JP5861048B1 - Detection of colorectal cancer by gene expression analysis - Google Patents
Detection of colorectal cancer by gene expression analysis Download PDFInfo
- Publication number
- JP5861048B1 JP5861048B1 JP2014265856A JP2014265856A JP5861048B1 JP 5861048 B1 JP5861048 B1 JP 5861048B1 JP 2014265856 A JP2014265856 A JP 2014265856A JP 2014265856 A JP2014265856 A JP 2014265856A JP 5861048 B1 JP5861048 B1 JP 5861048B1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- colorectal cancer
- genes
- protein
- gene set
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 118
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 108
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 106
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 14
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 203
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 45
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 29
- 102100022616 COMM domain-containing protein 8 Human genes 0.000 claims description 18
- 102100037815 Fas apoptotic inhibitory molecule 3 Human genes 0.000 claims description 18
- 101710190642 Fas apoptotic inhibitory molecule 3 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000899986 Homo sapiens COMM domain-containing protein 8 Proteins 0.000 claims description 18
- 101000666450 Homo sapiens XK-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100040406 Lysophosphatidic acid receptor 6 Human genes 0.000 claims description 18
- 101710149751 Lysophosphatidic acid receptor 6 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100038350 XK-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 11
- 102100030390 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100029830 28S ribosomal protein S28, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 10
- 102100032500 40S ribosomal protein S27-like Human genes 0.000 claims description 10
- 102100028550 40S ribosomal protein S4, Y isoform 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100036464 Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100024394 Adipocyte enhancer-binding protein 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710105604 Adipocyte enhancer-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004145 Annexin A1 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004276 BCL2-related protein A1 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000879 BCL2-related protein A1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100028672 C-type lectin domain family 4 member D Human genes 0.000 claims description 10
- 102100038125 Centromere protein Q Human genes 0.000 claims description 10
- 101710084070 Centromere protein Q Proteins 0.000 claims description 10
- 102100038122 Centromere protein R Human genes 0.000 claims description 10
- 102100027828 DNA repair protein XRCC4 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100035427 Forkhead box protein O1 Human genes 0.000 claims description 10
- 101000583063 Homo sapiens 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000727483 Homo sapiens 28S ribosomal protein S28, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 10
- 101000731896 Homo sapiens 40S ribosomal protein S27-like Proteins 0.000 claims description 10
- 101000696103 Homo sapiens 40S ribosomal protein S4, Y isoform 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000713904 Homo sapiens Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000766905 Homo sapiens C-type lectin domain family 4 member D Proteins 0.000 claims description 10
- 101000884559 Homo sapiens Centromere protein R Proteins 0.000 claims description 10
- 101000649315 Homo sapiens DNA repair protein XRCC4 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000877727 Homo sapiens Forkhead box protein O1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101001076642 Homo sapiens Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000711369 Homo sapiens Probable ribosome biogenesis protein RLP24 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000995300 Homo sapiens Protein NDRG2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101001067960 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 37 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000796020 Homo sapiens Putative gamma-taxilin 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000618118 Homo sapiens Speriolin-like protein Proteins 0.000 claims description 10
- 101000641015 Homo sapiens Sterile alpha motif domain-containing protein 9 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100025891 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100034040 Probable ribosome biogenesis protein RLP24 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100034436 Protein NDRG2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710156987 Protein S100-A8 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100034474 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 37 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100031345 Putative gamma-taxilin 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100021035 Regulator of G-protein signaling 18 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710148110 Regulator of G-protein signaling 18 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100021914 Speriolin-like protein Human genes 0.000 claims description 10
- 102100034291 Sterile alpha motif domain-containing protein 9 Human genes 0.000 claims description 10
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims description 10
- 102100023562 Zinc finger protein 584 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710143333 Zinc finger protein 584 Proteins 0.000 claims description 10
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000237 interleukin-24 Proteins 0.000 claims description 10
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 102100038108 Arylamine N-acetyltransferase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100035915 D site-binding protein Human genes 0.000 claims description 5
- 101000884385 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000873522 Homo sapiens D site-binding protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101000965929 Homo sapiens Ragulator complex protein LAMTOR3 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100040885 Ragulator complex protein LAMTOR3 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 101150076211 TH gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 10
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 10
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003196 serial analysis of gene expression Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101000856500 Bacillus subtilis subsp. natto Glutathione hydrolase proenzyme Proteins 0.000 description 1
- OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N Cy3-bifunctional dye zwitterion Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035487 diastolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000035488 systolic blood pressure Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】大腸癌に関連して発現が変動する遺伝子を解析して、大腸癌を検出する方法並びに検出試薬の提供。【解決手段】特定の２０個の遺伝子セットの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む大腸癌を検出するための試薬、並びに特定の２０個の遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて大腸癌を検出する方法。【選択図】なしA method and a detection reagent for detecting colorectal cancer by analyzing a gene whose expression varies in relation to colorectal cancer. A reagent for detecting colorectal cancer comprising a nucleotide comprising the nucleotide sequence of a specific 20 gene set or a nucleotide comprising a partial sequence thereof, as well as measuring the expression level of the specific 20 genes, A method for detecting colorectal cancer based on the expression level. [Selection figure] None
Description
本発明は、末梢血液を材料とし遺伝子発現解析を利用した大腸癌の検出に関する。 The present invention relates to detection of colorectal cancer using gene expression analysis using peripheral blood as a material.
大腸癌は日本人で部位別のがん死亡数（男女計）順位が3番目の消化器系悪性腫瘍であり、厚生労働省調べでは年間4万1千人の患者が死亡する。早期発見し治療を行えば完治しうるが、早期病変であるほど臨床症状を呈さず、進行した状態で発見され予後不良の転帰をとる症例も認められる。早期発見の契機として、検診の際の内視鏡・画像検査にて偶然に発見される場合や、癌とは直接的に関連しない症状を精査する過程で発見される場合も多く、現在のところ、大腸癌の早期発見に有用な特異性の高い血液診断マーカーは存在しない。大腸癌の存在を出来るだけ早い段階で診断できるシステムを確立することは極めて重要である。 Colorectal cancer is the third gastrointestinal malignant tumor in Japan, ranked by number of cancer deaths (gender total) by region. According to a survey by the Ministry of Health, Labor and Welfare, 41,000 patients die each year. It can be completely cured if it is detected early and treated, but there are cases where early lesions do not show clinical symptoms and are found in an advanced state and have a poor prognosis outcome. As an opportunity for early detection, there are many cases where it is discovered accidentally by endoscopy and image inspection at the time of screening, or in the process of examining symptoms that are not directly related to cancer. There is no specific blood diagnostic marker useful for early detection of colorectal cancer. It is extremely important to establish a system that can diagnose the presence of colorectal cancer as early as possible.
昨今、DNAマイクロアレイ技術の発展、及びヒトゲノム解読によって、全遺伝子を対象とした網羅的遺伝子発現解析が可能になった。これにより、新しい癌の診断・予後予測、治療後の再発率の予測などが可能になった。本発明者らのグループは、大腸癌における遺伝子発現プロファイルを解析し、遺伝子発現プロファイルによる大腸癌の特異的検出方法を開発し（特許文献１を参照）、DNAマイクロアレイを用いた検出方法を実施している。 Recently, development of DNA microarray technology and human genome decoding have enabled comprehensive gene expression analysis for all genes. This has made it possible to diagnose and predict a new cancer, predict the recurrence rate after treatment, and so on. Our group analyzed a gene expression profile in colorectal cancer, developed a specific detection method for colorectal cancer based on the gene expression profile (see Patent Document 1), and carried out a detection method using a DNA microarray. ing.
本発明は、患者への侵襲も低く、且つ患者からの遺伝子抽出も容易な方法で、大腸癌に関連して発現が変動する遺伝子を解析して、大腸癌を検出する方法、並びに大腸癌を検出するための検出試薬の提供を目的とする。 The present invention relates to a method for detecting colorectal cancer by analyzing a gene whose expression varies in relation to colorectal cancer by a method that is less invasive to the patient and easy to extract a gene from the patient. An object is to provide a detection reagent for detection.
本発明者らは、リアルタイムPCRによる検出方法がDNAマイクロアレイを用いた検出方法より低コストで行うことができ、またより迅速な検出が可能になることに鑑み、リアルタイムPCRによる大腸癌の検出方法を開発すべく大腸癌患者における遺伝子発現プロファイルを解析した。 In view of the fact that the detection method using real-time PCR can be performed at a lower cost than the detection method using a DNA microarray, and more rapid detection is possible, a detection method for colorectal cancer using real-time PCR has been proposed. The gene expression profile in colorectal cancer patients was analyzed for development.
