JP5858908B2 - Kit and method for preparing cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote - Google Patents
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Description
本発明は、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット及び方法に関する。 The present invention relates to a kit and a method for producing a cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote.
また、本発明は、カニクイザルの集団及びその維持方法、カニクイザルの集団の各種モデル動物としての使用に関する。 The present invention also relates to a group of cynomolgus monkeys and a method for maintaining the same, and the use of the group of cynomolgus monkeys as various model animals.
再生医療及び癌治療等の研究において、個体間で細胞移植を行うための実験動物モデルが必要とされている。このような実験動物モデルとしては遺伝的に均一な動物である、いわゆる純系動物が好ましいとされる。移植により拒絶反応が起こると実験に支障をきたすからである。 In research such as regenerative medicine and cancer treatment, an experimental animal model for performing cell transplantation between individuals is required. As such an experimental animal model, a so-called pure animal which is a genetically uniform animal is preferable. This is because if transplantation causes rejection, the experiment will be hindered.
マウスのような小型実験動物では、長期間近親交配を繰り返すことによって、対立遺伝子が全て同一になったホモ結合体を作り出すことができる。このため、前述の目的で使用される実験動物モデルとしては従来から小型動物であるマウスが使用されてきた。 In small laboratory animals such as mice, homozygotes in which alleles are all identical can be produced by repeated inbreeding for a long time. For this reason, mice that are small animals have been used as experimental animal models used for the above-mentioned purposes.
一方で、ヒトにより近い中型以上の実験動物モデルの構築が長らく課題とされてきた。しかしながら、中型以上の動物は長期間近親交配を繰り返すと遺伝子異常がみられるなどの問題が生じるため、純系動物を作製することは困難とされる。 On the other hand, the construction of medium-sized and larger experimental animal models closer to humans has long been a challenge. However, it is difficult to produce a pure strain of animals of medium size or larger because problems such as abnormal genes appear when long-term inbreeding is repeated.
カニクイザルは真猿類狭鼻類オナガザル上科オナガザル科マカカ属サルに属し、形態（目、指紋、掌紋、内臓及び歯式等）、生理（内分泌及び代謝等）、知能、並びに疾患等においてヒトとの間に類似性又は近似性が認められる。このため、実験動物として非常に有用であるとされる。 The cynomolgus monkey belongs to the macaque monkey genus of the monkey nasal rhinoceros superfamily, rhesus macaque, and has morphologies (eyes, fingerprints, palm prints, viscera, dental formulas, etc.), physiology (endocrine and metabolism, etc.), intelligence, and diseases. Similarity or closeness is observed between them. For this reason, it is said that it is very useful as an experimental animal.
しかしながら、カニクイザルは中型動物であるだけでなく、排卵周期が約２８日、妊娠期間が約１６０日と比較的長く、加えて出産個体数が１頭であるなど、マウスをはじめとするげっ歯類やイヌをはじめとする食肉目等に比べても繁殖効率の面で難があることが知られている。このため、従来の方法によって純系動物を取得することは非常に困難であった。 However, cynomolgus monkeys are not only medium-sized animals, but also have a relatively long ovulation cycle of about 28 days, a gestation period of about 160 days, and a single birthing animal. It is known that there are difficulties in breeding efficiency compared to meat and dogs. For this reason, it was very difficult to obtain a pure animal by a conventional method.
このため、カニクイザルについては個体間で移植を行う等の、拒絶反応が問題となるような実験を行うことができなかった。 For this reason, for cynomolgus monkeys, it was not possible to conduct experiments in which rejection was a problem, such as transplantation between individuals.
本発明は、個体間で移植を行っても拒絶反応の起こらないカニクイザル集団を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a cynomolgus monkey population in which rejection does not occur even if transplantation is performed between individuals.
本発明者らは、純系動物をわざわざ得るまでもなく、MHC全遺伝子に関してホモ接合体であるカニクイザルを安定的に供給しうるシステムを構築することにより上記課題を解決するという従来なかった新しい解決手段を着想した。しかしながら、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を安定的に供給するという技術的手段は未だかつて全く知られておらず、本発明者らはその具現化のため多大な試行錯誤を余儀なくされた。 The inventors of the present invention have not been able to bother purely animals, and a new solution to solve the above problem by constructing a system capable of stably supplying cynomolgus monkeys that are homozygous for all MHC genes. Inspired. However, the technical means of stably supplying the cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote has not been known at all, and the present inventors have been forced to make a great deal of trial and error for its realization.
膨大な労力と時間を投入して精力的に調査を行った結果、本発明者らは最終的に全MHC遺伝子に関してホモ接合体である雄カニクイザル及び雌カニクイザルを新たに見出すことに成功した。それぞれ別個に200分の１の確率でしか存在しない雌雄のカニクイザルを両方とも発見したことになる。また、雌雄がつがいの形で存在している確率は計算上わずか40,000分の１にすぎない。本発明者らは、このつがいのカニクイザルを利用することにより特定のMHC遺伝子に関してホモ接合体であるカニクイザルを安定的に供給しうるシステムを構築でき、ひいては前述の課題を解決できることに思い至った。 As a result of investigating enormously with a great deal of effort and time, the present inventors finally succeeded in finding new male and female cynomolgus monkeys that are homozygous for all MHC genes. Both male and female cynomolgus monkeys have been discovered, each with a probability of only 200 times. Moreover, the probability that a male and female exist in the form of a pair is only 1 / 40,000 in calculation. The present inventors have come up with the idea that by utilizing this paired cynomolgus monkey, a system capable of stably supplying a cynomolgus monkey that is homozygous for a specific MHC gene can be constructed, and thus the above-mentioned problems can be solved.
本発明はかかる知見に基づきさらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
［項１］
（Ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザル；及び
（Ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザル
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。
［項２］
（ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子；及び
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。
［項３］
（ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子；及び
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を受精させて得られうる受精卵。
［項４］
項３記載の受精卵を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。
［項５］
（ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子；及び
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を受精させる工程を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の作製方法。
［項６］
項５の方法により得られうるカニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体。
［項７］
（Ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザル；及び
（Ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザル
を含む、カニクイザルの集団。
［項８］
MHC全遺伝子以外の遺伝子は不均質（heterogeneous）である、項７に記載の集団。
［項９］
項７に記載のカニクイザルの集団のモデル動物としての使用であって、移植、再生医療、癌、骨髄移植及び感染症からなる群から選ばれるいずれかのモデル動物としての使用。
［項１０］
項７に記載のカニクイザルの集団の維持方法であって、配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子と配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子を体外受精により受精させ、受精卵を雌のカニクイザルの子宮内に移して胎児を発生させることを特徴とする、方法。The present invention has been completed as a result of further studies based on such knowledge, and is described below.
[Claim 1]
(A) at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10; and (B) MHC comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey that is homozygous for all genes.
[Section 2]
(A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
[Section 3]
(A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A fertilized egg obtainable by fertilizing at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
[Claim 4]
A kit for preparing a cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote comprising the fertilized egg according to Item 3.
[Section 5]
(A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A method for producing a cynomolgus monkey MHC all-gene homozygote comprising a step of fertilizing at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
[Claim 6]
A cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote obtainable by the method of Item 5.
[Claim 7]
(A) at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10; and (B) MHC comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10. A population of cynomolgus monkeys comprising at least one female cynomolgus monkey that is homozygous for all genes.
[Section 8]
Item 8. The population according to Item 7, wherein genes other than all MHC genes are heterogeneous.
[Claim 9]
Use of the cynomolgus monkey population according to Item 7 as a model animal, wherein the cynomolgus monkey population is selected from the group consisting of transplantation, regenerative medicine, cancer, bone marrow transplantation, and infectious diseases.
[Section 10]
The cynomolgus monkey population maintenance method according to Item 7, wherein at least one male cynomolgus sperm homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 and SEQ ID NOs: 1 to Fertilizing at least one female cynomolgus monkey egg homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequence represented by 10 by in vitro fertilization and transferring the fertilized egg into the uterus of a female cynomolgus monkey A method characterized by.
本発明のキット及び作製方法を用いると、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を多数作製することができる。カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体が多数存在していると、それらの個体間で移植を行ったとしても拒絶反応が起こらないため、再生医療や癌治療等の研究のための強力なツールとなりうる。 By using the kit and production method of the present invention, a large number of cynomolgus monkey MHC whole gene homozygotes can be produced. If many cynomolgus monkey MHC homozygotes exist, even if transplantation is performed between these individuals, rejection does not occur, which can be a powerful tool for research such as regenerative medicine and cancer treatment.
これらのカニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を使用して得られたデータは、ヒトに容易に外挿することができる。このため、動物実験からヒトの治療への移行に要する期間が飛躍的に短縮されうる。 Data obtained using these cynomolgus monkey MHC whole gene homozygotes can be easily extrapolated to humans. For this reason, the period required for the transition from animal experiments to human treatment can be dramatically shortened.
Ｉ．キット
本発明のキットは、次の通りである。
＜キット１＞
（Ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザル；及び
（Ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザル
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。
＜キット２＞
（ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子；及び
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。
＜キット３＞
（ａ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雄カニクイザルの精子；及び
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を受精させて得られうる受精卵を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。I. Kit The kit of the present invention is as follows.
<Kit 1>
(A) at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10; and (B) MHC comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey that is homozygous for all genes.
<Kit 2>
(A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
<Kit 3>
(A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for preparing a cynomolgus monkey MHC all gene homozygote comprising a fertilized egg that can be obtained by fertilizing an egg of at least one female cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene.
１．配列番号１〜１０で表されるDNA配列
それぞれ配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなる遺伝子群は、カニクイザルの全てのMHC遺伝子（本発明において「MHC全遺伝子」という。）に相当する。1. The gene group consisting of the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 respectively corresponding to the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 corresponds to all MHC genes of cynomolgus monkeys (referred to as “MHC all genes” in the present invention). .
配列番号１はMHCクラスIIβ鎖（MHC class II antigen beta chain）であるMafa-DPB1遺伝子のMafa-DPB1*49アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 1 is a DNA sequence called the Mafa-DPB1 * 49 allele of the Mafa-DPB1 gene, which is an MHC class II β beta chain.
配列番号２はMHCクラスIIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-DPA1遺伝子のMafa-DPA1*0205アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 2 is a DNA sequence called the Mafa-DPA1 * 0205 allele of the Mafa-DPA1 gene, which is an MHC class II antigen alpha chain.
配列番号３はMHCクラスIIβ鎖（MHC class II antigen beta chain）であるMafa-DQB1遺伝子のMafa-DQB1*0608アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 3 is a DNA sequence called the Mafa-DQB1 * 0608 allele of the Mafa-DQB1 gene, which is an MHC class II β beta chain.
配列番号４はMHCクラスIIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-DQA1遺伝子のMafa-DQA1*0107アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 4 is a DNA sequence called the Mafa-DQA1 * 0107 allele of the Mafa-DQA1 gene, which is an MHC class II antigen alpha chain.
配列番号５はMHCクラスIIβ鎖（MHC class II antigen beta chain）であるMafa-DRB1遺伝子のMafa-DRB1*1007アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 5 is a DNA sequence called the Mafa-DRB1 * 1007 allele of the Mafa-DRB1 gene, which is an MHC class II β beta chain.
配列番号６はMHCクラスIIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-DRA1遺伝子のMafa-DRA1*010201アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 6 is a DNA sequence called the Mafa-DRA1 * 010201 allele of the Mafa-DRA1 gene, which is an MHC class II α alpha chain.
配列番号７はMHCクラスIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-B遺伝子のMafa-B*0490101アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 7 is a DNA sequence called the Mafa-B * 0490101 allele of the Mafa-B gene, which is an MHC class I α chain (MHC class II antigen alpha chain).
