JP5747260B2 - Method for labeling polynucleotide and method for measuring test substance - Google Patents
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Description
本発明は、アプタマーを介して標識物質をポリヌクレオチドに結合させる新規なポリヌクレオチドの標識方法及び該標識方法を利用した被検物質の測定方法に関する。 The present invention relates to a novel polynucleotide labeling method for binding a labeling substance to a polynucleotide via an aptamer, and a test substance measuring method using the labeling method.
血液中のバイオマーカーの検出は、疾患の早期発見や診断において非常に重要である。バイオマーカーにより求められる検出範囲は異なるが、例えば腫瘍マーカーの場合、多くの重要なマーカータンパク質(CRP, VEGF等)はpMレベルの検出限界が求められる。こういった血液中に微量にしか存在しないバイオマーカーを高感度に検出するためには、シグナルの増幅が必須である。 Detection of biomarkers in blood is very important for early detection and diagnosis of diseases. For example, in the case of a tumor marker, many important marker proteins (CRP, VEGF, etc.) are required to have a pM level detection limit, although the detection range required varies depending on the biomarker. In order to detect such a biomarker present only in a minute amount in blood with high sensitivity, signal amplification is essential.
シグナルの増幅のためには酵素等の標識物質が用いられている。現在バイオマーカーの検出に多用されているELISA法も酵素によるシグナル増幅を行っており、アルカリフォスファターゼやセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素が主に用いられている。また、血糖を電気化学的に検出するグルコースセンサーでは、グルコースオキシダーゼやピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素が用いられている。 A labeling substance such as an enzyme is used for signal amplification. The ELISA method, which is currently widely used for biomarker detection, also performs signal amplification with an enzyme, and an enzyme that catalyzes a coloring reaction such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase is mainly used. In glucose sensors that electrochemically detect blood sugar, oxidoreductases such as glucose oxidase and pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase are used.
ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）は、グルコースに対する触媒活性がおよそ５０００Ｕ／ｍｇと非常に高く、溶存酸素の影響を受けない、また、補酵素との結合が安定であり、EDTA耐性を示すといった利点を持つ。既に確立しているグルコースセンサーのセンシングシステムを利用できるという利点もあり、既存の酵素の中ではセンシング素子として非常に有効な酵素であると考えられる。 Pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase (PQQGDH) has an extremely high catalytic activity on glucose of about 5000 U / mg, is not affected by dissolved oxygen, is stable in binding with a coenzyme, and exhibits EDTA resistance. have. There is also an advantage that a sensing system of an already established glucose sensor can be used, and it is considered that the existing enzyme is a very effective enzyme as a sensing element.
現在の主な酵素の固定化方法には、吸着法、包括法、架橋法、共有結合法の4種類がある。吸着法は、酵素活性が保てる場合が多いが、はがれ易いという欠点がある。また、包括法もよく用いられているが、やはり酵素の漏出が多い。一方、共有結合法、架橋法は強く固定化ができるもの、酵素が失活して活性がなくなってしまうという問題がある。そこで、昔から酵素に対する抗体を使って酵素を固定化できないかという試みが行われてきた。しかし、現在までに、抗体を使って酵素活性を保持したまま酵素を固定化できたという報告はない。 There are currently four main enzyme immobilization methods: adsorption, inclusion, cross-linking, and covalent bonding. In many cases, the adsorption method can maintain the enzyme activity, but has a drawback that it is easily peeled off. Inclusive methods are also often used, but there are still many enzyme leaks. On the other hand, the covalent bond method and the cross-linking method can be strongly immobilized, and there is a problem that the enzyme is deactivated and the activity is lost. Therefore, attempts have been made since long ago to determine whether an enzyme can be immobilized using an antibody against the enzyme. However, to date, there has been no report that the enzyme can be immobilized using the antibody while maintaining the enzyme activity.
一方、任意の分子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドであるアプタマーが知られている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献１)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を５〜１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得することができる。 On the other hand, aptamers that are oligonucleotides that specifically bind to arbitrary molecules are known. Aptamers that specifically bind to a desired target molecule can be produced by a method called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) (Non-patent Document 1). In this method, a target molecule is immobilized on a carrier, a nucleic acid library consisting of nucleic acids having a large number of random base sequences is added to the target molecule, nucleic acids that bind to the target molecule are recovered, and this is amplified by PCR. Again, the target molecule is added to the immobilized carrier. By repeating this step about 5 to 10 times, aptamers with high binding power to the target molecule can be concentrated, the base sequence thereof can be determined, and the aptamer that recognizes the target molecule can be obtained.
この特異的結合性という特性から、アプタマーは分子認識素子としての利用が期待されている。酵素等で標識したDNAアプタマーを用いれば、標的分子を特異的に検出することができる。しかしながら、上記したように、現在用いられている酵素固定化法は、強固な固定化と標識酵素の活性保持とを両立するのが困難である。酵素の活性を低下させずに、酵素を分子認識素子に結合させる方法が求められている。 Due to this specific binding property, aptamers are expected to be used as molecular recognition elements. If a DNA aptamer labeled with an enzyme or the like is used, the target molecule can be specifically detected. However, as described above, it is difficult for the currently used enzyme immobilization method to achieve both strong immobilization and retention of the activity of the labeling enzyme. There is a need for a method of binding an enzyme to a molecular recognition element without reducing the activity of the enzyme.
従って、本発明の目的は、標識酵素の活性を低下させることなく分子認識素子を酵素標識することができる新規な手段を提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel means capable of enzyme labeling a molecular recognition element without reducing the activity of the labeling enzyme.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、酵素の活性を大きく損なうことなく特異的に結合できるアプタマーを酵素標識の仲介物に用いることにより、酵素活性を維持した状態でポリヌクレオチドの標識を容易に行えることを見出し、さらに、かかる標識方法をアプタマーの標識に利用して新規な測定系を構築し、本願発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have made it possible to easily label a polynucleotide while maintaining the enzyme activity by using an aptamer that can specifically bind without significantly impairing the activity of the enzyme as a mediator of the enzyme label. The inventors have found that this can be done, and further constructed a novel measurement system utilizing such a labeling method for aptamer labeling, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、標識物質と、該標識物質に特異的に結合する標識結合性アプタマー領域を含むポリヌクレオチドとを接触させることにより、該アプタマー領域を介して標識物質をポリヌクレオチドに結合させることを含み、前記標識物質が酵素であり、前記標識結合性アプタマー領域は、該酵素の酵素活性を保持した状態で該酵素を結合でき、前記ポリヌクレオチドが所望の標的分子に特異的に結合するアプタマーである、ポリヌクレオチドの標識方法を提供する。また、本発明は、標識物質と、該標識物質に特異的に結合する標識結合性アプタマー領域及び被検物質に特異的に結合する被検物質結合性アプタマー領域を含むポリヌクレオチドと、被検物質を含み得る試料とを接触させ、次いで、前記標識物質及び前記被検物質を結合した前記ポリヌクレオチド中の該標識物質の活性を測定することを含み、前記標識物質が酵素であり、前記標識結合性アプタマー領域は、該酵素の酵素活性を保持した状態で該酵素を結合できる、試料中の被検物質の測定方法を提供する。さらに、本発明は、標識物質に特異的に結合する標識結合性アプタマー領域及び被検物質に特異的に結合する被検物質結合性アプタマー領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記標識物質が酵素であり、前記標識結合性アプタマー領域は、該酵素の酵素活性を保持した状態で該酵素を結合できる、被検物質の測定試薬を提供する。
That is, the present invention allows a labeling substance to bind to a polynucleotide via the aptamer region by contacting the labeling substance with a polynucleotide containing a label-binding aptamer region that specifically binds to the labeling substance. The labeling substance is an enzyme, and the label-binding aptamer region is capable of binding the enzyme while retaining the enzyme activity of the enzyme , and the aptamer that specifically binds the polynucleotide to a desired target molecule der Ru, provides a method of labeling polynucleotides. The present invention also provides a labeling substance, a polynucleotide containing a label-binding aptamer region that specifically binds to the labeling substance and a test substance-binding aptamer region that specifically binds to the test substance, and a test substance And then measuring the activity of the labeling substance in the polynucleotide bound to the labeling substance and the test substance, wherein the labeling substance is an enzyme, and the label binding The sex aptamer region provides a method for measuring a test substance in a sample that can bind the enzyme while maintaining the enzyme activity of the enzyme. Furthermore, the present invention includes a polynucleotide comprising a label-binding aptamer region that specifically binds to a labeling substance and a test substance-binding aptamer region that specifically binds to a test substance, wherein the labeling substance is an enzyme. The label-binding aptamer region provides a measurement reagent for a test substance capable of binding the enzyme while maintaining the enzyme activity of the enzyme.