その結果、大腸癌と関連した２０個の遺伝子セットを２セット見出し、さらにこれら２０個の遺伝子の発現レベルと大腸癌の関係を統計的に判別解析し、２０個の遺伝子の発現レベルにより大腸癌陽性か陰性かを判別できる判別式を開発し、本発明を完成させるに至った。 As a result, two sets of 20 genes associated with colorectal cancer were found, and the relationship between the expression level of these 20 genes and colorectal cancer was statistically discriminated and analyzed. A discriminant that can discriminate between positive and negative has been developed and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 以下の２０個の遺伝子セットＡ又は２０個の遺伝子セットＢの２０個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む大腸癌を検出するための試薬：
遺伝子セットＡ
（１）Chromosome 21 open reading frame 56（C21orf56）
（２）CD69 molecule（CD69）
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（５）Forkhead box O1（FOXO1）
（６）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2（IMPDH2）
（７）Late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3（LAMTOR3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（９）Leucine rich repeat containing 68（LRRC68）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（１１）N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) （NAT1）
（１２）NDRG family member 2（NDRG2）
（１３）Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) （PLCB1）
（１４）Regulator of G-protein signaling 18（RGS18）
（１５）Ribosomal protein S27-like（RPS27L）
（１６）Ribosomal protein S4, Y-linked 1（RPS4Y1）
（１７）Ribosomal L24 domain containing 1（RSL24D1）
（１８）Sterile alpha motif domain containing 9（SAMD9）
（１９）SUB1 homolog (S. cerevisiae) （SUB1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
遺伝子セットＢ
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
（２１）AE binding protein 1（AEBP1）
（２２）Annexin A1（ANXA1）
（２３）BCL2-related protein A1（BCL2A1）
（２４）Centromere protein Q（CENPQ）
（２５）C-type lectin domain family 4, member D（CLEC4D）
（２６）Chromosome Y open reading frame 15B（CYorf15B）
（２７）D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein（DBP）
（２８）Interleukin 24（IL24）
（２９）Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin)（ITGB3BP）
（３０）Mitochondrial ribosomal protein S28（MRPS28）
（３１）S100 calcium binding protein A12（S100A12）
（３２）S100 calcium binding protein A8（S100A8）
（３３）Thioredoxin（TXN）
（３４）X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4（XRCC4）
（３５）Zinc finger protein 584（ZNF584）。
[２] 一部配列を含むヌクレオチドがPCR用プライマーである、[１]の大腸癌を検出するための試薬。
[３] 被験体における以下の２０個の遺伝子セットＡ又は２０個の遺伝子セットＢの２０個の遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルに基づいて大腸癌を検出する方法：
遺伝子セットＡ
（１）Chromosome 21 open reading frame 56（C21orf56）
（２）CD69 molecule（CD69）
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（５）Forkhead box O1（FOXO1）
（６）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2（IMPDH2）
（７）Late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3（LAMTOR3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（９）Leucine rich repeat containing 68（LRRC68）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（１１）N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) （NAT1）
（１２）NDRG family member 2（NDRG2）
（１３）Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) （PLCB1）
（１４）Regulator of G-protein signaling 18（RGS18）
（１５）Ribosomal protein S27-like（RPS27L）
（１６）Ribosomal protein S4, Y-linked 1（RPS4Y1）
（１７）Ribosomal L24 domain containing 1（RSL24D1）
（１８）Sterile alpha motif domain containing 9（SAMD9）
（１９）SUB1 homolog (S. cerevisiae) （SUB1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
遺伝子セットＢ
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
（２１）AE binding protein 1（AEBP1）
（２２）Annexin A1（ANXA1）
（２３）BCL2-related protein A1（BCL2A1）
（２４）Centromere protein Q（CENPQ）
（２５）C-type lectin domain family 4, member D（CLEC4D）
（２６）Chromosome Y open reading frame 15B（CYorf15B）
（２７）D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein（DBP）
（２８）Interleukin 24（IL24）
（２９）Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin)（ITGB3BP）
（３０）Mitochondrial ribosomal protein S28（MRPS28）
（３１）S100 calcium binding protein A12（S100A12）
（３２）S100 calcium binding protein A8（S100A8）
（３３）Thioredoxin（TXN）
（３４）X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4（XRCC4）
（３５）Zinc finger protein 584（ZNF584）。
[４] 被験体の遺伝子の発現レベルが、被験体の末梢血細胞のmRNAを用いて測定する、[３]の大腸癌を検出する方法。
[５] 遺伝子の発現レベルを、[３]の２０個の遺伝子セットＡ又は２０個の遺伝子セットＢの２０個の遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとした定量PCRにより測定する、[３]又は[４]の大腸癌を検出する方法。
[６] 以下の工程を含む、[３]〜[５]のいずれかの大腸癌を検出する方法：
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する工程；
（２）遺伝子セットＡの２０個の遺伝子又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子をPCRにより増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値により標準化し、標準化Ct値を得る工程；
（３）遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式に代入し、大腸癌が陽性である確率を算出する工程。
[７] 以下の判別式を用いて大腸癌を検出する[６]の大腸癌を検出する方法であって、以下の判別式から算出される数値が０より大きい場合に大腸癌陽性であると判定する、[６]の大腸癌を検出する方法：
式：intercept + Σ(beta i × X i)
[式において、intercept は定数、beta iは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す]。
[８] ２０個の遺伝子セットＡを用いる判別式Ａにおけるintercept及び各遺伝子のbeta iが以下に示す値である、[７]の大腸癌を検出する方法：
intercept: 1.947970595
intercept：1.507712014
[1] A reagent for detecting colorectal cancer comprising nucleotides comprising the nucleotide sequences of 20 genes of the following 20 gene sets A or 20 gene sets B or nucleotides comprising a partial sequence thereof:
Gene set A
(1) Chromosome 21 open reading frame 56 (C21orf56)
(2) CD69 molecule (CD69)
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(5) Forkhead box O1 (FOXO1)
(6) IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2)
(7) Late endosomal / lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3 (LAMTOR3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(9) Leucine rich repeat containing 68 (LRRC68)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(11) N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT1)
(12) NDRG family member 2 (NDRG2)
(13) Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) (PLCB1)
(14) Regulator of G-protein signaling 18 (RGS18)
(15) Ribosomal protein S27-like (RPS27L)
(16) Ribosomal protein S4, Y-linked 1 (RPS4Y1)
(17) Ribosomal L24 domain containing 1 (RSL24D1)
(18) Sterile alpha motif domain containing 9 (SAMD9)
(19) SUB1 homolog (S. cerevisiae) (SUB1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
Gene set B
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
(21) AE binding protein 1 (AEBP1)
(22) Annexin A1 (ANXA1)
(23) BCL2-related protein A1 (BCL2A1)
(24) Centromere protein Q (CENPQ)
(25) C-type lectin domain family 4, member D (CLEC4D)
(26) Chromosome Y open reading frame 15B (CYorf15B)
(27) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (DBP)
(28) Interleukin 24 (IL24)
(29) Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin) (ITGB3BP)
(30) Mitochondrial ribosomal protein S28 (MRPS28)
(31) S100 calcium binding protein A12 (S100A12)
(32) S100 calcium binding protein A8 (S100A8)
(33) Thioredoxin (TXN)
(34) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (XRCC4)
(35) Zinc finger protein 584 (ZNF584).
[2] The reagent for detecting colorectal cancer according to [1], wherein a nucleotide containing a partial sequence is a primer for PCR.
[3] A method for measuring the expression level of 20 genes in the following 20 gene sets A or 20 gene sets B in a subject and detecting colorectal cancer based on the expression level:
Gene set A
(1) Chromosome 21 open reading frame 56 (C21orf56)
(2) CD69 molecule (CD69)
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(5) Forkhead box O1 (FOXO1)
(6) IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2)
(7) Late endosomal / lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3 (LAMTOR3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(9) Leucine rich repeat containing 68 (LRRC68)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(11) N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT1)
(12) NDRG family member 2 (NDRG2)
(13) Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) (PLCB1)
(14) Regulator of G-protein signaling 18 (RGS18)
(15) Ribosomal protein S27-like (RPS27L)
(16) Ribosomal protein S4, Y-linked 1 (RPS4Y1)
(17) Ribosomal L24 domain containing 1 (RSL24D1)
(18) Sterile alpha motif domain containing 9 (SAMD9)
(19) SUB1 homolog (S. cerevisiae) (SUB1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
Gene set B
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
(21) AE binding protein 1 (AEBP1)
(22) Annexin A1 (ANXA1)
(23) BCL2-related protein A1 (BCL2A1)
(24) Centromere protein Q (CENPQ)
(25) C-type lectin domain family 4, member D (CLEC4D)
(26) Chromosome Y open reading frame 15B (CYorf15B)
(27) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (DBP)
(28) Interleukin 24 (IL24)
(29) Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin) (ITGB3BP)
(30) Mitochondrial ribosomal protein S28 (MRPS28)
(31) S100 calcium binding protein A12 (S100A12)
(32) S100 calcium binding protein A8 (S100A8)
(33) Thioredoxin (TXN)
(34) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (XRCC4)
(35) Zinc finger protein 584 (ZNF584).
[4] The method for detecting colon cancer according to [3], wherein the expression level of the gene of the subject is measured using mRNA of peripheral blood cells of the subject.
[5] Quantification of gene expression level targeting nucleotides comprising nucleotide sequences of 20 genes of 20 gene sets A or 20 gene sets B of [3] or nucleotides containing partial sequences thereof [3] or [4], wherein the colorectal cancer is detected by PCR.
[6] A method for detecting colorectal cancer according to any of [3] to [5], comprising the following steps:
(1) A step of extracting mRNA from peripheral blood cells collected from a subject;
(2) 20 genes of gene set A or 20 genes of gene set B are amplified by PCR, Ct (Cycle threshold) value is obtained, standardized by Ct value of housekeeping gene such as GAPDH, and standardized Obtaining a Ct value;
(3) A step of substituting the standardized Ct value of each gene of gene set A or gene set B into a discriminant and calculating the probability that colorectal cancer is positive.
[7] The method for detecting colorectal cancer according to [6], wherein colorectal cancer is detected using the following discriminant, and when the numerical value calculated from the following discriminant is greater than 0: The method for detecting colorectal cancer according to [6] to determine:
Expression: intercept + Σ (beta i × X i)
[In the formula, intercept is a constant, beta i is a coefficient for the ith gene of 20 genes in gene set A or gene set B, and xi is the i th gene of 20 genes in gene set A or gene set B. It is the standardized Ct value of the gene, and Σ indicates the total of beta × X of each of the 20 genes in gene set A or gene set B].
[8] The method for detecting colorectal cancer according to [7], wherein intercept in discriminant A using 20 gene sets A and beta i of each gene are the values shown below:
intercept: 1.947970595
intercept ： 1.507712014
本発明の２０個の遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のリアルタイムPCRで測定した発現レベルに基づいて、被験体が大腸癌に罹患しているか否かを高精度で判定することができる。特に、統計的解析により開発した遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子の発現レベルを変数とした判別式を用いることにより、容易にかつ高精度に大腸癌を検出することが可能である。 Based on the expression levels measured by real-time PCR of the 20 genes of the 20 gene sets A or B of the present invention, it is possible to determine with high accuracy whether or not the subject suffers from colorectal cancer. it can. In particular, it is possible to easily and accurately detect colorectal cancer by using a discriminant using the expression level of 20 genes of gene set A or gene set B developed by statistical analysis as a variable. .
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法で用いる遺伝子は、大腸癌で発現レベルが変動する３５個の遺伝子である。これらの３５個の遺伝子の発現レベルを測定し発現プロファイルを解析することにより大腸癌を検出することができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The genes used in the method of the present invention are 35 genes whose expression levels vary in colorectal cancer. Colon cancer can be detected by measuring the expression levels of these 35 genes and analyzing the expression profile.
本発明の方法で用いる遺伝子は、以下に述べる方法で選択することができる。医師が大腸癌であると判断した患者を大腸癌群とし、該大腸癌群及び健常人群から末梢血単核球を採取し、該単核球からトータルmRNAを単離する。単離したmRNAをヒト遺伝子を含むDNAマイクロアレイに適用し、遺伝子の発現レベルを測定し、階層的クラスタリング分析を行い、大腸癌群と健常人群とで発現レベルに差がある遺伝子を選択する。マイクロアレイ解析で選択された遺伝子について大腸癌群と健常人群に関してリアルタイムPCRを用いて発現解析を行う。この際、GAPDH（グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ）等のハウスキーピング遺伝子をコントロールとして発現を解析すればよい。最終的にリアルタイムPCR解析により大腸癌群で健常人群と発現レベルが異なる遺伝子を大腸癌特異的遺伝子として選択することができる。 The gene used in the method of the present invention can be selected by the method described below. A patient judged by a doctor as having colorectal cancer is taken as a colorectal cancer group, peripheral blood mononuclear cells are collected from the colorectal cancer group and healthy people group, and total mRNA is isolated from the mononuclear cells. The isolated mRNA is applied to a DNA microarray containing human genes, the gene expression level is measured, hierarchical clustering analysis is performed, and genes having a difference in expression level between the colorectal cancer group and the healthy human group are selected. Expression analysis is performed using real-time PCR for the colorectal cancer group and the healthy human group for the genes selected by microarray analysis. At this time, expression may be analyzed using a housekeeping gene such as GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) as a control. Finally, a gene whose expression level is different from that of a healthy group in a colon cancer group can be selected as a colon cancer-specific gene by real-time PCR analysis.
