JP5819056B2 - Cell culture substrate - Google Patents
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Description
本発明は、細胞の裏面を容易に観察可能な細胞培養用基材に関するものである。 The present invention relates to a cell culture substrate capable of easily observing the back surface of a cell.
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
また、細胞表面に発現するタンパク質は、細胞表面で均一に発現しているのではなく、例えば、培地と接する面（表面）と、足場と接着している面（裏面）とでは、異なる発現状態となることが知られている。このため、細胞の裏面に発現しているタンパク質について評価する場合には、細胞を足場である支持体から剥離する必要がある。
Currently, various animal and plant cell cultures are being performed, and new cell culture methods have been developed. Cell culture techniques are used for the purpose of elucidating biochemical phenomena and properties of cells and producing useful substances. In addition, attempts have been made to examine the physiological activity and toxicity of artificially synthesized drugs using cultured cells.
In addition, proteins expressed on the cell surface are not uniformly expressed on the cell surface. For example, the expression state differs between the surface in contact with the medium (front surface) and the surface adhered to the scaffold (back surface). It is known that For this reason, when evaluating about the protein expressed on the back surface of a cell, it is necessary to peel a cell from the support body which is a scaffold.
ここで、細胞培養支持体から細胞シートを剥離する方法はこれまで種々検討されており、従来、酵素反応を用いて支持体と細胞間の結合を弱める方法や、細胞接着力の弱い支持体や細胞接着力の変化する支持体を使用する方法が用いられている。 Here, various methods for detaching the cell sheet from the cell culture support have been studied so far. Conventionally, a method of weakening the bond between the support and cells using an enzymatic reaction, A method using a support that changes cell adhesion is used.
酵素反応を用いる方法としては、より具体的には、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）等を用いて細胞間接着分子を構成するタンパク質等を分解する方法が挙げられる。しかしながら、この方法では細胞−支持体表面の結合だけでなく、細胞−細胞間の結合も弱めてしまう。このため、この方法では、細胞シートに少なからず損傷を与えてしまうといった問題があった。 More specifically, the method using an enzyme reaction includes a method of degrading a protein constituting an intercellular adhesion molecule using a protease (proteolytic enzyme) or the like. However, this method weakens not only cell-support surface binding but also cell-cell binding. For this reason, this method has a problem that the cell sheet is damaged to some extent.
また、細胞接着力の変化する支持体を用いる方法としては、例えば、特許文献１および２に、細胞増殖表面を温度応答性ポリマーで被覆した支持体が開示されている。
さらに特許文献３には、イオンビームを照射することにより剥離することができる剥離層に細胞を接着し、細胞を回収する方法が開示されている。また、特許文献４には、細胞パターンの形成および、その細胞パターンを回収する方法が開示されている。特許文献５には、所望の細胞を所望のパターンに沿って培養することが開示されている。
In addition, as a method using a support that changes cell adhesion, for example, Patent Documents 1 and 2 disclose a support in which a cell growth surface is coated with a temperature-responsive polymer.
Further, Patent Document 3 discloses a method for recovering cells by adhering cells to a release layer that can be released by irradiation with an ion beam. Patent Document 4 discloses the formation of a cell pattern and a method for recovering the cell pattern. Patent Document 5 discloses culturing desired cells along a desired pattern.
しかしながら、細胞を細胞培養支持体から剥離した場合、細胞は培地内に浮遊した状態となるため、細胞の表裏の判断が困難となり、例えば、細胞の裏面側に発現しているタンパク質等についてのみを正確に評価することが困難であるといった問題があった。 However, when the cells are detached from the cell culture support, the cells are in a suspended state in the medium, making it difficult to determine the front and back of the cells. For example, only the proteins expressed on the back side of the cells There was a problem that it was difficult to evaluate accurately.
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、細胞の裏面を容易に観察可能な細胞培養用基材を提供することを主目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and a main object of the present invention is to provide a cell culture substrate capable of easily observing the back surface of cells.
上記目的を達成するために、本発明は、刺激により細胞の接着度合いが変化する刺激応答性領域と、細胞接着性を有する細胞接着領域と、細胞非接着性を有する細胞非接着領域と、を有し、上記刺激応答性領域および上記細胞接着領域の境界部分である接着境界を有し、上記刺激応答性領域の外周の少なくとも一部に、上記刺激応答性領域および上記細胞非接着領域の境界部分である非接着境界を有することを特徴とする細胞培養用基材を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides a stimulus-responsive region in which the degree of cell adhesion changes by stimulation, a cell-adhesive region having cell adhesion, and a cell non-adhesion region having cell non-adhesion. And having an adhesion boundary which is a boundary portion between the stimulation responsive region and the cell adhesion region, and at least a part of the outer periphery of the stimulation responsive region, the boundary between the stimulation responsive region and the cell non-adhesion region A cell culture substrate having a non-adhesive boundary which is a part is provided.
本発明によれば、上記細胞培養用基材上に細胞を播種・培養することにより、上記刺激応答性領域および細胞接着領域上に、細胞間結合で細胞同士が少なくとも単層で結合された細胞シートを形成することができ、その後、上記刺激応答性領域に刺激を与えることにより、上記細胞シートのうち上記刺激応答性領域に接着していた部分のみを剥離させ、培地中に浮遊させることができる。
ここで、このように剥離・浮遊した細胞は、足場のない状態で収縮する性質から、上記細胞シートは上記接着境界の方向に収縮し、上記刺激応答性領域との接着側表面（裏面）を培地側に向くように裏返る。
このため、上記細胞シートの一部が自発的に裏返ることで、裏面が培地側に向いた状態で保持することができ、細胞の裏面を容易に観察可能とすることができる。その結果、例えば、細胞の裏面側でしか発現していないタンパク質等の評価を容易に行うことができる。
According to the present invention, by seeding and culturing cells on the cell culture substrate, cells are bound to each other in at least a single layer by intercellular bonding on the stimulation-responsive region and the cell adhesion region. A sheet can be formed, and then the stimulus-responsive region is stimulated to peel only the portion of the cell sheet that has adhered to the stimulus-responsive region and suspended in the medium. it can.
Here, due to the property that the cells detached and suspended in this way contract without a scaffold, the cell sheet contracts in the direction of the adhesion boundary, and the adhesion-side surface (back surface) with the stimulus-responsive region is Turn over so that it faces the medium side.
For this reason, when a part of the cell sheet is turned over spontaneously, it can be held in a state where the back surface faces the culture medium side, and the back surface of the cell can be easily observed. As a result, for example, it is possible to easily evaluate proteins that are expressed only on the back side of the cells.
本発明においては、上記刺激応答性領域の全外周に、上記非接着境界を有することが好ましい。上記刺激応答性領域に接着している細胞シートを上記刺激応答性領域の外周に沿って安定的に剥離することができるからである。 In this invention, it is preferable to have the said non-adhesion boundary in the outer periphery of the said stimulus responsive area | region. This is because the cell sheet adhered to the stimulus responsive region can be stably peeled along the outer periphery of the stimulus responsive region.
本発明においては、上記非接着境界の形状が、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状であることが好ましい。上記刺激応答性領域に接着している細胞シートを上記刺激応答性領域の外周に沿って安定的に剥離することができるからである。 In the present invention, the shape of the non-adhesion boundary is preferably an arc shape that is convex with respect to the cell adhesion region. This is because the cell sheet adhered to the stimulus responsive region can be stably peeled along the outer periphery of the stimulus responsive region.
本発明においては、上記接着境界の形状が、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域の幅ｔおよび上記細胞接着領域の凸部の幅ｓが、ｓ≧１／３ｔを満たすことが好ましい。上記刺激応答性領域に接着している細胞シートが安定的に裏返るからである。
In the present invention, the shape of the adhesive interface is a circular arc shape convex against the above cell adhesion region, the width s of the convex portion of the width t and the cell adhesion region of the stimulus responsive region, s ≧ It is preferable to satisfy 1 / 3t . This is because the cell sheet adhered to the stimulus-responsive region is stably turned over.
本発明においては、上記刺激応答性領域が、温度変化により細胞の接着度合いが変化する温度応答性材料を含むことが好ましい。刺激の付与が容易だからである。 In the present invention, it is preferable that the stimulus-responsive region includes a temperature-responsive material in which the degree of cell adhesion changes due to a temperature change. This is because it is easy to apply a stimulus.
本発明においては、上記温度応答性材料が、ポリイソプロピルアクリルアミドであることが好ましい。細胞の培養に適した温度において細胞接着性を有し、細胞へのダメージの少ない温度で細胞非接着性を発現することから、一部が自発的に裏返った上記細胞シートを容易に形成することができるからである。 In the present invention, the temperature-responsive material is preferably polyisopropylacrylamide. Cell adhesion is achieved at a temperature suitable for cell culture, and cell non-adhesion is expressed at a temperature at which damage to the cell is small, so that the above-mentioned cell sheet, which is partly turned over, can be easily formed. Because you can.
本発明は、上述の細胞培養用基材と、上記細胞培養用基材の上記細胞接着領域および上記刺激応答性領域上に接着した細胞からなる細胞シートと、を有することを特徴とする細胞付基板を提供する。 The present invention has the above-mentioned cell culture substrate, and a cell sheet comprising cells adhered to the cell adhesion region and the stimulus-responsive region of the cell culture substrate. Providing a substrate.
本発明によれば、上記細胞培養用基材上に上記細胞シートが接着していることにより、一部が裏返った上記細胞シートを形成でき、上記細胞シートの接着側表面（裏面）を容易に観察することができる。したがって、細胞の裏面でしか発現していないタンパク質等の評価を任意のタイミングで容易に行うことができる。 According to the present invention, since the cell sheet is adhered on the cell culture substrate, the cell sheet partially turned over can be formed, and the adhesion side surface (back surface) of the cell sheet can be easily formed. Can be observed. Therefore, it is possible to easily evaluate a protein or the like expressed only on the back surface of the cell at an arbitrary timing.
本発明は、細胞の裏面を任意のタイミングで容易に観察可能な細胞培養用基材を提供できるといった効果を奏する。 The present invention has an effect that a cell culture substrate capable of easily observing the back surface of a cell at an arbitrary timing can be provided.
本発明は、細胞培養用基材およびそれを用いた細胞付基板に関するものである。
以下、本発明の細胞培養用基材および細胞付基板について詳細に説明する。
The present invention relates to a cell culture substrate and a cell-attached substrate using the same.
Hereinafter, the cell culture substrate and the cell-attached substrate of the present invention will be described in detail.
Ａ．細胞培養用基材
まず、本発明の細胞培養用基材について説明する。
本発明の細胞培養用基材は、刺激により細胞の接着度合いが変化する刺激応答性領域と、細胞接着性を有する細胞接着領域と、細胞非接着性を有する細胞非接着領域と、を有し、上記刺激応答性領域および上記細胞接着領域の境界部分である接着境界を有し、上記刺激応答性領域の外周の少なくとも一部に、上記刺激応答性領域および上記細胞非接着領域の境界部分である非接着境界を有することを特徴とするものである。
A. First, the cell culture substrate of the present invention will be described.
The substrate for cell culture of the present invention has a stimulus-responsive region in which the degree of cell adhesion changes upon stimulation, a cell-adhesive region having cell adhesion, and a cell non-adhesion region having cell non-adhesion. An adhesion boundary that is a boundary portion between the stimulation responsive region and the cell adhesion region, and at least a part of an outer periphery of the stimulation responsive region at a boundary portion between the stimulation responsive region and the cell non-adhesion region. It is characterized by having a certain non-adhesive boundary.