本発明により、アプタマーを用いた新規な標識方法及び該方法を利用した新規測定系が提供された。アプタマーは、従来、測定対象となる分子を捕捉するために用いられており、これを標識の仲介物として利用するという発想はいままでにない新規な発想である。従来では、測定対象分子を捕捉するためのアプタマーへの標識は、架橋法等の化学結合法により行なわれていたが、かかる方法では強固な結合は達成できるものの標識酵素の活性が著しく損なわれるという問題があった。本発明の方法によれば、標識物質の標識としての活性を保持した状態でポリヌクレオチドに標識を付することができる。標識物質が酵素であっても、本発明の標識方法によれば、その酵素活性を保持した状態でポリヌクレオチドを酵素標識することができる。被検物質を特異的に結合するアプタマーを当該標識方法で標識すれば、標識結合性アプタマーと被検物質結合性アプタマーのそれぞれの特異結合能を利用して、標識量を指標に被検物質を測定可能である。特に、アプタマーの構造変化を利用した新規な測定系の構築も可能である。その一例として、下記実施例に記載される測定系では、標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域とを含むポリヌクレオチドが用いられる。該ポリヌクレオチドは、被検物質が存在しない状態では標識物質の結合が阻害され、被検物質が存在する状態では標識物質が結合できるような構造変化を生じるように構成されており、標識の活性を指標として試料中の被検物質の量を測定することができる。用いるアプタマーの配列を適宜選択することで、様々な被検物質に対して測定系を構築できる。 According to the present invention, a novel labeling method using an aptamer and a novel measurement system using the method are provided. Aptamers are conventionally used to capture molecules to be measured, and the idea of using them as mediators of labels is a novel concept that has never been seen before. Conventionally, the labeling of the aptamer for capturing the molecule to be measured has been performed by a chemical bonding method such as a cross-linking method, but although such a method can achieve strong binding, the activity of the labeling enzyme is significantly impaired. There was a problem. According to the method of the present invention, a polynucleotide can be labeled while retaining the activity of the labeling substance as a label. Even if the labeling substance is an enzyme, according to the labeling method of the present invention, the polynucleotide can be enzyme-labeled while retaining the enzyme activity. If an aptamer that specifically binds a test substance is labeled by the labeling method, the specific binding ability of each of the label-binding aptamer and the test substance-binding aptamer is used to label the test substance using the labeling amount as an index. It can be measured. In particular, it is also possible to construct a new measurement system using aptamer structural changes. As an example, in the measurement system described in the following examples, a polynucleotide containing a label-binding aptamer region and a test substance-binding aptamer region is used. The polynucleotide is configured so that the binding of the labeling substance is inhibited in the absence of the test substance, and the structural change is such that the labeling substance can be bound in the presence of the test substance. The amount of the test substance in the sample can be measured using as an index. By appropriately selecting the aptamer sequence to be used, measurement systems can be constructed for various test substances.
本発明の標識方法では、標識物質である酵素に特異的に結合するアプタマー領域（標識結合性アプタマー領域）をポリヌクレオチドに含ませ、該領域を介してポリヌクレオチドに標識物質である酵素を結合させる。上記の通り、アプタマーは、SELEXのような偶然を積極的に利用する方法により作出されるので、公知のいかなる標識物質である酵素に対しても、これと特異的に結合するアプタマーを作出することが可能である。 In the labeling method of the present invention, an aptamer region (label-binding aptamer region) that specifically binds to an enzyme that is a labeling substance is included in the polynucleotide, and the enzyme that is the labeling substance is bound to the polynucleotide via the region. . As described above, aptamers, since it is produced by a method utilizing accidental such as SELEX positively, against enzymes that are any known labeling substance to produce an aptamer that specifically binds to this Is possible.
標識物質は酵素である。酵素の種類は特に限定されず、免疫測定等の各種測定系において標識として従来用いられているものを好ましく使用することができる。そのような標識酵素の具体例を挙げると、発光反応を触媒するルシフェラーゼや、発色反応を触媒するセイヨウワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼの他、電気化学的に測定可能な反応を触媒するβ−ラクタマーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（例えばピロロキノリンキノングルコースオキシダーゼ等）及びグルコースオキシダーゼ等が挙げられる。中でも、ピロロキノリンキノングルコースオキシダーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）は、グルコースに対し非常に高い活性を有し、標識酵素として有望な酵素である。なお、これら公知の標識酵素のうち、アルカリフォスファターゼについては、特異的に結合するアプタマーが既に報告されている（WO 00/79004 A1）。 Labeling substance is an enzyme. The type of the enzyme is not particularly limited, and those conventionally used as labels in various measurement systems such as immunoassay can be preferably used. Specific examples of such a labeling enzyme include luciferase that catalyzes a luminescent reaction, horseradish peroxidase and alkaline phosphatase that catalyze a coloring reaction, and β-lactamase and glucose that catalyze an electrochemically measurable reaction. Examples include dehydrogenase (for example, pyrroloquinoline quinone glucose oxidase) and glucose oxidase. Among them, pyrroloquinoline quinone glucose oxidase (PQQGDH) has a very high activity with respect to glucose and is a promising enzyme as a labeling enzyme. Of these known labeling enzymes, aptamers that specifically bind have already been reported for alkaline phosphatase (WO 00/79004 A1).
標識結合性アプタマー領域は、標識物質に特異的に結合する能力を有するアプタマー配列からなる。該標識結合性アプタマー領域は、標識物質の標識としての活性を大きく損なうことなく、標識としての使用に十分な活性を保持した状態で標識物質を結合できるものである。すなわち、標識結合性アプタマー領域は、該領域を含むポリヌクレオチドのうちで、該領域に標識を結合したポリヌクレオチドと、標識を結合していないポリヌクレオチドとが識別可能であり、好ましくは、標識を結合したポリヌクレオチドの定量も可能な程度に標識物質の活性が維持された状態で標識物質を結合できる領域である。 The label-binding aptamer region consists of an aptamer sequence having the ability to specifically bind to a labeling substance. The label-binding aptamer region is capable of binding a labeling substance while maintaining sufficient activity for use as a label without significantly impairing the labeling substance's activity as a label. That is, the label-binding aptamer region is capable of discriminating between the polynucleotide containing the region and the polynucleotide bound to the region and the polynucleotide not bound to the label. In this region, the labeling substance can be bound in a state where the activity of the labeling substance is maintained to such an extent that the bound polynucleotide can be quantified.
該領域に採用する標識結合性アプタマーが、そのように標識物質の活性を保持した状態で標識物質を結合できるか否かは、例えば次のようにして調べることができる。プレートのウェルの一部に標識結合性アプタマーを固定化し、このウェル及びアプタマー非固定のウェルに標識物質を添加、洗浄後、標識物質の活性を測定する。標識結合性アプタマーを固定化したウェルにおける標識物質の活性が、アプタマー非固定のウェルにおける標識物質の活性よりも有意に大きく、両者の差がおよそ３〜４倍程度以上あれば、本発明の標識方法における標識結合性アプタマー領域に採用することができる。なお、アプタマー非固定のウェルに加えて、標識物質とは異なる物質への特異的結合能を有する任意のアプタマーを固定化したウェルも準備し、このウェルに非特異的に結合した標識物質の活性を測定して上記評価に加えてもよい。 Whether or not the label-binding aptamer employed in the region can bind the labeling substance in such a state that the activity of the labeling substance is retained can be examined, for example, as follows. A label-binding aptamer is immobilized on a part of the well of the plate, a labeling substance is added to the well and the aptamer-unfixed well, washed, and the activity of the labeling substance is measured. If the activity of the labeling substance in the well in which the label-binding aptamer is immobilized is significantly larger than the activity of the labeling substance in the well in which the aptamer is not immobilized, and the difference between the two is about 3 to 4 times or more, the label of the present invention The label-binding aptamer region in the method can be employed. In addition to the aptamer non-immobilized well, a well in which any aptamer having specific binding ability to a substance different from the labeled substance is prepared, and the activity of the labeled substance non-specifically bound to this well is prepared. May be measured and added to the above evaluation.
