JP5806168B2 - New screening method for anti-invasive drugs - Google Patents
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Description
本発明は、がん治療および抗がん剤開発分野における抗浸潤作用を有する物質のスクリーニング法ならびに該スクリーニング法により得られる抗浸潤剤に関する。 The present invention relates to a method for screening a substance having an anti-invasive action in the fields of cancer therapy and anti-cancer drug development, and an anti-invasive agent obtained by the screening method.
がん細胞が正常組織へ浸潤、転移する際には、細胞はその進行方向にラッフル膜を形成し、細胞膜の進展を伴いながら、糸状仮足や葉状仮足を形成し、それを足場に活発に動くことが知られている。 When cancer cells invade and metastasize into normal tissues, the cells form a raffle membrane in the direction of progression, and while the cell membrane progresses, they form filamentous and lamellipodia, and use it as a scaffold It is known to move.
これまでに、がんの浸潤および/または転移のリスクを予想する方法として、特定の核酸またはポリペプチドのマーカーの同定が盛んに試みられており、たとえば、口腔がんの浸潤を予測するマーカーとして、浸潤能の高い細胞において高い発現を示す遺伝子が検討されている(特許文献1)。この診断マーカーは、口腔がん患者より樹立した培養細胞株から、インビトロ浸潤アッセイを用いて浸潤能の高い細胞を分離し、浸潤能の高い細胞において高い発現を示す遺伝子である、IFITM1およびWNT5Bを同定して得られている。 In the past, as a method for predicting the risk of cancer invasion and / or metastasis, identification of a specific nucleic acid or polypeptide marker has been actively attempted, for example, as a marker for predicting oral cancer invasion. A gene that exhibits high expression in cells with high invasive ability has been studied (Patent Document 1). This diagnostic marker isolates cells with high invasive ability from cultured cell lines established from oral cancer patients using an in vitro invasion assay, and is a gene showing high expression in cells with high invasive ability, IFITM1 and WNT5B. It is obtained by identification.
また、抗浸潤薬としては、すでに様々な化合物が報告されている。たとえば、3−シアノ−キノリン誘導体が非受容体型チロシンキナーゼの阻害薬として、またダイナミン機能阻害剤としての低分子化合物や、MAPKキナーゼ経路の阻害または非受容体チロシンキナーゼ阻害剤としてキナゾリン誘導体が記載されている(特許文献2〜4)。 Various compounds have already been reported as anti-invasive agents. For example, 3-cyano-quinoline derivatives are described as low-receptor tyrosine kinase inhibitors, low-molecular compounds as dynamin function inhibitors, and quinazoline derivatives as MAPK kinase pathway inhibitors or non-receptor tyrosine kinase inhibitors. (Patent Documents 2 to 4).
一方、前述のラッフル膜形成や仮足形成は、アクチンと呼ばれるタンパク質が重合した線維を中心とした細胞骨格に裏打ちされている。すなわち、アクチンの線維形成が細胞浸潤の際の最も重要な因子の1つであることも知られている(特許文献5)。 On the other hand, the above-mentioned raffle film formation and pseudopodia formation are backed by a cytoskeleton centered on fibers in which a protein called actin is polymerized. That is, it is also known that actin fibril formation is one of the most important factors during cell infiltration (Patent Document 5).
しかしながら、これらアクチン線維形成に関与するタンパク質や因子は数多く存在するため、それぞれのタンパク質の阻害剤を用いても、アクチン重合が効率よく阻害されないことが多く、アクチンの重合を抑制する薬剤を直接スクリーニングすることはこれまでのところ報告されていない。 However, since there are many proteins and factors involved in the formation of these actin fibrils, actin polymerization is often not efficiently inhibited even when inhibitors of each protein are used, and drugs that suppress actin polymerization are directly screened. To do so far has not been reported.
他方、本発明者らは、インビトロにおいてアクチン線維を形成させる系やその形成度合いの評価について一定の方法を確立することに成功しており、この系により既知のダイナミン阻害剤やアクチン阻害剤のアクチン重合に対する関与を確認している(非特許文献1および2)。 On the other hand, the present inventors have succeeded in establishing a certain method for evaluating the formation of actin fibrils in vitro and the degree of formation thereof. By this system, actin, a known dynamin inhibitor and actin inhibitor Participation in polymerization has been confirmed (Non-Patent Documents 1 and 2).
本発明は、候補物質から迅速にかつ効率的に抗浸潤作用を有する物質を同定することができるスクリーニング法ならびに該スクリーニング法により得られる抗浸潤剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a screening method capable of quickly and efficiently identifying a substance having an anti-invasive action from candidate substances, and an anti-invasive agent obtained by the screening method.
本発明者らは、試験管内においてアクチン線維を形成させる技術をこれまでに確立しているが、驚くべきことに、この技術を用いて定量化したアクチン形成率を用いることにより、候補物質の中から抗浸潤作用を有する物質をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。つまり、本発明の方法により得られるアクチン線維形成率は、細胞における抗浸潤作用と優れた相関を示すものである。一般に、前述のとおり生体におけるアクチン線維形成は多数の因子が関与する機序によるため、このようなインビトロのシンプルな系におけるアクチン線維形成阻害作用を指標とすることにより、多数の候補物質の抗浸潤作用を迅速に評価できたということは、非常に驚くべきことである。 The present inventors have established a technique for forming actin fibrils in vitro. Surprisingly, by using the actin formation rate quantified using this technique, the candidate substances can be selected. From these results, it was found that a substance having an anti-invasive action could be screened, and the present invention was completed. That is, the actin fiber formation rate obtained by the method of the present invention shows an excellent correlation with the anti-invasion action in cells. In general, since actin fibril formation in a living body is based on a mechanism involving many factors as described above, anti-invasion of a large number of candidate substances can be achieved by using the actin fibril formation inhibitory action in such a simple system in vitro as an index. It was very surprising that the action could be evaluated quickly.
すなわち、本発明は、抗浸潤作用を有する物質を同定するための方法であって、
(a)標識化アクチンを含み、候補物質を含むかまたは含まない各細胞質懸濁液を提供する工程、
(b)該細胞質懸濁液に、負電荷を有するリン脂質を含むリポソームを添加し、アクチン線維形成を刺激する工程、
(c)アクチン線維形成度を測定する工程、
(d)候補物質の非存在下におけるアクチン線維形成度(A)に対する、候補物質の存在下におけるアクチン線維形成度(B)の割合をアクチン線維形成率として得る工程、および
(e)アクチン線維形成率の値を指標として候補物質の抗浸潤作用を評価する工程
を含む方法に関する。
That is, the present invention is a method for identifying a substance having an anti-invasive action,
(A) providing each cytoplasmic suspension comprising labeled actin and with or without a candidate substance;
(B) adding a liposome containing a negatively charged phospholipid to the cytoplasmic suspension to stimulate actin fibril formation;
(C) measuring the degree of actin fibril formation,
(D) obtaining a ratio of the degree of actin fiber formation (B) in the presence of the candidate substance to the degree of actin fiber formation (A) in the absence of the candidate substance as an actin fiber formation rate; and (e) actin fiber formation. The present invention relates to a method including a step of evaluating an anti-invasive action of a candidate substance using a rate value as an index.
本発明の方法においては、(a)工程にさらにATPおよびATP再生系を含有させることが好ましい。 In the method of the present invention, it is preferable to further include ATP and an ATP regeneration system in the step (a).
本発明の方法においては、標識化アクチンがピレンアクチンであることが好ましい。 In the method of the present invention, the labeled actin is preferably pyrene actin.
本発明の方法においては、細胞質懸濁液は、脳細胞、肝細胞または精巣細胞から調製されることが好ましい。 In the method of the present invention, the cytoplasmic suspension is preferably prepared from brain cells, hepatocytes or testis cells.
本発明の方法においては、抗浸潤作用が、ラッフル膜形成阻害作用、細胞遊走阻害作用および/または細胞浸潤阻害作用であることが好ましい。 In the method of the present invention, the anti-invasive action is preferably a raffle film formation inhibitory action, a cell migration inhibitory action and / or a cell infiltration inhibitory action.
本発明はまた、N’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジドを含む抗浸潤剤に関する。 The present invention also relates to an anti-invasive agent comprising N '-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2-hydroxybenzohydrazide.
本発明の好ましい態様において、抗浸潤剤は、抗腫瘍剤、がん細胞の遊走阻害薬、がん細胞の浸潤阻害薬、抗転移薬、免疫抑制剤である。 In a preferred embodiment of the present invention, the anti-invasive agent is an antitumor agent, a cancer cell migration inhibitor, a cancer cell infiltration inhibitor, an anti-metastatic agent, or an immunosuppressant.
本発明の方法によれば、多数の候補物質の抗浸潤作用を迅速かつ効果的にスクリーニングすることができ、たとえばプレートリーダーによるハイスループット化も可能である。実際に本発明者らは、分子ライブラリーよりランダムに抽出した150種類以上の化合物のスクリーニングを行い、本発明のスクリーニング方法の有効性を確認している。 According to the method of the present invention, the anti-invasive action of a large number of candidate substances can be screened quickly and effectively, and for example, high throughput can be achieved with a plate reader. In fact, the present inventors screened 150 or more compounds randomly extracted from a molecular library, and confirmed the effectiveness of the screening method of the present invention.
本発明のスクリーニング方法により発見されたN’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジドは、ラッフル膜の形成を有効に阻害し、がん細胞の遊走も阻害するという抗浸潤作用を示すことが確認され、医薬組成物、たとえば抗浸潤剤、抗腫瘍剤、がん細胞の遊走阻害薬、抗転移薬、免疫抑制剤として使用することが可能である。 N ′-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2-hydroxybenzohydrazide discovered by the screening method of the present invention effectively inhibits the formation of a raffle film and also inhibits the migration of cancer cells. It has been confirmed to show invasive action, and can be used as a pharmaceutical composition, for example, an anti-invasive agent, an antitumor agent, a cancer cell migration inhibitor, an anti-metastatic agent, or an immunosuppressant.
本発明において、「抗浸潤作用」とは、がん細胞が周囲の組織に入り込んで増殖する浸潤の過程を抑制する作用を意味する。浸潤がおこると、がん細胞が血液中に入り、血行性に他の臓器や組織に入り込み転移するということになる。たとえば、浸潤の過程には細胞内でのアクチン線維の形成が必須であることから、アクチン線維形成が効率的に抑制できれば、がん細胞は他の組織に入っていくことができず、一ヵ所にとどまることになり、転移を抑制することができる。 In the present invention, the “anti-invasive action” means an action that suppresses an invasion process in which cancer cells enter the surrounding tissue and proliferate. When invasion occurs, cancer cells enter the blood and enter the other organs and tissues in a hematogenous manner and metastasize. For example, since the formation of actin fibrils in cells is essential for the invasion process, if actin fibril formation can be efficiently suppressed, cancer cells cannot enter other tissues, and one place Therefore, metastasis can be suppressed.
本明細書において、「アクチン線維形成」という用語は、単量体のGアクチンとGアクチンとが重合して線維状のアクチン(F−アクチンとも言う)になることを意味し、アクチン重合、F−アクチン形成などとも同じ意味として使用される。 In the present specification, the term “actin fibril formation” means that monomeric G actin and G actin polymerize to form fibrous actin (also referred to as F-actin). -Synonymous with actin formation.
本発明における「候補物質」とは、水溶液に可溶、もしくは分散可能であれば、分子量、化合物の組成は問わないものである。たとえば、低分子有機化合物、高分子有機化合物、天然有機化合物、生薬などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The “candidate substance” in the present invention is not particularly limited in terms of molecular weight and compound composition as long as it is soluble or dispersible in an aqueous solution. Examples include, but are not limited to, low molecular organic compounds, high molecular organic compounds, natural organic compounds, and crude drugs.
本発明のスクリーニング方法は、抗浸潤作用を有する物質を同定するための方法であって、(a)標識化アクチンを含み、候補物質を含むかまたは含まない細胞質懸濁液を提供する工程、(b)該細胞質懸濁液に、負電荷を有するリン脂質を含むリポソームを添加し、アクチン線維形成を刺激する工程、(c)アクチン線維形成度を測定する工程、(d)候補物質の非存在下におけるアクチン線維形成度(A)に対する、候補物質の存在下におけるアクチン線維形成度(B)の割合をアクチン線維形成率として得る工程、および(e)アクチン線維形成率の値を指標として候補物質の抗浸潤作用を評価する工程を含む。 The screening method of the present invention is a method for identifying a substance having an anti-invasive action, comprising: (a) providing a cytoplasmic suspension containing labeled actin and containing or not containing a candidate substance; b) adding liposomes containing negatively charged phospholipids to the cytoplasmic suspension to stimulate actin fibril formation, (c) measuring the degree of actin fibril formation, (d) absence of candidate substances A step of obtaining a ratio of the degree of actin fiber formation (B) in the presence of the candidate substance with respect to the degree of actin fiber formation (A) below as an actin fiber formation rate, and (e) a candidate substance using the value of the actin fiber formation rate as an index The step of evaluating the anti-invasive action of
本発明のスクリーニング方法において、(a)工程は、標識化アクチンを含み、候補物質を含むかまたは含まない各細胞質懸濁液を提供する工程であるが、アクチン線維の形成をより効率的に行うため、ATP、GTP、ATP再生系(ATPに加えCPK(クレアチンホスホキナーゼ)、CP(クレアチンリン酸))などをさらに含有することが好ましい。細胞質としては、脳細胞、肝細胞、精巣細胞など、種々の細胞由来の細胞質を用いることができるが、アクチン線維形成率の高さの点から脳細胞質がより好ましい。細胞の起源は特に限定されるものではないが、抗浸潤剤のスクリーニングという観点から、ヒトの薬剤評価系において用いられる哺乳類、たとえばラット、マウス、モルモット、ウサギ、ブタ、サル、イヌなどがより好ましい。また、細胞質の懸濁に使用する緩衝液としては、無機リンを含有しない緩衝液であって、生理的pHであるpH7.4付近に調整されたグットバッファーなど生化学分野において使用される緩衝液であれば、特に制限なく用いることができ、たとえば、HEPES、MES、PIPESなどが挙げられる。この緩衝液に、KCl、MgCl2、CaCl2などをおおよそ等張でアクチン線維形成に最適な組成や、濃度となるように添加し、スクロース等で粘度を調整して用いることができる。さらに、懸濁液中のタンパク質を活性化させる目的でDTTを添加することや、カルシウム濃度を調節する目的でEGTAなどを添加することも好ましい。細胞質懸濁液の細胞質濃度は、(b)工程に使用する際の最終濃度として、好ましくは約3〜約30mg/ml、より好ましくは約6〜約20mg/ml、最も好ましくは約8〜約14mg/mlである。細胞質濃度が3mg/mlより低いとアクチン線維の形成が首尾よく達成されない傾向があり、30mg/mlより高いと高粘性となりアクチン線維形成を正確に定量できない傾向がある。 In the screening method of the present invention, step (a) is a step of providing each cytoplasmic suspension containing a labeled actin and containing or not containing a candidate substance, but more efficiently forms actin fibers. Therefore, it is preferable to further contain ATP, GTP, ATP regeneration system (CPK (creatine phosphokinase), CP (creatine phosphate) in addition to ATP) and the like. As the cytoplasm, cytoplasms derived from various cells such as brain cells, hepatocytes, testis cells and the like can be used, but brain cytoplasm is more preferable from the viewpoint of high actin fiber formation rate. The origin of the cell is not particularly limited, but from the viewpoint of screening for anti-invasive agents, mammals used in human drug evaluation systems, such as rats, mice, guinea pigs, rabbits, pigs, monkeys, dogs, etc. are more preferable. . The buffer used for suspending cytoplasm is a buffer that does not contain inorganic phosphorus, and is used in the biochemical field, such as a good buffer adjusted to around physiological pH 7.4. If it is, it can be used without a restriction | limiting in particular, For example, HEPES, MES, PIPES etc. are mentioned. KCl, MgCl 2 , CaCl 2, etc. can be added to this buffer solution so as to be approximately isotonic and optimal in composition and concentration for actin fiber formation, and the viscosity can be adjusted with sucrose or the like. Furthermore, it is also preferable to add DTT for the purpose of activating the protein in the suspension or EGTA for the purpose of adjusting the calcium concentration. The cytoplasmic concentration of the cytoplasmic suspension is preferably about 3 to about 30 mg / ml, more preferably about 6 to about 20 mg / ml, and most preferably about 8 to about 10 as the final concentration when used in step (b). 14 mg / ml. When the cytoplasm concentration is lower than 3 mg / ml, actin fiber formation tends to be not achieved successfully, and when it is higher than 30 mg / ml, the viscosity becomes high and the actin fiber formation tends not to be accurately quantified.
