JP5803036B2 - Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) - Google Patents
Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) Download PDFInfo
- Publication number
- JP5803036B2 JP5803036B2 JP2010035637A JP2010035637A JP5803036B2 JP 5803036 B2 JP5803036 B2 JP 5803036B2 JP 2010035637 A JP2010035637 A JP 2010035637A JP 2010035637 A JP2010035637 A JP 2010035637A JP 5803036 B2 JP5803036 B2 JP 5803036B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transgenic
- minipig
- human apolipoprotein
- gene
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 title claims description 81
- 244000309715 mini pig Species 0.000 title claims description 79
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 55
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 21
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 16
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 6
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWMSSKBMOFPBDM-UHFFFAOYSA-N 4-carbamoylbenzenesulfonyl chloride Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YWMSSKBMOFPBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 108010012927 Apoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960001656 amikacin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N hypotaurine Chemical compound [NH3+]CCS([O-])=O VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、ヒト疾患モデルとして利用し得るトランスジェニックミニブタに関する。詳細には、本発明は、ヒトアポリポプロテイン(a)を発現するトランスジェニックミニブタに関する。 The present invention relates to a transgenic minipig that can be used as a human disease model. Specifically, the present invention relates to transgenic minipigs that express human apolipoprotein (a).
動脈硬化症は心臓、脳血管疾患の原因となっているが、現在までに有効な治療法は存在しない。動脈硬化が生じる原因については、ヒトアポリポプロテイン(a)が危険因子の一つとして挙げられている。 Although arteriosclerosis is the cause of heart and cerebrovascular disease, there is no effective treatment to date. Regarding the cause of arteriosclerosis, human apolipoprotein (a) is cited as one of the risk factors.
ヒトアポリポプロテイン(a)は、血中にてコレステロールやリン脂質、他のタンパク質と結合してリポプロテイン(a)という複合体を形成する。リポプロテイン(a)について、疫学的にリポプロテイン(a)の量と動脈硬化（虚血性心疾患）発症との間に関連性が見出されおり、そのため動脈硬化発症機構におけるアポリポプロテイン(a)の関与が注目されている（非特許文献１および２）。しかしながら、依然として動脈硬化症発症機構は解明されていない。
Human apolipoprotein (a) binds to cholesterol, phospholipids, and other proteins in the blood to form a complex called lipoprotein (a). Regarding lipoprotein (a), an epidemiological relationship has been found between the amount of lipoprotein (a) and the onset of arteriosclerosis (ischemic heart disease). Therefore, apolipoprotein (a) in the onset mechanism of atherosclerosis Has been attracting attention (Non-Patent
今日、ヒト疾患発症機構の解明を目的として、様々な哺乳動物種に由来する疾患モデル動物の作出が報告されている。中でもブタは生理学的および解剖学的にヒトと類似しており、ヒト疾患モデル動物として注目されている。とりわけミニブタは臓器サイズや生理機能がヒトと非常に類似していること、多胎動物であるため１度に多くの産仔が得られること、小型であることから実験上の取り扱いや飼育管理が容易であること等からヒト疾患モデル動物として注目されている。 Today, the production of disease model animals derived from various mammalian species has been reported for the purpose of elucidating the mechanism of human disease onset. Among them, pigs are physiologically and anatomically similar to humans, and are attracting attention as human disease model animals. In particular, minipigs are very similar to humans in organ size and physiological function, and because they are multiple embryos, many pups can be obtained at one time. Therefore, it attracts attention as a human disease model animal.
そこでヒト疾患、特にヒト動脈硬化症の発症機構の解明、治療および予防法の確立を目的として、疾患モデルとして利用可能なミニブタの作出が望まれている。 Therefore, for the purpose of elucidating the pathogenesis of human diseases, particularly human arteriosclerosis, and establishing treatment and prevention methods, it is desired to produce minipigs that can be used as disease models.
本発明は、ヒト疾患、特にヒト動脈硬化症のモデル動物として利用可能なミニブタを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a minipig that can be used as a model animal for human diseases, particularly human arteriosclerosis.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ヒト疾患、特にヒト動脈硬化症のモデル動物として、ヒトアポリポプロテイン(a)を発現するトランスジェニックミニブタが有用であると考え、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors consider that a transgenic minipig expressing human apolipoprotein (a) is useful as a model animal for human diseases, particularly human arteriosclerosis, The present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタ。
［２］ ヒト疾患モデルとして使用する、［１］のトランスジェニックミニブタ。
［３］ ヒト疾患が、動脈硬化症である、［２］のトランスジェニックミニブタ。
［４］ ［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニックミニブタをファウンダーとして確立される、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を含むトランスジェニックミニブタの系統。
［５］ ［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニックミニブタ、または［４］のトランスジェニックミニブタの系統、由来の臓器、組織、卵、精子、および受精卵。
［６］ ［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニックミニブタ、または［４］のトランスジェニックミニブタの系統、から確立される株化細胞。
［７］ ［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニックミニブタ、または［４］のトランスジェニックミニブタの系統、から作出されるトランスジェニックミニブタクローン個体。
［８］ ［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニックミニブタ、［４］のトランスジェニックミニブタの系統、［５］の臓器や組織、［６］の株化細胞、および／または［７］のトランスジェニックミニブタクローン個体を使用する、動脈硬化症の治療および／または予防のための薬剤のスクリーニング方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A transgenic minipig introduced with a human apolipoprotein (a) gene.
