー遺伝子による被検物質の発がんプロモーション活性の判定と分類
ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）は、上記したＢｈａｓ４２細胞形質転換試験により強い陽性反応が得られた化学物質である。上記と同様の手順で、ＴＢＨＱ処理後２４時間のＢｈａｓ４２細胞からｍＲＮＡ試料を調製し、マイクロアレイ解析を行ない、ＦＤＲ０．０１未満で且つシグナル強度が２倍以上又は０．５倍以下に変化した遺伝子を調べた。変化が認められた遺伝子について、上記で選出した１９９遺伝子（増大１２６遺伝子、減少７３遺伝子）との一致性を調べた。その結果を下記表６及び表７に示す。3. Determination and classification of carcinogenic promotion activity of test substance by selected marker gene Tert-butylhydroquinone (TBHQ) is a chemical substance that has obtained a strong positive reaction by the Bhas42 cell transformation test described above. In the same procedure as above, mRNA samples were prepared from Bhas42 cells 24 hours after TBHQ treatment, microarray analysis was conducted, Examined. About the gene by which the change was recognized, the coincidence with the 199 gene selected above (an increase 126 gene, a decrease 73 gene) was investigated. The results are shown in Tables 6 and 7 below.
ＴＢＨＱ処理したＢｈａｓ４２細胞で発現量が変化した遺伝子の一致性は、ＴＰＡとの間で非常に高かった。Ｂｈａｓ４２形質転換活性陰性であるＥＤとの間では、一致する遺伝子は見出されなかった。ＴＢＨＱは発がんプロモーション活性を有し、その活性はＴＰＡ型と判定することができた。 The consistency of the gene whose expression level was changed in TBhaQ-treated Bhas42 cells was very high with TPA. No matching gene was found with ED that was negative for Bhas42 transformation activity. TBHQ has carcinogenic promotion activity, and its activity could be determined as TPA type.
Claims (6)
遺伝子群A:
(2)(6)(9)(12)(18)(19)(20)(22)(25)(27)(28)(32)(34)(41)(56)(57)(59)(60)(62)(63)(65)(66)(70)(73)(74)(75)(76)(77)(78)(80)(82)(86)(87)(89)(90)(93)(94)(99)(103)(105)(107)(111)(113)(114)(117)(123)(127)(128)(130)(131)(133)(134)(135)(136)(137)(138)(139)(140)(141)(142)(143)(146)(147)(149)(150)(151)(152)(154)(155)(156)(157)(158)(159)(160)(161)(164)(165)(166)(167)(168)(169)(171)(172)(173)(175)(176)(177)(178)(179)(180)(181)(182)(183)(184)(186)(187)(188)(189)(191)(193)(195)(196)(197)(199)
遺伝子群B:
(11)(16)(29)(37)(46)(47)(50)(54)(55)(58)(64)(67)(68)(69)(71)(72)(83)(85)(91)(95)(96)(101)(102)(104)(109)(110)(115)(116)(122)(125)(129)(132)(145)(151)(162)(163)(170)(184)(185)(192)(194)(198)
遺伝子群C:
(1)(3)(4)(5)(8)(10)(13)(14)(15)(17)(21)(23)(26)(30)(31)(33)(35)(36)(40)(42)(44)(45)(48)(49)(51)(52)(53)(64)(71)(79)(88)(92)(97)(100)(106)(107)(108)(112)(119)(120)(121)(124)(126)(190)(192)
遺伝子群D:
(7)(21)(24)(33)(38)(43)(84)(98)(118)(133)(144)(145)(148)(153)(156)(157)(174)(192)