なお、本発明において、「標識物質の活性」とは、標識物質が持つ標識としての生理活性その他の機能を意味する。具体的には、酵素活性である。標識物質の活性量は、このような機能の量を常法により測定することで調べることができ、具体的には、基質を添加してその酵素反応量を常法により測定すればよい。
In the present invention, “activity of the labeling substance” means physiological activity or other functions as a label possessed by the labeling substance. Specifically, it is enzyme activity. The active amount of the labeling substance can be examined by measuring the amount of such a function by a conventional method. Specifically, the amount of the enzyme reaction may be measured by a conventional method by adding a substrate.
また、「特異的に結合する」とは、標識物質との特異性及び親和性が高く、反応系内に存在する他の分子への結合が全くないかあるとしても相対的に無視できるほど少量しか結合しないという意味である。特異的結合能の評価は、例えば公知のアプタマーブロッティング法（例えば特開２００８−２３７０４２号公報参照）等により容易に行うことができる。具体的には、メンブレンにアプタマーが結合する標識物質と無関係なタンパク質とを固定化し、これに対してアプタマーを反応させて、両者への結合量を調べればよい。標識物質への結合量が多く、無関係なタンパク質との結合量が全くあるいは殆ど観察されない程度であれば、そのアプタマーの標識物質への特異性及び親和性は高いと判断することができる。また、常法の表面プラズモン共鳴法によっても結合の親和性及び特異性を調べることができる。 In addition, “specifically binds” means that the specificity and affinity with the labeling substance is high, and even if there is no binding to other molecules present in the reaction system, the amount is relatively negligible. It means that they only combine. The specific binding ability can be easily evaluated by, for example, a known aptamer blotting method (see, for example, JP-A-2008-237042). Specifically, a labeling substance to which the aptamer binds to the membrane and an unrelated protein are immobilized, and the aptamer is reacted with this to examine the binding amount to both. If the amount of binding to the labeling substance is large and the amount of binding to an irrelevant protein is not observed at all or almost, it can be judged that the aptamer has high specificity and affinity for the labeling substance. The affinity and specificity of binding can also be examined by a conventional surface plasmon resonance method.
標識結合性アプタマーは、使用する標識物質に応じて適宜選択することができる。上記した通り、アプタマーの作製方法は公知であり、当業者であれば常法により所望の標識物質に特異的に結合するアプタマーを創製することができる。また、既に多数のアプタマーが知られており（例えば、特許文献１; 特許文献２; Hermann et al., (2000) Science 287, 820-825; Osborne SE, Ellington AD. (1997) Chem Rev Apr 1, 97(2), 349-370等）、そのような公知のアプタマーを用いてもよい。例えば、標識物質としてＰＱＱＧＤＨを用いる場合、ＰＱＱＧＤＨに特異的に結合し、かつその酵素活性を標識としての使用に十分な程度に保持した状態で結合できるＰＱＱＧＤＨ結合性アプタマーの例としては、下記実施例で用いられているアプタマー（配列番号２）を挙げることができる。 The label-binding aptamer can be appropriately selected depending on the labeling substance to be used. As described above, aptamer production methods are known, and those skilled in the art can create an aptamer that specifically binds to a desired labeling substance by a conventional method. Many aptamers are already known (for example, Patent Document 1; Patent Document 2; Hermann et al., (2000) Science 287, 820-825; Osborne SE, Ellington AD. (1997) Chem Rev Apr 1 97 (2), 349-370, etc.), such known aptamers may be used. For example, when PQQGDH is used as a labeling substance, examples of PQQGDH-binding aptamers that specifically bind to PQQGDH and can be bound in a state where the enzyme activity is maintained at a level sufficient for use as a label include the following examples. And the aptamer (SEQ ID NO: 2) used in the above.
標識すべきポリヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよく、またPNA等の人工核酸でもよいが、安定性及び合成の容易さ等の観点からはDNAが好ましい。また、ポリヌクレオチドの具体例としては、特に限定されないが、核酸の増幅や測定に用いるプライマー及びプローブ、並びに標的分子への特異的な結合能を有するアプタマー等を挙げることができる。所望の標的分子に特異的に結合するアプタマーの創製方法は上記した通り公知であり（非特許文献２等）、既に種々のアプタマーが報告され利用されている（例えば、Hermann et al., (2000) Science 287, 820-825; Osborne SE, Ellington AD. (1997) Chem Rev Apr 1, 97(2), 349-370等）。なお、アプタマーのサイズは特に限定されないが、通常15mer程度〜200mer程度である。 The polynucleotide to be labeled may be DNA or RNA, or may be an artificial nucleic acid such as PNA, but DNA is preferred from the viewpoint of stability and ease of synthesis. Specific examples of the polynucleotide include, but are not limited to, primers and probes used for nucleic acid amplification and measurement, and aptamers having a specific binding ability to a target molecule. Methods for creating aptamers that specifically bind to a desired target molecule are known as described above (Non-patent Document 2 etc.), and various aptamers have already been reported and used (for example, Hermann et al., (2000 Science 287, 820-825; Osborne SE, Ellington AD. (1997) Chem Rev Apr 1, 97 (2), 349-370, etc.). The size of the aptamer is not particularly limited, but is usually about 15 mer to about 200 mer.
標識すべきポリヌクレオチドには、任意に部位に標識結合性アプタマー領域を含ませる。すなわち、ポリヌクレオチドの塩基配列中の任意の部位に標識結合性アプタマー配列を含ませる。ポリヌクレオチド中における標識結合性アプタマー領域の設定部位は特に限定されず、ポリヌクレオチドの末端部でもよいし、内部でもよい。例えば、標識すべきポリヌクレオチドがプローブやプライマー、アプタマー等である場合、かかるポリヌクレオチドのいずれかの末端部に直接又は適宜スペーサー配列等を介して連結させた構造にすることができる。 The polynucleotide to be labeled optionally includes a label-binding aptamer region at the site. That is, a label-binding aptamer sequence is included at an arbitrary site in the polynucleotide base sequence. The setting site of the label-binding aptamer region in the polynucleotide is not particularly limited, and may be the terminal portion of the polynucleotide or the inside thereof. For example, when the polynucleotide to be labeled is a probe, primer, aptamer or the like, a structure in which such a polynucleotide is linked directly or appropriately through a spacer sequence or the like can be used.
上記した標識方法をアプタマーに適用することで、アプタマーの特異的結合能を利用した測定系を構築することができる。本願発明者らは、上記標識方法を利用した新規な被検物質測定系を構築した。以下、上記標識方法を利用したアプタマーによる被検物質の測定方法について説明する。 By applying the labeling method described above to an aptamer, a measurement system using the specific binding ability of the aptamer can be constructed. The inventors of the present application constructed a novel test substance measurement system using the labeling method. Hereinafter, a method for measuring a test substance using an aptamer using the labeling method will be described.
本発明の測定方法において標識対象となるポリヌクレオチドは、被検物質に特異的に結合するアプタマー（被検物質結合性アプタマー）である。言い換えると、該測定方法において用いるポリヌクレオチドは、上記した標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域とを含む。以下、便宜的に、これら２つの領域を含むポリヌクレオチドを「測定用ポリヌクレオチド」と呼ぶ。測定用ポリヌクレオチドにおいて、標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域とは、いずれが5'側に配置されていてもよい。下記実施例では標識結合性アプタマー領域が被検物質結合性アプタマーの5'側に配置されているが、これとは逆であってもよい。 The polynucleotide to be labeled in the measurement method of the present invention is an aptamer that specifically binds to a test substance (test substance-binding aptamer). In other words, the polynucleotide used in the measurement method includes the label-binding aptamer region and the test substance-binding aptamer region described above. Hereinafter, for convenience, a polynucleotide comprising these two regions is referred to as a “measurement polynucleotide”. In the measurement polynucleotide, either the label-binding aptamer region or the test substance-binding aptamer region may be arranged on the 5 ′ side. In the following examples, the label-binding aptamer region is arranged on the 5 ′ side of the test substance-binding aptamer, but this may be reversed.