配列番号８はMHCクラスIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-B遺伝子のMafa-B*06502アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 8 is a DNA sequence called a Mafa-B * 06502 allele of the Mafa-B gene which is an MHC class I α chain (MHC class II antigen alpha chain).
配列番号９はMHCクラスIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-I遺伝子のMafa-I*0111アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 9 is a DNA sequence called the Mafa-I * 0111 allele of the Mafa-I gene, which is an MHC class I alpha chain.
配列番号１０はMHCクラスIα鎖（MHC class II antigen alpha chain）であるMafa-A遺伝子のMafa-A*05202アレルと呼ばれるDNA配列である。 SEQ ID NO: 10 is a DNA sequence called the Mafa-A * 05202 allele of the Mafa-A gene which is an MHC class I α chain (MHC class II antigen alpha chain).
２．MHC全遺伝子ホモ接合体雄カニクイザル及びMHC全遺伝子ホモ接合体雌カニクイザル 2. MHC full gene homozygous male cynomolgus monkey and MHC full gene homozygous female cynomolgus monkey
それぞれ配列番号１〜１０で表されるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である雄カニクイザル及び雌カニクイザルは、本発明者らが初めて発見したものである。以下、この雄カニクイザル及び雌カニクイザルのことをそれぞれ「雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体」及び「雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体」ということがある。 The male cynomolgus monkey and the female cynomolgus monkey that are homozygotes for all the MHC genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 10, respectively, have been discovered by the present inventors for the first time. Hereinafter, this male cynomolgus monkey and female cynomolgus monkey may be referred to as “male cynomolgus monkey MHC all gene homozygote” and “female cynomolgus monkey MHC all gene homozygote”, respectively.
３．雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子
雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子は、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体から得ることができる。取得源としては７〜２０歳の雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体が好ましい。3. Sperm of male cynomolgus MHC full gene homozygote and sperm of male cynomolgus monkey MHC full gene homozygote can be obtained from male cynomolgus MHC full gene homozygote. The acquisition source is preferably a 7-20 year old male cynomolgus MHC whole gene homozygote.
精子の取得方法としては、特に限定されないが、例えば実施例２の方法等が挙げられる。 The method for obtaining sperm is not particularly limited, and examples thereof include the method of Example 2.
また、雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子は、雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体から得ることができる。取得源としては４〜１５歳の雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体が好ましい。取得源としては、特に限定されないが、体重2.5〜3.5kgの雌カニクイザルが好ましい。 Moreover, the egg of a female cynomolgus monkey MHC all gene homozygote can be obtained from a female cynomolgus monkey MHC all gene homozygote. The acquisition source is preferably a female cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote aged 4 to 15 years. Although it does not specifically limit as an acquisition source, The female cynomolgus monkey with a body weight of 2.5-3.5 kg is preferable.
卵子の取得方法としては、特に限定されないが、例えば実施例３の方法等が挙げられる。 Although it does not specifically limit as an acquisition method of an egg, For example, the method of Example 3 etc. are mentioned.
また、特に限定されないが、これらの精子は次のようにして保存することができる。 Moreover, although it does not specifically limit, these sperm can be preserve | saved as follows.
［必要な試薬］
1. BWW（Biggers, Whitten and Whittingham’s）
2. BWW+Caffeine+cAMP
3.TTE-G[Required reagents]
1. BWW (Biggers, Whitten and Whittingham's)
2. BWW + Caffeine + cAMP
3.TTE-G
［必要な物品］
1. インキュベータ
2. 遠心分離機
3. 顕微鏡
4. 15mlチューブ
5. 電動ピペット
6. 10ml ピペット
7. 1mlピペットマン + 1mlチップ
8. アスピレータ
9. 冷蔵庫 (4℃)
10. 氷
11. 精子凍結用ストロー
12. ストロー封入用シリンジ (シリンジ + チューブ + イエローチップ)
13. ストロー封入用パウダー、水
14. 液体窒素
15. 発泡スチロールケース(2個)
16. 気層上部凍結用ネット、気層下部凍結用の発泡スチロール板
17. ピンセット
18. 液体窒素保存用タンク
19. マクラー精子数カウントチャンバー[Necessary goods]
1. Incubator
2. Centrifuge
3. Microscope
4. 15ml tube
5. Electric pipette
6. 10ml pipette
7. 1ml pipetman + 1ml tip
8. Aspirator
9. Refrigerator (4 ℃)
10. Ice
11. Sperm freezing straw
12. Syringe for filling straw (syringe + tube + yellow tip)
13. Powder for filling the straw, water
14. Liquid nitrogen
15. Styrofoam case (2 pieces)
16. Styrofoam board for freezing upper air layer and lower air layer
17. Tweezers
18. Liquid nitrogen storage tank
19. McLa Sperm Count Chamber
［方法］
Ｉ．精液採取後の処理と凍結保存法
1. 精子を電気刺激法により採取した。
2. 採取した精液は15mlチューブに入れ、37℃、5%CO2インキュベータ内で静置後、液状部分のみを別のチューブに移し、10ml BWWを加え混和した。
3.遠心分離による洗浄後、約0.5ml残して上清を捨てた。
4. 精子数が5,000万〜1億/mlになる様にBWWを加えた後、4℃で60分間静置した。
5. その後、氷水中で精子溶液の1/5量のTTE-G（Tes, Tris, egg york base - glycerol）溶液を加え、5分間静置する。これを5回繰り返した。
6. 氷水中で60分間静置した後、精子溶液を凍結用ストローに封入した。
7. ストローは、液体窒素の気層上部、気層下部で5分ずつ保持し、その後液体窒素中に投入し凍結した。
8. 精子の凍結ストローは、液体窒素の凍結タンク内で保存した。[Method]
I. Treatment after semen collection and cryopreservation
1. Sperm was collected by electrical stimulation.
2. The collected semen was placed in a 15 ml tube and allowed to stand in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Then, only the liquid part was transferred to another tube, and 10 ml BWW was added and mixed.
3. After washing by centrifugation, the supernatant was discarded leaving about 0.5 ml.
4. BWW was added so that the number of spermatozoa would be 50 million to 100 million / ml, and then allowed to stand at 4 ° C for 60 minutes.
5. After that, add 1/5 volume of TTE-G (Tes, Tris, egg york base-glycerol) solution in ice water and let stand for 5 minutes. This was repeated 5 times.
6. After standing in ice water for 60 minutes, the sperm solution was sealed in a freezing straw.
7. The straw was held for 5 minutes at the upper and lower layers of liquid nitrogen, and then put into liquid nitrogen and frozen.
8. Sperm freezing straws were stored in a liquid nitrogen freezing tank.
［参考：精子融解法］
1.チューブにBWW+Caffeine+cAMPを37℃に暖めておいた。
2. 液体窒素中からストローを取り出し、室温で30秒間融解する。その後、37℃の温水中で30秒間融解した。
3. ストローの両端を切断し、BWW+Caffeine+cAMP内に融解精子を入れ混和した。
4. 37℃、5%CO2インキュベータ内で30分間静置した。
5. その後、遠心分離により洗浄し、スイムアップさせて使用した。[Reference: Sperm melting method]
1. BWW + Caffeine + cAMP was warmed to 37 ° C in the tube.
2. Remove the straw from the liquid nitrogen and thaw for 30 seconds at room temperature. Then, it thawed for 30 seconds in 37 ° C. warm water.
3. Both ends of the straw were cut, and melted sperm was mixed in BWW + Caffeine + cAMP.
4. It was allowed to stand for 30 minutes in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
5. Then, it was washed by centrifugation and used after being swim up.
なお、本出願人はこれらの精子及び卵子をそれぞれ特許法施行規則第27条の3第1項の規定に準じて分譲する用意がある。 The applicant is prepared to sell these sperm and eggs in accordance with the provisions of Article 27-3, Paragraph 1 of the Patent Law Enforcement Regulations.
４．雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を受精させて得られうる受精卵
雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を受精させて得られうる受精卵は、限定されないが、例えば両者を顕微授精により受精させることによって得ることができる。顕微授精の方法としては、特に限定されないが、例えば実施例４に記載の方法を挙げることができる。4). Male cynomolgus monkey MHC homozygous sperm and female cynomolgus monkey MHC homozygous sperm and female cynomolgus monkey MHC homozygous sperm of male cynomolgus monkey MHC homozygote A fertilized egg that can be obtained by fertilizing an egg is not limited, but can be obtained, for example, by fertilizing both by microinsemination. The method of microinsemination is not particularly limited, and examples thereof include the method described in Example 4.
顕微授精の他に体外受精法も利用できるが、顕微授精は必要とする精子数が卵子１個につき１個であるのに対し、体外受精法は1〜5ｘ105個もの大量の個数が必要である。また顕微授精法の方が受精効率は高くなる。In vitro fertilization can be used in addition to microinsemination, but microinsemination requires one sperm per egg, whereas in vitro fertilization requires a large number of 1-5 x 10 5 is there. Moreover, the fertilization efficiency is higher in the microinsemination method.
このようにして得られうる受精卵（胚）を、すぐさま次に説明するとおり雌の子宮内に移すなどして胎児を発生させてもよいし、いったん保存してもよい。なお、特に限定されないが、これらの受精卵（胚）は次のようにして保存することができる。 The fertilized egg (embryo) thus obtained may be immediately transferred into a female uterus as described below, or a fetus may be generated, or may be stored once. Although not particularly limited, these fertilized eggs (embryos) can be preserved as follows.
［胚の凍結融解に必要な試薬］
1. 凍結キット（VITRIFICATION KIT Vitrification Media ; ES、VS; KITAZATO Biopharma）
2. 融解キット (VITRIFICATION KIT Thawing Media ; TS、DS、WS1,2 KITAZATO Biopharma) [Reagents required for freeze-thawing of embryos]
1. Freezing kit (VITRIFICATION KIT Vitrification Media; ES, VS; KITAZATO Biopharma)
2. Thawing kit (VITRIFICATION KIT Thawing Media; TS, DS, WS1,2 KITAZATO Biopharma)
［胚の凍結融解に必要な物品］
1. 4-well dish (NUNC)
2. 1mlピペットマン + チップ
3. Cryotop (KITAZATO Biopharma)
4. 実体顕微鏡
5. 胚操作用ガラスピペット
6. タイマー
7. ピンセット(2本)
8. 液体窒素
9. 発泡スチロールケース
10. アルミケーン
11. ケーン用チューブ
12. 加温プレート
13. インキュベータ[Articles required for freeze-thawing of embryos]
1. 4-well dish (NUNC)
2. 1ml pipetman + tip
3. Cryotop (KITAZATO Biopharma)
4. Stereo microscope
5. Glass pipette for embryo manipulation
6. Timer
7. Tweezers (2)
8. Liquid nitrogen
9. Styrofoam case
10. Aluminum cane
11. Cane tube
12. Heating plate
13. Incubator
［方法］
Ｉ．胚の凍結
1. 凍結操作の30分以上前から凍結キットのES、およびVSをクリーンベンチ内に置き、室温に温めた。
2. ES、VSのチューブを転倒混和させた後それぞれを4-well dishの別々のwellに注入した。
3. 凍結する胚をインキュベータから取り出し、観察を行った。
4. 胚をピペット先端に保持して、持ち込むメディウムの量を極力少なくし、ES表面に静かにのせてストップウォッチをセットした。
5. 卵子が沈降しながら収縮する事を観察し、その後細胞質体積が完全に回復することを確認した (この時、4-8cell胚、胚盤胞期胚共にES内での平衡化時間は15分を上限とした) 。
6. 持ち込むESを極力少なくして胚をVS表面に移動した。
7. ピペット内のESをVSで洗浄した後、VS中で胚を2、3度ピペッティングすることで洗浄した。
8. ポリプロピレンのシートに極少量のVSと共に胚をのせ、液体窒素中に浸漬して凍結を行った(VS液に胚を移動してから凍結するまでは１分以内に行った)。
9. その後、液体窒素内でシート部にキャップをしてケーンに移し、液体窒素用凍結保存タンク中にて保存した。[Method]
I. Embryo freezing
1. At least 30 minutes before the freezing operation, ES and VS of the freezing kit were placed in a clean bench and warmed to room temperature.
2. After mixing the ES and VS tubes by inversion, each was poured into separate wells of a 4-well dish.
3. Frozen embryos were removed from the incubator and observed.
4. Holding the embryo at the tip of the pipette, reducing the amount of medium to bring in as much as possible, placing it gently on the ES surface and setting the stopwatch.
5. Observed that the ovum contracted while sinking, and then confirmed that the cytoplasmic volume was completely restored (at this time, the equilibration time in ES was 15 for both the 4-8 cell embryo and the blastocyst stage embryo) Min).
6. Fewer ES were brought to move embryos to the VS surface.
7. After washing the ES in the pipette with VS, the embryo was washed by pipetting twice or three times in VS.
8. The embryo was placed on a polypropylene sheet together with a very small amount of VS and immersed in liquid nitrogen for freezing (the transfer of the embryo to the VS solution was performed within 1 minute).
9. Then, the sheet was capped in liquid nitrogen, transferred to a cane, and stored in a liquid nitrogen cryopreservation tank.
ＩＩ．胚の融解
1. 融解操作１時間以上前からTSと融解用の4-well dishを37℃に温めておいた。
2. 融解する胚が凍結保存されているケーンからCryotopを取り出し、液体窒素中に保持しながら融解操作を行う実体顕微鏡の近くに移動させた。
3. DS、WS1,2をそれぞれ転倒混和し、4-well dishの別々のwellに注入した。
4. 最後に、温めておいたTSを転倒混和して4-well dishに注入した。
5. 液体窒素中にてCryotopのキャップをはずし、37℃のTS中にシート部分を浸漬して胚の融解を行い、ストップウォッチをセットした。
6. 融解開始から1分以内に、胚をDS底面中央に移し、上からピペット内のTSをかけて3分間静置する。
7. 次にWS1底面中央に胚を移動して、上からピペット内のDSを振りかけて5分静置する。
8. 最後にWS1の持ち込みを極力少なくして、胚をWS2の中央表面に乗せ加温プレート上で5分間静置した。
9. 形態的に正常な胚のみを20% BS 添加のCMRL-1066に移し、38℃、5% CO2、5% O2条件下で培養した。II. Embryo melting
1. The TS and the 4-well dish for melting were warmed to 37 ° C for at least 1 hour before the melting operation.
2. Cryotop was taken out of the cane in which the embryos to be thawed were cryopreserved, and moved to a stereomicroscope where the thawing operation was performed while being kept in liquid nitrogen.
3. Inverted DS and WS1,2, respectively, and injected into separate wells of a 4-well dish.
4. Finally, the warmed TS was mixed by inversion and poured into a 4-well dish.
5. Remove the Cryotop cap in liquid nitrogen, immerse the sheet in 37 ° C TS, thaw the embryo, and set the stopwatch.
6. Within 1 minute from the start of thawing, move the embryo to the center of the bottom of the DS and place it in the pipette from the top for 3 minutes.
7. Next, move the embryo to the center of the bottom of WS1, sprinkle the DS in the pipette from above, and let it stand for 5 minutes.
8. Finally, the amount of WS1 was reduced as much as possible, and the embryo was placed on the central surface of WS2 and allowed to stand on a warming plate for 5 minutes.
9. Only morphologically normal embryos were transferred to CMRL-1066 supplemented with 20% BS and cultured under conditions of 38 ° C., 5% CO 2 , 5% O 2 .
このようにして得られうる受精卵（胚）を従来の方法にしたがって雌の子宮内に移すなどすることにより胎児とし、さらにこれを従来の方法にしたがって飼育することによって、雄MHC全遺伝子ホモ接合体又は雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を得ることができる。発情期にある６歳以上の雌の子宮内に移すのが好ましい。子宮内に戻してから通常約１６０日後に子供が産まれる。受精卵から個体を取得する方法として具体的には、限定されないが、例えば次の方法を挙げることができる。腹腔鏡によって卵巣観察を行い、排卵跡の確認された６歳以上のメス個体の卵管内に腹腔鏡を用いて胚移植する。その方法としては、下記を挙げることができる。移植後約３０日後に超音波診断装置を用いて胎嚢と心拍動を確認し、その後移植後約１６０日後に子供が得られる。 The fertilized egg (embryo) thus obtained is transferred into a female uterus according to a conventional method, and the fetus is bred according to a conventional method. Body or female cynomolgus monkey MHC whole gene homozygotes can be obtained. It is preferably transferred into the womb of a female over 6 years of age in estrus. A child is usually born about 160 days after returning into the womb. Although it does not specifically limit as a method to acquire an individual | organism | solid from a fertilized egg, For example, the following method can be mentioned. The ovaries are observed with a laparoscope, and embryo transfer is performed using a laparoscope into the oviduct of a female individual over 6 years old with confirmed ovulation. Examples of the method include the following. About 30 days after transplantation, the uterine sac and heartbeat are confirmed using an ultrasonic diagnostic apparatus, and then a child is obtained about 160 days after transplantation.
［準備物品等］
1. 腹腔鏡
2. 胚移植カテーテル用外套管（トラカール）、移植鉗子用外套管（トラカール）
移植用鉗子および操作用鉗子
3. 移植用カテーテル
4. カテーテルのホルダー
5. 移植用ガイド
6. 1ml シリンジ
7. ディッシュ（Falcon 3037） 2枚
8. 実体顕微鏡
9. CMRL-1066
10. ピンセット
レシピエント個体
月経から10-16日目の成熟メスカニクイザルの卵巣を腹腔鏡下で観察し、排卵跡の確認された個体を用いた。[Prepared goods]
1. Laparoscope
2. Mantle tube (trocar) for embryo transfer catheter, mantle tube (tracar) for transplant forceps
Transplant forceps and operating forceps
3. Transplant catheter
4. Catheter holder
5. Porting guide
6. 1ml syringe
7. Two dishes (Falcon 3037)
8. Stereo microscope
9. CMRL-1066
10. The ovary of mature cynomolgus monkeys 10-16 days after menstruation of tweezers recipients was observed laparoscopically, and individuals with confirmed ovulation traces were used.
［胚移植］
4-8細胞期または胚盤胞期の顕微授精胚を移植胚とし、移植した。
1. 移植当日の朝、受精胚を観察し写真等記録しておいた。
2. 1mlシリンジに胚移植用カテーテルを装着し、カテーテル内には前日からインキュベートしておいた培養液(CMRL-1066)を充填させた（カテーテル内には先端まで培養液があること）。
3. 胚を1枚目のディッシュで洗浄し、２枚目のディッシュに移した（2個以上の場合は胚をくっつけておいた）。
4. ピンセットでカテーテルを保持し、２枚目のディッシュを使ってカテーテル内に胚を吸引した。[Embryonic transfer]
Microinseminated embryos at the 4-8 cell stage or blastocyst stage were used as transplanted embryos and transplanted.
1. On the morning of the day of transplantation, fertilized embryos were observed and photographs were recorded.
2. An embryo transfer catheter was attached to a 1 ml syringe, and the culture medium (CMRL-1066) that had been incubated from the previous day was filled into the catheter (the culture medium should be in the catheter up to the tip).
3. The embryo was washed with the first dish and transferred to the second dish (if more than two embryos were attached).
4. The catheter was held with tweezers and the embryo was aspirated into the catheter using the second dish.
［卵管内胚移植］
1. レシピエントとなる個体の排卵側の卵管および卵管采の場所を確認した。
2. 腹腔鏡の操作鉗子挿入部とは逆の位置に、移植用外套管を挿入し、カテーテル用ガイドを入れた。
3. 卵管采から卵管内に、移植用カテーテルのガイドを挿入した。
4. 卵管走行などの確認ができた後、移植用カテーテルをゆっくり挿入した。
5. 卵管采に移植用カテーテルを確実に挿入したら、内筒をゆっくり押し、胚を卵管内に移植し、移植した胚が戻らないように慎重に卵管内からカテーテルを抜いた。
6. すぐに実体顕微鏡下で、カテーテル内を洗浄し、胚が残っていないことを確認した。
妊娠診断は、移植約1ヶ月目に超音波診断にて行った。[Intratubal embryo transfer]
1. The location of the oviduct and fallopian tubule on the ovulation side of the recipient individual was confirmed.
2. The outer tube for transplantation was inserted at a position opposite to the operation forceps insertion part of the laparoscope, and the catheter guide was inserted.
3. A catheter guide for transplantation was inserted into the fallopian tube from the fallopian tube.
4. After confirming that the fallopian tube was running, the catheter for transplantation was slowly inserted.
5. After the transplantation catheter was securely inserted into the fallopian tube, the inner tube was pushed slowly, the embryo was transferred into the fallopian tube, and the catheter was carefully pulled out of the fallopian tube so that the transferred embryo did not return.
6. Immediately under a stereomicroscope, the inside of the catheter was washed to confirm that no embryos remained.
Pregnancy was diagnosed by ultrasonic diagnosis about 1 month after transplantation.
そして、このようにして得られた雄雌カニクイザルを利用することにより、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を受精させて得られうる受精卵を再び得ることができる。 Then, by using the male and female cynomolgus monkeys thus obtained, fertilized eggs obtained by fertilizing male cynomolgus monkey MHC all gene homozygous sperm and female cynomolgus monkey MHC all gene homozygous ovum again. Can be obtained.
これを繰り返すことにより、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を容易に多数取得することができる。 By repeating this, a large number of cynomolgus monkey MHC whole gene homozygotes can be easily obtained.
５．キット１
キット１は、少なくとも１種の雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体及び少なくとも１種の雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を含む、カニクイザルMHC遺伝子ホモ接合体を作製するためのキットである。5. Kit 1
Kit 1 is a kit for producing a cynomolgus monkey MHC gene homozygote comprising at least one male cynomolgus monkey MHC all gene homozygote and at least one female cynomolgus monkey MHC all gene homozygote.
キット１は、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の生命を維持するために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、例えば、飼育用ケージ等が挙げられる。飼育用ケージとしては、特に限定されないが、例えば、幅ｘ高さｘ奥行が500x800x800mmを規格とする箱形ステンレス製ケージで、給水、給餌設備と排尿、排糞等の生理的要求を満たすものであり、かつ、清浄状態と保つために洗浄作業が行いやすい構造をもつものであれば好ましい。さらに、動物の福祉（エンリッチメント）に配慮し、止まり木、ぶら下がり棒等の設備が備わっているものであればより好ましい。 Kit 1 may include equipment or materials necessary to maintain the life of a male cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote and a female cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote. Such equipment is not limited, and examples thereof include breeding cages. The cage for breeding is not particularly limited. For example, it is a box-shaped stainless steel cage with a standard width x height x depth of 500x800x800mm, which satisfies physiological requirements such as water supply, feeding equipment, urination, and feces. It is preferable if it has a structure that facilitates the cleaning operation in order to maintain a clean state. Furthermore, in consideration of animal welfare (enrichment), it is more preferable if it is provided with facilities such as a perch and a hanging bar.
キット１は、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を受精させるために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、例えば、顕微授精法に用いられる機器又は材料等が挙げられる。そのような材料としては、限定されないが、例えば、実施例４に記載のもの等が挙げられる。 Kit 1 may include equipment or materials necessary to fertilize male cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote and female cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote. Examples of such an apparatus include, but are not limited to, an apparatus or a material used for microinsemination. Examples of such materials include, but are not limited to, those described in Example 4.
キット１は、カニクイザルMHC遺伝子ホモ接合体を作製するための手順を示した指示書を含んでいてもよい。 Kit 1 may include instructions that show the procedure for making a cynomolgus monkey MHC gene homozygote.
６．キット２
キット２は、少なくとも１種の雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び少なくとも１種の雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を含む、カニクイザルMHC遺伝子ホモ接合体を作製するためのキットである。6). Kit 2
Kit 2 is a kit for preparing a cynomolgus MHC gene homozygote comprising at least one male cynomolgus monkey MHC homozygous sperm and at least one female cynomolgus MHC homozygous ovum. .
キット２は、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子の活性を維持するために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、例えば、実施例４で使用したもの等が挙げられる。 Kit 2 may include equipment or materials necessary to maintain the activity of male cynomolgus MHC full gene homozygous sperm and female cynomolgus MHC full gene homozygous ovum. Examples of such devices include, but are not limited to, those used in Example 4.
キット２は、精子と卵子を受精させるために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、実施例４で使用したもの等が挙げられる。 The kit 2 may include equipment or materials necessary for fertilizing sperm and eggs. Examples of such devices include, but are not limited to, those used in Example 4.
キット２は、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するための手順を示した指示書を含んでいてもよい。 Kit 2 may include instructions that show the procedure for making a cynomolgus MHC whole gene homozygote.
７．キット３
キット３は、少なくとも１種の雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び少なくとも１種の雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を受精させて得られうる受精卵を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキットである。7). Kit 3
Kit 3 comprises a cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote comprising a fertilized egg obtainable by fertilizing at least one male cynomolgus monkey MHC homozygous sperm and at least one female cynomolgus monkey MHC homozygous ovum. This is a kit for producing a joined body.
キット３は、前述の受精卵の活性を維持するために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、例えば、実施例４で使用したもの等が挙げられる。 The kit 3 may include equipment or materials necessary for maintaining the activity of the fertilized egg. Examples of such devices include, but are not limited to, those used in Example 4.
キット３は、受精卵から個体を得るために必要な機器又は材料を含んでいてもよい。そのような機器としては、限定されないが、実施例４で使用したもの、及び胚移植に使用するものとして先述したもの等が挙げられる。 The kit 3 may include equipment or materials necessary for obtaining an individual from a fertilized egg. Such devices include, but are not limited to, those used in Example 4 and those previously described as those used for embryo transfer.
キット３は、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するための手順を示した指示書を含んでいてもよい。 Kit 3 may include instructions that indicate the procedure for generating a cynomolgus MHC whole gene homozygote.
ＩＩ．作製方法
本発明の作製方法は、雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子を受精させる工程を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の作製方法である。II. Production Method The production method of the present invention is a method for producing a cynomolgus monkey MHC all gene homozygote comprising a step of fertilizing a male cynomolgus monkey MHC all gene homozygote sperm and a female cynomolgus monkey MHC all gene homozygote egg.
精子と卵子の受精は、顕微授精によって行うことが好ましい。両者を受精させることによって受精卵を生じさせ、さらにこれから個体を生じさせて飼育することにより多数のカニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体（カニクイザルの集団）を得ることができる。 Fertilization of sperm and eggs is preferably performed by microinsemination. By fertilizing both, a fertilized egg is produced, and then an individual is produced and bred to obtain a large number of cynomolgus monkey MHC all gene homozygotes (a group of cynomolgus monkeys).
以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on test examples and examples. However, the present invention is not limited to these specific examples.
実施例１．雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の取得 Example 1. Acquisition of male cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote and female cynomolgus monkey MHC whole gene homozygote
［実験方法］
１．約千頭のカニクイザルにおける末梢血よりRNAを抽出した。具体的には次の通り行った。
(1) 大腿静脈より約1 mLを採血した。
(2) 1 mLの血液に3 mLのTRIzol Reagent（Invitrogen）を加え、両者を混合することにより、RNAをTri-Sol溶液中に固定させた。
(3) この溶液に800 μLのクロロホルムを加え混合した後、8000 x g、4℃、20分間の条件にて遠心分離し、1 mLの上層を2 mLチューブ（Eppendorf）に移した。この溶液に1 mLのイソプロピルアルコール（Wako）を加え、転倒撹拌した後、12000 x g、4℃、20分間の条件にて遠心分離し、上清を捨て沈査を得た。この沈査に1 mLの70%エタノール（Wako）を加え、転倒撹拌した後、12000 x g、4℃、20分間の条件にて遠心分離し、上清を捨て沈査を得た。最終的に、この沈査を風乾させた後、20 μLのDEPC treated Waterを加えることによりRNAを抽出して溶解させた。
(4) RNA溶液の純度や濃度は分光光度計により測定した。すなわち、RNA溶液の純度は260 nm / 280 nm により算出した。また、RNA溶液の濃度は260 nmにおける吸光度より算出した。
(5) RNA溶液から1本鎖DNAおよび2本鎖DNAを除去するために、DNase I （Amplification グレイド、Invitrogen）を用いたDNAase処理を行った。すなわち、1 μgのRNAに1 μLの10X DNase I Reaction Buffer、1 μL（1 U/μL）のDNase Iを加え、反応液の全量をDEPC-treated waterにて10 μLに調整した。これを15分間室温に放置した後、1 μLの25 mM EDTA溶液を加え、85℃で15分間の熱処理によりDNase Iを失活させた。[experimental method]
1. RNA was extracted from peripheral blood in about 1,000 cynomolgus monkeys. Specifically, it was performed as follows.
(1) About 1 mL of blood was collected from the femoral vein.
(2) 3 mL of TRIzol Reagent (Invitrogen) was added to 1 mL of blood, and both were mixed to fix RNA in the Tri-Sol solution.
(3) After 800 μL of chloroform was added to this solution and mixed, the mixture was centrifuged at 8000 × g, 4 ° C. for 20 minutes, and the 1 mL upper layer was transferred to a 2 mL tube (Eppendorf). 1 mL of isopropyl alcohol (Wako) was added to this solution and stirred by inversion, followed by centrifugation at 12000 × g, 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was discarded to obtain a precipitate. 1 mL of 70% ethanol (Wako) was added to the precipitate, and the mixture was inverted and stirred, and then centrifuged at 12000 × g, 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was discarded to obtain a precipitate. Finally, the precipitate was air-dried, and RNA was extracted and dissolved by adding 20 μL of DEPC treated water.
(4) The purity and concentration of the RNA solution were measured with a spectrophotometer. That is, the purity of the RNA solution was calculated by 260 nm / 280 nm. The concentration of the RNA solution was calculated from the absorbance at 260 nm.
(5) In order to remove single-stranded DNA and double-stranded DNA from the RNA solution, DNAase treatment using DNase I (Amplification Grade, Invitrogen) was performed. That is, 1 μL of 10 × DNase I Reaction Buffer and 1 μL (1 U / μL) of DNase I were added to 1 μg of RNA, and the total amount of the reaction solution was adjusted to 10 μL with DEPC-treated water. After standing at room temperature for 15 minutes, 1 μL of 25 mM EDTA solution was added, and DNase I was inactivated by heat treatment at 85 ° C. for 15 minutes.
２．そのRNAを鋳型として、逆転写反応によりcDNAを合成した。具体的には次の通り行った。
(1) DNase I処理したRNAを鋳型として、逆転写酵素ReverTra Aceキット（TOYOBO）を用いて逆転写反応により１本鎖cDNAを合成した。すなわち、1 μLのDNase I処理RNA溶液に、4 μLの5 x RT緩衝液、2 μLのdNTP溶液、1 μLのRNA inhibitor、1 μLの逆転写酵素、1 μLのオリゴd(T)プライマーを加え、反応液の全量をDEPC-treated waterにて20 μLに調整した。これを30℃で10分間の後、続いて42℃で20分間、99℃で5分間、4℃で5分間の順で逆転写酵素反応を行い、１本鎖cDNAを合成した。2. CDNA was synthesized by reverse transcription using the RNA as a template. Specifically, it was performed as follows.
(1) Single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription using DNase I-treated RNA as a template and reverse transcriptase ReverTra Ace kit (TOYOBO). In other words, 1 μL of DNase I-treated RNA solution is mixed with 4 μL of 5 x RT buffer, 2 μL of dNTP solution, 1 μL of RNA inhibitor, 1 μL of reverse transcriptase, and 1 μL of oligo d (T) primer. In addition, the total amount of the reaction solution was adjusted to 20 μL with DEPC-treated water. This was followed by 10 minutes at 30 ° C., followed by reverse transcriptase reaction in the order of 42 ° C. for 20 minutes, 99 ° C. for 5 minutes, and 4 ° C. for 5 minutes to synthesize single-stranded cDNA.
３．そのcDNAを鋳型として、各MHC遺伝子特定的プライマーを用いてPCR反応を行った。具体的には次の通り行った。 3. Using the cDNA as a template, PCR reaction was performed using specific primers of each MHC gene. Specifically, it was performed as follows.
(1)下記の表１に記したPCRプライマーを選択あるいは設計したものをRT-PCR増幅に用いた。 (1) Selected or designed PCR primers listed in Table 1 below were used for RT-PCR amplification.
(2) PCR増幅はKOD-FXポリメラーゼ（TOYOBO）を用いた。すなわち、1 μLのcDNA溶液に、10 μLの2 xPCR緩衝液、4 μLのdNTP溶液、1 μL (10 pmol / μL) ずつのPCRプライマー、0.4 μLのKOD-FXポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて20 μLに調整した。これを94℃で2分間の保温後、続いて98℃で10秒間、60℃で30秒間、68℃で1分間の３ステップを１工程として、これを35回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。 (2) For PCR amplification, KOD-FX polymerase (TOYOBO) was used. In other words, add 10 μL of 2 x PCR buffer, 4 μL of dNTP solution, 1 μL (10 pmol / μL) of each PCR primer, and 0.4 μL of KOD-FX polymerase to 1 μL of cDNA solution. Was adjusted to 20 μL with sterile water. This was kept at 94 ° C. for 2 minutes, and then this was repeated 35 times with 3 steps of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 1 minute as one step. In this PCR amplification, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used.
４．そのPCR産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
1) PCR 産物の精製はExoSAP (GE Healthcare) を用いた。すなわち、5 μLのPCR産物に2 μLのExoSAP-ITを加えた混合液を37℃で15分間、続いて80℃で15分間の条件で反応させた。
(2) PCR産物のシークエンシング反応には、Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) を用いた。すなわち、1 μLの産物に、1 μLのTerminator Ready Reaction Mix (Applied Biosystems)、1.5 μLの5 x Sequencing Buffer、1 μLのPCR増幅用プライマー (5 pmol /μl)を加え、5.5 μLの滅菌水にて反応液の全量を10 μLに調整した。これを95℃で1分間の保温後、続いて95℃で10秒間、50℃で5秒間、60℃で2.5分間の３ステップを１工程として、これを30回繰り返した。なお、このPCR増幅にはGeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。
(3) シークエンシング反応産物はClean SEQ (Agencourt Bioscience) を用いて精製した。すなわち、シークエンシング反応産物に10 μLの磁気ビーズ溶液および 42 μLの85 % エタノールを加えて攪拌した後、PCRプレートをマグネットプレート上に置き、磁気ビーズを5 分間吸着させた。その後、溶液のみを取り除き、室温にて10 分間乾燥させ、これに40 μLの滅菌水を加え、マグネットプレート上で5 分間静置することでDNAを溶解させた。このうちの35 μLを別のPCRプレートに移し取り、塩基配列の解読に供した。
(4) シークエンシング反応精製産物の塩基配列は、3130 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて決定した。4). The base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows.
1) ExoSAP (GE Healthcare) was used for purification of PCR products. That is, a mixture obtained by adding 2 μL of ExoSAP-IT to 5 μL of the PCR product was reacted at 37 ° C. for 15 minutes and then at 80 ° C. for 15 minutes.
(2) Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) was used for sequencing PCR products. That is, add 1 μL of Terminator Ready Reaction Mix (Applied Biosystems), 1.5 μL of 5 x Sequencing Buffer, and 1 μL of PCR amplification primer (5 pmol / μl) to 1 μL of product, and add 5.5 μL of sterile water. The total volume of the reaction solution was adjusted to 10 μL. This was kept at 95 ° C. for 1 minute, and then this was repeated 30 times with 3 steps of 95 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, and 60 ° C. for 2.5 minutes as one step. In this PCR amplification, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used.
(3) The sequencing reaction product was purified using Clean SEQ (Agencourt Bioscience). That is, 10 μL of magnetic bead solution and 42 μL of 85% ethanol were added to the sequencing reaction product and stirred, and then the PCR plate was placed on the magnet plate to adsorb the magnetic beads for 5 minutes. Thereafter, only the solution was removed, dried at room temperature for 10 minutes, 40 μL of sterilized water was added thereto, and the mixture was allowed to stand on a magnetic plate for 5 minutes to dissolve the DNA. 35 μL of this was transferred to another PCR plate and subjected to decoding of the base sequence.
(4) Sequencing reaction The base sequence of the purified product was determined using 3130 xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
５．Mafa-AならびにMafa-B由来のPCR産物の塩基配列はサブクローニング法とシークエンシング法の併用により決定した。具体的には次の通り行った。
(1) Mafa-AならびにMafa-B由来のPCR産物をTarget Clone（登録商標） (TOYOBO) にクローニングした。すなわち、4.5 μLのPCR産物に0.5 μLの10x A-attachment Mixを加え、60℃で10分間反応させた後、そのうちの3 μLに5 μLの2x Ligation Buffer、1 μLの pTA2 Vector（50ng/μl）、1 μLのT4 DNA Ligaseを加え、24℃で30分間の条件でライゲーション反応をさせた。
(2) 氷中で10 μlのDH5 αCompetent Cells,High Efficiency(TOYOBO)に1.5 μlのライゲーション産物を加え、氷中で30分間、42℃で30秒間、氷中で2分間静置した。その後、90 μLのSOC培地を加え、37 ℃で1 時間の予備培養を行った。これをLB (アンピシリン＋IPTG、X-gal)プレート培地に50 μLを塗り広げ、37 ℃で一晩培養した。
(3)得られたコロニーのうち、インサートDNAを有する白いコロニーを選別し、これを1.2 mLのLB培地にて37 ℃で12 時間振とう培養した。培養後、3000 rpm、室温、15分間の条件で遠心分離した。その後、Robot-96 Plasmid Kit (MACHEREY-NAGEL)ならびにep5075 プラスミド抽出装置(eppendorf)の手順に従いプラスミドDNAを抽出した。最終的に100μLの滅菌水に溶解、これを塩基配列決定の鋳型DNAとした。なお、サブクローニングの際の人工的な塩基置換を避けるために、1個体サンプルあたり32個のサブクローン由来のプラスミドDNAを抽出した。塩基配列決定法は4-(2)〜(4)にしたがった。5. The base sequences of PCR products derived from Mafa-A and Mafa-B were determined by a combination of subcloning method and sequencing method. Specifically, it was performed as follows.
(1) PCR products derived from Mafa-A and Mafa-B were cloned into Target Clone (registered trademark) (TOYOBO). Specifically, 0.5 μL of 10x A-attachment Mix was added to 4.5 μL of the PCR product, reacted at 60 ° C for 10 minutes, 3 μL of this was added to 5 μL of 2x Ligation Buffer, 1 μL of pTA2 Vector (50 ng / μl ), 1 μL of T4 DNA Ligase was added, and the ligation reaction was performed at 24 ° C. for 30 minutes.
(2) 1.5 μl of the ligation product was added to 10 μl of DH5 α Competent Cells, High Efficiency (TOYOBO) in ice, and left in ice for 30 minutes, at 42 ° C. for 30 seconds, and in ice for 2 minutes. Thereafter, 90 μL of SOC medium was added, and preculture was performed at 37 ° C. for 1 hour. 50 μL of this was spread on an LB (ampicillin + IPTG, X-gal) plate medium and cultured at 37 ° C. overnight.
(3) Among the obtained colonies, white colonies having insert DNA were selected and cultured in 1.2 mL of LB medium with shaking at 37 ° C. for 12 hours. After incubation, the mixture was centrifuged at 3000 rpm, room temperature, and 15 minutes. Thereafter, plasmid DNA was extracted according to the procedures of Robot-96 Plasmid Kit (MACHEREY-NAGEL) and ep5075 plasmid extractor (eppendorf). Finally, it was dissolved in 100 μL of sterilized water, and this was used as template DNA for base sequencing. In order to avoid artificial base substitution during subcloning, plasmid DNA derived from 32 subclones was extracted per individual sample. The nucleotide sequencing method was according to 4- (2) to (4).
６．その情報よりMHC全遺伝子ホモ接合体を特定した。具体的には次の通り行った。
得られた塩基配列データはDNAシークエンスアセンブルソフトウェアSequencher 4.1 (Gene Codes Corporation)を用いてデータの結合ならびに編集を加えることにより決定し、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Mac v11.0 (Software Development)および類似配列検索プログラムBLASTを用いて、決定した塩基配列が目的とするカニクイザルMHC遺伝子の対立遺伝子であることを確認した。その塩基配列情報より、各遺伝子座ともに１種類の対立遺伝子しか認められなかった個体をMHC全遺伝子ホモ接合体とした。6). The MHC homozygote was identified from the information. Specifically, it was performed as follows.
The obtained base sequence data is determined by combining and editing data using DNA sequence assembly software Sequencher 4.1 (Gene Codes Corporation), genetic information processing software GENETYX Mac v11.0 (Software Development) and similar sequence search Using the program BLAST, it was confirmed that the determined nucleotide sequence was an allele of the target cynomolgus MHC gene. Based on the nucleotide sequence information, an individual in which only one type of allele was found at each locus was designated as an MHC all gene homozygote.
７．その個体について、混合リンパ球反応によりMHC全遺伝子ホモ接合体であることを確認した。具体的には次の通り行った。
カニクイザルよりヘパリンを加えた注射器で２mlを採血した。1200rpm、22℃で10分間遠心し、血漿を分離した。細胞成分をPBS 2.5mlに浮遊後、Ficoll-Paque液上に重層し、1800rpm、22℃で、30分間遠心した。リンパ球成分を回収し、Hanks液で２回洗浄した。その後培養液（RPMI-1640+FCS10%+2-ME）に浮遊させた。MHC全遺伝子ホモ接合体ではないstimulator細胞には30Gyの放射線を照射した。MHC全遺伝子ホモ接合体であるresponder細胞（1x105個/100μl/well）を放射線照射したstimulator細胞（1x105個/100μl/well）と混合し、96ウェルU底プレート内で72時間培養した（37℃、二酸化炭素5％）。[3H]-methyl thymidineを0.5μCi加えてさらに１６時間培養後、フィルター上に細胞をハーベストし、液体シンチレーションカウンターで[3H]-methyl thymidineのDNAへの取り込みを測定した。その結果、responder細胞のみの培養では179cpmの反応を示した（negative control）。一方、stimulator細胞と培養するとそれぞれ655及び440cpmの増殖反応を示した（positive control）。これに対して、MHC全遺伝子ホモ接合体由来の細胞に対する増殖反応は263cpmで、MHC全遺伝子ホモ接合体ではないstimulator由来の細胞に対する反応より低値であった。7). The individual was confirmed to be homozygous for all MHC genes by a mixed lymphocyte reaction. Specifically, it was performed as follows.
2 ml of blood was collected from a cynomolgus monkey with a syringe to which heparin was added. The plasma was separated by centrifugation at 1200 rpm and 22 ° C. for 10 minutes. The cell components were suspended in 2.5 ml of PBS, layered on Ficoll-Paque solution, and centrifuged at 1800 rpm at 22 ° C. for 30 minutes. Lymphocyte components were collected and washed twice with Hanks solution. Thereafter, it was suspended in a culture solution (RPMI-1640 + FCS10% + 2-ME). Stimulator cells that are not homozygous for the entire MHC gene were irradiated with 30 Gy of radiation. Responder cells (1 × 10 5 cells / 100 μl / well), which are homozygotes for all MHC genes, were mixed with irradiated stimulator cells (1 × 10 5 cells / 100 μl / well) and cultured in 96-well U-bottom plates for 72 hours ( 37 ℃, carbon dioxide 5%). After adding [3H] -methyl thymidine 0.5 μCi and further culturing for 16 hours, the cells were harvested on the filter, and the incorporation of [3H] -methyl thymidine into DNA was measured with a liquid scintillation counter. As a result, a culture with only responder cells showed a response of 179 cpm (negative control). On the other hand, when cultured with stimulator cells, they showed growth responses of 655 and 440 cpm, respectively (positive control). In contrast, the proliferation response to cells derived from homozygotes for all MHC genes was 263 cpm, which was lower than the response to cells derived from stimulators that were not homozygotes for all MHC genes.
［考察］
遺伝学的手法及び免疫学的手法という二つの性格の異なる実験系で同じ結果が得られたことから、得られた２個体はMHC全遺伝子ホモ接合体と言える。
遺伝子のレベルでMHC全遺伝子ホモ接合体であることが明らかになったが、まだ同定していないMHC遺伝子が蛋白質として発現されて拒絶反応を起こす可能性があった。そこで、拒絶反応を試験管内で見ることができる混合リンパ球反応を上記のように行なった。その結果、MHC全遺伝子ホモ接合体リンパ球はMHC全遺伝子ホモ接合体ではないリンパ球には反応したが、MHC全遺伝子ホモ接合体リンパ球には反応しなかった。従って、機能的にも得られた２個体はMHC全遺伝子ホモ接合体であることが判明した。[Discussion]
Since the same results were obtained in two different experimental systems, the genetic method and the immunological method, the two obtained individuals can be said to be homozygotes for all MHC genes.
At the gene level, it became clear that the entire MHC gene was homozygous, but an MHC gene that had not yet been identified could be expressed as a protein and cause rejection. Therefore, a mixed lymphocyte reaction in which rejection was observed in vitro was performed as described above. As a result, all MHC gene homozygous lymphocytes reacted with lymphocytes that were not MHC all gene homozygotes, but did not react with all MHC gene homozygous lymphocytes. Therefore, it was found that the two individuals obtained functionally were homozygous for the entire MHC gene.
実施例２．雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子の取得
［精液採取対象個体］
7歳以上のオスカニクイザルを用いた。Example 2 Obtaining spermatozoa of male cynomolgus monkey MHC all-gene homozygote
Male cynomolgus monkeys over 7 years old were used.
［精液採取に必要な物品］
1. サル保定用ロープ
2. 電気刺激機 (本体、電極、ペニスホルダー、フットペダル)
3. 15mlチューブ (iwaki)
4. ケラチンクリーム
5. ペーパータオル
6. 皮膚保護用軟膏[Articles required for semen collection]
1. Monkey retaining rope
2. Electrical stimulator (main unit, electrode, penis holder, foot pedal)
3.15ml tube (iwaki)
4. Keratin cream
5. Paper towel
6. Skin protection ointment
［方法］
1. 対象個体の給餌器を外し、狭体をゆっくり引いて保定を行った。
2. ロープをサルの手足にかけ、サルの体がケージの扉に大の字の格好で張り付く様に調整して、ロープの端をケージに結びつけた。
3. ケージの前面扉の小窓を開け、サルのペニスを露出させ、生理食塩液でよく洗浄し水分はペーパータオルで拭き取った。
4. ペニスに電極ホルダーを付け、ケラチンクリームを塗って電気の通りを良くし、ホルダーに電極をつないだ。
5.ペニスの反応に注意しながら5Vの直流電気を約5秒間パルス状に通電した。
6. 電気刺激を行っても精液を採取出来なかった場合、通電を停止した。通電と停止の操作を、3回まで繰り返した。
7. 精液の採取が出来なかった場合、電圧を10Vに上げて同様の操作を行った。それでも精液が採取出来なかった場合、電圧を5Vずつ20Vまで上げながら操作を繰り返した。
8. 直流電流で４段階（5V、10V、15V、20V）の電圧による電気刺激を行っても、精液の採取が出来なかった場合は、電流を直流から交流に切り変えた。
9. 直流と同様に、5Vの電圧の交流電流で、約5秒間パルス状に電気刺激を3回まで繰り返した。
10. この操作でも精液が採取出来なかった場合、電圧を10Vに上げて同様の操作を行った。
11. それでも精液が採取出来なかった場合、電圧を5Vずつ上げながら操作を繰り返した。
12. 交流電流で４段階(5V、10V、15V、20V)の電圧による電気刺激を行っても、精液が採取出来なかった場合、そのサルからの精液採取は終了して、他のオス個体の精液採取に取りかかった。
13. サルが射精し始めたら電気刺激を止め、出た精液は無菌の15mlチューブに採取した。
14. 精液の採取が終わったら電極とホルダーを外し、ペニスに皮膚保護軟膏を塗布しておいた。
15. ケージの小窓を閉めてから、足、手の順にロープを解き、狭体を戻した。
16. 採取した精液は、出来る限り人肌程度の温度に保ちながら搬出した。[Method]
1. The subject's feeder was removed, and the narrow body was pulled slowly to keep it.
2. The rope was placed on the limb of the monkey and adjusted so that the body of the monkey would stick to the cage door in a large shape, and the end of the rope was tied to the cage.
3. The small window on the front door of the cage was opened to expose the monkey's penis, washed thoroughly with physiological saline, and wiped with a paper towel.
4. An electrode holder was attached to the penis, keratin cream was applied to improve the electrical path, and the electrode was connected to the holder.
5. While paying attention to the reaction of the penis, 5V DC electricity was applied in pulses for about 5 seconds.
6. If the semen could not be collected even after electrical stimulation, the energization was stopped. The operation of energizing and stopping was repeated up to 3 times.
7. If semen could not be collected, the voltage was raised to 10V and the same operation was performed. If the semen could not be collected, the operation was repeated while increasing the voltage by 5V to 20V.
8. If the semen could not be collected even when the electrical stimulation was performed with DC voltage in 4 steps (5V, 10V, 15V, 20V), the current was switched from DC to AC.
9. As with direct current, electrical stimulation was repeated up to 3 times in a pulse for about 5 seconds with an alternating current of 5V.
10. If semen could not be collected by this operation, the voltage was raised to 10V and the same operation was performed.
11. If the semen could not be collected, the operation was repeated while increasing the voltage by 5V.
12. If semen could not be collected even if the electrical stimulation was performed with AC voltage of 4 levels (5V, 10V, 15V, 20V) with AC current, semen collection from the monkey was terminated and other male individuals I started collecting semen.
13. When the monkeys began to ejaculate, the electrical stimulation was stopped and the resulting semen was collected in a sterile 15 ml tube.
14. When the semen was collected, the electrode and holder were removed, and skin protection ointment was applied to the penis.
15. After closing the small cage window, unfastened the rope in the order of feet and hands, and returned the narrow body.
16. The collected semen was carried out while maintaining the temperature of human skin as much as possible.
実施例３．雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子の取得
［実験方法］
［採卵対象個体］
年齢4歳以上（１５歳まで）、体重2.5〜3.5kgのメスカニクイザルを用いた。Example 3 Obtaining eggs of female cynomolgus monkey MHC homozygote [Method of experiment]
[Individuals for egg collection]
Mes cynomolgus monkeys aged 4 years and older (up to 15 years) and weighing 2.5-3.5 kg were used.
［必要な試薬］
1. 性腺刺激ホルモン放出ホルモン；GnRH (リュープリン（登録商標）)
2. 性腺刺激ホルモン; FSH (ゴナピュール（登録商標）)
3. ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン; hCG (プベローゲン（登録商標）)
4. 硫酸ジヒドロストレプトマイシン（マイシリンゾル（登録商標））
5. ブプレノルフィン塩酸塩（レペタン（登録商標））
6. 塩酸ケタミン（ケタラール（登録商標））
7. 塩酸キシラジン（セラクタール（登録商標））
8. イソフルラン（フォーレン（登録商標））
9. ポピドンヨード（イソジン軟膏（登録商標））
10. 70％アルコール,アルコール綿花
11. ポピドンヨード（イソジン液（登録商標））
12. 採卵用培養液；α-MEM(Modified Eagle’s Medium) +10 % SSS (serum substitute supplement,)
13. 培養用培養液；TALP (modified Tyrode solution with albumin, lactate, and pyruvate) + 0.3% BSA[Required reagents]
1. Gonadotropin releasing hormone; GnRH (Leuplin (registered trademark))
2. Gonadotropin; FSH (Gonapure®)
3. Human chorionic gonadotropin; hCG (Pverogen (registered trademark))
4. Dihydrostreptomycin sulfate (Mycillin sol (registered trademark))
5. Buprenorphine hydrochloride (Repetan (registered trademark))
6. Ketamine hydrochloride (Ketalar®)
7. Xylazine hydrochloride (Seractal (registered trademark))
8. Isoflurane (Foren (registered trademark))
9. Popidone iodine (Isodine ointment (registered trademark))
10. 70% alcohol, alcohol cotton
11. Popidone iodine (Isodine solution (registered trademark))
12. Egg culture medium: α-MEM (Modified Eagle's Medium) +10% SSS (serum substitute supplement,)
13. Culture medium: TALP (modified Tyrode solution with albumin, lactate, and pyruvate) + 0.3% BSA
［準備物品等］
1. 腹腔鏡（関節鏡）
2. 腹腔鏡外套管
3. 操作用鉗子
4. 操作用外套管
5. 20Gカテラン針
6. 2.5mlシリンジ
7. 実体顕微鏡
8. モニター[Prepared goods]
1. Laparoscope (arthroscope)
2. Laparoscopic mantle
3. Forceps for operation
4. Mantle tube for operation
5. 20G cattellan needle
6. 2.5ml syringe
7. Stereo microscope
8. Monitor
［卵巣刺激法］
1. 採卵予定日を決めた。
2. GnRH（リュープリン）を投与するための個体を選抜した。
3. 成熟メスカニクイザルの月経が観察された日、または3ヶ月以上月経が確認できない個体の卵巣を腹腔鏡により観察した。
4. 新たな発育卵胞や排卵痕がない、または卵巣周期休止状態にある個体にGnRH（0.9mg/head）を皮下投与した。
5. GnRH投与から約２週間後、再度腹腔鏡により卵巣観察を行い、卵巣が休止状態にあることを確認し、FSH製剤である卵胞成熟ホルモン (ゴナピュール)を使用し、9日間微量連続投与した。
6. ホルモン投与量は15IU/kg/dayから開始した。
7. 途中、ホルモン投与5日目に、腹腔鏡にて卵胞発育状態を確認した。なお、卵胞発育が十分な個体は同量を維持し、不十分な個体は20IU/kg/day に増量して、いずれも計9日間微量連続投与した。
8. ホルモン投与から10日目、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG：プベローゲン；400IU/kg）を投与し、40時間目に採卵した。[Ovarian stimulation]
1. Decided the date of egg collection.
2. Individuals to administer GnRH (Leuplin) were selected.
3. Laparoscope was used to observe the ovary of an individual who was not able to confirm menstruation for 3 months or more on the day when menstruation was observed in a mature cynomolgus monkey.
4. GnRH (0.9 mg / head) was administered subcutaneously to individuals who had no new developmental follicles or ovulation marks or were in ovarian cycle resting state.
5. About 2 weeks after GnRH administration, ovary observation was performed again by laparoscope, and it was confirmed that the ovary was in a dormant state, and a follicular maturation hormone (gonapur), an FSH preparation, was used for 9 days. .
6. Hormone dose started at 15 IU / kg / day.
7. On the fifth day of hormone administration, the follicular growth status was confirmed with a laparoscope. Individuals with sufficient follicular growth maintained the same amount, while those with insufficient follicles were increased to 20 IU / kg / day, all of which were administered in small amounts for a total of 9 days.
8. On day 10 after hormone administration, human chorionic gonadotropin (hCG: pverogen; 400 IU / kg) was administered, and eggs were collected at 40 hours.
［採卵方法］
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの投与40時間目に、卵巣刺激を行った個体から麻酔下にて腹腔鏡を用い、成熟未受精卵子を吸引採取した。
1. あらかじめ採卵用培養液を入れた2.5mlシリンジを挿入した20Gカテラン針に付け、腹腔鏡下にて発育卵胞より卵胞液と共に卵丘-卵子複合体を丁寧に吸引採取した。
2. 同様に発育卵胞からの採卵を繰り返した。
3. 回収液は直ちに実体顕微鏡下で検卵し、卵丘-卵子複合体はα-MEM+10 % SSS、37℃、5% CO2条件下で培養した。
4. 採卵作業が終了した後、抗生物質と鎮痛剤を3日間連続して筋肉内投与した。[Oocyte collection method]
At 40 hours after administration of human chorionic gonadotropin, mature unfertilized ova were aspirated and collected from an individual subjected to ovarian stimulation under anaesthesia using a laparoscope.
1. It was attached to a 20G cattellan needle inserted with a 2.5 ml syringe containing an egg-collecting culture medium in advance, and the cumulus-oocyte complex was carefully aspirated and collected from the follicular fluid under the laparoscope.
2. In the same manner, egg collection from the growing follicle was repeated.
3. The collected solution was immediately examined under a stereomicroscope, and the cumulus-egg complex was cultured under α-MEM + 10% SSS, 37 ° C., 5% CO 2 conditions.
4. After completing the egg collection work, antibiotics and analgesics were administered intramuscularly for 3 consecutive days.
［麻酔法］
腹腔鏡による卵巣観察、採卵のそれぞれの手術の際の麻酔法は、塩酸ケタミン（5mg/kg）と塩酸キシラジン（1mg/kg）の混合液を筋肉内投与とした。３０分を超える場合は、1.5-3.0％イソフルランによる吸入麻酔を施した。[Anesthesia]
As anesthesia for laparoscopic ovary observation and egg collection, a mixture of ketamine hydrochloride (5 mg / kg) and xylazine hydrochloride (1 mg / kg) was administered intramuscularly. If it exceeded 30 minutes, inhalation anesthesia with 1.5-3.0% isoflurane was performed.
［採取卵子のステージ分けと前培養］
採卵した卵子の発育段階によるステージ分けを行った。
1. 卵胞から採取された卵丘-卵子複合体はα-MEM+10 % SSS、 37℃、5% CO2条件下で培養した。
2. その後、ヒアルロニダーゼに曝すことにより(< 1分間)卵丘細胞を除去し、卵子の成熟ステージごとにMII卵子 (Metaphase II) 、MI卵子 (Metaphase I)、GV卵子 (Germinal Vesicle) 、Dg卵子 (Degenerate) の４つに分類し、TALP (modified Tyrode solution with albumin, lactate, and pyruvate) + 0.3% BSAにて37℃、5% CO2条件下で約1時間、インキュベートを行った。[Staging and pre-culture of collected eggs]
Stages were classified according to the stage of development of the collected eggs.
1. The cumulus-ovum complex collected from the follicle was cultured under conditions of α-MEM + 10% SSS, 37 ° C., 5% CO 2 .
2. Subsequent exposure to hyaluronidase (<1 minute) removes cumulus cells, and MII eggs (Metaphase II), MI eggs (Metaphase I), GV eggs (Germinal Vesicle), Dg eggs at each maturation stage of the egg. (Degenerate), and incubated with TALP (modified Tyrode solution with albumin, lactate, and pyruvate) + 0.3% BSA under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for about 1 hour.
実施例４．雄カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の精子及び雌カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体の卵子から得られうる受精卵の取得
次のようにして卵子を準備した。Example 4 Obtaining fertilized eggs obtained from sperm of male cynomolgus monkey MHC full gene homozygote and egg of female cynomolgus monkey MHC full gene homozygote Oocytes were prepared as follows.
［必要な試薬］
1. Hyaluronidase
2. TALP+0.3％BSA (T3)
3. TALP-Hepes+0.3％BSA[Required reagents]
1. Hyaluronidase
2. TALP + 0.3% BSA (T3)
3. TALP-Hepes + 0.3% BSA
［必要な物品］
1. インキュベータ
2. 倒立型顕微鏡
3. 200μlピペット
4. Double dish (Falcon)
5. ガラスピペット (胚の操作用)[Necessary goods]
1. Incubator
2. Inverted microscope
3. 200μl pipette
4. Double dish (Falcon)
5. Glass pipette (for embryo manipulation)
［方法］
1. 採取した卵子をヒアルロニダーゼにて処理(＜1分間)し、卵丘細胞を除去した。
2. 裸化した卵子はT3培地に入れ、インキュベータで約1時間前培養した。
3. 前培養の後、MII(第二減数分裂中期)卵子を顕微授精（ICSI）に供した。[Method]
1. Treated eggs with hyaluronidase (<1 minute) to remove cumulus cells.
2. Naked eggs were placed in T3 medium and pre-cultured for about 1 hour in an incubator.
3. After pre-culture, MII (second meiotic metaphase) eggs were subjected to microinsemination (ICSI).
次のようにして精子を調製した。 Sperm was prepared as follows.
［必要な試薬］
1. BWW
2. BWW+Caffeine+cAMP (精子活性化用)[Required reagents]
1. BWW
2. BWW + Caffeine + cAMP (for sperm activation)
［必要な物品］
1. インキュベータ (37℃、5%CO2)
2. 遠心分離機 (1400rpm)
3. 倒立型顕微鏡
4. 15mlチューブ
5. 10ml ピペット
6. 1mlピペットマン
7. マクラー精子数カウントチャンバー[Necessary goods]
1. incubator (37 ℃, 5% CO 2 )
2. Centrifuge (1400rpm)
3. Inverted microscope
4. 15ml tube
5. 10ml pipette
6. 1ml pipette man
7. McLar sperm count chamber
［方法］
新鮮な精子を使用する場合は、次のようにした。
1. 精子を電気刺激法により採取した。
2. 採取した精液は15mlチューブに入れ、37℃、5%CO2 インキュベータ内で静置後、液状部分のみを別の15mlチューブに移し、BWW+Caffeine+cAMPを10ml加えて混和した。
3. 37℃、5%CO2インキュベータ内で1時間の前培養を行った後、1,400rpmで3分間遠心した。
4. 約0.5ml残して上清を捨てた。
5. 沈殿を崩さない様に約1mlになる様にBWW+Caffeine+cAMPを加え、インキュベータ内でスイムアップさせた。
6.スイムアップした精子を顕微授精に使用した。[Method]
When using fresh sperm, it was as follows.
1. Sperm was collected by electrical stimulation.
2. The collected semen was placed in a 15 ml tube and allowed to stand in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Then, only the liquid part was transferred to another 15 ml tube, and 10 ml of BWW + Caffeine + cAMP was added and mixed.
3. Pre-culture was performed for 1 hour in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator and then centrifuged at 1,400 rpm for 3 minutes.
4. The supernatant was discarded leaving about 0.5 ml.
5. BWW + Caffeine + cAMP was added so that it might become about 1 ml so that precipitation might not be destroyed, and it was made to swim up in an incubator.
6. Swim-up sperm was used for microinsemination.
凍結保存精子を使用する場合は、精子融解後に次のようにした。
1. ラウンドチューブにBWW+0.3%BSA+Caffeine+cAMPを37℃に暖めておいた。
2. 液体窒素中からストローを取り出し、室温で30秒間融解した。その後、37℃の温水中で30秒間融解した。
3. ストローの両端を切断し、BWW+Caffeine+cAMP内に融解精子を混和した。
4. 37℃、5%CO2インキュベータ内で静置した。
5. その後、1,400rpmで3分間遠心し、約0.5ml残して上清を捨てた。
6. 沈殿を崩さない様にBWW+Caffeine+cAMPで約1mlまでメスアップし、インキュベータ内でスイムアップさせた。
7.スイムアップした精子を回収し、使用した。When using cryopreserved sperm, the following was performed after sperm thawing.
1. BWW + 0.3% BSA + Caffeine + cAMP was warmed to 37 ° C in a round tube.
2. The straw was taken out of the liquid nitrogen and thawed at room temperature for 30 seconds. Then, it thawed for 30 seconds in 37 ° C. warm water.
3. Both ends of the straw were cut, and the molten sperm was mixed in BWW + Caffeine + cAMP.
4. It was allowed to stand in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
5. Thereafter, the mixture was centrifuged at 1,400 rpm for 3 minutes, and the supernatant was discarded leaving about 0.5 ml.
6. Make up to about 1 ml with BWW + Caffeine + cAMP so as not to disrupt the precipitate, and then swim up in the incubator.
7. Swim-up sperm was collected and used.
次のようにして顕微授精を行った。 Microinsemination was performed as follows.
［必要な試薬］
1. PVP (ナカメディカル SAGE PVP 7%)
2. TALP-Hepes+0.3％BSA (TH3)
3. TALP+0.3％BSA (T3)
4. CMRL+20%BS[Required reagents]
1. PVP (Naka Medical SAGE PVP 7%)
2. TALP-Hepes + 0.3% BSA (TH3)
3. TALP + 0.3% BSA (T3)
4. CMRL + 20% BS
［必要な物品］
1. 倒立型顕微鏡(Olympus)
2. マイクロマニュピレーター
3. インジェクター (セルトラム)
4. インキュベータ
5. 6cm dish (Falcon)
6. 10μlピペット + チップ
7. ICSI用インジェクションピペット
8. ICSI用ホールディングピペット
9. ガラスピペット (胚の操作用)[Necessary goods]
1. Inverted microscope (Olympus)
2. Micromanipulator
3. Injector (Celtram)
4. Incubator
5. 6cm dish (Falcon)
6. 10 μl pipette + tip
7. Injection pipette for ICSI
8. Holding pipette for ICSI
9. Glass pipette (for embryo manipulation)
［方法］
1. 第一極体の放出が見られる第二減数分裂中期卵（MII卵子）を用いた。
2. 顕微授精（Intra Cytoplasmic Sperm Injection, ICSI）には、オスカニクイザルから採取した新鮮精子または凍結融解精子を用いた。
3. ICSIは、マイクロマニュピレーターを装備した倒立型顕微鏡を用い、インジェクターの先端にICSI用インジェクションピペットを接続して行った。
4. 運動性良好の精子を探し、不動化した。
5. MII卵子は、ホールディングピペットで保持した。
6. 不動化した精子を１個ずつインジェクションピペット内に吸引し、卵子細胞質内に、精子をゆっくり注入した。
7. 精子が卵子細胞質内に入ったことを確認した後、インジェクションピペットをゆっくり抜いた。
8. ホールディングピペットから卵子を離し、生存卵子をT3培地に移し、２細胞期胚までT3培地で培養し、２細胞期胚以降はCMRL+20%BSに移して、38℃、5% CO2、5% O2インキュベータ内で7〜9日間培養した。[Method]
1. A second meiotic egg (MII egg) with a first polar body release was used.
2. Fresh or frozen-thawed sperm collected from male cynomolgus monkeys were used for microinsemination (Intra Cytoplasmic Sperm Injection, ICSI).
3. ICSI was performed by using an inverted microscope equipped with a micromanipulator and connecting an injection pipette for ICSI to the tip of the injector.
4. Searched for sperm with good motility and immobilized.
5. MII eggs were held with a holding pipette.
6. Each immobilized sperm was sucked into the injection pipette one by one, and the sperm was slowly injected into the egg cytoplasm.
7. After confirming that the sperm had entered the ovum cytoplasm, the injection pipette was slowly removed.
8. Release the ovum from the holding pipette, transfer the viable ovum to T3 medium, culture in T3 medium up to the 2-cell stage embryo, transfer to CMRL + 20% BS after the 2-cell stage embryo, 38 ° C, 5% CO 2 The cells were cultured in a 5% O 2 incubator for 7 to 9 days.
顕微授精後、20-26時間目までに２細胞期胚へと発生した。２日目に４細胞期胚、３日目に６−８細胞期胚、４日目に８−10細胞期胚、５日目に12−桑実胚、６日目に桑実胚-凝集桑実胚、７日目に早期胚盤胞期胚-胚盤胞期胚、８日目に胚盤胞期胚-拡張胚盤胞期胚へと発生した。 It developed into a 2-cell embryo by 20-26 hours after microinsemination. 4th-stage embryo on the 2nd day, 6-8th-stage embryo on the 3rd day, 8-10th-stage embryo on the 4th day, 12-morula on the 5th day, Mulberry embryo on the 6th day-Aggregation Mulberry embryos, early blastocyst stage-blastocyst stage embryo on day 7 and blastocyst stage embryo-expanded blastocyst stage embryo on day 8.
Mafa-hp1陽性サル群を使用する研究応用例
特定のMHC homozygous個体から同じMHC heterozygous個体への臓器または細胞移植では拒絶は起こらない。一方、逆の方向では拒絶が起こる。すなわち、特定のMHC heterozygous個体から同じMHC個体homozygousへの臓器または細胞移植は不可能である。従って、特定のMHC homozygous個体を有していることが重要である。Research application using Mafa-hp1-positive monkeys No rejection occurs in organ or cell transplantation from a specific MHC homozygous individual to the same MHC heterozygous individual. On the other hand, rejection occurs in the opposite direction. That is, organ or cell transplantation from a specific MHC heterozygous individual to the same MHC individual homozygous is impossible. Therefore, it is important to have a specific MHC homozygous individual.
カニクイザルのMHCはMafaと名付けられている。また、特定の10種類のMafa遺伝子セットをハプロタイプと呼んでいる。本発明で開示した10種類の遺伝子セットを本書で「Mafa-hp1」と呼ぶことがある。 The cynomolgus monkey MHC is named Mafa. In addition, 10 specific Mafa gene sets are called haplotypes. The ten gene sets disclosed in the present invention may be referred to herein as “Mafa-hp1”.
１）再生医療
癌の転移や肝癌のために大部分の肝臓を除去した患者に、自分のiPS細胞から作製した肝細胞を投与することにより、肝臓の機能を補えるかどうかの前臨床試験は重要である。それぞれのサルからiPS細胞を作製し肝細胞に分化させ、それぞれのサルにこの肝細胞を移植することも可能である。しかし、実際の臨床応用とは異なり、前臨床試験では、実験の有意差を調べるために実験個体を増やすことやそれぞれのiPS細胞間の質的差をなくすことが必要である。そこで、同じiPS細胞由来の肝細胞を別の多くの個体に移植する実験系が有用となる。1) Regenerative medicine Preclinical studies are important to determine whether hepatocytes prepared from their own iPS cells can be supplemented to patients whose liver has been removed due to cancer metastasis or liver cancer. It is. It is also possible to prepare iPS cells from each monkey, differentiate them into hepatocytes, and transplant these hepatocytes into each monkey. However, unlike actual clinical application, in preclinical studies, it is necessary to increase the number of experimental individuals and eliminate qualitative differences between each iPS cell in order to examine the significant difference in the experiment. Thus, an experimental system in which the same iPS cell-derived hepatocytes are transplanted into many different individuals is useful.
本発明者らはすでにMafa-hp1 homozygousサルからいくつかのiPS細胞株を樹立している。これらのiPS細胞株から肝細胞を誘導し、大部分の肝臓を除去した他のMafa-hp1 homozygousまたはheterozygousサルに移植し、移植した肝細胞の機能を調べることができる。 The present inventors have already established several iPS cell lines from Mafa-hp1 homozygous monkeys. Hepatocytes can be induced from these iPS cell lines, transplanted to other Mafa-hp1 homozygous or heterozygous monkeys from which most of the liver has been removed, and the function of the transplanted hepatocytes can be examined.
このことは、癌に限らず、肝臓の機能の低下しているアルコール性やウイルス性の肝硬変の治療にも応用が可能である。また、遺伝子変異により肝機能の低下している先天性疾患の場合では、自分のiPS細胞由来の肝細胞を作製しても、この細胞自体に遺伝子変異があるので有用ではない。そこで、HLAの一致する人由来のiPS細胞から作製した肝細胞を移植する必要がある（肝臓移植をする必要がないので、iPS細胞提供者にはほとんど負担がかからない）。このような臨床応用では、MHCの一致するサルへのiPS細胞由来肝細胞移植実験での前臨床のデータがそのまま使用できるので、ますますサルでの前臨床実験は重要になってくる。 This can be applied not only to cancer but also to treatment of alcoholic or viral cirrhosis in which the function of the liver is reduced. In the case of a congenital disease in which liver function is reduced due to a gene mutation, it is not useful to produce a hepatocyte derived from its own iPS cell because the cell itself has a gene mutation. Therefore, it is necessary to transplant hepatocytes prepared from iPS cells derived from a person with a matching HLA (since there is no need for liver transplantation, there is almost no burden on the iPS cell provider). In such clinical applications, pre-clinical experiments in monkeys are becoming more and more important because pre-clinical data in iPS cell-derived hepatocyte transplantation experiments to monkeys with matching MHC can be used as they are.
同じことが、膵臓のラ氏島細胞にもあてはまる。重症の糖尿病の患者にも応用可能になる。その他、神経、骨、軟骨の再生等のiPS細胞から分化可能な細胞を移植する治療にはサルでの前臨床実験が必要と考えられる。 The same applies to the islet cells of the pancreas. It can also be applied to patients with severe diabetes. In addition, pre-clinical experiments in monkeys are considered necessary for the treatment of transplanting differentiable cells from iPS cells such as nerve, bone, and cartilage regeneration.
２）癌モデル
癌は日本人の死因の一位であり、種々の治療法が施行されているが、未だに制圧されてはいない。細胞生物学や分子生物学の知見が集積し、マウスでは癌の治療研究（特に免疫療法）において治療成績は向上してきている。しかし、マウスとヒトはどちらもほ乳類であるが、これまでの経験からマウスで有効であった癌治療法（特に免疫療法）をヒトに適応した場合有効であることが少ないことがわかっている。そこで、マウスで有効であった癌治療法をヒトに適用する前に、よりヒトに近い動物モデルで実証する必要がある。2) Cancer model cancer is the leading cause of death in Japan, and various treatments have been implemented, but it has not yet been suppressed. The knowledge of cell biology and molecular biology has been accumulated, and in mice, therapeutic results have improved in cancer treatment research (especially immunotherapy). However, although both mice and humans are mammals, it has been found from experience so far that they are rarely effective when cancer therapy (particularly immunotherapy) that has been effective in mice is applied to humans. Therefore, before applying a cancer therapy effective in mice to humans, it is necessary to demonstrate it in an animal model closer to humans.
サルの癌モデルは、癌ができてもその癌を移植できないために一定の実験数を確保できない。サルの癌モデルを確立するためには、癌細胞のMHCと同じMHCを有するサルを用意しなければならない。Mafa-hp1 homozygousサル由来の癌細胞株があれば、Mafa-hp1 heterozygousのサルに移植可能となり、サルの癌モデルが完成する。一方、我々はすでにMafa-hp1 homozygousメスサルからiPS細胞を樹立している。この細胞はiPS細胞作製に必要とされた４遺伝子を導入してある。この内Mycは高率に癌化を誘導するので、この細胞を肝細胞に分化させた後に、他の癌遺伝子の導入や癌抑制遺伝子の抑制により肝癌細胞が確立されると考えられる。また、NOD-scidマウスなどに移植するとテラトーマができるので、この細胞を培養して分化した癌細胞を確立することも可能と考えられる。 The monkey cancer model cannot secure a certain number of experiments because it can not be transplanted even if it has cancer. In order to establish a monkey cancer model, a monkey having the same MHC as that of cancer cells must be prepared. If there is a cancer cell line derived from Mafa-hp1 homozygous monkeys, it can be transplanted into Mafa-hp1 heterozygous monkeys, and a monkey cancer model is completed. On the other hand, we have already established iPS cells from Mafa-hp1 homozygous female monkeys. In this cell, 4 genes required for iPS cell production have been introduced. Of these, Myc induces canceration at a high rate, and it is considered that hepatoma cells are established by introducing other oncogenes or suppressing tumor suppressor genes after the cells are differentiated into hepatocytes. In addition, since teratomas can be formed when transplanted into NOD-scid mice and the like, it is considered possible to establish differentiated cancer cells by culturing these cells.
また、血球系への分化も可能であり、白血病モデルも作製可能と考えられる。その他、将来的には自在に種々の癌モデルを作製することが可能になると期待される。この研究を通して、現在ある意味人体実験に近い種々の癌治療法をサルで行ない、より有効な治療法のみを選択できる。これにより、患者の負担を軽減させることが可能になると考えられる。 In addition, it can be differentiated into a blood cell lineage, and a leukemia model can be produced. In addition, it is expected that various cancer models can be freely created in the future. Through this research, monkeys can perform various cancer treatments that are similar to human experiments in the current sense, and only the more effective treatments can be selected. Thereby, it is considered possible to reduce the burden on the patient.
３）骨髄移植モデル
白血病の治療には骨髄移植が使用されているが、他の癌治療では治療効果は明確にはなっていない。マウスでは白血病以外の悪性腫瘍の治療にも骨髄移植が効果を示すことが判明しているが、いきなり癌患者に骨髄移植するのは人体実験に近く危険である。上記のサルでの癌モデルが確立したら、骨髄移植による癌治療の効果を判定できる。どのような癌には骨髄移植による治療が可能か、どの程度の骨髄細胞を移入すればよいか、放射線量はどの程度必要かなどの検定が可能になる。3) Bone marrow transplantation model Bone marrow transplantation is used to treat leukemia, but the therapeutic effect is not clear for other cancer treatments. Bone marrow transplantation has been shown to be effective in the treatment of malignant tumors other than leukemia in mice, but suddenly bone marrow transplantation to cancer patients is close to human experiments and is dangerous. Once the above monkey cancer model has been established, the effect of cancer treatment by bone marrow transplantation can be determined. It is possible to test what kind of cancer can be treated by bone marrow transplantation, how much bone marrow cells should be transferred, and how much radiation dose is required.
４）感染症モデル
マウスでも感染実験は可能であるが、常に適切な感染モデルになるとは限らない。例えば、インフルエンザ感染ではマウスはインフルエンザ抵抗性の遺伝子が欠損しており、インルエンザに感受性が高くなっている。すなわち、高病原性インフルエンザウイルスでなくてもマウスは簡単に死亡する。従って、サルが人により近いモデルとなっている。4) Infectious disease model Infection experiments are possible with mice, but they are not always appropriate infection models. For example, in influenza infection, mice are deficient in influenza resistance genes and are more susceptible to inluenza. That is, mice die easily even if they are not highly pathogenic influenza viruses. Therefore, the monkey is a model closer to humans.
病原体が感染すると、宿主の免疫を抑えて自分の生き残りを計ることが多い。免疫系の細胞の機能を調べることにより、感染時に免疫系の細胞が抑制されているかどうか明らかになる。一方、宿主の免疫系が過剰に反応してサイトカインを大量に産生し、サイトカインストームと呼ばれる状態になることもある。免疫系が過剰に反応した場合と抑制された場合では治療方法が逆になる。 When a pathogen is infected, the host's immunity is often suppressed to measure their survival. By examining the function of cells of the immune system, it becomes clear whether the cells of the immune system are suppressed during infection. On the other hand, the immune system of the host may react excessively to produce a large amount of cytokines, resulting in a state called cytokine storm. The treatment is reversed when the immune system reacts excessively and when it is suppressed.
MHC分子は移植に関与するだけでなく、外来抗原由来ペプチドをT（リンパ球）細胞に提示し活性化することができる（図２）。従って、MHCの判明しているサルを感染実験に使用することにより、T細胞の活性化を調べることが可能になる。すなわち、特定のMHCに結合する病原体由来のペプチドを同定できるので、このペプチドで感染個体のT細胞を刺激して、感染後のT細胞が活性化されているのか、病原体により反応性が抑制されているのかの検索が可能になる。これにより、ウイルス感染に対する治療法の方向性が決定される。また、MHCの判明しているサルを使用すれば、ワクチンや治療薬を投与した場合の免疫反応の増強の程度もモニタリングでき、より効果的なワクチンや治療薬の開発に寄与すると考えられる。 MHC molecules are not only involved in transplantation, but can also present and activate foreign antigen-derived peptides to T (lymphocyte) cells (FIG. 2). Therefore, it becomes possible to examine the activation of T cells by using monkeys with known MHC for infection experiments. In other words, since a peptide derived from a pathogen that binds to a specific MHC can be identified, the T cell of an infected individual is stimulated with this peptide, and whether the T cell after infection is activated or the reactivity is suppressed by the pathogen. It becomes possible to search if it is. This determines the direction of treatment for viral infection. In addition, if monkeys with known MHC are used, it is possible to monitor the degree of enhancement of the immune response when a vaccine or therapeutic agent is administered, which will contribute to the development of more effective vaccines or therapeutic agents.
Claims (10)
（Ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザル
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。 (A) at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10; and (B) MHC comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey that is homozygous for all genes.
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を含む、カニクイザルMHC全遺伝子ホモ接合体を作製するためのキット。 (A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A kit for producing a cynomolgus MHC whole gene homozygote comprising at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を受精させて得られうる受精卵。 (A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A fertilized egg obtainable by fertilizing at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for the entire MHC gene.
（ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも１種の雌カニクイザルの卵子
を受精させる工程を含む、カニクイザルMHC遺伝子ホモ接合体の作製方法。 (A) sperm of at least one male cynomolgus monkey that is homozygous for the entire MHC gene comprising the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (b) from the DNA sequence represented by SEQ ID NOs: 1-10. A method for producing a cynomolgus MHC gene homozygote comprising the step of fertilizing at least one female cynomolgus monkey egg that is homozygous for all MHC genes.
（Ｂ）配列番号１〜１０で表されるDNA配列からなるMHC全遺伝子に関してホモ接合体である少なくとも1種の雌カニクイザル
のみからなる、カニクイザルの集団。 (A) at least one male cynomolgus monkey homozygous for all MHC genes comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 10; and (B) MHC comprising the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 1-10. At least one female cynomolgus monkey that is homozygous for all genes
A group of cynomolgus monkeys consisting only of
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| JPN6011042515; 北 夕紀、他: 'カニクイザル３集団におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子（Ｍａｆａ-Ａ）の多型性の比較．' ＭＨＣ ｖｏｌ． １６， ｎｏ． ２, 2009, ｐ． ７９ （Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ-２） * |
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