本発明において使用する標識化アクチンの標識としては、ピレン、ローダミンまたはフルオレセインなどが挙げられるが、アクチンまたはアクチン線維の検出を可能にするものである限りこれらに限定されるものではない。後述するようにアクチン線維の形成を定量的に検出できることからピレンを用いることが好ましい。 Examples of the label for the labeled actin used in the present invention include pyrene, rhodamine, fluorescein and the like, but are not limited to these as long as it enables detection of actin or actin fibers. As will be described later, it is preferable to use pyrene because formation of actin fibers can be quantitatively detected.
本発明のスクリーニング方法において、(b)工程は、負電荷を有するリン脂質を含むリポソームを添加することにより、(a)工程にて調製した細胞質懸濁液中におけるアクチン線維の形成を刺激する工程である。負電荷を有するリン脂質としては、特に限定されるものではないが、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸(PIP2)などが挙げられ、その他のリン脂質たとえばホスファチジルコリン(PC)などと組み合わせて安定なリポソームを形成する。 In the screening method of the present invention, the step (b) is a step of stimulating the formation of actin fibers in the cytoplasmic suspension prepared in the step (a) by adding a liposome containing a phospholipid having a negative charge. It is. The phospholipid having a negative charge is not particularly limited, and examples thereof include phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol-4,5-diphosphate (PIP 2 ), and other phospholipids such as phosphatidylcholine ( PC) and the like to form stable liposomes.
(a)工程および(b)工程については、具体的には、たとえばマウス脳細胞質にATP存在下でホスファチジルセリン(PS)を含むリポソームを加えることにより実施できる(非特許文献2)。 Specifically, the step (a) and the step (b) can be carried out, for example, by adding liposomes containing phosphatidylserine (PS) in the presence of ATP in the mouse brain cytoplasm (Non-patent Document 2).
本発明のスクリーニング方法において、(c)工程は、アクチン線維の形成度を測定する工程であるが、その方法は、標識化アクチンの種類に依存し、アクチン線維形成の刺激前後における分光学的または形態学的変化を評価するなどの方法を用いることができる。 In the screening method of the present invention, the step (c) is a step of measuring the degree of formation of actin fibrils, but the method depends on the type of labeled actin and is spectroscopically or before and after stimulation of actin fibril formation. Methods such as assessing morphological changes can be used.
具体的には、密度が高くなると特定波長の強度が増大する特徴を有するピレンを用いてアクチンを標識した場合、アクチン線維形成量をこのピレンの特定波長(励起波長:365nm、蛍光波長:407nm)の蛍光強度を分光学的に測定することができる。この方法は、確立されており、アクチン線維形成度合いと蛍光量がよく相関し、高い精度で定量的に測定できる方法であり好ましい。この方法は、ピレンに限定されるものではなく、ピレンと同様の特徴を有する標識も使用することができる。 Specifically, when actin is labeled using pyrene having the characteristic that the intensity of a specific wavelength increases as the density increases, the actin fibril formation amount is determined based on the specific wavelength of this pyrene (excitation wavelength: 365 nm, fluorescence wavelength: 407 nm). Can be measured spectroscopically. This method has been established and is preferable because it can be quantitatively measured with high accuracy because the degree of actin fibril formation and the amount of fluorescence are well correlated. This method is not limited to pyrene, and a label having the same characteristics as pyrene can also be used.
たとえば本発明の1つの実施態様として、ピレンを用いるアクチン線維形成度の測定は、ピレンアクチンおよびATPを含み、候補物質または溶媒のみを加えた脳細胞質懸濁液中に、負電荷を有するリン脂質を含むリポソームを添加し、添加後から蛍光変化が平衡となるまで(およそ1000〜2000秒)、蛍光分光光度計にて経時的に蛍光強度を測定することにより行うことができる。 For example, as one embodiment of the present invention, the measurement of the degree of actin fibril formation using pyrene is a phospholipid having a negative charge in a brain cytoplasm suspension containing pyrene actin and ATP, to which only a candidate substance or a solvent is added. Is added, and the fluorescence intensity is measured over time with a fluorescence spectrophotometer until the change in fluorescence reaches equilibrium (approximately 1000 to 2000 seconds) after the addition.
その他、標識アクチンとしてローダミンまたはフルオレセインなど、蛍光顕微鏡によりその蛍光が検出可能な分子で標識したアクチンを用いる場合には、本発明のスクリーニング方法において、アクチン線維形成を誘導した後、蛍光顕微鏡下で、実際に形成されたアクチン線維を直接蛍光顕微鏡にて観察し、その顕微鏡画像をカメラで取得し、それらを比較することにより、形態学的にアクチン線維形成度を評価することができる。 In addition, when using actin labeled with a molecule whose fluorescence can be detected by a fluorescence microscope such as rhodamine or fluorescein as the labeled actin, in the screening method of the present invention, after inducing actin fibril formation, under a fluorescence microscope, The actin fibril formation degree can be evaluated morphologically by observing the actually formed actin fibrils directly with a fluorescence microscope, acquiring the microscope images with a camera, and comparing them.
本発明のスクリーニング方法の(d)工程において求められるアクチン線維形成率とは、候補物質を含まないコントロールのアクチン再現系におけるアクチン線維形成度(A)を100とした、候補物質の存在下でのアクチン線維形成度(B)の割合を示すものである(図2)。 The actin fibril formation rate required in the step (d) of the screening method of the present invention is the degree of actin fibril formation (A) in a control actin reproduction system that does not include a candidate substance, and is 100 in the presence of a candidate substance. It shows the ratio of the degree of actin fiber formation (B) (FIG. 2).