[2] The transgenic minipig according to [1], which is used as a human disease model.
[3] The transgenic minipig according to [2], wherein the human disease is arteriosclerosis.
[4] A transgenic minipig strain containing the human apolipoprotein (a) gene, which is established using the transgenic minipig according to any one of [1] to [3] as a founder.
[5] The transgenic minipig according to any one of [1] to [3], or the line, origin organ, tissue, egg, sperm and fertilized egg of the transgenic minipig according to [4].
[6] A cell line established from the transgenic minipig according to any one of [1] to [3], or the transgenic minipig line of [4].
[7] A transgenic minipig clone individual produced from the transgenic minipig of any one of [1] to [3] or the transgenic minipig line of [4].
[8] The transgenic minipig according to any one of [1] to [3], the transgenic minipig line of [4], the organ or tissue of [5], the established cell line of [6], and / or [7] A method for screening a drug for the treatment and / or prevention of arteriosclerosis, using the transgenic minipig clone individual.
本発明により、ヒト疾患モデル、特にヒト動脈硬化症のモデルとして利用し得るヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタを提供することができる。 The present invention can provide a transgenic minipig introduced with a human apolipoprotein (a) gene that can be used as a human disease model, particularly as a human arteriosclerosis model.
本発明に用いられるヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子は公知であり、GenBank等に配列情報が公開されており、例えば、アクセッション番号X06290として登録されている。本発明においてはこれを利用することができる。「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子」はcDNAであっても、ゲノムDNAであってもよいが好ましくはcDNAである。なお本明細書中、特に断りがないかぎり、「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子」にはcDNAおよびゲノムDNAの両形態が含まれる。 The human apolipoprotein (a) gene used in the present invention is known, and its sequence information is disclosed in GenBank and the like, for example, registered as accession number X06290. This can be used in the present invention. The “human apolipoprotein (a) gene” may be cDNA or genomic DNA, but is preferably cDNA. In the present specification, unless otherwise specified, the “human apolipoprotein (a) gene” includes both cDNA and genomic DNA forms.
本発明において「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子」には、上記公知のヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子配列において、１から数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつヒトアポリポプロテイン(a)の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から30個、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個又は２個である。 In the present invention, the “human apolipoprotein (a) gene” has a deletion, substitution, addition or insertion of one to several nucleotides in the known human apolipoprotein (a) gene sequence, and human apolipoprotein (a) gene. A gene encoding a protein having the activity of protein (a) is also included. Although the range of “1 to several” is not particularly limited, for example, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, Particularly preferably, it is 1 to 3, or 1 or 2.
また本発明において「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子」には、上記公知のヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなり、かつヒトアポリポプロテイン(a)の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、2〜6×SSC（1×SSCの組成：0.15M NaCl, 0.015M クエン酸ナトリウム, pH 7.0）および0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中42〜55℃にてハイブリダイズを行い、0.1〜0.2×SSCおよび0.1〜0.5％SDSを含有する溶液中55〜65℃にて洗浄を行う条件をいう。 Further, in the present invention, the “human apolipoprotein (a) gene” includes a nucleotide sequence that can hybridize with a DNA comprising a complementary nucleotide sequence to the known human apolipoprotein (a) gene sequence under stringent conditions. And a gene encoding a protein having the activity of human apolipoprotein (a). “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, 2 to 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15M NaCl, 0.015M Hybridization at 42-55 ° C in a solution containing sodium citrate, pH 7.0) and 0.1-0.5% SDS, to 55-65 ° C in a solution containing 0.1-0.2 × SSC and 0.1-0.5% SDS This is the condition for cleaning.
さらに本発明において「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子」には、上記公知のヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトアポリポプロテイン(a)タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。 Furthermore, in the present invention, the “human apolipoprotein (a) gene” is 80% when calculated using the known human apolipoprotein (a) gene sequence and BLAST or the like (for example, default or default parameters). As mentioned above, a gene encoding a protein consisting of a base sequence having an identity of 90% or more, most preferably 95% or more, and having the activity of a human apolipoprotein (a) protein is also included.
「ヒトアポリポプロテイン(a)の活性」としては、特には限定されないが、例えば、特定のリポタンパク質と結合し、リポタンパク質の認識や脂質代謝に関与する酵素群の活性化あるいは補酵素として機能することが挙げられ、特に高比重、中間比重、低比重または超低比重のリポタンパクに結合して当該タンパク質の代謝に関与することが挙げられる。 The “activity of human apolipoprotein (a)” is not particularly limited. For example, it binds to a specific lipoprotein and functions as an activation of a group of enzymes involved in lipoprotein recognition and lipid metabolism or as a coenzyme. In particular, it binds to lipoproteins with high specific gravity, medium specific gravity, low specific gravity or very low specific gravity and participates in the metabolism of the protein.
「ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタ」は公知の手法、特には限定されないが、例えば特開2000-316420号公報、特開2007-135543号公報などに記載される方法を利用して作出することができる。 “Transgenic minipig introduced with human apolipoprotein (a) gene” is a known method, and is not particularly limited. For example, the method described in JP 2000-316420 A, JP 2007-135543 A, etc. is used. Can be created.
本発明における「ミニブタ」としては、特に限定されることなく公知の系統、例えば、ミネソタ系、ゲッチゲン系、オーミニ系、クラウン系、ゲッチンゲン系、中国系などを用いることができるが、好ましくはクラウン系ミニブタである。 The “minipig” in the present invention is not particularly limited, and known strains such as Minnesota, Götzgen, Ohmini, Crown, Goettingen, and Chinese can be used. A miniature pig.
当該トランスジェニックミニブタの作出に際してはまず、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を、ベクターに組み込み、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入用ベクターを構築する。ベクターは、当該分野において通常使用されるもの（例えば、プラスミド（pCAGGSプラスミド等）、ファージ、ウイルス、人工染色体等）がいずれも好適に使用でき、特に限定されない。遺伝子導入用ベクターにおいて使用するプロモーターとしては、当該分野において公知のもの（例えばＣＭＶ、ＥＦ−１α、β-アクチンなど）がいずれも使用でき、特に限定されない。遺伝子導入用ベクターには、遺伝子導入細胞の選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子を含めても良い。選択マーカーは、当該分野において通常使用されるもの（例えば、抗生物質（ネオマイシンなど）耐性遺伝子、生合成遺伝子等）がいずれも好適に使用でき、特に限定されない。 In producing the transgenic minipig, first, a human apolipoprotein (a) gene is incorporated into a vector to construct a vector for introducing human apolipoprotein (a) gene. Any vector commonly used in the art (for example, a plasmid (pCAGGS plasmid, etc.), phage, virus, artificial chromosome, etc.) can be suitably used as the vector, and is not particularly limited. Any promoter known in the art (eg, CMV, EF-1α, β-actin, etc.) can be used as the promoter used in the gene transfer vector, and is not particularly limited. The gene introduction vector may contain a selection marker gene in order to facilitate selection of the gene introduction cell. As the selection marker, any one commonly used in the art (for example, antibiotic (neomycin and the like) resistance gene, biosynthetic gene, etc.) can be suitably used, and is not particularly limited.
構築した遺伝子導入用ベクターをミニブタの受精卵またはミニブタの体細胞に導入する。受精卵は当該分野において通常用いられる手法に従って人工授精により得ることができる。体細胞は特に限定されることなく、あらゆる体細胞を用いることができるが、例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、卵丘細胞などを用いることができる。受精卵または体細胞への遺伝子導入用ベクターの導入には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクションなどの、当該分野で公知のいずれの方法を採用しても良い。 The constructed vector for gene transfer is introduced into fertilized eggs of minipigs or somatic cells of minipigs. A fertilized egg can be obtained by artificial insemination according to a technique usually used in the art. Somatic cells are not particularly limited, and any somatic cell can be used. For example, kidney cells, fibroblasts, cumulus cells, and the like can be used. Any method known in the art, such as microinjection, electroporation, transfection, or lipofection, may be employed for introducing a gene introduction vector into a fertilized egg or somatic cell.
遺伝子導入された体細胞は核移植のためのドナー細胞として利用する。この場合、遺伝子導入された体細胞の核を、除核した未受精卵（卵母細胞）に融合法などを用いて移植し、遺伝子導入された体細胞に由来するクローン胚を得ることができる。 The transfected somatic cell is used as a donor cell for nuclear transfer. In this case, the nucleus of the somatic cell into which the gene has been introduced can be transplanted into an enucleated unfertilized egg (oocyte) using a fusion method or the like to obtain a cloned embryo derived from the somatic cell into which the gene has been introduced. .