標識結合性アプタマー領域の条件は上記と同様である。すなわち、標識物質を結合しないポリヌクレオチドと標識物質を結合したポリヌクレオチドとが標識物質の活性量によって識別可能であり、かつ、好ましくは標識物質を結合したポリヌクレオチドを標識物質の活性量によって定量可能である程度に標識物質の活性が維持された状態で標識物質を結合できるものである。 The conditions for the label-binding aptamer region are the same as described above. In other words, a polynucleotide that does not bind a labeling substance and a polynucleotide that binds a labeling substance can be distinguished by the amount of activity of the labeling substance, and preferably the polynucleotide bound by the labeling substance can be quantified by the amount of activity of the labeling substance. The labeling substance can be bound in a state where the activity of the labeling substance is maintained to some extent.
該測定用ポリヌクレオチドは、標識物質と被検物質とをそれぞれの対応する領域に同時に結合できるものである。すなわち、一方の結合が他方の結合を阻害しないものである。この点において、本発明の測定方法は、被検物質の結合により既に結合していた標識酵素がアプタマー領域から離脱する公知のＡＥＳとは大きく相違する。 The measurement polynucleotide is capable of simultaneously binding a labeling substance and a test substance to the corresponding regions. That is, one bond does not inhibit the other bond. In this respect, the measurement method of the present invention is greatly different from the known AES in which the labeled enzyme already bound by the binding of the test substance is released from the aptamer region.
測定用ポリヌクレオチドとしては、被検物質が存在する状態において、存在しない状態よりも有意に多く標識物質が結合できるものを用いることが好ましい。すなわち、被検物質が存在しない状態では標識結合性アプタマー領域への標識物質の結合が阻害されるが、被検物質が存在する状態では標識結合性アプタマー領域に標識物質が結合できるものであることが好ましい。本明細書において、このような機能を便宜的に「構造スイッチング」と呼ぶ。かかる測定用ポリヌクレオチドによれば、標識物質が結合したポリヌクレオチドにはほぼ必ず被検物質も結合していることになるため、標識物質のみが結合したポリヌクレオチドの生成を抑制することができ、より正確に被検物質を測定することができる。 As the polynucleotide for measurement, it is preferable to use a polynucleotide to which a labeled substance can bind significantly more in the state where the test substance exists than in the state where the test substance does not exist. That is, the binding of the labeling substance to the label-binding aptamer region is inhibited in the absence of the test substance, but the labeling substance can bind to the label-binding aptamer area in the state of the test substance. Is preferred. In this specification, such a function is called “structural switching” for convenience. According to such a polynucleotide for measurement, since the test substance is almost always bound to the polynucleotide bound to the labeling substance, the production of the polynucleotide bound only to the labeling substance can be suppressed, The test substance can be measured more accurately.
そのようなポリヌクレオチドは、例えば次のような構成にすることにより達成できる。分子内には、相互に相補的な領域が存在する。すなわち、ポリヌクレオチド分子内には、ある部分配列とそれに対して相補的な配列とが存在する。被検物質が存在しない状態では、この領域が分子内ハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成し、これにより標識結合性アプタマー領域が所期の立体構造を形成できなくなる。そうすると、標識結合性アプタマー領域はその特異結合能を発揮できなくなるので、標識物質を結合することができなくなる。すなわち、上記した分子内ハイブリダイゼーションによる二本鎖形成により、標識物質の標識結合性アプタマー領域への結合が阻害されることになる。本発明において、このような、標識物質結合性アプタマーの立体構造形成を妨害する相互に相補的な領域を「二本鎖形成領域」という。 Such a polynucleotide can be achieved, for example, by adopting the following constitution. Within the molecule, there are regions that are complementary to each other. In other words, a partial sequence and a sequence complementary thereto are present in the polynucleotide molecule. In the absence of the test substance, this region forms a double strand by intramolecular hybridization, which prevents the label-binding aptamer region from forming the desired three-dimensional structure. Then, since the label-binding aptamer region cannot exhibit its specific binding ability, it cannot bind the labeling substance. That is, the above-described double-strand formation by intramolecular hybridization inhibits the binding of the labeling substance to the label-binding aptamer region. In the present invention, such mutually complementary regions that interfere with the formation of the three-dimensional structure of the labeling substance-binding aptamer are referred to as “double-strand forming regions”.
該二本鎖形成領域は、必ずしもいずれかのアプタマー領域内の配列を含む必要はなく、別途追加した塩基配列とその相補配列とからなるものであってもよいが、少なくとも一部にいずれかのアプタマー領域内の配列を含むことが好ましい。言い換えると、二本鎖形成領域は、いずれかのアプタマー領域内の部分配列とその相補配列とを含むことが好ましい。特に、標識結合性アプタマー領域内の部分配列とその相補鎖を含むことが好ましい。このように構成すると、二本鎖形成によりそれぞれのアプタマーが所期の立体構造をとることが妨害され、その結果、標識物質の標識結合アプタマー領域への結合が阻害される。とりわけ、標識結合性アプタマー領域内の部分配列とその相補鎖とからなる二本鎖形成領域を設けると、被検物質の非存在下では標識結合性アプタマー領域が所期の立体構造をとりにくくなる可能性が高く、一方で被検物質存在下では被検物質結合性アプタマー領域が所期の立体構造をとることにより上記した二本鎖形成が解かれて標識結合性アプタマー領域がその立体構造をとりやすくなると考えられ、被検物質の有無による構造スイッチングがより好ましく生じると考えられる。二本鎖形成領域がアプタマー領域内の部分配列を含む場合、その部分配列は、アプタマー領域の全長以下、好ましくは全長の半分以下であり、採用するアプタマー領域の長さにもよるが、通常は5mer〜20mer程度である。 The double-stranded forming region does not necessarily include a sequence in any aptamer region, and may comprise a separately added base sequence and its complementary sequence, but at least a portion of It preferably includes a sequence within the aptamer region. In other words, the double-stranded forming region preferably includes a partial sequence in any aptamer region and its complementary sequence. In particular, it preferably includes a partial sequence in the label-binding aptamer region and its complementary strand. If comprised in this way, formation of a double strand will prevent each aptamer from taking the desired three-dimensional structure, As a result, the coupling | bonding to the label | marker binding aptamer area | region of a labeling substance will be inhibited. In particular, if a double-stranded forming region consisting of a partial sequence in the label-binding aptamer region and its complementary strand is provided, the label-binding aptamer region will not easily take the desired three-dimensional structure in the absence of the test substance. On the other hand, in the presence of the test substance, the test substance-binding aptamer region takes the desired three-dimensional structure, so that the above-mentioned double-strand formation is released, and the label-binding aptamer area changes its three-dimensional structure. It is considered that the structure switching is more preferably caused by the presence or absence of the test substance. When the double-stranded forming region includes a partial sequence in the aptamer region, the partial sequence is not more than the full length of the aptamer region, preferably not more than half of the full length, usually depending on the length of the aptamer region employed, It is about 5mer to 20mer.
二本鎖形成領域によって形成される二本鎖構造は、標識結合性アプタマー領域内部に位置していてもよいし、標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域との間に位置していてもよい。以下、前者を第１の形態、後者を第２の形態として、各形態について具体的に説明する。 The double-stranded structure formed by the double-stranded forming region may be located inside the label-binding aptamer region or between the label-binding aptamer region and the test substance-binding aptamer region. May be. Hereinafter, each form will be specifically described with the former as the first form and the latter as the second form.