本発明で用いる遺伝子は以下に示す３５個の遺伝子である。かっこ内に遺伝子のSymbol、NCBI RefSeqID及び配列番号を示す。
（１）Chromosome 21 open reading frame 56（C21orf56）（NM_032261.4）（配列番号１）
（２）CD69 molecule（CD69）（NM_001781.2）（配列番号２）
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）（NM_017845.3）（配列番号３）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）（NM_005449.4）（配列番号４）
（５）Forkhead box O1（FOXO1）（NM_002015.3）（配列番号５）
（６）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2（IMPDH2）（NM_000884.2）（配列番号６）
（７）Late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3（LAMTOR3）（NM_021970.3）（配列番号７）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）（NM_005767.5）（配列番号８）
（９）Leucine rich repeat containing 68（LRRC68）（XM_001722969.2）（配列番号９）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）（NM_006986.3）（配列番号１０）
（１１）N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) （NAT1）（NM_000662.7）（配列番号１１）
（１２）NDRG family member 2（NDRG2）（NM_201541.1）（配列番号１２）
（１３）Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) （PLCB1）（NM_015192.3）（配列番号１３）
（１４）Regulator of G-protein signaling 18（RGS18）（NM_130782.2）（配列番号１４）
（１５）Ribosomal protein S27-like（RPS27L）（NM_015920.3）（配列番号１５）
（１６）Ribosomal protein S4, Y-linked 1（RPS4Y1）（NM_001008.3）（配列番号１６）
（１７）Ribosomal L24 domain containing 1（RSL24D1）（NM_016304.2）（配列番号１７）
（１８）Sterile alpha motif domain containing 9（SAMD9）（NM_017654.3）（配列番号１８）
（１９）SUB1 homolog (S. cerevisiae) （SUB1）（NM_006713.3）（配列番号１９）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）（NM_212559.2）（配列番号２０）
（２１）AE binding protein 1（AEBP1）（NM_001129.4）（配列番号２１）
（２２）Annexin A1（ANXA1）（NM_000700.1）（配列番号２２）
（２３）BCL2-related protein A1（BCL2A1）（NM_004049.3）（配列番号２３）
（２４）Centromere protein Q（CENPQ）（NM_018132.3）（配列番号２４）
（２５）C-type lectin domain family 4, member D（CLEC4D）（NM_080387.4）（配列番号２５）
（２６）Chromosome Y open reading frame 15B（CYorf15B）（NM_032576.4）（配列番号２６）
（２７）D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein（DBP）（NM_001352.4）（配列番号２７）
（２８）Interleukin 24（IL24）（NM_006850.3）（配列番号２８）
（２９）Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin)（ITGB3BP）（NM_014288.4）（配列番号２９）
（３０）Mitochondrial ribosomal protein S28（MRPS28）（NM_014018.2）（配列番号３０）
（３１）S100 calcium binding protein A12（S100A12）（NM_005621.1）（配列番号３１）
（３２）S100 calcium binding protein A8（S100A8）（NM_002964.4）（配列番号３２）
（３３）Thioredoxin（TXN）（NM_003329.3）（配列番号３３）
（３４）X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4（XRCC4）（NM_003401.3）（配列番号３４）
（３５）Zinc finger protein 584（ZNF584）（NM_173548.1）（配列番号３５）
上記３５の遺伝子（１）〜（３５）の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜３５に示す。
The genes used in the present invention are the 35 genes shown below. The symbol of the gene, NCBI RefSeqID and the sequence number are shown in parentheses.
(1) Chromosome 21 open reading frame 56 (C21orf56) (NM_032261.4) (SEQ ID NO: 1)
(2) CD69 molecule (CD69) (NM_001781.2) (SEQ ID NO: 2)
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8) (NM_017845.3) (SEQ ID NO: 3)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3) (NM_005449.4) (SEQ ID NO: 4)
(5) Forkhead box O1 (FOXO1) (NM_002015.3) (SEQ ID NO: 5)
(6) IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2) (NM_000884.2) (SEQ ID NO: 6)
(7) Late endosomal / lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3 (LAMTOR3) (NM_021970.3) (SEQ ID NO: 7)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6) (NM_005767.5) (SEQ ID NO: 8)
(9) Leucine rich repeat containing 68 (LRRC68) (XM_001722969.2) (SEQ ID NO: 9)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1) (NM_006986.3) (SEQ ID NO: 10)
(11) N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT1) (NM_000662.7) (SEQ ID NO: 11)
(12) NDRG family member 2 (NDRG2) (NM_201541.1) (SEQ ID NO: 12)
(13) Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) (PLCB1) (NM_015192.3) (SEQ ID NO: 13)
(14) Regulator of G-protein signaling 18 (RGS18) (NM_130782.2) (SEQ ID NO: 14)
(15) Ribosomal protein S27-like (RPS27L) (NM_015920.3) (SEQ ID NO: 15)
(16) Ribosomal protein S4, Y-linked 1 (RPS4Y1) (NM_001008.3) (SEQ ID NO: 16)
(17) Ribosomal L24 domain containing 1 (RSL24D1) (NM_016304.2) (SEQ ID NO: 17)
(18) Sterile alpha motif domain containing 9 (SAMD9) (NM_017654.3) (SEQ ID NO: 18)
(19) SUB1 homolog (S. cerevisiae) (SUB1) (NM_006713.3) (SEQ ID NO: 19)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX) (NM_212559.2) (SEQ ID NO: 20)
(21) AE binding protein 1 (AEBP1) (NM_001129.4) (SEQ ID NO: 21)
(22) Annexin A1 (ANXA1) (NM_000700.1) (SEQ ID NO: 22)
(23) BCL2-related protein A1 (BCL2A1) (NM_004049.3) (SEQ ID NO: 23)
(24) Centromere protein Q (CENPQ) (NM_018132.3) (SEQ ID NO: 24)
(25) C-type lectin domain family 4, member D (CLEC4D) (NM_080387.4) (SEQ ID NO: 25)
(26) Chromosome Y open reading frame 15B (CYorf15B) (NM_032576.4) (SEQ ID NO: 26)
(27) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (DBP) (NM_001352.4) (SEQ ID NO: 27)
(28) Interleukin 24 (IL24) (NM_006850.3) (SEQ ID NO: 28)
(29) Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin) (ITGB3BP) (NM_014288.4) (SEQ ID NO: 29)
(30) Mitochondrial ribosomal protein S28 (MRPS28) (NM_014018.2) (SEQ ID NO: 30)
(31) S100 calcium binding protein A12 (S100A12) (NM_005621.1) (SEQ ID NO: 31)
(32) S100 calcium binding protein A8 (S100A8) (NM_002964.4) (SEQ ID NO: 32)
(33) Thioredoxin (TXN) (NM_003329.3) (SEQ ID NO: 33)
(34) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (XRCC4) (NM_003401.3) (SEQ ID NO: 34)
(35) Zinc finger protein 584 (ZNF584) (NM_173548.1) (SEQ ID NO: 35)
The base sequences of the 35 genes (1) to (35) are shown in SEQ ID NOs: 1 to 35 in the sequence listing, respectively.
本発明の方法において用いるヌクレオチドは、上記配列を含むヌクレオチド又はその断片配列からなるヌクレオチドを含む。また、本発明に用いるヌクレオチドは、上記配列番号で示される塩基配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド及びその断片配列からなるヌクレオチドも含まれる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、上記塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約98％以上である塩基配列を含有するヌクレオチド等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するヌクレオチドを単離し得る。ただし、上記のSSC、SDS及びに温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。さらに、これらの遺伝子はバリアントを有する場合もあり、本発明で用いる遺伝子には上記遺伝子のバリアントも含まれる。バリアントの塩基配列は遺伝子データベースにアクセスすることにより得ることができる。本発明のヌクレオチドは該バリアントの塩基配列を含むヌクレオチド又はその断片配列からなるヌクレオチドも含む。 The nucleotide used in the method of the present invention includes a nucleotide comprising the above-described sequence or a nucleotide sequence thereof. The nucleotides used in the present invention also include nucleotides that hybridize under stringent conditions with nucleotides having the base sequence shown by the above SEQ ID NOs and nucleotide fragments thereof. As such nucleotides, for example, the degree of homology with the above base sequence is about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, and particularly preferably about 98% on the whole. Examples include nucleotides containing the above base sequences. Hybridization is a method known in the art such as the method described in Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) or the like. It can be done according to the method. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. Here, “stringent conditions” are, for example, “1XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” conditions, and more severe conditions are “0.5XSSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” conditions. There are more severe conditions such as “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”. Thus, nucleotides having higher homology with the probe sequence can be isolated as the hybridization conditions become more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization). It is possible to achieve the same stringency as described above by appropriately combining the reaction time and the like. Furthermore, these genes may have variants, and the genes used in the present invention include variants of the above genes. The base sequence of the variant can be obtained by accessing a gene database. The nucleotide of the present invention also includes a nucleotide comprising the nucleotide sequence of the variant or a fragment sequence thereof.
また、本発明で用いるヌクレオチドは、上記遺伝子のセンス鎖よりなるヌクレオチド、アンチセンス鎖よりなるヌクレオチドのいずれをも用いることができる。 In addition, as the nucleotide used in the present invention, either a nucleotide composed of a sense strand of the above gene or a nucleotide composed of an antisense strand can be used.
本発明において、遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の発現量、発現強度又は発現頻度をいい、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、又はその翻訳産物の産生量、活性等により解析することができる。また、発現プロファイルとは、各遺伝子の発現レベルに関する情報をいう。遺伝子の発現レベルは、絶対値で表してもよく、また相対値で表してもよい。なお、発現プロファイルを発現パターンという場合もある。 In the present invention, the expression level of a gene refers to the expression level, expression intensity, or expression frequency of the gene, and is usually analyzed based on the production amount of the transcription product corresponding to the gene or the production amount, activity, etc. of the translation product. Can do. Moreover, an expression profile means the information regarding the expression level of each gene. The gene expression level may be expressed as an absolute value or a relative value. The expression profile may be referred to as an expression pattern.
本発明の方法において、被験体における上記３５の遺伝子のうち、（１）〜（２０）までの２０遺伝子の遺伝子セットＡ、又は（３）、（４）、（８）、（１０）及び（２０）〜（３５）の２０遺伝子の遺伝子セットＢの発現レベルを指標に大腸癌を検出する。 In the method of the present invention, among the 35 genes in the subject, the gene set A of 20 genes from (1) to (20), or (3), (4), (8), (10) and (10) Colorectal cancer is detected using the expression level of the gene set B of 20 genes (20) to (35) as an index.
発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物、すなわちmRNAの測定により行ってもよいし、遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質の測定により行ってもよい。好ましくは、遺伝子の転写産物の測定により行なう。遺伝子の転写産物には、mRNAから逆転写されて得られたcDNAも含まれる。 The expression level may be measured by measuring a gene transcription product, ie, mRNA, or by measuring a gene translation product, ie, protein. Preferably, it is carried out by measuring a gene transcription product. A gene transcription product also includes cDNA obtained by reverse transcription from mRNA.