ここで、前記遺伝子はそれぞれ下記の通りである。
(1) 1100001G20Rik（配列番号1）
(2) 2310002L13Rik（配列番号2）
(3) 2410066E13Rik（配列番号3）
(4) 5430417L22Rik（配列番号4）
(5) 6430527G18Rik（配列番号5）
(6) Aen（配列番号6）
(7) Aldh1a7（配列番号7）
(8) Apcdd1（配列番号8）
(9) Aspm（配列番号9）
(10) Atp2a2（配列番号10）
(11) AW112010（配列番号11）
(12) Bcat1（配列番号12）
(13) C3（配列番号13）
(14) Car5b（配列番号14）
(15) Cbs（配列番号15）
(16) Ccl11（配列番号16）
(17) Ccl9（配列番号17）
(18) Ccne2（配列番号18）
(19) Ccrn4l /// LOC100047134（配列番号19）
(20) Cdc6（配列番号20）
(21) Cebpd（配列番号21）
(22) Ces1（配列番号22）
(23) Cib2（配列番号23）
(24) Cp（配列番号24）
(25) Ctps（配列番号25）
(26) Cyr61（配列番号26）
(27) Dkc1（配列番号27）
(28) Dtl（配列番号28）
(29) Emilin1（配列番号29）
(30) Enpp3（配列番号30）
(31) Ephb2（配列番号31）
(32) Eps8 /// LOC632638（配列番号32）
(33) Errfi1（配列番号33）
(34) Exo1（配列番号34）
(35) Fam171a2（配列番号35）
(36) Fam43a（配列番号36）
(37) Fbn1（配列番号37）
(38) Fkbp5（配列番号38）
(40) Foxf1a（配列番号40）
(41) Foxm1（配列番号41）
(42) Galntl2（配列番号42）
(43) Gdpd2（配列番号43）
(44) Gdpd5（配列番号44）
(45) Gfod1（配列番号45）
(46) Gla（配列番号46）
(47) Glb1（配列番号47）
(48) Gm10638（配列番号48）
(49) Gm11428（配列番号49）
(50) Gm14446（配列番号50）
(51) Gm22（配列番号51）
(52) Gpr133（配列番号52）
(53) Grk5（配列番号53）
(54) Gsta1 /// Gsta2（配列番号54）
(55) Herc5（配列番号55）
(56) Hirip3（配列番号56）
(57) Hmga2（配列番号57）
(58) Ifi205 /// Mnda（配列番号58）
(59) Ifrd2（配列番号59）
(60) Il13ra1（配列番号60）
(62) Ivns1abp（配列番号62）
(63) Kif20b（配列番号63）
(64) Lgals2（配列番号64）
(65) LOC100045677 /// Mcm3（配列番号65）
(66) Ltbp1（配列番号66）
(67) Lum（配列番号67）
(68) Ly6e（配列番号68）
(69) Masp1（配列番号69）
(70) Matr3（配列番号70）
(71) Mmp13（配列番号71）
(72) Mpeg1（配列番号72）
(73) Mthfd1（配列番号73）
(74) Mtm1（配列番号74）
(75) Myc（配列番号75）
(76) Nolc1（配列番号76）
(77) Nop16（配列番号77）
(78) Nop56（配列番号78）
(79) Nr2f2（配列番号79）
(80) Nsl1（配列番号80）
(82) Pdss1（配列番号82）
(83) Peg3（配列番号83）
(84) Per1（配列番号84）
(85) Plekhg4（配列番号85）
(86) Pnn（配列番号86）
(87) Polr1b（配列番号87）
(88) Prelp（配列番号88）
(89) Prkg2（配列番号89）
(90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4（配列番号90）
(91) Ptgfr（配列番号91）
(92) Ptprf（配列番号92）
(93) Rrm2（配列番号93）
(94) Rrp12（配列番号94）
(95) Rsad2（配列番号95）
(96) S100b（配列番号96）
(97) S1pr3（配列番号97）
(98) Sema3g（配列番号98）
(99) Shmt2（配列番号99）
(100) Slc7a3（配列番号100）
(101) Slfn2（配列番号101）
(102) Slfn4（配列番号102）
(103) Smc2（配列番号103）
(104) Spon2（配列番号104）
(105) Srm（配列番号105）
(106) St3gal5（配列番号106）
(107) Steap1（配列番号107）
(108) Tbc1d4（配列番号108）
(109) Timp4（配列番号109）
(110) Tjp2（配列番号110）
(111) Tk1（配列番号111）
(112) Tmem41a（配列番号112）
(113) Tmem97（配列番号113）
(114) Tnfrsf12a（配列番号114）
(115) Tnfsf10（配列番号115）
(116) Trim25（配列番号116）
(117) Trp53（配列番号117）
(118) Tsc22d3（配列番号118）
(119) Tspan2（配列番号119）
(120) Ttc7b（配列番号120）
(121) Ttll1（配列番号121）
(122) Ttyh2（配列番号122）
(123) Ung（配列番号123）
(124) Vdr（配列番号124）
(125) Wwp2（配列番号125）
(126) Zc3h8（配列番号126）
(127) Adamts4（配列番号127）
(128) Agt（配列番号128）
(129) Ankrd1（配列番号129）
(130) Apod（配列番号130）
(131) Aspn（配列番号131）
(132) Atrx（配列番号132）
(133) AU015680（配列番号133）
(134) Bdh2（配列番号134）
(135) Boc（配列番号135）
(136) Btg2（配列番号136）
(137) Calml4（配列番号137）
(138) Cbr2（配列番号138）
(139) Cd1d1（配列番号139）
(140) Clu /// LOC100046120（配列番号140）
(141) Col27a1（配列番号141）
(142) Col3a1（配列番号142）
(143) Crlf1（配列番号143）
(144) Cxcl5（配列番号144）
(145) Cyr61（配列番号145）
(146) D0H4S114（配列番号146）
(147) D530037H12Rik（配列番号147）
(148) Dbp（配列番号148）
(149) Dcn（配列番号149）
(150) Dhrs3（配列番号150）
(151) Dleu2（配列番号151）
(152) Dusp1（配列番号152）
(153) Dusp5（配列番号153）
(154) Ebf1（配列番号154）
(155) Egr1（配列番号155）
(156) Egr2（配列番号156）
(157) Egr3（配列番号157）
(158) Enpp2（配列番号158）
(159) Fbxo32（配列番号159）
(160) Fmod（配列番号160）
(161) Fos（配列番号161）
(162) Gpc6（配列番号162）
(163) Hist1h1c（配列番号163）
(164) Ier2（配列番号164）
(165) Jhdm1d（配列番号165）
(166) Kdm6b（配列番号166）
(167) Lgals7（配列番号167）
(168) Lipa（配列番号168）
(169) LOC100047324 /// Sesn1（配列番号169）
(170) LOC640441 /// Thbs1（配列番号170）
(171) Matn2（配列番号171）
(172) Mmp14（配列番号172）
(173) Nr4a1（配列番号173）
(174) Per3（配列番号174）
(175) Pik3ip1（配列番号175）
(176) Plac8（配列番号176）
(177) Postn（配列番号177）
(178) Ppargc1a（配列番号178）
(179) Prelp（配列番号179）
(180) Prokr1（配列番号180）
(181) Ptgfr（配列番号181）
(182) Ptn（配列番号182）
(183) Ptplb（配列番号183）
(184) Rbms3（配列番号184）
(185) Rhobtb3（配列番号185）
(186) Scn2a1（配列番号186）
(187) Sesn3（配列番号187）
(188) Slc9a3r2（配列番号188）
(189) Sned1（配列番号189）
(190) Sorbs2（配列番号190）
(191) Sox4（配列番号191）
(192) Tpm1（配列番号192）
(193) Trp53inp2（配列番号193）
(194) Tsc22d2（配列番号194）
(195) Wbscr27（配列番号195）
(196) Ypel1（配列番号196）
(197) Ypel2（配列番号197）
(198) Zbed6（配列番号198）
(199) Zfp36（配列番号199） In Bhas42 cells treated with a test substance, a method for detecting the carcinogenic promotion activity of the test substance, using as an index the change in the expression level of a gene selected from at least one of the following gene groups A to D: , (1)-(38), (40)-(60), (62)-(80), (82)-(126) are genes whose tumor promotion activity is detected when expression is increased. And the gene of (127) to (199) is a gene whose oncogenic promotion activity is detected when expression is decreased.
Gene group A:
(2) (6) (9) (12) (18) (19) (20) (22) (25) (27) (28) (32) (34) (41) (56) (57) (59 ) (60) (62) (63) (65) (66) (70) (73) (74) (75) (76) (77) (78) (80) (82) (86) (87) ( 89) (90) (93) (94) (99) (103) (105) (107) (111) (113) (114) (117) (123) (127) (128) (130) (131) (133) (134) (135) (136) (137) (138) (139) (140) (141) (142) (143) (146) (147) (149) (150) (151) (152 ) (154) (155) (156) (157) (158) (159) (160) (161) (164) (165) (166) (167) (168) (169) (171) (172) ( 173) (175) (176) (177) (178) (179) (180) (181) (182) (183) (184) (186) (187) (188) (189) (191) (193) (195) (196) (197) (199)
Gene group B:
(11) (16) (29) (37) (46) (47) (50) (54) (55) (58) (64) (67) (68) (69) (71) (72) (83 ) (85) (91) (95) (96) (101) (102) (104) (109) (110) (115) (116) (122) (125) (129) (132) (145) ( 151) (162) (163) (170) (184) (185) (192) (194) (198)
Gene group C:
(1) (3) (4) (5) (8) (10) (13) (14) (15) (17) (21) (23) (26) (30) (31) (33) (35 ) (36) (40) (42) (44) (45) (48) (49) (51) (52) (53) (64) (71) (79) (88) (92) (97) ( 100) (106) (107) (108) (112) (119) (120) (121) (124) (126) (190) (192)
Gene group D:
(7) (21) (24) (33) (38) (43) (84) (98) (118) (133) (144) (145) (148) (153) (156) (157) (174 ) (192)
Here, the genes are as follows.
(1) 1100001G20Rik (SEQ ID NO: 1)
(2) 2310002L13Rik (SEQ ID NO: 2)
(3) 2410066E13Rik (SEQ ID NO: 3)
(4) 5430417L22Rik (SEQ ID NO: 4)
(5) 6430527G18Rik (SEQ ID NO: 5)
(6) Aen (SEQ ID NO: 6)
(7) Aldh1a7 (SEQ ID NO: 7)
(8) Apcdd1 (SEQ ID NO: 8)
(9) Aspm (SEQ ID NO: 9)
(10) Atp2a2 (SEQ ID NO: 10)
(11) AW112010 (SEQ ID NO: 11)
(12) Bcat1 (SEQ ID NO: 12)
(13) C3 (SEQ ID NO: 13)
(14) Car5b (SEQ ID NO: 14)
(15) Cbs (SEQ ID NO: 15)
(16) Ccl11 (SEQ ID NO: 16)
(17) Ccl9 (SEQ ID NO: 17)
(18) Ccne2 (SEQ ID NO: 18)
(19) Ccrn4l /// LOC100047134 (SEQ ID NO: 19)
(20) Cdc6 (SEQ ID NO: 20)
(21) Cebpd (SEQ ID NO: 21)
(22) Ces1 (SEQ ID NO: 22)
(23) Cib2 (SEQ ID NO: 23)
(24) Cp (SEQ ID NO: 24)
(25) Ctps (SEQ ID NO: 25)
(26) Cyr61 (SEQ ID NO: 26)
(27) Dkc1 (SEQ ID NO: 27)
(28) Dtl (SEQ ID NO: 28)
(29) Emilin1 (SEQ ID NO: 29)
(30) Enpp3 (SEQ ID NO: 30)
(31) Ephb2 (SEQ ID NO: 31)
(32) Eps8 /// LOC632638 (sequence number 32)
(33) Errfi1 (SEQ ID NO: 33)
(34) Exo1 (SEQ ID NO: 34)
(35) Fam171a2 (SEQ ID NO: 35)
(36) Fam43a (SEQ ID NO: 36)
(37) Fbn1 (SEQ ID NO: 37)
(38) Fkbp5 (SEQ ID NO: 38)
(40) Foxf1a (SEQ ID NO: 40)
(41) Foxm1 (SEQ ID NO: 41)
(42) Galntl2 (SEQ ID NO: 42)
(43) Gdpd2 (SEQ ID NO: 43)
(44) Gdpd5 (SEQ ID NO: 44)
(45) Gfod1 (SEQ ID NO: 45)
(46) Gla (SEQ ID NO: 46)
(47) Glb1 (SEQ ID NO: 47)
(48) Gm10638 (SEQ ID NO: 48)
(49) Gm11428 (SEQ ID NO: 49)
(50) Gm14446 (SEQ ID NO: 50)
(51) Gm22 (SEQ ID NO: 51)
(52) Gpr133 (SEQ ID NO: 52)
(53) Grk5 (SEQ ID NO: 53)
(54) Gsta1 /// Gsta2 (sequence number 54)
(55) Herc5 (SEQ ID NO: 55)
(56) Hirip3 (SEQ ID NO: 56)
(57) Hmga2 (SEQ ID NO: 57)
(58) Ifi205 /// Mnda (SEQ ID NO: 58)
(59) Ifrd2 (SEQ ID NO: 59)
(60) Il13ra1 (SEQ ID NO: 60)
(62) Ivns1abp (SEQ ID NO: 62)
(63) Kif20b (SEQ ID NO: 63)
(64) Lgals2 (SEQ ID NO: 64)
(65) LOC100045677 /// Mcm3 (sequence number 65)
(66) Ltbp1 (SEQ ID NO: 66)
(67) Lum (SEQ ID NO: 67)
(68) Ly6e (SEQ ID NO: 68)
(69) Masp1 (SEQ ID NO: 69)
(70) Matr3 (SEQ ID NO: 70)
(71) Mmp13 (SEQ ID NO: 71)
(72) Mpeg1 (SEQ ID NO: 72)
(73) Mthfd1 (SEQ ID NO: 73)
(74) Mtm1 (SEQ ID NO: 74)
(75) Myc (SEQ ID NO: 75)
(76) Nolc1 (SEQ ID NO: 76)
(77) Nop16 (SEQ ID NO: 77)
(78) Nop56 (SEQ ID NO: 78)
(79) Nr2f2 (SEQ ID NO: 79)
(80) Nsl1 (SEQ ID NO: 80)
(82) Pdss1 (SEQ ID NO: 82)
(83) Peg3 (SEQ ID NO: 83)
(84) Per1 (SEQ ID NO: 84)
(85) Plekhg4 (SEQ ID NO: 85)
(86) Pnn (SEQ ID NO: 86)
(87) Polr1b (SEQ ID NO: 87)
(88) Prelp (SEQ ID NO: 88)
(89) Prkg2 (SEQ ID NO: 89)
(90) Prl2c2 /// Prl2c3 /// Prl2c4 (sequence number 90)
(91) Ptgfr (SEQ ID NO: 91)
(92) Ptprf (SEQ ID NO: 92)
(93) Rrm2 (SEQ ID NO: 93)
(94) Rrp12 (SEQ ID NO: 94)
(95) Rsad2 (SEQ ID NO: 95)
(96) S100b (SEQ ID NO: 96)
(97) S1pr3 (SEQ ID NO: 97)
(98) Sema3g (SEQ ID NO: 98)
(99) Shmt2 (SEQ ID NO: 99)
(100) Slc7a3 (SEQ ID NO: 100)
(101) Slfn2 (SEQ ID NO: 101)
(102) Slfn4 (SEQ ID NO: 102)
(103) Smc2 (SEQ ID NO: 103)
(104) Spon2 (SEQ ID NO: 104)
(105) Srm (SEQ ID NO: 105)
(106) St3gal5 (SEQ ID NO: 106)
(107) Steap1 (SEQ ID NO: 107)
(108) Tbc1d4 (SEQ ID NO: 108)
(109) Timp4 (SEQ ID NO: 109)
(110) Tjp2 (SEQ ID NO: 110)
(111) Tk1 (SEQ ID NO: 111)
(112) Tmem41a (SEQ ID NO: 112)
(113) Tmem97 (SEQ ID NO: 113)
(114) Tnfrsf12a (SEQ ID NO: 114)
(115) Tnfsf10 (SEQ ID NO: 115)
(116) Trim25 (SEQ ID NO: 116)
(117) Trp53 (SEQ ID NO: 117)
(118) Tsc22d3 (SEQ ID NO: 118)
(119) Tspan2 (SEQ ID NO: 119)
(120) Ttc7b (SEQ ID NO: 120)
(121) Ttll1 (SEQ ID NO: 121)
(122) Ttyh2 (SEQ ID NO: 122)
(123) Ung (SEQ ID NO: 123)
(124) Vdr (SEQ ID NO: 124)
(125) Wwp2 (SEQ ID NO: 125)
(126) Zc3h8 (SEQ ID NO: 126)
(127) Adamts4 (SEQ ID NO: 127)
(128) Agt (SEQ ID NO: 128)
(129) Ankrd1 (SEQ ID NO: 129)
(130) Apod (SEQ ID NO: 130)
(131) Aspn (SEQ ID NO: 131)
(132) Atrx (SEQ ID NO: 132)
(133) AU015680 (SEQ ID NO: 133)
(134) Bdh2 (SEQ ID NO: 134)
(135) Boc (SEQ ID NO: 135)
(136) Btg2 (SEQ ID NO: 136)
(137) Calml4 (SEQ ID NO: 137)
(138) Cbr2 (SEQ ID NO: 138)
(139) Cd1d1 (SEQ ID NO: 139)
(140) Clu /// LOC100046120 (SEQ ID NO: 140)
(141) Col27a1 (SEQ ID NO: 141)
(142) Col3a1 (SEQ ID NO: 142)
(143) Crlf1 (SEQ ID NO: 143)
(144) Cxcl5 (SEQ ID NO: 144)
(145) Cyr61 (SEQ ID NO: 145)
(146) D0H4S114 (SEQ ID NO: 146)
(147) D530037H12Rik (SEQ ID NO: 147)
(148) Dbp (SEQ ID NO: 148)
(149) Dcn (SEQ ID NO: 149)
(150) Dhrs3 (SEQ ID NO: 150)
(151) Dleu2 (SEQ ID NO: 151)
(152) Dusp1 (SEQ ID NO: 152)
(153) Dusp5 (SEQ ID NO: 153)
(154) Ebf1 (SEQ ID NO: 154)
(155) Egr1 (SEQ ID NO: 155)
(156) Egr2 (SEQ ID NO: 156)
(157) Egr3 (SEQ ID NO: 157)
(158) Enpp2 (SEQ ID NO: 158)
(159) Fbxo32 (SEQ ID NO: 159)
(160) Fmod (SEQ ID NO: 160)
(161) Fos (SEQ ID NO: 161)
(162) Gpc6 (SEQ ID NO: 162)
(163) Hist1h1c (SEQ ID NO: 163)
(164) Ier2 (SEQ ID NO: 164)
(165) Jhdm1d (SEQ ID NO: 165)
(166) Kdm6b (SEQ ID NO: 166)
(167) Lgals7 (SEQ ID NO: 167)
(168) Lipa (SEQ ID NO: 168)
(169) LOC100047324 /// Sesn1 (sequence number 169)
(170) LOC640441 /// Thbs1 (sequence number 170)
(171) Matn2 (SEQ ID NO: 171)
(172) Mmp14 (SEQ ID NO: 172)
(173) Nr4a1 (SEQ ID NO: 173)
(174) Per3 (SEQ ID NO: 174)
(175) Pik3ip1 (SEQ ID NO: 175)
(176) Plac8 (SEQ ID NO: 176)
(177) Postn (SEQ ID NO: 177)
(178) Ppargc1a (SEQ ID NO: 178)
(179) Prelp (SEQ ID NO: 179)
(180) Prokr1 (SEQ ID NO: 180)
(181) Ptgfr (SEQ ID NO: 181)
(182) Ptn (SEQ ID NO: 182)
(183) Ptplb (SEQ ID NO: 183)
(184) Rbms3 (SEQ ID NO: 184)
(185) Rhobtb3 (SEQ ID NO: 185)
(186) Scn2a1 (SEQ ID NO: 186)
(187) Sesn3 (SEQ ID NO: 187)
(188) Slc9a3r2 (SEQ ID NO: 188)
(189) Sned1 (SEQ ID NO: 189)
(190) Sorbs2 (SEQ ID NO: 190)
(191) Sox4 (SEQ ID NO: 191)
(192) Tpm1 (SEQ ID NO: 192)
(193) Trp53inp2 (SEQ ID NO: 193)
(194) Tsc22d2 (SEQ ID NO: 194)
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