本発明のスクリーニング方法の(e)工程において、アクチン線維形成率の値を指標として抗浸潤作用を評価する場合、アクチン線維形成率が100より減少していることを指標とし、好ましくは約70以下、より好ましくは約30以下である被験物質に抗浸潤作用があると評価するものとする。 In the step (e) of the screening method of the present invention, when the anti-invasive action is evaluated using the value of actin fibril formation rate as an index, the actin fiber formation rate is decreased from 100, preferably about 70 or less. More preferably, the test substance that is about 30 or less has an anti-invasive effect.
本発明のスクリーニング方法により、アクチン線維形成阻害作用や抗浸潤作用が同定され、細胞アッセイにおいても高い抗浸潤作用が確認された化合物として、N’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジド(本明細書においては、化合物No.1ともいう)が挙げられる。N’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジドは、市販品(ビタスーエム(Vitas-M)ラボラトリー社)を入手するか、あるいは常法により製造することができる。 N ′-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2 is a compound in which an actin fibril formation inhibitory action and an anti-invasive action have been identified by the screening method of the present invention and a high anti-invasive action has been confirmed in cell assays. -Hydroxybenzohydrazide (also referred to herein as Compound No. 1). N '-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2-hydroxybenzohydrazide is commercially available (Vitas-M Laboratories) or can be produced by a conventional method.
したがって、本発明によれば、N’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジドまたはその薬学的に許容され得る塩を含む抗浸潤剤が提供される。 Therefore, according to the present invention, there is provided an anti-invasive agent comprising N '-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2-hydroxybenzohydrazide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
N’−(4−(ジプロピルアミノ)ベンジリデン)−2−ヒドロキシベンゾヒドラジドの類似の化合物については、つい最近AMP−活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)の阻害剤として報告がなされている(国際公開第2012/027548号)が、アクチン線維形成への関与については全く知られていない。 Similar compounds of N ′-(4- (dipropylamino) benzylidene) -2-hydroxybenzohydrazide have recently been reported as inhibitors of AMP-activated protein kinase (AMPK) (International Publication No. 1). 2012/0275548) is not known at all for its involvement in actin fibril formation.
本発明の抗浸潤剤は、アクチン線維形成が必須である細胞活動、例えばマクロファージの食作用、がん細胞の遊走、転移などに有効である。したがって、本発明の抗浸潤剤は、抗腫瘍剤、がん細胞の遊走阻害薬、抗転移薬、免疫抑制剤などとして使用することができる。 The anti-invasive agent of the present invention is effective for cell activities in which actin fibril formation is essential, such as macrophage phagocytosis, cancer cell migration, and metastasis. Therefore, the anti-invasive agent of the present invention can be used as an antitumor agent, a cancer cell migration inhibitor, an anti-metastatic agent, an immunosuppressant, and the like.
薬学的に許容され得る塩としては、塩基性付加塩、酸付加塩などが挙げられ、塩基性付加塩としては、たとえばナトリウム塩およびカリウム塩等のアルカリ金属塩;たとえばカルシウム塩およびマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩;たとえばアンモニウム塩;たとえばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩およびN,N’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩などが挙げられ、酸付加塩としては、たとえば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩および過塩素酸塩等の無機酸塩;たとえば酢酸塩、ギ酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩およびトリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩;たとえばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびp−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩などが挙げられる。 Examples of pharmaceutically acceptable salts include basic addition salts, acid addition salts, and the like. Examples of basic addition salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; for example, calcium salts and magnesium salts. Alkaline earth metal salts; for example ammonium salts; organic amine salts such as trimethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, ethanolamine salt, diethanolamine salt, triethanolamine salt, procaine salt and N, N′-dibenzylethylenediamine salt Examples of acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate and perchlorate; for example, acetate, formate, maleate, fumarate, and tartaric acid. Salt, citrate, ascorbate and trifluoroacetate Organic acid salts of; for example methanesulfonate, isethionate, and sulfonates such as benzenesulfonate and p- toluenesulphonate salts.
本発明の抗浸潤剤の投与方法としては、静脈、動脈、経口、筋肉内、皮下、腹腔内、点鼻、点眼、点耳、経皮、局所投与などが挙げられる。 Examples of the administration method of the anti-invasive agent of the present invention include intravenous, arterial, oral, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, nasal drop, eye drop, ear drop, transdermal, and local administration.
本発明の抗浸潤剤の投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、液状注射薬、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、座薬、貼付薬などが挙げられる。 Examples of the dosage form of the anti-invasive agent of the present invention include tablets, powders, granules, capsules, liquid injections, nasal drops, eye drops, ear drops, suppositories, and patches.
本発明の抗浸潤剤の投与量は、種々の条件、たとえば年齢、体重、症状などにより変動するが、通常、約1〜100mg/kgである。 The dose of the anti-invasive agent of the present invention varies depending on various conditions such as age, weight, symptoms, etc., but is usually about 1 to 100 mg / kg.
本発明の方法にしたがってスクリーニングを行い、インビトロでアクチン線維形成を阻害することが見出された物質については、その抗浸潤効果を従来から用いられている評価方法により確認することができる。 Screening is performed according to the method of the present invention, and for substances found to inhibit actin fibril formation in vitro, the anti-invasive effect can be confirmed by a conventionally used evaluation method.