遺伝子導入された体細胞に由来するクローン胚は、活性化処理を行い減数分裂を促すことができる。クローン胚の活性化処理は、特に限定されることなく化学物質、電気、超音波を用いて行うことができる。その後、活性化処理したクローン胚は、細胞分裂を阻害するが核分裂は阻害しないように、サイトカラシンＢのような薬剤で処理すればよい。 Cloned embryos derived from the transfected somatic cells can be activated to promote meiosis. The activation treatment of the cloned embryo is not particularly limited and can be performed using a chemical substance, electricity, or ultrasound. Thereafter, the activated clone embryo may be treated with a drug such as cytochalasin B so as to inhibit cell division but not nuclear division.
遺伝子導入された受精卵または遺伝子導入された体細胞に由来するクローン胚を、レシピエントミニブタの卵管に移植する。移植に際しては、移植する受精卵またはクローン胚の発生段階と、移植されるレシピエントの発情周期を同期化しておく。発情周期の同期化および受精卵またはクローン胚の移植作業は、当該分野において通常用いられる手法に従って行うことができる。 A cloned embryo derived from a transgenic fertilized egg or a transgenic somatic cell is transplanted into the oviduct of a recipient minipig. At the time of transplantation, the developmental stage of the fertilized egg or cloned embryo to be transplanted is synchronized with the estrous cycle of the recipient recipient. The synchronization of the estrous cycle and the transfer operation of a fertilized egg or a cloned embryo can be performed according to a technique usually used in the art.
得られた産仔におけるヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子の確認は、産仔（例えば、尾）より採取した組織・細胞におけるヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子またはタンパク質を検出・確認することによって行うことができる。ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子の発現は、ノザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridizationなどによって検出・確認することができる。ヒトアポリポプロテイン(a)の発現は、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定などによって検出・確認することができる。 Confirmation of the human apolipoprotein (a) gene in the obtained offspring can be performed by detecting and confirming the human apolipoprotein (a) gene or protein in tissues / cells collected from the offspring (eg, tail). it can. The expression of the human apolipoprotein (a) gene can be detected and confirmed by Northern hybridization, RT-PCR, in situ hybridization and the like. The expression of human apolipoprotein (a) can be detected and confirmed by Western blotting, ELISA, or measurement using a protein chip to which an antibody is bound.
上記の如くして得られる本発明に係るヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタは、当該分野で公知の手段により、該トランスジェニックミニブタをファウンダーとして、ファウンダー個体またはファウンダー個体由来の卵、精子、もしくは受精卵などを使用してホモ接合体またはヘテロ接合体を得ることができ、得られたホモ接合体またはヘテロ接合体から、病態解析、薬剤スクリーニングなどの研究上更に有用なトランスジェニックミニブタ系統を確立することができる。系統の確立においては、当該分野で公知のクローン作成などの手段（Wilmutら, Nature, vol. 385, 1997）が必要な場合もある。また、ファウンダーであるトランスジェニックミニブタまたはその系統から、これも当該分野で公知の手法により、株化細胞を確立することも可能である。 The transgenic minipig introduced with the human apolipoprotein (a) gene according to the present invention obtained as described above is a founder individual or an egg derived from the founder, using the transgenic minipig as a founder by means known in the art. , Sperm, or fertilized egg can be used to obtain a homozygote or heterozygote, and the obtained homozygote or heterozygote can be used for further research in pathological analysis, drug screening, etc. A minipig line can be established. In establishing the strain, means such as cloning known in the art (Wilmut et al., Nature, vol. 385, 1997) may be required. In addition, it is possible to establish a cell line from a founder transgenic minipig or a strain thereof by a technique known in the art.
本発明に係るヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタおよびその系統、これらの臓器、組織、または株化細胞などは、ヒト疾患、例えば、動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、血管性痴呆、糖尿病、腎疾患肝疾患など、特にヒト動脈硬化症のモデルとして用いることができる。 Transgenic minipigs and their strains into which the human apolipoprotein (a) gene according to the present invention has been introduced, organs, tissues or cell lines thereof are human diseases such as arteriosclerosis, ischemic heart disease, cerebrovascular It can be used as a model for human arteriosclerosis, particularly for disorders, vascular dementia, diabetes, kidney disease and liver disease.
ヒトアポリポプロテイン(a)は、血中にてコレステロールやリン脂質、他のタンパク質と結合してリポプロテイン(a)という複合体を形成することが知られている。リポプロテイン(a)について、疫学的にリポプロテイン(a)の量と動脈硬化（虚血性心疾患）発症との間に関連性が見出されており、ヒト動脈硬化発症においてアポリポプロテイン(a)が危険因子の一つとして認識されている（Maher VM. et.al., Curr Opin Lipidol. 1995 Aug;6(4):229-35； Fan J. et.al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 Jan;21(1):88-94.）。 Human apolipoprotein (a) is known to bind to cholesterol, phospholipids, and other proteins in blood to form a complex called lipoprotein (a). Regarding lipoprotein (a), an epidemiological relationship has been found between the amount of lipoprotein (a) and the onset of arteriosclerosis (ischemic heart disease). Is recognized as one of the risk factors (Maher VM. Et.al., Curr Opin Lipidol. 1995 Aug; 6 (4): 229-35; Fan J. et.al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001 Jan; 21 (1): 88-94.).
また、ミニブタは臓器サイズや生理機能がヒトと非常に類似しているために、他の動物種を用いたヒト疾患モデルと比べて、ヒト疾患発症のメカニズムを効率的に解析することができる。 In addition, since minipigs are very similar in organ size and physiological function to humans, the mechanism of human disease development can be analyzed more efficiently than in human disease models using other animal species.
したがって、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を発現するトランスジェニックミニブタ個体およびその系統、これらの臓器、組織、または株化細胞を分子生物学的、生化学的、形態学的、生理学的に解析することによってヒト動脈硬化症発症のメカニズムを効率的に解析することができる。 Therefore, molecular biological, biochemical, morphological and physiological analysis of transgenic minipig individuals expressing human apolipoprotein (a) and their strains, these organs, tissues or cell lines Thus, the mechanism of human atherosclerosis development can be efficiently analyzed.
また、本発明に係るヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタおよびその系統、これらの臓器、組織、または株化細胞などを用いて、ヒト疾患、特にヒト動脈硬化症の治療および予防のための薬剤のスクリーニング方法を実施することができる。当該方法においては、本発明に係るヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタおよびその系統、これらの臓器、組織、または株化細胞に、ヒト動脈硬化症の治療および予防に有用と考えられる因子を投与する工程（例えば、培地への添加、当該因子の強制発現などを含む）；ならびにヒト動脈硬化症の発症および症状を低減し得る因子を同定する工程を含む。 Further, using the transgenic minipig and the strains, the organs, tissues, or established cells thereof, into which the human apolipoprotein (a) gene according to the present invention has been introduced, treatment and prevention of human diseases, particularly human arteriosclerosis. A drug screening method can be implemented. In this method, it is considered that the transgenic minipigs introduced with the human apolipoprotein (a) gene according to the present invention and their strains, these organs, tissues, or cell lines are useful for the treatment and prevention of human arteriosclerosis. Administering a factor (including, for example, addition to a medium, forced expression of the factor, etc.); and identifying a factor that can reduce the onset and symptoms of human arteriosclerosis.
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞に由来するクローン胚の作製
レシピエント卵子
食肉センター由来ブタ卵巣から採取した卵丘細胞卵子複合体を成熟培地中で41〜42時間培養した。成熟培養後、ヒアルロニダーゼを用いて卵丘細胞を除去し、第一極体を放出した形態的に正常な卵子のみを選抜した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is further demonstrated, this invention is not limited to these Examples.
Example 1: Production of cloned embryos derived from human apolipoprotein (a) gene-introduced mini-pig somatic cells Recipient ovum Cumulus cell ovary complex collected from porcine ovary derived from meat center in maturation medium Cultured for 42 hours. After mature culture, cumulus cells were removed using hyaluronidase, and only morphologically normal eggs that released the first polar body were selected.
ドナー細胞
ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子をコードするｃＤＮＡ（山梨大学医学部 範 江林（Jianglin Fan）教授より御分与頂いた）より終止コドンを取り除き、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)タンパク質由来のアミノ酸配列（HAタグ）をコードするＤＮＡを連結して、これをサイトメガロウイルスのエンハンサーとアクチンプロモーターを持つベクターに組み込み、細胞に導入するためのＤＮＡ構築物（図１）を作製した。当該ＤＮＡ構築物をクラウン系ミニブタ雄成体腎臓由来細胞に導入し、当該細胞をジェネティシン(G418)を添加した培地に播種し選択培養を行って、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したクラウン系ミニブタ雄成体腎臓由来細胞を作製した。
Donor cells Amino acid sequence derived from hemagglutinin (HA) protein of influenza virus by removing the stop codon from cDNA encoding human apolipoprotein (a) gene (provided by Professor Jianglin Fan, Faculty of Medicine, University of Yamanashi) DNA encoding (HA tag) was linked and incorporated into a vector having a cytomegalovirus enhancer and an actin promoter to prepare a DNA construct (FIG. 1) for introduction into cells. The DNA construct is introduced into cells derived from a crown-type minipig male adult kidney, the cells are seeded in a medium supplemented with geneticin (G418), subjected to selective culture, and a crown-type minipig male introduced with a human apolipoprotein (a) gene. Adult kidney-derived cells were prepared.
核移植
卵子は吸引除去法により除核後、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したクラウン系ミニブタ雄成体腎臓由来細胞を囲卵腔に挿入し、融合液中で電気刺激を与えることで融合処理を行った。融合処理1時間後、融合確認を行い融合胚は超音波（周波数2872kHz、burst rate 10Hz、Duty比 10%、強度65V）を30秒間照射して活性化処理を行った。
Nuclear transplantation Oocytes are enucleated by the aspiration removal method, and then a fusion treatment is performed by inserting cells derived from adult male kidneys of the crown system that have introduced the human apolipoprotein (a) gene into the periplasmic space and applying electrical stimulation in the fusion solution. Went. One hour after the fusion treatment, fusion confirmation was performed, and the fusion embryo was subjected to an activation treatment by irradiating with ultrasonic waves (frequency 2872 kHz, burst rate 10 Hz, duty ratio 10%, intensity 65 V) for 30 seconds.
活性化処理後、クローン胚はサイトカラシンB添加修正PZM-3中で2時間培養後、修正PZM3（1リットル中、6.322g NaCl、0.746g KCl、0.099g MgSO4・7H2O、0.048g KH2PO4、2.106g NaHCO3、0.24g Na pyruvate、0.218g Ca (lactate)2・5H2O、0.146g Glutamine、0.546g Hypotaurine、20ml Basal Medium Eagle amino acid solution(x50)、10ml Minimum Essential Medium nonessential amino acid solution (x100)、3g BSA, 50mg 硫酸アミカシンを加える）中に移した。 After activation treatment, cloned embryos were cultured in cytoplasmin B supplemented modified PZM-3 for 2 hours, then modified PZM3 (in one liter, 6.322 g NaCl, 0.746 g KCl, 0.099 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.048 g KH 2 PO 4 , 2.106 g NaHCO 3 , 0.24 g Na pyruvate, 0.218 g Ca (lactate) 2・ 5H 2 O, 0.146 g Glutamine, 0.546 g Hypotaurine, 20 ml Basal Medium Eagle amino acid solution (x50), 10 ml Minimum Essential Medium nonessential amino acid solution (x100), 3 g BSA, 50 mg amikacin sulfate was added).
実施例２：ヒトアポリポプロテイン(a)を発現するクラウン系ミニブタクローン個体の作出
方法
実験１
ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞に由来するクローン胚の体外発生状況とヒトアポリポプロテイン(a)の発現状況を調べた。すなわち、クローン胚は活性化処理後２日目の卵割状況と７日目に胚盤胞形成状況を調べ、得られた胚盤胞についてはヒトアポリポプロテイン(a)発現状況を、一次抗体に抗HAラット抗体および二次抗体にローダミン標識抗ラット抗体を用いて蛍光免疫細胞化学的に観察した。
Example 2: Production of a crown-type minipig clone individual expressing human apolipoprotein (a)
The in vitro development status of cloned embryos derived from human apolipoprotein (a) gene-introduced minipig somatic cells and the expression status of human apolipoprotein (a) were investigated. In other words, clone embryos were examined for cleavage conditions on the second day after activation treatment and blastocyst formation conditions on the seventh day, and for the obtained blastocysts, the expression status of human apolipoprotein (a) was used as the primary antibody. The anti-HA rat antibody and the secondary antibody were observed by fluorescence immunocytochemistry using rhodamine-labeled anti-rat antibody.
実験２
ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞に由来するクローン胚の体内発生状況を調べた。すなわち、クローン胚は活性化2時間後に発情を同期化した受胚ミニブタ5頭の卵管へ外科的移植した。受胚ミニブタは超音波画像診断法にて受胎状況を観察し、出産まで至らせた。
The in vivo development of cloned embryos derived from human apolipoprotein (a) transgenic minipig somatic cells was investigated. That is, cloned embryos were surgically transferred to the oviducts of 5 embryo recipient minipigs synchronized in
実験３
実験２で得られたヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞に由来するクローン産仔におけるヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子発現とヒトアポリポプロテイン(a)発現状況を調べた。すなわち、得られたクローン産仔の主要臓器組織(心臓、肺、大動脈、大脳、腎臓、肝臓、胃、小腸、大腸、精巣、皮膚)から総RNAを抽出し、逆転写(RT)-PCRにより遺伝子発現状況を検討した。さらに、臓器の一部は固定後、パラフィン切片を作成し、一次抗体に抗HAラット抗体および二次抗体に抗ラットIgGを用いて、標識ストレプトアビジン・ビオチン[LSAB]法によりヒトアポリポプロテイン(a)発現状況を免疫組織化学的に観察した。
なお、対照として非クローン産仔の主要臓器における発現状況を観察した。
Human apolipoprotein (a) gene expression and human apolipoprotein (a) expression status in cloned offspring derived from human porcine somatic cells introduced with
As a control, the expression status in the main organs of non-cloned offspring was observed.
実験４
実験２で得られたミニブタクローン産仔の腎臓細胞を用いて、上記実施例１と同様の手法を用いてリクローン胚を作製し、当該リクローン胚の体外発生状況とヒトアポリポプロテイン(a)発現状況を調べた。すなわち、リクローン胚は活性化処理後２日目の卵割状況と７日目に胚盤胞形成状況を調べ、また得られた胚盤胞におけるヒトアポリポプロテイン(a)発現状況を、一次抗体に抗HAラット抗体および二次抗体にローダミン標識抗ラット抗体を用いて蛍光免疫細胞化学的に観察した。
Using the kidney cells of the minipig clones obtained in
結果
実験１
結果は表１に示した。ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞を用いた核移植における融合率は77.8±3.0%(200/254)であった。体細胞クローン胚の卵割率は77.9±4.2% (159/198)、胚盤胞形成率は18.8±3.9%(38/198)であり、胚盤胞の細胞数は39.7±9.4個であった。また、蛍光免疫細胞化学的解析により、全ての胚盤胞(38個)においてヒトアポリポプロテイン(a)発現が確認された。
The results are shown in Table 1. The fusion rate in nuclear transfer using human apolipoprotein (a) transgenic mini-pig somatic cells was 77.8 ± 3.0% (200/254). The cleavage rate of somatic cell cloned embryos was 77.9 ± 4.2% (159/198), the blastocyst formation rate was 18.8 ± 3.9% (38/198), and the number of blastocyst cells was 39.7 ± 9.4. It was. Moreover, human apolipoprotein (a) expression was confirmed in all blastocysts (38) by fluorescence immunocytochemical analysis.
また胚盤胞については、抗HA抗体を用いた蛍光免疫細胞化学的解析の結果、全ての胚盤胞についてヒトアポリポプロテイン(a)の発現が確認された（図２）。 As for blastocysts, the expression of human apolipoprotein (a) was confirmed in all blastocysts as a result of fluorescence immunocytochemical analysis using anti-HA antibody (FIG. 2).
実験２
結果は表２に示した。クローン胚を移植した受胚ミニブタ５頭のうち、２頭が受胎し、胚移植後111 日目に１頭から帝王切開により３頭の雄産仔が得られた。３頭の雄産仔の体重は220g, 220g および200gであった。
The results are shown in Table 2. Of 5 mini-pig embryos transplanted with cloned embryos, 2 were conceived and 3 male offspring were obtained by cesarean section from 111 on day 111 after embryo transfer. The three male offspring weighed 220 g, 220 g and 200 g.
実験３
実験２で得られたヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ体細胞に由来するクローン産仔の主要臓器に由来する総RNAを用いたRT-PCR解析の結果、実験２で得られた３頭の産仔すべての主要臓器において、ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子の発現が観察できた（図３）。
As a result of RT-PCR analysis using total RNA derived from the major organs of cloned offspring derived from miniature porcine somatic cells derived from human apolipoprotein (a) gene obtained in
一方、ヒトアポリポプロテイン(a)発現も同様に３頭の産仔すべての主要臓器で観察できたが、発現状況は臓器間で異なり、心臓で最も強く（反応：＋＋；図４Ａ）、大脳で最も弱かった（反応：＋；図４Ｃ）。クローン産仔の各主要臓器におけるヒトアポリポプロテイン(a)発現状況は表３に示した。 On the other hand, human apolipoprotein (a) expression was also observed in all three major pups, but the expression was different among the organs and was the strongest in the heart (reaction: ++; Fig. 4A). The weakest (reaction: +; FIG. 4C). Table 3 shows the expression status of human apolipoprotein (a) in each major organ of cloned offspring.
実験４
結果は表４に示した。ヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子導入ミニブタ産仔の腎臓細胞を用いた核移植における融合率は77.1±5.0%(139/177)であった。リクローン胚の卵割率は73.6±3.8% (102/139)、胚盤胞形成率は19.5±3.2%(26/139)であり、胚盤胞の細胞数は43.2±2.1個であった。
The results are shown in Table 4. The fusion rate in nuclear transfer using kidney cells of miniature pigs born with human apolipoprotein (a) gene transfer was 77.1 ± 5.0% (139/177). The cleavage rate of the recloned embryo was 73.6 ± 3.8% (102/139), the blastocyst formation rate was 19.5 ± 3.2% (26/139), and the number of blastocyst cells was 43.2 ± 2.1.
また、蛍光免疫細胞化学的解析により、全ての胚盤胞(26個)においてヒトアポリポプロテイン(a)発現が確認された（図５） Moreover, human apolipoprotein (a) expression was confirmed in all blastocysts (26) by fluorescence immunocytochemical analysis (FIG. 5).
結論
以上の結果から、動脈硬化の危険因子として知られているヒトアポリポプロテイン(a)を発現するクラウン系ミニブタクローン個体が作出できたことが示された。
Conclusion From the above results, it was shown that a crown-type minipig clone individual expressing human apolipoprotein (a) known as a risk factor for arteriosclerosis could be produced.
本発明により、ヒト動脈硬化の危険因子と知られるヒトアポリポプロテイン(a)遺伝子を導入したトランスジェニックミニブタおよびその系統、これらの臓器、組織、または株化細胞などを得ることができる。これらを分子生物学的、生化学的、形態学的、生理学的に解析することによってヒト動脈硬化症の成立機構を効率的に解析することができる。当該疾患成立機構の解析過程で得られた知見をもとにして、遺伝子治療、薬剤スクリーニングなどによる創薬などを含む、治療法および予防法の開発が可能であると期待される。 According to the present invention, transgenic minipigs and their strains, organs, tissues, cell lines, and the like into which human apolipoprotein (a) gene, which is known as a risk factor for human arteriosclerosis, is introduced can be obtained. By analyzing these molecularly, biochemically, morphologically, and physiologically, it is possible to efficiently analyze the establishment mechanism of human arteriosclerosis. Based on the knowledge obtained in the analysis process of the disease establishment mechanism, it is expected that development of therapeutic and preventive methods including drug discovery by gene therapy, drug screening, etc. is possible.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010035637A JP5803036B2 (en) | 2010-02-22 | 2010-02-22 | Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010035637A JP5803036B2 (en) | 2010-02-22 | 2010-02-22 | Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011167150A JP2011167150A (en) | 2011-09-01 |
| JP5803036B2 true JP5803036B2 (en) | 2015-11-04 |
Family
ID=44681937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010035637A Expired - Fee Related JP5803036B2 (en) | 2010-02-22 | 2010-02-22 | Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5803036B2 (en) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0941310A1 (en) * | 1996-10-11 | 1999-09-15 | THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM | Methods for the generation of primordial germ cells and transgenic animal species |
-
2010
- 2010-02-22 JP JP2010035637A patent/JP5803036B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011167150A (en) | 2011-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Niemann et al. | Somatic cell nuclear transfer cloning: practical applications and current legislation | |
| Li et al. | Cloned ferrets produced by somatic cell nuclear transfer | |
| AU2002232858B2 (en) | Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells | |
| KR20180091821A (en) | How to manipulate humanized CAR T-cells and platelets by genetic complementarity | |
| CN108697067A (en) | Composition and method prepared by the organ of chimeric embryo-auxiliary | |
| US20230365638A1 (en) | Etv2 and uses thereof | |
| Xie et al. | Sex manipulation technologies progress in livestock: a review | |
| Zhou et al. | Production of myostatin-targeted goat by nuclear transfer from cultured adult somatic cells | |
| JP2002537785A (en) | Genetic modification of somatic cells and their use | |
| KR20210005661A (en) | Pathogen-resistant animals with modified aminopeptidase N (ANPEP) gene | |
| Jeong et al. | Establishment of a canine model of human type 2 diabetes mellitus by overexpressing phosphoenolypyruvate carboxykinase | |
| Gong et al. | Aberrant expression of imprinted genes and their regulatory network in cloned cattle | |
| JP6172699B2 (en) | Hyperlipidemia model pig | |
| CN108882696A (en) | By genetic complement to the engineered of humanization kidney | |
| Olsson et al. | Insights from one thousand cloned dogs | |
| Loi et al. | Asymmetric nuclear reprogramming in somatic cell nuclear transfer? | |
| JP5803036B2 (en) | Production of minipigs expressing human apolipoprotein (a) | |
| EP3185678B1 (en) | Pig model for diabetes | |
| Sasaki | Creating genetically modified marmosets | |
| JP2006522609A (en) | A method for correcting spindle defects associated with somatic cell nuclear transfer in animals | |
| JP5771240B2 (en) | Immunodeficient pig | |
| Chen et al. | Effect of microinjection of a single IVF-derived blastomere on the development of cloned embryos at the eight-cell stage in bovine | |
| WO2005028655A1 (en) | A method for increasing the efficiency of transgenic animal production | |
| Takahashi et al. | Strategy for selective acquisition of transgenic marmosets using the piggyBac transposon system | |
| 정연우 | Production of Transgenic Dogs Carrying Human Phosphoenolpyruvate Carboxykinase and Amyloid Precursor protein Gene by Nuclear Transfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121106 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140507 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140630 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150113 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150804 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150813 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5803036 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |