JP5847140B2 - Test method for chronic thromboembolic pulmonary hypertension - Google Patents
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Description
本発明は、主に慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査方法に関する。また、本発明は慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査キットにも関する。 The present invention mainly relates to a test method for chronic thromboembolic pulmonary hypertension. The present invention also relates to a test kit for chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
慢性血栓塞栓性肺高血圧症（Chronic thromboembolic pulmonary hypertension、CTEPH）は、我が国では難病として指定をされている原因が不明な疾患である。慢性血栓塞栓性肺高血圧症は、比較的中枢の肺動脈内に生じた血栓により肺血管床が減少し、肺高血圧が生じる病態であると考えられている。急性肺塞栓症から２年間で3.8％の患者が移行して発症をすると考えられている（非特許文献１）。しかしながら、60％の患者では深部静脈血栓症の症状がないことが報告されている（非特許文献２）。従って、深部静脈血栓症の症状がない患者では、無症候性の血栓塞栓症なのか、別のメカニズムにより生じる病態であるかは明らかにされていない。 Chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH) is a disease whose cause has been designated as an intractable disease in Japan. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension is considered to be a pathological condition in which the pulmonary vascular bed is reduced due to a thrombus formed in a relatively central pulmonary artery, resulting in pulmonary hypertension. It is considered that 3.8% of patients will shift from acute pulmonary embolism in 2 years to develop the disease (Non-patent Document 1). However, it has been reported that 60% of patients have no symptoms of deep vein thrombosis (Non-patent Document 2). Therefore, it has not been clarified whether patients with no symptoms of deep vein thrombosis are asymptomatic thromboembolism or a pathological condition caused by another mechanism.
また、欧米などの海外では抗リン脂質抗体陽性、脾臓摘出、ペースメーカー感染などが、慢性血栓塞栓性肺高血圧症のリスク因子として報告されている。しかしながら、我が国での慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者では、脾臓摘出やペースメーカー感染を合併している患者は少ない。 In addition, anti-phospholipid antibody positive, splenectomy, pacemaker infection, etc. have been reported as risk factors for chronic thromboembolic pulmonary hypertension in foreign countries such as Europe and America. However, few patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension in Japan have splenectomy or pacemaker infection.
近年、治療方法の確立により、慢性血栓塞栓性肺高血圧症は正しく診断を行うことができれば、十分な治療効果が期待できる。しかしながら、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者が初期に訴える自覚症状は、労作時の息切れ、呼吸困難、胸痛などの非特異的な症状に止まる。そのため、医師は主に問診を通じて、患者が慢性血栓塞栓性肺高血圧症を有している可能性を判断する必要がある。さらに、慢性血栓塞栓性肺高血圧症を正確に検査するためには、右心カテーテル検査、肺換気・血流シンチグラム、胸部造影CT等の検査を行う必要がある。すなわち、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査は、入院が必要であり、患者及び医療従事者の双方にとって負担が大きいのが現状である。 If chronic thromboembolic pulmonary hypertension can be correctly diagnosed by establishing a treatment method in recent years, a sufficient therapeutic effect can be expected. However, subjective symptoms initially reported by patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension are limited to nonspecific symptoms such as shortness of breath, difficulty in breathing, and chest pain. Therefore, doctors need to determine the possibility that a patient has chronic thromboembolic pulmonary hypertension mainly through an interview. Furthermore, in order to accurately examine chronic thromboembolic pulmonary hypertension, examinations such as right heart catheter examination, pulmonary ventilation / blood flow scintigram, and thoracic contrast CT are required. That is, the examination of chronic thromboembolic pulmonary hypertension requires hospitalization, and the current situation is that both patients and medical workers are burdened.
このような現状において、外来おいて、主にスクリーニング目的で、採血などによりに実施できる、簡便かつ正確に慢性血栓塞栓性肺高血圧症を検査できる方法が望まれている。 Under such circumstances, there is a demand for a method that can easily and accurately test chronic thromboembolic pulmonary hypertension that can be carried out by blood sampling or the like mainly for screening purposes in an outpatient setting.
本発明は、簡便かつ正確に慢性血栓塞栓性肺高血圧症を検査できる方法の提供を、主な課題とする。本発明はまた、斯かる検査方法を実施できる慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査キットを提供することをも課題とする。 The main object of the present invention is to provide a method capable of examining chronic thromboembolic pulmonary hypertension simply and accurately. Another object of the present invention is to provide a test kit for chronic thromboembolic pulmonary hypertension that can carry out such a test method.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の試料中の濃度及び／又は試料中での血小板の活性化を指標として、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査ができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに検討をかさねることにより完成したものである。 The present inventor has conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the concentration of Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein in the sample and / or platelet activation in the sample is used as an index. We found that we can test for pulmonary hypertension. The present invention has been completed by conducting further studies based on such findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を包含する。 That is, this invention includes the invention of the aspect hung up below.
項１、 （i）Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の試料中の濃度、及び
（ii）試料中での血小板の活性化
の少なくとも１つを指標とする、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査方法。
Item 1, (i) Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration in sample, and (ii) Chronic thromboembolic pulmonary hypertension using at least one of platelet activation as an index Method.
項２、 （i）TAFIタンパク質の試料中の濃度、及び
（ii）試料中での血小板の活性化
を指標とする、項１に記載の検査方法。
Item 2. The test method according to Item 1, wherein (i) the concentration of the TAFI protein in the sample, and (ii) platelet activation in the sample are used as indices.
項３、 ［1］（i）試料中のThrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の濃度測定、及び（ii）試料中の血小板の活性化の評価の少なくとも１つを実施する工程、並びに、
［2］上記［1］の結果に基づき、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無及び／又はリスクを評価する工程
を含む、項１又は２に記載の検査方法。
Item 3, [1] (i) performing at least one of Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration measurement in the sample, and (ii) evaluating platelet activation in the sample, and
[2] The examination method according to Item 1 or 2, comprising a step of evaluating the presence and / or risk of chronic thromboembolic pulmonary hypertension based on the result of [1] above.
項４、 TAFIタンパク質の濃度が予め設定したカットオフ値より大きい場合に、慢性血栓塞栓性肺高血圧症である及び／又は発症するリスクがあると評価する、項３に記載の検査方法。 Item 4. The test method according to Item 3, wherein when the concentration of TAFI protein is greater than a preset cutoff value, the thromboembolic pulmonary hypertension is evaluated and / or there is a risk of developing.
項５、 血小板全体に対する活性化した血小板の割合が予め設定したカットオフ値以上である場合に、慢性血栓塞栓性肺高血圧症である及び／又は発症するリスクがあると評価する、項３に記載の検査方法。 Item 5, if the ratio of activated platelets to the total platelets is equal to or higher than a preset cutoff value, evaluate that there is a risk of developing and / or developing chronic thromboembolic pulmonary hypertension Inspection method.
項６、 （a）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第１のカットオフ値より大きい場合、又は、（b）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第２のカットオフ値より大きく第１のカットオフ値以下であり、かつ、血小板全体に対する活性化した血小板の割合が第3のカットオフ値以上である場合に慢性血栓塞栓性肺高血圧症である及び／又は発症するリスクがあると評価する、項３に記載の検査方法。 Item 6, (a) when the concentration of TAFI protein is greater than a preset first cutoff value, or (b) when the concentration of TAFI protein is greater than a preset second cutoff value, the first cutoff A value that is less than or equal to the value, and that the ratio of activated platelets to total platelets is greater than or equal to the third cut-off value, evaluates that the patient is at risk of developing and / or developing chronic thromboembolic pulmonary hypertension 3. The inspection method according to 3.
項７、 （i）Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の濃度を測定するための手段、及び
（ii）血液試料中での血小板の活性化を評価するための手段
の少なくもと１つを含む、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査キット。
Item 7, including (i) means for measuring Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration, and (ii) at least one means for assessing platelet activation in a blood sample Chronic thromboembolic pulmonary hypertension test kit.
本発明により、簡便かつ正確に慢性血栓塞栓性肺高血圧症を検査できる方法が提供される。本発明の検査方法は、患者の血液を検査することで行うことができる、外来診療で実施することができるなどの理由により、患者及び医療従事者の双方への負担が小さい。 The present invention provides a method capable of examining chronic thromboembolic pulmonary hypertension easily and accurately. The inspection method of the present invention can be performed by examining a patient's blood, and can be performed in an outpatient clinic. Therefore, the burden on both the patient and the medical staff is small.
本発明の検査方法により、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の患者が積極的に検査され、その結果、患者が有効な治療を早期に受けることができるようになると期待される。 With the testing method of the present invention, patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension are actively tested, and as a result, it is expected that patients will be able to receive effective treatment early.
１．慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査方法
慢性血栓塞栓性肺高血圧症
本発明の検査方法は、慢性血栓塞栓性肺高血圧症（Chronic thromboebolic pulmonary hypertension、CTEPH）を対象とする。
1. Test method for chronic thromboembolic pulmonary hypertension
Chronic thromboembolic pulmonary hypertension The test method of the present invention targets chronic thromboebolic pulmonary hypertension (CTEPH).
慢性血栓塞栓性肺高血圧症とは、器質化した血栓により肺動脈が慢性的に閉塞を起こし、肺高血圧症を合併し、労作時の息切れなどを認める疾患を主に指す。顕著な臨床所見としては、上昇した肺動脈圧（ｍPAP、例えば25mmHg以上）と正常な肺動脈楔入圧（右心房圧）（PCWP、例えば、15mmHg以下）（以上は、例えば右心カテーテル検査で測定できる。）；肺血流分布の異常が認められること（例えば、肺換気・血流シンチグラム検査により測定できる。）；肺動脈に慢性化した慢性化した血栓が認められること（例えば、胸部CT（コンピューター断層撮影法）検査、肺動脈造影、光干渉断層撮影（optical coherence tomography、OCT）により検査をすることができる。）が挙げられる。 Chronic thromboembolic pulmonary hypertension mainly refers to a disease in which the pulmonary artery is chronically obstructed by an organized thrombus, which is combined with pulmonary hypertension, and shortness of breath is observed during exertion. Prominent clinical findings include elevated pulmonary arterial pressure (mPAP, eg 25 mmHg or higher) and normal pulmonary artery wedge pressure (right atrial pressure) (PCWP, eg 15 mmHg or lower) (which can be measured, for example, by right heart catheterization) ); Abnormality in pulmonary blood flow distribution (eg, can be measured by pulmonary ventilation / blood flow scintigram); Chronic thrombosis in pulmonary artery is observed (eg, chest CT (computer Tomography), pulmonary arteriography, and optical coherence tomography (OCT).).
臨床においては、CTEPHと他の肺高血圧症（pulmonary hypertension、PH）との鑑別をする必要がある。肺高血圧症の病態に応じて、適した処置が異なるためである。鑑別の対象となる他の肺高血圧症は、特発性肺動脈性肺高血圧症、左心疾患による肺高血圧症、肺疾患および／または低酸素による肺高血圧症、膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症などを含む。特に、特発性肺動脈性肺高血圧症（Pulmonary Arterial Hypertension）との鑑別が重要である。慢性血栓塞栓性肺高血圧症は、通常、カテーテル治療（経皮的肺動脈形成術）や血栓内膜摘出術などの処置により肺高血圧の正常化を図り、一方で、特発性肺動脈性肺高血圧症は経口薬などの対症療法を施す。 In clinical practice, it is necessary to differentiate between CTEPH and other pulmonary hypertension (PH). This is because the appropriate treatment varies depending on the pathology of pulmonary hypertension. Other pulmonary hypertension to be identified include idiopathic pulmonary arterial hypertension, pulmonary hypertension due to left heart disease, pulmonary hypertension due to pulmonary disease and / or hypoxia, pulmonary arterial pulmonary hypertension associated with collagen disease, etc. including. In particular, differentiation from idiopathic pulmonary arterial hypertension is important. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension is usually achieved by normalizing pulmonary hypertension through treatment such as catheter therapy (percutaneous pulmonary angioplasty) or endometrial resection, while idiopathic pulmonary arterial hypertension is Give symptomatic treatment such as oral medicine.
検査方法
本発明の検査方法は、
（i）Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の試料中の濃度、及び
（ii）試料中での血小板の活性化
の少なくとも１つを指標とする。
Inspection method The inspection method of the present invention comprises:
(I) Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration in the sample, and (ii) at least one of platelet activation in the sample.
本明細書において、「検査」とは、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無の検査、及び、慢性血栓塞栓性肺高血圧症のリスクの検査を含む。好ましくは、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無の検査を指す。「リスクの検査」とは、将来慢性血栓塞栓性肺高血圧症を発症する可能性の有無の検査、判定を含む。「検査」は、「判定」、「診断」と換言することもできる。 In the present specification, “test” includes a test for the presence or absence of chronic thromboembolic pulmonary hypertension and a test for the risk of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Preferably, it refers to a test for the presence or absence of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. “Risk examination” includes examination and determination of the possibility of developing chronic thromboembolic pulmonary hypertension in the future. “Inspection” can also be referred to as “determination” and “diagnosis”.
本発明の検査方法は、上記（i）のみ、上記（ii）のみ、又は、上記（i）及び（ii）の組み合わせを指標するものであってもよい。検査結果の正確さの観点から、上記（i）及び（ii）の組み合わせを指標する検査方法であることが好ましい。 The inspection method of the present invention may be an indicator of only the above (i), only the above (ii), or a combination of the above (i) and (ii). From the viewpoint of the accuracy of the inspection result, an inspection method that indicates the combination of the above (i) and (ii) is preferable.
試料、被験対象
本発明の検査方法において、試料は被験対象から採取したものを用いる。上記（i）及び（ii）の組み合わせを指標する場合、同一の試料を用いて検査を行うことが好ましい。
Sample, test subject In the test method of the present invention, a sample collected from a test subject is used. When indicating the combination of (i) and (ii) above, it is preferable to perform the inspection using the same sample.
試料は、検査方法の被験対象に由来する。被験対象は、特に限定されるものではないが、ヒトを含む哺乳類が例示される。非ヒト哺乳類としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。本発明の検査方法の好ましい被験対象は、ヒトである。被験対象がヒトである場合、労作時の息切れなどの慢性血栓塞栓性肺高血圧症に特徴的な自覚症状を有する患者、好ましくは肺高血圧症の疑いがある患者、特に好ましくは慢性血栓塞栓性肺高血圧症と特発性肺動脈性肺高血圧症などの肺高血圧症との鑑別が必要な患者が、被験対象として挙げられる。また、急性肺塞栓症から慢性血栓塞栓性肺高血圧症へと移行する患者もいるため、急性肺塞栓症である患者若しくは急性肺塞栓症の既往歴がある患者も、好ましい被験対象として挙げられる。 The sample is derived from the subject to be tested. The test subject is not particularly limited, and examples include mammals including humans. Non-human mammals include mice, rats, dogs, cats, cows, sheep, horses and the like. A preferred test subject of the test method of the present invention is a human. When the test subject is a human, patients with subjective symptoms characteristic of chronic thromboembolic pulmonary hypertension such as shortness of breath during exertion, preferably patients suspected of having pulmonary hypertension, particularly preferably chronic thromboembolic lung Patients who need to differentiate between hypertension and pulmonary hypertension such as idiopathic pulmonary arterial hypertension are listed as test subjects. In addition, since there are patients who shift from acute pulmonary embolism to chronic thromboembolic pulmonary hypertension, patients with acute pulmonary embolism or patients with a history of acute pulmonary embolism are also preferable subjects.
被験対象がヒトである場合、被験対象の性別、年齢、人種は特に限定されない。本発明の好ましい態様の1つにおいては、被験対象は東洋人（例えば、日本人、中国人、韓国など。）、特に日本人である。また、本発明の好ましい態様の1つにおいては、統計的に患者が多いとの観点から、被験対象は女性である。 When the test subject is a human, the sex, age, and race of the test subject are not particularly limited. In one preferred embodiment of the present invention, the test subject is an Oriental (eg, Japanese, Chinese, Korean, etc.), particularly a Japanese. In one of the preferred embodiments of the present invention, the test subject is a woman from the viewpoint that there are statistically many patients.
試料としては、被験対象に由来する血液試料を好適に用いることができる。血液試料の具体例には、例えば血液（全血）及び血液に由来する血清、血漿などが含まれる。血液試料は好ましくは血漿である。血漿は、血液から血球成分を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下（例えば、クエン酸ナトリウムの存在下。）で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。 As a sample, a blood sample derived from a test subject can be suitably used. Specific examples of the blood sample include blood (whole blood), serum derived from blood, plasma, and the like. The blood sample is preferably plasma. Plasma is a portion obtained by removing blood cell components from blood, and can be obtained, for example, as a supernatant when subjected to centrifugation under conditions that do not cause blood to clot (for example, in the presence of sodium citrate).
血液試料が由来する血管は限定されない。体循環の血管（動脈（末梢動脈）、静脈（末梢静脈）、毛細血管。）又は肺循環の血管（肺動脈、肺静脈、肺毛細血管。）から採血することができる。採血の簡便性の観点から、体循環の血管、特に静脈（末梢静脈）から採血をすることが好ましい。 The blood vessel from which the blood sample is derived is not limited. Blood can be collected from blood vessels in the systemic circulation (arteries (peripheral arteries), veins (peripheral veins), capillaries), or blood vessels in the pulmonary circulation (pulmonary arteries, pulmonary veins, pulmonary capillaries). From the viewpoint of simplicity of blood collection, it is preferable to collect blood from blood vessels in the systemic circulation, particularly veins (peripheral veins).
本発明の検査方法は、好ましくは、
［1］（i）試料中のThrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の濃度測定、及び（ii）試料中の血小板の活性化の評価の少なくとも１つを実施する工程、並びに、
［2］上記［1］の結果に基づき、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無及び／又はリスクを評価する工程
を含む、検査方法である。
The inspection method of the present invention is preferably
[1] performing at least one of (i) measuring the concentration of Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein in the sample, and (ii) evaluating platelet activation in the sample, and
[2] A test method comprising a step of evaluating the presence and / or risk of chronic thromboembolic pulmonary hypertension based on the result of [1] above.
Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の試料中濃度
本発明の検査方法において、Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（Thrombin Activated Fibrinolysis Inhibitorという場合もある、TAFI）タンパク質の試料中濃度を指標とすることができる。
Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) Protein Concentration in Sample In the test method of the present invention, the Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (sometimes referred to as Thrombin Activated Fibrinolysis Inhibitor, TAFI) protein concentration in a sample can be used as an index.
TAFIタンパク質は、公知のタンパク質である。TAFIタンパク質は、Carboxypeptidase B2（CPB2）遺伝子座にコードされる、プロカルボキシペプチダーゼ(カルボキシペプチダーゼ前駆体)である。TAFIタンパク質は、主に肝臓で産生され、血漿中に存在すること、及び、トロンビン又はトロンボモジュリンに結合したトロンビンにより切断され活性化型カルボキシペプチダーゼを生じると考えられている。 TAFI protein is a known protein. TAFI protein is a procarboxypeptidase (a carboxypeptidase precursor) encoded by the Carboxypeptidase B2 (CPB2) locus. TAFI protein is thought to be produced primarily in the liver, present in plasma, and cleaved by thrombin bound to thrombin or thrombomodulin to produce an activated carboxypeptidase.
TAFIタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードするmRNAの配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
ヒトTAFIタンパク質：NP_001863、NP_001265470
ヒトTAFI mRNA：NM_001872、NM_001278541。
The amino acid sequence of the TAFI protein and the mRNA sequence encoding the TAFI protein are registered in GenBank provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) with the following accession numbers (multiple revisions ( If revision) is registered, it is understood to refer to the latest revision.):
Human TAFI protein: NP_001863, NP_001265470
Human TAFI mRNA: NM_001872, NM_001278541.
TAFIタンパク質の血中濃度を測定する手段は、当業者が適宜選択することができる。好適には、TAFIタンパク質を特異的に検出することができる抗体（すなわち、TAFIタンパク質に特異的に結合する抗体。）（抗体（イムノグロブリンタンパク質）分子の全長、及び、F(ab)、F(ab')2等のフラグメントを含む。）を用いた免疫学的検定が例示される。免疫学的検定としては、ELISA、EIA、ウェスタンブロットなどが例示され、中でもELISAなどの定量的試験を行える手法が好ましい。免疫学的検定に用いる抗体は、試料中のTAFIタンパク質を特異的に検出することができる抗体であれば、特に限定されない。 Means for measuring the blood concentration of TAFI protein can be appropriately selected by those skilled in the art. Preferably, an antibody capable of specifically detecting the TAFI protein (ie, an antibody that specifically binds to the TAFI protein) (the full length of the antibody (immunoglobulin protein) molecule, and F (ab), F ( ab ') includes fragments such as 2 )). Examples of the immunoassay include ELISA, EIA, Western blot, etc. Among them, a technique capable of performing a quantitative test such as ELISA is preferable. The antibody used in the immunoassay is not particularly limited as long as it is an antibody that can specifically detect TAFI protein in a sample.
TAFIタンパク質の血中濃度の測定は、例えば、文献Tani S et al., Microbiol Immunol. 47(4):295-300 (2003)に記載の方法に準じて、当該文献に記載の抗ヒトTAFIモノクローナル抗体2A16（anti human TAFI monoclonal antibody 2A16）、抗ヒトTAFIモノクローナル抗体10G1（anti human TAFI monoclonal antibody 10G1）を用いて行うことができる。モノクローナル抗体2A16及びモノクローナル抗体10G1は、いずれかを単独で用いても、２種組み合わせても用いることができ、感度の観点から組み合わせて用いることが好ましい。 The blood concentration of TAFI protein is measured, for example, according to the method described in the document Tani S et al., Microbiol Immunol. 47 (4): 295-300 (2003), and the anti-human TAFI monoclonal described in the document. It can be performed using antibody 2A16 (anti human TAFI monoclonal antibody 2A16) and anti-human TAFI monoclonal antibody 10G1 (anti human TAFI monoclonal antibody 10G1). Monoclonal antibody 2A16 and monoclonal antibody 10G1 can be used either alone or in combination of two, and are preferably used in combination from the viewpoint of sensitivity.
TAFIタンパク質の試料中濃度の測定は、市販の試薬を使用して行うこともできる。例えば、ELISAによりTAFIタンパク質の試料中濃度を測定する試薬として、市販品を使用することができる。 Measurement of the TAFI protein concentration in the sample can also be performed using a commercially available reagent. For example, a commercially available product can be used as a reagent for measuring the concentration of TAFI protein in a sample by ELISA.
本発明において、TAFIタンパク質の試料中濃度の測定は、プロカルボキシペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ前駆体）と活性化型カルボキシペプチダーゼの両方の検出、又は、プロカルボキシペプチダーゼのみの検出のいずれであってもよい。 In the present invention, measurement of the concentration of TAFI protein in a sample may be either detection of both procarboxypeptidase (carboxypeptidase precursor) and activated carboxypeptidase, or detection of procarboxypeptidase alone.
測定されるTAFIタンパク質の試料中濃度は、絶対値及び相対値のいずれであってもよい。好ましくは、TAFIタンパク質の試料中濃度は、その絶対値が測定される。 The concentration of TAFI protein to be measured in the sample may be either an absolute value or a relative value. Preferably, the absolute value of the TAFI protein concentration in the sample is measured.
血小板の活性化
本発明の検査方法において、血小板の活性化を指標とすることができる。「血小板の活性化を指標とする」は、「活性化血小板の存在を指標とする」と換言することもできる。好適には、試料中の血小板の全体に対する、活性化した血小板の割合を指標とすることができる。
Platelet Activation In the test method of the present invention, platelet activation can be used as an index. “Using platelet activation as an index” can be rephrased as “using the presence of activated platelets as an index”. Preferably, the ratio of activated platelets to the total platelets in the sample can be used as an index.
血小板の活性化は、公知の手法により評価することができる。例えば、活性化血小板のマーカー（活性化依存型）を利用する手段が挙げられる。具体的には、試料中の血小板の全体のうち、活性化血小板のマーカーが陽性である血小板の割合により測定をすることができる。活性化血小板のマーカーとしては、P-セレクチン（CD62P）、PAC-1などが挙げられる。活性化血小板のマーカーは、1種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Platelet activation can be evaluated by a known method. For example, a means using a marker of activated platelets (activation-dependent type) can be mentioned. Specifically, it can be measured by the proportion of platelets that are positive for the activated platelet marker out of the total platelets in the sample. Examples of activated platelet markers include P-selectin (CD62P) and PAC-1. The activated platelet marker can be used alone or in combination of two or more.
試料中の血小板の全体は、CD61、CD42aなどの活性化非依存型の血小板マーカーにより検出をすることができる。具体的には、CD61、CD42aなどのマーカーが陽性である細胞を、血小板であると判定することで、血小板が検出される。ここで、「血小板の全体」とは、活性化した血小板及び活性化していない血小板を包含する。 上記P-セレクチン(CD62P)、PAC-1、CD61、CD42aは、細胞表面マーカーである。 Total platelets in the sample can be detected by activation-independent platelet markers such as CD61 and CD42a. Specifically, platelets are detected by determining that cells that are positive for markers such as CD61 and CD42a are platelets. Here, “total platelets” include activated platelets and non-activated platelets. P-selectin (CD62P), PAC-1, CD61, and CD42a are cell surface markers.
血小板のマーカーを検出する手段は特に限定されない。例えば、フローサイトメトリー法、免疫染色法などが挙げられる。好ましい態様としてフローサイトメトリー法が挙げられる。 The means for detecting the platelet marker is not particularly limited. For example, a flow cytometry method, an immunostaining method, etc. are mentioned. A preferred embodiment is a flow cytometry method.
なお、細胞について特定のマーカーが「陽性」であるとは、細胞が当該マーカーを発現していることを指す。細胞がマーカーを発現していることは、例えば、当該メーカーを特異的に検出することができる（すなわち、当該マーカーに特異的に結合する）抗体を用いて検出することができる。 In addition, that a specific marker is “positive” for a cell means that the cell expresses the marker. The expression of the marker in the cell can be detected, for example, using an antibody that can specifically detect the manufacturer (that is, specifically binds to the marker).
その他の血小板の活性化を評価する手段として、血小板由来マイクロパーティクルを指標とする手段も挙げられる。血小板由来マイクロパーティクルを指標とする場合、例えば、GPIb（CD42b）をマーカーとして、フローサイトメトリー法、又は、ELISA、EIA、ウェスタンブロットなど免疫学的検定により検出をすることができる
本発明の好ましい態様の1つにおいては、P-セレクチン及びPAC-1をマーカーとして、活性化血小板を検出することができる。すなわち、具体的には、P-セレクチン及びPAC-1がともに陽性である血小板の、試料中の血小板全体に対する割合を求めることで評価をすることができる。
Other means for evaluating platelet activation include means using platelet-derived microparticles as an index. When platelet-derived microparticles are used as an indicator, for example, GPIb (CD42b) can be used as a marker, and detection can be performed by flow cytometry or immunoassay such as ELISA, EIA, Western blot, etc. Preferred embodiment of the present invention In one of these, activated platelets can be detected using P-selectin and PAC-1 as markers. Specifically, the evaluation can be performed by determining the ratio of platelets positive for both P-selectin and PAC-1 to the total platelets in the sample.
その他の指標
本発明の検査方法は、他の公知の、あるいは将来的に見出される慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査方法と組み合わせてもよい。
Other Indicators The test method of the present invention may be combined with other known or future test methods for chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
評価基準
本発明の検査方法において、試料中のTAFIタンパク質の濃度測定、及び／又は（ii）試料中の血小板の活性化の評価に基づき、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無及び／又はリスクを評価する。検査方法における評価基準は、当業者が適宜選択することができる。
Evaluation Criteria In the test method of the present invention, the presence and / or risk of chronic thromboembolic pulmonary hypertension is determined based on the measurement of the concentration of TAFI protein in the sample and / or (ii) the evaluation of platelet activation in the sample. evaluate. Evaluation criteria in the inspection method can be appropriately selected by those skilled in the art.
評価基準として、予め設定したカットオフ値を使用することができる。 As an evaluation criterion, a preset cutoff value can be used.
例えば、TAFIタンパク質の濃度を指標とする場合、試料中のTAFIタンパク質の濃度が予め設定したカットオフ値より大きい場合に、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の存在及び／又は発症の可能性があると判定することができる。 For example, when the TAFI protein concentration is used as an index, the presence and / or onset of chronic thromboembolic pulmonary hypertension may occur when the TAFI protein concentration in the sample is greater than a preset cutoff value. Can be determined.
試料中の血小板の活性化を指標とする場合、試料中の活性化した血小板の、血小板全体に対する割合が、予め設定したカットオフ値より大きい場合に、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の存在及び／又は発症の可能性があると判定することができる。 When the activation of platelets in the sample is used as an indicator, the presence of chronic thromboembolic pulmonary hypertension and / or the ratio of activated platelets in the sample to the total platelets is greater than a preset cutoff value. Or it can determine with the possibility of onset.
上記カットオフ値は、種々の統計解析手法により求めることができる。慢性血栓塞栓性肺高血圧症における中央値若しくは平均値、ROC曲線解析に基づく値などが例示される。カットオフ値を複数設定することもできる。 The cut-off value can be obtained by various statistical analysis methods. Examples include median or average values in chronic thromboembolic pulmonary hypertension, values based on ROC curve analysis, and the like. A plurality of cutoff values can also be set.
TAFIタンパク質の濃度を指標とする場合、例えば、カットオフ値を、20〜60μg/ml程度の範囲の値、好ましくは25〜55μg/ml程度の範囲の値、特に好ましくは30〜50μg/ml程度の範囲の値などに設定することができる。 When the concentration of TAFI protein is used as an index, for example, the cutoff value is a value in the range of about 20-60 μg / ml, preferably a value in the range of about 25-55 μg / ml, particularly preferably about 30-50 μg / ml. It can be set to a range value.
血小板の活性化を指標とする場合、例えば、カットオフ値を、血小板全体に対する活性化した血小板の割合（存在比）を20〜50%程度の範囲の値、好ましくは25〜45%程度の範囲の値、特に好ましくは30〜40%の範囲の値などに設定することができる。 When platelet activation is used as an indicator, for example, the cut-off value and the ratio (abundance ratio) of activated platelets to the whole platelets are in the range of about 20 to 50%, preferably in the range of about 25 to 45%. Value, particularly preferably in the range of 30 to 40%.
TAFIタンパク質の濃度と血小板の活性化との組み合わせを指標とする場合、例えば、（a）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第１のカットオフ値より大きい、又は、（b）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第２のカットオフ値より大きく予め設定した第１のカットオフ値以下であり、かつ、血小板全体に対する活性化した血小板の割合が、予め設定した第３のカットオフ値以上であることを基準とすることができる。ここで、第１のカットオフ値は、第２のカットオフ値より大きい値である。 When the combination of the TAFI protein concentration and platelet activation is used as an index, for example, (a) the TAFI protein concentration is larger than a preset first cutoff value, or (b) the TAFI protein concentration is The ratio of activated platelets relative to the whole platelets is greater than or equal to a preset third cutoff value that is greater than the preset second cutoff value and less than or equal to the preset first cutoff value. Can be used as a reference. Here, the first cutoff value is larger than the second cutoff value.
上記第１のカットオフ値及び第２のカットオフ値は、第１のカットオフ値が第２のカットオフ値より大きいことを限度として、第１のカットオフ値を40〜60μg/ml程度の範囲の値、好ましくは45〜55μg/ml程度の範囲の値に、特に好ましくは50μg/ml程度の値に、及び、第２のカットオフ値を20〜40μg/ml程度の範囲の値、好ましくは25〜35μg/ml程度の範囲の値、特に好ましくは30μg/ml程度の値にそれぞれ設定することができる。上記第３のカットオフ値は、20〜50%程度の範囲の値、好ましくは25〜45%程度の範囲の値、特に好ましくは30〜40%の範囲の値などに設定することができる。 The first cut-off value and the second cut-off value are about 40 to 60 μg / ml with the first cut-off value being larger than the second cut-off value. A value in the range, preferably in the range of about 45-55 μg / ml, particularly preferably in the range of about 50 μg / ml, and a second cutoff value in the range of about 20-40 μg / ml, preferably Can be set to a value in the range of about 25 to 35 μg / ml, particularly preferably about 30 μg / ml. The third cutoff value can be set to a value in the range of about 20 to 50%, preferably a value in the range of about 25 to 45%, particularly preferably a value in the range of 30 to 40%.
かくして、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査が達成される。 Thus, testing for chronic thromboembolic pulmonary hypertension is achieved.
本発明の検査方法により慢性血栓塞栓性肺高血圧症である又は発症のリスクがあると評価された被験対象は、右心カテーテル検査、肺換気・血流シンチグラム検査、胸部CT（コンピューター断層撮影法）検査、肺動脈造影、光干渉断層撮影（optical coherence tomography、OCT）などによる慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無の精密検査及び／又は病巣部の確定を行うことが好ましい。また、特に精密検査により慢性血栓塞栓性肺高血圧症である蓋然性が高いと判断された場合に、肺血栓内膜摘除術や経皮的肺動脈形成術などの治療及び／又は進行の予防をするための適切な処置を行うことが好ましい。 Test subjects evaluated as having or at risk of developing chronic thromboembolic pulmonary hypertension by the test method of the present invention include right heart catheterization, pulmonary ventilation / blood flow scintigram, chest CT (computed tomography). ) It is preferable to conduct detailed examinations for the presence or absence of chronic thromboembolic pulmonary hypertension and / or to determine the lesion by examination, pulmonary arteriography, optical coherence tomography (OCT), or the like. In addition, in order to prevent the progression and / or progression of pulmonary thrombectomy or percutaneous pulmonary angioplasty, especially when it is determined by close examination that there is a high probability of chronic thromboembolic pulmonary hypertension It is preferable to take appropriate measures.
また、本発明の検査方法により慢性血栓塞栓性肺高血圧症である又は発症のリスクがあると評価されなかった被験対象は、即座の対応は必要がないものの、十分な経過観察を行うことが望ましい。 In addition, test subjects who have not been evaluated as having chronic thromboembolic pulmonary hypertension or being at risk of developing by the test method of the present invention do not need immediate treatment, but should be adequately monitored. .
２．キット
本発明は、慢性血栓塞栓性肺高血圧症を検査するためのキットをも提供する。
2. Kit The present invention also provides a kit for examining chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
本発明のキットは、
（i）Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の濃度を測定するための手段、及び
（ii）血液試料中での血小板の活性化を評価するための手段
の少なくもと１つを含む。
The kit of the present invention comprises
(I) comprises at least one means for measuring Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration; and (ii) means for assessing platelet activation in a blood sample.
TAFIタンパク質の濃度を測定するための手段としては、前述のTAFIタンパク質を特異的に検出する抗体を用いた免疫学的検定などを実施するための手段が例示される。具体的には、TAFIタンパク質を特異的に検出することができる抗体、及び／又は、その他のELISA法、EIA法、ウェスタンブロット法などの免疫学的検定を実施するための試薬が例示される。 Examples of means for measuring the concentration of TAFI protein include means for carrying out an immunoassay using an antibody that specifically detects the TAFI protein described above. Specifically, an antibody capable of specifically detecting TAFI protein and / or a reagent for performing immunoassay such as other ELISA method, EIA method, Western blot method and the like are exemplified.
血液試料中での血小板の活性化を評価するための手段としては、前述の活性化血小板のマーカーを利用して血小板の活性化を評価する手段、血小板由来マイクロパーティクルを指標として血小板の活性化を評価する手段などを実施するための手段が例示される。具体的には、P-セレクチン（CD62P）、PAC-1などの活性化血小板のマーカーを特異的に検出することができる抗体（抗P-セレクチン（CD62P）抗体、抗PAC-1抗体）、CD61、CD42aなどの活性化非依存型の血小板マーカーを特異的に検出することができる抗体（抗CD61抗体、抗CD42a抗体）、その他のフローサイトメトリー法、免疫染色法などを実施するための試薬（抗体は、特にフローサイトメトリー法に用いる場合、蛍光色素などにより標識されていることが好ましい。）；GPIbなどの血小板由来マイクロパーティクルを特異的に検出することができる抗体（抗GPIb抗体）、その他のフローサイトメトリー法、又は、ELISA法、EIA法、ウェスタンブロット法などの免疫学的検定を実施するための試薬が例示される。 Means for evaluating platelet activation in blood samples include means for evaluating platelet activation using the aforementioned activated platelet marker, and platelet activation using platelet-derived microparticles as an indicator. Means for implementing the means for evaluating and the like are exemplified. Specifically, antibodies that can specifically detect markers of activated platelets such as P-selectin (CD62P) and PAC-1 (anti-P-selectin (CD62P) antibody, anti-PAC-1 antibody), CD61 Reagents for carrying out antibodies (anti-CD61 antibody, anti-CD42a antibody) that can specifically detect activation-independent platelet markers such as CD42a, other flow cytometry methods, immunostaining methods, etc. The antibody is preferably labeled with a fluorescent dye or the like, particularly when used for flow cytometry.); An antibody that can specifically detect platelet-derived microparticles such as GPIb (anti-GPIb antibody), and others And reagents for performing immunoassays such as ELISA, EIA, and Western blot.
また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えば試料を採取するための道具（例えば、注射器。）、ポジティブコントロール試料（例えば、慢性血栓塞栓性肺高血圧症であることが確定している患者由来の試料。）及びネガティブコントロール試料（例えば、慢性血栓塞栓性肺高血圧症でないことが確定している患者（健常者、肺動脈性肺高血圧症などの他の肺高血圧症患者が例示される。）由来の試料。）などが挙げられるが、これに限定されない。上記検査方法を行うための手順を書き記した書面などを含むこともできる。 The kit of the present invention can contain other components as necessary. Other components include, for example, tools for taking samples (eg, syringes), positive control samples (eg, samples from patients who have been confirmed to have chronic thromboembolic pulmonary hypertension) and negative controls. Samples (for example, samples derived from patients who have been confirmed not to have chronic thromboembolic pulmonary hypertension (normal subjects, other pulmonary hypertension patients such as pulmonary arterial pulmonary hypertension are exemplified)) and the like. However, it is not limited to this. It can also include a document in which a procedure for performing the inspection method is written.
本発明のキットは、常法に従い、上記成分を適宜備えることで作製することができる。 The kit of the present invention can be prepared by appropriately providing the above components according to a conventional method.
キットの使用形態は特に限定されないが、上記「１．」欄に記載の検査方法に用いることが好ましい。上記検査方法に用いた場合、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査を容易に行うことが可能となる。 Although the usage form of a kit is not specifically limited, It is preferable to use for the inspection method as described in said "1." column. When used in the above-described testing method, it is possible to easily test for chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
以下に、実施例等に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
全ての統計解析をJMP Pro (SAS Institute Inc., Cary, NC) で行った。血小板活性化の割合はクラスカルワーリス検定を使用した。他の連続変数は“mean ± SD”で表し、多重比較検定は1way ANOVA後Turkey-Kramer検定を使用した。P-valueが0.05以下を統計的に有意差があると判断した。 All statistical analyzes were performed with JMP Pro (SAS Institute Inc., Cary, NC). The percentage of platelet activation used the Kruskal-Wallis test. The other continuous variables were expressed as “mean ± SD”, and the multiple comparison test used the 1-way ANOVA followed by the Turkey-Kramer test. A P-value of 0.05 or less was judged to be statistically significant.
[実施例１]
慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者（CTEPH）と、非肺高血圧症患者（non-PH）及び肺動脈性肺高血圧症患者（PAH）とにおける、Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の血漿中濃度を測定した。
[Example 1]
Measure plasma concentrations of Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), non-pulmonary hypertension (non-PH), and pulmonary arterial hypertension (PAH) did.
＜患者群＞
以下の患者群から採取した血液について試験を行った。
<Patient group>
Tests were conducted on blood collected from the following patient groups.
（i）非肺高血圧症患者（non-PH）群：19人（膠原病患者9人、高血圧患者4人、拡張型心筋症患者2人、先天性心疾患患者1人、その他の疾患3人）
（ii）肺動脈性肺高血圧症患者（PAH）群 ：22人（特発性肺動脈性肺高血圧症患者14人、膠原病性肺高血圧症患者4人、先天性心疾患に伴う肺高血圧症患者4人）、及び
（iii）慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者（CTEPH）群 ：27人。
(I) Nonpulmonary hypertension patients (non-PH) group: 19 (9 patients with collagen disease, 4 patients with hypertension, 2 patients with dilated cardiomyopathy, 1 patient with congenital heart disease, 3 other diseases )
(Ii) Pulmonary arterial hypertension patients (PAH) group: 22 (14 patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension, 4 patients with collagen pulmonary hypertension, 4 patients with pulmonary hypertension associated with congenital heart disease) ), And (iii) chronic thromboembolic pulmonary hypertension patients (CTEPH) group: 27 people.
なお、本研究は東北大学倫理委員会の承認を受けて行い、全ての患者にインフォームドコンセントを行い、承諾を得て行ったものである。 This study was conducted with the approval of the Tohoku University Ethics Committee, and informed consent was given to all patients and consent was obtained.
＜方法＞
上記患者群から、右心カテーテル検査の時に得た末梢静脈由来の血液試料及び肺動脈由来の血液試料から血漿を分離し、TAFIタンパク質の血漿中濃度をELISAにより測定した。測定は、文献Tani S et al., Microbiol Immunol. 47(4):295-300 (2003)に記載の方法に準じて行った。
<Method>
From the patient group, plasma was separated from a blood sample derived from a peripheral vein and a blood sample derived from a pulmonary artery obtained at the time of right heart catheterization, and the plasma concentration of TAFI protein was measured by ELISA. The measurement was performed according to the method described in the document Tani S et al., Microbiol Immunol. 47 (4): 295-300 (2003).
＜結果及び考察＞
結果を図１に示す。
<Results and discussion>
The results are shown in FIG.
図１に示すように、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者のTAFIタンパク質の血漿中濃度は、非肺高血圧症患者及び肺動脈性肺高血圧症患者と比べて有意に高いことが明らかとなった。 As shown in FIG. 1, it was revealed that the plasma concentration of TAFI protein in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension is significantly higher than that in non-pulmonary hypertension patients and pulmonary arterial pulmonary hypertension patients.
[参考例１]
慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者 （CTEPH）と、非肺高血圧症患者（non-PH）及び肺動脈性肺高血圧症患者（PAH）とにおける、各種線溶系マーカーの血漿中濃度を測定した。
[Reference Example 1]
Plasma concentrations of various fibrinolytic markers were measured in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), patients with non-pulmonary hypertension (non-PH), and patients with pulmonary arterial hypertension (PAH).
＜患者群＞
以下の患者群から採取した血液について試験を行った。
<Patient group>
Tests were conducted on blood collected from the following patient groups.
（i）非肺高血圧症患者(non-PH)群：19人（膠原病患者9人、高血圧患者4人、拡張型心筋症患者2人、先天性心疾患患者1人、その他の疾患3人）10人、
（ii）肺動脈性肺高血圧症患者 (PAH)群 ：22人（特発性肺動脈性肺高血圧症患者14人、膠原病性肺高血圧症患者4人、先天性心疾患に伴う肺高血圧症患者4人）、及び
（iii）慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者 (CTEPH)群 ：27人。
(I) Nonpulmonary hypertension patients (non-PH) group: 19 (9 patients with collagen disease, 4 patients with hypertension, 2 patients with dilated cardiomyopathy, 1 patient with congenital heart disease, 3 other diseases )10 people,
(Ii) Pulmonary arterial hypertension patients (PAH) group: 22 (14 patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension, 4 patients with collagen pulmonary hypertension, 4 patients with pulmonary hypertension associated with congenital heart disease) ), And (iii) Patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH) group: 27 people.
なお、本研究は東北大学倫理委員会の承認を受けて行い、全ての患者にインフォームドコンセントを行い、承諾を得て行ったものである。 This study was conducted with the approval of the Tohoku University Ethics Committee, and informed consent was given to all patients and consent was obtained.
＜方法＞
実施例１と同様にして、各種線溶系メーカーの血漿中濃度をELISAにより測定した。具体的には、フォン・ウィルブランド因子活性（vWF活性）、プラスミノーゲン、トロンボモジュリン、トータルPAI-1（PAI-1）及びα2プラスミンインヒビター・プラスミン複合体（PIC）を測定した。
<Method>
In the same manner as in Example 1, plasma concentrations of various fibrinolytic manufacturers were measured by ELISA. Specifically, von Willebrand factor activity (vWF activity), plasminogen, thrombomodulin, total PAI-1 (PAI-1) and α 2 plasmin inhibitor / plasmin complex (PIC) were measured.
測定は、SRL Laboratory Co (Tokyo, Japan)に委託をした。 The measurement was commissioned to SRL Laboratory Co (Tokyo, Japan).
＜結果及び考察＞
結果を図２に示す。
<Results and discussion>
The results are shown in FIG.
従来報告の通り、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者において、線溶系のマーカーの亢進は検出されなかった。
［図２］肺高血圧症患者における各種線溶系マーカーの測定結果を示す。非肺高血圧症患
者（non-PH、n=19）、肺動脈性肺高血圧症患者 （PAH、n=22）及び慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者（CTEPH、n=27）のそれぞれについて測定を行った。１）末梢静脈（CV）由来の試料；２）肺動脈（PA）由来の試料。
As previously reported, no enhancement of fibrinolytic markers was detected in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
FIG. 2 shows measurement results of various fibrinolytic markers in patients with pulmonary hypertension. Measurements were made on patients with non-pulmonary hypertension (non-PH, n = 19), patients with pulmonary arterial hypertension (PAH, n = 22), and patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH, n = 27) It was. 1) Sample from peripheral vein (CV); 2) Sample from pulmonary artery (PA).
[実施例２]
慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者(CTEPH)と、非肺高血圧症患者(non-PH)及び肺動脈性肺高血圧症患者 (PAH)とにおける、血小板の活性化を評価した。
[Example 2]
Platelet activation was assessed in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), non-pulmonary hypertension (non-PH) and pulmonary arterial hypertension (PAH).
＜患者群＞
以下の患者群から採取した血液について試験を行った。
<Patient group>
Tests were conducted on blood collected from the following patient groups.
（i）非肺高血圧症患者（non-PH）群：12人（膠原病患者3人、高血圧症患者3人、高脂血症患者2人、拡張型心筋症患者1人、その他の疾患3人）、
（ii）肺動脈性肺高血圧症患者（PAH）群 ：19人（特発性肺動脈性肺高血圧症患者8人、膠原病性肺高血圧症患者4人、先天性心疾患に伴う肺高血圧症患者7人）、及び
（iii）慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者（CTEPH）群 ：22人。
(I) Non-pulmonary hypertension patients (non-PH) group: 12 (3 patients with collagen disease, 3 patients with hypertension, 2 patients with hyperlipidemia, 1 patient with dilated cardiomyopathy, other diseases 3 Man),
(Ii) Pulmonary arterial hypertension patients (PAH) group: 19 (8 patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension, 4 patients with collagen pulmonary hypertension, 7 patients with pulmonary hypertension associated with congenital heart disease) ), And (iii) chronic thromboembolic pulmonary hypertension patient (CTEPH) group: 22 people.
なお、本研究は東北大学倫理委員会の承認を受けて行い、全ての患者にインフォームドコンセントを行い、承諾を得て行ったものである。 This study was conducted with the approval of the Tohoku University Ethics Committee, and informed consent was given to all patients and consent was obtained.
＜方法＞
右心カテーテルの時に末梢静脈から最終濃度0.313％のクエン酸ナトリウムに4ml採血した。採血後１時間以内に採血管を25度で10分間、200gで遠心して、その上清をPlatelet rich plasma (PRP) として集めた。Poly-prepOChromatography Columns (BIO-RAD, Hercules, CA) に6mlのSepharose 2B (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) を6ml入れ、 Ca2+の入っていないHEPES-Tyrode Buffer (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 0.42 mM NaH2PO4, 1.7 mM MgCl2, 11.9 mM NaHCO3, 5 mM glucose) 8mlで2回洗浄した。PRP 1 mlをこのカラムに注ぎ、Ca2+の入っていないHEPES-Tyrode Buffer を1 mlずつ注ぎ、1 mlずつ分画した。2-4mlの分画を回収し、これを洗浄血小板とした。
<Method>
At the time of right heart catheterization, 4 ml of blood was collected from a peripheral vein into a final concentration of 0.313% sodium citrate. Within 1 hour after blood collection, the blood collection tube was centrifuged at 200 g at 25 degrees for 10 minutes, and the supernatant was collected as Platelet rich plasma (PRP). Add 6 ml of Sepharose 2B (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) to Poly-prepOChromatography Columns (BIO-RAD, Hercules, CA), HEPES-Tyrode Buffer without Ca 2+ (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, It was washed twice with 8 ml of 2.68 mM KCl, 0.42 mM NaH 2 PO 4 , 1.7 mM MgCl 2 , 11.9 mM NaHCO 3 , 5 mM glucose). 1 ml of PRP was poured onto this column, 1 ml of HEPES-Tyrode Buffer containing no Ca 2+ was poured into each column, and 1 ml was fractionated. 2-4 ml fractions were collected and used as washed platelets.
抗ヒトモノクローナル抗体であるPAC-1 FITC (活性化αIIbβIIIの抗体) 、CD62P-PE (P-Selectinの抗体) 、CD61-PerCP (活性化非依存的血小板抗体) (Beckton, Dickinson and Companey, Franklin Lakes, NJ) それぞれ5 mlを得られた洗浄血小板1.25 mlに加え、遮光して25度で20分間インキュベーションした。この時、非特異的結合を評価するためにMouse IgG1-PE control antibody (Beckton, Dickinson and Companey, Franklin Lakes, NJ) 5 mlと RGDS peptides (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 25 mgを使用した。インキュベーション後、4度に冷やした1％パラホルムアミド溶液を500 ml加え固定した。24時間以内にFC-500 Flow Cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA) を用いてフローサイトメトリーを行った。血小板を散乱光ドットプロット (FSC; Forward Scatter vs SSC; Side Scatter) 及びCD61抗原の有無で血小板を同定し、血小板が5000 countsになるまで測定した。PAC-1陽性、P-Selectin陽性の血小板数をTotal血小板数に対する割合で計算した。 Anti-human monoclonal antibodies PAC-1 FITC (activated αIIbβIII antibody), CD62P-PE (P-Selectin antibody), CD61-PerCP (activation-independent platelet antibody) (Beckton, Dickinson and Companey, Franklin Lakes) , NJ) 5 ml each was added to 1.25 ml of the washed platelets and incubated for 20 minutes at 25 ° C., protected from light. At this time, Mouse IgG1-PE control antibody (Beckton, Dickinson and Companey, Franklin Lakes, NJ) 5 ml and RGDS peptides (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 25 mg were used to evaluate non-specific binding. . After incubation, 500 ml of a 1% paraformamide solution cooled in 4 degrees was added and fixed. Within 24 hours, flow cytometry was performed using an FC-500 Flow Cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Platelets were identified by scattering light dot plot (FSC; Forward Scatter vs SSC; Side Scatter) and the presence or absence of CD61 antigen and measured until the platelets reached 5000 counts. The number of PAC-1 positive and P-Selectin positive platelets was calculated as a percentage of the total platelet count.
＜結果及び考察＞
非肺高血圧症患者、肺動脈性肺高血圧症患者及び慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者のそれぞれの典型例につき、フローサイトメトリーの結果を図３に示す。
<Results and discussion>
FIG. 3 shows the results of flow cytometry for each typical example of a non-pulmonary hypertension patient, a pulmonary arterial pulmonary hypertension patient, and a chronic thromboembolic pulmonary hypertension patient.
図中、ネガティブコントロール試料（Mouse IgG1-PE control antibodyとRGDS peptidesを使用した試料）が出ない領域をD3（PAC-1陰性、P-Selectin陰性）と定義し、D1（PAC-1陽性、P-Selectin陰性）、D2（PAC-1陽性、P-Selectin陽性）、D4（PAC-1陽性、P-Selectin陽性）の各領域を定義されたD3に即して定義した。 In the figure, the area where negative control samples (samples using Mouse IgG1-PE control antibody and RGDS peptides) do not appear is defined as D3 (PAC-1 negative, P-Selectin negative) and D1 (PAC-1 positive, P -Selectin negative), D2 (PAC-1 positive, P-Selectin positive), and D4 (PAC-1 positive, P-Selectin positive) were defined according to the defined D3.
図２に示す各患者のD1〜D4の分布を、表１に示す。 Table 1 shows the distribution of D1 to D4 of each patient shown in FIG.
測定を行った患者における、活性化している血小板（すなわち、D2領域に含まれる血小板）の割合の分布を、図４に示す。 FIG. 4 shows the distribution of the percentage of activated platelets (that is, platelets contained in the D2 region) in the patient who performed the measurement.
[実施例３]
慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者におけるTAFIタンパク質の血漿中濃度及び血小板の活性化の評価結果を組み合わせた。
[Example 3]
Combined the evaluation results of TAFI protein plasma concentration and platelet activation in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
＜方法＞
実施例１及び実施例２に準じて、TAFIタンパク質の血漿中濃度及び血小板の活性化の評価を両方行った患者について、慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者の割合の集計をした。
結果を、表２及び表３に示す。
<Method>
According to Example 1 and Example 2, the percentage of patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension was tabulated for patients who had both evaluated the plasma concentration of TAFI protein and the activation of platelets.
The results are shown in Tables 2 and 3.
＜結果及び考察＞
結果を、表２及び表３に示す。
<Results and discussion>
The results are shown in Tables 2 and 3.
TAFIタンパク質の血漿中濃度のカットオフ値は、表２及び３において30μg/ml及び50μg/mlとした。血小板活性化のカットオフ値（フローサイトメトリーの結果において、D2の領域に分布する血小板の、血小板全体に対する割合。）は、表２においては30%、表３においては40%とした。 The cut-off values of TAFI protein plasma concentration were 30 μg / ml and 50 μg / ml in Tables 2 and 3. The cut-off value for platelet activation (the ratio of platelets distributed in the D2 region to the total platelets in the flow cytometry results) was 30% in Table 2 and 40% in Table 3.
（i）TAFIタンパク質の血漿中濃度が50μg/mlより大きい、又は、（ii）TAFIタンパク質の血漿中濃度が30μg/mlより大きく50μg/ml以下であり、かつ、活性化した血小板の割合がカットオフ値以上の場合に、患者が慢性血栓塞栓性肺高血圧症である割合が顕著に多かった。 (I) TAFI protein plasma concentration is greater than 50 μg / ml, or (ii) TAFI protein plasma concentration is greater than 30 μg / ml but less than or equal to 50 μg / ml, and the percentage of activated platelets is cut Significantly more patients had chronic thromboembolic pulmonary hypertension when they were above the off value.
一方、（ii）TAFIタンパク質の血漿中濃度が50μg/ml以下30μg/mlより大きく、かつ、活性化した血小板の割合がカットオフ値未満、並びに、（iv）TAFIタンパク質の血漿中濃度が30μg/ml以下の場合には、患者が慢性血栓塞栓性肺高血圧症である割合が少なかった。特に、TAFIタンパク質の血漿中濃度が30μg/ml以下の場合には、活性化した血小板がカットオフ以上であっても、慢性血栓塞栓性肺高血圧症である患者は本実施例では認められなかった。 On the other hand, (ii) the concentration of TAFI protein in plasma is 50 μg / ml or less and greater than 30 μg / ml and the proportion of activated platelets is less than the cutoff value, and (iv) the concentration of TAFI protein in plasma is 30 μg / ml Less than ml, the percentage of patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension was low. In particular, when the plasma concentration of TAFI protein was 30 μg / ml or less, patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension were not observed in this example even though the activated platelets were above the cutoff .
以上実施例１〜3の結果は、（i）Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor（TAFI）タンパク質の血液試料中の濃度、及び（ii）血小板の活性化の少なくとも１つを指標として、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査をすることができることを実証している。 As described above, the results of Examples 1 to 3 are as follows: (i) Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration in blood sample, and (ii) at least one of platelet activation as an index, chronic thromboembolic pulmonary hypertension It has been demonstrated that it can be tested for symptoms.
Claims (5)
（ii）試料中での血小板の活性化
を慢性血栓塞栓性肺高血圧症の指標とする方法であって、
（a）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第１のカットオフ値より大きい場合、又は、
（b）TAFIタンパク質の濃度が予め設定した第２のカットオフ値より大きく第１のカットオフ値以下であり、かつ、血小板全体に対する活性化した血小板の割合が第3のカットオフ値以上である場合に慢性血栓塞栓性肺高血圧症である及び／又は発症するリスクがあるとの指標とする、方法。 (I) Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration in the sample, and (ii) platelet activation in the sample.
, Which is an index of chronic thromboembolic pulmonary hypertension,
(A) when the concentration of TAFI protein is larger than a preset first cutoff value, or
(B) The TAFI protein concentration is greater than the preset second cutoff value and less than or equal to the first cutoff value, and the ratio of activated platelets to the total platelets is greater than or equal to the third cutoff value A method that is indicative of chronic thromboembolic pulmonary hypertension and / or risk of developing .
［2］上記［1］の結果を、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の有無及び／又はリスクの指標とするする工程
を含む、請求項１に記載の方法。 [1] (i) a step of implementing Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor in a sample (TAFI) concentration measurement of proteins, and (ii) assessment of platelet activation in the sample, and,
[2] The results of the above [1], comprising the step of an indicator of the presence or absence and / or risk of chronic thromboembolic pulmonary hypertension, the method according to claim 1.
（ii）血液試料中での血小板の活性化を評価するための手段
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を実施するための、慢性血栓塞栓性肺高血圧症の検査キット。 (I) a means for measuring Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) protein concentration; and (ii) a means for assessing platelet activation in a blood sample.
The containing, for carrying out the method according to any one of claims 1 to 4, test kits chronic thromboembolic pulmonary hypertension.
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