JP5746617B2 - Injectable hydrogel forming a chitosan mixture - Google Patents

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Description

本発明は、pH依存および温度感受性の方法でヒドロゲルを形成するキトサンの組み合わせ、このようなヒドロゲルを形成するために用いる水溶液、およびその使用に関するものである。   The present invention relates to a combination of chitosan that forms hydrogels in a pH-dependent and temperature-sensitive manner, aqueous solutions used to form such hydrogels, and uses thereof.

ヒドロゲルは、水または他の生体液において分散する高く水和した、高分子ネットワークである。ヒドロゲルは、温度が上昇すると粘度が高くなる温度感受性(または熱硬化性)である。このようなヒドロゲルは、非温度感受性のヒドロゲルと比較して適用部位で好ましい適用性および長期の生存期間を有し、これによって持続放出薬物送達システムに対する媒体として有利である。   Hydrogels are highly hydrated, polymeric networks that are dispersed in water or other biological fluids. Hydrogels are temperature sensitive (or thermosetting) that increase in viscosity as temperature increases. Such hydrogels have favorable applicability at the site of application and long survival times compared to non-temperature sensitive hydrogels, which is advantageous as a vehicle for sustained release drug delivery systems.

キトサンを含む様々なポリマーは、ヒドロゲルの調製に用いることができる。キトサンは、部分的にキチンの実質的なN−脱アセチル化で得られるポリマーの族として発生し、後者は、β−1,4連鎖におけるN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)の直鎖多糖である。キチンは、無脊椎動物、とくにクラスタシィアン(例えば、エビ、カニ、ロブスター)の外骨格において多量に存在する。キトサン生成に用いる商業的な脱アセチル化プロセスには、一般的に、濃縮したアルカリ溶液、通常水酸化ナトリウムでの食用貝類の加工廃棄物の処理を含む。その生成の間に達成した脱アセチル化にしたがって、キトサンは、D−グルコサミン(GlcN)およびGlcNAcのヘテロポリマーである、またはGlcNのみから形成したホモポリマーである。様々な技術が、脱アセチル化の程度を変化させるために、また、所定のアセチル化の程度を有するキトサンを得るための再アセチル化に利用できる。脱アセチル化の結果、ポリマー鎖に沿って遊離アミノ基ができ、選択した酸性システムにおいて溶解するポリマーを提供する。所定の程度の脱アセチル化であるキトサンの溶解度は、ポリマー分子量、温度および酸溶媒の濃度および性質等、多岐のパラメータに依存する。
A variety of polymers including chitosan can be used in the preparation of hydrogels. Chitosan occurs in part as a family of polymers obtained by substantial N-deacetylation of chitin , the latter being a linear polysaccharide of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) in the β-1,4 linkage. It is. Chitin is abundant in the exoskeleton of invertebrates, especially clusterian (eg, shrimp, crab, lobster). Commercial deacetylation processes used for chitosan production generally include treatment of edible shellfish processing waste with concentrated alkaline solutions, usually sodium hydroxide. Depending on the deacetylation achieved during its production, chitosan is a heteropolymer of D-glucosamine (GlcN) and GlcNAc, or a homopolymer formed only from GlcN. A variety of techniques are available for changing the degree of deacetylation and also for reacetylation to obtain chitosan having a predetermined degree of acetylation. Deacetylation results in free amino groups along the polymer chain, providing a polymer that dissolves in the selected acidic system. The solubility of chitosan, which is a predetermined degree of deacetylation, depends on a variety of parameters such as polymer molecular weight, temperature and concentration and nature of the acid solvent.

したがって、キトサンを特徴付けるために用いる一つのパラメータは、GlcN単位に対するGlcNAc単位の割合であり、アセチル化の程度(DA)、または脱アセチル化の逆の程度(DDもしくはDDA)として表す。キトサンの構造は、さらに、ポリマー鎖内のGlcNAcおよびGlcNの分布様式によって特徴付けられ、例えば、非均一に脱アセチル化したキトサンは、様々な大きさおよび/または鎖における場所のブロックにおいて起こるが、均一に脱アセチル化したキトサンは、ポリマー鎖に沿って乱雑に分布した脱アセチル化の単位を有する。さらに、分子量は重要なパラメータであり、アセチル化の程度および分布様式と共に、溶解度、生分解性および粘度等のキトサンの特性を規定する。   Thus, one parameter used to characterize chitosan is the ratio of GlcNAc units to GlcN units, expressed as the degree of acetylation (DA) or the reverse degree of deacetylation (DD or DDA). The structure of chitosan is further characterized by the mode of distribution of GlcNAc and GlcN within the polymer chain, for example, non-homogeneously deacetylated chitosan occurs in various sizes and / or block locations in the chain, Homogeneously deacetylated chitosan has deacetylated units randomly distributed along the polymer chain. In addition, molecular weight is an important parameter and defines the characteristics of chitosan such as solubility, biodegradability and viscosity along with the degree and distribution pattern of acetylation.

キトサンは、生体接着性、生体適合性、非毒性、および非免疫原性であり、医学、薬学、化粧品および組織工学の分野において用いることができる。例えば、局所的な眼球用途、眼球内注射および網膜の近辺における移植に対するキトサンの用途が開示された(Felt et al., 1999; Patashnik et al., 1997; Song et al., 2001)。さらに、電気湿式スピニングによる均一なサブミクロンのキトサンファイバーおよび人工筋肉、バイオセンサー、および人工臓器コンポーネントの応用における用途が開示されている(Lee et al., 2006)。キトサンは、例えばリゾチーム等の特定の酵素によって特異的に認識され、開裂するため、生体内分解性および生分解性である(Muzzarelli, 1997; Koga, 1998)。   Chitosan is bioadhesive, biocompatible, non-toxic and non-immunogenic and can be used in the fields of medicine, pharmacy, cosmetics and tissue engineering. For example, the use of chitosan for topical ocular use, intraocular injection and transplantation near the retina has been disclosed (Felt et al., 1999; Patashnik et al., 1997; Song et al., 2001). Additionally, uniform submicron chitosan fibers by electrowet spinning and uses in artificial muscle, biosensor, and artificial organ component applications have been disclosed (Lee et al., 2006). Chitosan is biodegradable and biodegradable because it is specifically recognized and cleaved by certain enzymes such as lysozyme (Muzzarelli, 1997; Koga, 1998).

架橋したキトサンおよび/またはさらなるポリマーと組み合わせたキトサンを有する様々なヒドロゲルが既知であり、例えば、ゲニピンと架橋したキトサン塩化物またはキトサングルタミン酸塩(Mwale et al., 2005)、椎間板細胞をカプセル化する骨格として有効であることが報告され(Roughley et al., 2006);キトサングラフトポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、軟骨細胞および半月板細胞を取り込むのに有効であると報告され(Chen et al., 2006);キトサン/ポリ(アクリル酸)pH−感受性ヒドロゲル(Shi et al., 2004);キトサン,β−グリセロールリン酸塩およびヒドロキシエチルセルロース(Li et al., 2002);キトサン/ポリビニルピロリジンpH感受性ヒドロゲル(Risbud et al., 2000);N−アセチルキトサンおよびトロップコラーゲン(Hirano et al., 2000);コンドロイチン硫酸およびキトサン(Sechriest et al., 2000);パルミトイルグリコールキトサン(Noble et al., 1999);ポリ(カプロラクトン)−コーポリ(エチレングリコール)−コ−ポリ(カプロラクトン)ジアクリル酸塩およびキトサン(Zhu et al., 2005);酸化およびN−カルボキシエチルキトサン(Weng et al, 2007)がある。   Various hydrogels with cross-linked chitosan and / or chitosan in combination with further polymers are known, eg encapsulate genipin cross-linked chitosan chloride or chitosan glutamate (Mwale et al., 2005), intervertebral disc cells Effective as a skeleton (Roughley et al., 2006); chitosan-grafted poly (N-isopropylacrylamide), reported to be effective in taking up chondrocytes and meniscal cells (Chen et al., Chitosan / poly (acrylic acid) pH-sensitive hydrogel (Shi et al., 2004); chitosan, β-glycerol phosphate and hydroxyethylcellulose (Li et al., 2002); chitosan / polyvinylpyrrolidine pH-sensitive hydrogel (Risbud et al., 2000); N-acetylchitosan and trop collagen (H irano et al., 2000); chondroitin sulfate and chitosan (Sechriest et al., 2000); palmitoyl glycol chitosan (Noble et al., 1999); poly (caprolactone) -copoly (ethylene glycol) -co-poly (caprolactone) There are diacrylate and chitosan (Zhu et al., 2005); oxidized and N-carboxyethyl chitosan (Weng et al, 2007).

特許文献1は、0.1〜5.0重量%のキトサン;および1.0〜20重量%のポリオールまたは砂糖の一リン酸二塩基塩を有する多糖ベースのゲル溶液を開示し、前記ゲル溶液は、6.5〜7.4のpHおよび20℃以下の温度で溶液であり、20〜70℃の温度範囲内でゲルを形成する。この開示によると、温度感受性のキトサンヒドロゲルは、β−グリセリンリン酸で約80%脱アセチル化したキトサンを中和することによって調製する。   U.S. Patent No. 6,057,077 discloses a polysaccharide-based gel solution having 0.1-5.0 wt% chitosan; and 1.0-20 wt% polyol or sugar monophosphate dibasic salt, said gel solution Is a solution at a pH of 6.5 to 7.4 and a temperature of 20 ° C. or less, and forms a gel within a temperature range of 20 to 70 ° C. According to this disclosure, a temperature sensitive chitosan hydrogel is prepared by neutralizing chitosan about 80% deacetylated with β-glycerin phosphate.

β−グリセリンリン酸を含む温度感受性キトサンヒドロゲルには、軟骨欠損および軟骨修復を行う商標BST-CarGel(商標);創傷治療するBST-DermOn(商標);および膝の痛みを治療するBST-InPod(商標)がある。   Temperature sensitive chitosan hydrogels containing β-glycerin phosphate include BST-CarGel ™ for cartilage defects and cartilage repair; BST-DermOn ™ for wound treatment; and BST-InPod for treating knee pain ( Trademark).

前述の先行技術製品および関連する多くの不利益には、制限された分解率、およびグリセリンリン酸または類似の可塑化塩の使用によって与えられる制限があり、β−グリセリンリン酸は、正に帯電した薬品と反応することができる負に帯電した分子的実体であり、それらの沈殿を導く、またはヒドロゲルからのそれらの放出のかく乱を導く。したがって、β−グリセリンリン酸の存在は、キトサン/β−グリセリンリン酸ヒドロゲルを用いることができる薬品の範囲を減少させる。   The aforementioned prior art products and many of the disadvantages associated with them have limited degradation rates and limitations imposed by the use of glycerin phosphate or similar plasticizing salts, and β-glycerin phosphate is positively charged. Is a negatively charged molecular entity that can react with the drug, leading to their precipitation or perturbing their release from the hydrogel. Thus, the presence of β-glycerol phosphate reduces the range of drugs that can be used with the chitosan / β-glycerol phosphate hydrogel.

さらに、ゲル化時間および粘度等のヒドロゲルの特徴の調節は、グリセリンリン酸の濃度に依存し、したがって、β−グリセリンリン酸の溶解度によって制限される。とくに、β−グリセリンリン酸の濃度は、短いゲル化時間に必要であり、投与後のヒドロゲルの迅速排除を避けるのにも必要である。しかし、高濃度のβ−グリセリンリン酸もヒドロゲルの粘度を減少させる。したがって、これらのヒドロゲルは、短いゲル化時間および高粘度の望ましい組み合わせを欠如する。さらに、高濃度のβ−グリセリンリン酸には、投与部位でヒドロゲルの沈殿がある。加えて、キトサン/β−グリセリンリン酸ゲルは、混濁度よって阻止されるため、眼球または典型的な投与等の特定の投与に対して不適切となる。   Furthermore, the regulation of hydrogel characteristics such as gel time and viscosity is dependent on the concentration of glycerin phosphate and is therefore limited by the solubility of β-glycerine phosphate. In particular, the concentration of β-glycerin phosphate is necessary for short gel times and is also necessary to avoid rapid elimination of the hydrogel after administration. However, high concentrations of β-glyceryl phosphate also reduce the viscosity of the hydrogel. Thus, these hydrogels lack the desirable combination of short gel time and high viscosity. Furthermore, high concentrations of β-glyceryl phosphate have hydrogel precipitates at the site of administration. In addition, chitosan / β-glycerol phosphate gel is blocked by turbidity, making it unsuitable for certain administrations such as the eyeball or typical administration.

脱アセチル化および無水酢酸再アセチル化したキトサンを用いる透明なキトサン/β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの調製が開示されている(Berger et al., 2004)。この文献によると、キトサン/β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの混濁は、キトサンの脱アセチル化の程度および再アセチル化の間の媒体の均一性によって調節し、グルコースアミンモノマーの分散モードに影響を与える。したがって、透明なキトサン/β−グリセリンリン酸ヒドロゲルの調製は、30〜60%の脱アセチル化の程度の均一に再アセチル化下キトサンを必要とすると報告されている。   The preparation of transparent chitosan / β-glycerin phosphate hydrogels using deacetylated and acetic anhydride reacetylated chitosan has been disclosed (Berger et al., 2004). According to this document, the turbidity of the chitosan / β-glycerin phosphate hydrogel is controlled by the degree of chitosan deacetylation and the homogeneity of the medium during reacetylation and affects the dispersion mode of the glucoseamine monomer. Thus, the preparation of transparent chitosan / β-glycerin phosphate hydrogels has been reported to require chitosan under uniform reacetylation to the extent of 30-60% deacetylation.

特許文献2は、疑似熱硬化性の中和キトサン化合物を開示し、全化合物を基にして0.1〜2.0重量%、好ましくは0.5〜1重量%有し、80〜90%の脱アセチル化の程度を有するキトサン由来の均一に再アセチル化したキトサンから成り、200kDaより大きい、好ましくは600kDaより大きい分子量を有し、NaOH等の水酸化塩基で中和した、30〜60%、好ましくは45〜55%の脱アセチル化の程度であり、前記化合物は、5℃より高い温度でリン酸のない透明なヒドロゲルを形成する。この文献によると、キトサンのアセチル化および脱アセチル化モノマーの均一な分布は、対象のヒドロゲルを得るために重要な基準である。さらに、対象のヒドロゲルの整合性は、ジオール、とくに1,3−プロパノールを加えることによって改善される。   Patent document 2 discloses a pseudo-thermosetting neutralized chitosan compound, having 0.1 to 2.0% by weight, preferably 0.5 to 1% by weight, based on all compounds, 80 to 90% 30 to 60% consisting of uniformly reacetylated chitosan derived from chitosan having a degree of deacetylation of, having a molecular weight greater than 200 kDa, preferably greater than 600 kDa, neutralized with a hydroxide base such as NaOH, Preferably at a degree of deacetylation of 45-55%, the compound forms a transparent hydrogel free of phosphoric acid at temperatures above 5 ° C. According to this document, the uniform distribution of chitosan acetylated and deacetylated monomers is an important criterion for obtaining the hydrogel of interest. Furthermore, the integrity of the subject hydrogel is improved by adding diols, especially 1,3-propanol.

特許文献3は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびアスコルビン酸からセンタ木下薬品をキトサンと組み合わせて有する、制御放出製剤を開示し、ゲル様の複合体は、薬品および中性から酸性の範囲の環境におけるキトサンから成る。この文献によると、キトサンは、80〜90%脱アセチル化され、約5〜70重量%の濃度で製剤において存在する。   U.S. Patent No. 6,057,037 discloses a controlled release formulation having a center Kinoshita drug in combination with chitosan from an angiotensin converting enzyme inhibitor and ascorbic acid, the gel-like complex is chitosan in the drug and neutral to acidic range environments. Consists of. According to this document, chitosan is 80-90% deacetylated and is present in the formulation at a concentration of about 5-70% by weight.

特許文献4は、3次元粒子において分散した生存分子で、熱可塑性の半透性膜においてカプセル化した本質的には架橋していないキトサン核マトリクスを有するカプセル化装置を開示し、キトサン核マトリクスは、前記細胞を含むキトサン溶液の沈殿によって形成される。この開示によると、キトサン沈殿物は、一価のイオンを有する緩衝溶液におけるキトサン含有カプセルの置換またはキトサン溶液のpH調整等の十分な数の遊離アミノ基の電荷を除去または隠すいずれかの方法によって達成できる。   U.S. Patent No. 6,057,031 discloses an encapsulating device having an essentially non-crosslinked chitosan core matrix encapsulated in a thermoplastic semipermeable membrane with living molecules dispersed in three-dimensional particles, wherein the chitosan core matrix is , Formed by precipitation of a chitosan solution containing the cells. According to this disclosure, chitosan precipitates are obtained by any method that removes or hides the charge of a sufficient number of free amino groups, such as replacement of chitosan-containing capsules in a buffer solution with monovalent ions or pH adjustment of the chitosan solution. Can be achieved.

特許文献5は、キトサンおよび望ましくない組織接着を防ぐためキトサンに固定化したヘパリンを有する薬剤の組み合わせの用途を開示している。この開示によると、キトサンは、約90%ものN−アセチル化の程度を有し、この薬剤はとりわけ溶液またはゲルの形態で用いる。   U.S. Patent No. 6,057,032 discloses the use of chitosan and a drug combination having heparin immobilized on chitosan to prevent unwanted tissue adhesion. According to this disclosure, chitosan has a degree of N-acetylation of as much as about 90% and this drug is used in particular in the form of a solution or gel.

特許文献6は、約40%より小さい、好ましくは約2〜約6%のアセチル化の程度を有し、慢性または急性の創傷の皮膚病変の回復および瘢痕形成に用いる組成物を開示している。   U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a composition having a degree of acetylation of less than about 40%, preferably about 2 to about 6%, for use in the recovery and scar formation of skin lesions in chronic or acute wounds. .

特許文献7は、溶液またはヒドロゲルの形態のイオン性キトサンヨード複合体を開示し、キトサンまたはその誘導体、水溶性運搬体;元素状ヨード;およびヨード源を有する。この開示によると、キトサンは、10〜1000kDa、好ましくは100〜800kDa、および最も好ましくは250〜750kDaの平均分子量および40〜95%、好ましくは60〜90%の脱アセチル化の程度を有する。   U.S. Patent No. 6,057,031 discloses an ionic chitosan iodine complex in the form of a solution or hydrogel, having chitosan or a derivative thereof, a water soluble carrier; elemental iodine; and an iodine source. According to this disclosure, chitosan has an average molecular weight of 10-1000 kDa, preferably 100-800 kDa, and most preferably 250-750 kDa and a degree of deacetylation of 40-95%, preferably 60-90%.

特許文献8は、異なる程度の脱アセチル化を有するキトサンの断片を有する薬物放出ファイバーおよびそれらの製造方法を開示する。この文献は、特定のキトサンの脱アセチル化の程度を示していない。特許文献9は、接着剤としての遺伝子組み換えヒト血清アルブミンおよび架橋剤としての二機能および多機能アルデヒドを有する生物組織に対する接着剤を開示している。この文献によると、接着剤は、さらなる成分、とりわけ50%アセチル化キトサン等の部分的にアセチル化したキトサンを有し、さらに、接着剤の水溶液を使用する前に凍結乾燥し、水または注射生理食塩水で再構成する。   U.S. Patent No. 6,057,031 discloses drug release fibers having chitosan fragments with different degrees of deacetylation and methods for their production. This document does not indicate the degree of deacetylation of a particular chitosan. Patent Document 9 discloses an adhesive for a biological tissue having a recombinant human serum albumin as an adhesive and a bifunctional and multifunctional aldehyde as a cross-linking agent. According to this document, the adhesive has further components, in particular partially acetylated chitosan such as 50% acetylated chitosan, and is further lyophilized before using an aqueous solution of adhesive, Reconstitute with saline.

特許文献10は、例えば10N アルカリ等の水溶液で低温膨張させる特定のキチンを少なくとも36時間投与し、その後、高温でアルカリ溶液と特定の膨張したキトサンを反応させて脱アセチル化を起こすことによってキトサンを調製する方法を開示している。この文献によると、膨張は最高30℃で行い、脱アセチル化は膨張の段階よりも少なくとも5℃、好ましくは少なくとも25℃高い温度で行い、また、アセチル化は、0.2〜0.7、とくに0.45〜0.6の程度を有するキトサン生成物を与えるようにする。この開示された方法は、さらに、脱アセチル化の後に洗浄するステップを有し、この生成物は随意的にはさらに例えばゲルまたは溶液の形態によって修正される。この開示によると、完全に水溶性であり、すなわち、重量97%であるキトサン生成物は、希釈酸性溶液において溶解する。   In Patent Document 10, for example, a specific chitin that is low-temperature expanded with an aqueous solution of 10N alkali or the like is administered for at least 36 hours, and then the chitosan is reacted by reacting the alkaline solution with the specific expanded chitosan at a high temperature to cause deacetylation. A method of preparation is disclosed. According to this document, the expansion is carried out at a maximum of 30 ° C., the deacetylation is carried out at a temperature that is at least 5 ° C., preferably at least 25 ° C. higher than the stage of expansion, and the acetylation is carried out by 0.2 to 0.7, In particular, a chitosan product having a degree of 0.45 to 0.6 is provided. The disclosed method further comprises a washing step after deacetylation, and the product is optionally further modified, for example by gel or solution form. According to this disclosure, a chitosan product that is completely water soluble, ie, 97% by weight, dissolves in a dilute acidic solution.

特許文献11は、持続放出または粘膜接着剤および生理活性剤を有する製剤組成物を開示し、この持続放出または粘膜接着剤は、異なる程度のアセチル化(F)を有する少なくとも2個のキトサンを有し、少なくとも1個のキトサンは、0.25〜0.80(例えば、0.30〜0.60または0.33〜0.55)の範囲のF値を有する。また文献は、少なくとも0.1、および好ましくは少なくとも0.2異なるFを有する2個以上のキトサンの混合物を開示し、このキトサンは組成物の重量で5〜98%を有する。この文献によると、この組成物は、消化管、例えば口腔または直腸的に投与するために適切な形態であり、ゲル等がある。 U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a pharmaceutical composition having a sustained release or mucoadhesive agent and a bioactive agent, the sustained release or mucoadhesive agent comprising at least two chitosans having different degrees of acetylation (F A ). having at least one of chitosan, 0.25 to 0.80 (e.g., 0.30 to 0.60 or 0.33 to 0.55) with the F a value in the range. The document is at least 0.1, and preferably discloses mixtures of two or more of chitosan with at least 0.2 different F A, the chitosan has a 5 to 98% by weight of the composition. According to this document, the composition is in a form suitable for administration in the gastrointestinal tract, eg, buccal or rectal, such as a gel.

特許文献12は、栄養物質および0.25〜0.80のアセチル化の程度(F)を有するキトサンまたはキトサンの混合物を有する食品を開示している。 Patent Document 12 discloses a food product having a mixture of chitosan or chitosan having a degree of acetylation of nutrients and 0.25~0.80 (F A).

特許文献11および12は、注射可能な溶液またはゲル形態の溶液を提示していない。これらの文献は、規定の粘度のキトサンヒドロゲルを提示せず、また、キトサンの混合物からのヒドロゲルの調製を開示していない。事実、特許文献11および12において記載した組成物および生成物は、中性領域におけるpH値で沈殿するため生理学的条件下でヒドロゲルを形成できない高脱アセチル化キトサン、または中性pHおよび37℃で溶解できるままの高アセチル化キトサンのいずれかを有する。   Patent documents 11 and 12 do not present an injectable solution or a solution in gel form. These documents do not present chitosan hydrogels of a defined viscosity and do not disclose the preparation of hydrogels from a mixture of chitosans. In fact, the compositions and products described in U.S. Patent Nos. 6,099,086 and 5,973, are highly deacetylated chitosan that precipitates at pH values in the neutral region and cannot form hydrogels under physiological conditions, or at neutral pH and 37 ° C. Has any of the highly acetylated chitosan that remains soluble.

特許文献13は、本発明の優先日の後に開示され、約30%〜約60%の範囲のアセチル化の程度を有する少なくとも1種類のキトサンを有するキトサン組成物を開示し、少なくとも1種類のキトサンは、少なくとも70%のアセチル化の程度を有し、その組成物は、ヒドロゲルからpHおよびインド依存性のゲル化を行う。この文献によると、高く脱アセチル化したおよび高アセチル化キトサンのそれぞれの分子量は、10kDa〜約400kDaの範囲であり、高脱アセチル化キトサンは好ましくは約200kDaより大きい分子量を有し、高アセチル化キトサンは好ましくは約60kDaより大きい分子量を有する。   U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a chitosan composition disclosed after the priority date of the present invention and having at least one chitosan having a degree of acetylation in the range of about 30% to about 60%, and at least one chitosan. Has a degree of acetylation of at least 70% and the composition provides pH and Indian dependent gelation from the hydrogel. According to this document, the molecular weight of each highly deacetylated and highly acetylated chitosan ranges from 10 kDa to about 400 kDa, and the highly deacetylated chitosan preferably has a molecular weight greater than about 200 kDa and is highly acetylated. Chitosan preferably has a molecular weight greater than about 60 kDa.

粘度、機械的強度、好ましいゲル形成の割合、生理学的条件下での分解および予測可能な薬物放出プロファイルの特性を組み合わせるキトサン組成物を形成するヒドロゲルに対する満たされていないニーズがあり、遅延放出薬物製剤の開発および骨格および再生医療に対する移植に利用できる。   There is an unmet need for a hydrogel that forms a chitosan composition that combines viscosity, mechanical strength, rate of preferred gel formation, degradation under physiological conditions and predictable drug release profile, delayed release drug formulation Can be used for development and transplantation for skeletal and regenerative medicine.

米国特許第6344488号明細書US Pat. No. 6,344,488 国際公開2005/097871号International Publication No. 2005/097871 米国特許第4738850号明細書U.S. Pat. No. 4,738,850 米国特許第6140089号明細書US Pat. No. 6140089 米国特許第6486140号明細書US Pat. No. 6,486,140 米国特許公開第2005/0042265号明細書US Patent Publication No. 2005/0042265 米国特許第6521243号明細書US Pat. No. 6,512,243 米国特許第6858222号明細書US Pat. No. 6,858,222 米国特許第6329337号明細書US Pat. No. 6,329,337 国際公開第03/011912号International Publication No. 03/011912 国際公開第2004/069230号International Publication No. 2004/069230 国際公開第2004/068971号International Publication No. 2004/068971 国際公開第2008/072230号International Publication No. 2008/072230

本発明は、キトサン組成物を形成するpHおよび温度依存性ヒドロゲル、キトサンの混合物を有するゲルおよびそれらの用途を提供する。   The present invention provides pH and temperature dependent hydrogels that form chitosan compositions, gels having a mixture of chitosan and their uses.

本発明は、部分的に、アセチル化/脱アセチル化の程度に関して異なる2個の異なるキトサンを有する組成物が、特定の分子量の範囲を有し、pHおよび温度の生理学的条件でヒドロゲルを形成するが、中性領域以下のpH値および/または低温、例えば冷凍以下の温度で液体状態にあることに基づくものである。   The present invention is such that a composition having two different chitosans that differ in terms of the degree of acetylation / deacetylation has a specific molecular weight range and forms a hydrogel at physiological conditions of pH and temperature. Is based on being in a liquid state at a pH value below the neutral range and / or at a low temperature, for example a temperature below freezing.

とくに、組成物は、約20%以下の範囲のアセチル化の程度を有する第1種類のキトサン(「高脱アセチル化したキトサン」または「タイプ1キトサン」として本願明細書でほとんど同じ意味で示す);および約40%〜約60%の範囲でアセチル化の程度を有する第2種類目のキトサン(「高アセチル化したキトサン」または「タイプ2キトサン」として本願明細書でほとんど同じ意味で示す)を有する。言い換えれば、第1および第2種類のキトサンそれぞれの脱アセチル化の程度は、それぞれ、約80%〜約100%の範囲、および約40%〜約60%の範囲である。   In particular, the composition is a first type of chitosan having a degree of acetylation in the range of about 20% or less (shown in this specification as “highly deacetylated chitosan” or “type 1 chitosan” in much the same sense herein). And a second type of chitosan having a degree of acetylation in the range of about 40% to about 60% (shown almost interchangeably herein as "highly acetylated chitosan" or "type 2 chitosan"); Have. In other words, the degree of deacetylation of each of the first and second types of chitosan is in the range of about 80% to about 100% and in the range of about 40% to about 60%, respectively.

本発明のキトサンヒドロゲルは、先行技術の1種類のキトサンを有するキトサンゲル形成組成物より有利である。とくに、本願明細書で示すキトサンの組み合わせを用いると、1種類のキトサンを有するゲルまたはヒドロゲルと比較して、その結果できるヒドロゲルの物理的、化学的および薬学的特性が改善される。   The chitosan hydrogel of the present invention is advantageous over chitosan gel-forming compositions having one type of chitosan of the prior art. In particular, the combination of chitosans shown herein improves the physical, chemical and pharmaceutical properties of the resulting hydrogel compared to a gel or hydrogel having a single type of chitosan.

いずれかの理論または作用機構に制約されることなく、本発明は、高脱アセチル化キトサンと相互作用する高アセチル化キトサンの能力を利用し、これによって、高アセチル化キトサンの比存在下で同じpH条件下で通常起こる高脱アセチル化キトサンの沈殿を避ける。より詳細には、高脱アセチル化キトサンは遊離アミノ基のプロトン化のために約6.5より高いpH値で水溶液中で沈殿し、したがって、ヒドロゲル形成に対してヒト対象にそれのみで注入するのが不適切である。一方、高アセチル化キトサンは、機械的強度および硬度を与えるためヒドロゲル形成に有利であり、リゾチームに対して低い基質であるため比較的長い時間安定性を示し、それによってゆっくり分解される。高アセチル化キトサンは、高脱アセチル化キトサンの特性を補完するために用いることができるが、これは前者が、生理学的pHで溶解でき、それらを含むヒドロゲルに弾力性および軟性を与え、またリゾチームによってより敏速に分解されるためである。高アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンとの相互作用は、水素結合、疎水性結合およびファンデルワールス力の組み合わせを介していると考えられ、中性領域におけるpH値で安定なヒドロゲルの形成を可能にし、そのマイクロ環境のpHが高脱アセチル化キトサンのpKa値よりも大きいときでさえもその溶解性を維持できる。組成物を形成する開示したヒドロゲルは、様々な医学用途、とくに、遅延放出薬物製剤、骨関節症等の変性状態の粘弾性治療および、組織再生に対する移植および骨格において利用できる。   Without being bound by any theory or mechanism of action, the present invention takes advantage of the ability of highly acetylated chitosan to interact with highly deacetylated chitosan, thereby the same in the presence of a ratio of highly acetylated chitosan. Avoid precipitation of highly deacetylated chitosan that normally occurs under pH conditions. More particularly, highly deacetylated chitosan precipitates in aqueous solution at a pH value higher than about 6.5 due to protonation of free amino groups and is therefore injected by itself into human subjects for hydrogel formation Is inappropriate. On the other hand, highly acetylated chitosan is advantageous for hydrogel formation because it provides mechanical strength and hardness, and because it is a low substrate for lysozyme, it exhibits a relatively long time stability and thereby degrades slowly. Highly acetylated chitosan can be used to complement the properties of highly deacetylated chitosan, which allows the former to dissolve at physiological pH, impart elasticity and softness to hydrogels containing them, and lysozyme This is because it can be decomposed more quickly. The interaction of highly acetylated chitosan with highly deacetylated chitosan is thought to be through a combination of hydrogen bonds, hydrophobic bonds and van der Waals forces, resulting in the formation of hydrogels that are stable at pH values in the neutral region. Enabling and maintaining its solubility even when the pH of the microenvironment is greater than the pKa value of highly deacetylated chitosan. The disclosed hydrogels forming the composition can be utilized in a variety of medical applications, particularly in delayed release drug formulations, viscoelastic treatment of degenerative conditions such as osteoarthritis, and transplantation and scaffolds for tissue regeneration.

一つの態様によると、本発明は、約40%〜約60%の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約20%未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、25℃および中性領域におけるpHで、この組成物は、50rpmのせん断速度で少なくとも約100mPa・sの粘度を有する。特定の実施形態によると、25℃および中性領域におけるpHで、この組成物は、200rpmのせん断速度で約70mPa・s未満の粘度を有する。   According to one embodiment, the present invention provides a chitosan composition having a highly acetylated chitosan having a degree of acetylation in the range of about 40% to about 60% and a highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation of less than about 20%. At 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of at least about 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. According to certain embodiments, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of less than about 70 mPa · s at a shear rate of 200 rpm.

本願明細書で用いる中性pHは、pH7.0±0.2を示す。   The neutral pH used in the present specification indicates pH 7.0 ± 0.2.

特定の実施形態において、25℃および中性領域におけるpHで、この組成物は、20rpmのせん断速度で少なくとも約400mPa・sの粘度を有し、100rpmのせん断速度で約200mPa・s未満の粘度を有する。   In certain embodiments, at 25 ° C. and a pH in the neutral region, the composition has a viscosity of at least about 400 mPa · s at a shear rate of 20 rpm and a viscosity of less than about 200 mPa · s at a shear rate of 100 rpm. Have.

特定の実施形態において、25℃および中性領域におけるpHで、この組成物は、pH6.0の同じ組成物の少なくとも2分の1、好ましくは少なくとも3分の1の粘度を有し、この粘度は20rpmのせん断速度で規定するものとする。   In certain embodiments, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of at least one-half, preferably at least one-third that of the same composition at pH 6.0. Is defined by a shear rate of 20 rpm.

特定の実施形態によると、1℃および中性領域におけるpHで、この組成物は液体の形態である。   According to a particular embodiment, at 1 ° C. and pH in the neutral region, the composition is in liquid form.

特定の実施形態によると、25℃およびpH6.5±0.2以下で、この組成物は液体の形態である。   According to a particular embodiment, at 25 ° C. and pH 6.5 ± 0.2 or less, the composition is in liquid form.

他の態様によると、本発明はさらにヒドロゲルの形態のキトサンを提供し、この組成物は、約40%〜約60%の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約20%未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、25℃およびpH7.0±0.2で、この組成物は、20rpmのせん断速度で少なくとも約100mPa・sの粘度を有する。   According to another aspect, the present invention further provides chitosan in the form of a hydrogel, the composition comprising highly acetylated chitosan having a degree of acetylation within the range of about 40% to about 60% and less than about 20%. A chitosan composition having a highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation is provided, and at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least about 100 mPa · s at a shear rate of 20 rpm. .

特定の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2で、この組成物は、50rpmのせん断速度で少なくとも約100mPa・sの粘度を有する。特定の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2で、この組成物は、50rpmのせん断速度で少なくとも約200mPa・sの粘度を有する。特定の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2で、この組成物は、20rpmのせん断速度で少なくとも約400mPa・sの粘度を有する。   According to certain embodiments, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least about 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. According to certain embodiments, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least about 200 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. According to certain embodiments, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least about 400 mPa · s at a shear rate of 20 rpm.

さらに他の実施形態によると、本発明はさらに、注射可能な溶液の形態のキトサン組成物を提供し、この組成物は、約40%〜約60%の範囲内におけるアセチル化度を有する高アセチル化キトサンおよび約20%未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有するキトサン組成物を提供し、25℃および中性領域以下のpHで、この組成物は、50rpmのせん断速度で約150mPa・s未満の粘度を有する。   According to yet another embodiment, the present invention further provides a chitosan composition in the form of an injectable solution, wherein the composition has a high acetylation having a degree of acetylation in the range of about 40% to about 60%. A chitosan composition having a highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation of less than about 20% is provided, and at 25 ° C. and a pH below the neutral region, the composition is about 150 mPas at a shear rate of 50 rpm. Has a viscosity of less than s.

特定の実施形態によると、25℃および中性領域以下のpHで、この組成物は50rpmのせん断速度で約100mPa・s未満の粘度を有する。   According to certain embodiments, at 25 ° C. and a pH below the neutral range, the composition has a viscosity of less than about 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm.

特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンは約45%〜約55%の範囲内におけるアセチル化度を有し、高脱アセチル化キトサンは約15%以下のアセチル化度を有する。   According to certain embodiments, the highly acetylated chitosan has a degree of acetylation within the range of about 45% to about 55%, and the highly deacetylated chitosan has a degree of acetylation of about 15% or less.

特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンは均一に再アセチル化したキトサンである。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、非均一に脱アセチル化したキトサンである。   According to certain embodiments, the highly acetylated chitosan is a homogeneously reacetylated chitosan. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan is a heterogeneously deacetylated chitosan.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは少なくとも約100kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも約200kDaの分子量を有する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of at least about 100 kDa and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of at least about 200 kDa.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約100kDa〜約2000kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約2000kDaの分子量を有する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of about 100 kDa to about 2000 kDa, and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 2000 kDa.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約100kDa〜約700kDa、例えば約100kDa〜約400kDaまたは約400kDa〜約700kDaの分子量を有し;高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの分子量を有する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of about 100 kDa to about 700 kDa, such as about 100 kDa to about 400 kDa or about 400 kDa to about 700 kDa; the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 250 kDa. Have.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約400kDa〜約700kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約100kDa;約400kDa、および約650kDaから成る群から選択される分子量を有し;高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの分子量を有する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of about 400 kDa to about 700 kDa, and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 250 kDa. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight selected from the group consisting of about 100 kDa; about 400 kDa, and about 650 kDa; the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 250 kDa.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約0.2%〜約3%w/vの濃度でそれぞれ存在する。他の特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約0.5%〜約2%w/vの濃度でそれぞれ存在する。他の特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の約1%〜約1.2%w/vの濃度でそれぞれ存在する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan are each present at a concentration of about 0.2% to about 3% w / v of the total composition. According to another particular embodiment, the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan are each present at a concentration of about 0.5% to about 2% w / v of the total composition. According to another particular embodiment, the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan are each present at a concentration of about 1% to about 1.2% w / v of the total composition.

特定の実施形態によると、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:1,1:2,1:3および1:4から成る群から選択する。   According to certain embodiments, the proportion of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan in the composition is selected from the group consisting of 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 1: 4.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約1%〜約1.2%w/vの濃度で存在し、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:1である。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan are each present at a concentration of about 1% to about 1.2% w / v of the total composition, and the highly deacetylated chitosan in the composition And the ratio of highly acetylated chitosan is 1: 1.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約400kDa〜約700kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの分子量を有し、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約1%〜約1.2%w/vの濃度で存在し;組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:1である。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of about 400 kDa to about 700 kDa, the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 250 kDa, and the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan Are each present at a concentration of about 1% to about 1.2% w / v of the total composition; the ratio of highly deacetylated and highly acetylated chitosan in the composition is 1: 1.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約2000kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの分子量を有し、高脱アセチル化キトサンの濃度は全組成物の0.5%w/vであり、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:2,1:3および1:4から成る群から選択する。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of about 2000 kDa, the highly acetylated chitosan has a molecular weight of about 200 kDa to about 250 kDa, and the concentration of the highly deacetylated chitosan is 0% of the total composition. The ratio of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan is selected from the group consisting of 1: 2, 1: 3 and 1: 4.

特定の実施形態によると、ヒドロゲルは、約50%未満のヒドロゲルはその形成後4日で分解される分解プロファイルを有する。   According to certain embodiments, the hydrogel has a degradation profile in which less than about 50% of the hydrogel degrades 4 days after its formation.

特定の実施形態によると、この組成物はさらにリゾチーム阻害剤を有し、リゾチーム阻害剤は、タンパク質および単糖から成る群から選択する。特定の実施形態によると、単糖はトリ−N−アセチル−グルコサミンである。特定の実施形態によると、リゾチーム阻害剤は、高アセチル化キトサンに結合する。特定の実施形態によると、組成物は、高アセチル化キトサンに結合したトリ−N−アセチル−グルコサミンを有する。   According to certain embodiments, the composition further comprises a lysozyme inhibitor, wherein the lysozyme inhibitor is selected from the group consisting of proteins and monosaccharides. According to a particular embodiment, the monosaccharide is tri-N-acetyl-glucosamine. According to certain embodiments, the lysozyme inhibitor binds to highly acetylated chitosan. According to certain embodiments, the composition has tri-N-acetyl-glucosamine bound to highly acetylated chitosan.

特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらに、多糖、リン脂質およびそれら組み合わせから選択した少なくとも1つの負に帯電した物質を有する。特定の実施形態によると、負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、グリコサミノグリカンおよびそれら組み合わせから成る群から選択する。特定の実施形態によると、グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸から成る群から選択する。   According to certain embodiments, the chitosan composition further comprises at least one negatively charged material selected from polysaccharides, phospholipids, and combinations thereof. According to certain embodiments, the negatively charged polysaccharide is selected from the group consisting of animal derived polysaccharides, plant derived polysaccharides, glycosaminoglycans and combinations thereof. According to a particular embodiment, the glycosaminoglycan is selected from the group consisting of chondroitin sulfate, deltaman sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, hyaluronic acid, keratan sulfate.

特定の実施形態によると、リン脂質は、ホスファチジルコリンである。特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらに、ヒアルロン酸を有し、ホスファチジルコリンは、滑液の交換および/または例えば骨関節症の治療等の粘弾性の治療において用いる。   According to a particular embodiment, the phospholipid is phosphatidylcholine. According to certain embodiments, the chitosan composition further comprises hyaluronic acid and the phosphatidylcholine is used in the treatment of viscoelasticity, such as exchange of synovial fluid and / or treatment of, for example, osteoarthritis.

特定の実施形態によると、組成物は、薬物をカプセル化するキトサンおよび/またはゲルにおいて組み込んだ電気スピンしたキトサンのマイクロスフェアを有する。   According to certain embodiments, the composition has chitosan encapsulating the drug and / or electrospun chitosan microspheres incorporated in a gel.

特定の実施形態によると、組成物はさらに少なくとも1個の薬物、ポリペプチドおよび細胞(動物細胞または植物細胞等)を有する。   According to certain embodiments, the composition further comprises at least one drug, polypeptide and cell (such as an animal cell or plant cell).

特定の実施形態によると、組成物はさらに乳化剤を有する。特定の実施形態において、キトサンおよび乳化剤はナノ粒子の形である。特定の実施形態において、ナノ粒子はヒドロゲルにおいてカプセル化する。   According to certain embodiments, the composition further comprises an emulsifier. In certain embodiments, the chitosan and emulsifier are in the form of nanoparticles. In certain embodiments, the nanoparticles are encapsulated in a hydrogel.

特定の実施形態によると、組成物は直接的な点滴、注射および内視鏡投与から選択した経路によって投与するように製剤する。   According to certain embodiments, the composition is formulated for administration by a route selected from direct infusion, injection, and endoscopic administration.

特定の実施形態によると、埋め込み型装置は、ヒドロゲルの形態の組成物を有する。この埋め込み型装置は、組織修復、組織再構築、組織高知己、および組織置換から選択した用途がある。   According to certain embodiments, the implantable device has a composition in the form of a hydrogel. This implantable device has applications selected from tissue repair, tissue remodeling, tissue knowledge, and tissue replacement.

特定の実施形態によると、抗接着装置は本発明の組成物を有し、心臓胸郭部の手術および腹部の手術等の用途において用いる。   According to certain embodiments, an anti-adhesion device has the composition of the present invention and is used in applications such as cardiothoracic surgery and abdominal surgery.

特定の実施形態によると、薬物送達装置またはシステムは本発明の組成物を有する。薬物送達装置またはシステムは、包埋剤の遅延放出のためにある。このシステムにおいて用いる薬物の非限定的な実施例には、例えば、ACE−阻害剤、抗炎症薬、眼薬、泌尿器薬等のタンパク質および非タンパク質剤がある。他の実施形態において、化粧品送達装置は本発明の組成物を有する。適切な化粧品の実施例には、皺取り剤がある。薬物送達装置もしくはシステム、または化粧品送達装置はまた、随意的に、1個以上のミネラル、ビタミン、食品添加物またはて植物由来の抽出物等の天然抽出物を有する。ヒドロゲルその物は、随意的に活性成分と共に、食品添加物として用いることができる。   According to certain embodiments, the drug delivery device or system has a composition of the invention. The drug delivery device or system is for delayed release of the embedding agent. Non-limiting examples of drugs used in this system include, for example, proteins and non-protein agents such as ACE-inhibitors, anti-inflammatory drugs, ophthalmic drugs, urological drugs and the like. In other embodiments, a cosmetic delivery device has the composition of the present invention. An example of a suitable cosmetic product is a wrinkle remover. The drug delivery device or system or cosmetic delivery device also optionally has one or more minerals, vitamins, food additives or natural extracts such as plant-derived extracts. The hydrogel itself can be used as a food additive, optionally with active ingredients.

特定の実施形態において、薬物、化粧品、ミネラル、ビタミン、食品添加物または天然抽出物はいずれもナノ粒子の形であり、ナノ粒子は本発明のヒドロゲルにおいてカプセル化する。   In certain embodiments, any drug, cosmetic, mineral, vitamin, food additive or natural extract is in the form of nanoparticles and the nanoparticles are encapsulated in the hydrogel of the invention.

特定の実施形態によると、3次元ゲル構築物は本発明の組成物を有し、ヒドロゲルは細胞の支持体である。特定の実施形態によると、細胞は、内生細胞または外生細胞であり、構築物は随意的にさらに外生増殖因子を有する。特定の実施形態によると、細胞積載人工マトリクスは本発明のヒドロゲルを有する。特定の実施形態によると、細胞は軟骨細胞、線維軟骨細胞、靭帯線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、腱細胞、筋線維芽細胞、筋原線維芽細胞、間充織幹細胞および角化細胞から成る群から選択する。   According to certain embodiments, a three-dimensional gel construct has the composition of the present invention, and the hydrogel is a cell support. According to certain embodiments, the cell is an endogenous or exogenous cell and the construct optionally further comprises an exogenous growth factor. According to a particular embodiment, the cell-loaded artificial matrix has a hydrogel of the invention. According to certain embodiments, the cells consist of chondrocytes, fibrochondrocytes, ligament fibroblasts, dermal fibroblasts, tendon cells, myofibroblasts, myofibroblasts, mesenchymal stem cells and keratinocytes Select from group.

特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、踵痛を治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、創傷を治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、細胞膜を分裂させる薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、手術接着を予防または治療する薬剤の調製を提供する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、鍵板断裂等の腱板損傷を治療する薬剤の調製を提供し、その薬剤は随意的にはさらに自己細胞を有する。特定の実施形態によると、本発明の組成物の用途に、骨関節症を治療する薬剤の調製を提供し、組成物は随意的にはさらに本願明細書で示すように滑液としてヒアルロン酸およびホスファチジルコリンを有する。   According to certain embodiments, the use of the composition of the present invention provides for the preparation of a medicament for treating colic. According to certain embodiments, the use of the composition of the present invention provides for the preparation of a medicament for treating wounds. According to certain embodiments, the use of the composition of the invention provides for the preparation of an agent that disrupts cell membranes. According to certain embodiments, the use of the composition of the present invention provides for the preparation of a medicament for preventing or treating surgical adhesions. According to certain embodiments, the use of the composition of the present invention provides for the preparation of a medicament for treating rotator cuff injury such as rupture of the key board, which medicament optionally further comprises autologous cells. According to certain embodiments, the use of the composition of the present invention provides for the preparation of a medicament for treating osteoarthritis, the composition optionally further comprising hyaluronic acid and synovial fluid as shown herein Has phosphatidylcholine.

いくつかの実施形態によると、キトサンヒドロゲルは、膣萎縮、乾燥眼、乾燥結膜炎、乾燥鼻後の呼吸器系感染症等の状態を治療する平滑剤、および様々な擦り傷に対する一般的な鎮静剤として用いる。   According to some embodiments, chitosan hydrogel is used as a smoothing agent to treat conditions such as vaginal atrophy, dry eyes, dry conjunctivitis, respiratory infections after dry nose, and a general sedative for various abrasions Use.

さらなる態様によると、本発明は、約100kDa〜約4000kDa、例えば約100kDa〜約2000kDaの範囲内における分子量および約20%未満のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンおよび約200〜約20000Daの範囲の分子量の単糖オリゴマーを有するキトサン組成物を提供し、組成物は水溶液の形態である。   According to a further aspect, the present invention provides a highly deacetylated chitosan having a molecular weight in the range of about 100 kDa to about 4000 kDa, such as about 100 kDa to about 2000 kDa, and a degree of acetylation of less than about 20%, and a range of about 200 to about 20000 Da. A chitosan composition having a monosaccharide oligomer of the molecular weight is provided, wherein the composition is in the form of an aqueous solution.

特定の実施形態によると、単糖オリゴマーは、キトサンオリゴマー;D−グルコサミンオリゴマーおよびN−アセチル−D−グルコサミンオリゴマーから成る群から選択する。特定の実施形態において、キトサンオリゴマーは、約20%未満のアセチル化の程度を有する高脱アセチル化キトサンオリゴマー、および約40%〜約60%のアセチル化の程度を有する高アセチル化キトサンオリゴマーから成る群から選択する。特定の実施形態によると、高アセチル化キトサンオリゴマーは約45%〜約55%の範囲のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンオリゴマーは、約15%以下のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、N−アセチル−D−グルコサミンオリゴマーは、最大約7単位を有する。特定の実施形態によると、D−グルコサミンオリゴマーは、3〜約100単位を有する。特定の実施形態によると、D−グルコサミンオリゴマーは、3〜約50単位を有する。   According to a particular embodiment, the monosaccharide oligomer is selected from the group consisting of chitosan oligomers; D-glucosamine oligomers and N-acetyl-D-glucosamine oligomers. In certain embodiments, the chitosan oligomer consists of a highly deacetylated chitosan oligomer having a degree of acetylation of less than about 20% and a highly acetylated chitosan oligomer having a degree of acetylation of about 40% to about 60%. Select from group. According to certain embodiments, the highly acetylated chitosan oligomer has a degree of acetylation ranging from about 45% to about 55%. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan oligomer has a degree of acetylation of about 15% or less. According to certain embodiments, the N-acetyl-D-glucosamine oligomer has a maximum of about 7 units. According to certain embodiments, the D-glucosamine oligomer has from 3 to about 100 units. According to certain embodiments, the D-glucosamine oligomer has from 3 to about 50 units.

特定の実施形態によると、単糖オリゴマーおよび約100kDa〜約2000kDaの範囲の分子量を有する高脱アセチル化キトサンの割合は、1:1より大きい。   According to certain embodiments, the proportion of monosaccharide oligomers and highly deacetylated chitosan having a molecular weight in the range of about 100 kDa to about 2000 kDa is greater than 1: 1.

特定の実施形態において、割合は約2:1〜20:1である。   In certain embodiments, the ratio is about 2: 1 to 20: 1.

特定の実施形態において、25℃および中性領域以下のpHで、組成物は50rpmのせん断速度で150mPa・s未満の粘度を有する。特定の実施形態において、25℃および中性領域以下のpHで、組成物は50rpmのせん断速度で100mPa・s未満の粘度を有する。特定の実施形態において、25℃および中性領域におけるpHで、組成物は200rpmのせん断速度で70mPa・s未満の粘度を有する。   In certain embodiments, at 25 ° C. and a pH below the neutral range, the composition has a viscosity of less than 150 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. In certain embodiments, at 25 ° C. and a pH below the neutral range, the composition has a viscosity of less than 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. In certain embodiments, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of less than 70 mPa · s at a shear rate of 200 rpm.

他の態様によると、本発明は安定なヒドロゲルの生成方法を提供し、この方法は、約40〜約60%の範囲内におけるアセチル化度を有する少なくとも1個の高アセチル化キトサン、および約20%未満のアセチル化度を有する少なくとも1個の高脱アセチル化キトサンを酸性水溶液において溶解させ、複合溶液を形成するステップと;複合溶液のpHを値6.5〜7.2に調整するステップと;pHを値7.0から7.6まで上げる間に複合溶液の温度を37℃まで上昇させるステップとをし、25℃で50rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有するヒドロゲルを形成する。   According to another aspect, the present invention provides a method for producing a stable hydrogel comprising at least one highly acetylated chitosan having a degree of acetylation in the range of about 40 to about 60%, and about 20 Dissolving at least one highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation of less than% in an acidic aqueous solution to form a complex solution; adjusting the pH of the complex solution to a value of 6.5 to 7.2; Increasing the temperature of the composite solution to 37 ° C. while raising the pH from 7.0 to 7.6 to form a hydrogel having a viscosity of at least 100 mPa · s at 25 ° C. and a shear rate of 50 rpm .

断りのない限り、本願明細書で用いるすべての技術的および/または科学的用語は本発明の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味である。本願明細書で記載するのと類似または等価の方法および材料は、本発明の実施形態の実践または試験において用いることができるが、例示的な方法および/または材料を以下で説明する。対立の場合には、定義を含め、明細書を制御する。加えて、材料、方法、および実施例は、ただの例示に過ぎず、必ずしも限定されることはない。   Unless defined otherwise, all technical and / or scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art of the present invention. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of embodiments of the present invention, exemplary methods and / or materials are described below. In case of conflict, control the specification, including definitions. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and not necessarily limited.

本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面につき実施例として本願明細書で記載する。本願明細書で詳細な図面についての詳細と共に、特定に示すものは、実施例および本発明の実施形態の例示的説明の目的である。これに関連して、図面を用いた説明によって、当業者が本発明の実施形態をどのように実践するか理解できる。   Several embodiments of the present invention are described herein by way of example with reference to the accompanying drawings. It is for the purpose of illustrating the examples and exemplary embodiments of the invention, which are specifically indicated, along with the details of the detailed drawings in the specification. In this context, the description with the aid of the drawings allows those skilled in the art to understand how to practice the embodiments of the present invention.

図1は、2種類の異なるキトサンを有する液体組成物からの本発明のいくつかの実施形態に従ってヒドロゲルの形成を示す。FIG. 1 illustrates the formation of a hydrogel according to some embodiments of the present invention from a liquid composition having two different chitosans. 図2は、タイプ1およびタイプ2のキトサンの組み合わせから形成した異なるヒドロゲル組成物の経時分解を示す。図2Aは、1:1(ダイアモンド印);1:2(四角印);および1:3(三角印)の割合でタイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)と組み合わせたタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)を有する組成物の分解を示し、未分解のままのゲルの重量のパーセンテージで表す。FIG. 2 shows the time degradation of different hydrogel compositions formed from a combination of Type 1 and Type 2 chitosans. FIG. 2A shows type 2 chitosan (MW220 kDa; DA50) combined with type 1 chitosan (MW65 kDa; DA15) in the ratio of 1: 1 (diamond mark); 1: 2 (square mark); and 1: 3 (triangle mark). And shows the degradation of the composition with a percentage of the weight of the gel remaining undegraded. 図2Bは、1:1の割合でタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)および65kDaおよびDA15(三角印)または100kDaおよびDA9(四角印)のいずれかのタイプ1キトサンの組み合わせから形成したヒドロゲル組成物の経時分解を示す。FIG. 2B shows a hydrogel composition formed from a combination of type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50) and 65 kDa and DA15 (triangle mark) or 100 kDa and DA9 (square mark) type 1 chitosan in a 1: 1 ratio. Degradation with time is shown. 図3は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのヘモグロビンの放出を示し、溶離液におけるタンパク質の量(μg/mL)によって測定する。ダイアモンド、四角、三角、星、およびアスタリスクによって示したこのシステムは実験の反復を示し、丸印は実験の平均を示す。FIG. 3 shows the release of hemoglobin from a hydrogel composition formed from a combination of type 1 chitosan (MW 65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50), measured by the amount of protein (μg / mL) in the eluent. To do. This system, indicated by diamonds, squares, triangles, stars, and asterisks, indicates experimental repeats, and circles indicate the average of experiments. 図4は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのウシ血清アルブミン(BSA)の放出を示し、溶離液の光学濃度(OD)によって測定する。ダイアモンド、四角、三角、星、およびアスタリスクによって示したこのシステムは実験の反復を示し、丸印は実験の平均を示す。FIG. 4 shows the release of bovine serum albumin (BSA) from a hydrogel composition formed from a combination of type 1 chitosan (MW 65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50), and the optical density (OD) of the eluent. Measure by. This system, indicated by diamonds, squares, triangles, stars, and asterisks, indicates experimental repeats, and circles indicate the average of experiments. 図5は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からのBSAの放出を示す棒グラフである。FIG. 5 is a bar graph showing the release of BSA from a hydrogel composition formed from a combination of type 1 chitosan (MW 65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50). 図6は、BSAを含む(四角印)または含まない(ダイアモンド印)のいずれかの、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からの経時分解を示し、未分解のゲルの重量のパーセンテージで示す。FIG. 6 shows a hydrogel composition formed from a combination of type 1 chitosan (MW65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW220 kDa; DA50), either with BSA (square mark) or not (diamond mark). It shows degradation over time and is expressed as a percentage of the weight of the undegraded gel. 図7は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)およびBSAの組み合わせから形成したヒドロゲル組成物からの分解プロファイル(三角印)とのBSAの放出プロファイル(四角印)との統合を示す。FIG. 7 shows the release profile of BSA (square marks) with degradation profiles (triangle marks) from hydrogel compositions formed from a combination of type 1 chitosan (MW 65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50) and BSA. Shows integration. 図8は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物で処理した(図8A)または未処理(図8B)のいずれかのラットから取った創傷床の生体検査の組織病理形態を示す。FIG. 8 is taken from either a treated (FIG. 8A) or untreated (FIG. 8B) rat with a hydrogel composition formed from a combination of type 1 chitosan (MW 65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW 220 kDa; DA50). Figure 5 shows the histopathological form of biopsy of a wound bed. 図9は、タイプ1キトサン(MW65kDa;DA15)およびタイプ2キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物およびアセチルグルコサミンオリゴマー(Gel)での糖尿病ラットにおける創傷の治療の結果を示し、生体検査後7日目の創傷床生体検査の表面積で示す。対照群の動物において、傷は、ギブス包帯で覆う(対照+カバー)または覆わないままにする(覆わない対照)のいずれかであった。FIG. 9 shows the results of treatment of wounds in diabetic rats with a hydrogel composition and acetylglucosamine oligomer (Gel) formed from a combination of type 1 chitosan (MW65 kDa; DA15) and type 2 chitosan (MW220 kDa; DA50) It is shown by the surface area of the wound bed biopsy 7 days after the examination. In the control group of animals, the wounds were either covered with a Gibbs bandage (control + cover) or left uncovered (uncovered control). 図10は、鍵板損傷のラットに行ったin vivoの実験の結果を示す。縫合後の骨髄細胞を含むキトサンヒドロゲルで処理したラットからの組織スライス(図10A)は、炎症細胞の移動および欠陥部における回復を示すが、縫合後未処理のラットからのスライス(図10B)は、回復の兆しのない空の欠陥部を示す。FIG. 10 shows the results of an in vivo experiment performed on rats with a keyboard injury. Tissue slices from rats treated with chitosan hydrogel containing bone marrow cells after suturing (FIG. 10A) show migration of inflammatory cells and recovery in the defect, while slices from untreated rats after suturing (FIG. 10B) Shows empty defects with no sign of recovery. 図11は、摩擦係数を測定する概略的な図面を示す。FIG. 11 shows a schematic drawing for measuring the coefficient of friction. 図12は、正常な軟骨の2層間で測定した静止摩擦係数を示し、生理食塩水;高脱アセチル化キトサン(MW660kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせから形成したヒドロゲル組成物(組み合わせ);さらにコンドロイチン硫酸を含む同じキトサンの組み合わせ(+CS);さらにコンドロイチン硫酸およびホスファチジルコリンを含む同じキトサンの組み合わせ(+CS/PC);またはヒアルロン酸(HA)を用いる。FIG. 12 shows the static coefficient of friction measured between two layers of normal cartilage, a hydrogel composition formed from a combination of saline; highly deacetylated chitosan (MW 660 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50). The same chitosan combination further containing chondroitin sulfate (+ CS); the same chitosan combination further including chondroitin sulfate and phosphatidylcholine (+ CS / PC); or hyaluronic acid (HA) is used. 図13は、25℃で測定したpHの機能として様々なキトサン組成物の粘度を示す。高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)および高脱アセチル化キトサン(MW420kDa;DA9)を含む組成物は、そのものまたは組み合わせのいずれかである。FIG. 13 shows the viscosity of various chitosan compositions as a function of pH measured at 25 ° C. Compositions comprising highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) and highly deacetylated chitosan (MW 420 kDa; DA9) are either themselves or in combination. 図14は、25℃で測定したpHの機能として2種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW65kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせ、または1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW100kDa;DA9)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせを含む。FIG. 14 shows the viscosity of a composition having two types of chitosan as a function of pH measured at 25 ° C. The composition is a combination of 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW65 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW220 kDa; DA50), or 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW100 kDa; DA9). And a combination of highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50). 図15は、25℃および様々なせん断速度で測定したときの異なるpH値での2種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なpH値での1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW100kDa;DA9)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせ(図15A);または様々なpH値での1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW65kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせ(図15B)を含む。FIG. 15 shows the viscosity of a composition having two types of chitosan at different pH values as measured at 25 ° C. and various shear rates. The composition can be a combination of 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 100 kDa; DA9) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) at various pH values (FIG. 15A); A 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 65 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) combination (FIG. 15B). 図16は、1℃および様々なせん断速度で測定したときの異なるpH値での2種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なpH値での1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW100kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)(SK10:50)の組み合わせ;または様々なpH値での1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW65kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせ(FVL10:50)を含む。FIG. 16 shows the viscosity of a composition having two types of chitosan at different pH values as measured at 1 ° C. and various shear rates. The composition comprises a combination of 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 100 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) (SK10: 50) at various pH values; or at various pH values A 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 65 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) in combination (FVL 10:50). 図17は、様々なせん断速度で、1℃(図17A)または25℃(図17B)で、共に様々なpH値で測定したときの、1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW100kDa;DA9)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせを有する組成物の粘度を示す。FIG. 17 shows a 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 100 kDa; measured at various pH values, both at 1 ° C. (FIG. 17A) or 25 ° C. (FIG. 17B). Figure 2 shows the viscosity of a composition having a combination of DA9) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50). 図18は、様々なせん断速度で、1℃(図18A)または25℃(図18B)で、共に様々なpH値で測定したときの、1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW65kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせを有する組成物の粘度を示す。FIG. 18 shows a 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 65 kDa; when measured at various shear rates at 1 ° C. (FIG. 18A) or 25 ° C. (FIG. 18B), both at various pH values. 2 shows the viscosity of a composition having a combination of DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50). 図19は、25℃および様々なせん断速度で測定したときの、異なるpH値での2種類のキトサンを有する組成物の粘度を示す。組成物は、様々なpH値で、1:1の割合の高脱アセチル化キトサン(MW660kDa;DA15)および高アセチル化キトサン(MW220kDa;DA50)の組み合わせを有する。FIG. 19 shows the viscosity of a composition having two types of chitosan at different pH values as measured at 25 ° C. and various shear rates. The composition has a 1: 1 ratio of highly deacetylated chitosan (MW 660 kDa; DA15) and highly acetylated chitosan (MW 220 kDa; DA50) at various pH values.

本発明のpH依存性および温度感受性キトサンヒドロゲルは、1種類のキトサンを有する先行技術のキトサンゲル形成組成物より有利である。とくに、本願明細書で示すキトサンの組み合わせの用途は、1種類のキトサンを有するゲルまたはヒドロゲルと比較して、その結果できたヒドロゲルの物理的、化学的および薬物動態的に改善した特性を示す。本願明細書で用いるように、「1種類のキトサンを有する」組成物は、高脱アセチル化キトサンまたは高アセチル化キトサンのいずれかが組成物において存在する唯一のキトサンである組成物を示す。とくに、例えば国際特許第2005/097871号パンフレットにおいて開示されたような、高アセチル化キトサンのみを含むヒドロゲルは、おそらくゲル形成に関与する異なる相互作用のために本発明のヒドロゲルよりも機械的にずっと弱い。加えて、高アセチル化キトサンのみから形成したゲルは、ゲル形成に影響を与える高いキトサン濃度を必要とする、および/または例えば国際特許第2005/097871号パンフレットにおいて開示されているように、ゲルの粘弾性挙動を改善するように1,3−プロパンジオール等の添加剤が必要である。さらに、いくつかの場合において、高アセチル化キトサンのみを含む組成物は、低温でしかゲルを形成せず、in vivo用途で価値がない。最後に、高アセチル化キトサンのみから形成したゲルは、好ましい基質である、リゾチーム等の血清酵素によって敏速に酵素分解される。したがって、このようなゲルは本発明のヒドロゲルと比較してin vivoで比較的短い半減期を有し、また、したがって、前者は長期的な回復力および安定性を必要とする遅延放出薬物製剤、移植および装置の準備に対して適切でない。   The pH-dependent and temperature-sensitive chitosan hydrogels of the present invention are advantageous over prior art chitosan gel-forming compositions having one type of chitosan. In particular, the chitosan combination applications shown herein exhibit the resulting physical, chemical and pharmacokinetically improved properties of the resulting hydrogel compared to a gel or hydrogel having a single type of chitosan. As used herein, a composition “having one kind of chitosan” refers to a composition in which either highly deacetylated chitosan or highly acetylated chitosan is the only chitosan present in the composition. In particular, hydrogels containing only highly acetylated chitosan, such as disclosed in WO 2005/097871, for example, are much more mechanically than the hydrogels of the present invention, probably due to different interactions involved in gel formation. weak. In addition, gels formed solely from highly acetylated chitosan require high chitosan concentrations that affect gel formation and / or as disclosed in eg WO 2005/097871 Additives such as 1,3-propanediol are required to improve viscoelastic behavior. Further, in some cases, compositions containing only highly acetylated chitosan form gels only at low temperatures and are not valuable for in vivo applications. Finally, gels formed solely from highly acetylated chitosan are rapidly enzymatically degraded by a preferred substrate, a serum enzyme such as lysozyme. Thus, such gels have a relatively short half-life in vivo compared to the hydrogels of the present invention, and therefore the former is a delayed release drug formulation that requires long-term resilience and stability, Not appropriate for implantation and device preparation.

加えて、高脱アセチル化キトサン自信がそれらのpKaより大きいpH値で沈殿し、したがって、例えば米国特許第6344488号明細書において開示されているように、中性領域におけるpH値でそれらの安定性およびゲル化に影響を与えるβ−グリセロリン硫酸等の添加剤が必要である。このゲルは、背景技術において記載したように、分解速度、ゲル化時間および粘度に関する制限によって阻害される。
定義
In addition, highly deacetylated chitosan confidence precipitates at pH values greater than their pKa, and thus their stability at pH values in the neutral region, for example as disclosed in US Pat. No. 6,344,488. And additives such as β-glyceroline sulfate that affect gelation are required. This gel is hampered by limitations on degradation rate, gel time and viscosity, as described in the background art.
Definition

本願明細書で用いるように、数値で示して用いるときの用語「約」は、値±10%を意味する。   As used herein, the term “about” when used in numerical terms means a value of ± 10%.

本願明細書で用いるように、本発明の組成物に関連する用語「疑似熱硬化性」は、温度は、組成物のゲル化を誘導することはないが、温度が上昇したときにゲル化時間を劇的に短縮する触媒として機能することを意味する。   As used herein, the term “pseudo-thermosetting” related to the composition of the present invention refers to the gelation time when the temperature does not induce gelation of the composition, but increases in temperature. It functions as a catalyst that dramatically shortens

本願明細書で用いるように、用語「ヒドロゲル」は、少なくとも90%の水和度を有する3次元高分子ネットワークを示し、定常状態においてほとんど流れを見せない。本発明のキトサンヒドロゲルは、一般的に約6.5以上のpHおよび約4℃以上の温度で定常状態に到達する。明確に理解されることには、本発明に従ったキトサンヒドロゲルは、膨張状態において高脱アセチル化キトサン等の1種類のキトサンから形成したキトサンゲルを含まない。   As used herein, the term “hydrogel” refers to a three-dimensional polymer network having a degree of hydration of at least 90% and shows little flow in steady state. The chitosan hydrogels of the present invention generally reach a steady state at a pH of about 6.5 or higher and a temperature of about 4 ° C. or higher. It is clearly understood that the chitosan hydrogel according to the present invention does not include a chitosan gel formed from one type of chitosan such as highly deacetylated chitosan in the expanded state.

本願明細書で用いるように、用語「粘度」は、せん断力または伸長応力のいずれかによって変形した流体抵抗の測定を示す。ニュートン流体は、幅広いせん断速度で一定の粘度を示す、すなわち、せん断速度から独立しているが、(ポリマーゲル等の)非ニュートン流体は、異なるせん断速度に対して異なる粘度を示す。非ニュートン流体は、せん断力およびせん断速度間の異なる相互作用を示す。一般的に、非ニュートン流体の粘度は、高いせん断速度で減少し(すきばさみとして既知の現象)、また粘度は低いせん断速度で増加する。   As used herein, the term “viscosity” refers to the measurement of fluid resistance deformed by either shear force or elongational stress. Newtonian fluids exhibit a constant viscosity over a wide range of shear rates, i.e., independent of shear rate, while non-Newtonian fluids (such as polymer gels) exhibit different viscosities for different shear rates. Non-Newtonian fluids exhibit different interactions between shear forces and shear rates. In general, the viscosity of a non-Newtonian fluid decreases at a high shear rate (a phenomenon known as squealing) and the viscosity increases at a low shear rate.

動的粘度のSI物理単位は、パスカル−秒(Pa・s)であり、kg・m−1・s−1と同一である。ミリパスカル(mPa・s)は0.01Pa・sである。他の単位は平衡における粘度を示すために使用し、パスカル−秒および平衡の間の関係は10P=1kg・m−1・s−1=1Pa・sである。非ニュートン流体の粘度は、血流計で測定し、特定の応力場または流体に対して変形させ、その結果の変形または力をモニタリングする。 The SI physical unit of dynamic viscosity is Pascal-second (Pa · s), which is the same as kg · m −1 · s −1 . The millipascal (mPa · s) is 0.01 Pa · s. Other units are used to indicate the viscosity at equilibrium, and the relationship between Pascal-seconds and equilibrium is 10P = 1 kg · m −1 · s −1 = 1 Pa · s. The viscosity of the non-Newtonian fluid is measured with a blood flow meter and deformed against a specific stress field or fluid and the resulting deformation or force is monitored.

本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「非均一な脱アセチル化」は、D−グルコサミンの脱アセチル化単位が様々な大きさおよび/または分布のブロックにおいて起きていることを意味する。本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「均一な脱アセチル化」は、D−グルコサミンの脱アセチル化単位はポリマーにおいて乱雑に分布することを意味する。   As used herein, the term “heterogeneous deacetylation” in relation to chitosan means that the deacetylated units of D-glucosamine occur in blocks of varying size and / or distribution. . As used herein, the term “homogeneous deacetylation” in relation to chitosan means that the deacetylated units of D-glucosamine are randomly distributed in the polymer.

本願明細書で用いるように、キトサンに関連した用語「均一な再アセチル化」は、脱アセチル化したキトサンが、N−アセチルD−グルコサミン単位およびD−グルコサミン単位がポリマーにおいて乱雑に分布するように再アセチル化していることを意味する。   As used herein, the term “homogeneous reacetylation” related to chitosan means that deacetylated chitosan is distributed randomly in the polymer with N-acetyl D-glucosamine units and D-glucosamine units. Means reacetylation.

本願明細書で用いるように、用語「中性pH」、「中性領域におけるpH」、「中性化」「生理学的pH」等は7.0±0.2のpHを意味する。   As used herein, the terms “neutral pH”, “pH in the neutral region”, “neutralization”, “physiological pH” and the like mean a pH of 7.0 ± 0.2.

本願明細書で用いるように、用語「単糖オリゴマー」は、3〜約100の単量体の重合度を有する単糖を意味する。オリゴマーは、例えばD−グルコサミン単位のみの1種類の単糖から形成する、またはキトサンオリゴマーのように例えばD−グルコサミン単位およびN−アセチル−D−グルコサミン単位等の異なる種類の単糖単位を含む。   As used herein, the term “monosaccharide oligomer” means a monosaccharide having a degree of polymerization of from 3 to about 100 monomers. Oligomers are formed from a single monosaccharide, for example only of D-glucosamine units, or contain different types of monosaccharide units, such as D-glucosamine units and N-acetyl-D-glucosamine units, as chitosan oligomers.

用語「有する」、「含む」「持つ」およびそれら類語は、「含むが限定しない」を意味する。   The terms “comprising”, “including”, “having” and the like mean “including but not limited to”.

用語「から成る」は、「含むが限定しない」を意味する。   The term “consisting of” means “including but not limited to”.

用語「主にから成る」は、組成物、方法または構造がさらなる成分、ステップおよび/もしくは部分を有するが、さらなる成分、ステップおよび/もしくは部分が請求項の組成物、方法または構造の基本的および新規の特徴を材料的に変えることができないときのみである。   The term “consisting essentially of” means that the composition, method or structure has additional components, steps and / or parts, but the additional components, steps and / or parts are fundamental to the claimed composition, method or structure and Only when new features cannot be materially changed.

本願明細書で用いるように、単数形「a」[an]および[the]は、とくに断りがない限り複数形を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも1個の化合物」は、それら混合物を含む、複数の化合物を含む。   As used herein, the singular forms “a” [an] and [the] include the plural unless specifically stated otherwise. For example, the term “compound” or “at least one compound” includes a plurality of compounds, including mixtures thereof.

購入可能なキトサン等の約70〜100%の脱アセチル化の程度(本願明細書でDDまたはDDAと示す)まで脱アセチル化したキトサン(すなわち、最大約30%のアセチル化度、DA)は、本願明細書でタイプ1キトサンまたはキトサンタイプ1と表す。これらのキトサンは生理学的pHで不溶であり、リゾチームによって認識されにくい。このようなキトサンは、in vivoにおいて用いるとき、比較的遅い生分解によって一般的に特徴づけられ、脱アセチル化の程度に依存して、数日から数カ月続く。この種類のキトサンによって形成したゲルは、低いアセチル化度を有し、遊離アミン基は、多くの疎水性相互作用との高密度の水素結合をする。   Chitosan (ie, up to about 30% degree of acetylation, DA) deacetylated to a degree of deacetylation of about 70-100% such as commercially available chitosan (denoted herein as DD or DDA) is In this specification, it is expressed as type 1 chitosan or chitosan type 1. These chitosans are insoluble at physiological pH and are not easily recognized by lysozyme. Such chitosan, when used in vivo, is generally characterized by a relatively slow biodegradation and lasts days to months depending on the degree of deacetylation. Gels formed with this type of chitosan have a low degree of acetylation and the free amine groups have a high density of hydrogen bonds with many hydrophobic interactions.

キトサンの分解速度は、脱アセチル化の程度の機能を示す。キトサンの分解は、細胞増殖およびリモデリングに影響を与える。   The degradation rate of chitosan indicates a function of the degree of deacetylation. Chitosan degradation affects cell growth and remodeling.

高均一に脱アセチル化または再アセチル化したキトサン(約30%〜約60%のアセチル化度を有する)は、本願明細書でタイプ2キトサンまたはキトサンタイプ2で表す。このキトサンは、リゾチームによって容易に消化/分解され、したがって、例えば薬物カプセル化の制御された薬物放出を可能にする。   Highly uniformly deacetylated or reacetylated chitosan (having a degree of acetylation of about 30% to about 60%) is referred to herein as type 2 chitosan or chitosan type 2. This chitosan is easily digested / degraded by lysozyme, thus allowing for controlled drug release, eg, drug encapsulation.

キトサンの脱アセチル化の程度が30%未満であれば、キトサンは、酸性条件で不溶であり本発明の実施形態において用いるために不適切なキトサンに近いポリマーとなる。70%以上の脱アセチル化度で、キトサンの沈殿が起こる。   If the degree of deacetylation of chitosan is less than 30%, chitosan becomes a polymer close to chitosan that is insoluble under acidic conditions and unsuitable for use in embodiments of the present invention. With a degree of deacetylation of 70% or more, chitosan precipitation occurs.

キトサンの脱アセチル化度は、例えば、R.A. Muzarelli and R. Richetti [Carbohydr. Polym. 5, 461-472, 1985 or R.A. Muzarelli and R. Richetti in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press 385-388, 1986] において開示されているような分光光度法によって規定する。簡単に言えば、例えば後者の方法において、キトサンを1%酢酸において溶解し、DDをN−アセチル−D−グルタミン溶液を標準液として用いて200,201,202,203および204でUVによってN−アセチル−グルコサミンの量を測定することによって測定する。   The degree of deacetylation of chitosan can be determined, for example, by RA Muzarelli and R. Richetti [Carbohydr. Polym. 5, 461-472, 1985 or RA Muzarelli and R. Richetti in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press 385-388, 1986] as defined by spectrophotometry. Briefly, for example, in the latter method, chitosan is dissolved in 1% acetic acid and DD is N-by UV with 200, 201, 202, 203 and 204 using N-acetyl-D-glutamine solution as a standard solution. It is measured by measuring the amount of acetyl-glucosamine.

一つの実施形態によると、本発明は、約40%〜約60%の範囲内におけるアセチル化度を有する少なくとも1個の高アセチル化キトサン(タイプ2)および約20%未満のアセチル化度を有する少なくとも1個の高脱アセチル化キトサン(タイプ1)の組み合わせを有する多糖キトサン組成物に関連する。高くアセチル化したタイプ2キトサンは、高脱アセチル化キトサンタイプ1と静電気の、水素および疎水性相互作用を通して相互作用する。相互作用の程度は、pHの上昇に伴って増加する。両タイプのキトサンの溶液を有する組成物は、グリセロリン酸エステルを必要とすることなく、生理学的pHで安定なゲルを形成することができる。したがって、得られた組成物はグリセロリン酸エステルを欠如している。   According to one embodiment, the present invention has at least one highly acetylated chitosan (type 2) having a degree of acetylation in the range of about 40% to about 60% and a degree of acetylation of less than about 20%. Relevant to polysaccharide chitosan compositions having a combination of at least one highly deacetylated chitosan (type 1). Highly acetylated type 2 chitosan interacts with highly deacetylated chitosan type 1 through electrostatic, hydrogen and hydrophobic interactions. The degree of interaction increases with increasing pH. A composition having a solution of both types of chitosan can form a gel stable at physiological pH without the need for glycerophosphate. Accordingly, the resulting composition lacks glycerophosphate.

したがって、記載するキトサン組成物は、水溶液またはヒドロゲルの形態のいずれかである。液体状態からヒドロゲルへの転移は、約6.5以上のpH条件で起こる。ヒドロゲルは、生理学的条件、すなわち中性領域におけるpHおよび37℃において安定である。   Accordingly, the chitosan composition described is either in aqueous solution or hydrogel form. The transition from the liquid state to the hydrogel occurs at pH conditions above about 6.5. The hydrogel is stable at physiological conditions, i.e. pH in the neutral region and 37 [deg.] C.

本願明細書で記載する組成物は、室温またはそれ未満の温度(例えば4℃)でゲルを形成することに留意されたい。それにも関わらず、この条件でのゲル形成は遅く、数日から数カ月続くため、水溶液として組成物を保管および転移することができる。   Note that the compositions described herein form a gel at or below room temperature (eg, 4 ° C.). Nevertheless, gel formation under these conditions is slow and lasts days to months, allowing the composition to be stored and transferred as an aqueous solution.

未保護状態におけるタイプ1のキトサンは、生理学的条件pH以下の約6.5のpHで沈殿する。高く疎水性で均一にアセチル化したキトサタイプ2のキトサンタイプ1との相互作用は、水素および疎水性結合の形成によって非均一にアセチル化したタイプ1キトサンのこの沈殿を妨げ、安定な準固体のヒドロゲルが中性領域におけるpH7.0での形成を可能にする。   Type 1 chitosan in the unprotected state precipitates at a pH of about 6.5 below the physiological condition pH. The interaction of highly hydrophobic and uniformly acetylated chitosa type 2 with chitosan type 1 prevents this precipitation of non-homogeneously acetylated type 1 chitosan by formation of hydrogen and hydrophobic bonds, resulting in a stable quasi-solid hydrogel Allows formation at pH 7.0 in the neutral region.

形成した第2結合は、非均一なキトサン鎖のカプセル化を可能にし、そのpKaより大きいpHでの溶解度を維持する。一般的に、この第2鎖相互作用は、ゲル形成に関与する主な分子力である(Chenite et al.3 2000; Berger et al., 2005)。 The formed second bond allows for the encapsulation of non-homogeneous chitosan chains and maintains its solubility at a pH greater than its pKa. In general, this second strand interaction is the main molecular force involved in gel formation (Chenite et al. 3 2000; Berger et al., 2005).

タイプ1キトサンは、主にゲルの安定性、強度および硬度に寄与し、分解を遅くするが、タイプ2キトサンは、ゲルの軟性、弾力性および速い溶解に寄与する。タイプ1およびタイプ2キトサンを有する組成物の分解プロファイルは、以下の実施例2においてさらに記載し、図2において示す。とくに、本発明は、約100kDaの分子量を有するタイプ1キトサンおよび200〜250kDaの範囲内の分子量を有するタイプ2キトサンから形成したヒドロゲルは、ほぼ線形の分解速度を提供するが、少なくとも50%のヒドロゲルがゲル形成後4日間未分解のままである(図2B)。逆に、低分子量の同じタイプ2キトサンおよびタイプ1キトサンから形成したゲルは、あまり望ましくない2相の分解パターンを示す(図2A)。タイプ2キトサンは、「保護基」または「コーティング」として認識され、タイプ1キトサンの周りに殻を提供し、沈殿を妨げる。   Type 1 chitosan contributes mainly to the stability, strength and hardness of the gel and slows down degradation, whereas type 2 chitosan contributes to the softness, elasticity and fast dissolution of the gel. The degradation profile of compositions having type 1 and type 2 chitosan is further described in Example 2 below and is shown in FIG. In particular, the present invention provides that hydrogels formed from type 1 chitosan having a molecular weight of about 100 kDa and type 2 chitosan having a molecular weight in the range of 200-250 kDa provide a substantially linear degradation rate, but at least 50% of the hydrogel Remains undegraded for 4 days after gel formation (FIG. 2B). Conversely, gels formed from the same low molecular weight type 2 chitosan and type 1 chitosan show a less desirable two-phase degradation pattern (FIG. 2A). Type 2 chitosan is recognized as a “protecting group” or “coating” and provides a shell around type 1 chitosan to prevent precipitation.

さらに、タイプ2キトサンはリゾチームによって認識される。この特徴は、本願明細書で記載する組成物から形成したヒドロゲルの分解速度の制御を可能にする。例えば、リゾチーム阻害剤のタイプ2との結合は、タンパク質または単糖であり、形成したヒドロゲルの分解速度を遅くする。リゾチーム阻害剤の適切な実施例は、単糖トリ−N−アセチルグルコサミンである。代案として、組成物は、実施例4において記載するように、例えば創傷治癒において比較的速い分解速度を有する。   In addition, type 2 chitosan is recognized by lysozyme. This feature allows control of the degradation rate of hydrogels formed from the compositions described herein. For example, lysozyme inhibitor binding to type 2 is a protein or monosaccharide and slows the degradation rate of the formed hydrogel. A suitable example of a lysozyme inhibitor is the monosaccharide tri-N-acetylglucosamine. Alternatively, the composition has a relatively fast degradation rate, eg, in wound healing, as described in Example 4.

記載する組成物から形成したヒドロゲルの物理的および化学的特性は、キトサンの分子量および/もしくはアセチル化度を増減する、または異なるソースからのキトサンの自然なアセチル化の多様性ことによって変えることができる。ゲルの特性はさらに、再アセチル化の種類の選択によって(すなわち、均一または非均一)、または脱アセチル化/アセチル化状態の分布パターンを描くことによって制御することができる。   The physical and chemical properties of hydrogels formed from the described compositions can be altered by increasing or decreasing the molecular weight and / or degree of acetylation of chitosan or by the diversity of natural acetylation of chitosan from different sources . The properties of the gel can be further controlled by selection of the type of reacetylation (ie uniform or non-uniform) or by drawing a distribution pattern of deacetylated / acetylated states.

好ましくは、高アセチル化キトサンは、均一に再アセチル化する。さらに好ましくは、高く脱アセチル化下キトサンは非均一に脱アセチル化する。   Preferably, the highly acetylated chitosan is uniformly reacetylated. More preferably, chitosan under high deacetylation is non-uniformly deacetylated.

一般的に、購入可能なキトサンは、乾燥キチンフレークの脱アセチル化によって産業的に調製する(Muzzarelli, 1986)。脱アセチル化は、好ましくは、フレークの表面でキチン分子の非晶質領域において起こり、その結果、様々なブロックの大きさの脱アセチル化単位の分布を有する非均一な単量体となる。比較すると、均一条件下の再アセチル化したキトサンは、脱アセチル化した単量体の乱雑な分布を可能にし、キトサンの結晶度を減少させ、逆にその溶解度も減少させる(Aiba, 1991, 1994; Ogawa and Yui, 1993 ; Milot et. al., 1998)。   In general, commercially available chitosan is industrially prepared by deacetylation of dried chitin flakes (Muzzarelli, 1986). Deacetylation preferably takes place in the amorphous region of the chitin molecule on the surface of the flakes, resulting in a heterogeneous monomer having a distribution of deacetylated units of various block sizes. In comparison, reacetylated chitosan under homogeneous conditions allows for a messy distribution of deacetylated monomers, reducing the crystallinity of chitosan and conversely reducing its solubility (Aiba, 1991, 1994). Ogawa and Yui, 1993; Milot et. Al., 1998).

非均一な脱アセチル化の方法は、例えば、U.S. Patent No. 4,195,175; Varum et al., pages 127- 136 in "Advances in chitin chemistry", Ed. C. J. Brine, 1992; Ottoy et al., Carbohydrate Polymers 29:17-24 (1996); Sannan et al., Macromol. Chem. 176:1191-1195 (1975); Sannan et al, Macromol. Chem. 177: 3589-3600 (1976); Kurita et al., Chemistry Letters 1597-1598 (1989); and CA 2,101,079において開示されている。   Non-uniform methods of deacetylation are described, for example, in US Patent No. 4,195,175; Varum et al., Pages 127-136 in "Advances in chitin chemistry", Ed. CJ Brine, 1992; Ottoy et al., Carbohydrate Polymers 29 : 17-24 (1996); Sannan et al., Macromol. Chem. 176: 1191-1195 (1975); Sannan et al, Macromol. Chem. 177: 3589-3600 (1976); Kurita et al., Chemistry Letters 1597-1598 (1989); and CA 2,101,079.

キトサンの均一な再アセチル化は、アミン基をアセチル基で置換することによって疎水部位の数を増加させる効果を有し、また、キトサンを折れやすくする結晶構造を減少させ、キトサンの上昇した溶解度において堆積する。再アセチル化は、ポリマーの再折り畳みを妨げ、直鎖を維持するため、pH依存の溶解度の減少を妨げる。一般的に、医薬品グレードおよび十分な分子量の商品であるキトサンはいずれも、再アセチル化したキトサンの調製において用いることができる。均一な再アセチル化の方法は、例えばWO 2005/097871 およびWO 03/011912において開示されている。   Uniform reacetylation of chitosan has the effect of increasing the number of hydrophobic sites by substituting the amine group with an acetyl group, and also reduces the crystal structure that makes chitosan apt to break, and in the increased solubility of chitosan. accumulate. Reacetylation prevents polymer refolding and maintains linearity, thus preventing pH-dependent solubility reduction. In general, any pharmaceutical grade and sufficient molecular weight commercial chitosan can be used in the preparation of reacetylated chitosan. Homogeneous reacetylation methods are disclosed, for example, in WO 2005/097871 and WO 03/011912.

再アセチル化後、生成物を、例えばUV方法(Muzarelli et al. in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, New York, 385- 388, (1986))によって測定する脱アセチル化度に関して、および例えばサイズ排除クロマトグラフィー(Felt et al. Int. J. Pharm. 180:185-193 (1999) )によって規定する分子量に関して特徴づける。   After reacetylation, the product is measured with respect to the degree of deacetylation as measured, for example, by the UV method (Muzarelli et al. In "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, New York, 385-388, (1986)), and For example, it is characterized in terms of molecular weight as defined by size exclusion chromatography (Felt et al. Int. J. Pharm. 180: 185-193 (1999)).

特定の実施形態において、本願明細書で記載するキトサン組成物は、組成物が25℃および中性領域におけるpHにあるとき50rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有する。より高い200rpmのせん断速度で、組成物が同じ温度およびpH条件であるとき、粘度は70mPa・sを超えない。他の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2で、組成物は20rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有する。他の実施形態によると、25℃および中性領域におけるpHで、組成物は20rpmのせん断速度で少なくとも400mPa・sの粘度を有する。他の実施形態によると、25℃および中性領域におけるpHで、組成物は100rpmのせん断速度で200mPa・s未満の粘度を有する。他の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2でヒドロゲル組成物は20rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有する。他の実施形態によると、25℃およびpH7.0±0.2でヒドロゲル組成物は50rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・s、または少なくとも200mPa・sの粘度を有する。好ましくは、25℃および中性領域におけるpHで、粘度を20rpmのせん断速度で規定するとき、組成物はpH6.0での同じ組成物よりも少なくとも2倍の粘度を有する。また好ましくは、25℃および中性領域におけるpHで、粘度を20rpmのせん断速度で規定するとき、組成物はpH6.0での同じ組成物よりも少なくとも3倍の粘度を有する。他の実施形態によると、25℃および中性領域以下のpHで、液体組成物は50rpmのせん断速度で約150mPa・s未満の粘度を有する。他の実施形態によると、25℃および中性領域以下のpHで、液体組成物は50rpmのせん断速度で約100mPa・s未満の粘度を有する。   In certain embodiments, the chitosan compositions described herein have a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm when the composition is at 25 ° C. and pH in the neutral region. At higher 200 rpm shear rates, the viscosity does not exceed 70 mPa · s when the composition is at the same temperature and pH conditions. According to another embodiment, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 20 rpm. According to another embodiment, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of at least 400 mPa · s at a shear rate of 20 rpm. According to another embodiment, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of less than 200 mPa · s at a shear rate of 100 rpm. According to another embodiment, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the hydrogel composition has a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 20 rpm. According to other embodiments, at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the hydrogel composition has a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm, or at least 200 mPa · s. Preferably, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity at least twice that of the same composition at pH 6.0 when the viscosity is defined at a shear rate of 20 rpm. Also preferably, the composition has a viscosity of at least 3 times that of the same composition at pH 6.0, when the viscosity is defined at a shear rate of 20 rpm at 25 ° C. and a pH in the neutral region. According to other embodiments, at 25 ° C. and a pH below the neutral range, the liquid composition has a viscosity of less than about 150 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. According to another embodiment, at 25 ° C. and a pH below the neutral range, the liquid composition has a viscosity of less than about 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm.

例えば図19において示すように、せん断力が弱くなるにつれて組成物の粘度が高くなる実証は、ヒドロゲルを含むゲルの特性である非ニュートン流体の挙動を示すことである。すなわち、この組成物が未分配の状態のときに、固体のような特性を有するゲルに「なる」が、これは事実、固体と比較して液体により類似した密度を有する高く水和した状態のためである。さらに、この組成物により強い力が加わったとき、ほぼ液体状態のままを維持する。さらに、実施例9において記載するように、本発明のキトサンヒドロゲルは、組成物が中性pH領域にあるときのみ形成され、低いpH値では加わるせん断力とほぼ独立である低い粘度を示す。言い換えれば、中性領域未満のpHでは、組成物はほぼ液体状態であり、例えば、in vivoのゲル形成に対する注射等の投与前に液体状態における低いpHおよび/または冷蔵保存に対して安定であることを示す。キトサンの分子量の増加は、その粘度を高くし、このポリマーは高く水和され、また高い疎水性である。これは、例えば、660kDaの分子量のタイプ1のキトサンを有する組成物FM80:50 1:1の粘度が組成物SK10:50 1:1よりもずっと高いことを示す実施例9および図19において実証され、後者は、100kDaの分子量のタイプ1キトサンを有する。より具体的には、ゲル状態において、これらの組成物はそれぞれ、約420および約110mPa・sの粘度を示す。したがって、本発明は、様々な強度および水分保持のヒドロゲルの形成を可能にする。これは、当業者も選択した分解速度、薬物放出、および機械的強度のヒドロゲルを生成することができる。   For example, as shown in FIG. 19, a demonstration that the viscosity of the composition increases as the shear force decreases is to show the behavior of non-Newtonian fluids, a characteristic of gels including hydrogels. That is, when the composition is in an undistributed state, it “gets” into a gel with solid-like properties, which in fact is a highly hydrated state with a more similar density to the liquid compared to the solid. Because. Furthermore, when a strong force is applied to the composition, it remains substantially liquid. Furthermore, as described in Example 9, the chitosan hydrogel of the present invention is formed only when the composition is in the neutral pH region and exhibits a low viscosity that is almost independent of the applied shear force at low pH values. In other words, at a pH below the neutral range, the composition is almost in the liquid state and is stable to low pH in the liquid state and / or refrigerated storage prior to administration, eg, injection to in vivo gel formation. It shows that. Increasing the molecular weight of chitosan increases its viscosity, making this polymer highly hydrated and highly hydrophobic. This is demonstrated, for example, in Example 9 and FIG. 19, which shows that the viscosity of composition FM80: 50 1: 1 with type 1 chitosan with a molecular weight of 660 kDa is much higher than composition SK10: 50 1: 1. The latter has type 1 chitosan with a molecular weight of 100 kDa. More specifically, in the gel state, these compositions exhibit viscosities of about 420 and about 110 mPa · s, respectively. Thus, the present invention allows the formation of hydrogels of varying strength and moisture retention. This can produce hydrogels with degradation rates, drug release, and mechanical strengths also selected by those skilled in the art.

好ましくは、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンのそれぞれは、約100kDaよりも大きい分子量を有する。特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンは、少なくとも約100kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも約200kDaの分子量を有する。他の特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンは、約100kDa〜約2000kDaの範囲内の分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約200kDa〜約2000kDaの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約100kDa〜約700kDa、例えば、約100kDa〜約400kDa、または約400kDa〜約700kDa等の範囲内の分子量を有し、高脱アセチル化キトサンは、約200kDa〜約250kDaの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約400kDa〜約700kDaの範囲内の分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約200kDa〜約250kDaの範囲内の分子量を有する。特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは、約100kDa;約400kDa、および約650kDaから成る群から選択される分子量を有し、高アセチル化キトサンは、約200kDa〜約250kDaの範囲内の分子量を有する。   Preferably, each of the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan has a molecular weight greater than about 100 kDa. In certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of at least about 100 kDa and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of at least about 200 kDa. In other specific embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 100 kDa to about 2000 kDa, and the highly acetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 200 kDa to about 2000 kDa. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 100 kDa to about 700 kDa, such as about 100 kDa to about 400 kDa, or about 400 kDa to about 700 kDa, and the highly deacetylated chitosan is , Having a molecular weight in the range of about 200 kDa to about 250 kDa. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 400 kDa to about 700 kDa, and the highly acetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 200 kDa to about 250 kDa. According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight selected from the group consisting of about 100 kDa; about 400 kDa, and about 650 kDa, and the highly acetylated chitosan is in the range of about 200 kDa to about 250 kDa. Has a molecular weight.

キトサンの分子量は、例えばO. Felt, P. Purrer, J. M. Mayer, B. Plazonnet, P. Burri and R. Gurny in Int. J. Pharm. 180, 185- 193 (1999)において報告されているように、サイズ排除クロマトグラフィーによって規定する。MWの上限は、必要な投与の簡便性によって規定し、これは選択した用途に依存する。   The molecular weight of chitosan is reported, for example, in O. Felt, P. Purrer, JM Mayer, B. Plazonnet, P. Burri and R. Gurny in Int. J. Pharm. 180, 185-193 (1999). Defined by size exclusion chromatography. The upper limit of MW is defined by the required ease of administration, which depends on the application chosen.

アセチル化の程度が高い結果、0〜30%DA、高値で40〜60%の範囲において疎水性が増加し、ポリマーはDAが増加するにつれてより溶解しやすくなる。さらに、N−アセチルグルコサミンの数が増加すると、リゾチームに対する認識部位の増加によって体内における分解速度が増加する。こうして、ヒドロゲルからの薬物の放出速度はキトサンアセチル化の変化によって制御できる。   As a result of the high degree of acetylation, the hydrophobicity increases in the range of 0-30% DA, high values of 40-60%, and the polymer becomes more soluble as the DA increases. Furthermore, when the number of N-acetylglucosamines increases, the degradation rate in the body increases due to an increase in recognition sites for lysozyme. Thus, the rate of drug release from the hydrogel can be controlled by changes in chitosan acetylation.

分子量の変化、脱アセチル化の程度およびアセチル化部位の分布、2個以上のキトサンの濃度および割合は、ゲル形成が起こる条件(pH,温度など)に影響を与え;溶解度;生分解性;タンパク質との結合性;活性薬物成分または他の化学物質;疎水性/親水性;水和度;ゲルの生物学的および生体適合特性、細胞成長、増殖および生存への効果、炎症または抗炎症メディエータとしての機能のキトサンの能力、おとび創傷治癒の加速または減速に対するキトサンの効果等である。   Changes in molecular weight, degree of deacetylation and distribution of acetylation sites, concentration and proportion of two or more chitosans affect the conditions (pH, temperature, etc.) under which gel formation occurs; solubility; biodegradability; protein As an active drug ingredient or other chemical; hydrophobic / hydrophilicity; degree of hydration; biological and biocompatible properties of the gel, effects on cell growth, proliferation and survival, as an inflammation or anti-inflammatory mediator Such as the ability of chitosan to function, and the effect of chitosan on acceleration or deceleration of wound healing.

例えば、高分子量のタイプ1のキトサンは、高い疎水性および高い粘度を有し、その結果高い分子間相互作用によってより強いゲルができる。高いDDAのタイプ1キトサンは、低い分解速度を有する。高い結晶性を有するタイプ1キトサンは、結晶形が不溶であるため低い分解速度を有する。こうして当業者は、その結果できたゲル混合物の特性を予測し、したがって異なる種類のキトサンの独特の組み合わせを用いて所定の特性を有するゲルを形成することができる。   For example, high molecular weight type 1 chitosan has high hydrophobicity and high viscosity, resulting in a stronger gel due to high intermolecular interactions. High DDA type 1 chitosan has a low degradation rate. Type 1 chitosan having high crystallinity has a low decomposition rate due to its insoluble crystal form. Thus, those skilled in the art can predict the properties of the resulting gel mixture and thus use a unique combination of different types of chitosan to form gels with predetermined properties.

実施例7および9において示すように、用いるキトサンの分子量の変化、それらの濃度およびタイプ1キトサンおよびタイプ2キトサン間の割合は、ゲル形成が起こる条件に影響を与える。こうして、当業者は、生理学的条件下でヒドロゲルを生成するように適切なパラメータを選択することができる。   As shown in Examples 7 and 9, changes in the molecular weight of chitosan used, their concentration and the ratio between type 1 chitosan and type 2 chitosan affect the conditions under which gel formation occurs. Thus, one skilled in the art can select appropriate parameters to produce a hydrogel under physiological conditions.

好ましくは、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約0.2%〜3%w/vの濃度で存在する。   Preferably, the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan are each present at a concentration of about 0.2% to 3% w / v of the total composition.

いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約0.5%〜2%w/vの濃度で存在する。   In some embodiments, the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan are each present at a concentration of about 0.5% to 2% w / v of the total composition.

いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンはそれぞれ、全組成物の約1%〜1.2%w/vの濃度で存在する。   In some embodiments, the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan are each present at a concentration of about 1% to 1.2% w / v of the total composition.

いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンが、上述の濃度は高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンのそれぞれに対するものであるように、1:1である。   In some embodiments, the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan are 1: 1 such that the above concentrations are for the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan, respectively.

他の実施形態において、例えば、用いるキトサンの分子量およびそれら濃度に依存して、割合は2:1、3:1および4:1でもよい。また、1.1:1,1.2:1,1.5:1,1.8:1および1:1〜4:1の範囲でいずれの割合でもよいことが考えられる。   In other embodiments, the ratio may be 2: 1, 3: 1 and 4: 1 depending on, for example, the molecular weight of chitosan used and their concentration. Further, it is conceivable that any ratio may be within the range of 1.1: 1, 1.2: 1, 1.5: 1, 1.8: 1 and 1: 1 to 4: 1.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは全組成物の約1%〜1.2%w/vの濃度で存在し、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は1:1である。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan are present at a concentration of about 1% to 1.2% w / v of the total composition, wherein the highly deacetylated chitosan and the highly acetylated chitosan in the composition The ratio of modified chitosan is 1: 1.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約400kDa〜約700kDaの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは全組成物の約1%〜1.2%w/vの濃度で存在し;組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は1:1である。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 400 kDa to about 700 kDa, and the highly acetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 200 kDa to about 250 kDa, the highly acetylated chitosan and the high Deacetylated chitosan is present at a concentration of about 1% to 1.2% w / v of the total composition; the ratio of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan in the composition is 1: 1.

特定の実施形態によると、高脱アセチル化キトサンは約2000kDaの範囲で分子量を有し、高アセチル化キトサンは約200kDa〜約250kDaの範囲で分子量を有し、高脱アセチル化キトサンの濃度は組成物の0.5%w/vであり、組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は1:2,1:3および1:4である。   According to certain embodiments, the highly deacetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 2000 kDa, the highly acetylated chitosan has a molecular weight in the range of about 200 kDa to about 250 kDa, and the concentration of the highly deacetylated chitosan is the composition 0.5% w / v of the product, and the ratio of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan in the composition is 1: 2, 1: 3 and 1: 4.

一般的に、ヒドロゲルを形成するために用いるいずれかのキトサン、とくにタイプ1キトサンのMWが増加すると、逆にその濃度が下がり、キトサンのMWの減少は、ヒドロゲルを形成するためにそれらの高い濃度が必要となることが推測される。   In general, increasing the MW of any chitosan used to form a hydrogel, particularly type 1 chitosan, conversely decreases its concentration, and reducing the chitosan's MW increases their high concentration to form a hydrogel. Is estimated to be necessary.

本願明細書で記載する組成物は、例えば、前述したキトサン/β−グリセロリン酸ヒドロゲルと比較して、形成したヒドロゲルの特性、例えば、ヒドロゲル強度、分解速度、および放出速度等を制御する可能性が必要である。   The compositions described herein may control the properties of the formed hydrogel, such as hydrogel strength, degradation rate, release rate, etc., for example as compared to the chitosan / β-glycerophosphate hydrogel described above. is necessary.

本発明のヒドロゲルは、異なる分子量または脱アセチル化度を有するタイプ1またはタイプ2のいずれかから選択した第3キトサンを有し、その結果できたヒドロゲルを制御する。   The hydrogel of the present invention has a third chitosan selected from either type 1 or type 2 with different molecular weights or degrees of deacetylation, and controls the resulting hydrogel.

本発明に従った多糖ヒドロゲルは、随意的にはさらに、負に帯電した多糖または負に帯電したリン脂質等の負に帯電した物質を有する。負に帯電した多糖は、様々な動物由来の多糖、植物由来の多糖、グルコサミノグリカンおよびそれら組み合わせがある。グリコサミノグリカンには、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれら組み合わせがある。   The polysaccharide hydrogel according to the present invention optionally further comprises a negatively charged substance such as a negatively charged polysaccharide or a negatively charged phospholipid. Negatively charged polysaccharides include various animal-derived polysaccharides, plant-derived polysaccharides, glucosaminoglycans and combinations thereof. Examples of glycosaminoglycans include chondroitin sulfate, dermatan sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, hyaluronic acid, keratan sulfate, and combinations thereof.

例示的に適切なリン脂質は、ホスファチジルコリンである。特定の実施形態によると、キトサン組成物はさらにヒアルロン酸およびホスファチジルコニンを有する。この組成物は、骨関節症の治療における滑液の置換として用いることができ高く有効であり、実施例6において記載するように、軟骨表面間の摩擦を軽減する。   An exemplary suitable phospholipid is phosphatidylcholine. According to certain embodiments, the chitosan composition further comprises hyaluronic acid and phosphatidylconine. This composition can be used as a synovial fluid replacement in the treatment of osteoarthritis and is highly effective and reduces friction between cartilage surfaces as described in Example 6.

いくつかの実施形態において、本願明細書で記載するキトサン生成物はさらにグリコサミノグリカンおよびリン脂質の両方を有する。   In some embodiments, the chitosan products described herein further have both glycosaminoglycans and phospholipids.

このように、これらの2種類のキトサンを基にした異なる組成物および混合物は、広範囲の用途に対して適切な特性を有するヒドロゲルを提供するために用いる。例示的な用途には、限定することはないが、例えば、薬剤または薬物の遅延放出、様々な濃度の足場に対する、薬物送達システムがあり、細胞成長を支持するまたは骨格構造支持に対するゲルもあり;滑液回復;組織再構築;傷跡の残らない治療およびマクロファージ活性化を促進する創傷被覆剤;人工皮膚の製造;人工腎臓膜;骨充填;および踵痛回復および滑液回復組成物がある。   Thus, these two different chitosan-based compositions and mixtures are used to provide hydrogels with suitable properties for a wide range of applications. Exemplary applications include, but are not limited to, drug delivery systems, eg, delayed release of drugs or drugs, various concentrations of scaffolds, and gels that support cell growth or support skeletal structures; Synovial fluid recovery; tissue remodeling; wound dressings that promote scar-free treatment and macrophage activation; artificial skin manufacture; artificial kidney membrane; bone filling; and colic recovery and synovial fluid recovery compositions.

ヒドロゲルは、そのまま(in vivo)皮下、腹腔内、筋肉内または生物学的に関連のある組織、骨欠損、骨折、関節腔、体内管、眼袋、または充実性腫瘍において形成する。   Hydrogels form in vivo, subcutaneously, intraperitoneally, intramuscularly or in biologically relevant tissues, bone defects, fractures, joint cavities, body vessels, eye bags, or solid tumors.

多糖溶液は、動物またはヒト体内に注射または内視鏡投与によって導入する。   The polysaccharide solution is introduced into the animal or human body by injection or endoscopic administration.

薬物、ポリペプチド、マイクロ生物体、動物またはヒト細胞は、ゲル化する前に多糖溶液内に取り入れる。   Drugs, polypeptides, micro-organisms, animal or human cells are taken up in a polysaccharide solution before gelling.

本発明に従うと、本願明細書で記載する組成物から形成した多糖ゲルを、化粧品、薬学、医学および/または手術において用いる生体適合性の分解可能な材料を生成する用途も提供する。   In accordance with the present invention, polysaccharide gels formed from the compositions described herein are also provided for generating biocompatible degradable materials for use in cosmetics, pharmacy, medicine and / or surgery.

ここで、ヒドロゲルは、これらの溶液を本願明細書で記載する生理学的条件に露呈するとき、本願明細書で記載するキトサン水溶液から形成した準固体ゲルを包囲する。ヒドロゲルは、好ましくは、キトサン組成物を投与するときin vivoで形成するが、代案として、例えば移植等に利用する前にex vivoで形成する。   Here, the hydrogel surrounds the quasi-solid gel formed from the aqueous chitosan solution described herein when these solutions are exposed to the physiological conditions described herein. The hydrogel is preferably formed in vivo when the chitosan composition is administered, but alternatively, it is formed ex vivo prior to use, for example, for implantation.

ゲルは、全体を、または構成物として、動物もしくはヒトのいずれかにおける、移植可能な装置もしくは回復するための移植、組織および/もしくは臓器の再構築および/または再置換に組み込む。   The gel is incorporated in whole or as a component into implantable devices or implants for recovery, tissue and / or organ remodeling and / or replacement in either animals or humans.

ゲルは、全体を、または構成物として、移植可能な、経皮的もしくは皮膚的薬物送達システムに用いる。   Gels are used in whole or as a construct for implantable, transdermal or dermal drug delivery systems.

ゲルは、全体を、または構成物として、眼科移植または薬物送達システムに用いる。   Gels are used in whole or as constructs for ophthalmic implants or drug delivery systems.

ゲルは、同様の生物工学ハイブリッド材料および組織のエンジニアリングおよび培養に用いる細胞搭載(cell-loaded)人工材料を生成するために用いる。   Gels are used to produce similar biotechnological hybrid materials and cell-loaded artificial materials for use in tissue engineering and culture.

搭載した細胞は、軟骨細胞(人工滑液)、線維軟骨肉腫(メニスカス)、靭帯線維芽細胞(靭帯)、皮膚線維芽細胞(皮膚)、腱細胞(腱)、筋線維芽細胞(筋肉)、間充織幹細胞、ケラチノサイト(皮膚)、および神経と、含脂肪細胞または骨髄細胞から成る群から選択する。事実、増殖することができるいずれかの組織からの細胞は、随意的にこの構築物において組み込むことができる。   The loaded cells are chondrocytes (artificial synovial fluid), fibrochondrosarcoma (meniscus), ligament fibroblasts (ligament), skin fibroblasts (skin), tendon cells (tendon), myofibroblasts (muscle), Selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, keratinocytes (skin), and nerves, and adipocytes or bone marrow cells. In fact, cells from any tissue that can proliferate can optionally be incorporated into the construct.

創傷治癒の主な損傷は、生物膜の存在である。生物膜は、少なくとも80パーセント存在する、キトサンに類似した通常正に帯電した細胞外高分子から成る。キトサンは随意的には生物膜妨害物として使用し、創傷を衛生にし、バクテリアを破壊するときの生体膜の阻害効果を制限する。ラクトフェリンと混合したキトサンゲルは、随意的にはいずれかの慢性的な創傷または慢性的になる創傷における生体膜を破壊する遅延放出保有宿主として機能する。キシリトールと混合したキトサンゲルも、随意的には特異的な生体膜妨害物となる。   The main damage of wound healing is the presence of biofilm. Biofilms consist of normally positively charged extracellular macromolecules similar to chitosan, present at least 80 percent. Chitosan is optionally used as a biofilm blocker to limit the biological membrane's inhibitory effects when hygienizing wounds and destroying bacteria. Chitosan gel mixed with lactoferrin optionally serves as a delayed release reservoir that destroys biological membranes in any chronic wound or chronic wound. Chitosan gel mixed with xylitol also optionally becomes a specific biomembrane barrier.

本発明によると、動物もしくはヒトの生理学的場所での骨様、線維軟骨様、または滑液様のin situ形成に対する支持体、キャリア、再構成装置または置換体として機能する注射可能なまたは移植可能なゲルバイオ材料としての搭載した多糖ゲルの用途も提供する。   In accordance with the present invention, an injectable or implantable that functions as a support, carrier, reconstitution device or replacement for bone-like, fibrocartilage-like, or synovial fluid-like in situ formation in an animal or human physiological location The use of the loaded polysaccharide gel as a novel gel biomaterial is also provided.

例えば、本発明に従ったキトサンゲルは、眼の治療に対する持続送達薬物システムとして有効である。キトサン化合物の眼球刺激テストを基にした結果は、キトサン調製物がそれらの優れた耐久力を基にした眼科ゲルとして用いるために適切であることを示す(Molinaro et. al., 2002)。   For example, the chitosan gel according to the present invention is effective as a sustained delivery drug system for ocular treatment. The results based on the eye irritation test of chitosan compounds show that chitosan preparations are suitable for use as ophthalmic gels based on their superior durability (Molinaro et. Al., 2002).

本発明のさらなる実施形態によると、遅延放出薬物送達ヒドロゲルシステムは、高くアセチル化したタイプ1キトサンおよび高く脱アセチル化したタイプ2キトサンを有するように提供する。   According to a further embodiment of the present invention, a delayed release drug delivery hydrogel system is provided having highly acetylated type 1 chitosan and highly deacetylated type 2 chitosan.

本発明のいずれの薬物送達システムは、様々な薬物の送達に使用でき、限定することはないが、鎮痛剤、麻酔薬、抗ニキビ剤、老化防止剤、抗バクテリア剤、構成物質、抗火傷剤、抗鬱剤、抗皮膚炎剤、抗浮腫剤、抗ヒスタミン剤、抗蠕虫感染剤、抗コレステロール症用薬、抗炎症薬、抗刺激剤、抗脂質異常症薬、抗菌剤、抗真菌薬、抗酸化剤、かゆみ止め薬、抗脂質異常症薬、抗酒さ剤、抗脂漏薬、防腐剤、抗膨張剤、抗ウイルス剤、抗酵母剤、心・血管作動薬、化学療法薬、コルチコステロイド、抗カビ剤、ホルモン、ヒドロキシ酸、角質溶解薬、ラクタム、マイトサイド、非ステロイド抗炎症薬、シラミ駆除剤、プロゲスチン、治療薬、疥癬虫殺虫剤、および血管拡張剤がある。   Any drug delivery system of the present invention can be used to deliver a variety of drugs including, but not limited to, analgesics, anesthetics, anti-acne agents, anti-aging agents, anti-bacterial agents, constituents, anti-burn agents , Antidepressant, anti-dermatitis agent, anti-edema agent, anti-histamine agent, anti-helminth infection agent, anti-cholesterol drug, anti-inflammatory agent, anti-irritant agent, antilipidemic agent, antibacterial agent, antifungal agent, antioxidant agent , Anti-itch agent, antilipidemic agent, anti-rosacea, anti-seborrheic agent, antiseptic, anti-swelling agent, antiviral agent, anti-yeast agent, cardiovascular agent, chemotherapeutic agent, corticosteroid, There are anti-fungal agents, hormones, hydroxy acids, keratolytic agents, lactams, mitides, non-steroidal anti-inflammatory agents, lice control agents, progestins, therapeutic agents, scabicides, and vasodilators.

他の態様によると、本発明は安定なヒドロゲルの生成方法を提供するが、この方法は、酢酸水溶液に約40〜約60%の範囲でアセチル化度を有する少なくとも1個の高アセチル化キトサンおよび約20%以上のアセチル化度を有する少なくとも1個の高脱アセチル化キトサンを溶解し、複合溶液を形成するステップと;複合溶液のpHを6.5〜7.2の値に調整するステップと;複合溶液の温度を37℃まで上げ、pH値を7.0〜7.6まで上げるステップを有し、25℃で50rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有するヒドロゲルを形成する。   According to another aspect, the present invention provides a method of producing a stable hydrogel, which method comprises at least one highly acetylated chitosan having a degree of acetylation in an aqueous acetic acid solution in the range of about 40 to about 60% and Dissolving at least one highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation of about 20% or more to form a complex solution; adjusting the pH of the complex solution to a value of 6.5 to 7.2; Raising the temperature of the composite solution to 37 ° C. and raising the pH value to 7.0-7.6 to form a hydrogel having a viscosity of at least 100 mPa · s at 25 ° C. and a shear rate of 50 rpm.

いくつかの実施形態において、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンの溶解は、同じ容器において同時に行う。   In some embodiments, the dissolution of the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan occurs simultaneously in the same vessel.

随意的には、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンの溶解は、別々の溶液において行い2種類の溶液を生成する。この実施形態において、このプロセスはさらに、これらの2種類の溶液を混合して複合溶液を生成するステップを有する。   Optionally, the dissolution of highly acetylated chitosan and highly deacetylated chitosan is performed in separate solutions to produce two solutions. In this embodiment, the process further comprises the step of mixing these two solutions to form a composite solution.

さらに本発明のいくつかの実施形態によると、本願明細書で記載するプロセスによって形成したpH依存および温度依存のヒドロゲルを提供する。   Further, according to some embodiments of the present invention, there are provided pH-dependent and temperature-dependent hydrogels formed by the processes described herein.

本発明はさらに、高脱アセチル化キトサンおよびキトサンオリゴマー等の様々な単糖オリゴマーの混合物も本願明細書で記載するように所定の特性を有するヒドロゲルを形成することもわかる。   The present invention further shows that mixtures of various monosaccharide oligomers such as highly deacetylated chitosan and chitosan oligomers also form hydrogels with certain properties as described herein.

このように、本発明のさらなる態様によると、約100〜約4000kDa、例えば約100kDa~yaku 2000kDa(キトサンポリマー)の範囲で分子量および約20%以上のアセチル化度を有する少なくとも1個の高脱アセチル化キトサンと、約200〜約2000kDaの範囲で分子量を有する少なくとも1個のキトサンオリゴマーを有するキトサン組成物を提供し、この組成物は、水溶液の形である。キトサンオリゴマーは、約20%以上のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンオリゴマーである、または代案として、約40%〜約60%、例えば約45%〜約55%の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサンオリゴマーである。特定の実施形態において、高脱アセチル化キトサンオリゴマーは、約15%以下のアセチル化度を有する。特定の実施形態によると、単糖オリゴマーは3〜約100の間のD−グルコサミンオリゴマーである。特定の実施形態において、D−グルコサミンオリゴマーは、3〜約50単位を有する。特定の実施形態において、単糖オリゴマーは最大7単位を有するN−アセチル−D−グルコサミンオリゴマーである。いくつかの実施形態において、単糖オリゴマーおよび高脱アセチル化キトサンポリマー間の割合は1:1であり、とりわけ、高アセチル化キトサンおよびキトサンオリゴマーのMWに依存して、2:1〜20:1の範囲もよい。   Thus, according to a further aspect of the present invention, at least one high deacetylation having a molecular weight and a degree of acetylation of about 20% or more in the range of about 100 to about 4000 kDa, such as about 100 kDa to yaku 2000 kDa (chitosan polymer). There is provided a chitosan composition having a modified chitosan and at least one chitosan oligomer having a molecular weight in the range of about 200 to about 2000 kDa, wherein the composition is in the form of an aqueous solution. The chitosan oligomer is a highly deacetylated chitosan oligomer having a degree of acetylation of about 20% or more, or alternatively, a degree of acetylation in the range of about 40% to about 60%, such as about 45% to about 55%. It is a highly acetylated chitosan oligomer. In certain embodiments, the highly deacetylated chitosan oligomer has a degree of acetylation of about 15% or less. According to certain embodiments, the monosaccharide oligomer is between 3 and about 100 D-glucosamine oligomers. In certain embodiments, the D-glucosamine oligomer has 3 to about 50 units. In certain embodiments, the monosaccharide oligomer is an N-acetyl-D-glucosamine oligomer having up to 7 units. In some embodiments, the ratio between the monosaccharide oligomer and the highly deacetylated chitosan polymer is 1: 1, especially depending on the MW of the highly acetylated chitosan and chitosan oligomer 2: 1 to 20: 1. The range of is also good.

したがって、高アセチル化キトサンの濃度は、例えば、1%、2%、4%、10%であり、いずれの濃度も1〜20%(w/w)の範囲内である。   Therefore, the concentration of highly acetylated chitosan is, for example, 1%, 2%, 4%, 10%, and any concentration is in the range of 1-20% (w / w).

オリゴマーの濃度は所定の割合にしたがって選択する。   The concentration of the oligomer is selected according to a predetermined ratio.

単糖キトサンオリゴマーは、pH6.5およびそれ以上で水溶性であり、高アセチル化キトサンの「保護基」として機能し、本願明細書で記載するように高アセチル化キトサンによって影響された類似体と同様である。   Monosaccharide chitosan oligomers are water soluble at pH 6.5 and above, function as “protecting groups” for highly acetylated chitosan, and analogs affected by highly acetylated chitosan as described herein. It is the same.

特定の実施形態において、25℃および中性領域におけるpHで、組成物は50rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有する。特定の実施形態において、25℃および中性領域におけるpHで組成物は200rpmのせん断速度で70mPa・s未満の粘度を有する。   In certain embodiments, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 50 rpm. In certain embodiments, at 25 ° C. and pH in the neutral region, the composition has a viscosity of less than 70 mPa · s at a shear rate of 200 rpm.

キトサンポリマーおよびキトサンオリゴマーの組み合わせを有するヒドロゲルは、本願明細書で記載するいずれかの用途において利用でき、実施例8において記載するように調製する。   Hydrogels having a combination of chitosan polymer and chitosan oligomer can be utilized in any of the applications described herein and are prepared as described in Example 8.

本明細書を通して、本発明の様々な実施形態は範囲フォーマットにおいて存在する。範囲フォーマットにおける記載は、単に利便性および簡潔のためであり、本発明の融通のきかない制限として解釈されない。したがって、範囲の説明は、詳細に説明したすべての可能な部分的な範囲および範囲内のそれぞれの数値を有すると考えられる。例えば、1〜6等の範囲の説明は、1〜3,1〜4,1〜52〜4,2〜6,3〜6などの具体的に説明した部分的な範囲および例えば1,2,3,4,5および6の範囲内のそれぞれの数字として考えられる。これは、範囲の幅に関係なく適応する。   Throughout this specification, various embodiments of this invention exist in a range format. The description in range format is merely for convenience and brevity and is not to be construed as an inflexible limitation of the invention. Accordingly, the description of a range is considered to have all the possible subranges described in detail and each numerical value within the range. For example, the description of the range of 1 to 6 etc. is a partial range specifically described such as 1 to 3, 1 to 4, 1 to 52 to 4, 2 to 6, 3 to 6 and the like, for example 1, 2, Considered as each number in the range of 3, 4, 5 and 6. This applies regardless of the range width.

数の範囲を本願明細書に示す時はいつでも、示した範囲内のいずれかの示した数字(分数または整数)を含むことを意味する。第1数字および第2数字の「間の範囲」および第1数字「から」第2数字「まで」の「範囲」は、本願明細書で置換可能であり、第1および第2数字をおよびすべてのそれらの間の分数および整数を含むことを意味する。   Whenever a range of numbers is given herein, it is meant to include any indicated number (fractional or integer) within the indicated range. The “range” between the first number and the second number and the “range” of the first number “to” and the second number “to” are interchangeable herein, and the first and second numbers and all Is meant to include fractions and integers between them.

本願明細書で用いるように、用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための方法、手段、技術および手順を意味し、限定することはないが、化学的、薬学的、生物学的、生化学的および医学的技術者の熟練者に既知の、または方法、手段、技術および手順によって容易に応用できるかのいずれかのそれらの方法、手段、技術および手順を示す。   As used herein, the term “method” means a method, means, technique and procedure for accomplishing a given task, including but not limited to chemical, pharmaceutical, biological Those methods, means, techniques and procedures, either known to those skilled in biochemical and medical technicians, or readily applicable by methods, means, techniques and procedures, are indicated.

本願明細書で用いるように、用語「処理」は、状態の進行を無効にする、ほぼ阻害する、遅延するまたは回復させる、状態の臨床的または美観的症状をほぼ改善する、または症状状態の臨床的または美観の症状の発症をほぼ予防することを含む。   As used herein, the term “treatment” refers to negating, almost inhibiting, delaying or reversing the progression of a condition, substantially improving a clinical or aesthetic symptom of a condition, or clinical of a symptomatic condition. This includes almost preventing the onset of symptomatic or aesthetic symptoms.

別々の実施形態の内容において明らかに記載するように、本発明の特定の特徴も、一つの実施形態の組み合わせにおいて提供する。逆に、一つの実施形態のないようにおいて簡単のため説明するように、本発明の様々な特徴も、本発明のいずれかの他の示した実施形態において別々にまたは適切な組み合わせにおいて提供する。様々な実施形態の内容において記載した特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしで効果がない限り、それらの実施形態の重要な特徴と考えられる。   Certain features of the present invention are also provided in combination with one embodiment, as clearly described in the context of separate embodiments. Conversely, as described for simplicity in the absence of one embodiment, the various features of the invention are also provided separately or in any appropriate combination in any other illustrated embodiment of the invention. Certain features that are described in the content of the various embodiments are considered to be important features of those embodiments, unless the embodiment is effective without those elements.

上述したようにおよび以下の請求項において示すように本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的な支持をされる。   As described above and as set forth in the following claims, various embodiments and aspects of the invention are experimentally supported in the following examples.

実施例1
キトサンヒドロゲルの調製
アセチル化度15%および分子量65kDaのキトサン(Koyo, Japan)を、0.9% HClと24時間混合することによって溶解し、3%(w/v)のキトサン濃度を有するタイプ1キトサン溶液を生成した。
Example 1
Preparation of Chitosan Hydrogel Chitosan (Koyo, Japan) having a degree of acetylation of 15% and a molecular weight of 65 kDa is dissolved by mixing with 0.9% HCl for 24 hours and has a chitosan concentration of 3% (w / v) A chitosan solution was produced.

51%脱アセチル化度および220kDaの分子量の均一に脱アセチル化したキトサン(Koyo, Japan)を0.9% HClと24時間混合することによって溶解し、3%(w/v)のキトサン濃度を有するタイプ2キトサン溶液を生成した。   Uniformly deacetylated chitosan (Koyo, Japan) with a degree of 51% deacetylation and a molecular weight of 220 kDa was dissolved by mixing with 0.9% HCl for 24 hours to obtain a chitosan concentration of 3% (w / v). A type 2 chitosan solution was produced.

タイプ1およびタイプ2キトサン溶液を、タイプ1のタイプ2に対する割合が1:1,1:2および1:3となるように混合し、pH6.8で滴定し、24時間4℃で放置し、その後さらに、水酸化ナトリウムでpH7.3まで4℃で滴定した。   Type 1 and Type 2 chitosan solutions were mixed so that the ratio of Type 1 to Type 2 was 1: 1, 1: 2 and 1: 3, titrated at pH 6.8 and left at 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, it was further titrated with sodium hydroxide to pH 7.3 at 4 ° C.

その結果できた組成物は室温で液体であった。温度が37℃まで上昇しpH7.4まで上昇したとき、液体溶液は図1に示すような安定な準固体ヒドロゲルを生成した。   The resulting composition was liquid at room temperature. When the temperature rose to 37 ° C. and rose to pH 7.4, the liquid solution produced a stable quasi-solid hydrogel as shown in FIG.

実施例2
キトサンヒドロゲルの分解プロファイル
疑似熱硬化性ヒドロゲル(3%w/v)を、上述の実施例1において記載したように、均一にアセチル化したタイプ2キトサンおよび非均一に脱アセチル化したタイプ1キトサンを用いて調製した(ヒドロゲルA)。ヒドロゲルAは、1:1,1:2および1:3の割合で調製した。異なるヒドロゲル(ヒドロゲルB)をヒドロゲルAに対して用いたのと同じタイプ2キトサンおよび分子量100kDaのタイプ1非均一キトサンを用いて調製した。
Example 2
Degradation profile of chitosan hydrogel A pseudo-thermosetting hydrogel (3% w / v) was prepared from homogeneously acetylated type 2 chitosan and non-homogeneously deacetylated type 1 chitosan as described in Example 1 above. (Hydrogel A). Hydrogel A was prepared at 1: 1, 1: 2 and 1: 3 ratios. A different hydrogel (hydrogel B) was prepared using the same type 2 chitosan used for hydrogel A and a type 1 heterogeneous chitosan with a molecular weight of 100 kDa.

各ゲル1グラムは、3重の50mLのプラスチックチューブに入れた。   One gram of each gel was placed in a triple 50 mL plastic tube.

10%ウシ血清培養液3mLアリコートを各チューブに予め定めた時間間隔で(1,2,3,4,5,6および7日目)加えた。各時間間隔の最後に、繰り返し50mLの精製水を加え、数時間室温に放置し、また、水を除去することによって24時間以上3回洗浄した。洗浄プロセスは、ゲルからのすべての可溶な材料を除去した。   A 3 mL aliquot of 10% bovine serum culture was added to each tube at predetermined time intervals (1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 days). At the end of each time interval, 50 mL of purified water was repeatedly added, left at room temperature for several hours, and washed three times for 24 hours or more by removing water. The washing process removed all soluble material from the gel.

その後、ゲルを凍結、凍結乾燥および重量を測定した。重量分解は、時間間隔の関数として、サンプルの重量における変化から計算した。   The gel was then frozen, lyophilized and weighed. The weight resolution was calculated from the change in sample weight as a function of time interval.

血清酵素によるヒドロゲルの分解を図2Aにおいて示す。   Degradation of the hydrogel by serum enzymes is shown in FIG. 2A.

2種類の異なる分解動態は、図2Aにおいて示した各組成物によって示し;最初の急速相は3〜6日内に終結し、遅い相は、14日後に部分的な分解を示す。ゲルの分解速度は、タイプ1に対するタイプ2の高い割合を有する組成物においてより敏速であり、すなわち、1:1組成物は1:3組成物より敏速に分解する。急速相は、高い可溶性で容易にタイプ2キトサンの分解に反映し、血清酵素によって容易に認識される。遅延動態相は、キトサンタイプ1に関連し、血清酵素によって容易に認識されず消化されない。   Two different degradation kinetics are shown by each composition shown in FIG. 2A; the first rapid phase is terminated within 3-6 days, and the slow phase shows partial degradation after 14 days. The degradation rate of the gel is more rapid in compositions having a high ratio of type 2 to type 1, ie, a 1: 1 composition degrades more rapidly than a 1: 3 composition. The rapid phase is highly soluble and easily reflects in the degradation of type 2 chitosan and is easily recognized by serum enzymes. The delayed kinetic phase is associated with chitosan type 1 and is not easily recognized or digested by serum enzymes.

グルコサミンポリマーの再アセチル化の制御は、リゾチームによるキトサンの認識の程度を操作し、また、その結果ヒドロゲル分解の速度を操作するのに非常に重要なツールである。酵素活性を制御する主な要因は、ポリマーにおけるN−アセチルグルコサミン(GlNAc)のパーセンテージである(Ran et al., 2005)。この理由は、キトサンタイプ2における再アセチル化度が50%から35%への減少が、分解速度を非常に減少させ、その結果ずっと浅い傾きとなる。一方、タイプ1キトサンのアセチル化度が増加すると、その結果、ポリマーの分解が速くなる。2種類のキトサンの適切な組み合わせの選択は、図2Aにおいて示した2個の傾きの代わりに、経時の1個の線形分解カーブとなる。加えて、タイプ1キトサンの分子量の少なくとも100kDaまでの増加は、組成物の分解速度を減少させ、図2Bにおいて示すように、分解の線形速度となる。   Controlling the reacetylation of glucosamine polymers is a very important tool for manipulating the degree of chitosan recognition by lysozyme and consequently manipulating the rate of hydrogel degradation. The main factor controlling enzyme activity is the percentage of N-acetylglucosamine (GlNAc) in the polymer (Ran et al., 2005). The reason for this is that a reduction in the degree of reacetylation from 50% to 35% in chitosan type 2 greatly reduces the degradation rate, resulting in a much shallower slope. On the other hand, increasing the degree of acetylation of type 1 chitosan results in faster polymer degradation. The selection of the appropriate combination of the two types of chitosan results in one linear decomposition curve over time instead of the two slopes shown in FIG. 2A. In addition, increasing the molecular weight of type 1 chitosan to at least 100 kDa reduces the degradation rate of the composition, resulting in a linear rate of degradation, as shown in FIG. 2B.

実施例3
キトサンヒドロゲルによるタンパク質の遅延放出
本願明細書で遅延放出運搬体として示したキトサン疑似熱硬化性ヒドロゲルの潜在力を研究するため、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミン(BSA)を溶質として用いた。これらの化合物は、タンパク質標準としてよく用いられる。
Example 3
Delayed release of protein by chitosan hydrogel To study the potential of the chitosan pseudo-thermosetting hydrogel shown here as a delayed release vehicle, hemoglobin and bovine serum albumin (BSA) were used as solutes. These compounds are often used as protein standards.

上述の実施例1において記載したキトサン混合物を含み、両キトサンの最終濃度が3.5%である1mLの溶液に、BSA25μlアリコートおよび40μlヘモグロビンを加え、その結果、ヒドロゲルにおける最終濃度がそれぞれ4mg/mLおよび1mg/mLとなるようにした。タンパク質含有ヒドロゲルを3mLPBSにおいて1週間37°
で培養した。培地を毎日交換し、図3〜7において示すように、ヒドロゲルから放出されたタンパク質の量を測定した。
To a 1 mL solution containing the chitosan mixture described in Example 1 above, with a final concentration of both chitosans of 3.5%, 25 μl aliquots of BSA and 40 μl hemoglobin were added so that the final concentration in the hydrogel was 4 mg / mL each And 1 mg / mL. Protein-containing hydrogel in 3 mL PBS for 1 week at 37 °
In culture. The medium was changed daily and the amount of protein released from the hydrogel was measured as shown in FIGS.

図3において示すように、すべての試験において、多量のヘモグロビンが最初に放出され、放出速度は時間とともに減少した。最初の破裂が示さなかった。   As shown in FIG. 3, in all tests, a large amount of hemoglobin was first released and the release rate decreased with time. No initial burst was shown.

BSAはヘモグロビンと同じプロファイルを示した(図4および5)。ほぼ線形の傾きを得た(図4)。BSAのゲルとの混合は、ゲルの安定性を改善し、キトサン混合物のみと比較してタンパク質放出速度は減少した。   BSA showed the same profile as hemoglobin (Figures 4 and 5). A nearly linear slope was obtained (FIG. 4). Mixing BSA with the gel improved the stability of the gel and decreased the protein release rate compared to the chitosan mixture alone.

放出したBSAの量対分解したゲルの量の割合の比較(図7)は、タンパク質の放出速度がゲル分解速度よりも速いことを示した。   A comparison of the ratio of the amount of BSA released to the amount of gel degraded (FIG. 7) showed that the rate of protein release was faster than the rate of gel degradation.

図7において示したデータは、タイプ1キトサンのアセチル化度および分子量に関連し、その結果タンパク質放出プロファイルにおいて毎日放出速度が減少した。しかし、2種類のキトサンのアセチル化度および分子量等のさらなる変数の適切な選択によって、ゲルの特性を規定でき、また、キトサン構造に対するタンパク質薬物の親和性を改良することができる。この特定の組み合わせは、特定の薬物の放出速度を一定にできることが期待され、拡散およびマトリクス分解速度の組み合わせに反映する。   The data shown in FIG. 7 is related to the degree of acetylation and molecular weight of type 1 chitosan, resulting in a decrease in daily release rate in the protein release profile. However, by proper selection of additional variables such as the degree of acetylation and molecular weight of the two chitosans, the properties of the gel can be defined and the affinity of the protein drug for the chitosan structure can be improved. This particular combination is expected to provide a constant release rate for a particular drug and reflects a combination of diffusion and matrix degradation rates.

実施例4
創傷被覆材としてのキトサンヒドロゲルのin vivo研究
デブスナラットは、高脂肪の食事で飼育して育ったとき糖尿病症状を発症することで知られており、2型糖尿病のモデルとして用いた。これらの動物は、重度の感染症、壊疽および敗血症を発症しやすく、病的状態および死さえも引き起こすため、糖尿病の慢性皮膚潰瘍を刺激する、また皮膚創傷治癒の研究に優れたモデルとして考えられる。
Example 4
In vivo study of chitosan hydrogel as a wound dressing Debsna rats are known to develop diabetic symptoms when raised on a high fat diet and were used as a model for type 2 diabetes. These animals are prone to develop severe infections, gangrene and sepsis, cause morbidity and even death, thus stimulating diabetic chronic skin ulcers and considered as excellent models for studying skin wound healing .

皮膚を評価し創傷を回復させる共通のパラメータには、
1.修復組織において見られる新血管形成の時間
2.好中球活性の減少
3.加速したマクロファージ活性
4.創傷の完全上皮形成による創傷の閉鎖の時間
5.ケラチン生成細胞単分子層の形成
6.線維芽細胞−堆積細胞外マトリクスネットワークによる上皮および真皮相の結合
がある。
Common parameters for evaluating the skin and healing the wound include
1. 1. Neovascularization time seen in repaired tissue 2. reduced neutrophil activity 3. Accelerated macrophage activity 4. Time of wound closure due to complete epithelialization of the wound 5. Formation of keratinocyte monolayer There is an epithelial and dermal phase connection by a fibroblast-deposited extracellular matrix network.

キトサン混合物の組成物は、高脱アセチル化キトサン(660kDa,DA15)、高アセチル化キトサン(220kDa,DA50)および1〜7単位のN−アセチル−D−グルコサミンオリゴマー(Koyo, Osaka, Japan)の混合物を含む。製剤は、それぞれ、1:0.8:0.2の割合の3個の成分を有する。   The composition of the chitosan mixture is a mixture of highly deacetylated chitosan (660 kDa, DA15), highly acetylated chitosan (220 kDa, DA50) and 1-7 units of N-acetyl-D-glucosamine oligomer (Koyo, Osaka, Japan). including. Each formulation has three components in a ratio of 1: 0.8: 0.2.

25匹のメス成熟デブスナラット、それぞれ体重150〜160グラムを用いた。   Twenty-five female mature fatsna rats, each weighing 150-160 grams, were used.

13匹は、0日目の前に4〜6週間開始した高脂肪の食事の投与後糖尿病を発症した。   Thirteen animals developed diabetes after administration of a high fat meal starting 4-6 weeks before Day 0.

正常な血糖値(正常血糖)を有する6匹は、高脂肪食事を与えたとき糖尿病に対して抗体を有し、第1対照として使用し、正常の低脂肪、低カロリーの食事を与えたときの正常血糖を有する6匹を第2対照として使用した。   Six animals with normal blood glucose levels (normoglycemia) have antibodies against diabetes when fed a high fat diet, used as a primary control, and fed a normal low fat, low calorie diet Six animals with normoglycemia were used as the second control.

0日目に、2mm直径の丸い貫通パンチ生検を、Metriconventer−production装置を用いて首の毛を剃った皮膚に、表皮、真皮および筋肉までの皮下組織に施した。   On day 0, a 2 mm diameter round penetrating punch biopsy was performed on the shaved skin of the neck using a Metriconventer-production device and on the subcutaneous tissue down to the epidermis, dermis and muscle.

7匹の糖尿病動物の怪我を、実施例1のキトサンベースのゲルを創傷範囲に投与することによって処理し、さらに6匹の動物を未処理とした。ゲルは、処理群の創傷範囲に毎日再塗布した。対照群における半分の動物において、ギブス包帯を創傷全体に覆い、残りの半分は覆わなかった。   Seven diabetic animal injuries were treated by administering the chitosan-based gel of Example 1 to the wound area and a further six animals were untreated. The gel was reapplied daily to the wound area of the treatment group. In half of the animals in the control group, the Gibbs bandage was covered over the entire wound and the other half was not covered.

7日間、すべての動物は超接写写真を撮り、創傷の大きさを3日おきに測定した。体重および血中グルコース濃度をデジタルグルコメーター(Ascensia Elite of Bayer)を用いて、ラットの尾をカットして垂れた血液を吸うことによって1週間に1回測定した。   For 7 days, all animals were super close-up photographed and wound size was measured every 3 days. Body weight and blood glucose concentration were measured once a week using a digital glucometer (Ascensia Elite of Bayer) by cutting the rat's tail and sucking drooping blood.

7日後、動物を殺し、貫通生検を実行した。皮膚を収集し固定化溶液に入れた。皮膚サンプルをさらに組織学的および免疫組織化学染色し、処理および未処理の創傷の違いを評価した。   Seven days later, the animals were killed and a penetration biopsy was performed. The skin was collected and placed in an immobilization solution. Skin samples were further histologically and immunohistochemically stained to assess differences between treated and untreated wounds.

得られた結果は、ゲルで処理したラットが創傷表面面積によって評価すると創傷治癒において統計学的に大きく増加したことを示す(図9)。代表的な組織学的サンプルは、図8Aにおいて示す滑らかな表面に示すように、創傷治癒を証明するが、対照の未処理のサンプル(図8B)は創傷治癒を証明しない。   The results obtained show that rats treated with the gel have a statistically significant increase in wound healing as assessed by wound surface area (FIG. 9). A representative histological sample demonstrates wound healing as shown in the smooth surface shown in FIG. 8A, whereas the control untreated sample (FIG. 8B) does not demonstrate wound healing.

実施例5
腱板回復
腱板裂傷は、肩痛の一般的な原因である。腱板損傷の発生は、年齢とともに増加し、最も頻度が高いのは、スポーツまたは外傷よりも腱の変性によって起こる。提案される治療は、リハビリテーションから裂傷した腱の手術まで幅広い。最良の治療は、全患者に対して異なり、実際に多くの患者はそれらの怪我の満足な回復を得られていない。
Example 5
Rotator Cuff Recovery A rotator cuff tear is a common cause of shoulder pain. Incidence of rotator cuff increases with age, most frequently due to tendon degeneration rather than sports or trauma. Proposed treatments range from rehabilitation to ruptured tendon surgery. The best treatment is different for all patients, and in fact many patients have not obtained a satisfactory recovery of their injuries.

本発明は、いくつかの実施形態において、自己細胞を超音波診断装置コントロール下で腱板裂傷に送達することができる注射可能な生成物を提供することによって背景技術のこれらの欠点を克服する。他の実施形態において、注射可能な生成物は、例えば組織治癒等の骨髄細胞の移植を可能にする。   The present invention, in some embodiments, overcomes these drawbacks of the background art by providing an injectable product that can deliver autologous cells to a rotator cuff tear under the control of an ultrasound diagnostic device. In other embodiments, the injectable product enables bone marrow cell transplantation, such as tissue healing.

好ましくは、この手順は、外来患者または局所麻酔が必要な外来患者に行う。   Preferably, this procedure is performed on an outpatient or an outpatient in need of local anesthesia.

ゲルの最初の液体特性によって腱裂傷範囲にすべて接着させることができる。   The initial liquid properties of the gel can all be adhered to the tendon laceration area.

in vivo実験を、腱損傷および回復のためにラットに行った(外科的に損傷させた腱)。損傷した腱を縫合し、本願明細書で示すキトサンヒドロゲルおよび骨髄細胞で処理した;対照の動物は縫合しただけである。20匹の動物を3カ月実験した。組織学的に、腱の回復および筋肉萎縮の防止が共に達成された。   In vivo experiments were performed on rats (surgically damaged tendons) for tendon injury and recovery. Injured tendons were sutured and treated with chitosan hydrogel and bone marrow cells as indicated herein; the control animals were only sutured. Twenty animals were tested for 3 months. Histologically, both tendon recovery and prevention of muscle atrophy were achieved.

さらに、in vivo実験を外科的に腱板損傷したラットに行った。この損傷を上述したように処理した。手術後6週間の組織の組織学的スライスは、反対側の肩におけるみ未処理の対照欠陥と比較して、内因性細胞が隣り合う組織から捕捉され、損傷部位の状態を改良したことを示す。例示的な結果を図10A(処理)および図10B(未処理)において示す。   In addition, in vivo experiments were performed on rats with surgically damaged rotator cuffs. This damage was treated as described above. A histological slice of tissue 6 weeks after surgery shows that endogenous cells have been captured from adjacent tissue and improved the condition of the injury site compared to an untreated control defect on the contralateral shoulder. . Exemplary results are shown in FIG. 10A (processed) and FIG. 10B (unprocessed).

実施例6
キトサン混合物を、プロテオグリカン(例えばコンドロイチン硫酸)、ヒアルロン酸、および/またはリン脂質(例えばホスファチジルコリン)等の負に帯電した物質の保有宿主として機能するように設計した。この混合物は、正常の滑液を刺激するレオロジー特性を有し、軟骨再生および関節機構の是正、および例えば骨関節症における用途が可能である。
Example 6
The chitosan mixture was designed to function as a reservoir for negatively charged substances such as proteoglycans (eg chondroitin sulfate), hyaluronic acid, and / or phospholipids (eg phosphatidylcholine). This mixture has rheological properties that stimulate normal synovial fluid and can be used for cartilage regeneration and correction of joint mechanisms, and for example in osteoarthritis.

これらの組成物の特性を評価するため、静止摩擦係数をin vitroで2個の平坦な軟骨表面間で測定し、様々な試験組成物を用いた。組成物の使用後、軟骨表面を他方の上に一方を載せ、一端をゆっくり徒手で持ち上げた。運動が開始した正確な角度をデジタル傾斜計で測定した。規定を3回にわたって行い、平均静止摩擦係数μを、http://www.pa.uky.edu/~phy211/Friction_book.htmlにおいて開示され図11において示すように数式μ≦tan(傾斜角度)に従って計算した。   To evaluate the properties of these compositions, the coefficient of static friction was measured in vitro between two flat cartilage surfaces and various test compositions were used. After use of the composition, the cartilage surface was placed one on top of the other and one end slowly lifted manually. The exact angle at which movement began was measured with a digital inclinometer. The regulation is performed three times, and the average static friction coefficient μ is disclosed in http://www.pa.uky.edu/~phy211/Friction_book.html and shown in FIG. 11 according to the formula μ ≦ tan (inclination angle). Calculated.

図12は、正常軟骨の2層間の静止摩擦係数を表し:ヒドロゲルを用いていない対照システム(「Saline(生理食塩水)」で示す);キトサンタイプ1(660kDaのMW;DA15)およびキトサンタイプ2(220kDaのMW;DA50)を有するキトサンヒドロゲルの組み合わせ(「Combination(組み合わせ)」で示す);前述したキトサンヒドロゲルの組み合わせにさらに0.1%コンドロイチン硫酸を有する(+CSと示す)、前述したキトサンヒドロゲルの組み合わせにさらに0.1%コンドロイチン硫酸および0.1%ホスファチジルコリンを有する(+CS/PCと示す)、および1%ヒアルロン酸溶液(HAと示す)に対して測定した。   FIG. 12 represents the coefficient of static friction between the two layers of normal cartilage: a control system without hydrogel (shown as “Saline”); chitosan type 1 (660 kDa MW; DA15) and chitosan type 2 Chitosan hydrogel combination (denoted “Combination”) with MW of 220 kDa (DA50); chitosan hydrogel previously described with 0.1% chondroitin sulfate (denoted + CS) in addition to the chitosan hydrogel combination previously described In combination with 0.1% chondroitin sulfate and 0.1% phosphatidylcholine (shown as + CS / PC), and 1% hyaluronic acid solution (shown as HA).

得られたデータは、コンドロイチン硫酸およびホスファチジルコリンと組み合わせたタイプ1およびタイプ2キトサンを有するヒドロゲル組成物の組み合わせが滑液様の摩擦係数となることを明らかに示す。   The data obtained clearly shows that the combination of hydrogel compositions with type 1 and type 2 chitosan combined with chondroitin sulfate and phosphatidylcholine results in a synovial fluid-like coefficient of friction.

実施例7
キトサンヒドロゲルの形成条件の制御
キトサンポリマー(またはオリゴマー)は、その分子量、その脱アセチル化度、その結晶度およびそのアセチル基の分布モードによって規定する。
Example 7
Control of formation conditions of chitosan hydrogel A chitosan polymer (or oligomer) is defined by its molecular weight, its degree of deacetylation, its degree of crystallinity and its distribution mode of acetyl groups.

水溶液に脱アセチル化キトサンの溶解は限度がある。例えば、HCl0.15Nを用いると、200kDa以上のMWを有するキトサンは、約10%(w/v)未満の濃度の溶液となり、分子量が増加すると、最高溶液濃度は生理学的NaCl濃度となる。高濃度のHCl(または酢酸等の他の酸)は、高濃度のキトサン溶液が可能である。   There is a limit to the dissolution of deacetylated chitosan in aqueous solution. For example, with HCl 0.15N, chitosan with a MW of 200 kDa or more becomes a solution with a concentration of less than about 10% (w / v), and as the molecular weight increases, the maximum solution concentration becomes the physiological NaCl concentration. High concentrations of HCl (or other acids such as acetic acid) can be highly concentrated chitosan solutions.

最も一般的な購入可能なキトサンは、5〜30%の低DA(アセチル化度)を有し、本願明細書ではタイプ1キトサンと表す。タイプ1キトサンは、6.5以上のpHで溶液から沈殿する。したがって、生理学的環境でタイプ1キトサン溶液は存在せず、キトサンの実施等の現在の用途は、様々な種類の固体キトサンを用いる。   The most common commercially available chitosan has a low DA (degree of acetylation) of 5-30% and is referred to herein as type 1 chitosan. Type 1 chitosan precipitates out of solution at a pH of 6.5 or higher. Thus, there is no Type 1 chitosan solution in a physiological environment, and current applications such as chitosan practice use various types of solid chitosan.

50%まで均一に脱アセチル化したまたは30〜60%まで均一に再アセチル化したキトサンをタイプ2キトサンと表す。このキトサンは、高脱アセチル化キトサン(タイプ1)と比較して、水溶液において優れた溶解性を有し、また、一般的にその濃度に依存して中性および生理学的pHで溶解する。220kDaのMWおよび3%(w/v)以上の濃度を有する例示的なこのキトサンは、7.5以上のpHでゲルを形成する。
キトサンポリマーの混合物を用いたヒドロゲル形成
Chitosan that has been uniformly deacetylated to 50% or uniformly reacetylated to 30-60% is designated as type 2 chitosan. This chitosan has superior solubility in aqueous solution compared to highly deacetylated chitosan (type 1) and generally dissolves at neutral and physiological pH depending on its concentration. This exemplary chitosan having a MW of 220 kDa and a concentration of 3% (w / v) or higher forms a gel at a pH of 7.5 or higher.
Hydrogel formation using a mixture of chitosan polymers

タイプ1キトサンおよびタイプ2キトサンを生理学的pHおよび特定の条件下で混合すると、ポリマーの沈殿は観察されず、その代わり混合物はヒドロゲルを形成する。ヒドロゲル形成には、タイプ1キトサンのタイプ2キトサンによる「被覆」(または「保護」)があり、2種類のキトサン間の親和性によって影響され、それらの間の相互作用をもたらす(例えば、ヒドロゲル結合、疎水性相互作用および/またはファンデルワールス力)。   When Type 1 chitosan and Type 2 chitosan are mixed under physiological pH and certain conditions, no polymer precipitation is observed, instead the mixture forms a hydrogel. Hydrogel formation includes a “coating” (or “protection”) of type 1 chitosan with type 2 chitosan, which is influenced by the affinity between the two types of chitosan, resulting in an interaction between them (eg, hydrogel binding Hydrophobic interaction and / or van der Waals forces).

ゲル化プロセスは、数分間または何日もかかり、システムの粘度の連続的な増加によって証明される。   The gelation process takes minutes or days and is evidenced by a continuous increase in the viscosity of the system.

行った(ex vivo)実験において、ヒドロゲル形成は、側面に最初の溶液を有するガラス管を回転させ、溶液が流れるか、またはその代わりに準固体のゲルが形成してガラス管の底に堆積しているかどうかを評価することによって規定する。ゲル形成は、チューブの種類、形態およびパラメータ(例えば直径)および評価時間に依存する。   In ex vivo experiments, hydrogel formation is accomplished by rotating a glass tube with the original solution on the side and the solution flows or instead a quasi-solid gel is formed and deposited at the bottom of the glass tube. It is specified by evaluating whether or not. Gel formation depends on tube type, morphology and parameters (eg diameter) and evaluation time.

この実験において、ヒドロゲル形成は以下のように規定した;1mLの溶液を14mm(直径)丸底ガラスフラスコにおいて、37℃で一晩培養した。その後、ガラス管を水平にし、液体の流れがあるかないかを規定した。液体の流れがないことはハイドゲルが形成したことを示す。ヒドロゲルは、全量の水を含みおよび準固体状態において硬いままであった。流れが存在するが「よく区別できない」構造も、ヒドロゲルが形成したことを示す。液体流れの存在および/または2つの異なる相、固体および液体の形成は、ヒドロゲルが形成していないことを示す。
ヒドロゲル形成の制御
材料
In this experiment, hydrogel formation was defined as follows: 1 mL of the solution was incubated overnight at 37 ° C. in a 14 mm (diameter) round bottom glass flask. The glass tube was then leveled to determine if there was a liquid flow. The absence of liquid flow indicates the formation of a hyde gel. The hydrogel contained all of the water and was hard in the quasi-solid state. Structures where there is a flow but are not well distinguished also indicate that a hydrogel has formed. The presence of a liquid stream and / or the formation of two different phases, solid and liquid, indicates that no hydrogel has formed.
Control materials for hydrogel formation

2個の購入可能な高く脱アセチル化したポリマー(キトサンタイプ1)をこの実験において用いた:
FM(登録商標)80(MW=660kDa;85%DDA(脱アセチル化度);および
FM(登録商標)80S(MW=420kDa;91.3%DDA)を、共にKoyo,Osaka,Japanから購入した。
Two commercially available highly deacetylated polymers (chitosan type 1) were used in this experiment:
FM® 80 (MW = 660 kDa; 85% DDA (degree of deacetylation); and FM® 80S (MW = 420 kDa; 91.3% DDA) were both purchased from Koyo, Osaka, Japan. .

高アセチル化キトサン(キトサンタイプ2)、DAC(登録商標)50(MW=220kDa;50%DDA)もKoyo,Osaka,Japanから購入した。
分析プロトコール
Highly acetylated chitosan (chitosan type 2), DAC® 50 (MW = 220 kDa; 50% DDA) was also purchased from Koyo, Osaka, Japan.
Analysis protocol

貯蔵液の調製。キトサンポリマー(粉末)をHCl 0.15Nで混合し、溶液を24時間室温で撹拌した。以下のように貯蔵液を作成した:
FM(登録商標)80−2 2%(w/v)溶液
FM(登録商標)80S−2 2%(w/v)DAC(登録商標)50−3 3%(w/v)
Stock solution preparation. The chitosan polymer (powder) was mixed with HCl 0.15N and the solution was stirred for 24 hours at room temperature. The stock solution was made as follows:
FM (registered trademark) 80-2 2% (w / v) solution FM (registered trademark) 80S-2 2% (w / v) DAC (registered trademark) 50-3 3% (w / v)

混合物生成。上述の貯蔵溶液を用いて、各キトサンの所定の最終濃度(w/v)および所定のそれらの割合を有する混合物を調製した。例示的な混合物は、FM(登録商標)80:DAC(登録商標)50が1.2:1.2であり、各キトサンは最終濃度1.2%(w/v)であり、それらの割合が1:1である。   Mixture formation. Using the stock solution described above, a mixture having a predetermined final concentration (w / v) of each chitosan and a predetermined ratio thereof was prepared. An exemplary mixture is FM® 80: DAC® 50 is 1.2: 1.2, each chitosan is at a final concentration of 1.2% (w / v), their proportions Is 1: 1.

滴定。上述の混合物を、氷浴で(0℃)NaOH(2N,1Nおよび0.5N濃度)で約7.3のpHとなるまでゆっくり滴定した。1mLのサンプルをその後混合物から滴定間連続的に取り、各サンプルを14mmガラス管に入れた。サンプルを密封し、37℃で一晩培養した。   Titration. The above mixture was slowly titrated in an ice bath (0 ° C.) with NaOH (2N, 1N and 0.5N concentrations) to a pH of about 7.3. A 1 mL sample was then taken continuously from the mixture during the titration and each sample was placed in a 14 mm glass tube. Samples were sealed and incubated overnight at 37 ° C.

ゲル形成試験。各ガラス管を水平にし、ゲル形成を上述のように規定した。   Gel formation test. Each glass tube was leveled and gel formation was defined as described above.

結果。以下の表1は、様々なFM(登録商標)80:DAC(登録商標)50混合物に対して得られた結果を示す。   result. Table 1 below shows the results obtained for various FM® 80: DAC® 50 mixtures.

Figure 0005746617
Figure 0005746617

この結果は、15%DAの660kDaキトサンタイプ1(およびFM(登録商標)80と類似の結晶度)およびDAC(登録商標)50の等しい(1:1)w/w割合の混合物は、各キトサンの最終濃度が0.8%(w/v)となるとき、pH7.5付近でゲルを形成することを示す。   This result shows that a mixture of 15% DA 660 kDa chitosan type 1 (and similar crystallinity as FM® 80) and DAC® 50 with an equal (1: 1) w / w ratio for each chitosan When the final concentration of is 0.8% (w / v), it indicates that a gel is formed around pH 7.5.

この混合物は、各キトサンの最終濃度1.2%(w/v)で、各キトサンの最終濃度1%(w/v)の混合物と比較して(7.6〜7.7)、広いpH領域でヒドロゲルを形成し(7.42〜7.66)、したがって、最終濃度が高いとヒドロゲル形成に対するpH領域が広くなることを示す(本願明細書で記載する)。   This mixture has a final pH of 1.2% (w / v) for each chitosan compared to a mixture of 1% (w / v) final concentration of each chitosan (7.6-7.7) and a broad pH. It forms a hydrogel in the region (7.42-7.66), thus indicating that a higher final concentration indicates a wider pH region for hydrogel formation (described herein).

FM80:DAC50割合が1:1より高いとき(例えば1:0.6)、ヒドロゲルは形成されない。   When the FM80: DAC50 ratio is higher than 1: 1 (eg 1: 0.6), no hydrogel is formed.

以下の表2は、様々なFM(登録商標)80S:DAC(登録商標)50混合物に対して得られた結果を示す。   Table 2 below shows the results obtained for various FM® 80S: DAC® 50 mixtures.

Figure 0005746617
Figure 0005746617

これらの結果はさらに、各ポリマーの約1%の最低濃度が示した条件下pH7.5付近でヒドロゲル形成するために必要であることを支持する。   These results further support that a minimum concentration of about 1% of each polymer is necessary to form a hydrogel near pH 7.5 under the indicated conditions.

これらの実験は、試験したシステムにおいてヒドロゲル形成に影響を与えるパラメータには、pH,キトサンタイプ1およびタイプ2ポリマーの相対割合(w/w)、各キトサンポリマーの分子量(MW)、各キトサンポリマーの最終濃度および温度があることを示す。   These experiments show that parameters affecting hydrogel formation in the tested system include pH, relative proportions of chitosan type 1 and type 2 polymers (w / w), molecular weight of each chitosan polymer (MW), Indicates final concentration and temperature.

pH。ゲル形成はpH依存であり、溶液混合物は特定のpH領域でのみヒドロゲルを形成する。このpH領域は、キトサンの最終濃度が高くなるほど広くなる。絶対pH値は、キトサン最終濃度が低くなるほど増加する。   pH. Gel formation is pH dependent and the solution mixture forms a hydrogel only at certain pH regions. This pH range becomes wider as the final concentration of chitosan increases. The absolute pH value increases with decreasing chitosan final concentration.

例えば、420kDaのMWを有するキトサンタイプ1および220kDaのMWを有するタイプ2キトサンは、それぞれ1〜1.2%の濃度で1:1w/w割合であり、ゲルが4℃で形成されるpH領域は7.4〜7.7である。高いpH値では、沈殿が観察される。   For example, chitosan type 1 having a MW of 420 kDa and type 2 chitosan having a MW of 220 kDa have a 1: 1 w / w ratio at a concentration of 1 to 1.2%, respectively, and a pH region in which a gel is formed at 4 ° C. Is 7.4 to 7.7. At high pH values, precipitation is observed.

4℃でのpH値は、25℃で0.5低いpH値と相互に関連することに留意されたい。したがって、4℃でのpHは、25℃でpH6.9となる。   Note that the pH value at 4 ° C correlates with a pH value that is 0.5 lower at 25 ° C. Therefore, the pH at 4 ° C. becomes pH 6.9 at 25 ° C.

タイプ1キトサンの最終濃度。タイプ1キトサンは、ヒドロゲルの骨格と考えられる。したがって、ヒドロゲル形成は、タイプ1キトサンの最終濃度に依存する。タイプ1キトサンのMWが増加すると、組成物における最終濃度が減少し、逆に、すなわち、MWが減少すると組成物における最終濃度が高くなる。   Final concentration of type 1 chitosan. Type 1 chitosan is considered the backbone of the hydrogel. Thus, hydrogel formation depends on the final concentration of type 1 chitosan. Increasing the MW of Type 1 chitosan decreases the final concentration in the composition, conversely, decreasing the MW increases the final concentration in the composition.

タイプ1キトサンの分子量。高いMWのタイプ1キトサンの使用は、pH機能領域、すなわちヒドロゲル形成が可能な領域を減少させる。例えば、MW660kDaのタイプ1キトサンを有する組成物は、pH領域7.4〜7.7においてヒドロゲルを形成するが、MW2000kDaのタイプ1キトサンを有する組成物は、pH領域7.0〜7.3においてヒドロゲルを形成する。さらに、タイプ1キトサンのMWが増加すると、必要なタイプ2キトサンの相対濃度が増加する。さらに、タイプ1キトサンの濃度が高くなると(例えば0.5%まで)、ヒドロゲル形成が起こるpH領域が7.2〜7.4までシフトする(4℃で)。   Molecular weight of type 1 chitosan. The use of high MW type 1 chitosan reduces the pH functional area, ie the area where hydrogel formation is possible. For example, a composition having a MW 660 kDa type 1 chitosan forms a hydrogel in the pH range 7.4-7.7, whereas a composition having a MW 2000 kDa type 1 chitosan is in the pH range 7.0-7.3. Form a hydrogel. Furthermore, increasing the MW of type 1 chitosan increases the required relative concentration of type 2 chitosan. Furthermore, as the concentration of type 1 chitosan increases (eg, up to 0.5%), the pH region where hydrogel formation occurs shifts to 7.2-7.4 (at 4 ° C.).

さらに、タイプ1キトサンのMWが減少すると(例えば420kDaから200kDaまで)、ヒドロゲル形成に必要なキトサンの濃度は増加する。200kDa以下のMWのタイプ1キトサンに必要な例示的な濃度は、1.2〜1.5%(w/v)以上である。この条件下で、ヒドロゲル形成に対するpH値は、7.5〜7.8にシフトする(4℃で)。   Furthermore, as the MW of type 1 chitosan decreases (eg from 420 kDa to 200 kDa), the concentration of chitosan required for hydrogel formation increases. Exemplary concentrations required for MW type 1 chitosan below 200 kDa are 1.2-1.5% (w / v) or higher. Under this condition, the pH value for hydrogel formation shifts to 7.5-7.8 (at 4 ° C.).

タイプ2キトサンの濃度。タイプ1キトサンおよびタイプ2キトサンの最小相対濃度がヒドロゲル形成に必要である(例えば1:1割合)。加えて、一定の最終濃度にタイプ1キトサンを維持し、タイプ2キトサン濃度を増やすと、ヒドロゲル形成に対する他のパラメータの範囲が広がる(例えば、pH機能領域が増加する)。タイプ2キトサン濃度の増加は、さらにヒドロゲルが形成するpHを低くする。   Concentration of type 2 chitosan. A minimum relative concentration of type 1 chitosan and type 2 chitosan is required for hydrogel formation (eg 1: 1 ratio). In addition, maintaining Type 1 chitosan at a constant final concentration and increasing Type 2 chitosan concentration broadens the range of other parameters for hydrogel formation (eg, increases the pH functional area). Increasing the type 2 chitosan concentration further lowers the pH at which the hydrogel forms.

タイプ2キトサンの分子量。220kDaより高いMWのタイプ2キトサンを用いると、混合物におけるタイプ2キトサンの相対濃度が低くなる。高いMWのタイプ2キトサンによって、高い保護が起こり、キトサンタイプ1の安定性が改良される(広範囲のタイプ1キトサンのMW)。この条件で、ヒドロゲル形成するpH領域は広がる。   Molecular weight of type 2 chitosan. Using a MW type 2 chitosan higher than 220 kDa results in a lower relative concentration of type 2 chitosan in the mixture. High MW type 2 chitosan provides high protection and improves the stability of chitosan type 1 (extensive type 1 chitosan MW). Under this condition, the pH region where the hydrogel is formed is expanded.

例えば、MW2000kDaのタイプ2キトサンおよびMW660kDaのキトサンを用いると、ヒドロゲル形成するpHは約7.8であるが、2000kDaのタイプ2キトサンおよび2000kDaのタイプ1キトサンを用いると、ヒドロゲル形成するpHは約7.6である。   For example, when using MW 2000 kDa type 2 chitosan and MW 660 kDa chitosan, the pH for hydrogel formation is about 7.8, but when using 2000 kDa type 2 chitosan and 2000 kDa type 1 chitosan, the pH for hydrogel formation is about 7 .6.

温度。温度は、ヒドロゲル形成速度に線形的に影響を与える。したがって、37℃で、ヒドロゲルは室温または4℃よりも速く形成される。   temperature. Temperature linearly affects the hydrogel formation rate. Thus, at 37 ° C, the hydrogel forms faster than room temperature or 4 ° C.

タイプ1キトサンおよびタイプ2キトサンの相対割合。ヒドロゲル形成に必要な割合は、各キトサンのMWに依存する。例えば、タイプ1キトサンのMWが増加すると(例えば2000kDaまで)、必要な濃度は約0.5%まで減少する可能性がある。しかし、タイプ2およびタイプ1間の割合が、例えば2:1,3:1、および4:1まで増加すると推定される。   Relative proportion of type 1 chitosan and type 2 chitosan. The proportion required for hydrogel formation depends on the MW of each chitosan. For example, as the MW of type 1 chitosan increases (eg up to 2000 kDa), the required concentration may decrease to about 0.5%. However, it is estimated that the ratio between Type 2 and Type 1 increases to, for example, 2: 1, 3: 1, and 4: 1.

タイプ2キトサンのMWが220kDaから例えば2000kDaまで増加すると、ヒドロゲル形成に必要な最低濃度は、例えば0.5%(1%の代わり)まで減少し、これは高いMWのタイプ1キトサンを用いて割合が約1:1であるときである。   As the MW of type 2 chitosan increases from 220 kDa to, for example, 2000 kDa, the minimum concentration required for hydrogel formation decreases to, for example, 0.5% (instead of 1%), which is proportionate with high MW type 1 chitosan Is about 1: 1.

実施例8
高アセチル化および高脱アセチル化キトサンオリゴマーおよび高脱アセチル化キトサンポリマーから形成したキトサンヒドロゲル
高脱アセチル化キトサンのオリゴマーは、同じ脱アセチル度を有する高脱アセチル化キトサンポリマーと異なり、6.5より高いpHで可溶である。したがって、高脱アセチル化キトサンポリマー(例えば200〜2000kDaの分子量)のキトサンオリゴマー(例えば200〜2000kDaのMW)を組み合わせた混合物からのヒドロゲルの形成を試験した。
Example 8
Chitosan hydrogels formed from highly acetylated and highly deacetylated chitosan oligomer and highly deacetylated chitosan polymer Soluble at high pH. Therefore, the formation of hydrogels from mixtures combining chitosan oligomers (eg 200-2000 kDa MW) of highly deacetylated chitosan polymers (eg 200-2000 kDa molecular weight) was tested.

タイプ1キトサンポリマー(MW660)の溶液を、ヒドロゲル形成を評価するため、高く脱アセチル化したオリゴマー(MW200〜1500Da)の溶液とそれぞれ混合した。高く脱アセチル化したオリゴマーは、溶液において最終濃度1%、2%、4%および10%で存在し、高く脱アセチル化したポリマーは最終濃度1%で存在した。試験した割合(オリゴマー対ポリマー)は1:1,2:1,4:1および10:1であった。   A solution of type 1 chitosan polymer (MW 660) was each mixed with a highly deacetylated oligomer (MW 200-1500 Da) solution to evaluate hydrogel formation. Highly deacetylated oligomers were present in solution at final concentrations of 1%, 2%, 4% and 10%, and highly deacetylated polymers were present at a final concentration of 1%. The ratios tested (oligomer to polymer) were 1: 1, 2: 1, 4: 1, and 10: 1.

1:1溶液を除いた、すべての試験混合物はキトサンヒドロゲルを形成し、驚くべきことに、高脱アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンポリマーおよび高脱アセチル化キトサンオリゴマーの混合物はヒドロゲルを形成した。   Except for the 1: 1 solution, all test mixtures formed chitosan hydrogels, and surprisingly, a mixture of highly deacetylated chitosan highly deacetylated chitosan polymer and highly deacetylated chitosan oligomer formed a hydrogel. .

同様に、ヒドロゲル形成は、タイプ1キトサンポリマー(MW420;DA9)および高脱アセチル化キトサンオリゴマー(MW200〜2000Da)の組み合わせで様々な割合を用いて評価した。加えて、キトサンオリゴマーの位置における異なる単糖を用いた組み合わせを試験した。表3において示すように、その結果は、キトサンヒドロゲルは:単糖およびN−アセチル−D−グルコサミンのオリゴマー;単糖およびD−グルコサミンのオリゴマー;フルクトース;メチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースで形成することを示す。逆に、ヒドロゲル形成はオリゴマーデンプン、ラミナリンまたはイヌリンを用いて観察されなかった。

Similarly, hydrogel formation was evaluated using various ratios with combinations of type 1 chitosan polymer (MW420; DA9) and highly deacetylated chitosan oligomer (MW200-2000 Da). In addition, combinations with different monosaccharides at the chitosan oligomer position were tested. As shown in Table 3, the results show that chitosan hydrogels are formed with: monosaccharides and oligomers of N-acetyl-D-glucosamine; monosaccharides and oligomers of D-glucosamine; fructose; methylcellulose and hydroxyethylcellulose. Conversely, hydrogel formation was not observed with oligomeric starch, laminarin or inulin.

Figure 0005746617
Figure 0005746617

同様の結果は、すなわち、ヒドロゲル形成は、高脱アセチル化キトサンポリマー(例えばMW200〜2000kDa)および高アセチル化キトサンオリゴマー(例えばMW1000〜20000Da)の混合物に対して得られる。   Similar results, i.e., hydrogel formation, is obtained for a mixture of highly deacetylated chitosan polymer (e.g. MW 200-2000 kDa) and highly acetylated chitosan oligomer (e.g. MW 1000-20000 Da).

実施例9
高アセチル化および高脱アセチル化キトサンポリマーから形成したキトサンヒドロゲルの粘度実験
実施例7において記載した主旨を、キトサンポリマーから形成した様々なヒドロゲルの粘度実験において立証した。
Example 9
Viscosity experiments of chitosan hydrogels formed from highly acetylated and highly deacetylated chitosan polymers The main points described in Example 7 were demonstrated in the viscosity experiments of various hydrogels formed from chitosan polymers.

材料および方法
この実験において用いたキトサンポリマーを、すべてKoyo(Osaka, Japan)から購入し、表4において示す。
Materials and Methods All chitosan polymers used in this experiment were purchased from Koyo (Osaka, Japan) and are shown in Table 4.

Figure 0005746617
Figure 0005746617

組み合わせたキトサン溶液を2つのいずれかの方法で調製した。一つの方法では、タイプ1およびタイプ2キトサンの貯蔵溶液をそれぞれ、実施例7において示したように、所定の濃度で調製した。1℃または25℃のいずれかでNaOHで遅滴の滴定を、所定のpHとなるまで行った。代案の方法では、予め重さをはかった粉末のタイプ1およびタイプ2キトサンを、例えばHCl(0.15N)または酢酸(0.25N)等の酸性溶液と混合した。可溶化した後、溶液を1℃または25℃のいずれかで所定のpHとなるまでNaOHでゆっくり滴定した。   A combined chitosan solution was prepared in one of two ways. In one method, stock solutions of type 1 and type 2 chitosan were each prepared at a predetermined concentration as shown in Example 7. A slow titration with NaOH at either 1 ° C. or 25 ° C. was performed until a predetermined pH was reached. In an alternative method, pre-weighed powder type 1 and type 2 chitosan were mixed with an acidic solution such as HCl (0.15 N) or acetic acid (0.25 N). After solubilization, the solution was slowly titrated with NaOH at either 1 ° C. or 25 ° C. until a predetermined pH was reached.

FML(登録商標)、SK(登録商標)10またはFM(登録商標)80のいずれかとDAC(登録商標)50との混合物を有する溶液を、それぞれ1:1(それぞれFVL:50 1:1;SK10:50 1:1およびFM80:50 1:1)の割合で調製した。サンプル(0.5mL)を51780の範囲係数を有するコーンスピンドルに取り付けたBrookfield RVDV-II+ Pro viscometerにおいて分析した。範囲係数を回転速度(RPM)によって分けると、センチポアズ(cP)において測定した最大粘度を規定する。したがって、例えば、200RPMでこのシステムにおいて最大250cPの粘度が測定できる。
結果
Solutions with a mixture of either FML®, SK® 10 or FM® 80 and DAC® 50 were each 1: 1 (FVL: 50 1: 1 respectively; SK10 : 50 1: 1 and FM 80:50 1: 1). Samples (0.5 mL) were analyzed on a Brookfield RVDV-II + Pro viscometer attached to a cone spindle with a range factor of 51780. Dividing the range factor by the rotational speed (RPM) defines the maximum viscosity measured in centipoise (cP). Thus, for example, a viscosity of up to 250 cP can be measured in this system at 200 RPM.
result

図13は、DAC(登録商標)50を1%(ダイアモンド印)または2%(四角印);またはFM(登録商標)80を1%(アスタリスク印);またはFM(登録商標)80およびDAC(登録商標)50を1:1の割合(楕円印)有する組成物から得た結果を示す。   FIG. 13 shows DAC® 50 at 1% (diamond mark) or 2% (square mark); or FM® 80 at 1% (asterisk mark); or FM® 80 and DAC ( The result obtained from the composition which has a ratio (registered trademark) 50 of 1: 1 (oval mark) is shown.

図13において示すように、タイプ1キトサン(FM(登録商標)80SまたはFM(登録商標)80)の1%溶液は25℃で約4.5〜6.5の試験したpH領域において低い粘度を有する。高いpH値まで滴定すると、これらの組成物の粘度は、キトサンが沈殿するため規定できず、明らかにキトサンのpKaを超える。これらの結果によって、1個の高脱アセチル化キトサンを有する溶液はin vivoの用途に適切でないことがわかる。タイプ2キトサンDAC(登録商標)50の1%溶液は、25℃で約5.4〜約7.6の試験したpH領域においても可溶であり、in vivoで用いることができることに匹敵するが、低い粘度を示しヒドロゲルを形成しない。逆に、溶液FM80:50の1:1の組み合わせの溶液は、図13において示すように、約6.5のpHおよび25℃で液体から準固体のゲルに転移する。とくに、このpHで、組成物は非ニュートン挙動を示し始め、さらにpHが高くなるとその粘度が高くなる、すなわち、pH6.9で約175mPa・sの粘度となる。これらの結果は、分子量660kDaの15%アセチル化した(すなわち高く脱アセチル化した)キトサンおよび分子量220kDaの50%アセチル化した(すなわち高くアセチル化した)キトサンの1:1の混合物が生理学的条件でヒドロゲルを形成するために適切なことを示す。   As shown in FIG. 13, a 1% solution of type 1 chitosan (FM® 80S or FM® 80) has a low viscosity in the tested pH range of about 4.5-6.5 at 25 ° C. Have. When titrated to high pH values, the viscosity of these compositions cannot be defined as chitosan precipitates and clearly exceeds the pKa of chitosan. These results indicate that a solution with one highly deacetylated chitosan is not suitable for in vivo applications. A 1% solution of type 2 chitosan DAC® 50 is soluble in the tested pH range of about 5.4 to about 7.6 at 25 ° C., comparable to that it can be used in vivo. It exhibits a low viscosity and does not form a hydrogel. Conversely, a 1: 1 combination solution of solution FM 80:50 transitions from a liquid to a quasi-solid gel at a pH of about 6.5 and 25 ° C., as shown in FIG. In particular, at this pH, the composition begins to exhibit non-Newtonian behavior and increases at higher pH, i.e., at a pH of 6.9, a viscosity of about 175 mPa · s. These results show that a 1: 1 mixture of 15% acetylated (ie, highly deacetylated) chitosan with a molecular weight of 660 kDa and 50% acetylated (ie, highly acetylated) chitosan with a molecular weight of 220 kDa was observed at physiological conditions. It is appropriate to form a hydrogel.

図14は、高脱アセチル化キトサンFVL(登録商標)および高アセチル化キトサンDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせ(ダイアモンド印);まあは高脱アセチル化キトサンSK(登録商標)10およびDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせ(四角印)を有する組成物で得られた結果を示す。図14は、各混合物FVL:50 1:1およびSK10:50 1:1は中性に近いpH値で粘度が大きく増加し、準固体のヒドロゲルを形成することを示す。これらの結果は、高アセチル化キトサンの高脱アセチル化キトサンとの組み合わせが、中性pHで後者の沈殿を防ぎ、ヒドロゲル形成を可能にすることを確証する。加えて、SK10:50の1:1の粘度は、pH値全体でFVL:50 1:1よりもずっと高い。とくに、pH約7で、これらの混合物はそれぞれ約55および42mPa・sの粘度を示す。これらの混合物は、高脱アセチル化キトサンの分子量のみが異なる、すなわちそれぞれ100および650kDaであるため、高脱アセチル化キトサンの分子量が、本発明のヒドロゲル組成物の粘度および非ニュートン流体の挙動を規定するためにpHとともに重要な要素であることを示す。   FIG. 14 shows a 1: 1 ratio combination of highly deacetylated chitosan FVL® and highly acetylated chitosan DAC® 50 (diamond marks); or highly deacetylated chitosan SK®. 10 shows the results obtained with a composition having a 1: 1 ratio combination (squares) of 10 and DAC® 50. FIG. 14 shows that each mixture FVL: 50 1: 1 and SK10: 50 1: 1 greatly increases in viscosity at near-neutral pH values to form a quasi-solid hydrogel. These results confirm that the combination of highly acetylated chitosan with highly deacetylated chitosan prevents the latter precipitation at neutral pH and allows hydrogel formation. In addition, the 1: 1 viscosity of SK10: 50 is much higher than FVL: 50 1: 1 across pH values. In particular, at a pH of about 7, these mixtures exhibit viscosities of about 55 and 42 mPa · s, respectively. Since these mixtures differ only in the molecular weight of the highly deacetylated chitosan, ie, 100 and 650 kDa, respectively, the molecular weight of the highly deacetylated chitosan defines the viscosity and non-Newtonian fluid behavior of the hydrogel composition of the present invention. It shows that it is an important factor together with pH.

これらの結論はさらに、SK(登録商標)10およびDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせで(図15A)pH5.13(x印);5.67(白四角印);6(白三角印);6.24(白ダイアモンド印);6.51(アスタリスク印);6.65(黒丸印);6.75(白丸印);6.87(黒ダイアモンド印)および7(黒四角印);またはFVL(登録商標)およびDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせで(図15B)pH5.45(白ダイアモンド印);5.7(黒四角印);6.04(白三角印);6.3(x印);6.56(アスタリスク印);6.68(黒丸印);6.82(黒三角印);6.88(黒ダイアモンド印)および7.03(白四角印)を有する組成物で得た、図15における結果によって支持される。   These conclusions are further obtained in a 1: 1 ratio combination of SK®10 and DAC®50 (FIG. 15A) pH 5.13 (marked x); 5.67 (open squares); 6 (White triangle mark); 6.24 (white diamond mark); 6.51 (asterisk mark); 6.65 (black circle mark); 6.75 (white circle mark); 6.87 (black diamond mark) and 7 ( (Black square mark); or in a 1: 1 ratio combination of FVL® and DAC® 50 (FIG. 15B) pH 5.45 (white diamond mark); 5.7 (black square mark); 6 .04 (white triangles); 6.3 (x symbols); 6.56 (asterisks); 6.68 (black circles); 6.82 (black triangles); 6.88 (black diamonds) and Results in FIG. 15 obtained with a composition having 7.03 (white squares) Thus it is supported.

図15Aは、溶液のpH値が中性領域、すなわち6.87および7のとき、SK10:50の1:1の粘度はせん断速度が減少すると劇的に増加するが、低いpH値では、同じ組成物はせん断速度の減少に伴う粘度の増加を示さないことを示す。すなわち、SK10:50の1:1は、中性領域未満のpH値でニュートン流体挙動を示し、中性領域におけるpHで非ニュートン流体挙動を示す。逆に、FVL:50の1:1は、中性pHでせん断速度が減少するとき粘度が少ししか増加せず、液体状態のままであり(図15B)、SK10:50 1:1における105mPa・sと比較して約35mPa・sのピーク粘度となる。   FIG. 15A shows that when the pH value of the solution is in the neutral region, ie 6.87 and 7, the 1: 1 viscosity of SK10: 50 increases dramatically with decreasing shear rate, but is the same at lower pH values. It shows that the composition does not show an increase in viscosity with decreasing shear rate. That is, 1: 1 of SK10: 50 shows Newtonian fluid behavior at pH values below the neutral region and non-Newtonian fluid behavior at pH in the neutral region. Conversely, 1: 1 for FVL: 50 has only a slight increase in viscosity when the shear rate decreases at neutral pH and remains in the liquid state (FIG. 15B), with 105 mPa · s at SK10: 50 1: 1. The peak viscosity is about 35 mPa · s compared to s.

図16は、低温、すなわち1℃で、本発明の組成物におけるpH誘起粘度増加を縮小させたことを示す。この図における結果は、SK(登録商標)10およびDAC(登録商標)50(SK10:50)の1:1の割合の組み合わせでpH5.35(黒丸印);5.92(黒ダイアモンド印);6.22(アスタリスク印);6.81(黒四角印);6.95(黒三角印)および7.01(x印);またはFVLおよびDAC(登録商標)50(FVL10:50)の1:11の割合の組み合わせでpH5.85(白ダイアモンド印);6.2(グレー四角印);6.44(白三角印);6.76(グレー三角印);6.94(白四角印)および7.00(白丸印)を有する組成物で得られた。   FIG. 16 shows that at low temperatures, ie 1 ° C., the increase in pH-induced viscosity in the compositions of the present invention was reduced. The results in this figure are pH 5.35 (black circles); 5.92 (black diamonds) at a 1: 1 ratio combination of SK® 10 and DAC® 50 (SK 10:50); 6.22 (asterisk mark); 6.81 (black square mark); 6.95 (black triangle mark) and 7.01 (x mark); or 1 of FVL and DAC® 50 (FVL10: 50) : PH 5.85 (white diamond mark); 6.2 (gray square mark); 6.44 (white triangle mark); 6.76 (gray triangle mark); 6.94 (white square mark) ) And 7.00 (open circles).

1℃で、SK10:50 1:1は、25℃で観察された劇的な増加と比較して、粘度のゆるやかな増加しか示さない。より具体的には、1℃でおよび低いせん断速度で、SK10:50 1:1の粘度は、pHが約5.3から約7まで増加すると、50から65mPa・sまで増加するが(すなわち30%増加)、25℃および低いせん断速度で、同じ組成物の粘度は、pHが同じように増加すると、20から110mPa・sまで増加する(すなわち55%増加)(図15A)。これは、本発明に従ったキトサン組成物は、液体または比較してゲル化していない状態において保存するために低い温度で保管することを提案する。注意されたいのは、中性pHおよび低いせん断速度で、FVL:50 1:1は、25℃と比較して1℃で大きな粘度を示し(図15Bと図16の比較)、室温およびそれ以上の温度までの温度が上がると粘度が減少する傾向があるため、この組成物のin vivoでのヒドロゲル形成に対する用途を提案する。   At 1 ° C., SK10: 50 1: 1 shows only a gradual increase in viscosity compared to the dramatic increase observed at 25 ° C. More specifically, at 1 ° C. and at low shear rates, the viscosity of SK10: 50 1: 1 increases from 50 to 65 mPa · s as the pH increases from about 5.3 to about 7 (ie 30 % Increase), at 25 ° C. and a low shear rate, the viscosity of the same composition increases from 20 to 110 mPa · s (ie, a 55% increase) when the pH is similarly increased (FIG. 15A). This suggests that the chitosan composition according to the present invention is stored at a low temperature for storage in a liquid or relatively ungelled state. Note that at neutral pH and low shear rate, FVL: 50 1: 1 shows a greater viscosity at 1 ° C. compared to 25 ° C. (compare FIG. 15B and FIG. 16), room temperature and above. Since the viscosity tends to decrease with increasing temperature up to the temperature of, a use of this composition for hydrogel formation in vivo is proposed.

図17は、様々なせん断速度および1℃で測定したときのSK(登録商標)10およびDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせを有する組成物で(図17A)、組成物は、pH5.35(縦棒記号);5.92(丸記号);6.22(アスタリスク印);6.45(x印);6.81(三角印);6.95(四角印)および7.01(ダイアモンド印);または25℃で(図17B)、組成物はpH5.13(x印);5.67(白四角印);6(白三角印);6.24(白ダイアモンド印);6.51(アスタリスク印);6.65(黒丸印);6.75(白丸印);6.87(黒ダイアモンド印)および7(黒四角印)を有する組成物で得た結果を示す。1℃および25℃共に、SK10:50 1:1は、5.35〜6.8のpH値領域全体でニュートン流体挙動を示し、粘度はせん断力に関わりなく粘度が比較的変化しない、すなわち、せん弾力200〜50rpm間で粘度の変化が見られないことを示す。しかし、約6.8以上のpH値で、組成物はせん断力が増加したとき粘度の増加を示し、非ニュートン流体挙動を示す。この増加は、とくに25℃で明らかであり、pH7でせん断力が200から50rpmまで減少するとき粘度は65から110mPa・sまで増加する(図17、パネルB)。これらの条件下で(pH7、25℃)、組成物は粘度を増加し続け、時間とともにヒドロゲル形成を行う。逆に、1℃で、粘度は約55から約65mPa・sまでしか増加しない(図17、パネルA)。留意するべき事に、pH6.8およびそれ以下のpHを有する組成物は、1℃での同じ組成物と比較して25℃で低い粘度を示し、生理学的pHおよび温度の状態がヒドロゲル形成に最適であることが示唆される。   FIG. 17 is a composition having a 1: 1 ratio combination of SK® 10 and DAC® 50 when measured at various shear rates and 1 ° C. (FIG. 17A). PH 5.35 (vertical bar symbol); 5.92 (circle symbol); 6.22 (asterisk symbol); 6.45 (x symbol); 6.81 (triangular symbol); 6.95 (square symbol) and 7.01 (diamond mark); or at 25 ° C. (FIG. 17B), the composition has a pH of 5.13 (x mark); 5.67 (white square mark); 6 (white triangle mark); 6.24 (white diamond) 6.51 (black circle mark); 6.75 (white circle mark); 6.87 (black diamond mark) and 7 (black square mark). Indicates. For both 1 ° C. and 25 ° C., SK 10:50 1: 1 shows Newtonian fluid behavior throughout the pH value range of 5.35 to 6.8, and the viscosity remains relatively unchanged regardless of shear force, ie It indicates that no change in viscosity is observed between the resilience of 200-50 rpm. However, at pH values above about 6.8, the composition exhibits an increase in viscosity when shear force is increased and exhibits non-Newtonian fluid behavior. This increase is particularly evident at 25 ° C., and the viscosity increases from 65 to 110 mPa · s when the shear force decreases from 200 to 50 rpm at pH 7 (FIG. 17, panel B). Under these conditions (pH 7, 25 ° C.), the composition continues to increase in viscosity and undergoes hydrogel formation over time. Conversely, at 1 ° C., the viscosity only increases from about 55 to about 65 mPa · s (FIG. 17, panel A). It should be noted that a composition having a pH of 6.8 and below exhibits a lower viscosity at 25 ° C compared to the same composition at 1 ° C, and the physiological pH and temperature conditions contribute to hydrogel formation. Suggested to be optimal.

図18は、約100kDa未満の分子量の高脱アセチル化キトサンを有する組み合わせたキトサン組成物が、生理学的条件下でゲル形成に適切でないことを示す。この図における結果は、FVL(登録商標)およびDAC(登録商標)50を1:1の割合で組み合わせたもので、様々なせん断速度および1℃で(図18A)測定し、組成物はpH5.85(丸印);6.2(アスタリスク印);6.44(x印);6.76(三角印);6.94(四角印)および7.00(ダイアモンド印);または25℃で測定し(図18B)。組成物は5.45(白ダイアモンド印;5.7(白四角印);6.04(白三角印);6.3(x印);6.56(アスタリスク印);6.68(丸印);6.82(黒三角印);6.88(黒ダイアモンド印)および7.03(黒四角印)を有する。   FIG. 18 shows that a combined chitosan composition having a high deacetylated chitosan with a molecular weight of less than about 100 kDa is not suitable for gel formation under physiological conditions. The results in this figure are a combination of FVL® and DAC® 50 in a 1: 1 ratio, measured at various shear rates and 1 ° C. (FIG. 18A), and the composition has a pH of 5. 85 (circle); 6.2 (asterisk); 6.44 (x); 6.76 (triangle); 6.94 (square) and 7.00 (diamond); or at 25 ° C. Measure (Figure 18B). The composition is 5.45 (white diamond mark; 5.7 (white square mark); 6.04 (white triangle mark); 6.3 (x mark); 6.56 (asterisk mark); 6.68 (circle) 6.82 (black triangle mark); 6.88 (black diamond mark) and 7.03 (black square mark).

示すように、FVL:50 1:1は、pHが中性に近づくにつれて粘度が増加するが、ゲル形成は1℃(図18A)でも25℃でも(図18B)でもゲルは形成されない。事実、前述したように、この組成物は、25℃と比較して1℃で高い粘度を示す(中性pH,低せん断速度)。この結果は、高脱アセチル化キトサンの分子量が本発明の組成物におけるゲル形成を規定するために重要なパラメータであることを示す。   As shown, FVL: 50 1: 1 increases in viscosity as the pH approaches neutrality, but gel formation does not form at 1 ° C. (FIG. 18A) or 25 ° C. (FIG. 18B). In fact, as mentioned above, this composition exhibits a higher viscosity at 1 ° C compared to 25 ° C (neutral pH, low shear rate). This result shows that the molecular weight of the highly deacetylated chitosan is an important parameter for defining the gel formation in the composition of the present invention.

図19は、高脱アセチル化キトサンの分子量の増加がそれらの粘度を改善する子を示し、FM(登録商標)80およびDAC(登録商標)50の1:1の割合の組み合わせでpH4.81(ダイアモンド印);5.93(四角印);6.24(トライアングル印);6.43(x印);6.64(アスタリスク印)および6.91(丸印)を有する組成物を示す。25℃で、FM80:50 1:1は、SK10:50 1:1(約6.8〜約6.9)と比較して低いpHで(約6.4〜約6.6)ヒドロゲル形成を開始する(図17B参照)。さらに、中性pHで達した粘度は、高い分子量のタイプ1キトサンを有する組成物において非常に高く、すなわち、FM80:50 1:1に対して420mPa・sであるのに対し、SK10:50 1:1で約110mPa・sである。これらの結果は、タイプ1キトサンの分子量は用途によって異なるが、それでもヒドロゲル形成できることを示す。例えば、より粘度の高いヒドロゲルは、in vivoの持続的な耐久性を必要とする移植に望ましいが、低い粘度のヒドロゲルは、遅延放出薬物製剤の所定の放出特性を達成するために十分である。   FIG. 19 shows children whose increased molecular weight of highly deacetylated chitosan improves their viscosity, with a 1: 1 ratio of FM® 80 and DAC® 50 at a pH of 4.81 ( A composition having diamonds); 5.93 (squares); 6.24 (triangles); 6.43 (xs); 6.64 (asterisks) and 6.91 (circles) is shown. At 25 ° C., FM80: 50 1: 1 exhibits hydrogel formation at a lower pH (about 6.4 to about 6.6) compared to SK10: 50 1: 1 (about 6.8 to about 6.9). Start (see FIG. 17B). Furthermore, the viscosity reached at neutral pH is very high in compositions with high molecular weight type 1 chitosan, ie 420 mPa · s for FM 80:50 1: 1, whereas SK 10:50 1 : 1 is about 110 mPa · s. These results indicate that the molecular weight of type 1 chitosan varies depending on the application, but can still form a hydrogel. For example, higher viscosity hydrogels are desirable for implants that require sustained durability in vivo, while low viscosity hydrogels are sufficient to achieve the predetermined release characteristics of delayed release drug formulations.

本発明を特定の実施形態に基づいて記載したが、多くの代替案、修正および変化が当業者には明らかである。したがって、このすべての代替案、修正および変化は、添付の請求項の範囲内であるとする。
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Although the present invention has been described with reference to particular embodiments, many alternatives, modifications and variations will be apparent to those skilled in the art. Accordingly, all such alternatives, modifications and variations are intended to be within the scope of the appended claims.
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Claims (13)

ヒドロゲルの形態のキトサン組成物であって、前記組成物は、40%〜60%の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサンと、20%以下のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを含み、25℃およびpH7.0±0.2で前記組成物は20rpmのせん断速度で少なくとも100mPa・sの粘度を有し、高脱アセチル化キトサンは非均一に脱アセチル化し、高アセチル化キトサンは均一に再アセチル化してなり、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは、全組成物の0.2%〜3%w/vの濃度でそれぞれ存在するキトサン組成物。   A chitosan composition in the form of a hydrogel comprising a highly acetylated chitosan having a degree of acetylation in the range of 40% to 60% and a highly deacetylated chitosan having a degree of acetylation of 20% or less. And at 25 ° C. and pH 7.0 ± 0.2, the composition has a viscosity of at least 100 mPa · s at a shear rate of 20 rpm, the highly deacetylated chitosan is non-uniformly deacetylated and the highly acetylated chitosan is A chitosan composition that is uniformly reacetylated, wherein the highly acetylated chitosan and the highly deacetylated chitosan are each present in a concentration of 0.2% to 3% w / v of the total composition. 高脱アセチル化キトサンは少なくとも100kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも200kDaの分子量を有する請求項1に記載のキトサン組成物。   The chitosan composition of claim 1, wherein the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of at least 100 kDa and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of at least 200 kDa. 高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の0.5%〜2%w/vの濃度でそれぞれ存在し、前記組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:1,1:2,1:3および1:4から成る群から選択される請求項1に記載のキトサン組成物。   Highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan are each present at a concentration of 0.5% to 2% w / v of the total composition, and the proportion of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan in said composition is The chitosan composition of claim 1, selected from the group consisting of: 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 1: 4. 多糖、リン脂質およびそれら組み合わせから成る群から選択される少なくとも1個の負に帯電した物質をさらに含む請求項1に記載のキトサン組成物。   The chitosan composition according to claim 1, further comprising at least one negatively charged substance selected from the group consisting of polysaccharides, phospholipids, and combinations thereof. 負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項4に記載のキトサン組成物。   The negatively charged polysaccharide is selected from the group consisting of animal-derived polysaccharides, plant-derived polysaccharides, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, hyaluronic acid, keratan sulfate, and combinations thereof. A chitosan composition according to claim 1. 薬物、ポリペプチド、動物細胞および植物細胞の少なくとも1個をさらに含む請求項1〜5のいずれかに記載のキトサン組成物。   The chitosan composition according to any one of claims 1 to 5, further comprising at least one of a drug, a polypeptide, an animal cell, and a plant cell. 請求項1〜6のいずれかに記載の組成物を有する埋め込み型装置。   An implantable device comprising the composition according to claim 1. 外科的接着の予防または治療、創傷治癒、組織再生および組織交換から成る群から選択される少なくとも1つの用途のための薬剤を調製するための請求項1〜6のいずれかに記載のキトサン組成物の使用。   A chitosan composition according to any of claims 1 to 6 for preparing a medicament for at least one application selected from the group consisting of prevention or treatment of surgical adhesions, wound healing, tissue regeneration and tissue exchange. Use of. 注射可能な溶液の形態のキトサン組成物であって、前記組成物は、40%〜60%の範囲でアセチル化度を有する高アセチル化キトサン、および20%以下のアセチル化度を有する高脱アセチル化キトサンを有し、25℃および中性領域未満のpHで前記組成物は50rpmのせん断速度で150mPa・s以下の粘度を有し、高アセチル化キトサンおよび高脱アセチル化キトサンは全組成物の0.2%〜3%w/vの濃度でそれぞれ存在するキトサン組成物。   A chitosan composition in the form of an injectable solution, said composition comprising a highly acetylated chitosan having a degree of acetylation in the range of 40% to 60% and a high deacetylation having a degree of acetylation of 20% or less The composition has a viscosity of less than 150 mPa · s at a shear rate of 50 rpm at a pH below 25 ° C. and a neutral range, and a highly acetylated chitosan and a highly deacetylated chitosan Chitosan compositions each present at a concentration of 0.2% to 3% w / v. 高脱アセチル化キトサンは少なくとも100kDaの分子量を有し、高アセチル化キトサンは少なくとも200kDaの分子量を有する請求項9に記載のキトサン組成物。   The chitosan composition of claim 9, wherein the highly deacetylated chitosan has a molecular weight of at least 100 kDa and the highly acetylated chitosan has a molecular weight of at least 200 kDa. 高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンは、全組成物の0.5%〜2%w/vの濃度でそれぞれ存在し、前記組成物における高脱アセチル化キトサンおよび高アセチル化キトサンの割合は、1:1,1:2,1:3および1:4から成る群から選択される請求項9に記載のキトサン組成物。   Highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan are each present at a concentration of 0.5% to 2% w / v of the total composition, and the proportion of highly deacetylated chitosan and highly acetylated chitosan in said composition is The chitosan composition of claim 9 selected from the group consisting of: 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 1: 4. 多糖、リン脂質およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも1個の負に帯電した物質をさらに含む請求項9に記載のキトサン組成物。   The chitosan composition according to claim 9, further comprising at least one negatively charged substance selected from the group consisting of polysaccharides, phospholipids, and combinations thereof. 負に帯電した多糖は、動物由来の多糖、植物由来の多糖、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項12に記載のキトサン組成物。   The negatively charged polysaccharide is selected from the group consisting of animal-derived polysaccharides, plant-derived polysaccharides, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, heparin, hyaluronic acid, keratan sulfate, and combinations thereof. A chitosan composition according to claim 1.
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