そのような方法としては、たとえばラッフル膜の形成阻害や、創傷治癒アッセイにおける細胞浸潤阻害などを評価する方法があげられる。 Examples of such a method include a method for evaluating inhibition of raffle film formation and inhibition of cell invasion in a wound healing assay.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例1 アクチン線維の形成
(1−a)マウス脳細胞質の調製
Yamadaら、J. Biol. Chem., 2009, Vol.284, pp.34244-34256にしたがい、マウス(系統C57BL6J)の脳20個を、5mlのXB緩衝液(10mM HEPES、100mM KCl、2mM MgCl2、0.1mM CaCl2、5mM EGTA、50mM スクロース、1mM ジチオスレイトール、1μg/ml ロイペプチン、5μg/mlペプスタチン、および0.4mg/ml フッ素化フェニルメチルスルホニル)pH7.4で懸濁した。懸濁溶液を3,000×gで20分間、10,000×gで20分間遠心分離した。得られた上清をXB緩衝液で4倍に希釈し、400,000×gで1時間遠心分離した。透明な上清を注意深く集め、Centriprep−10濃縮装置(アミコン社)を用いて4分の1の体積に濃縮した。細胞質の最終濃度は40〜50mg/mlであった。
Example 1 Formation of actin fibers (1-a) Preparation of mouse brain cytoplasm According to Yamada et al., J. Biol. Chem., 2009, Vol.284, pp.34244-34256, 20 brains of mice (strain C57BL6J) 5 ml of XB buffer (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 5 mM EGTA, 50 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol, 1 μg / ml leupeptin, 5 μg / ml pepstatin, and 0.4 mg / ml ml fluorinated phenylmethylsulfonyl) pH 7.4. The suspension was centrifuged at 3,000 × g for 20 minutes and 10,000 × g for 20 minutes. The resulting supernatant was diluted 4-fold with XB buffer and centrifuged at 400,000 × g for 1 hour. The clear supernatant was carefully collected and concentrated to a quarter volume using a Centriprep-10 concentrator (Amicon). The final concentration of cytoplasm was 40-50 mg / ml.
(1−b)アクチン線維形成反応
(1−a)で得られたマウス脳細胞質を最終濃度で12mg/mlになるように、40U/ml CPK(クレアチンホスホキナーゼ)、8mM CP(クレアチンリン酸)、1mM ATP、0.286mg/ml ピレンアクチンおよび0.1mM GTPを含むXB緩衝液に希釈し、被験物質を加えて混合した。その後10分間保温した後、その混合液65μlに、120μM リポソーム(50%PC、50%PS:アバンティ・ポーラー・リピッド社)5μlを加えることによりアクチン線維(F−アクチン)形成反応を開始した。ピレンアクチンはサイトスケルトン社から購入した。他の試薬は和光純薬より購入した。表1に示す被験物質(図3)をDMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解して用い、ネガティブコントロールには、被験物質の溶媒量と同量のDMSOを添加した。被験物質のサンプル内での最終濃度は、40μMであり、被験物質を溶解している溶媒DMSOは最終1%(v/v、サンプル内)となるよう希釈を調節した。
(1-b) Actin fibril formation reaction 40 U / ml CPK (creatine phosphokinase), 8 mM CP (creatine phosphate) so that the mouse brain cytoplasm obtained in (1-a) has a final concentration of 12 mg / ml. Diluted in XB buffer containing 1 mM ATP, 0.286 mg / ml pyreneactin and 0.1 mM GTP, the test substance was added and mixed. After incubating for 10 minutes, actin fiber (F-actin) formation reaction was initiated by adding 5 μl of 120 μM liposome (50% PC, 50% PS: Avanti Polar Lipid) to 65 μl of the mixture. Pyrene actin was purchased from Cytoskeleton. Other reagents were purchased from Wako Pure Chemical. The test substance shown in Table 1 (FIG. 3) was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) and used as a negative control, and the same amount of DMSO as the solvent of the test substance was added. The final concentration of the test substance in the sample was 40 μM, and the dilution was adjusted so that the solvent DMSO in which the test substance was dissolved was final 1% (v / v, in the sample).
(1−c)アクチン線維形成率の評価方法
F−アクチン形成量は、ピレン標識アクチンに由来するピレンの蛍光強度変化を指標として定量した(図1)。ピレンは密度が高くなると407nmの蛍光強度が増大する(励起波長:365nm、蛍光波長:407nm)。この蛍光強度は、アクチン線維の形成量に比例することが知られている。蛍光強度変化は、蛍光分光光度計(F−2500HITACHI、日立製)を用い、F−アクチン形成量の経時的変化を測定した。F−アクチン形成量は、リポソーム添加後からピレンの蛍光変化が平衡となった2000秒までの蛍光強度の増加量を測定した(図2)。被験物質を含まない場合における増加量を100%とし、標準化した。
(1-c) Evaluation Method for Actin Fiber Formation Rate The amount of F-actin formation was quantified using the change in the fluorescence intensity of pyrene derived from pyrene-labeled actin as an index (FIG. 1). As the density of pyrene increases, the fluorescence intensity at 407 nm increases (excitation wavelength: 365 nm, fluorescence wavelength: 407 nm). This fluorescence intensity is known to be proportional to the amount of actin fibers formed. The change in fluorescence intensity was measured using a fluorescence spectrophotometer (F-2500HITACHI, manufactured by Hitachi), and the change with time in the amount of F-actin formed was measured. The amount of F-actin formation was determined by measuring the amount of increase in fluorescence intensity after the addition of liposomes until 2000 seconds when the fluorescence change of pyrene was in equilibrium (FIG. 2). When the test substance was not included, the increase was 100% and standardized.
結果を図4に示す。ポジティブコントロールであるダイナソアは、アクチン線維形成率がコントロールに対して35.3%と高いアクチン線維形成阻害効果を示し、評価系が適切であることが裏付けられた。そして化合物No.1は、28.5%と非常に高いアクチン線維形成阻害効果を示した。一方、化合物No.2〜No.6についてはそれぞれコントロールに対して98.5%、95.6%、108.8%、104.5%および107.8%とアクチン線維形成阻害作用を示さなかった。 The results are shown in FIG. As a positive control, Dynasoa showed an actin fibril formation inhibitory effect with an actin fibril formation rate as high as 35.3% of the control, confirming that the evaluation system is appropriate. And compound no. 1 showed a very high actin fibril formation inhibitory effect of 28.5%. On the other hand, Compound No. 2-No. 6 was 98.5%, 95.6%, 108.8%, 104.5% and 107.8% of the control, respectively, showing no actin fibril formation inhibitory effect.
この結果から、化合物No.1がアクチン線維形成阻害薬および浸潤抑制薬としての候補になると考えられ、化合物No.2〜No.6については、細胞における抗浸潤作用は期待できないことを示唆している。 From this result, Compound No. 1 is considered to be a candidate as an actin fibril formation inhibitor and an infiltration suppressor. 2-No. About 6, it suggests that the anti-invasive action in the cells cannot be expected.
実施例2 肺がん細胞株におけるラッフル膜形成阻害の検討
(2−a)肺がん細胞株の培養
ヒト肺がん細胞株(H1299:ATCC No.CRL−5803)を10%ウシ胎仔血清(FBS)(インビトロジェン社)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:インビトロジェン社)中で、37℃、5%CO2存在下で培養した。
Example 2 Examination of Raffle Film Formation Inhibition in Lung Cancer Cell Line (2-a) Culture of Lung Cancer Cell Line Human lung cancer cell line (H1299: ATCC No. CRL-5803) was obtained from 10% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen) The cells were cultured in a Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM: Invitrogen) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
(2−b)血清刺激によるラッフル膜形成
ヒト肺がん細胞株H1299を、6ウェルプレートに2×104細胞/ウェルとなるように、コラーゲンコートしたカバーガラス(岩城ガラス社)を入れ、2日間培養したのち、0.1%FBSを含むDMEM2mlに培地を交換し、さらに16〜24時間培養した。その後、10%FBSを含むDMEM2mlに培地を交換し、10分間保温した。細胞を速やかに氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)にて洗った後、4%パラホルムアルデヒド(和光純薬社)を含むPBSで室温にて20分間固定した。固定後、0.1%TX−100(シグマ−アルドリッチジャパン社)を含むPBSで細胞の透過処理を行なった。さらに、10%ロバ血清を含むPBSにてブロッキングを行った後、ローダミンで修飾されたファロイジン(モレキュラープローブ社)で細胞を処理することにより、細胞内のアクチン線維を染色した。染色処理後、定法に従い、マウント剤(ダイアゴニスティック・バイオシステムズ社)を用いてスライドガラスにマウントした。被験物質のラッフル膜形成阻害効果を調べる際には、表1の被験物質が40μMになるように溶解した0.1%FBS−DMEM2mlと細胞を37℃に保温し、血清による刺激30分前に、細胞に投与した。各化合物は、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させているため、被験物質を含まないコントロールには、化合物溶液のかわりに、同体積のDMSOを用いて観察し、取得した画像は、Adobe Photoshop(登録商標)CS3(アドビ システムズ社)およびAdobe Illustrator(登録商標)CS3(アドビ システムズ社)を用いて編集した。
(2-b) Raffle membrane formation by serum stimulation Put a collagen-coated cover glass (Iwaki Glass Co., Ltd.) in a 6-well plate so that the human lung cancer cell line H1299 is 2 × 10 4 cells / well and culture for 2 days. After that, the medium was replaced with 2 ml of DMEM containing 0.1% FBS, and further cultured for 16 to 24 hours. Thereafter, the medium was replaced with 2 ml of DMEM containing 10% FBS, and the temperature was kept for 10 minutes. The cells were quickly washed with ice-cooled phosphate buffered saline (PBS), and then fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 20 minutes. After fixation, the cells were permeabilized with PBS containing 0.1% TX-100 (Sigma-Aldrich Japan). Furthermore, after blocking with PBS containing 10% donkey serum, the cells were treated with rhodamine-modified phalloidin (Molecular Probes) to stain intracellular actin fibers. After the staining treatment, the slide glass was mounted using a mounting agent (Diagonistic Biosystems) according to a conventional method. When investigating the raffle film formation inhibitory effect of the test substance, 2 ml of 0.1% FBS-DMEM in which the test substance of Table 1 was dissolved to 40 μM and the cells were kept at 37 ° C., and 30 minutes before stimulation with serum Administered to the cells. Since each compound was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), the control containing no test substance was observed using the same volume of DMSO instead of the compound solution, and the acquired image was Adobe Photoshop (registered). (Trademark) CS3 (Adobe Systems Incorporated) and Adobe Illustrator (registered trademark) CS3 (Adobe Systems Incorporated) were used for editing.
結果を図5に示す。血清刺激をしない細胞では、細胞辺縁部にラッフル膜がほとんど形成されないが、コントロールでは、血清刺激にて、矢印で示されるようなF−アクチンが豊富に存在するラッフル膜1の形成が認められた。化合物No.2〜6を投与した系ではラッフル膜はコントロールと同等に形成されるのに対し、化合物No.1投与群では、ラッフル膜はほとんど形成されないことから、化合物No.1のアクチン線維形成阻害効果が細胞レベルで確認された。 The results are shown in FIG. In cells that are not serum-stimulated, almost no raffle membrane is formed at the cell edge, but in the control, formation of a raffle membrane 1 in which F-actin is abundant as shown by the arrow is observed during serum stimulation. It was. Compound No. In the system administered with 2 to 6, the raffle film is formed in the same manner as the control, whereas compound No. In the 1 administration group, almost no raffle film was formed. 1 actin fibril formation inhibitory effect was confirmed at the cellular level.
この結果から、実施例1における試験管レベルでのアクチン線維形成評価系が、がん培養細胞における抗浸潤作用とよい相関作用を示すことがわかる。 From this result, it can be seen that the actin fibril formation evaluation system at the test tube level in Example 1 shows a good correlation with the anti-invasive action in cancer cultured cells.
実施例3 創傷治療アッセイによる細胞遊走阻害の検討
(3−a)細胞の培養
実施例2と同様にH1299細胞を培養した。
Example 3 Examination of Cell Migration Inhibition by Wound Treatment Assay (3-a) Cell Culture H1299 cells were cultured in the same manner as in Example 2.
(3−b)創傷治癒アッセイ
H1299細胞をガラスボトムディッシュ(岩城ガラス社)にコンフルエントになるように培養した。アッセイする1日前に、0.1%FBS−DMEMに培養液を交換し、16〜20時間培養する。その後、イエローチップを用いて、一定の間隔で、細胞を線状にランダムに4ヵ所かき取った。ディッシュ1枚を0時間とし、メタノールで固定後、直ちにギムザ染色(シグマ・アルドリッチ社)を行なった。その他のディッシュは、被験物質を含まないコントロールとポジティブコントロールのダイナソア、化合物No.1および化合物No.2とし、被験物質が40μMになるように溶解した0.1%FBS−DMEM2mlを保温し、創傷作成後すぐに投与した。被験物質を含まないコントロールには、化合物溶液のかわりに、同体積のDMSOを用いて観察した。経時で観察する細胞は、37℃、5%CO2の条件下でさらに9時間培養した。培養後、細胞をメタノールで固定し、ギムザ染色を行った。ギムザ染色を行った細胞を顕微鏡で観察し画像を取得した。細胞がどの程度隙間を埋めたのかを評価するために、同じシャーレでランダムに5ヵ所を選びその埋めた面積を、画像上から、ImageJ(NIH)を用いて計測し、その平均値を計算した。
(3-b) Wound healing assay H1299 cells were cultured to become confluent in a glass bottom dish (Iwaki Glass Co., Ltd.). One day before assay, change the culture medium to 0.1% FBS-DMEM and incubate for 16-20 hours. Thereafter, the cells were randomly scraped at four points at regular intervals using a yellow chip. One dish was set to 0 hours, fixed with methanol, and immediately stained with Giemsa (Sigma-Aldrich). Other dishes include control-free dysoa and compound no. 1 and compound no. 2, 2 ml of 0.1% FBS-DMEM in which the test substance was dissolved to 40 μM was kept warm and administered immediately after wound creation. Controls containing no test substance were observed using the same volume of DMSO instead of the compound solution. The cells observed over time were further cultured for 9 hours under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . After culture, the cells were fixed with methanol and stained with Giemsa. The cells subjected to Giemsa staining were observed with a microscope to obtain an image. In order to evaluate how much gaps the cells filled, five areas were randomly selected in the same petri dish, and the filled areas were measured from the image using ImageJ (NIH), and the average value was calculated. .
結果を図6および7に示す。図6からは、細胞が機械的にかき取られた部分の左右より細胞が移動してくる度合いを測定し、コントロールの浸潤した細胞が創傷部分を埋めた面積を100として細胞の浸潤能を図7にまとめた。化合物No.2投与群では浸潤能が97.5%とコントロールとほとんど差を認めないが、ポジティブコントロールのダイナソア投与群では53.3%、化合物No.1投与群では70.7%と、顕著にがん細胞の浸潤能が抑制された。 The results are shown in FIGS. From FIG. 6, the degree of cell migration is measured from the left and right of the part where the cell is mechanically scraped, and the infiltrating ability of the cell is illustrated with the area where the wounded part of the control fills the wound area as 100 7 Compound No. In the 2 administration group, the infiltration ability was 97.5%, which is almost the same as that of the control, but in the positive control dynasoa administration group, 53.3%, Compound No. In one administration group, the invasive ability of cancer cells was remarkably suppressed at 70.7%.
これは、実施例1の試験管レベルでのアクチン線維形成阻害作用が、がん培養細胞を用いた実験においても浸潤抑制効果として相関よく確認できたことを示している。 This shows that the actin fibril formation inhibitory action at the test tube level in Example 1 was confirmed with good correlation as an infiltration suppressing effect in experiments using cultured cancer cells.
1 ラッフル膜
2 創傷部分
1 Raffle membrane 2 Wound part
Claims (4)
(a)標識化アクチンを含み、候補物質を含むかまたは含まない各細胞質懸濁液を提供する工程、
(b)該細胞質懸濁液に、負電荷を有するリン脂質を含むリポソームを添加し、アクチン線維形成を刺激する工程、
(c)アクチン線維形成度を測定する工程、
(d)候補物質の非存在下におけるアクチン線維形成度(A)に対する、候補物質の存在下におけるアクチン線維形成度(B)の割合をアクチン線維形成率として得る工程、および
(e)アクチン線維形成率の値を指標として候補物質の抗浸潤作用を評価する工程
を含み、
前記細胞質懸濁液が、哺乳類の脳細胞、肝細胞または精巣細胞から調製される方法。 A method for identifying a substance having an anti-invasive action,
(A) providing each cytoplasmic suspension comprising labeled actin and with or without a candidate substance;
(B) adding a liposome containing a negatively charged phospholipid to the cytoplasmic suspension to stimulate actin fibril formation;
(C) measuring the degree of actin fibril formation,
(D) obtaining a ratio of the degree of actin fiber formation (B) in the presence of the candidate substance to the degree of actin fiber formation (A) in the absence of the candidate substance as an actin fiber formation rate, and (e) actin fiber formation the process of evaluating the anti-invasive effect of a candidate agent value rate as an index look-containing,
A method wherein the cytoplasmic suspension is prepared from mammalian brain cells, hepatocytes or testis cells .
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