遺伝子の転写産物の測定は、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて遺伝子発現の程度を測定すればよい。遺伝子発現の程度は、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量PCR法、マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法等で測定することが可能である。好ましくは定量PCR法で遺伝子発現を測定する。 The gene transcript may be measured by measuring the degree of gene expression using nucleotides containing all or part of the base sequence of the gene as a probe or primer. The degree of gene expression can be measured by a quantitative PCR method targeting a gene to be quantified or a fragment thereof, a method using a microarray (microchip), a Northern blot method, or the like. Preferably, gene expression is measured by quantitative PCR.
定量PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、Serial analysis of gene expression(SAGE)法（米国特許第527,154号、第544,861号、欧州特許公開第0761822号）、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等がある。リアルタイムPCRとしては、例えばTaqMan（登録商標）プローブを用いた方法等が挙げられる。ここに挙げた方法はいずれも公知の方法で行うことができる。 Quantitative PCR methods include agarose gel electrophoresis, fluorescent probe method, RT-PCR method, real-time PCR method, ATAC-PCR method (Kato, K. et al., Nucl. Acids Res., 25, 4694-4696, 1997), Taqman PCR method (SYBR (registered trademark) green method) (Schmittgen TD, Methods 25, 383-385, 2001), Body Map method (Gene, 174, 151-158 (1996)), Serial analysis of gene expression (SAGE) Method (US Patent Nos. 527,154, 544,861, European Patent Publication No. 0761822), MAGE method (Micro-analysis of Gene Expression) (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-232888), and the like. Examples of real-time PCR include a method using a TaqMan (registered trademark) probe. Any of the methods mentioned here can be carried out by known methods.
PCR法は公知の手法で行うことができる。用いるプライマーの塩基長は、５〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは15〜25である。通常、標的遺伝子の塩基配列に基づいてフォワードプライマー及びリバースプライマーが設計される。本発明の方法において、配列番号１〜３５の標的遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーの配列を設計することができる。 The PCR method can be performed by a known method. The base length of the primer used is 5 to 50, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 25. Usually, a forward primer and a reverse primer are designed based on the base sequence of the target gene. In the method of the present invention, the primer sequence can be designed based on the base sequence of the target gene of SEQ ID NOs: 1 to 35.
これらの方法を用いて、上記遺伝子の全部又は一部から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の量を測定すればよい。 Using these methods, the amount of messenger RNA (mRNA) transcribed from all or part of the gene may be measured.
DNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを適当な基板上に固定化することにより作製することができる。 A DNA microarray (DNA chip) can be prepared by immobilizing nucleotides comprising the base sequence of the gene or nucleotides including a partial sequence thereof on an appropriate substrate.
固定基板としては、ガラス板、石英板、シリコンウェハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これは基板上のプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。ポリヌクレオチド又はその断片の固定化方法としては、ヌクレオチドの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させることもできる。固定化は、アレイ機を用いて行えばよい。上記２０個の遺伝子又はその断片を基板に固相化してDNAマイクロアレイを作製し、該DNAマイクロアレイと蛍光物質で標識した被験体由来のmRNAまたはcDNAを接触させ、ハイブリダイズさせ、DNAマイクロアレイ上の蛍光強度を測定することにより、mRNAの種類と量を決定することができる。その結果、被験体において発現が変動している遺伝子がわかり、遺伝子発現プロファイルを得ることができる。被験体由来のmRNAを標識する蛍光物質は、限定されず、市販の蛍光物質を用いることができる。例えば、Cy3、Cy5等を用いればよい。mRNAの標識は公知の方法で行うことができる。DNAマイクロアレイを用いた方法は、上記遺伝子のmRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブの使用により測定することができる。測定に用いるプローブの塩基長は、10〜50bp、好ましくは15〜25bpである。 Examples of the fixed substrate include a glass plate, a quartz plate, and a silicon wafer. Examples of the size of the substrate include 3.5 mm × 5.5 mm, 18 mm × 18 mm, 22 mm × 75 mm, etc., which are variously set according to the number of probe spots on the substrate and the size of the spots. be able to. As a method for immobilizing a polynucleotide or a fragment thereof, it is possible to electrostatically bind to a solid phase carrier surface-treated with a polycation such as polylysine, polyethyleneimine, polyalkylamine, etc. A nucleotide having a functional group such as an amino group, an aldehyde group, an SH group, or biotin can be covalently bonded to a solid phase surface into which a functional group such as an aldehyde group or an epoxy group has been introduced. Immobilization may be performed using an array machine. The 20 genes or fragments thereof are immobilized on a substrate to prepare a DNA microarray. The DNA microarray is contacted with mRNA or cDNA derived from a subject labeled with a fluorescent substance, hybridized, and fluorescent on the DNA microarray. By measuring the intensity, the type and amount of mRNA can be determined. As a result, a gene whose expression is fluctuating in a subject can be known, and a gene expression profile can be obtained. The fluorescent substance for labeling mRNA derived from a subject is not limited, and a commercially available fluorescent substance can be used. For example, Cy3, Cy5, etc. may be used. mRNA can be labeled by a known method. The method using a DNA microarray can be measured by using a nucleotide probe that hybridizes to the mRNA of the above gene. The base length of the probe used for measurement is 10 to 50 bp, preferably 15 to 25 bp.
遺伝子の翻訳産物の測定は、翻訳されたタンパク質を定量するか、又はタンパク質の活性を測定すればよい。タンパク質の定量はELISA等の免疫測定法により行うことができる。 The translation product of the gene may be measured by quantifying the translated protein or measuring the activity of the protein. Protein quantification can be performed by immunoassay methods such as ELISA.
遺伝子の転写産物を測定する場合の試料は、被験体の細胞を用い、細胞からmRNAを抽出単離すればよい。細胞は、限定されないが、血液中の細胞が好ましく、その中でも末梢血液中の白血球、特に単核球（PBMC）が好ましい。単核球は、血液成分分離装置を用いたアフェレーシスによって単離することもできるし、末梢血液から密度勾配遠心分離法により単離してもよい。密度勾配遠心分離による単核球の単離は、公知のFicoll-Paque（登録商標）比重遠心法により行うことができる。 As a sample for measuring a gene transcript, the subject's cells may be used, and mRNA may be extracted and isolated from the cells. The cells are not limited, but are preferably cells in blood, among which leukocytes in peripheral blood, particularly mononuclear cells (PBMC) are preferred. Mononuclear cells can be isolated by apheresis using a blood component separator, or can be isolated from peripheral blood by density gradient centrifugation. Isolation of mononuclear cells by density gradient centrifugation can be performed by a known Ficoll-Paque (registered trademark) specific gravity centrifugation method.
本発明の方法により、被験体が大腸癌に罹患しているか否かを評価判定し、大腸癌に罹患するリスクの程度を評価判定することができる。また、被験体が大腸癌に罹患するリスクが高いか否かを評価判定することができる。さらに、大腸癌に罹患している被験体における病態予測、予後予測が可能になる。本発明は、大腸癌に罹患しているか否か、あるいは罹患するリスクが高いかの判定、並びに病態予測及び予後予測を行うための補助的データを取得する方法でもある。 According to the method of the present invention, it is possible to evaluate and determine whether or not a subject has colorectal cancer, and to evaluate and determine the degree of risk of having colorectal cancer. In addition, it can be evaluated whether or not the subject has a high risk of suffering from colorectal cancer. Furthermore, it is possible to predict a disease state and prognosis in a subject suffering from colorectal cancer. The present invention is also a method for obtaining auxiliary data for determining whether or not a person has colorectal cancer or having a high risk of being affected, and for predicting a disease state and prognosis.
例えば、被験体において、上記２０個の遺伝子セットＡ又はＢのうち、大腸癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が亢進しているか、大腸癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が減弱しているか、あるいは大腸癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が亢進し、かつ大腸癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が減弱している場合、被験体は大腸癌に罹患していると評価判定することができ、又は被験体は大腸癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。例えば、大腸癌患者において発現が亢進する遺伝子の発現が正常人に比べ有意に亢進している場合、又は大腸癌患者において発現が減弱する遺伝子の発現が正常人に比べ有意に減弱している場合、被験体は大腸癌に罹患しているか、又は大腸癌に罹患するリスクが高いと評価判定することができる。ここで、有意に亢進しているとは、統計学的に有意差をもって発現が亢進していると決定できることをいい、例えば遺伝子発現の絶対値又は相対値が1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは２倍以上に亢進している場合をいう。また、有意に減弱しているとは、統計学的に有意差をもって発現が減弱していると決定できることをいい、例えば遺伝子発現の絶対値又は相対値が３分の２以下、好ましくは２分の１以下、さらに好ましくは３分の１以下に減弱している場合をいう。ここで、評価、判定とは予測ともいう。また、本発明において、上記の大腸癌に罹患しているか否かの評価判定、大腸癌に罹患するリスクの評価判定、病態予測、予後予測等を広く大腸癌の検出という。 For example, in the subject, among the 20 gene sets A or B, the expression of a gene whose expression is increased in a colon cancer patient is increased, or the expression of a gene whose expression is attenuated in a colon cancer patient is decreased. Or if the expression of a gene whose expression is increased in colorectal cancer patients is increased and the expression of a gene whose expression is attenuated in colorectal cancer patients is attenuated, the subject is evaluated as having colon cancer. Or the subject can be assessed to be at high risk for developing colorectal cancer. For example, when the expression of a gene whose expression is enhanced in colorectal cancer patients is significantly increased compared to normal persons, or the expression of a gene whose expression is attenuated in colon cancer patients is significantly attenuated compared to normal persons The subject can be evaluated as having a colorectal cancer or having a high risk of having a colorectal cancer. Here, significantly increased means that it can be determined that expression is statistically significantly increased, for example, the absolute value or relative value of gene expression is 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more More preferably, it refers to a case where it is enhanced by 2 times or more. Also, “significantly attenuated” means that it can be determined that expression is attenuated with a statistically significant difference. For example, the absolute value or relative value of gene expression is 2/3 or less, preferably 2 minutes. Or less, more preferably 1/3 or less. Here, evaluation and determination are also called prediction. In the present invention, the above-described evaluation determination as to whether or not the patient suffers from colorectal cancer, evaluation evaluation of the risk of suffering from colorectal cancer, disease state prediction, prognosis prediction and the like are broadly referred to as colorectal cancer detection.