第１の形態の具体例を図１に示す。この例によれば、二本鎖形成領域は標識結合性アプタマー領域内の部分配列とその相補配列により構成され、二本鎖形成領域により形成される二本鎖領域は標識結合性アプタマー領域内部に含まれる。相補配列は、被検物質結合性アプタマーに隣接してポリヌクレオチド分子の末端部に好ましく設けられる。被検物質（図１中ではインスリン）と接触すると、被検物質結合性アプタマー領域がその所期の立体構造をとって被検物質と結合する。そうすると、二本鎖形成領域におけるハイブリダイゼーションが解かれ、標識結合性アプタマー領域がフリーになるので、標識結合性アプタマー領域もその所期の立体構造を形成して特異結合能を発揮できる状態となり、標識物質を結合するようになる。 A specific example of the first embodiment is shown in FIG. According to this example, the double-stranded region is composed of a partial sequence in the label-binding aptamer region and its complementary sequence, and the double-stranded region formed by the double-stranded region is located inside the label-binding aptamer region. included. The complementary sequence is preferably provided at the end of the polynucleotide molecule adjacent to the test substance binding aptamer. When contacted with a test substance (insulin in FIG. 1), the test substance-binding aptamer region takes its intended three-dimensional structure and binds to the test substance. Then, the hybridization in the double-stranded forming region is released and the label-binding aptamer region becomes free, so that the label-binding aptamer region also forms its intended three-dimensional structure and can exhibit its specific binding ability. The labeling substance becomes bound.
第２の形態の具体例を図２に示す。この例によれば、二本鎖形成領域は標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域の間に設けられ、二本鎖形成領域により形成される二本鎖領域は両アプタマー領域の間に位置する。二本鎖形成が円滑に行なわれるよう、相互に相補な配列の間にはスペーサー配列が設けられ、二本鎖形成時にはこのスペーサー配列がループ状になる。二本鎖形成領域には、部分的に標識結合性アプタマー領域内の配列が含まれており、別途追加した相互に相補な配列と共に二本鎖を形成する。もっとも、二本鎖形成領域は、標識結合性アプタマー領域内の部分配列とその相補鎖のみからなるものであってもよく、別途追加した相互に相補的な配列は必ずしも存在しなくてよい。また、被検物質結合性アプタマー領域がこの二本鎖形成に関わっていてもよい。すなわち、二本鎖形成領域には、被検物質結合性アプタマー領域内の配列とその相補配列が含まれていてもよい。 A specific example of the second embodiment is shown in FIG. According to this example, the double-stranded region is provided between the label-binding aptamer region and the test substance-binding aptamer region, and the double-stranded region formed by the double-stranded region is between both aptamer regions. Located in. A spacer sequence is provided between sequences complementary to each other so that double strand formation can be carried out smoothly. When the double strand is formed, this spacer sequence becomes a loop. The double-stranded forming region partially includes the sequence in the label-binding aptamer region, and forms a double strand together with a mutually added complementary sequence. However, the double-stranded forming region may be composed only of a partial sequence in the label-binding aptamer region and its complementary strand, and a mutually added complementary sequence may not necessarily exist. Further, the test substance-binding aptamer region may be involved in this double strand formation. That is, the double-stranded forming region may include a sequence in the test substance binding aptamer region and its complementary sequence.
被検物質が存在しない状態では、二本鎖形成領域がハイブリダイズして二本鎖を形成し、ポリヌクレオチド全体としては、ステムループ構造の末端に標識結合性アプタマー領域と被検物質結合性アプタマー領域とが連結したような形態をとる。被検物質（図２ではトロンビン）と接触すると、被検物質結合性アプタマー領域がその所期の立体構造をとって被検物質と結合する。そうすると、二本鎖形成領域におけるハイブリダイゼーションが解かれ、標識結合性アプタマー領域がフリーになるので、標識結合性アプタマー領域もその所期の立体構造を形成して特異結合能を発揮できる状態となり、標識物質を結合するようになる。 In the absence of the test substance, the double-stranded forming region hybridizes to form a double strand, and as a whole polynucleotide, the label-binding aptamer region and the test substance-binding aptamer at the end of the stem loop structure It takes the form that the area is connected. When contacted with a test substance (thrombin in FIG. 2), the test substance-binding aptamer region takes its intended three-dimensional structure and binds to the test substance. Then, the hybridization in the double-stranded forming region is released and the label-binding aptamer region becomes free, so that the label-binding aptamer region also forms its intended three-dimensional structure and can exhibit its specific binding ability. The labeling substance becomes bound.
第２の形態では、被検物質結合性アプタマー領域がその立体構造を形成したときに、その立体構造が安定に維持され且つ標識結合性アプタマー領域が二本鎖形成から安定的にフリーになるよう、被検物質結合性アプタマー領域の外側末端（すなわち二本鎖形成領域に隣接しない方の末端部）に、二本鎖形成領域内の配列と相補的な配列をさらに付加してもよい。このさらなる相補鎖は、被検物質結合性アプタマー領域の他方の末端に連結する二本鎖形成領域の少なくとも一部と相補である（つまり、図２の例では、標識結合性アプタマー領域内の配列と同一になる）。このようなさらなる相補鎖があると、被検物質結合性アプタマーがその立体構造をとったときに、標識結合性アプタマー領域との間で形成されていた二本鎖が解かれ、さらなる相補鎖の方と二本鎖が形成されやすくなるので、上記した構造スイッチングをより安定的に達成することができる。 In the second embodiment, when the test substance-binding aptamer region forms its three-dimensional structure, the three-dimensional structure is stably maintained, and the label-binding aptamer region is stably free from double-stranded formation. In addition, a sequence complementary to the sequence in the double-stranded forming region may be further added to the outer end of the test substance-binding aptamer region (that is, the end not adjacent to the double-stranded forming region). This further complementary strand is complementary to at least a part of the double-stranded forming region linked to the other end of the analyte-binding aptamer region (that is, in the example of FIG. 2, the sequence in the label-binding aptamer region). Is the same). When such an additional complementary strand is present, when the analyte-binding aptamer takes its three-dimensional structure, the duplex formed with the label-binding aptamer region is released, and the additional complementary strand is released. Therefore, the above-described structural switching can be achieved more stably.
上記いずれの形態においても、構成単位となる各種領域の連結部分には、適宜スペーサー配列を設けてもよい。測定用ポリヌクレオチド全体のサイズの上限は特に限定されず、基本的には採用する標識結合性アプタマー領域及び被検物質結合性アプタマー領域のサイズに応じて定まる。ただし、あまりに長いと合成の手間とコストがかかるため、測定用ポリヌクレオチドのサイズは通常200mer程度以下である。 In any of the above forms, a spacer sequence may be appropriately provided at the connecting portion of various regions serving as structural units. The upper limit of the overall size of the measurement polynucleotide is not particularly limited, and is basically determined according to the sizes of the label-binding aptamer region and the test substance-binding aptamer region to be employed. However, if it is too long, it takes time and cost for synthesis, and the size of the polynucleotide for measurement is usually about 200 mer or less.
本発明の測定方法では、上記した測定用ポリヌクレオチドを、被検物質を含み得る試料及び標識物質と接触させる。そうすると、測定用ポリヌクレオチドには標識物質と被検物質との両者が結合し、［標識物質］−［測定用ポリヌクレオチド］−［被検物質］の複合体が形成される。試料中に存在する被検物質の量が多ければそれだけ該複合体の形成量が多くなる。従って、該複合体中の標識物質の活性を測定すれば、この活性を指標として試料中の被検物質の量を測定することができる。 In the measurement method of the present invention, the above-described measurement polynucleotide is brought into contact with a sample that may contain a test substance and a labeling substance. Then, both the labeling substance and the test substance bind to the measurement polynucleotide, and a complex of [labeling substance]-[measurement polynucleotide]-[test substance] is formed. The greater the amount of test substance present in the sample, the greater the amount of complex formation. Therefore, if the activity of the labeling substance in the complex is measured, the amount of the test substance in the sample can be measured using this activity as an index.
複合体を形成した標識物質と形成しなかった非結合の標識物質との分離（Ｂ／Ｆ分離）を容易にする観点から、測定用ポリヌクレオチドは固相上に固定化されていることが好ましい。固相上に固定化したものを用いれば、測定用ポリヌクレオチドと被検物質と標識物質とが結合した複合体が固相上に形成され、標識物質は測定用ポリヌクレオチドを介して固相上に捕捉されることになるので、固相を洗浄することにより容易にＢ／Ｆ分離を達成できる。固相の種類は特に限定されず、従来の免疫測定に用いられる固相を好ましく用いることができる。具体例としては、磁気ビーズ、樹脂ビーズ、プレート等を挙げることができる。測定用ポリヌクレオチドの固相への固定化部位は特に限定されず、標識結合性アプタマー領域が存在する方の末端で固定化してもよいし、被検物質結合性アプタマー領域が存在する方の末端で固定化してもよい。 From the viewpoint of facilitating separation (B / F separation) between the labeling substance that has formed the complex and the non-binding labeling substance that has not been formed, the measurement polynucleotide is preferably immobilized on a solid phase. . If the substance immobilized on the solid phase is used, a complex in which the measurement polynucleotide, the test substance, and the labeling substance are combined is formed on the solid phase, and the labeling substance is formed on the solid phase via the measurement polynucleotide. Therefore, B / F separation can be easily achieved by washing the solid phase. The kind of solid phase is not particularly limited, and a solid phase used for conventional immunoassay can be preferably used. Specific examples include magnetic beads, resin beads, plates, and the like. The immobilization site of the measurement polynucleotide to the solid phase is not particularly limited, and may be immobilized at the end where the label-binding aptamer region exists, or the end where the test substance-binding aptamer region exists. It may be fixed with.
標識物質の活性の測定は、用いる標識物質の種類に応じて常法により容易に行なうことができる。例えば、標識物質としてＰＱＱＧＤＨを用いた場合には、ＰＱＱＧＤＨの基質を添加して酵素反応の量を測定すればよく、具体的には、例えば、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び2,6−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）等の適当な活性試薬を含む溶液中で、基質であるグルコースを反応させ、吸光度を測定することにより、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を容易に測定することができる。 The activity of the labeling substance can be easily measured by a conventional method depending on the type of labeling substance used. For example, when PQQGDH is used as a labeling substance, the amount of enzyme reaction may be measured by adding a substrate of PQQGDH. Specifically, for example, phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichlorophenol are used. The enzyme activity of PQQGDH can be easily measured by reacting glucose as a substrate in a solution containing an appropriate active reagent such as indophenol (DCIP) and measuring the absorbance.
測定対象となる被検物質は、それと特異的に結合するアプタマーが作成可能なものであれば何ら限定されない。具体例を挙げると、種々のタンパク質（糖タンパク質やリポタンパク質等のタンパク複合体を包含する）、糖類（多糖類、少糖類及び単糖類並びに糖脂質のような糖複合体を包含する）、脂質、核酸、低分子化合物等を例示することができる。上記の通り、アプタマーは、SELEXのような、偶然を積極的に利用する方法により作出されるので、ほとんど全ての被検物質に対して、これと特異的に結合するアプタマーを作出することが可能である。下記実施例に記載されるアプタマーを利用した測定系では、インスリンを被検物質としているが、上記の通り被検物質はこれに限定されるものではなく、好ましい具体例として、疾病のマーカー分子となるグルカゴンや、肝臓ガンマーカーとなるαフェトプロテイン、消化器ガンマーカーであるCEA、前立腺ガンマーカーのPSA、卵巣ガンマーカーのCA125、膵臓ガンマーカーのCA19-9、各種感染症のマーカーとなるHIVウイルス抗体、C型肝炎ウイルス抗体、A型肝炎ウイルス抗体、B型肝炎ウイルス抗体等を挙げることができる。 The test substance to be measured is not limited as long as an aptamer that specifically binds to it can be produced. Specific examples include various proteins (including protein complexes such as glycoprotein and lipoprotein), saccharides (including polysaccharide complexes such as polysaccharides, oligosaccharides and monosaccharides, and glycolipids), lipids , Nucleic acids, low molecular weight compounds and the like. As described above, since aptamers are created by a method that actively uses chance, such as SELEX, it is possible to create aptamers that specifically bind to almost all analytes. It is. In the measurement system using an aptamer described in the following examples, insulin is used as a test substance, but as described above, the test substance is not limited to this, and a preferable specific example includes a disease marker molecule and Glucagon, α-fetoprotein as a liver cancer marker, CEA as a digestive cancer marker, PSA as a prostate cancer marker, CA125 as an ovarian cancer marker, CA19-9 as a pancreatic cancer marker, HIV virus antibodies as markers for various infectious diseases , Hepatitis C virus antibody, hepatitis A virus antibody, hepatitis B virus antibody and the like.
測定に用いられる試料は、上記した被検物質を含み得る試料であれば特に限定されない。好ましい具体例としては、ヒト等の動物由来の体液（全血、血漿、血清、尿等）及びその希釈物、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、並びに組織又は細胞の抽出物等が挙げられる。 The sample used for the measurement is not particularly limited as long as it can contain the above-described test substance. Preferable specific examples include body fluids (whole blood, plasma, serum, urine, etc.) derived from animals such as humans and their dilutions, nasal swabs, throat swabs, and tissue or cell extracts.
上記した測定用ポリヌクレオチドは、被検物質の測定試薬として提供することができる。該測定試薬は、測定用ポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいし、該ポリヌクレオチドの安定化等に有用な保存剤等の他の成分を含んでいてもよい。また、該測定用ポリヌクレオチドは、既に固相に固定化された状態であってもよいし、あるいは、使用者が所望の固相に容易に固定化できるように、汎用の標識等を付加したものであってもよい。例えば、公知のアビジン被覆プレートに固定化できるように、ビオチン標識が付加されたものであってもよい。 The above-described measurement polynucleotide can be provided as a measurement reagent for a test substance. The measurement reagent may be composed only of a measurement polynucleotide, or may contain other components such as a preservative useful for stabilizing the polynucleotide. In addition, the measurement polynucleotide may be already immobilized on a solid phase, or a general-purpose label or the like is added so that the user can easily immobilize on a desired solid phase. It may be a thing. For example, a biotin label may be added so that it can be immobilized on a known avidin-coated plate.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１．アプタマー固定化ビーズを用いたPQQGDH酵素活性の検討
市販のNeutrAvidinビーズ（PIERCE社製）の表面にPQQGDH結合性アプタマーを固定化することにより、アプタマーを介してPQQGDHをビーズに固定化し、ビーズ上のPQQGDHの活性を調べた。
1. Examination of PQQGDH enzyme activity using aptamer-immobilized beads By immobilizing PQQGDH-binding aptamer on the surface of commercially available NeutrAvidin beads (manufactured by PIERCE), PQQGDH is immobilized on beads via aptamers and PQQGDH on the beads The activity of was examined.
本実験で用いたPQQGDH結合性アプタマーPGa4（配列番号２）は、配列番号１に示す30merのランダム配列を含むランダムssDNAライブラリーからSELEX法によるスクリーニングを経て創製されたものである。具体的には、ＰＱＱＧＤＨと競合タンパク質（C-reactive protein及びAlpha-fetoprotein）とを固定化したニトロセルロース膜を用いて、この膜に対してランダムライブラリーを反応させ、ＰＱＱＧＤＨに結合したssDNAを回収する、という操作を７ラウンド繰り返すことにより創製されたものである。 The PQQGDH-binding aptamer PGa4 (SEQ ID NO: 2) used in this experiment was created from a random ssDNA library containing a 30-mer random sequence shown in SEQ ID NO: 1 through screening by the SELEX method. Specifically, using a nitrocellulose membrane in which PQQGDH and competitor proteins (C-reactive protein and Alpha-fetoprotein) are immobilized, a random library is reacted with this membrane to recover ssDNA bound to PQQGDH. It was created by repeating the operation of "doing" seven rounds.
NeutrAvidinビーズ20μLにビオチン修飾したアプタマーを1 nmol加え、binding buffer (100 mM phosphate、150 mM NaCl2, pH 7.2)で全量500μLになるよう1.5 mlチューブに調製し、室温で1時間撹拌することでアプタマーをNeutrAvidinビーズに固定化した。その後、遠心分離によりビーズを回収し、TBS (10 mM Tris-HCl、5 mM KCl、150 mM NaCl, pH 7.4)で洗浄し、0.4 mM biotin 500μL中で15分間、1 %ブロッキングbuffer 500μL中で1時間撹拌しブロッキングした。CaCl2、PQQを1 mM、1μMとなるように加えてホロ化を行ったPQQGDHを、10 nM〜10μMとなるように調製し、作製したDNA固定化ビーズ2μLに添加して室温で15分間撹拌した。その後、遠心分離によってPQQGDH-DNA固定化ビーズを沈殿させ、余分なPQQGDHを含む上清を取り除いた。reaction bufferで何度か洗浄した後、180μL TBS、10μL活性試薬（終濃度0.06 mM DCIP及び0.6 mM PMS）、10μLグルコース（終濃度60 mM）を添加して、アプタマーを介してビーズに固定化されたPQQGDHの酵素活性を測定した。また、コントロールとして、アプタマーと同様の条件でInitial（配列番号１に示すランダムライブラリー）を固定化したビーズも作製し、その活性測定を行った。 Add 1 nmol of biotin-modified aptamer to 20 μL of NeutrAvidin beads, prepare 1.5 ml tube with a binding buffer (100 mM phosphate, 150 mM NaCl 2 , pH 7.2) to a total volume of 500 μL, and stir at room temperature for 1 hour. Was immobilized on NeutrAvidin beads. The beads are then collected by centrifugation, washed with TBS (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), and washed in 500 μL of 0.4 mM biotin for 15 minutes, 1 in 500 μL of 1% blocking buffer. Stir for hours to block. Prepare PQQGDH, which was hololated by adding CaCl 2 and PQQ to 1 mM and 1 μM, and add to 10 μM to 10 μM, add to 2 μL of the prepared DNA-immobilized beads, and stir at room temperature for 15 minutes. did. Thereafter, PQQGDH-DNA-immobilized beads were precipitated by centrifugation, and the supernatant containing excess PQQGDH was removed. After washing several times with reaction buffer, 180 μL TBS, 10 μL active reagent (final concentration 0.06 mM DCIP and 0.6 mM PMS), 10 μL glucose (final concentration 60 mM) are added, and immobilized on the beads via the aptamer. The enzyme activity of PQQGDH was measured. Further, as a control, beads were prepared by immobilizing Initial (random library shown in SEQ ID NO: 1) under the same conditions as aptamers, and the activity was measured.
PQQGDHの酵素活性測定は、PMS-DCIP系を用い（終濃度0.06 mM DCIP、0.6 mM PMS）、DCIPの600 nmの吸光度変化を追跡し、その吸光度の減少を酵素の反応速度とした。このとき1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活性を1 Uとした。またDCIPのpH 7.0におけるモル吸光係数は16.3 mM-1とした。 The enzyme activity of PQQGDH was measured using the PMS-DCIP system (final concentrations 0.06 mM DCIP, 0.6 mM PMS), and the change in absorbance at 600 nm of DCIP was followed. The decrease in absorbance was regarded as the enzyme reaction rate. At this time, the enzyme activity that reduces 1 μmol of DCIP per minute was defined as 1 U. The molar extinction coefficient of DCIP at pH 7.0 was 16.3 mM- 1 .
アプタマーに固定化したPQQGDHの活性測定結果を図３に示す。PGa4アプタマーを固定化したビーズに、100 nMのPQQGDHを添加したサンプルでは、56 mU/ml程度の活性値を示したのに対し、Initialを固定化したビーズでは20 mU/ml程度の値であった。よって、PGa4にPQQGDHが固定化され、かつ固定化された状態で活性を維持していることが示唆された。PQQGDHの5000 U/mlという高い活性値を考えると、今回得られた活性値は非常に小さかったが、固定化されたPQQGDHが活性を維持していることが確認できた。 The results of measuring the activity of PQQGDH immobilized on the aptamer are shown in FIG. The sample with 100 nM PQQGDH added to the beads immobilized with PGa4 aptamer showed an activity value of about 56 mU / ml, whereas the beads with immobilized Immobil were about 20 mU / ml. It was. Therefore, it was suggested that PQQGDH was immobilized on PGa4 and maintained in an immobilized state. Considering the high activity value of PQQGDH of 5000 U / ml, the activity value obtained this time was very small, but it was confirmed that the immobilized PQQGDH maintained the activity.
２．アプタマー固定化プレートを用いたPQQGDH酵素活性の検討
市販のNeutra Avidin固定化プレートをTBS (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)で10回洗浄し、1 wellごとにビオチン修飾アプタマーを50 pmol/100μL加え、室温で1時間振とうすることで固定化した。200μL TBST (10 mM Tris-HCl、5 mM KCl、150 mM NaCl, 0.05% Tween, pH 7.4)で10回洗浄し、2%スキムミルク溶液で1時間ブロッキングを行った。洗浄を10回行った後、種々の濃度のホロ化PQQGDHを添加し、30分間振とうした。洗浄を6回（最後の2回は、tweenを含まないTBSを用いて洗浄した）した後、180μL TBS、10μL活性試薬（終濃度0.06 mM DCIP及び0.6 mM PMS）、10μLグルコース（終濃度25 mM）を添加して、アプタマーを介してプレートに固定化されたPQQGDHの酵素活性を上記したPMS-DCIP系を用いて測定した。
2. Examination of PQQGDH enzyme activity using aptamer-immobilized plates Wash commercially available Neutra Avidin-immobilized plates 10 times with TBS (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), and biotin every well. The modified aptamer was added at 50 pmol / 100 μL and immobilized by shaking for 1 hour at room temperature. The plate was washed 10 times with 200 μL TBST (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween, pH 7.4), and blocked with a 2% skim milk solution for 1 hour. After 10 washes, different concentrations of holo-PQQGDH were added and shaken for 30 minutes. After 6 washes (last 2 were washed with TBS without tween), 180 μL TBS, 10 μL active reagent (final concentrations 0.06 mM DCIP and 0.6 mM PMS), 10 μL glucose (final concentration 25 mM) ) And the enzyme activity of PQQGDH immobilized on the plate via the aptamer was measured using the PMS-DCIP system described above.
測定結果を図４に示す。DNAを固定化していないときは、ほぼGDH活性は確認されなかったのに対し（図４中の「-DNA」）、PGa4を固定化したウェルでは固定化しなかった場合の約4倍の活性値を得た。PGa4に結合したPQQGDHの活性値を算出したところ、約26 U/mgとなり、PQQGDHの5000 U/mgという高い活性を考えるとこの値は低いものの、ウェルに固定化したPGa4に結合したPQQGDHは活性を保持していることが明らかになった。 The measurement results are shown in FIG. When DNA was not immobilized, almost no GDH activity was confirmed (“-DNA” in FIG. 4), whereas the PGa4 immobilized well had an activity value about 4 times that when not immobilized. Got. The activity value of PQQGDH bound to PGa4 was calculated to be about 26 U / mg. Considering the high activity of 5000 U / mg of PQQGDH, this value is low, but PQQGDH bound to PGa4 immobilized on the well is active. It was revealed that
３．インスリンアプタマーと組み合わせたssDNAの設計
インスリンアプタマー（IGA3、配列番号３）は、全長66 merのうちプライマー領域を除いた30 merのものを用いた。立体構造予測の結果から、このアプタマーはGカルテット構造を形成していると考えられている。解離定数は20μM以上であると予測できるが、正確な値は算出されていない。本研究では、このアプタマーとPGa4アプタマーを連結させ、一部にインスリンアプタマーまたはPGa4アプタマーの相補鎖を組み込んだDNA（以下PIaアプタマーとする）を設計した(表１、配列番号４〜１３）。設計方針としては、インスリン非存在下では、アプタマーが2本鎖を形成するためにPQQGDHが結合しにくいが、インスリン存在下ではアプタマーの構造が変化し、インスリン、PQQGDHともにアプタマーに結合しやすくなるよう設計を行った（図１）。つまり、インスリンの存在量をPQQGDHの酵素活性で測定する系である。PQQGDHのみでも、連結アプタマーに結合すると考えられるが、インスリン存在下のほうがよりPQQGDHがアプタマーに結合するほうに平衡が動くことにより、インスリンの存在量を測定できると考えられる。
3. Design of ssDNA Combined with Insulin Aptamer As the insulin aptamer (IGA3, SEQ ID NO: 3), a 30-mer protein having a primer region of 66 mer was used. From the results of the three-dimensional structure prediction, this aptamer is considered to form a G quartet structure. Although the dissociation constant can be predicted to be 20 μM or more, an accurate value has not been calculated. In this study, a DNA (hereinafter referred to as PIa aptamer) in which this aptamer and PGa4 aptamer were linked and partially incorporated with a complementary strand of insulin aptamer or PGa4 aptamer (Table 1, SEQ ID NOs: 4 to 13) was designed. As a design policy, in the absence of insulin, aptamer forms a double chain, so PQQGDH is difficult to bind. The design was done (Figure 1). In other words, this is a system that measures the abundance of insulin using the enzyme activity of PQQGDH. Although only PQQGDH is considered to bind to the linked aptamer, the abundance of insulin is considered to be measurable because the equilibrium moves more in the presence of insulin than PQQGDH binds to the aptamer.
表１中、小文字がPGa4（ＰＱＱＧＤＨアプタマー）領域、斜体がIGA3（インスリンアプタマー）領域であり、下線部及び二重下線部がそれぞれ相互に相補な領域である。すなわち、PIa1〜PIa4は基本的にはインスリンアプタマー領域中の部分配列に対する相補配列を5'末端に付加したものであり、かつ、相補的な領域をさらに増やすためにＰＱＱＧＤＨアプタマー領域の部分相補配列も追加したものである。PIa5〜10は、ＰＱＱＧＤＨアプタマー領域中の部分配列に対する相補配列を3'末端に付加したものである。 In Table 1, the lower case is the PGa4 (PQQGDH aptamer) region, the italic is the IGA3 (insulin aptamer) region, and the underlined portion and the double underlined portion are regions complementary to each other. That is, PIa1 to PIa4 are basically those in which a complementary sequence to the partial sequence in the insulin aptamer region is added to the 5 ′ end, and in order to further increase the complementary region, a partial complementary sequence in the PQQGDH aptamer region is also used. It is added. PIa5 to 10 are obtained by adding a complementary sequence to the partial sequence in the PQQGDH aptamer region at the 3 ′ end.
４．設計したssDNAの各タンパク質に対する結合の確認
ゲルシフトで結合の確認を行った。30μM GDHにCaCl2及びPQQをそれぞれ1 mM及び1μMとなるように加え、30分間インキュベートすることによりホロ化を行った。その後、ホロ化GDHまたはインスリンとフォールディングしたアプタマーを各々終濃度5μMとなるように混合し、1時間室温でインキュベートした。3％アガロースゲルに、GDH、インスリンとアプタマーの混合溶液またはアプタマーのみを添加して電気泳動を行った後、ゲルをサイバーグリーンで染色し、各タンパク質存在・非存在化におけるアプタマーのバンドの位置のシフトを観察した。
4). Confirmation of binding of designed ssDNA to each protein
The binding was confirmed by gel shift. CaCl 2 and PQQ were added to 30 μM GDH so as to be 1 mM and 1 μM, respectively, and incubated for 30 minutes to form a holo. Thereafter, the aptamers folded with holo-GDH or insulin were mixed to a final concentration of 5 μM and incubated at room temperature for 1 hour. Electrophoresis after adding GDH, insulin / aptamer mixed solution or aptamer alone to 3% agarose gel, and then staining the gel with Cyber Green to determine the position of aptamer bands in the presence / absence of each protein A shift was observed.
各タンパク質の存在の有無によるDNAのバンド位置のシフトを比較すると、PIa 4、PIa 6、PIa 7、PIa 8において若干のバンド位置のずれが観察された。また、タンパク質をCBB染色した結果、同じくPIa 4、PIa 6、PIa 7、PIa 8では、PQQGDHのみの場合とPQQGDH、インスリンの両方の存在下ではバンド位置が異なった。よって、これらのアプタマーは、PQQGDH、インスリンの存在下でそれぞれ所期の立体構造をとり、二つのタンパク質に結合できる可能性が示された。PQQGDHのみの場合でもバンドのシフトが観察されたが、インスリンの存在下で、よりPQQGDHがアプタマーと結合するほうに平衡が傾けば、差を見ることができると考えられる。 When the shifts in the band positions of DNA depending on the presence or absence of each protein were compared, slight band position shifts were observed in PIa 4, PIa 6, PIa 7, and PIa 8. In addition, as a result of CBB staining of the protein, the bands of PIa 4, PIa 6, PIa 7 and PIa 8 were different in the case of PQQGDH alone and in the presence of both PQQGDH and insulin. Therefore, it was shown that these aptamers have the desired three-dimensional structure in the presence of PQQGDH and insulin, and can bind to two proteins. Even when PQQGDH alone was used, a band shift was observed. However, if PQQGDH binds more to the aptamer in the presence of insulin, the difference can be seen.
５．アプタマー固定化プレートを用いた標的蛋白質の検出
市販のNeutra Avidin固定化プレートをTBS (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)で10回洗浄し、1 wellごとにビオチン修飾アプタマーを50 pmol/100μL加え、室温で1時間振とうすることで固定化した。200μL TBST (10 mM Tris-HCl、5 mM KCl、150 mM NaCl, 0.05% Tween, pH 7.4)で10回洗浄し、2%スキムミルク溶液で1時間ブロッキングを行った。洗浄を10回行った後、種々の濃度のホロ化PQQGDHまたはインスリンを添加し、30分間振とうした。洗浄を6回（最後の2回は、tweenを含まないTBSを用いて洗浄した）した後、180μL TBS、10μL 活性試薬（終濃度0.06 mM DCIP及び0.6 mM PMS）、10μL グルコース（終濃度25 mM）を添加して、アプタマーを介してプレートに固定化されたPQQGDHの酵素活性を上記したPMS-DCIP系を用いて測定した。また、コントロールとして、アプタマーを固定化しない場合とPGa4を固定化した場合で、上記と同様に実験を行った。
5. Detection of target protein using aptamer-immobilized plate Commercially available Neutra Avidin-immobilized plate is washed 10 times with TBS (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) and modified with biotin every well. Aptamer was added at 50 pmol / 100 μL and immobilized by shaking for 1 hour at room temperature. The plate was washed 10 times with 200 μL TBST (10 mM Tris-HCl, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween, pH 7.4), and blocked with a 2% skim milk solution for 1 hour. After 10 washes, various concentrations of holo PQQGDH or insulin were added and shaken for 30 minutes. After 6 washes (last 2 were washed with TBS without tween), 180 μL TBS, 10 μL active reagent (final concentration 0.06 mM DCIP and 0.6 mM PMS), 10 μL glucose (final concentration 25 mM) ) And the enzyme activity of PQQGDH immobilized on the plate via the aptamer was measured using the PMS-DCIP system described above. In addition, as a control, an experiment was performed in the same manner as described above, with no aptamer immobilized and with PGa4 immobilized.
アプタマー固定化プレートを用いたインスリン検出システムの原理と結果を図５及び図６に示す。インスリン-PQQGDH連結アプタマー：PIa 6、PIa 7、PIa 8を固定化した場合、PIa 7ではインスリンの存在下において活性値の30％程度の上昇が確認された。実際の活性値は上記のPGa4と同程度の値である。また、PIa 6、PIa 8ではPIa 7のような活性の変化は確認されず、逆にインスリンの存在下では活性は低下した。よって、PIa 7では、期待した構造変化が起こっていると考えられる。従って、酵素標識のオン・オフを利用した新規のセンシングシステムを構築できたと考えられる。 The principle and results of an insulin detection system using an aptamer-immobilized plate are shown in FIGS. Insulin-PQQGDH-linked aptamer: When PIa 6, PIa 7, and PIa 8 were immobilized, PIa 7 was confirmed to have an increase of about 30% in the presence of insulin. The actual activity value is about the same as the above PGa4. In PIa 6 and PIa 8, no change in activity as in PIa 7 was confirmed. Conversely, the activity decreased in the presence of insulin. Therefore, it is considered that the expected structural change is occurring in PIa 7. Therefore, it is considered that a new sensing system using on / off of the enzyme label could be constructed.
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