このような本発明の細胞培養用基材について図を参照して説明する。図１は、本発明の細胞培養用基材の一例を示す概略平面図であり、図２は、図１のＡ−Ａ線断面図である。
図１および図２に例示するように、本発明の細胞培養用基材１０は、刺激により細胞の接着度合いが変化する刺激応答性材料を含む刺激応答性層１と、細胞接着性を有する細胞接着材料を含む細胞接着層２と、細胞非接着性を有する細胞非接着材料を含む細胞非接着層３と、を有し、上記刺激応答性層１の露出表面である刺激応答性領域１１および上記細胞接着層２の露出表面である細胞接着領域１２の境界部分である接着境界Ｘを有し、上記細胞非接着層３の露出表面である細胞非接着領域１３が上記刺激応答性領域１１の周囲に配置され、上記刺激応答性領域の外周に、上記刺激応答性領域１１および細胞非接着領域１３の境界部分である非接着境界Ｙを有するものである。また、上記刺激応答性層１、細胞接着層２および細胞非接着性層３を支持する基材４を有するものである。
Such a cell culture substrate of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic plan view showing an example of the cell culture substrate of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA of FIG.
As illustrated in FIG. 1 and FIG. 2, the cell culture substrate 10 of the present invention includes a stimulus-responsive layer 1 including a stimulus-responsive material that changes the degree of cell adhesion upon stimulation, and cells having cell adhesion. A stimulus responsive region 11 having a cell adhesive layer 2 containing an adhesive material and a cell non-adhesive layer 3 containing a cell non-adhesive material having cell non-adhesive properties, and being an exposed surface of the stimulus responsive layer 1; It has an adhesion boundary X which is a boundary portion of the cell adhesion region 12 which is an exposed surface of the cell adhesion layer 2, and a cell non-adhesion region 13 which is an exposed surface of the cell non-adhesion layer 3 is the stimulation-responsive region 11. It is arranged around and has a non-adhesive boundary Y that is a boundary portion between the stimulus-responsive region 11 and the cell non-adhesive region 13 on the outer periphery of the stimulus-responsive region. Moreover, it has the base material 4 which supports the said stimulus responsive layer 1, the cell adhesion layer 2, and the cell non-adhesion layer 3.
従来の方法では、細胞の裏面、すなわち、足場である支持体に接着した面を安定的に評価することが難しく、細胞の裏面にのみ発現しているタンパク質等の評価を行うことは困難であった。
これに対して、本発明によれば、上記刺激応答性領域に刺激を与え細胞非接着性を発現させることにより、上記刺激応答性領域に接着している細胞からなる細胞シートを剥離することができる。
また、上記刺激応答性領域の周囲に上記細胞非接着領域が配置されていることにより、上記細胞シートを培地中に浮遊可能なものとすることができる。
さらに、上記刺激応答性領域が上記細胞接着領域との間で接着境界を有することにより、上記細胞シートが浮遊可能なものとなった場合であっても上記細胞接着領域において固定されたものとすることができる。
このため、図３（ａ）に例示するように、上記細胞培養用基材１０上に細胞を播種・培養することにより、上記刺激応答性領域および細胞接着領域上に、細胞間結合で細胞同士が少なくとも単層で結合された細胞シート２１を形成し、細胞付基板２０とした後に、上記刺激応答性領域に刺激を与えることにより（図３（ｂ））、上記細胞シート２１のうち上記刺激応答性領域に接着していた部分のみが剥離する。その後、剥離・浮遊した細胞は足場のない状態で収縮する性質から、図３（ｃ）そして、さらには（ｄ）に例示するように、上記細胞シート２１は、上記接着境界の方向に収縮し、刺激応答性領域との接着側表面（裏面）を培地側に向くように裏返る。
したがって、本発明の細胞培養用基材を用いることにより、上記細胞シートの一部を容易に裏返し、裏面が培地側に向いた状態で保持することができることから、細胞の裏面を容易に観察可能とすることができる。その結果、例えば、細胞の裏面側でしか発現していないタンパク質等の評価を容易に行うことができるのである。
なお、図３中の符号については、図２のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
In the conventional method, it is difficult to stably evaluate the back surface of the cell, that is, the surface adhered to the support, which is a scaffold, and it is difficult to evaluate proteins expressed only on the back surface of the cell. It was.
On the other hand, according to the present invention, the cell sheet composed of cells adhering to the stimulus-responsive region can be peeled off by stimulating the stimulus-responsive region and expressing cell non-adhesiveness. it can.
In addition, since the cell non-adhesion region is arranged around the stimulus responsive region, the cell sheet can be floated in the medium.
Further, even if the cell sheet can float due to the stimulus-responsive region having an adhesion boundary with the cell adhesion region, it is fixed in the cell adhesion region. be able to.
For this reason, as illustrated in FIG. 3 (a), by seeding and culturing cells on the cell culture substrate 10, cells are connected to each other on the stimulus-responsive region and the cell adhesion region. Is formed into a cell-attached substrate 20 and then stimulated to the stimulation-responsive region (FIG. 3 (b)), whereby the stimulation of the cell sheet 21 is performed. Only the part adhered to the responsive region peels off. Thereafter, since the detached and floating cells contract in the absence of a scaffold, the cell sheet 21 contracts in the direction of the adhesion boundary, as illustrated in FIG. 3C and further (d). Then, turn over so that the adhesion-side surface (back surface) with the stimulus-responsive region faces the medium side.
Therefore, by using the cell culture substrate of the present invention, a part of the cell sheet can be easily turned over and held with the back side facing the medium side, so that the back side of the cell can be easily observed. It can be. As a result, for example, it is possible to easily evaluate proteins that are expressed only on the back side of the cells.
The reference numerals in FIG. 3 indicate the same members as those in FIG.
また、通常、支持体に接着した細胞の剥離には、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）等の酵素を用いて、細胞間接着分子を構成するタンパク質等を分解する方法が用いられる。このような方法では、細胞−支持体表面の結合だけでなく、細胞−細胞間の結合も弱めてしまう。このため、上記細胞シートにダメージを与えてしまうといった問題があった。
しかしながら、本発明においては、上記刺激応答性領域を用いるものであるため、このような酵素の使用を不要なものとすることができるため、上記細胞シートにダメージを与えることなく、上記刺激応答性領域から剥離することができる。さらに、上記細胞−細胞間の結合を弱めることがないため、上記刺激応答性領域から剥離した際に、上記細胞シートから細胞が分離することや、上記細胞シートが切断されることを抑制することができる。このため、細胞の裏面を安定的に培地側に向いた状態とすることができるのである。
このように、本発明の細胞培養用基材を用いることにより、細胞シートの一部が細胞に大きなダメージが加わることなく裏返るため、裏面が培地側に向いた状態で安定的に保持することが可能となるのである。また、その結果、今までにない新規な評価を行うことが可能となるのである。
In general, a method of degrading a protein constituting an intercellular adhesion molecule using an enzyme such as a protease (proteolytic enzyme) is used for detaching the cell adhered to the support. Such a method weakens not only cell-support surface binding but also cell-cell binding. For this reason, there was a problem that the cell sheet was damaged.
However, in the present invention, since the stimulus-responsive region is used, the use of such an enzyme can be made unnecessary, and thus the stimulus-responsive property can be obtained without damaging the cell sheet. It can be peeled from the area. Furthermore, since the cell-cell bond is not weakened, it is possible to suppress separation of cells from the cell sheet and cleavage of the cell sheet when detached from the stimulus-responsive region. Can do. For this reason, the back surface of a cell can be made into the state which faced the culture medium side stably.
As described above, by using the cell culture substrate of the present invention, a part of the cell sheet is turned over without causing significant damage to the cells, so that the back surface can be stably held with the medium side facing. It becomes possible. As a result, it is possible to perform a new evaluation that has never been made.
本発明の細胞培養用基材は、刺激応答性領域、細胞接着性領域および細胞非接着性領域を少なくとも有するものである。
以下、本発明の細胞培養用基材の各構成について詳細に説明する。
The cell culture substrate of the present invention has at least a stimulus-responsive region, a cell adhesive region, and a cell non-adhesive region.
Hereafter, each structure of the base material for cell cultures of this invention is demonstrated in detail.
１．刺激応答性領域
本発明における刺激応答性領域は、刺激応答性材料を含む刺激応答性層の表面のうち、露出した範囲であり、刺激により細胞の接着度合いを変化させることにより培養する細胞の接着および剥離を行なうことができるものである。
1. Stimulus responsive region The stimulus responsive region in the present invention is an exposed range of the surface of the stimulus responsive layer containing the stimulus responsive material, and adhesion of cells to be cultured by changing the degree of cell adhesion by stimulation. And can be peeled off.
（１）刺激応答性領域
本発明における刺激応答性領域は、刺激により細胞の接着度合いを変化させることにより培養する細胞の接着および剥離を行なうことができるものである。
(1) Stimulus responsive region The stimulus responsive region in the present invention is capable of adhering and peeling cells to be cultured by changing the degree of cell adhesion by stimulation.
本発明における刺激応答性領域は、特定の刺激により細胞の接着度合いが高い細胞接着性を発現している状態から、細胞の接着度合いが低い細胞非接着性を発現している状態に変化し得るものである。 The stimulus-responsive region in the present invention can change from a state expressing cell adhesion with a high degree of cell adhesion by a specific stimulus to a state expressing cell non-adhesiveness with a low degree of cell adhesion. Is.
ここで、上記刺激応答性領域が細胞接着性を発現しているとは、上記刺激応答性領域上で、細胞が接着、伸展しやすく、細胞接着伸展率が高い状態であることをいうものである。本発明において、このような細胞接着伸展率が高い状態としては、具体的には、細胞接着伸展率が６０％以上である状態とすることができる。
本発明においては、なかでも、８０％以上であることが好ましい。効率的に細胞を培養し、細胞シートを形成させることができるからである。
Here, the stimulus-responsive region expressing cell adhesion means that the cells are easy to adhere and spread on the stimulus-responsive region and have a high cell adhesion extension rate. is there. In the present invention, specifically, such a state where the cell adhesion extension rate is high can be a state where the cell adhesion extension rate is 60% or more.
In the present invention, it is preferably 80% or more. This is because cells can be efficiently cultured and a cell sheet can be formed.
なお、本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内でウシ血管内皮細胞を播種し、３７℃インキュベーター内(ＣＯ２濃度５％)に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））を表すものである。
また、上記細胞の播種は、１０％ＦＢＳ(血清)入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて培養基材上に播種し、その後、上記細胞ができるだけ均一に分布するよう、上記細胞が播種された培養基材をゆっくりと振とうすることにより行うものである。
さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。また、細胞接着伸展率の測定個所としては、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いて測定を行うものである。
In the present invention, the cell adhesion spreading rate is such that bovine vascular endothelial cells are seeded in a seeding density range of 4000 cells / cm 2 or more and less than 30000 cells / cm 2 and stored in a 37 ° C. incubator (CO 2 concentration 5%). It represents the ratio of the cells that have been spread by adhesion at the time of culturing for 14.5 hours ({(number of cells adhered) / (number of cells seeded)} × 100 (%)).
The cells are seeded by suspending them in a DMEM medium containing 10% FBS (serum) and seeding them on a culture substrate, and then the culture medium on which the cells are seeded so that the cells are distributed as uniformly as possible. This is done by shaking the material slowly.
Furthermore, the measurement of the cell adhesion extension rate is performed after exchanging the medium immediately before the measurement to remove the non-adhered cells. In addition, the cell adhesion extension rate is measured at a location where the cell density is likely to be specific (for example, the center of a predetermined area where the density is likely to be high and the periphery of the predetermined area where the density is likely to be low). To measure.
また、上記刺激応答性領域が細胞非接着性を発現している場合とは、上記刺激応答性領域上で細胞が接着、伸展しにくく、細胞接着伸展率が低い状態であることをいうものである。本発明において、このような細胞接着伸展率が低い状態としては、具体的には、上記細胞接着伸展率が５％以下である状態とすることができる。本発明においては、なかでも２％以下であることが好ましい。
したがって、上記刺激応答性領域に細胞を播種すると、細胞接着性を発現している際には細胞が上記刺激応答性領域に接着するが、細胞非接着性を発現している際には細胞が上記刺激応答性領域に接着することを阻害されるため、上記刺激応答性領域に接着していた細胞を剥離することができる。
In addition, the case where the stimulus-responsive region expresses cell non-adhesiveness means that the cells are difficult to adhere and spread on the stimulus-responsive region and the cell adhesion extension rate is low. is there. In the present invention, specifically, such a state where the cell adhesion extension rate is low can be a state where the cell adhesion extension rate is 5% or less. In the present invention, the content is preferably 2% or less.
Therefore, when cells are seeded in the stimulus-responsive region, the cells adhere to the stimulus-responsive region when expressing cell adhesion, but the cells adhere to the stimulus-responsive region when expressed. Since adhesion to the stimulus-responsive region is inhibited, cells that have adhered to the stimulus-responsive region can be detached.
本発明に用いられる刺激応答性領域の形状としては、上記細胞接着領域との間で連続した細胞シートを安定的に形成することができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、既に説明した図１に示すような半円形状、図４および図５に例示するような略楕円形状等の円形状のもの、図６に例示するような多角形状、ライン状等であってもよい。また、複数の形状を組み合わせたものであってもよい。
なお、図４〜図６中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
また、図４および５においては、略楕円形状の刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２の境界である接着境界Ｘが、上記細胞接着領域１２に向かって凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。また、図６においては、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２が四角形状であり、両者により形成される接着境界Ｘが直線状であり、上記刺激応答性領域１２の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。
The shape of the stimulus-responsive region used in the present invention is not particularly limited as long as it can stably form a continuous cell sheet with the cell adhesion region. 1 may be a semicircular shape as shown in FIG. 1, a circular shape such as a substantially elliptical shape as illustrated in FIGS. 4 and 5, a polygonal shape as illustrated in FIG. 6, a line shape, or the like. . Further, a combination of a plurality of shapes may be used.
4 to 6 indicate the same members as those in FIG. 1, and a description thereof will be omitted here.
4 and 5, the adhesion boundary X, which is the boundary between the substantially elliptical stimulus-responsive region 11 and the cell adhesion region 12, has a convex arc shape toward the cell adhesion region 12. In this example, the periphery of the responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13. In FIG. 6, the stimulus responsive region 11 and the cell adhesion region 12 are square, the adhesion boundary X formed by both is linear, and the periphery of the stimulus responsive region 12 is the cell non-existence. This is an example surrounded by the adhesion region 13.
本発明に用いられる刺激応答性領域の幅、すなわち、上記接着境界からの距離としては、裏返った細胞シートを安定的に形成できるものであれば特に限定されるものではないが、具体的には、６０μｍ以上であることが好ましく、なかでも５００μｍ以上であることが好ましい。上記幅が上述の範囲内であることにより、上記刺激応答性領域上の細胞シートを安定的に裏返すことができるからである。
なお、上記幅は、上記細胞シートが裏返り得る最大幅をいうものであり、具体的には、図７に例示するように、上記接着境界Ｘが上記細胞接着領域１２に向かって凸状の場合、すなわち、上記接着境界Ｘおよび非接着境界Ｙの交点を結ぶ直線（図中の破線ａ）が上記刺激応答性領域１１に含まれる場合において、上記直線ａから垂直方向に上記非接着境界Ｙまでの距離のうち最長となる距離ｔをいうものである。また、例えば、図８に示すように上記接着境界Ｘが上記刺激応答性領域１１に向かって凸状、すなわち、上記直線ａが細胞接着領域１２に含まれる場合において、上記接着境界Ｘ上の点における接線（図中の一点破線ｂ）から垂直方向に上記非接着境界Ｙまでの距離のうち最長となる距離ｔ、または、既に説明した図６に示すように、上記接着境界Ｘが直線状である場合における上記接着境界Ｘから垂直方向に上記非接着境界Ｙまでの距離のうち最長となる距離をいうものである。
また、図７および図８中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
ここで、図７においては、略楕円形状の刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２の接着境界Ｘが、上記細胞接着領域１２に向かって凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれている例である。また、図８においては、略楕円形状の刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２との境界である接着境界Ｘが、上記刺激応答性領域１１に向かって凸状、すなわち、上記細胞接着領域１２に対して凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれている例である。
The width of the stimulus-responsive region used in the present invention, that is, the distance from the adhesion boundary is not particularly limited as long as it can stably form an inverted cell sheet, but specifically, The thickness is preferably 60 μm or more, and more preferably 500 μm or more. This is because the cell sheet on the stimulus-responsive region can be stably turned over when the width is within the above-described range.
In addition, the said width | variety says the maximum width which the said cell sheet can turn over, and specifically, when the said adhesion boundary X is convex toward the said cell adhesion area | region 12 so that it may illustrate in FIG. That is, when a straight line (broken line a in the figure) connecting the intersection of the adhesive boundary X and the non-adhesive boundary Y is included in the stimulus responsive region 11, the straight line a is perpendicular to the non-adhesive boundary Y. Is the longest distance t. For example, as shown in FIG. 8, when the adhesion boundary X is convex toward the stimulus responsive region 11, that is, when the straight line a is included in the cell adhesion region 12, the point on the adhesion boundary X is The distance t that is the longest of the distances from the tangent line (dotted line b in the figure) to the non-bonding boundary Y in the vertical direction, or the bonding boundary X is linear as shown in FIG. This is the longest distance among the distances from the adhesion boundary X to the non-adhesion boundary Y in the vertical direction in a certain case.
7 and 8 indicate the same members as those in FIG. 1, and therefore the description thereof is omitted here.
Here, in FIG. 7, the adhesion boundary X between the substantially elliptical stimulus-responsive region 11 and the cell adhesion region 12 has a circular arc shape convex toward the cell adhesion region 12, and the stimulus-responsive region 11. Is surrounded by the cell non-adhesion region 13. Further, in FIG. 8, the adhesion boundary X that is a boundary between the substantially elliptical stimulus-responsive region 11 and the cell adhesion region 12 is convex toward the stimulus-responsive region 11, that is, the cell adhesion region 12. Is an example in which the stimulus-responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13.
本発明に用いられる刺激応答性領域の数としては、本発明の細胞培養用基材内に少なくとも１つ含まれるものであれば特に限定されるものではない。本発明においては、既に説明した図１に示すように、細胞培養用基材内に１つであっても良く、図９に例示するように、複数有するものであっても良い。
なお、図９中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
図９においては、略楕円形状の刺激応答性領域１１を複数含み、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２との境界である接着境界Ｘが、上記細胞接着領域１２に向かって凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれている例である。
The number of stimulus-responsive regions used in the present invention is not particularly limited as long as at least one is included in the cell culture substrate of the present invention. In the present invention, as shown in FIG. 1 already described, one may be provided in the cell culture substrate, or a plurality may be provided as illustrated in FIG.
Note that the reference numerals in FIG. 9 indicate the same members as those in FIG. 1, and a description thereof will be omitted here.
In FIG. 9, a plurality of substantially elliptical stimulus-responsive regions 11 are included, and an adhesion boundary X that is a boundary between the stimulus-responsive region 11 and the cell adhesion region 12 is convex toward the cell adhesion region 12. In this example, the shape is arcuate, and the periphery of the stimulus-responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13.
本発明に用いられる刺激応答性領域の種類としては、１種類のみであっても良く、異なる刺激に応答する複数の刺激応答性領域を含むものであっても良い。 As a kind of stimulus responsive area used for the present invention, only one kind may be sufficient and a plurality of stimulus responsive areas which respond to different stimuli may be included.
本発明に用いられる刺激応答性領域は、その外周の少なくとも一部に、上記刺激応答性領域および細胞非接着領域の境界部分である非接着境界を有するものである。
ここで、上記非接着境界は、上記刺激応答性領域に刺激を与えた際に、上記非接着境界に沿って、上記細胞シートを培地中に浮遊させることができるものであれば特に限定されるものではない。このような非接着境界は、通常、平面視上、上記刺激応答性領域と上記細胞非接着領域とが接した状態を示すものであるが、例えば、上記刺激応答性領域および細胞非接着領域の間に、上記刺激応答性領域に刺激を与えた際に、上記非接着境界に沿って、上記細胞シートを培地中に浮遊させることができる程度の幅で形成された細胞接着領域等の他の領域が存在する箇所も含むものである。
本発明においては、なかでも、平面視上、上記細胞非接着領域と接する箇所であること、すなわち、上記刺激応答性領域および細胞非接着領域の間に他の領域を含まない箇所であることが好ましい。上記細胞シートを安定的に形成することができるからである。
The stimulus-responsive region used in the present invention has a non-adhesion boundary that is a boundary portion between the stimulus-responsive region and the cell non-adhesion region at least at a part of the outer periphery thereof.
Here, the non-adhesion boundary is particularly limited as long as the cell sheet can be suspended in the medium along the non-adhesion boundary when the stimulus-responsive region is stimulated. It is not a thing. Such a non-adhesion boundary usually indicates a state where the stimulation-responsive region and the cell non-adhesion region are in contact with each other in plan view. In the meantime, when a stimulus is applied to the stimulus-responsive region, the cell sheet is formed in such a width that the cell sheet can be suspended in the medium along the non-adhesion boundary. It also includes locations where areas exist.
In the present invention, in particular, it is a place that is in contact with the cell non-adhesion region in plan view, that is, a location that does not include other regions between the stimulus-responsive region and the cell non-adhesion region. preferable. This is because the cell sheet can be stably formed.
本発明に用いられる刺激応答性領域の上記細胞非接着領域との位置関係としては、上記刺激応答性領域の外周の少なくとも一部に上記非接着境界を有するものであれば特に限定されるものではなく、既に説明した図１に示すように、平面視上、上記刺激応答性領域の外周においてのみ上記非接着境界を有する関係や、図１０に例示するように、上記刺激応答性領域の外周において上記非接着境界を有する関係と上記非接着境界が上記刺激応答性領域内に含まれる関係とを組み合わせたものとすることができる。
また、本発明においては、上記刺激応答性領域の周囲に上記細胞非接着領域が配置されるものであれば良く、既に説明した図１に示すように、上記刺激応答性領域１１が上記細胞非接着領域１３により周囲が囲まれるものであっても良く、図１１に例示するように、上記刺激応答性領域１１の周囲の一部に上記細胞非接着領域１３が配置されるものであっても良い。
なお、図１０および図１１中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
また、図１０においては、略楕円形状の刺激応答性領域１１を含み、上記刺激応答性領域１１中に円形状の細胞非接着領域１３を有し、上記接着境界Ｘが上記細胞接着領域１１に向かって凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。図１１においては、略半円形状の刺激応答性領域１１を含み、上記接着境界Ｘが上記刺激応答性領域に向かって凸状、すなわち、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３および細胞接着領域１２により囲まれる例である。
The positional relationship between the stimulus-responsive region used in the present invention and the cell non-adherent region is not particularly limited as long as it has the non-adhesive boundary on at least a part of the outer periphery of the stimulus-responsive region. As shown in FIG. 1 which has already been described, in a plan view, the relationship having the non-adhesion boundary only at the outer periphery of the stimulus responsive region, or at the outer periphery of the stimulus responsive region as illustrated in FIG. The relationship having the non-adhesion boundary and the relationship in which the non-adhesion boundary is included in the stimulus responsive region can be combined.
Further, in the present invention, it is only necessary that the cell non-adhesion region is disposed around the stimulus responsive region, and as shown in FIG. The periphery may be surrounded by the adhesion region 13, and the cell non-adhesion region 13 may be disposed in a part of the periphery of the stimulus responsive region 11 as illustrated in FIG. 11. good.
Note that the reference numerals in FIGS. 10 and 11 indicate the same members as those in FIG.
In addition, in FIG. 10, the stimulus responsive region 11 having a substantially elliptical shape is included, and the stimulus responsive region 11 has a circular cell non-adhesive region 13, and the adhesion boundary X is in the cell adhesion region 11. In this example, the stimulus-responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13. In FIG. 11, the stimulus responsive region 11 having a substantially semicircular shape is included, and the adhesion boundary X is convex toward the stimulus responsive region, that is, an arc shape convex to the cell adhesion region. In this example, the periphery of the stimulus responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesion region 13 and the cell adhesion region 12.
本発明における刺激応答性領域および細胞非接着領域の境界である非接着境界の形状としては、上記刺激応答性領域に刺激を与えて細胞非接着性を発現させた際に、上記非接着境界に沿って、上記刺激応答性領域に接着していた細胞シートを剥離させることができるものであれば特に限定されるものではないが、上記非接着境界の形状が、上記細胞接着領域に対して凸状であることが好ましい。上記細胞シートを安定的に裏返すことができるからである。
また、本発明においては、なかでも、上記非接着境界の形状が円弧状であることが好ましい。上記非接着境界に沿って上記細胞シートを安定的に剥離させることができるからである。また、例えば、既に説明した図６に示すように、上記非接着境界に多角形の頂点が存在する場合、上記頂点において細胞が固着し、上記刺激応答性領域に刺激を与えたとしても細胞が安定的に剥離することができない可能性があるからである。
なお、上記非接着境界の形状が上記細胞接着領域に対して凸状であるとは、例えば、既に説明した図８に示すように、上記接着境界Ｘおよび非接着境界Ｙの交点を結ぶ直線ａが細胞接着領域１２に含まれることをいう。
As the shape of the non-adhesion boundary that is the boundary between the stimulus-responsive region and the cell non-adhesion region in the present invention, when the stimulus-responsive region is stimulated to express cell non-adhesion, the non-adhesion boundary is formed. Along with this, there is no particular limitation as long as the cell sheet adhered to the stimulus-responsive region can be peeled off, but the shape of the non-adhesion boundary is convex with respect to the cell adhesion region. It is preferable that it is a shape. This is because the cell sheet can be stably turned over.
Moreover, in the present invention, it is preferable that the shape of the non-adhesion boundary is an arc shape. This is because the cell sheet can be stably peeled along the non-adhesion boundary. In addition, for example, as shown in FIG. 6 described above, when a polygonal vertex is present at the non-adhesion boundary, the cell adheres at the vertex, and even if the stimulus is applied to the stimulus-responsive region, the cell does not This is because there is a possibility that it cannot be stably peeled off.
The shape of the non-adhesion boundary is convex with respect to the cell adhesion region, for example, as shown in FIG. 8 described above, a straight line a connecting the intersections of the adhesion boundary X and the non-adhesion boundary Y. Is included in the cell adhesion region 12.
本発明における非接着境界の上記刺激応答性領域の外周における形成箇所としては、上記刺激応答性領域の外周に少なくとも一部に形成されるものであれば特に限定されるものではないが、上記刺激応答性領域の全外周に形成されることが好ましい。上記細胞シートを上記刺激応答性領域の形状に沿って安定的に剥離可能なものとすることができるからである。
なお、上記刺激応答性領域の全外周とは、上記刺激応答性領域の外周のうち、上記接着境界が形成されていない箇所全てをいうものである。
The formation location of the non-adhesive boundary in the outer periphery of the stimulus responsive region in the present invention is not particularly limited as long as it is formed at least partially on the outer periphery of the stimulus responsive region. It is preferably formed on the entire outer periphery of the responsive region. This is because the cell sheet can be stably peeled along the shape of the stimulus-responsive region.
Note that the entire outer periphery of the stimulus responsive region refers to all of the outer periphery of the stimulus responsive region where the adhesive boundary is not formed.
本発明に用いられる刺激応答性領域の上記細胞非接着領域に対する高さとしては、上記細胞シートを安定的に形成可能であれば特に限定されるものではないが、上記刺激応答性領域および細胞非接着領域が同一の高さ、すなわち同一平面上に形成されるものであっても良く、異なるものであっても良い。 The height of the stimulus-responsive region used in the present invention with respect to the cell non-adhesion region is not particularly limited as long as the cell sheet can be stably formed. The adhesion regions may be formed at the same height, that is, on the same plane, or may be different.
本発明における刺激応答性領域は、上記細胞接着領域との境界部分である接着境界を有するものである。
ここで、上記接着境界とは、上記刺激応答性領域および細胞接着領域の境界であり、上記刺激応答性領域および細胞接着領域上に細胞同士が結合してなる、連続した細胞シートを形成でき、上記刺激応答性領域に刺激を与えた後に、上記細胞シートが分断することのないものであれば特に限定されるものではない。
したがって、通常、上記接着境界は、上記刺激応答性領域と上記細胞接着領域とが平面視上接している箇所を示すものであるが、本発明においては、これに限定されるものではない。例えば、図１２に例示するように、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２の間に、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２上で培養される細胞同士が接着することができる幅で配置された細胞非接着領域１３ａ等の他の領域が存在するものであっても良い。
本発明においては、なかでも、平面視上、上記刺激応答性領域および細胞接着領域が接する箇所であること、すなわち、上記刺激応答性領域および細胞接着領域の間に細胞非接着領域等の他の領域を含まない箇所であることが好ましい。本発明の細胞培養用基材を用いて細胞シートを形成した際に、上記接着境界で細胞シートが切断する等の不具合を低減させ、安定的に細胞シートを形成することができるためである。
なお、図１２中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。また、図１２中の細胞シート２１は、説明の容易のため、上記細胞接着領域および刺激応答性領域上形成された細胞シートの一部を示すものである。
また、図１２においては、四角形状の刺激応答性領域１１および四角形状の細胞接着領域１２を含み、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２の境界である接着境界Ｘが直線状であり、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。
The stimulus-responsive region in the present invention has an adhesion boundary that is a boundary portion with the cell adhesion region.
Here, the adhesion boundary is a boundary between the stimulation responsive region and the cell adhesion region, and a continuous cell sheet formed by cells being bonded on the stimulation responsive region and the cell adhesion region can be formed. There is no particular limitation as long as the cell sheet is not divided after the stimulus is applied to the stimulus-responsive region.
Therefore, the adhesion boundary usually indicates a place where the stimulus-responsive region and the cell adhesion region are in contact with each other in plan view, but the present invention is not limited to this. For example, as illustrated in FIG. 12, a width in which cells cultured on the stimulus responsive region 11 and the cell adhesion region 12 can adhere between the stimulus responsive region 11 and the cell adhesion region 12. There may be other regions such as the cell non-adhesion region 13a arranged in (1).
In the present invention, in particular, in a plan view, the stimulus-responsive region and the cell adhesion region are in contact with each other, that is, other regions such as a cell non-adhesion region between the stimulus-responsive region and the cell adhesion region. It is preferable that the area does not include a region. This is because when the cell sheet is formed using the cell culture substrate of the present invention, problems such as the cell sheet being cut at the adhesion boundary can be reduced, and the cell sheet can be stably formed.
Note that the reference numerals in FIG. 12 indicate the same members as those in FIG. 1, and a description thereof will be omitted here. Moreover, the cell sheet 21 in FIG. 12 shows a part of the cell sheet formed on the cell adhesion region and the stimulus-responsive region for easy explanation.
In addition, in FIG. 12, a quadrangular stimulation-responsive region 11 and a quadrangular cell adhesion region 12 are included, and an adhesion boundary X that is a boundary between the stimulation responsive region 11 and the cell adhesion region 12 is linear, This is an example in which the periphery of the stimulus-responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13.
本発明における接着境界の位置としては、上記刺激応答性領域に細胞非接着性を発現させた際に、裏返った細胞シートを安定的に形成できるものであれば特に限定されるものではない。
例えば、既に説明した図１に示すように、平面視上、上記刺激応答性領域の外周に配置されるものや、図１３に例示するように、平面視上、上記刺激応答性領域内に配置されるものとすることができる。
なお、図１３中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。また、図１３においては、円形状の刺激応答性領域１１を含み、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２との境界である接着境界Ｘが、上記細胞接着領域１２に向かって凸状の円弧状である箇所を含み、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。
The position of the adhesion boundary in the present invention is not particularly limited as long as it can stably form an inverted cell sheet when cell non-adhesiveness is expressed in the stimulus-responsive region.
For example, as shown in FIG. 1 which has already been described, the one arranged in the outer periphery of the stimulus responsive region in plan view, or the one in the stimulus responsive region in plan view as illustrated in FIG. Can be.
In addition, about the code | symbol in FIG. 13, since it shows the same member as the thing of FIG. 1, description here is abbreviate | omitted. Further, in FIG. 13, an adhesive boundary X that includes a circular stimulus-responsive region 11 and is a boundary between the stimulus-responsive region 11 and the cell adhesion region 12 is convex toward the cell adhesion region 12. This is an example in which a portion having an arc shape is included and the periphery of the stimulus responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13.
本発明に用いられる接着境界の数としては、少なくとも１つであれば特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜設定することができる。
例えば、図１４（ａ）および（ｂ）に例示するように３つとすることもできる。
なお、図１４中の符号については、図１のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。また、図１４（ａ）においては、半円形状の刺激応答性領域１１を含み、細胞接着領域１２および直線状の接着境界Ｘを複数有し、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例であり、図１４（ｂ）においては、一つの細胞接着領域１２と、上記刺激応答性領域１１および細胞接着領域１２が複数の細胞非接着領域１３を含み、直線状の接着境界Ｘを複数有し、上記刺激応答性領域１１の周囲が上記細胞非接着領域１３により囲まれる例である。
The number of adhesion boundaries used in the present invention is not particularly limited as long as it is at least one, and can be appropriately set according to the application.
For example, as illustrated in FIGS. 14A and 14B, the number may be three.
In addition, about the code | symbol in FIG. 14, since it shows the same member as the thing of FIG. 1, description here is abbreviate | omitted. 14A includes a semi-circular stimulus-responsive region 11, and has a plurality of cell adhesion regions 12 and linear adhesion boundaries X, and the periphery of the stimulus-responsive region 11 is the non-cell region. FIG. 14B shows an example surrounded by the adhesion region 13. In FIG. 14B, one cell adhesion region 12, the stimulation-responsive region 11 and the cell adhesion region 12 include a plurality of cell non-adhesion regions 13, and are linear. In this example, the stimulation-responsive region 11 is surrounded by the cell non-adhesive region 13.
また、本発明において上記各細胞接着領域との間で形成される接着境界の数としては、１つの刺激応答性領域との間に少なくとも１つの接着境界を形成でき、上記細胞シートを安定的に裏返すことができるものであれば特に限定されるものではない。
したがって、１つの細胞接着領域に１つの上記接着境界を形成するものであっても良く、1つの細胞接着領域に複数の上記接着境界を形成するものであっても良い。
具体的には、既に説明した図１や１３（ａ）に例示するように、１つの細胞接着領域との間に１つの接着境界を形成するものであっても良く、図１３（ｂ）に例示するように、１つの細胞接着領域との間に複数の接着境界を形成するものであっても良い。
In the present invention, as the number of adhesion boundaries formed between the cell adhesion regions, at least one adhesion boundary can be formed with one stimulus-responsive region, and the cell sheet can be stably formed. There is no particular limitation as long as it can be reversed.
Therefore, one adhesion boundary may be formed in one cell adhesion region, or a plurality of the adhesion boundaries may be formed in one cell adhesion region.
Specifically, as illustrated in FIGS. 1 and 13 (a) already described, one adhesion boundary may be formed between one cell adhesion region and FIG. 13 (b). As illustrated, a plurality of adhesion boundaries may be formed between one cell adhesion region.
本発明における接着境界の長さとしては、裏返った細胞シートを安定的に保持できる距離であれば特に限定されるものではなく、２０μｍ以上が好ましい。 The length of the adhesion boundary in the present invention is not particularly limited as long as it is a distance that can stably hold the inverted cell sheet, and is preferably 20 μm or more.
本発明に用いられる接着境界の形状としては、細胞シートを安定的に裏返すことができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、既に説明した図１および図６に示すような直線状であっても良く、図４および図５に示すような曲線状であっても良い。
本発明においては、なかでも、上記細胞接着領域に対して凸状であることが好ましく、特に、円弧状であることが好ましく、なかでも特に、上記刺激応答性領域の幅ｔおよび上記細胞接着領域の凸部の幅ｓが、ｓ≧１／３ｔを満たすことが好ましく、ｓ≧１／２ｔであることが特に好ましい。上記刺激応答性領域に刺激を与えた際に、上記細胞シートを安定的に裏返すことができ、図１５に例示するように、上記細胞シート２１が折り重なることを抑制することができるからである。したがって、上記細胞シートの裏面を正確に評価することができるからである。
なお、上記細胞接着領域の凸部の幅ｓは、図１６に例示するように、上記刺激応答性領域１１の幅を最大にする上記接着境界Ｘ上の点ｃから、上記点ｃにおける接線（図中の一点破線ｂ）から垂直方向に、上記接着境界および非接着境界の交点を結ぶ直線ａまでの距離をいうものである。
なお、図１５および図１６中の符号については、図１および図２のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
The shape of the adhesion boundary used in the present invention is not particularly limited as long as the cell sheet can be stably turned over. For example, a linear shape as shown in FIGS. 1 and 6 already described. It may be a curved shape as shown in FIG. 4 and FIG.
In the present invention, among others, it is preferably convex against the above cell adhesion region, particularly, preferably arc-shaped, among other things, the width t and the cell adhesion region of the stimulus responsive region It is preferable that the width s of the convex portion satisfies s ≧ 1 / 3t, and it is particularly preferable that s ≧ 1 / 2t. This is because, when a stimulus is applied to the stimulus-responsive region, the cell sheet can be stably turned over, and the cell sheet 21 can be prevented from being folded as illustrated in FIG. Therefore, the back surface of the cell sheet can be accurately evaluated.
Note that the width s of the convex portion of the cell adhesion region is tangent to the point c from the point c on the adhesion boundary X that maximizes the width of the stimulus responsive region 11 as illustrated in FIG. This is the distance from the one-dot broken line b) in the figure to the straight line a connecting the intersections of the bonding boundary and the non-bonding boundary in the vertical direction.
Note that the reference numerals in FIGS. 15 and 16 indicate the same members as those in FIGS. 1 and 2, and a description thereof will be omitted here.
本発明に用いられる刺激応答性領域の上記細胞接着領域に対する高さとしては、上記細胞シートを安定的に形成可能であれば特に限定されるものではないが、上記刺激応答性領域および細胞接着領域が同一の高さ、すなわち同一平面上に形成されるものであっても良く、異なるものであっても良い。 The height of the stimulus-responsive region used in the present invention with respect to the cell adhesion region is not particularly limited as long as the cell sheet can be stably formed, but the stimulus-responsive region and the cell adhesion region are not limited. May be formed at the same height, that is, on the same plane, or may be different.
（２）刺激応答性層
本発明に用いられる刺激応答性層は、上記刺激応答性材料を含み、平面視上、露出した表面である刺激応答性領域を有するものである。
(2) Stimulus responsive layer The stimulus responsive layer used in the present invention includes the stimulus responsive material and has a stimulus responsive region that is an exposed surface in plan view.
（ａ）刺激応答性材料
本発明に用いられる刺激応答性材料としては、刺激の有無により細胞の接着度合いが変化し、培養する細胞の接着および剥離を行なうことができるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、温度、光、ｐＨ、電位および磁力によりそれぞれ細胞の接着度合いが変化する温度応答性材料、光応答性材料、ｐＨ応答性材料、電位応答性材料、および磁力応答性材料等を挙げることができる。
本発明においては、なかでも、温度応答性材料であることが好ましい。刺激の付与が容易だからである。
(A) Stimulus-responsive material The stimulus-responsive material used in the present invention is not particularly limited as long as the degree of adhesion of cells changes depending on the presence or absence of stimulation and can adhere and detach cells to be cultured. For example, a temperature responsive material, a photoresponsive material, a pH responsive material, a potential responsive material, and a magnetic force responsive material in which the degree of cell adhesion changes depending on temperature, light, pH, potential, and magnetic force, respectively. Etc.
In the present invention, among them, a temperature responsive material is preferable. This is because it is easy to apply a stimulus.
本発明に用いられる刺激応答性材料の細胞の接着度合いの変化としては、少なくとも、細胞接着性を有する状態から細胞非接着性を有する状態に変化することができるものであれば特に限定されるものではなく、可逆的に変化するものであっても良く、非可逆的に変化するものであっても良く、用途によって選択されるものである。 The change in the degree of cell adhesion of the stimulus-responsive material used in the present invention is particularly limited as long as it can change from a state having cell adhesion to a state having cell non-adhesion. Instead, it may be reversibly changed or irreversibly changed, and is selected depending on the application.
本発明に用いられる刺激応答性材料の上記刺激応答性層中の含有量としては、刺激により上記刺激応答性層の表面である刺激応答性領域に所望の接着性の変化を得られるものであれば特に限定されるものではなく、上記材料の種類等によって異なるものである。 The content of the stimulus-responsive material used in the present invention in the stimulus-responsive layer is such that a desired adhesive change can be obtained in the stimulus-responsive region that is the surface of the stimulus-responsive layer by stimulation. If it is not specifically limited, it will differ according to the kind of the said material.
本発明に用いられる温度応答性材料は、温度変化により、細胞の接着度合いが変化するものであれば特に限定されるものではない。
本発明においては、上記温度応答性材料の細胞接着性を発揮する温度領域が、１０℃〜４５℃の範囲内であることが好ましく、なかでも、３３℃〜４０℃の範囲内であることが好ましい。上記温度領域が上述の範囲内であることにより、細胞を安定的に培養することができるからである。
The temperature-responsive material used in the present invention is not particularly limited as long as the degree of cell adhesion changes due to temperature change.
In this invention, it is preferable that the temperature range which exhibits the cell adhesiveness of the said temperature-responsive material exists in the range of 10 to 45 degreeC, and it is especially in the range of 33 to 40 degreeC. preferable. This is because the cells can be stably cultured when the temperature region is within the above range.
本発明における温度応答性材料の細胞非接着性を発揮する温度領域が、１℃〜３６℃の範囲内であることが好ましく、なかでも、４℃〜３２℃の範囲内であることが好ましい。上記温度領域が上述の範囲内であることにより、細胞へのダメージの少ないものとすることができるからである。 It is preferable that the temperature range which exhibits the cell non-adhesiveness of the temperature-responsive material in this invention exists in the range of 1 degreeC-36 degreeC, and it is preferable that it exists in the range of 4 degreeC-32 degreeC especially. This is because when the temperature range is within the above range, damage to cells can be reduced.
このような本発明に用いられる温度応答性材料としては、具体的には、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、及び、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等を挙げることができ、なかでもＰＩＰＡＡｍ、ポリ−Ｎ−ｎ―プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドを好ましく用いることができ、特に、ＰＩＰＡＡｍを好ましく用いることができる。細胞接着性を有する温度領域および細胞非接着性を有する温度領域が上述の温度領域であり、ダメージの少ないものとすることができるからである。
また、本発明においては、上記温度応答性材料が１種類のみからなるものであっても良く、２種類以上含むものであっても良い。また、温度領域の調整するため、上記温度応答性材料同士および／またはその他のポリマーと共重合したものを用いるものであっても良い。
Specific examples of the temperature-responsive material used in the present invention include poly-N-isopropylacrylamide (PIPAAm), poly-Nn-propylacrylamide, poly-Nn-propylmethacrylamide, poly -N-ethoxyethyl acrylamide, poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide, poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide, poly-N, N-diethyl acrylamide, etc. can be mentioned, among them PIPAAm, poly-N -N-Propylmethacrylamide and poly-N, N-diethylacrylamide can be preferably used, and PIPAAm can be particularly preferably used. This is because the temperature region having cell adhesion and the temperature region having cell non-adhesion are the above-described temperature regions and can be reduced in damage.
In the present invention, the temperature-responsive material may be composed of only one type or may contain two or more types. Further, in order to adjust the temperature region, a material copolymerized with the above temperature-responsive materials and / or other polymers may be used.
本発明に用いられる光応答性材料としては、光照射の有無により細胞の接着度合いが変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００５−２１０９３６号公報に開示されるような、光触媒や、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギドおよびロイコ色素等の光応答成分を含むものを用いることができる。 The photoresponsive material used in the present invention is not particularly limited as long as the degree of cell adhesion changes depending on the presence or absence of light irradiation. For example, it is disclosed in JP-A-2005-210936. In addition, photocatalysts and those containing photoresponsive components such as azobenzene, diarylethene, spiropyran, spirooxazine, fulgide and leuco dye can be used.
本発明に用いられる電位応答性材料としては、電位の印加により、細胞の接着度合いが変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００８−２９５３８２号公報に開示されるような、電極と、ＲＧＤ配列を含むペプチド等の細胞接着性部分を有し、上記電極表面にチオレートを介して結合するアルカンチオール、システイン、アルカンジスルフィド等のスペーサ物質とを有するものを挙げることができる。 The potential responsive material used in the present invention is not particularly limited as long as the degree of cell adhesion is changed by application of a potential. For example, it is disclosed in JP-A-2008-295382. Further, there may be mentioned those having an electrode and a spacer substance such as alkanethiol, cysteine, alkane disulfide, etc., which have a cell adhesive portion such as a peptide containing an RGD sequence and bind to the electrode surface via thiolate. .
本発明に用いられる磁力応答性材料としては、磁力の付与・除去により細胞の接着度合いが変化するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、特開２００５−３１２３８６号公報に開示されるような、フェライト等の磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソームを挙げることができる。 The magnetic force responsive material used in the present invention is not particularly limited as long as the degree of adhesion of cells changes due to the application / removal of magnetic force. For example, it is disclosed in JP-A-2005-312386. Examples thereof include positively charged liposomes encapsulating magnetic particles in which magnetic particles such as ferrite are encapsulated in positively charged liposomes.
（ｂ）刺激応答性層
本発明に用いられる刺激応答性層は、少なくとも上記刺激応答性材料を含むものである。
本発明においては、上記刺激応答性を阻害しない範囲内において、必要に応じて、レベリング剤、可塑剤、界面活性剤、消泡剤、増感剤等の添加剤や、ポリビニルアルコール、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ナイロン、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレンや、ポリエチレングリコール、ＭＰＣポリマー（商品名）等の両性イオン高分子等のバインダー樹脂を含むものであっても良い。
(B) Stimulus responsive layer The stimulus responsive layer used in the present invention contains at least the stimulus responsive material.
In the present invention, additives such as leveling agents, plasticizers, surfactants, antifoaming agents, sensitizers, polyvinyl alcohol, unsaturated polyesters, etc., as necessary, within a range that does not inhibit the stimulus responsiveness. , Acrylic resin, polyethylene, diallyl phthalate, ethylene propylene diene monomer, epoxy resin, phenol resin, polyurethane, melamine resin, polycarbonate, polyvinyl chloride, polyamide, polyimide, styrene butadiene rubber, chloroprene rubber, polypropylene, polybutylene, polystyrene, polyacetic acid Vinyl, nylon, polyester, polybutadiene, polybenzimidazole, polyacrylonitrile, epichlorohydrin, polysulfide, polyisoprene, polyethylene glycol, MPC polymer (trade name) And they comprise a binder resin zwitterionic polymers such like may.
本発明に用いられる刺激応答性層の膜厚としては、刺激応答性を発揮することができるものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、０．５ｎｍ〜 ３００ｎｍの範囲内であることが好ましく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。 The film thickness of the stimulus responsive layer used in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit stimulus responsiveness, and specifically, within a range of 0.5 nm to 300 nm. It is preferable that it is within a range of 1 nm to 100 nm.
本発明に用いられる刺激応答性層の形成方法としては、所望のパターンに形成可能であれば特に限定されるものではない。
具体的には、上記刺激応答性材料を含む刺激応答性材料組成物をスピンコート等の公知の塗布方法を用いて塗布し、フォトリソグラフィー法によりパターニングする方法や、グラビア印刷やフレキソ印刷、スクリーン印刷、インクジェット法などの公知のパターン塗布法を用いて上記刺激応答性材料組成物をパターン状に塗布する方法を挙げることができる。
また、上記刺激応答性層が、刺激応答性材料として光触媒等の無機物のみからなるものである場合には、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。均一な膜厚の層とすることができるからである。
The method for forming the stimulus-responsive layer used in the present invention is not particularly limited as long as it can be formed in a desired pattern.
Specifically, a method of applying a stimulus-responsive material composition containing the stimulus-responsive material using a known coating method such as spin coating, and patterning by a photolithography method, gravure printing, flexographic printing, screen printing And a method of applying the stimuli-responsive material composition in a pattern using a known pattern application method such as an inkjet method.
In addition, when the stimulus-responsive layer is made of only an inorganic substance such as a photocatalyst as the stimulus-responsive material, a method of using a vacuum film-forming method such as a sputtering method, a CVD method, or a vacuum evaporation method can be cited. it can. This is because a layer having a uniform film thickness can be obtained.
２．細胞接着領域
本発明に用いられる細胞接着領域は、上記細胞接着材料を含む細胞接着層の表面のうち、露出した範囲であり、細胞接着性を有し細胞を接着することができるものである。
2. Cell adhesion region The cell adhesion region used in the present invention is an exposed range of the surface of the cell adhesion layer containing the cell adhesion material, and has cell adhesion and can adhere cells.
（１）細胞接着領域
本発明における細胞接着領域は、上記刺激応答性領域との間で接着境界を形成するものである。
(1) Cell adhesion region The cell adhesion region in the present invention forms an adhesion boundary with the stimulation-responsive region.
このような細胞接着領域の細胞の接着度合いとしては、所望の細胞接着性を示すものであれば特に限定されるものではなく、上記刺激応答性領域が細胞接着性を発現している場合の細胞の接着度合いと同様とすることができる。 The degree of cell adhesion in such a cell adhesion region is not particularly limited as long as it exhibits a desired cell adhesion, and the cells when the stimulation-responsive region expresses cell adhesion. The degree of adhesion can be the same.
本発明における細胞接着領域の数、形状、一つあたりの面積としては、刺激応答性領域との間で細胞接着領域が少なくとも１つの接着境界を有し、裏返った細胞シートを安定的に形成できるものであれば良い。 As the number, shape, and area per cell adhesion region in the present invention, the cell adhesion region has at least one adhesion boundary with the stimulus responsive region, so that a reversed cell sheet can be stably formed. Anything is fine.
本発明に用いられる細胞接着領域の種類としては、１種類のみであっても良く、異なる細胞接着材料を含む細胞接着領域を含むものであっても良い。 As a kind of cell adhesion field used for the present invention, only one kind may be sufficient and a cell adhesion field containing a different cell adhesion material may be included.
本発明に用いられる細胞接着領域の上記細胞非接着領域との関係としては、上記細胞非接着領域と接していても良く、接していない状態であっても良い。目的とする細胞シートのパターンに応じて適宜設定されるものである。 The relationship between the cell adhesion region and the cell non-adhesion region used in the present invention may be in contact with the cell non-adhesion region or may be in a non-contact state. It is appropriately set according to the target cell sheet pattern.
本発明に用いられる細胞接着領域の上記細胞非接着領域に対する高さとしては、安定的に細胞シートを裏返すことができるものであれば特に限定されるものではなく、既に説明した図２に示すように、上記細胞非接着領域より低いものであっても良く、図１７に例示するように、上記細胞非接着領域より高いものであっても良い。
なお、図１７中の符号については、図２のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
The height of the cell adhesion region used in the present invention relative to the cell non-adhesion region is not particularly limited as long as the cell sheet can be stably turned over, as shown in FIG. In addition, it may be lower than the cell non-adhering region, or may be higher than the cell non-adhering region as illustrated in FIG.
In addition, about the code | symbol in FIG. 17, since it shows the same member as the thing of FIG. 2, description here is abbreviate | omitted.
（２）細胞接着層
本発明に用いられる細胞接着層としては、上記細胞接着材料を含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば生物化学的特性により細胞接着性を有するものであってもよく、また物理化学的特性により細胞接着性を有するもの等であってもよい。
このような細胞接着材料としては、一般的な細胞培養基板等に用いられる細胞接着材料を用いることができ、例えば物理化学的特性により細胞と接着する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。
また、生物化学的に細胞と接着性を有する材料としては、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、およびこれらの混合物、例えばマトリゲル等が挙げられる。
また、各種ガラス、プラズマ処理を施したポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。
(2) Cell adhesion layer The cell adhesion layer used in the present invention is not particularly limited as long as it contains the above cell adhesion material. For example, it has cell adhesion due to biochemical characteristics. Moreover, what has cell adhesiveness by a physicochemical characteristic etc. may be sufficient.
As such a cell adhesion material, a cell adhesion material used for a general cell culture substrate or the like can be used. For example, as a material that adheres to a cell due to physicochemical characteristics, for example, hydrophilic polystyrene, polylysine, etc. Examples include basic compounds such as basic polymers, aminopropyltriethoxysilane, and N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane, and condensates containing them.
In addition, as materials having biochemical adhesion to cells, fibronectin, laminin, tenascin, vitronectin, RGD (arginine-glycine-aspartic acid) sequence-containing peptide, YIGSR (tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine) sequence Examples thereof include peptides containing peptide, collagen, atelocollagen, gelatin, and mixtures thereof such as matrigel.
Moreover, various glass, polystyrene which gave plasma treatment, polypropylene, etc. are mentioned.
本発明に用いられる細胞接着層が含有可能な添加剤やバインダー樹脂、ならびに膜厚および形成方法としては、上記「１．刺激応答性領域」の項に記載の内容と同様とすることができる。 The additive, binder resin, film thickness, and formation method that can be contained in the cell adhesion layer used in the present invention can be the same as those described in the above section “1. Stimulus responsive region”.
本発明に用いられる細胞接着材料の上記細胞接着層中の含有量としては、所望の細胞接着性を発揮できるものであれば特に限定されるものではなく、上記材料の種類等によって異なるものである。 The content of the cell adhesion material used in the present invention in the cell adhesion layer is not particularly limited as long as the desired cell adhesion can be exhibited, and varies depending on the type of the material. .
３．細胞非接着領域
本発明に用いられる細胞非接着領域は、上記細胞非接着材料を含む細胞非接着層の表面のうち、露出した範囲であり、細胞非接着性を有するものである。
3. Cell non-adhesion region The cell non-adhesion region used in the present invention is an exposed range of the surface of the cell non-adhesion layer containing the cell non-adhesion material, and has cell non-adhesion.
（１）細胞非接着領域
本発明に用いられる細胞非接着領域は、少なくとも上記刺激応答性領域の周囲に配置されるものである。
(1) Cell non-adhesion region The cell non-adhesion region used in the present invention is disposed at least around the stimulation-responsive region.
このような細胞非接着領域の細胞の接着度合いとしては、所望の細胞非接着性を示すものであれば特に限定されるものではなく、上記刺激応答性領域が細胞非接着性を発現している場合の細胞の接着度合いと同様とすることができる。 The degree of cell adhesion in such a cell non-adhesive region is not particularly limited as long as it exhibits the desired cell non-adhesive property, and the stimulus-responsive region expresses cell non-adhesive property. It can be the same as the degree of cell adhesion in the case.
本発明における細胞非接着領域の数、形状、一つあたりの面積としては、刺激応答性領域との間で細胞接着領域が少なくとも１つの接着境界を有し、裏返った細胞シートを安定的に形成できるものであれば良い。 As the number, shape, and area per cell non-adhesion region in the present invention, the cell adhesion region has at least one adhesion boundary with the stimulus-responsive region, and a cell sheet that is turned over is stably formed. Anything is possible.
本発明に用いられる細胞非接着領域の種類としては、１種類のみであっても良く、異なる細胞非接着材料を含む複数の細胞非接着領域を含むものであっても良い。 As a kind of cell non-adhesion field used for the present invention, only one kind may be sufficient and a plurality of cell non-adhesion fields containing different cell non-adhesion materials may be included.
本発明に用いられる細胞非接着領域の上記非接着境界からの幅としては、上記刺激応答性領域の形状に細胞を接着させ培養することができるものであれば良く、例えば、５μｍ以上であることが好ましく、なかでも、１０μｍ以上であることが好ましい。上記幅が上述の範囲であることにより、上記細胞非接着領域上に細胞が増殖することを安定的に抑制することができるからである。 The width of the cell non-adhesion region used in the present invention from the non-adhesion boundary may be any width that allows cells to adhere to the shape of the stimulus-responsive region and can be cultured, for example, 5 μm or more. In particular, the thickness is preferably 10 μm or more. This is because, when the width is in the above-described range, it is possible to stably suppress cell growth on the cell non-adhesion region.
（２）細胞非接着層
本発明に用いられる細胞非接着層は、細胞非接着材料を含むものである。
このような細胞非接着材料としては、細胞と非接着性を有するものであれば良く、例えば水和能の高い材料を用いることができる。水和能の高い材料を細胞非接着材料として用いた場合には、細胞非接着材料の周りに水分子が集まった水和層が形成される。通常、このような水和能の高い物質は水分子との親和性の方が細胞との親和性より高いことから、細胞は上記水和能の高い材料と接着することができず、細胞との接着性が低いものとなるのである。ここで、上記水和能とは、水分子と水和する性質をいい、水和能が高いとは、水分子と水和しやすいことをいうこととする。
本発明において水和能が高く細胞非接着材料として用いられる材料としては、例えばポリエチレングリコールや、ベタイン構造等を有する両性イオン材料、リン脂質含有材料等が挙げられる。
(2) Cell non-adhesion layer The cell non-adhesion layer used in the present invention contains a cell non-adhesion material.
As such a non-cell-adhesive material, any material that has non-adhesiveness with cells can be used. When a material having a high hydration ability is used as the cell non-adhesive material, a hydrated layer in which water molecules gather around the cell non-adhesive material is formed. Usually, such a highly hydratable substance has a higher affinity for water molecules than for cells, so that the cell cannot adhere to the above hydratable material. This results in low adhesion. Here, the hydration ability means the property of hydrating with water molecules, and the high hydration ability means that it easily hydrates with water molecules.
Examples of the material having high hydration ability and used as a cell non-adhesive material in the present invention include polyethylene glycol, a zwitterionic material having a betaine structure and the like, and a phospholipid-containing material.
また、上記細胞非接着材料として、撥水性または撥油性を有する材料や、超親水性を有する材料も用いることができる。具体的には、ポリエチレングルコールジアクリレート、ポリエチレングルコールメタクリレート等を用いたエチレングリコール系材料、リン脂質ポリマー、長鎖アルキル系材料、フッ素系材料、シリコンなどの撥水性材料、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの親水性材料等が挙げられる。 Further, as the cell non-adhesive material, a material having water repellency or oil repellency or a material having super hydrophilicity can also be used. Specifically, ethylene glycol materials using polyethylene glycol diacrylate, polyethylene glycol methacrylate, etc., phospholipid polymers, long chain alkyl materials, fluorine materials, water repellent materials such as silicon, polyvinyl alcohol (PVA) And other hydrophilic materials.
本発明に用いられる細胞非接着層が含有可能な添加剤やバインダー樹脂、ならびに膜厚および形成方法としては、上記「１．刺激応答性領域」の項に記載の内容と同様とすることができる。 The additive and binder resin that can be contained in the cell non-adhesive layer used in the present invention, the film thickness, and the formation method can be the same as those described in the above section “1. Stimulus responsive region”. .
本発明に用いられる細胞非接着材料の上記細胞非接着材料層中の含有量としては、所望の細胞非接着性を発揮できるものであれば特に限定されるものではなく、上記材料の種類等によって異なるものである。 The content of the cell non-adhesive material used in the present invention in the cell non-adhesive material layer is not particularly limited as long as the desired cell non-adhesiveness can be exhibited. Is different.
４．細胞培養用基材
本発明の細胞培養用基材は、少なくとも、上記刺激応答性領域、細胞接着領域、および細胞非接着領域を含むものである。
本発明においては、既に説明した図２に示すように、上記刺激応答性領域、細胞接着領域、および細胞非接着領域を構成する刺激応答性層、細胞接着層および細胞非接着層を支持する基材を含むものであっても良い。
4). Cell culture substrate The cell culture substrate of the present invention includes at least the stimulation-responsive region, the cell adhesion region, and the cell non-adhesion region.
In the present invention, as shown in FIG. 2 which has already been described, the stimulus-responsive layer, the cell adhesion region, and the cell non-adhesion layer constituting the stimulus responsive region, the cell adhesion region, and the cell non-adhesion region are supported. A material may be included.
このような基材としては、上記刺激応答性層、細胞接着層および細胞非接着層等を支持することができるものであれば特に限定されるものではない。
本発明において上記基材の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等が挙げられる。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、もしくはその共重合体のような生分解性ポリマーであってもよい。また、ガラスを用いることもできる。
本発明においては、なかでも、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリカーボネートを好ましく用いることができ、特に、ポリエチレンテレフタレートを好ましく用いることができる。透明性、寸法安定性、機械的性質、電気的性質、耐薬品性等の性質に優れているからである。
Such a substrate is not particularly limited as long as it can support the stimulus-responsive layer, the cell adhesion layer, the cell non-adhesion layer, and the like.
In the present invention, the material of the substrate is polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), TAC (triacetyl cellulose), polyimide (PI), nylon (Ny), low density polyethylene (LDPE). , Medium density polyethylene (MDPE), vinyl chloride, vinylidene chloride, polyphenylene sulfide, polyethersulfone, polyethylene naphthalate, polypropylene, acrylic and the like. It may be a biodegradable polymer such as polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactan, or a copolymer thereof. Glass can also be used.
In the present invention, among these, polyethylene terephthalate, polystyrene, and polycarbonate can be preferably used, and polyethylene terephthalate can be particularly preferably used. This is because it excels in properties such as transparency, dimensional stability, mechanical properties, electrical properties, and chemical resistance.
本発明における基材の厚さとしては、上記刺激応答性層等を安定的に支持することができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、１０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上である。 The thickness of the base material in the present invention is not particularly limited as long as it can stably support the stimulus-responsive layer and the like. For example, the thickness is 10 μm or more, preferably 50 μm or more. .
また、図１８（ａ）および（ｂ）に例示するように、上記刺激応答性層１が、上記細胞接着層２および細胞非接着層３を支持する基材として用いられるように、上記刺激応答性層、細胞接着層および細胞非接着層のいずれかを、他の層を支持する基材とするものであっても良い。
なお、図１８中の符号については、図２のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
Further, as illustrated in FIGS. 18A and 18B, the stimulation response so that the stimulation responsive layer 1 is used as a base material that supports the cell adhesion layer 2 and the cell non-adhesion layer 3. Any of the sex layer, the cell adhesion layer, and the cell non-adhesion layer may be used as a base material for supporting other layers.
In addition, about the code | symbol in FIG. 18, since it shows the same member as the thing of FIG. 2, description here is abbreviate | omitted.
さらに、必要に応じて、露出表面を有さない他の層や、他の領域となる露出表面を有する他の層を含むものであっても良い。 Furthermore, if necessary, another layer having no exposed surface or another layer having an exposed surface serving as another region may be included.
本発明の細胞培養用基材の製造方法としては、上記刺激応答性領域等を安定的に形成できる方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、上記基材上に、上記刺激応答性層、細胞接着層および細胞非接着層をこの順で形成する方法を挙げることができる。 The method for producing the substrate for cell culture of the present invention is not particularly limited as long as it can stably form the stimulus-responsive region and the like. For example, the stimulus-responsive property is formed on the substrate. The method of forming a layer, a cell adhesion layer, and a cell non-adhesion layer in this order can be mentioned.
本発明の細胞培養用基材の用途としては、細胞の裏面を評価するために種々の細胞からなる細胞シートが形成された細胞付基板に用いることができる。 As a use of the cell culture substrate of the present invention, it can be used for a cell-attached substrate on which a cell sheet composed of various cells is formed in order to evaluate the back surface of the cell.
Ｂ．細胞付基板
次に、本発明の細胞付基板について説明する。
本発明の細胞付基板は、上述の細胞培養用基材と、上記細胞培養用基材の上記細胞接着領域および上記刺激応答性領域上に接着した細胞からなる細胞シートと、を有することを特徴とするものである。
B. Next, the substrate with cells of the present invention will be described.
The cell-attached substrate of the present invention includes the cell culture substrate described above, and a cell sheet composed of cells adhered on the cell adhesion region and the stimulus-responsive region of the cell culture substrate. It is what.
このような細胞付基板を図を参照して説明する。既に説明した図３（ｂ）に例示するように、本発明の細胞付基板２０は、上記細胞培養用基材１０と、上記細胞培養用基材１０の上記細胞接着領域および上記刺激応答性領域上に接着した細胞からなる細胞シート２１とを有するものである。 Such a cell-attached substrate will be described with reference to the drawings. As illustrated in FIG. 3B described above, the cell-attached substrate 20 of the present invention includes the cell culture substrate 10, the cell adhesion region and the stimulus responsive region of the cell culture substrate 10. It has a cell sheet 21 made of cells adhered on top.
本発明によれば、上記細胞培養用基材上に上記細胞シートが接着していることにより、一部が裏返った上記細胞シートを容易に形成でき、上記細胞シートの接着側表面（裏面）を容易に観察することができる。したがって、細胞の裏面でしか発現していないタンパク質等の評価を容易に行うことができる。 According to the present invention, since the cell sheet is adhered onto the cell culture substrate, the cell sheet partially turned over can be easily formed, and the adhesion side surface (back surface) of the cell sheet is formed. It can be easily observed. Therefore, it is possible to easily evaluate proteins and the like that are expressed only on the back surface of the cell.
本発明の細胞付基板は、上述の細胞培養用基材および細胞シートを少なくとも含むものである。
以下、本発明の細胞付基板の各構成について説明する。
なお、上記細胞培養用基材については、上記「Ａ．細胞培養用基材」の項に記載の内容と同様であるので、ここでの説明は省略する。
The cell-attached substrate of the present invention includes at least the above-described cell culture substrate and cell sheet.
Hereafter, each structure of the board | substrate with a cell of this invention is demonstrated.
The cell culture substrate is the same as that described in the section “A. Cell Culture Substrate”, and will not be described here.
１．細胞シート
本発明に用いられる細胞シートは、上記細胞からなるものであり、細胞間結合で上記細胞同士が少なくとも単層で結合され、シート状のものである。
このような細胞シートを構成する細胞としては、血球系等の非接着性細胞、細胞間結合の弱い細胞以外なら、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞を用いることができる。
具体的には、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等を用いることができる。
また上記細胞は、１種類のみであっても良く、２種類以上用いるものであっても良い。
1. Cell Sheet The cell sheet used in the present invention is composed of the above-mentioned cells, and the above-mentioned cells are bound at least in a single layer by intercellular bonding, and is in the form of a sheet.
As a cell constituting such a cell sheet, any tissue existing in a living body and cells derived therefrom can be used as long as it is other than a non-adherent cell such as a blood cell line or a cell having a weak intercellular bond.
Specifically, epithelial cells and endothelial cells that constitute each tissue and organ in the living body, skeletal muscle cells that exhibit contractility, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neurons that constitute the nervous system, glial cells, fibroblasts, As hepatocytes, non-hepatocytes and adipocytes related to metabolism in the living body, cells having differentiation ability, stem cells existing in various tissues, bone marrow cells, ES cells and the like can be used.
Moreover, the said cell may be only 1 type and may use 2 or more types.
２．細胞付基板
本発明の細胞付基板は、上記細胞培養用基材および細胞シートを少なくとも有するものであるが、必要に応じて、他の部材を有するものであっても良い。
2. Cell-attached substrate The cell-attached substrate of the present invention has at least the cell culture substrate and cell sheet, but may have other members as necessary.
本発明の細胞付基板の製造方法としては、上記細胞培養用基材上に上記細胞シートが接着しているものとすることができる方法であれば特に限定されるものではなく、例えば、他の培養基材上で培養し、そこから剥離した細胞シートを上記細胞培養用基材上に接着させる方法等を挙げることができるが、なかでも、上記細胞培養用基材上に上記細胞シートを形成可能な細胞を播種・培養する方法であることが好ましい。上記細胞シートを上記刺激応答性領域および細胞接着領域上に精度良く接着したものとすることができるからである。 The method for producing a substrate with cells of the present invention is not particularly limited as long as it is a method that allows the cell sheet to adhere to the cell culture substrate. Examples thereof include a method of culturing on a culture substrate and adhering the cell sheet peeled from the cell culture substrate to the cell culture substrate. Among them, the cell sheet is formed on the cell culture substrate. A method of seeding and culturing possible cells is preferable. This is because the cell sheet can be adhered to the stimulus-responsive region and the cell adhesion region with high accuracy.
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。 The present invention is not limited to the above embodiment. The above-described embodiment is an exemplification, and the present invention has substantially the same configuration as the technical idea described in the claims of the present invention, and any device that exhibits the same function and effect is the present invention. It is included in the technical scope of the invention.
以下、本発明について実施例および比較例を用いて具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described using examples and comparative examples.
［実施例１］
（１）温度応答性フィルムの作製
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、最終濃度２０重量％になるようにイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解させた。市販の易接着性ポリエチレンテレフタレートフィルム（三光産業社より入手、透明５０−Ｆセパ１０９０）（以下において「易接着ＰＥＴ」と略することがある）を調達し、これを１０ｃｍ角に切断した。ここに上記溶液を、易接着ＰＥＴの易接着面に展開し、ミヤバーでコーティングした。電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて該サンプル上に電子線照射を行い、該溶液をグラフト重合した。このときの電子線照射線量は３００ｋＧｙであった。
[Example 1]
(1) Production of temperature-responsive film N-isopropylacrylamide was dissolved in isopropyl alcohol (IPA) so as to have a final concentration of 20% by weight. A commercially available easy-adhesive polyethylene terephthalate film (obtained from Sanko Sangyo Co., Ltd., transparent 50-F Sepa 1090) (hereinafter sometimes abbreviated as “easily-adhesive PET”) was procured and cut into 10 cm squares. The above solution was spread on the easy-adhesion surface of easy-adhesion PET and coated with a Miya bar. The sample was irradiated with an electron beam using an electron beam irradiation apparatus (manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.), and the solution was graft polymerized. The electron beam irradiation dose at this time was 300 kGy.
（２）細胞培養用基材の作製
６０ｍｍφポリスチレンディッシュの全面に、上記温度応答性フィルムを切り抜いて貼り付けた。続いて、接着面にグリースを塗った３５ｍｍφシリコンリングを上記温度応答性フィルム上に貼り付け、EOG滅菌をした。
次いで、上記シリコンリング内側の温度応答性領域の半分にマトリゲル(BD Biosciences製 Growth Factor Reduced BD MatrigelTM Matrix)を塗り、インキュベーター内で３時間放置した。
このようにして、図１９に示すように、刺激応答性領域１１として上記温度応答性フィルム表面、細胞非接着領域１３としてシリコンリング表面および細胞接着領域１２としてマトリゲル表面を有する細胞培養用基材を作製した。
また、上記非接着境界は、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状に形成された。また、この場合の、上記非接着境界の曲率は、５．７ｍ−１であった。
(2) Production of Cell Culture Substrate The temperature-responsive film was cut out and pasted on the entire surface of a 60 mmφ polystyrene dish. Subsequently, a 35 mmφ silicon ring with the adhesive surface coated with grease was attached onto the temperature-responsive film and EOG sterilized.
Next, Matrigel (Growth Factor Reduced BD Matrigel ™ Matrix manufactured by BD Biosciences) was applied to half of the temperature-responsive region inside the silicon ring, and left in an incubator for 3 hours.
In this way, as shown in FIG. 19, the substrate for cell culture having the temperature-responsive film surface as the stimulus-responsive region 11, the silicon ring surface as the cell non-adhesive region 13, and the matrigel surface as the cell-adhesive region 12 is obtained. Produced.
The non-adhesion boundary was formed in a convex arc shape with respect to the cell adhesion region. In this case, the curvature of the non-adhesion boundary was 5.7 m −1 .
［実施例２］
マトリゲルを、図２０に示すように、上記温度応答性領域１１上に、上記細胞接着領域１２の凸部の幅ｓと、上記刺激応答性領域１１の幅ｔとがｓ＝１/３ｔとなるように塗った以外は、実施例１と同様にして細胞培養用基材を作製した。
なお、上記非接着境界は、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状に形成された。また、この場合の、上記非接着境界の曲率は、５．７ｍ−１であった。
[Example 2]
As shown in FIG. 20, the width s of the convex portion of the cell adhesion region 12 and the width t of the stimulus responsive region 11 are set to s = 1 / 3t on the temperature responsive region 11. A cell culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1 except that the coating was performed as described above.
The non-adhesion boundary was formed in a convex arc shape with respect to the cell adhesion region. In this case, the curvature of the non-adhesion boundary was 5.7 m −1 .
［実施例３］
マトリゲルを、図２１に示すように、上記温度応答性領域１１上に、上記細胞接着領域１２の凸部の幅ｓと、上記刺激応答性領域１１の幅ｔとがＳ＝１/２ｔとなるように塗った以外は、実施例１と同様にして細胞培養用基材を作製した。
なお、上記非接着境界は、上記細胞接着領域に対して凸状の円弧状に形成された。また、この場合の、上記非接着境界の曲率は、５．７ｍ−１であった。
[Example 3]
As shown in FIG. 21, the width s of the convex portion of the cell adhesion region 12 and the width t of the stimulus responsive region 11 are S = 1 / 2t on the temperature responsive region 11. A cell culture substrate was prepared in the same manner as in Example 1 except that the coating was performed as described above.
The non-adhesion boundary was formed in a convex arc shape with respect to the cell adhesion region. In this case, the curvature of the non-adhesion boundary was 5.7 m −1 .
［評価］
（１）細胞培養
上記細胞培養用基材上に、ウシ血管内皮細胞(P20)を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、６日間培養し、上記細胞接着領域および刺激応答性領域に接着した細胞シートを形成した。
[Evaluation]
(1) Cell culture Bovine vascular endothelial cells (P20) are seeded at a density of 1 × 10 5 cells / cm 2 on the cell culture substrate and cultured for 6 days. The cell adhesion region and the stimulus-responsive region A cell sheet adhered to was formed.
（２）裏面観察
上記細胞シートを形成後、２０℃インキュベーター内で１時間放置（刺激付与）し、上記細胞シートを観察した。顕微鏡観察結果を図１９〜図２１に示す。
その結果、円形の細胞シートのうち、温度応答性領域にあった細胞シートが基材底面から剥離し、自発的に裏返って細胞シート裏面が表に現れた。
また、実施例１〜３を比較すると、実施例１では上記細胞シートが接着境界付近（顕微鏡観察視野内）で折り重なった箇所が観察された。実施例２と実施例３では、安定した細胞シート裏面観察が可能であったが、実施例３の方が接着境界から長い幅で細胞シート裏面が観察できる点で、より裏面観察に適した構成であった。
(2) Backside observation After forming the cell sheet, the cell sheet was observed by leaving it in a 20 ° C incubator for 1 hour (stimulated). The microscope observation results are shown in FIGS.
As a result, among the circular cell sheets, the cell sheet that was in the temperature-responsive region was peeled off from the bottom surface of the base material and turned over spontaneously, and the back surface of the cell sheet appeared on the table.
Moreover, when Examples 1-3 were compared, in Example 1, the location where the said cell sheet folded up in the adhesion boundary vicinity (within a microscope observation visual field) was observed. In Example 2 and Example 3, stable cell sheet back surface observation was possible. However, Example 3 is more suitable for back surface observation in that the cell sheet back surface can be observed with a longer width from the adhesion boundary. Met.
１ … 刺激応答性層
２ … 細胞接着層
３ … 細胞非接着層
４ … 基材
１０ … 細胞培養用基材
１１ … 刺激応答性領域
１２ … 細胞接着領域
１３ … 細胞非接着領域
２０ … 細胞付基板
２１ … 細胞シート
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Stimulus response layer 2 ... Cell adhesion layer 3 ... Cell non-adhesion layer 4 ... Base material 10 ... Cell culture substrate 11 ... Stimulation response region 12 ... Cell adhesion region 13 ... Cell non-adhesion region 20 ... Substrate with cell 21 ... Cell sheet
Claims (7)
細胞接着性を有する細胞接着領域と、
細胞非接着性を有する細胞非接着領域と、
を有し、
前記刺激応答性領域および前記細胞接着領域の境界部分である接着境界を有し、
前記刺激応答性領域の外周の少なくとも一部に、前記刺激応答性領域および前記細胞非接着領域の境界部分である非接着境界を有することを特徴とする細胞培養用基材。 A stimulus-responsive region in which the degree of cell adhesion changes by stimulation;
A cell adhesion region having cell adhesion,
A cell non-adhesion region having cell non-adhesion;
Have
Having an adhesion boundary that is a boundary portion between the stimulus-responsive area and the cell adhesion area;
A cell culture substrate having a non-adhesive boundary that is a boundary portion between the stimulus-responsive region and the cell non-adhesive region at least at a part of the outer periphery of the stimulus-responsive region.
前記刺激応答性領域の幅ｔおよび前記細胞接着領域の凸部の幅ｓが、ｓ≧１／３ｔを満たすことを特徴とする請求項３に記載の細胞培養用基材。 The shape of the adhesive interface is the the arcuate convex against the cell adhesion region,
The cell culture substrate according to claim 3, wherein a width t of the stimulus-responsive region and a width s of a convex portion of the cell adhesion region satisfy s ≧ 1 / 3t .
前記細胞培養用基材の前記細胞接着領域および前記刺激応答性領域上に接着した細胞からなる細胞シートと、
を有することを特徴とする細胞付基板。 A cell culture substrate according to any one of claims 1 to 6 ,
A cell sheet comprising cells adhered to the cell adhesion region and the stimulus-responsive region of the cell culture substrate;
A substrate with cells, characterized by comprising:
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