また、上記２０個の遺伝子セットＡ又はＢのすべての遺伝子発現プロファイルを得て、発現プロファイルを解析することにより、被験体の病態又は大腸癌に罹患するリスクを評価判定することができる。被験体から得られた発現プロファイルが大腸癌患者群で得られた発現プロファイルと類似している場合、被験体は大腸癌に罹患していると評価判定することができ、被験体から得られた発現プロファイルが大腸癌群で得られた発現プロファイルと類似している場合、被験体は大腸癌に罹患しているか、又は大腸癌に罹患するリスクが大きいと評価判定することができる。また、被験体から得られた発現プロファイルを正常人で得られた発現プロファイルと比較し、正常人の発現プロファイルとの相違により、評価判定することもできる。 Moreover, by obtaining all the gene expression profiles of the 20 gene sets A or B and analyzing the expression profiles, the disease state of the subject or the risk of suffering from colorectal cancer can be evaluated and determined. If the expression profile obtained from the subject is similar to the expression profile obtained in the colorectal cancer patient group, the subject can be evaluated and determined to be suffering from colorectal cancer and obtained from the subject When the expression profile is similar to the expression profile obtained in the colorectal cancer group, it can be determined that the subject has colorectal cancer or has a high risk of having colorectal cancer. In addition, an expression profile obtained from a subject can be compared with an expression profile obtained in a normal person, and evaluation can be made based on a difference from the expression profile of a normal person.
遺伝子発現プロファイルは、蛍光強度等の発現シグナルのパターンが、デジタル数値で又は色を有する画像で記録される。遺伝子発現プロファイルの比較は、例えばパターン比較ソフトウェアを用いて行うことができ、判別分析、コックスハザード分析等を利用することができる。あらかじめ病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うための判別分析モデルを構築し、該判別分析モデルに被験体から得られた遺伝子発現プロファイルに関するデータを入力し、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うこともできる。例えば、判別分析により判別式を得て、蛍光強度と病態、病態予測又は予後予測を関連付け、判別式に被験体の発現シグナル数値を代入することにより、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うことができる。 The gene expression profile is recorded as an image in which a pattern of an expression signal such as fluorescence intensity is a digital value or a color. Comparison of gene expression profiles can be performed using, for example, pattern comparison software, and discriminant analysis, Cox hazard analysis, or the like can be used. Establish a discriminant analysis model to evaluate and determine the pathological condition in advance, perform pathological or prognostic prediction, input data on the gene expression profile obtained from the subject to the discriminant analysis model, evaluate and determine the pathological condition, Prediction or prognosis can also be performed. For example, a discriminant is obtained by discriminant analysis, the fluorescence intensity is associated with a disease state, a disease state prediction or a prognosis prediction, and the expression signal value of the subject is substituted into the discriminant to evaluate and determine the disease state. It can be performed.
本発明は、本発明の２０個の遺伝子セットＡ又はＢの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを含む大腸癌を検出するための試薬又はキットを包含する。該試薬は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブとして含む試薬であり、また前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ等の基板である。PCRキットの場合、他に熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキシヌクレオチド３リン酸、ヌクレオチド３リン酸等を含んでいてもよい。 The present invention includes a reagent or kit for detecting colorectal cancer comprising nucleotides comprising the nucleotide sequences of the 20 gene sets A or B of the present invention or nucleotides comprising a partial sequence thereof. The reagent is a reagent comprising a nucleotide comprising the nucleotide sequence of the gene or a nucleotide comprising a partial sequence thereof as a primer or probe, and a nucleotide comprising the nucleotide sequence of the gene or a nucleotide comprising a partial sequence thereof as a solid phase. A microarray substrate. In the case of a PCR kit, a thermostable polymerase, reverse transcriptase, deoxynucleotide triphosphate, nucleotide triphosphate and the like may be included.
この試薬又はキットは、上記２０個の遺伝子セットＡ又はＢのそれぞれの２０個全ての一部配列を含むヌクレオチドを含んでいる。 This reagent or kit contains a nucleotide containing a partial sequence of all 20 of each of the 20 gene sets A or B.
また、本発明の方法において、あらかじめ大腸癌に罹患しているか否かを検出し、大腸癌に罹患するリスクの程度を評価判定し、又は病態予測若しくは予後予測を行うための判別式を構築し、当該判別式に被験体から得られた２０個の遺伝子セットＡ又はＢの発現レベルに関するデータを入力し、大腸癌に罹患しているか否かを検出し、大腸癌に罹患するリスクの程度を評価判定し、又は病態予測若しくは予後予測を行うこともできる。例えば、判別分析により判別式を得て、発現レベルと病態、病態予測又は予後予測を関連付け、判別式に被験体の発現レベルを代入することにより、病態を評価判定し、病態予測又は予後予測を行うことができる。発現レベルを示す数値としては、例えば、リアルタイムPCRによって目的遺伝子の増幅を行ったときの増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数（Cycle threshold: Ct)が挙げられる。横軸に増幅のサイクル数、縦軸にPCR増幅産物量をプロットして、増幅曲線を作成し、PCR増幅産物量の値に閾値（Threshold）を設定したときに閾値と増幅曲線が交わる点のサイクル数がCt値となる。プローブを用いた場合は、蛍光強度を用いることもできる。発現レベルを測定するときは、被験体の状態に関らず普遍的に一定レベルで発現している遺伝子の発現レベルに対する相対値を用いるのが好ましい。普遍的に一定レベルで発現している遺伝子として、ハウスキーピング遺伝子が挙げられ、例えば、グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）が挙げられる。同一サンプルにおいて、各遺伝子の発現レベルの測定と同時にGAPDHの発現レベルを内部標準として測定し、各遺伝子の発現レベルをGAPDHの発現レベルに対する相対値で表せばよい。例えば、リアルタイムPCRで発現レベルを測定する場合、発現量が一定のハウスキーピング遺伝子（内部標準）について、リアルタイムPCRを行い、Ct値を求める。次いで、目的の遺伝子についてハウスキーピング遺伝子と同じ条件でリアルタイムPCRを行い、Ct値を求める。目的の遺伝子のCt値をハウスキーピング遺伝子のCt値で除し、標準化Ct値を求めて、判別式作成のための遺伝子定量値として用いればよい。一方、各遺伝子の発現レベルが蛍光強度で表される場合、各遺伝子の蛍光強度をGAPDHの蛍光強度で除すればよい。 Further, in the method of the present invention, it is detected whether or not the patient is previously suffering from colorectal cancer, the degree of risk of suffering from colorectal cancer is evaluated and determined, or a discriminant for constructing a disease state prediction or prognosis prediction is constructed. , Input data related to the expression level of 20 gene sets A or B obtained from the subject to the discriminant, detect whether or not the patient has colorectal cancer, and determine the degree of risk of having colorectal cancer. It is also possible to make an evaluation, or to predict a disease state or prognosis. For example, a discriminant is obtained by discriminant analysis, the expression level is associated with a disease state, a disease state prediction or a prognosis prediction. It can be carried out. Examples of the numerical value indicating the expression level include the cycle number (Cycle threshold: Ct) when the amplification product reaches a certain amount when the target gene is amplified by real-time PCR. Plot the number of amplification cycles on the horizontal axis and the amount of PCR amplification product on the vertical axis, create an amplification curve, and set the threshold value (Threshold) to the value of PCR amplification product amount. The number of cycles is the Ct value. When a probe is used, fluorescence intensity can also be used. When measuring the expression level, it is preferable to use a relative value to the expression level of a gene that is universally expressed at a constant level regardless of the state of the subject. Examples of genes that are universally expressed at a certain level include housekeeping genes, such as glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). In the same sample, the expression level of each gene can be measured simultaneously with the GAPDH expression level as an internal standard, and the expression level of each gene can be expressed as a relative value to the expression level of GAPDH. For example, when the expression level is measured by real-time PCR, real-time PCR is performed on a housekeeping gene (internal standard) with a constant expression level to obtain a Ct value. Next, real-time PCR is performed on the target gene under the same conditions as the housekeeping gene to obtain a Ct value. The Ct value of the target gene is divided by the Ct value of the housekeeping gene to obtain a standardized Ct value, which can be used as a gene quantitative value for creating a discriminant. On the other hand, when the expression level of each gene is expressed by fluorescence intensity, the fluorescence intensity of each gene may be divided by the fluorescence intensity of GAPDH.
判別分析は、２群以上の母集団から抽出した標本データを得て、どの母集団に属するか不明のサンプルデータがある場合に、このサンプルデータがどの母集団に属するか調べる方法である。本発明においては２０個の遺伝子セットＡ及びＢのそれぞれの２０個の遺伝子の発現レベルに関する数値からなる多変量データ（x1、x2、・・・xn）を説明変数として用いて、判別分析を行う。 Discriminant analysis is a method of obtaining sample data extracted from two or more populations and examining which population the sample data belongs to when there is unknown sample data belonging to which population. In the present invention, discriminant analysis is performed using multivariate data (x1, x2,..., Xn) consisting of numerical values related to the expression levels of 20 genes of 20 gene sets A and B as explanatory variables. .
このような判別分析の手法は公知であり、代表的な判別分析法として、サポートベクターマシン（support vector machine：SVM)による判別、線形判別関数による判別、ロジスティック回帰分析等があり、どのような手法を用いてもよいが、非線形への拡張が可能な線形カーネルをもつサポートベクターマシン（support vector machine; SVM)を用いることが好ましい。 Such discriminant analysis methods are known, and typical discriminant analysis methods include discriminating with a support vector machine (SVM), discriminating with a linear discriminant function, logistic regression analysis, etc. However, it is preferable to use a support vector machine (SVM) having a linear kernel that can be extended to nonlinear.
サポートベクターマシンを用いた判別式の作成においては、１つのサンプルをテストセット(testing set)とし、他を訓練セット（training set)とする交差検証法(Leave-one-out cross-validation; LOOCV）を行えばよい。 In creating discriminants using support vector machines, cross-validation (LOOCV) with one sample as the testing set and the other as the training set Can be done.
本発明の方法においては、リアルタイムPCRを用いて発現レベルを測定し、サポートベクターマシンを用いて構築した以下の判別式Iを用いればよい。
式I：intercept + Σ(beta i × X i) > 0 ならば 大腸癌陽性
[式Ｉにおいて、intercept は定数、beta iは２０個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは２０個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは２０個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]
In the method of the present invention, the expression level is measured using real-time PCR, and the following discriminant I constructed using a support vector machine may be used.
Formula I: colorectal cancer positive if intercept + Σ (beta i × X i)> 0
[In Formula I, intercept is a constant, beta i is a coefficient for the i-th gene of 20 genes, x i is the normalized Ct value of the i-th gene of 20 genes, and Σ is the value of 20 genes. Indicates that the total of beta x X of each gene is added. ]
２０個の遺伝子セットＡ及びＢについて上記の式Ｉにそれぞれに遺伝子のCt値を入れ計算し、算出された数値が０を超える場合に、大腸癌が陽性であると判定することができる。ここで、大腸癌が陽性であるとは、大腸癌に罹患していると判定することができ、大腸癌に罹患するリスクが高いと判定することができることをいう。 For the 20 gene sets A and B, the Ct value of the gene is put into the above formula I and calculated. When the calculated value exceeds 0, it can be determined that the colorectal cancer is positive. Here, being positive for colorectal cancer means that it can be determined that the patient is afflicted with colorectal cancer, and the risk of being afflicted with colorectal cancer is high.
ここで、（１）〜（２０）までの２０遺伝子の遺伝子セットＡ、又は（３）、（４）、（８）、（１０）及び（２０）〜（３５）の２０遺伝子の遺伝子セットＢについて、interceptの値及び各遺伝子のbetaは以下のとおりである。遺伝子セットＡ及びＢの各遺伝子のbetaは、それぞれ、表１及び２に示す。
遺伝子セットＡのintercept: 1.947970595
遺伝子セットＢのintercept： 1.507712014
Here, gene set A of 20 genes from (1) to (20) or gene set B of 20 genes from (3), (4), (8), (10) and (20) to (35) The value of intercept and the beta of each gene are as follows. The beta of each gene in gene sets A and B is shown in Tables 1 and 2, respectively.
Gene set A intercept: 1.947970595
Gene set B intercept: 1.507712014
本発明の方法による大腸癌の検出は、例えば、以下の工程で行う。
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する。
（２）遺伝子セットＡの２０個の遺伝子又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子をPCRにより増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値により標準化し、標準化Ct値を得る。
（３）遺伝子セットＡについては、遺伝子セットＡの各遺伝子の標準化Ct値を判別式Ａに代入し、大腸癌が陽性である確率Ｐを求める。遺伝子セットＢについては、遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式Ｂに代入し、Ｐを求める。
（４）Ｐが０を超える場合に、前記被験体は大腸癌が陽性であると評価判定することができる。
Detection of colorectal cancer by the method of the present invention is performed, for example, in the following steps.
(1) mRNA is extracted from peripheral blood cells collected from a subject.
(2) 20 genes of gene set A or 20 genes of gene set B are amplified by PCR, Ct (Cycle threshold) value is obtained, standardized by Ct value of housekeeping gene such as GAPDH, and standardized Get the Ct value.
(3) For gene set A, the standardized Ct value of each gene in gene set A is substituted into discriminant A to determine the probability P that colorectal cancer is positive. For gene set B, P is obtained by substituting the standardized Ct value of each gene of gene set B into discriminant B.
(4) When P exceeds 0, the subject can be evaluated and judged to be positive for colorectal cancer.
本発明は本発明の大腸癌を検出する方法により、被験体の大腸癌を検出するシステムを包含する。 The present invention includes a system for detecting colorectal cancer in a subject by the method for detecting colorectal cancer of the present invention.
本発明の大腸癌を検出するシステムは、
(a) 被験体の遺伝子発現プロファイルに関するデータを入力する手段、ここで入力される遺伝子発現プロファイルに関するデータとは、例えば、各遺伝子における標準化Ct値等の各遺伝子の発現レベルを示すデータである；
(b) 構築した判別式を記憶している記憶手段、
(c) (a)の入力手段を用いて入力したデータを(b)の記憶手段に記憶されている判別式に適用して、大腸癌の病態の決定を行うためのデータ処理手段、及び
(d) 予測された大腸癌の病態の決定、病態予測、予後予測を出力する出力手段、
を含むシステムである。
The system for detecting colorectal cancer of the present invention comprises:
(a) means for inputting data relating to the gene expression profile of the subject, and the data relating to the gene expression profile input here is data indicating the expression level of each gene such as a standardized Ct value in each gene;
(b) storage means for storing the constructed discriminant,
(c) applying data input using the input means of (a) to the discriminant stored in the storage means of (b), data processing means for determining the pathological condition of colorectal cancer, and
(d) an output means for outputting the predicted colorectal cancer pathological condition prediction, pathological condition prediction, and prognosis prediction;
It is a system including
(a)のデータを入力する手段は、キーボード又はデータを記憶した外部記憶装置等を含む。(b)の記憶手段はハードディスク等を含む。データ処理手段は、記憶手段から判別モデルを受け取るとともに、入力されたデータを処理して、処理結果を出力手段に送り、出力手段で処理結果が表示される。データ処理手段は、データを演算処理する中央演算処理装置（CPU）等を含む。また、出力手段は、結果を表示するモニタやプリンタを含む。 The means for inputting data in (a) includes a keyboard or an external storage device storing data. The storage means (b) includes a hard disk or the like. The data processing means receives the discrimination model from the storage means, processes the input data, sends the processing result to the output means, and the processing result is displayed by the output means. The data processing means includes a central processing unit (CPU) that performs arithmetic processing on data. The output means includes a monitor and a printer for displaying the result.
本発明のシステムは、市販のパーソナルコンピュータ等を用いて構築することが可能である。 The system of the present invention can be constructed using a commercially available personal computer or the like.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
本実施例において、用いた材料及び実験の方法は以下の通りであった。
対象
医師が大腸癌と診断した患者から採取した血液を大腸癌症例とした。対照群としては自治体主催における住民健診において同意を得た受診者の善意により提供された血液を下記検査項目により検索し正常値を示した受診者のみを健常人とした。
In this example, the materials used and the experimental methods were as follows.
Subjects Blood collected from patients diagnosed with colorectal cancer by a doctor was taken as a colorectal cancer case. As a control group, the blood provided by the good will of the examinees who obtained consent from the local government-sponsored medical checkups was searched according to the following test items, and only those who showed normal values were considered healthy.
検査項目
収縮期血圧、拡張期血圧、赤血球数、白血球数、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値、肝機能（GOT、GPT、γ-GTP）、腎機能（クレアチニン値）、脂質代謝（ＬＤＬ-c、ＨＤＬ-c、総コレステロール値）、尿タンパク、尿鮮血
Test items Systolic blood pressure, diastolic blood pressure, red blood cell count, white blood cell count, hemoglobin level, hematocrit level, liver function (GOT, GPT, γ-GTP), renal function (creatinine level), lipid metabolism (LDL-c, HDL- c, total cholesterol level), urine protein, urine fresh blood
末梢血液採取およびRNA抽出
パクスジーンRNA採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社 医療機器製造販売認証番号：218AFBZX00014000）を用いて、患者より末梢血液を採取した。
Peripheral blood collection and RNA extraction Peripheral blood was collected from a patient using a Paxgene RNA blood collection tube (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Medical Device Manufacturing and Sales Certification Number: 218AFBZX00014000).
RNA抽出及びハイブリダイゼーション
パクスジーンRNA採血管よりPAXgene Blood RNA Kit（PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，Switzerland）を用いて、プロトコールにしたがってRNAを抽出した。
RNA extraction and hybridization RNA was extracted from a Paxgene RNA blood collection tube using the PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Switzerland) according to the protocol.
マイクロアレイ解析
抽出したRNAを元にQuickAmp Labeling Kit，1color（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いてRNAを増幅し、同時にCy3色素にてラベル化を行った。ラベル化RNAをGene Expression Hybridization Kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を使用して混合した後、Whole Human Genomeマイクロアレイ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイによる解析は大腸癌検体12例、健常人検体13例を行った。なお、RNAの増幅からハイブリダイゼーションまでの行程はAgilent Technologiesが公表している実験プロトコールに従って作業を行った。
Microarray analysis Based on the extracted RNA, RNA was amplified using QuickAmp Labeling Kit, 1color (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.), And simultaneously labeled with Cy3 dye. Labeled RNA was mixed using Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.), And then hybridized to Whole Human Genome microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.). Microarray analysis was performed on 12 colorectal cancer specimens and 13 healthy subject specimens. The steps from RNA amplification to hybridization were performed according to an experimental protocol published by Agilent Technologies.
マイクロアレイのイメージ解析及び遺伝子の選出
マイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度はマイクロアレイスキャナ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にて獲得した。獲得したイメージはFeature Extraction ソフトウェア（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にて各スポットの蛍光強度の数値化を行った。この数値化により、そのスポット上に配置されているプローブの蛍光強度が算定された。
Microarray image analysis and gene selection The fluorescence intensity of each spot on the microarray was acquired with a microarray scanner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The acquired images were digitized for the fluorescence intensity of each spot using Feature Extraction software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). By this numerical conversion, the fluorescence intensity of the probe arranged on the spot was calculated.
GeneSpring GX（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて、マイクロアレイ上の全プローブの蛍光強度数値のノーマライゼーションを行った。 GeneSpring GX (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) was used to normalize the fluorescence intensity values of all probes on the microarray.
各プローブの発現増強減弱を示すノーマライズされた数値を元に各プローブの蛍光強度およびFlag情報から各遺伝子発現量の解析を行い、大腸癌群と健常人群とで遺伝子発現量に差がある解析結果となった遺伝子を365個選出した。 Analyze each gene expression from the fluorescence intensity and Flag information of each probe based on normalized values indicating the expression enhancement and attenuation of each probe, and there is a difference in gene expression between colorectal cancer group and healthy group 365 genes were selected.
リアルタイムPCRによる遺伝子発現量の測定
上記365個の遺伝子にハウスキーピング遺伝子15個、実験コントロール3個、18SrRNAを1個追加し合計384個とし、これら384個について一度にリアルタイムPCRでの測定が可能なCustom Profiler RT2 PCR Arrays（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を用いて癌症例および健常人に関して遺伝子発現量の測定を行った。リアルタイムPCR装置はLightCycler（登録商標） 480 リアルタイムPCRシステム（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland）を使用した。リアルタイムPCRによる測定は大腸癌検体22例、健常人検体27例を行った。なお、リアルタイムPCRにおける測定作業はQIAGENが公表しているRT2 HT First Strand HandbookおよびRT2 Profiler PCR Array Handbookに従った。
Measurement of gene expression by real-time PCR 15 housekeeping genes, 3 experimental controls and 1 18S rRNA are added to the above 365 genes for a total of 384. Real-time PCR can be measured for these 384 at once. The gene expression level was measured for cancer cases and healthy individuals using Custom Profiler RT 2 PCR Arrays (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). As the real-time PCR apparatus, a LightCycler (registered trademark) 480 real-time PCR system (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland) was used. Measurement by real-time PCR was performed on 22 colorectal cancer samples and 27 healthy subjects. The measurement work in real-time PCR was in accordance with RT 2 HT First Strand Handbook and RT 2 Profiler PCR Array Handbook published by QIAGEN.
リアルタイムPCRによる遺伝子発現量測定結果の解析および大腸癌特異的遺伝子の選出
まずハウスキーピング遺伝子15個の中からコントロール遺伝子として測定数値（Ct値）の標準化に使用するコントロール遺伝子を設定した後に、リアルタイムPCRによる測定をおこなった365個の遺伝子のCt値をコントロール遺伝子のCt値で標準化した。その標準化された数値を用いて統計的手法による解析を行った結果、大腸癌特異的遺伝子を選出した。
Analysis of gene expression level measurement results by real-time PCR and selection of colorectal cancer-specific genes First, set a control gene to be used for standardization of measurement values (Ct values) from 15 housekeeping genes, then real-time PCR The Ct values of 365 genes measured by the above were standardized with the Ct values of control genes. As a result of statistical analysis using the standardized values, colon cancer specific genes were selected.
本実施例において以下の結果が得られた。
コントロール遺伝子
ハウスキーピング遺伝子15個の中で、大腸癌検体22例におけるCt値の平均が24.72、健常人検体27例におけるCt値の平均が24.59であり、大腸癌群と健常人群との有意差検定におけるp値が0.5056であり有意差が無いことが確認できたことから、コントロール遺伝子を「GAPDH」に決定した。
In this example, the following results were obtained.
Control genes Among 15 housekeeping genes, the average Ct value in 22 colorectal cancer specimens was 24.72, and the average Ct value in 27 healthy specimens was 24.59. Since it was confirmed that the p-value was 0.5056 and there was no significant difference, the control gene was determined to be “GAPDH”.
大腸癌特異的遺伝子
大腸癌検体22例、健常人検体27例のリアルタイムPCRの測定結果から得られたCt値を標準化し統計的解析手法により解析した結果、リストにある35個の遺伝子を大腸癌特異的遺伝子として選出した。選出した遺伝子を表３に示す。
Colorectal cancer specific genes Standardized Ct values obtained from real-time PCR measurement results of 22 colorectal cancer specimens and 27 healthy human specimens, and analyzed by statistical analysis methods. Selected as a specific gene. Table 3 shows the selected genes.
このうち、大腸癌が陽性／陰性の判定には以下の2セットのいずれかの遺伝子群を用いて判定を行う事ができる。
＜セットA＞
No.1〜20までの20遺伝子
＜セットB＞
No.3、4、8、10及び20〜35までの20遺伝子
Among these, the determination of positive / negative colorectal cancer can be performed using one of the following two sets of gene groups.
<Set A>
20 genes from No. 1 to 20 <Set B>
No.3, 4, 8, 10, and 20 genes from 20 to 35
大腸癌判定式および判定結果
大腸癌の陽性／陰性の判定には、以下の判別式を使用する。判別式の構築方法の詳細については後述する。
式 ： intercept + Σ(beta i × X i) > 0 ならば 大腸癌陽性
[式Ｉにおいて、intercept は定数、beta iは２０個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは２０個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは２０個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す。]
Colorectal cancer judgment formula and judgment result The following discriminant formula is used for the positive / negative judgment of colorectal cancer. Details of the discriminant construction method will be described later.
Expression: If intercept + Σ (beta i × X i)> 0, colorectal cancer is positive
[In Formula I, intercept is a constant, beta i is a coefficient for the i-th gene of 20 genes, x i is the normalized Ct value of the i-th gene of 20 genes, and Σ is the value of 20 genes. Indicates that the total of beta x X of each gene is added. ]
セットAの場合はIntercept=1.947970595であり、セットBの場合はIntercept=1.507712014となる。betaはそれぞれ表４の通りである。遺伝子セットＡ及び遺伝子セットＢに対する判別式を、それぞれ、判別式Ａ及び判別式Ｂと呼ぶ。 In the case of set A, Intercept = 1.947970595, and in the case of set B, Intercept = 1.507712014. Each beta is as shown in Table 4. The discriminants for gene set A and gene set B are called discriminant A and discriminant B, respectively.
これらの判別式を用いてクロスバリデーションによる感度・特異度の推定を大腸癌検体22例、健常人検体27例に行ったところ、以下の結果となった。
大腸癌検体22例中陽性20例、陰性2例
健常人検体27例中陽性1例、陰性26例
この結果より、この判別式の感度は91％、特異度は96％となった。
When these discriminants were used to estimate sensitivity and specificity by cross-validation in 22 colorectal cancer samples and 27 healthy human samples, the following results were obtained.
Of the 22 colorectal cancer specimens, 20 were positive, 2 were negative, 1 was positive in 27 healthy specimens, and 26 were negative. From this result, the sensitivity of this discriminant was 91% and the specificity was 96%.
以下に大腸癌検出のための判別式の作成方法について詳細に記す。
金沢大学及び関連医療機関による臨床研究に登録され、マイクロアレイ解析が実施された大腸癌検体12例、健常人検体13例に対し、両群で発現量に大きな差が認められた345個の遺伝子を選抜した。これに、ハウスキーピング遺伝子15個を加えた合計380個からなる遺伝子セットに対し、大腸癌検体22例、健常人検体27例（合計49例）を対象として、リアルタイムPCRによって遺伝子発現量を測定した。
The method for creating a discriminant for detecting colorectal cancer is described in detail below.
For 12 colorectal cancer specimens registered in clinical research by Kanazawa University and related medical institutions and subjected to microarray analysis, and 13 healthy specimens, 345 genes whose expression levels were significantly different in both groups Selected. The gene expression level was measured by real-time PCR for 22 colorectal cancer specimens and 27 healthy subject specimens (total 49 cases) for a total of 380 gene sets including 15 housekeeping genes. .
リアルタイムPCR解析の対象である49例に対して、代表的な機械学習法の一つである線形カーネルをもつサポートベクターマシン（support vector machine）[Hastie T et al., Inference, and Prediction, 2nd edn. Springer, New York, 2009]を用いて判別式を作製した。全49例の内、一つの検体をテストセット、残り全てを訓練セットとする交差検証法（leave-one-out cross-validation; LOOCV）を実施した。判別に用いる遺伝子の選択には、逐次変数消去法（recursive feature elimination）[Guyon I et al., Machine Learning, 2002; 46: 389-422.]を用い、交差検証のステップ毎に遺伝子を選択した。判別精度の評価には、感度、特異度を用いた。判別に用いる遺伝子数を変化させたところ、LOOCVによる判別精度は遺伝子数が16個程度でほぼピークとなり、それ以上では判別精度はほぼ横ばいであった。この種の高次元データの判別解析では、判別に役立たない遺伝子（偽陽性）を多少選択しても、判別に役立つ遺伝子（真陽性）を取り逃がさないことがより重要との議論 [Simon R., Journal of Clinical Oncology, 2005; 23: 7332-41.]があること、49例という比較的小さなサンプルでの解析であること、最終製品で想定される測定コスト等を考慮して、やや多めの20個の遺伝子を用いるのが妥当と判断した。このときの感度は0.91、特異度は0.96であった。 Against 49 example is the subject of the real-time PCR analysis, typical support vector machine (support vector machine) with linear kernel, which is one of machine learning methods [Hastie T et al., Inference , and Prediction, 2 nd Edn. Springer, New York, 2009] was used to create the discriminant. A cross-validation method (LOOCV) was performed with one specimen as the test set and the rest as the training set among all 49 cases. For selection of genes used for discrimination, recursive feature elimination [Guyon I et al., Machine Learning, 2002; 46: 389-422.] Was used, and genes were selected at each cross-validation step. . Sensitivity and specificity were used for evaluation of discrimination accuracy. When the number of genes used for discrimination was changed, the discrimination accuracy by LOOCV reached a peak when the number of genes was about 16, and beyond that, the discrimination accuracy was almost flat. In this type of discriminant analysis of high-dimensional data, it is more important that genes that are useful for discrimination (true positives) are not missed even if some genes that are not useful for discrimination (false positives) are selected [Simon R. , Journal of Clinical Oncology, 2005; 23: 7332-41.] Considering the analysis with 49 relatively small samples and the expected measurement cost of the final product, a little more It was judged appropriate to use 20 genes. At this time, the sensitivity was 0.91 and the specificity was 0.96.
最後に、全49例を訓練セットとみなして、サポートベクターマシンを適用し、逐次変数消去法により20個の遺伝子を選択した。これより得られる判別式を将来の患者の判別に用いる判別式とした（判別式Ａ）。 Finally, all 49 cases were regarded as a training set, a support vector machine was applied, and 20 genes were selected by the sequential variable elimination method. The discriminant obtained from this was used as a discriminant used for discriminating future patients (discriminant A).
一方、上記の判別解析における解析対象49例のうち、23例（大腸癌検体10例、健常人検体13例）は先のマイクロアレイ解析で既に解析対象となっており、380個（正確にはハウスキーピング遺伝子を除いた345個）の遺伝子の選抜に用いられている。これより、これらの検体は、リアルタイムPCR解析においては常に訓練セットとみなすべきとも考えられる。そこで、参考解析として、この23例のみを訓練セットに用いた判別アルゴリズムの作製を上記のサポートベクターマシン、逐次変数消去法を用いて行った。残りの検体（新規にリアルタイムPCR解析の対象となった26例）をテストセットとして判別精度を評価したところ、遺伝子数と判別精度の傾向は先の判別解析とほぼ同様であった。そこで、ここでも遺伝子数は20個が妥当と判断し、このときの判別式も作製した（判別式Ｂ）。なお、感度は0.83、特異度は1.00であった。 On the other hand, out of 49 analysis targets in the above discriminant analysis, 23 cases (10 colorectal cancer specimens and 13 healthy specimens) have already been analyzed in the previous microarray analysis, and 380 (accurately house) It is used for selection of 345 genes excluding keeping genes). Therefore, it is considered that these specimens should always be regarded as a training set in real-time PCR analysis. Therefore, as a reference analysis, a discriminant algorithm using only these 23 cases as a training set was prepared using the support vector machine and the sequential variable elimination method described above. When the remaining specimens (26 cases newly targeted for real-time PCR analysis) were used as test sets, the discrimination accuracy was evaluated. The trends in the number of genes and discrimination accuracy were almost the same as in the previous discriminant analysis. Therefore, it was judged that 20 genes were appropriate here, and a discriminant at this time was also prepared (discriminant B). The sensitivity was 0.83 and the specificity was 1.00.
本発明により、低侵襲で簡便かつ高精度な大腸癌検出が可能になる。 The present invention makes it possible to detect colorectal cancer with minimal invasiveness and with high accuracy.
Claims (9)
遺伝子セットＡ
（１）Chromosome 21 open reading frame 56（C21orf56）
（２）CD69 molecule（CD69）
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（５）Forkhead box O1（FOXO1）
（６）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2（IMPDH2）
（７）Late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3（LAMTOR3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（９）Leucine rich repeat containing 68（LRRC68）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（１１）N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) （NAT1）
（１２）NDRG family member 2（NDRG2）
（１３）Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) （PLCB1）
（１４）Regulator of G-protein signaling 18（RGS18）
（１５）Ribosomal protein S27-like（RPS27L）
（１６）Ribosomal protein S4, Y-linked 1（RPS4Y1）
（１７）Ribosomal L24 domain containing 1（RSL24D1）
（１８）Sterile alpha motif domain containing 9（SAMD9）
（１９）SUB1 homolog (S. cerevisiae) （SUB1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
遺伝子セットＢ
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
（２１）AE binding protein 1（AEBP1）
（２２）Annexin A1（ANXA1）
（２３）BCL2-related protein A1（BCL2A1）
（２４）Centromere protein Q（CENPQ）
（２５）C-type lectin domain family 4, member D（CLEC4D）
（２６）Chromosome Y open reading frame 15B（CYorf15B）
（２７）D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein（DBP）
（２８）Interleukin 24（IL24）
（２９）Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin)（ITGB3BP）
（３０）Mitochondrial ribosomal protein S28（MRPS28）
（３１）S100 calcium binding protein A12（S100A12）
（３２）S100 calcium binding protein A8（S100A8）
（３３）Thioredoxin（TXN）
（３４）X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4（XRCC4）
（３５）Zinc finger protein 584（ZNF584） A reagent for measuring the expression level of only 20 genes of the following 20 gene sets A or 20 gene sets B, and detecting colon cancer based on the expression level, Reagent for detecting colorectal cancer comprising a nucleotide comprising the nucleotide sequence of 20 genes of gene set A or 20 gene sets B or a nucleotide comprising a partial sequence thereof:
Gene set A
(1) Chromosome 21 open reading frame 56 (C21orf56)
(2) CD69 molecule (CD69)
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(5) Forkhead box O1 (FOXO1)
(6) IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2)
(7) Late endosomal / lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3 (LAMTOR3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(9) Leucine rich repeat containing 68 (LRRC68)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(11) N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT1)
(12) NDRG family member 2 (NDRG2)
(13) Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) (PLCB1)
(14) Regulator of G-protein signaling 18 (RGS18)
(15) Ribosomal protein S27-like (RPS27L)
(16) Ribosomal protein S4, Y-linked 1 (RPS4Y1)
(17) Ribosomal L24 domain containing 1 (RSL24D1)
(18) Sterile alpha motif domain containing 9 (SAMD9)
(19) SUB1 homolog (S. cerevisiae) (SUB1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
Gene set B
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
(21) AE binding protein 1 (AEBP1)
(22) Annexin A1 (ANXA1)
(23) BCL2-related protein A1 (BCL2A1)
(24) Centromere protein Q (CENPQ)
(25) C-type lectin domain family 4, member D (CLEC4D)
(26) Chromosome Y open reading frame 15B (CYorf15B)
(27) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (DBP)
(28) Interleukin 24 (IL24)
(29) Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin) (ITGB3BP)
(30) Mitochondrial ribosomal protein S28 (MRPS28)
(31) S100 calcium binding protein A12 (S100A12)
(32) S100 calcium binding protein A8 (S100A8)
(33) Thioredoxin (TXN)
(34) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (XRCC4)
(35) Zinc finger protein 584 (ZNF584)
遺伝子セットＡ
（１）Chromosome 21 open reading frame 56（C21orf56）
（２）CD69 molecule（CD69）
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（５）Forkhead box O1（FOXO1）
（６）IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2（IMPDH2）
（７）Late endosomal/lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3（LAMTOR3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（９）Leucine rich repeat containing 68（LRRC68）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（１１）N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) （NAT1）
（１２）NDRG family member 2（NDRG2）
（１３）Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) （PLCB1）
（１４）Regulator of G-protein signaling 18（RGS18）
（１５）Ribosomal protein S27-like（RPS27L）
（１６）Ribosomal protein S4, Y-linked 1（RPS4Y1）
（１７）Ribosomal L24 domain containing 1（RSL24D1）
（１８）Sterile alpha motif domain containing 9（SAMD9）
（１９）SUB1 homolog (S. cerevisiae) （SUB1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
遺伝子セットＢ
（３）COMM domain containing 8（COMMD8）
（４）Fas apoptotic inhibitory molecule 3（FAIM3）
（８）Lysophosphatidic acid receptor 6（LPAR6）
（１０）Melanoma antigen family D, 1（MAGED1）
（２０）XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked（XKRX）
（２１）AE binding protein 1（AEBP1）
（２２）Annexin A1（ANXA1）
（２３）BCL2-related protein A1（BCL2A1）
（２４）Centromere protein Q（CENPQ）
（２５）C-type lectin domain family 4, member D（CLEC4D）
（２６）Chromosome Y open reading frame 15B（CYorf15B）
（２７）D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein（DBP）
（２８）Interleukin 24（IL24）
（２９）Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin)（ITGB3BP）
（３０）Mitochondrial ribosomal protein S28（MRPS28）
（３１）S100 calcium binding protein A12（S100A12）
（３２）S100 calcium binding protein A8（S100A8）
（３３）Thioredoxin（TXN）
（３４）X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4（XRCC4）
（３５）Zinc finger protein 584（ZNF584）。 A method of measuring the expression level of only 20 genes of the following 20 gene sets A or 20 gene sets B in a subject and detecting colorectal cancer based on the expression level:
Gene set A
(1) Chromosome 21 open reading frame 56 (C21orf56)
(2) CD69 molecule (CD69)
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(5) Forkhead box O1 (FOXO1)
(6) IMP (inosine 5'-monophosphate) dehydrogenase 2 (IMPDH2)
(7) Late endosomal / lysosomal adaptor, MAPK and MTOR activator 3 (LAMTOR3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(9) Leucine rich repeat containing 68 (LRRC68)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(11) N-acetyltransferase 1 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT1)
(12) NDRG family member 2 (NDRG2)
(13) Phospholipase C, beta 1 (phosphoinositide-specific) (PLCB1)
(14) Regulator of G-protein signaling 18 (RGS18)
(15) Ribosomal protein S27-like (RPS27L)
(16) Ribosomal protein S4, Y-linked 1 (RPS4Y1)
(17) Ribosomal L24 domain containing 1 (RSL24D1)
(18) Sterile alpha motif domain containing 9 (SAMD9)
(19) SUB1 homolog (S. cerevisiae) (SUB1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
Gene set B
(3) COMM domain containing 8 (COMMD8)
(4) Fas apoptotic inhibitory molecule 3 (FAIM3)
(8) Lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6)
(10) Melanoma antigen family D, 1 (MAGED1)
(20) XK, Kell blood group complex subunit-related, X-linked (XKRX)
(21) AE binding protein 1 (AEBP1)
(22) Annexin A1 (ANXA1)
(23) BCL2-related protein A1 (BCL2A1)
(24) Centromere protein Q (CENPQ)
(25) C-type lectin domain family 4, member D (CLEC4D)
(26) Chromosome Y open reading frame 15B (CYorf15B)
(27) D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein (DBP)
(28) Interleukin 24 (IL24)
(29) Integrin beta 3 binding protein (beta3-endonexin) (ITGB3BP)
(30) Mitochondrial ribosomal protein S28 (MRPS28)
(31) S100 calcium binding protein A12 (S100A12)
(32) S100 calcium binding protein A8 (S100A8)
(33) Thioredoxin (TXN)
(34) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 (XRCC4)
(35) Zinc finger protein 584 (ZNF584).
（１）被験体より採取した末梢血細胞よりmRNAを抽出する工程；
（２）遺伝子セットＡの２０個の遺伝子又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子をPCRにより増幅し、Ct（Cycle threshold）値を得て、GAPDH等のハウスキーピング遺伝子のCt値により標準化し、標準化Ct値を得る工程；
（３）遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの各遺伝子の標準化Ct値を判別式に代入し、大腸癌が陽性である確率を算出する工程。 The method for detecting colorectal cancer according to any one of claims 3 to 5, comprising the following steps:
(1) A step of extracting mRNA from peripheral blood cells collected from a subject;
(2) 20 genes of gene set A or 20 genes of gene set B are amplified by PCR, Ct (Cycle threshold) value is obtained, standardized by Ct value of housekeeping gene such as GAPDH, and standardized Obtaining a Ct value;
(3) A step of substituting the standardized Ct value of each gene of gene set A or gene set B into a discriminant and calculating the probability that colorectal cancer is positive.
式：intercept + Σ(beta i × X i)
[式において、intercept は定数、beta iは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のi番目の遺伝子に対する係数、ｘ iは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のi番目の遺伝子の標準化Ct値であり、Σは遺伝子セットＡ又は遺伝子セットＢの２０個の遺伝子のそれぞれの遺伝子のbeta × Xを合計することを示す]。 The method for detecting colorectal cancer according to claim 6, wherein colorectal cancer is detected using the following discriminant, and it is determined that colorectal cancer is positive when a numerical value calculated from the following discriminant is greater than 0: The method for detecting colorectal cancer according to claim 6, wherein:
Expression: intercept + Σ (beta i × X i)
[In the formula, intercept is a constant, beta i is a coefficient for the ith gene of 20 genes in gene set A or gene set B, and xi is the i th gene of 20 genes in gene set A or gene set B. It is the standardized Ct value of the gene, and Σ indicates the total of beta × X of each of the 20 genes in gene set A or gene set B].
intercept: 1.947970595
intercept: 1.947970595
intercept：1.507712014
intercept ： 1.507712014
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014265856A JP5861048B1 (en) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | Detection of colorectal cancer by gene expression analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014265856A JP5861048B1 (en) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | Detection of colorectal cancer by gene expression analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP5861048B1 true JP5861048B1 (en) | 2016-02-16 |
| JP2016123311A JP2016123311A (en) | 2016-07-11 |
Family
ID=55305487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014265856A Active JP5861048B1 (en) | 2014-12-26 | 2014-12-26 | Detection of colorectal cancer by gene expression analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5861048B1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011024618A1 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | 国立大学法人金沢大学 | Detection of digestive system cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, and biliary tract cancer by means of gene expression profiling |
| WO2013132074A2 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Integragen | A genotyping test for assessing risk of autism |
| JP2014204728A (en) * | 2006-11-24 | 2014-10-30 | エピゲノミクス アーゲー | Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the development of prostate cell proliferative disorders |
-
2014
- 2014-12-26 JP JP2014265856A patent/JP5861048B1/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014204728A (en) * | 2006-11-24 | 2014-10-30 | エピゲノミクス アーゲー | Methods and nucleic acids for the analysis of gene expression associated with the development of prostate cell proliferative disorders |
| WO2011024618A1 (en) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | 国立大学法人金沢大学 | Detection of digestive system cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, and biliary tract cancer by means of gene expression profiling |
| WO2013132074A2 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Integragen | A genotyping test for assessing risk of autism |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6015016895; 金沢大学十全医学会雑誌 第１２０巻、第２号, 2011, ６２〜６６頁 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016123311A (en) | 2016-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7042784B2 (en) | How to Quantify Prostate Cancer Prognosis Using Gene Expression | |
| US20200191791A1 (en) | Method for diagnosing lung cancers using gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells | |
| JP6404304B2 (en) | Prognosis prediction of melanoma cancer | |
| US10196691B2 (en) | Colon cancer gene expression signatures and methods of use | |
| CA2776751C (en) | Methods to predict clinical outcome of cancer | |
| JP2019013255A (en) | Gene expression profile algorithm and test for determining prognosis of prostate cancer | |
| JP4913331B2 (en) | Prognosis of colorectal cancer | |
| JP2009528825A (en) | Molecular analysis to predict recurrence of Dukes B colorectal cancer | |
| JP5852759B1 (en) | Detection of pancreatic cancer by gene expression analysis | |
| EP2304630A1 (en) | Molecular markers for cancer prognosis | |
| EP2754720A1 (en) | Prostate cancer survival and recurrence | |
| JP5970123B1 (en) | Detection of pancreatic cancer by gene expression analysis | |
| CN111269985A (en) | Application of hsa _ circRNA6448-14 in diagnosis and prognosis prediction of esophageal squamous cell carcinoma | |
| US20180051342A1 (en) | Prostate cancer survival and recurrence | |
| US20210079479A1 (en) | Compostions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| JP5861048B1 (en) | Detection of colorectal cancer by gene expression analysis | |
| JP6392201B2 (en) | Detection of pancreatic cancer by gene expression analysis | |
| JPWO2007088971A1 (en) | Genes that can be used for cancer prognosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150714 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5861048 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |