JP5733705B2 - System for increasing the activity of a specific promoter and vector carrying the system - Google Patents
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Description
本発明は腫瘍等の疾患の検出、治療に関する。本発明は特に特異的プロモーターの転写活性を特定の組織、細胞で特異的に上昇させ得るシステムを利用した疾患の検出、治療に関する。 The present invention relates to detection and treatment of diseases such as tumors. The present invention particularly relates to detection and treatment of diseases using a system capable of specifically increasing the transcriptional activity of a specific promoter in a specific tissue or cell.
従来の遺伝子治療はレトロウイルスやアデノウイルス、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）を中心とする遺伝子治療用ベクターが使用されてきた。そして投与対象の組織及び癌特異的に遺伝子を発現させるために組織又は癌特異的プロモーターが用いられてきたが、プロモーター活性が低く十分な遺伝子発現及び治療効果が達成できない欠点があった。
組織又は癌特異的遺伝子発現に関しては特異的プロモーターが使用されているが、その活性の弱さが大きな問題となっている。組織特異性を保ちつつプロモーター活性を上昇させる手段としてＧＡＬ４−ＶＰ１６融合蛋白を用いたｔｗｏ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ（ＴＳＴＡ）があり（特許文献１及び２並びに非特許文献１〜３を参照）、近年その有用性がｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇや治療において検討されている。しかし、癌細胞に関してはアンドロゲン反応性をもつプロモーターを用いてアンドロゲン依存性前立腺癌（ＬＮＣａｐ細胞）において検討しているのみであり、腫瘍全般に有効性のあるものではなく、その汎用性は低いと判断される。
レトロウイルスによるヒトへのＸ−ＳＣＩＤ遺伝子治療（幹細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏ治療）では白血病を誘発し、アデノウイルスによるヒトへのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子治療では、アデノウイルスベクターを肝静脈に注入し肝細胞で遺伝子発現をさせるものであったが、重篤な肝不全を引き起こし死亡者が出るという問題があった。レトロウイルスに関しては遺伝子翻訳開始領域にＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎを起してしまい、ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＬＭＯ２）を活性化してしまうことが原因となり白血病が発症したと考えられている。アデノウイルスにおいては投与直後の非特異的免疫活性（ＩＬ−６やＩＬ−８）及びウイルス蛋白（一部導入遺伝子蛋白）に対する細胞性・液性免疫の活性化が肝不全を引き起こしたことが報告されている。これらの方法を解決するためにはＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎが少ない、そして免疫原性の弱いウイルスベクターを用いた遺伝子導入が望ましく、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）がそのようなウイルスベクターである。一方、腫瘍の局所内投与は対象患者に大きな侵襲を与えるものであり、非侵襲的な遺伝子ベクター投与法つまり血管内投与が可能でなくてはならない。そのためには血管内投与後、腫瘍のみに治療用ベクターが導入され且つ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が起こるように感染向性・遺伝子発現が制御する必要があった。Conventional gene therapies have used gene therapy vectors centered on retroviruses, adenoviruses, and herpesviruses. In addition, tissue- or cancer-specific promoters have been used to express genes specifically for tissues to be administered and cancer. However, there is a drawback that promoter activity is low and sufficient gene expression and therapeutic effects cannot be achieved.
Specific promoters are used for tissue or cancer-specific gene expression, but the weakness of activity is a major problem. There is a two step transcription system (TSTA) using GAL4-VP16 fusion protein as a means for increasing promoter activity while maintaining tissue specificity (see Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Documents 1 to 3), which has recently been useful. Sex has been investigated in in vivo imaging and treatment. However, cancer cells are only examined in androgen-dependent prostate cancer (LNCap cells) using an androgen-responsive promoter, and are not effective for tumors in general, and their versatility is low. To be judged.
X-SCID gene therapy for humans with retrovirus (ex vivo treatment using stem cells) induces leukemia, and for ornithine transcarbamylase (OTC) gene therapy for humans with adenovirus, adenoviral vectors are introduced into the hepatic vein. It was injected to cause gene expression in hepatocytes, but there was a problem that it caused severe liver failure and resulted in death. Regarding retrovirus, it is considered that leukemia developed due to DNA integration in the gene translation initiation region and activation of oncogene (LMO2). In adenovirus, activation of cellular and humoral immunity against nonspecific immune activity (IL-6 and IL-8) and viral proteins (partially transgene proteins) immediately after administration has caused liver failure Has been. In order to solve these methods, it is desirable to introduce a gene using a viral vector with low DNA integration and weak immunogenicity, and adeno-associated virus (AAV) is such a viral vector. On the other hand, local administration of tumors causes great invasiveness to target patients, and it must be possible to perform noninvasive gene vector administration, that is, intravascular administration. For this purpose, after intravascular administration, it was necessary to control the infectivity and gene expression so that a therapeutic vector is introduced only into the tumor and gene expression occurs only in the tumor cells.
組織や腫瘍特異的である特異的プロモーターの転写活性を上昇させ、標的遺伝子の特異的発現を増大させるシステムの提供並びに上記システムを保持した、診断又は治療用ウイルス製剤の提供を目的とする。
本発明者は、上記の遺伝子治療に関わる問題点を克服すべく、新たなシステムの開発について鋭意検討を行った。本発明者は、プロモーターの活性を上昇させるシステムであるＴＳＴＡシステムにおいて、プロモーターとして組織や腫瘍に異的な特異的プロモーターを用い、さらに、転写活性化因子をコードするＤＮＡとして、酵母の転写活性化因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを用いたところ、特異的プロモーターの転写活性が飛躍的に高まり、標的遺伝子の発現量が増大することを見出し、改良型ＴＳＴＡシステムの開発に成功した。
さらに、上記の改良型ＴＳＴＡシステムをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組込み、アデノ随伴ウイルスの外殻に標的特異的ペプチドを挿入することにより、該標的特異的ペプチドと上記の改良型ＴＳＴＡシステムの作用で、ウイルスベクターを特定の組織、細胞へデリバリーし感染させ、該細胞中で特異的にプロモーターの活性を上昇させ、診断又は治療用標的遺伝子の発現を増大させ得ることを見出した。標的特異的ペプチドとして腫瘍細胞特異的ペプチドを用い、特異的プロモーターとして腫瘍特異的プロモーターを用いた場合、ＡＡＶベクターは腫瘍のみに導入され、かつ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が制御された。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
［２］ 第１の発現カセットの下流に第２の発現カセットが１つのＤＮＡ構築物中に連結されている、［１］のシステム。
［３］ 第１の発現カセットと第２の発現カセットを異なるＤＮＡ構築物として含む、［１］のシステム。
［４］ 特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５ プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）２ｖ プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ ａｎｋｉｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ プロモーター、ＡＮＦ プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ α１プロモーター、ＳＣＧ１０ プロモーター、ＧＦＡＰ プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ プロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、［１］〜［３］のいずれかのシステム。
［５］ 標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、［１］〜［４］のいずれかのシステム。
［６］ 治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である［５］のシステム。
［７］ 癌抑制遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、［６］のシステム。
［８］ ［１］〜［７］のいずれかのシステムを保持したベクター。
［９］ アデノ随伴ウイルスベクターである［８］のベクター。
［１０］ 外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、［９］のアデノ随伴ウイルスベクター。
［１１］ 標的細胞特異的結合ペプチドがＲＧＤ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）、ＮＧＲ、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３７）、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）、ＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）、ＡＰＲＰＧ（配列番号４８）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）及びＤＧＥＡ（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［１０］のアデノ随伴ウイルスベクター。
［１２］ ［７］〜［１１］のいずれかのベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
［１３］ 治療用遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子であり、標的細胞特異的結合ペプチドが、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）で現されるアミノ酸配列を有する、［１２］の腫瘍治療用製剤。
［１４］ ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡからなる転写因子をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
［１５］ 配列番号２２で表される配列からなるＤＮＡを含む、［１４］のＤＮＡ構築物。
［１６］ 特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで上昇させる方法。
［１７］ 特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５ プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）２ｖ プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ ａｎｋｉｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ プロモーター、ＡＮＦ プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ α１プロモーター、ＳＣＧ１０ プロモーター、ＧＦＡＰ プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、［１６］の方法。
［１８］ 標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、［１６］又は［１７］の方法。
［１９］ 治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である［１８］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−８２３５８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。The purpose of the present invention is to provide a system that increases the transcriptional activity of a specific promoter that is tissue or tumor specific and increases the specific expression of a target gene, and also provides a diagnostic or therapeutic viral preparation that retains the system.
The present inventor has intensively studied the development of a new system in order to overcome the problems associated with gene therapy. In the TSTA system, which is a system for increasing the activity of a promoter, the present inventor uses a promoter specific to a tissue or a tumor as a promoter, and further activates transcription of yeast as DNA encoding a transcriptional activator. DNA encoding the DNA binding domain (GAL4 DBD) of the factor GAL4, DNA encoding rat glucocorticoid receptor (Rat GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP), and When DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16, which is a transcription factor of HSV1 (herpes simplex virus), is used in this order, the transcriptional activity of a specific promoter is dramatically increased, and the expression of the target gene is increased. That the amount increases Out, and we succeeded in the development of improved TSTA system.
Further, by incorporating the above-described improved TSTA system into an adeno-associated virus (AAV) vector and inserting the target-specific peptide into the outer shell of the adeno-associated virus, the action of the target-specific peptide and the above-described improved TSTA system Thus, the present inventors have found that a viral vector can be delivered to a specific tissue or cell to be infected, the promoter activity can be specifically increased in the cell, and the expression of a target gene for diagnosis or treatment can be increased. When a tumor cell specific peptide was used as the target specific peptide and a tumor specific promoter was used as the specific promoter, the AAV vector was introduced only into the tumor, and gene expression was controlled only in the tumor cell.
That is, the present invention is as follows.
[1] DNA encoding a GAL4 DNA-binding domain downstream of a specific promoter, DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) inserted with a DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP), and A first expression cassette obtained by ligating DNA encoding a transcriptional activation domain of VP16 in this order, and comprising a GAL4 DNA binding domain (GAL4 DBD) and polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) A first expression cassette capable of expressing a transcription factor which is a fusion protein of a glucocorticoid receptor (GR) and a transcriptional activation domain inserted therein, and an inducibility responsive to the transcription factor and comprising a GAL4 binding site Promoter (GAL4 / A system for increasing the transcriptional activity of the specific promoter, comprising a second expression cassette in which a target gene is linked downstream of TATA).
[2] The system according to [1], wherein the second expression cassette is linked into one DNA construct downstream of the first expression cassette.
[3] The system according to [1], comprising the first expression cassette and the second expression cassette as different DNA constructs.
[4] Specific promoters include NkX2.5 promoter, GATA4 promoter, MLC (myosin light chain) 2v promoter, cardiac ankyrin repeat promoter, ANF promoter, BNP (brain native factor) promoter, ANP (attrint promoter) 1 promoter, tubulin α1 promoter, SCG10 promoter, GFAP promoter, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II promoter, neuron-specific enolase promoter, platelet-derived low factor beta (PDGF-β) chain promoter, hTERT promoter, prostate specific antigen (PSA) promoter, carcinoembryonic antigen (CEA) promoter, α-fetoprotein (AFP) promoter, cyclooxygenase-2 (COX-2) promoter and The system according to any one of [1] to [3], which is a tissue-specific or tumor-specific promoter selected from the group consisting of tyrosinase promoters.
[5] The system according to any one of [1] to [4], wherein the target gene is a reporter gene or a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease.
[6] The system according to [5], wherein the therapeutic gene is a tumor suppressor gene that can be used for tumor therapy.
[7] The system according to [6], wherein the tumor suppressor gene is a REIC / Dkk-3 gene.
[8] A vector retaining the system according to any one of [1] to [7].
[9] The vector according to [8], which is an adeno-associated virus vector.
[10] The adeno-associated virus vector according to [9], wherein the target cell-specific binding peptide is inserted into the outer shell, and the outer shell-modified virus vector has directivity for cells expressing the target cell-specific binding peptide.
[11] Target cell-specific binding peptides are RGD, CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 36), NGR, CNGRCVSGCAGRC (SEQ ID NO: 37), CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 40), CNSRLHLRC (SEQ ID NO: 41), CENWWGDVC (SEQ ID NO: 42), WRCVLREGPAGGCLFNRH (SEQ ID NO: 43), CLPVASC (SEQ ID NO: 44), CGAREMMC (SEQ ID NO: 45), CKSTHDRLC (SEQ ID NO: 46), CGNKRTRGC (SEQ ID NO: 47), APRPG (SEQ ID NO: 48), KQAGDV (SEQ ID NO: 49), LDV, The adeno-associated virus vector according to [10], comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of KRLDGS (SEQ ID NO: 50) and DGEA (SEQ ID NO: 51).
[12] A disease detection or treatment preparation comprising the vector according to any one of [7] to [11].
[13] The tumor therapeutic preparation according to [12], wherein the therapeutic gene is a REIC / Dkk-3 gene, and the target cell-specific binding peptide has an amino acid sequence represented by CDCRGDCFC (SEQ ID NO: 36).
[14] DNA encoding GAL4 DNA-binding domain, DNA encoding glucocorticoid receptor (GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP), and transcriptional activation domain of VP16 A DNA construct comprising a DNA sequence encoding a transcription factor consisting of DNA fused in this order.
[15] The DNA construct according to [14], comprising DNA consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 22.
[16] DNA encoding a GAL4 DNA-binding domain downstream of a specific promoter, DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) inserted with a DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP), and A first expression cassette obtained by ligating DNA encoding a transcriptional activation domain of VP16 in this order, and comprising a GAL4 DNA binding domain (GAL4 DBD) and polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) A first expression cassette capable of expressing a transcription factor which is a fusion protein of a glucocorticoid receptor (GR) and a transcriptional activation domain inserted therein, and an inducibility responsive to the transcription factor and comprising a GAL4 binding site Promoter (GAL4 / TATA) A method in which the activity of a specific promoter is increased in vitro by introducing a second expression cassette having a target gene linked downstream of the cell into which the specific promoter is active.
[17] Specific promoters include NkX2.5 promoter, GATA4 promoter, MLC (myosin light chain) 2v promoter, cardiac ankyrin repeat promoter, ANF promoter, BNP (brain neutral factor) promoter, ANP (attrint promoter) 1 promoter, tubulin α1 promoter, SCG10 promoter, GFAP promoter, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II promoter, neuron-specific enolase promoter, platelet-derived growth factor beta (PDGF-β) chain promoter, hTERT promoter, prostate specific antigen (PSA) promoter, carcinoembryonic antigen (CEA) promoter, α-fetoprotein (AFP) promoter, cyclooxygenase-2 (COX-2) promoter and [16] The method of [16], which is a tissue-specific or tumor-specific promoter selected from the group consisting of tyrosinase promoters.
[18] The method of [16] or [17], wherein the target gene is a reporter gene or a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease.
[19] The method of [18], wherein the therapeutic gene is a tumor suppressor gene that can be used for tumor therapy.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2009-82358, which is the basis of the priority of the present application.
図１は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムの概要を示す図である。図１Ａは従来のｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を、図１Ｂは従来のｔｗｏ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を、図１Ｃに本発明の改良型ｔｗｏ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を示す。
図２は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターの構造を示す図である。図２Ａは特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセット（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）の構造図を示し、図２Ｂが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセット（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ｈＲＥＩＣ）の構造図を示す。図２Ａの発現カセットの用途は全身の（微小）癌診断・モニター用ウイルス製剤であり、図２Ｂの発現カセットの用途は全身の（微小）癌治療用ウイルス製剤である。
図３は、本発明の発現カセットであるＤＮＡ構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造工程を示す図である。
図４は、本発明の発現カセットであるＤＮＡ構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造において用いたプライマー配列を示す図である。
図５は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いときの癌細胞におけるプロモータ活性の上昇を示す図である。
図６は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いたときの癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。図６Ａは各種癌細胞の結果を示し、図６ＢはＬＮＣａＰ細胞のグラフを拡大したものを示す。
図７は、アデノ随伴ウイルスの外殻への標的特異的ペプチドの挿入方法を示す図である。
図８は、外殻へ標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターの腫瘍細胞への導入効率を示す図である。図８ＡはＨＵＶＥＣの結果を、図８ＢはＳＫＯＶ−３の結果を、図８ＣはＫ５６２の結果を示す。
図９は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の検出の結果を示す図である。図９Ａに検討のスケジュールの概要及びＩＶＩＳ像を示し、図９Ｂに腫瘍塊の写真を示す。
図１０は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療スケジュールを示す図である。
図１１は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果を示す図である。図１１ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示し、図１１ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１２は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出スケジュールを示す図である。
図１３は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出の結果を示す図である。図１３Ａにコントロール群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示し、図１３ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１４は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療スケジュールを示す図である。
図１５は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果を示す図である。図１５ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示し、図１５ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１６は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いたときの各種癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an outline of the improved TSTA system of the present invention. FIG. 1A shows a structure of a structure used for a conventional single step transcription system, FIG. 1B shows a structure of a structure used for a conventional two amplification system, and FIG. The structure of is shown.
FIG. 2 is a diagram showing the structure of the adeno-associated virus vector of the present invention. FIG. 2A shows a structural diagram of an expression cassette (AdTSTA / RGD-AAV-Luc), which is a DNA construct introduced into an adeno-associated virus vector containing hTERT as a specific promoter and luciferase gene as a specific gene. FIG. FIG. 2 shows a structural diagram of an expression cassette (AdTSTA / RGD-AAV-hREIC) which is a DNA construct introduced into an adeno-associated virus vector containing hTERT as a specific promoter and human REIC / Dkk-3 gene as a specific gene. The use of the expression cassette of FIG. 2A is a virus preparation for whole body (micro) cancer diagnosis and monitoring, and the use of the expression cassette of FIG. 2B is a virus preparation for systemic (micro) cancer treatment.
FIG. 3 is a diagram showing the steps for producing a DNA construct and an adeno-associated virus vector, which are expression cassettes of the present invention.
FIG. 4 is a view showing primer sequences used in the production of a DNA construct, which is an expression cassette of the present invention, and an adeno-associated virus vector.
FIG. 5 is a graph showing an increase in promoter activity in cancer cells when the improved TSTA system of the present invention is used.
FIG. 6 is a diagram showing an increase in the expression of a target gene in cancer cells when the improved TSTA system of the present invention is used. FIG. 6A shows the results of various cancer cells, and FIG. 6B shows an enlarged graph of LNCaP cells.
FIG. 7 is a diagram showing a method for inserting a target-specific peptide into the outer shell of an adeno-associated virus.
FIG. 8 is a graph showing the efficiency of introduction of an adeno-associated virus vector having a target-specific peptide inserted into its outer shell into tumor cells. 8A shows the results of HUVEC, FIG. 8B shows the results of SKOV-3, and FIG. 8C shows the results of K562.
FIG. 9 is a diagram showing the results of primary lesion detection in orthotopic liver cancer model mice using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-Luc) of the present invention. FIG. 9A shows an outline of the examination schedule and an IVIS image, and FIG. 9B shows a photograph of the tumor mass.
FIG. 10 is a diagram showing a liver cancer treatment schedule in an orthotopic liver cancer model mouse using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-REIC) of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing the effect of treating liver cancer in an orthotopic liver cancer model mouse using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-REIC) of the present invention. FIG. 11A shows the IVIS signal and tissue Tunnel results (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-AFP (control group), and FIG. 11B shows the IVIS signal in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-REIC. The result of the tissue Tunnel (day 30) is shown.
FIG. 12 is a diagram showing a detection schedule of metastatic foci in a renal cancer hematogenous lung metastasis model mouse using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-Luc) of the present invention.
FIG. 13 is a diagram showing the results of detection of metastasis in renal cancer hematogenous lung metastasis model mice using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-Luc) of the present invention. FIG. 13A shows the observation result (day 30) of the IVIS signal and macropathology in the control group, and FIG. 13B shows the observation result (day 30) of the IVIS signal and macropathology in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-Luc.
FIG. 14 is a diagram showing a treatment schedule for metastatic lesions in renal cancer hematogenous lung metastasis model mice using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-REIC) of the present invention.
FIG. 15 is a diagram showing the therapeutic effect of metastases in renal cancer hematogenous lung metastasis model mice using the adeno-associated virus vector (AdTSTA / RGD-AAV-REIC) of the present invention. FIG. 15A shows the IVIS signal and tissue Tunnel result (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-AFP (control group), and FIG. 15B shows the IVIS signal in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-REIC. The result of the tissue Tunnel (day 30) is shown.
FIG. 16 is a diagram showing an increase in expression of a target gene in various cancer cells when the improved TSTA system of the present invention is used.
以下、本発明を詳細に説明する。
ＴＳＴＡ（Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムは、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｍａｉｎ）と強力な転写活性を有するＨＳＶ由来のＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞２ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。図１Ｂに概要を示す（図１においては、ＧＡＬ４−ＤＢＤは、ＧＡＬ４とのみ表示してある）。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母ＧＡＬ４とＶＰ１６を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にＧＡＬ４結合配列があり、そこにＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質が結合することにより活性化するＴＡＴＡ最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。ＴＳＴＡについては、Ｉｙｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１ Ｄｅｃ ４，９８（２５），ｐ．１４５９５−６００； Ｉｙｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００４ Ｓｅｐ，１０（３），ｐ．５４５−５２； Ｉｌａｇａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６ Ｎｏｖ １５，６６（２２），ｐ．１０７７８−８５；特表２００５−５０２６４５号公報；特表２００７−５３５１５号公報等に記載されている。
本発明の改良型ＴＳＴＡ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムは、特異的プロモーターの下流に転写因子をコードするＤＮＡ配列が連結したＤＮＡ構築物を含む、転写因子を発現し得る第１の発現カセットとＧＡＬ４タンパク質結合部位の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結したＤＮＡ構築物を含む第２の発現カセットを含む。第２の発現カセットは、第１の発現カセットにより発現した転写因子の作用で標的遺伝子を発現し得る。また、本発明は上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物でもある。本発明のシステムにおいては、第１の発現カセットと第２の発現カセットは異なる別々のＤＮＡ構築物として含まれていてもよく、第１の発現カセットと第２の発現カセットが連結した１つのＤＮＡ構築物として含まれていてもよい。
特異的プロモーターは選択的プロモーターともいい、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターが含まれる。例えば、組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等が挙げられ、それぞれ特定の組織又は器官でプロモーター活性を有するプロモーター、細胞等の特定の発生段階でプロモーター活性を有するプロモーター、腫瘍細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターである。この中でも組織若しくは器官特異的プロモーター及び腫瘍特異的プロモーターが好ましい。組織、器官特異的プロモーターとしてはＮｋＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）２ｖ、ｃａｒｄｉａｃ ａｎｋｉｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ、ＡＮＦ、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）などの心臓特異的プロモーターやＳＣＧ１０、ＧＦＡＰプロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ α１プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）−β ｃｈａｉｎプロモーター等の脳特異的プロモーターが挙げられる。また腫瘍特異的プロモーターとしては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター、チロシナーゼプロモーター等が挙げられる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いればよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、ＴＡＴＡボックスを含むことがある。ｈＴＥＲＴのコアプロモーターの配列を配列番号２に示す。通常、特異的プロモーターは転写活性が低く、特異的な標的遺伝子の発現量を増大させることは困難であったが、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターの活性を増大させることができる。
第１の発現カセットは、酵母の転写活性化因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを含む。従来のＴＳＴＡシステムにおいては、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡの融合ＤＮＡが用いられるが、本発明においては、これらのＤＮＡの間にポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）又はポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡが挿入される。グルココルチコイドレセプターの由来生物種は限定されないが、例えば、ラット由来のものが用いられる。グルココルチコイドレセプター中に挿入されるポリグルタミンのグルタミン残基又はポリプロリンのプロリン残基の数は１０〜８０、好ましくは２０〜７０、さらに好ましくは３０〜５０、特に好ましくは４０である。グルタミンはＣＡＡ又はＣＧＡでコードされ、ポリグルタミンをコードするＤＮＡは、ＣＡＡのみ又はＣＧＡのみを含んでいてもよいし、両者を含んでいてもよい。また、プロリンはＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧでコードされ、ポリプロリンをコードするＤＮＡは、これらのトリプレットのうち、１種、２種、３種又は４種を含み得る。また、ポリグルタミン又はポリプロリンはグルココルチコイドレセプター中のどの部分に挿入されてもよい。例えば、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のＴｙｒの後に挿入される。
ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４タンパク質のアミノ酸１〜１４７の断片であり、例えば、ＧＡＬ４結合ドメインをコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号４に示される。また、例えばポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡは配列番号５に示される。さらに、例えばＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡは配列番号６に示される。
第２の発現カセットは、ＧＡＬ４応答エレメントであるＧＡＬ４結合部位（ＧＡＬ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結した構造を有する。ＧＡＬ４結合部位（ＧＡＬ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）の下流に最小プロモーターが連結したものをＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーターともいい、ＧＡＬ４／ＴＡＴＡで表される。ＧＡＬ４結合部位は、５〜２０個、好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは５個連結させる。ＧＡＬ４結合ドメインの下流に位置するプロモーターは、第１の発現カセットにより発現される転写因子に応答性である誘導性プロモーターであり、ＧＡＬ４反応性プロモーター、ＴＡＴＡ最小プロモーター、アデノウイルスＥＩＩｂ最小プロモーターを用いることができる。例えば、ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号７に示され、最小プロモーターの塩基配列は配列番号８に示される。
標的遺伝子は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより最終的に発現させようとする標的遺伝子であり、癌などの疾患の診断に用い得るレポーター遺伝子又は癌などの疾患の治療に用い得る治療用遺伝子が挙げられる。
第１の発現カセットであるＤＮＡ構築物及び第２の発現カセットであるＤＮＡ構築物において、プロモーター等は作動可能に連結され、さらに、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ配列等の制御配列を含んでいてもよい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子（配列番号１０）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。また、ヘルペスウイルスサイミジンカイネース（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等のＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）レポーター遺伝子を用いることもできる。特定の疾患の治療に用い得る治療用遺伝子としては、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（配列番号２１）、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ等が挙げられる。
上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを特定の組織の細胞や腫瘍細胞に導入することにより、特異プロモーターが作動し、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）又はポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子が発現する。該転写因子は第２の発現カセットのＧＬＡ４結合部位に結合し、ＧＡＬ４応答性エレメントを含むプロモーターが作動し、下流に存在する標的遺伝子の発現が起こる。２段階の反応により、標的遺伝子の発現が増幅される。すなわち、改良形ＴＳＴＡシステムが作用し、特異的プロモーターの転写活性が上昇し、該細胞内で目的遺伝子が高効率で発現される。この結果、標的遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、発光やＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）等により特定の標的組織や標的細胞を検出することができる。また、標的遺伝子をして治療用遺伝子を用いた場合、疾患に関連する癌細胞等の特定の細胞や組織で治療用遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。第１の発現カセット及び第２の発現カセットは例えばベクターに挿入し、ベクターを介して細胞内に導入することができる。本発明において、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むベクターを、第１の発現カセットと第２の発現カセットを含むシステムを保持したベクターという。ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記発現カセットを導入したベクターを、感染等により細胞に導入すればよい。
第１の発現カセット及び第２の発現カセットを連結し、１つのＤＮＡ構築物として製造することもできる。該ＤＮＡ構築物は特異的プロモーター、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡ、ＧＡＬ４結合部位、最小プロモーター及び標的遺伝子が上流からこの順序で連結した構造を有する。この場合、第１の発現カセットと第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を１つのベクターに導入する。
本発明の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞を用いた実験に用いることも、非ヒト動物に導入して動物実験に用いることもでき、ヒトに導入して疾患の検出や治療に用いることもできる。
なお、配列番号１４に表される塩基配列において、配列番号１４に表される塩基配列の１〜３７３８番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号１（配列番号１４の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号１４の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号１４の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号１４の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号９（配列番号１４の１４７５〜１５９３番目の塩基に相当）、配列番号１０（ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１５９４〜３２４６番目の塩基に相当）、配列番号１１（配列番号１４の３２４７〜３２５９番目の塩基に相当）及び配列番号１２（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号１４の３２６０〜３７３８番目の塩基に相当）を連結したものは、特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む上記の改良型ＴＳＴＡシステムの第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＡＮ構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号１４に表される塩基配列の１〜１２９８番目の塩基からなる配列が第１の発現カセットに含まれ、１２９９〜３２４６番目の塩基からなる配列が第２の発現カセットに含まれる。
また、配列番号２０に表される塩基配列の１〜３１２２番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号１（配列番号２０の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号２０の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号２０の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号２０の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号１５（配列番号２０の１４７５〜１５４４番目の塩基に相当）、配列番号１６（ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子ＤＮＡ配列に６×ＨｉｓをコードするＤＮＡ配列を付加した配列；配列番号２０の１５４５〜２６２１番目の塩基に相当）、配列番号１７（配列番号２０の２６２２〜２６４３番目の塩基に相当）及び配列番号１８（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号２０の２６４４〜３１２２番目の塩基に相当）を連結したものは、特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み、レポーター遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含む上記の改良型ＴＳＴＡシステムの第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＡＮ構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号２０に表される塩基配列の１〜１２９８番目の塩基からなる配列が第１の発現カセットに含まれ、１２９９〜２６２１番目の塩基からなる配列が第２の発現カセットに含まれる。
本発明は、さらに、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合した融合ＤＮＡであって、転写活性化因子をコードするＤＮＡ構築物を含む。該ＤＮＡ構築物は例えば、配列番号２２に表される塩基配列からなる。
本発明の改良型ＴＳＴＡシステムはあらゆる特異的プロモーターの転写活性を上昇させることができる。本発明は、改良型ＴＳＴＡシステムを用いて特異的プロモーターの転写活性を上昇させる方法をも包含する。該方法においては、上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを特異的プロモーターが活性である細胞に導入する。該細胞内で、特異的プロモーターが作動し、転写因子が発現し、転写因子がＧＡＬ４応答性エレメントに結合し、該エレメント下流に位置する標的遺伝子の発現が増幅され、特異的プロモーターの活性が上昇する。本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを利用することにより、特異的プロモーター活性は、従来型のＴＳＴＡシステムを利用した場合に対して、少なくとも５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは２倍以上上昇する。プロモーター活性は後記の実施例に記載の方法で測定することができる。
本発明は、さらに、上記改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物である第１の発現カセット及び第２の発現カセットを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。該ベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とする。該ベクターはアデノ随伴ウイルスに上記の第１の発現カセットと第２の発現カセットを挿入して作製することができる。この際、第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＮＡ構築物を挿入してもよい。また、２種類の別々のアデノ随伴ウイルスベクターに挿入してもよく、この場合は細胞に２種類のベクターを導入すればよい。
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス属１本鎖ＤＮＡウイルスであり、（１）遺伝子長期発現、（２）低毒性、（３）分裂及び非分裂細胞に遺伝子導入が可能という特性を有する。コンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ；１本鎖ＤＮＡが連結した複合体）の形成が遺伝子長期発現の原因とされている。毒性に関してはアデノウイルスで知られるような肝毒性は少ない。
本発明においては、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻（カプシド）遺伝子に特定の細胞に特異的に発現するタンパク質に対する指向性を有し該細胞に結合する標的細胞特異的結合ペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、外殻を改変する。このようなペプチドを挿入することにより、該カプシド改変型アデノ随伴ウイルスベクターは特定のタンパク質を発現する特定の細胞を指向し該細胞に到達、結合し、感染し取り込まれ、細胞内で発現系が作用し、細胞内で標的遺伝子が発現し、診断や治療に用いることができる。アデノ随伴ウイルスの外殻遺伝子に挿入するＤＡＮがコードするペプチドは、腫瘍細胞や特定の組織若しくは器官の細胞に選択的に発現するタンパク質に結合することができ該細胞を指向する標的特異的ペプチドである。このようなペプチドとしては、例えば、腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有するペプチドが挙げられ、アミノ酸配列ＲＧＤ又はＮＧＲで表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ＲＧＤを含むペプチドとしては、ＲＧＤ配列を含みかつ細胞表面のインテグリンに対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、ＲＧＤを含めて５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、４Ｃ−ＲＧＤペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ：配列番号３６）が挙げられる。ペプチドとして４Ｃ−ＲＧＤペプチドを用いた場合、該ペプチドはインテグリンと結合親和性を有するので、例えば、ＣＨＯ細胞、気道上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、インテグリンを細胞表面に有する癌細胞（例えばヒトグリオーマ細胞ＬＮ４４４）等も指向する。ＮＧＲを含むペプチドとしては、ＮＧＲ配列を含みかつ細胞表面のアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）に対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、ＮＧＲを含めて５〜２０個のアミノ酸からなるものが好ましく、具体的には、例えば、ＮＧＲ関連ペプチド（ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ：配列番号３７）を挙げることができる。ペプチドとしてＮＧＲ関連ペプチドを用いた場合、該ペプチドはアミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３と結合親和性を有するので、例えば癌新生血管等のＣＤ１３発現細胞（例えばヒトグリオーマ細胞ＬＮ４４４）等も指向する。その他、臓器を指向するペプチドとして、脳を指向するＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）等、腎臓を指向するＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）等、（関節の）滑膜を指向するＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）等、ｔｕｍｏｒ ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓを指向するＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）等、血管新生している血管内皮細胞を指向するＡＰＲＰＧ（配列番号４８）などの細胞の表面に存在するインテグリン（インテグリンは総称で、複数の種類がある）を指向するＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）、ＤＧＥＡ（配列番号５１）等が挙げられる。これらのペプチドは、標的遺伝子を導入し、発現させようとする細胞に応じて適宜選択すればよい。これらのペプチドをコードする遺伝子を外殻遺伝子に挿入する場合、図７に示すように、配列番号３８で表される外殻の５８６番目から５９４番目のアミノ酸配列で表される部分に、リンカーＡＳ部及びＡＬＳ部を介して配列番号３９で表されるアミノ酸配列を挿入するようにすればよい。例えば、アデノ随伴ウイルスの外殻としてｔｙｐｅ１を用いて、リンカーとして上記のＡＳ部（制限酵素ＮｈｅＩ）とＡＬＳ部（制限酵素ＡｆｌＩ）を用いて、該リンカーを介して標的特異的ペプチドを自由に変更できるようにすればよい。
アデノ随伴ウイルスベクターは、公知の方法で製造することができる。例えば、米国特許第５，８５８，３５１号には、遺伝子治療に用い得る組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法等が記載されている（Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１；Ｂｅｒｎｓ「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｋｎｉｐｅ編等）。
図２に本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの模式図及び該ベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示す。図２Ａが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示し、図２Ｂが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示す図である。これらのＤＮＡ構築物はＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）で挟まれたアデノ随伴ウイルスの外殻に挿入する。
配列番号１４に図２Ａに構造を示すルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示し、配列番号２０に図２Ｂに構造を示すヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示す。配列番号１４に表される塩基配列は、配列番号１（配列番号１４の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号１４の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号１４の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号１４の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号９（配列番号１４の１４７５〜１５９３番目の塩基に相当）、配列番号１０（ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１５９４〜３２４６番目の塩基に相当）、配列番号１１（配列番号１４の３２４７〜３２５９番目の塩基に相当）、配列番号１２（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号１４の３２６０〜３７３８番目の塩基に相当）及び配列番号１３（配列番号１４の３７３９〜６６６４番目の塩基に相当）を連結したものに相当する。また、配列番号２０に表される塩基配列は、配列番号１（配列番号２０の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号２０の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号２０の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号２０の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号１５（配列番号２０の１４７５〜１５４４番目の塩基に相当）、配列番号１６（ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子ＤＮＡ配列に６×ＨｉｓをコードするＤＮＡ配列を付加した配列；配列番号２０の１５４５〜２６２１番目の塩基に相当）、配列番号１７（配列番号２０の２６２２〜２６４３番目の塩基に相当）、配列番号１８（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号２０の２６４４〜３１２２番目の塩基に相当）及び配列番号１９（配列番号２０の３１２３〜６０４８番目の塩基に相当）を連結したものに相当する。
本発明において上記配列番号の塩基配列で表されるＤＮＡは、それぞれのＤＮＡが有する活性又はそれぞれのＤＮＡがコードするタンパク質若しくはポリペプチドが有する活性を有している限り、塩基配列に変異を有していてもよい。例えば、それぞれの配列番号で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、それぞれの配列番号で表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡ構築物の構築に用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡを単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
これらのアデノ随伴ウイルスベクターにおいて、指向する細胞に合わせて特異的プロモーター配列を変更することができ、この場合、配列番号１４又は配列番号２０のｈ−ＴＥＲＴコアプロモーター配列を別のプロモーター配列に置換すればよい。また、診断に用いるレポーター遺伝子や治療に用いる遺伝子も適宜変更することができ、この場合、配列番号１４又は配列番号２０の遺伝子を別の遺伝子に置換すればよい。
本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、疾患検出又は疾患治療に用い得る。疾患としては、癌等が挙げられ、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻に挿入された特定の細胞に発現しているタンパク質に選択的に結合するＲＧＤ等のペプチドにより該細胞を指向し、該細胞に感染し、細胞内で改良型ＴＳＴＡシステムが作用し、標的遺伝子が発現する。標的遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子の場合、特定の細胞を発光等により検出することができる。特定の細胞が癌細胞の場合、被験体に投与することにより、被験体中の癌細胞を検出し、該被験体が癌に罹患していることを診断することができる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは細胞１個を検出することができるので、例えば微小癌の検出に用いることができる。
また、標的遺伝子が治療用遺伝子の場合、特定の細胞中で標的遺伝子が発現し、治療効果を発揮し得る。例えば、特定の細胞が癌細胞であり、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合、被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。本発明は、このようなアデノ随伴ウイルスベクターを含む診断又は治療用ウイルス製剤を包含する。治療用遺伝子として、ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合の治療対象となる癌としては、本発明の治療対象となる癌としては、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。
本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
アデノ随伴ウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノ随伴ウイルススベクターを、０．５×１０１１〜２．０×１０１２ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０１１〜１．０×１０１２ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１．０×１０１１〜５．０×１０１１ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重の量で投与すればよい。ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅは、アデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、ｐａｒｔｉｃｌｅということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
TSTA (Two-step transcriptional amplification) system is a mammal applying GAL4-DBD (DNA binding domain), which is a DNA binding domain of yeast GAL4 protein, and transcription activation domain of HSV-derived VP16 protein, which has strong transcriptional activity. It is an improvement of the cell 2 hybrid assay system. An outline is shown in FIG. 1B (in FIG. 1, GAL4-DBD is displayed only as GAL4). Specifically, there is a GAL4 binding sequence downstream of a fusion protein gene in which yeast GAL4 and VP16 are bound downstream of a tissue or cancer-specific promoter, and the TATA minimum activated by binding of the GAL4-VP16 fusion protein there A promoter (minimal promoter) finally translates the gene present downstream of the promoter. For TSTA, see Iyer M et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001 Dec 4, 98 (25), p. 14595-600; Iyer M et al, Mol Ther, 2004 Sep, 10 (3), p. 545-52; Ilagan R et al, Cancer Res, 2006 Nov 15, 66 (22), p. 10778-85; Japanese translations of PCT publication No. 2005-502645; and Japanese translations of PCT publication No. 2007-53515.
The improved TSTA (advanced two-step transcription amplification) system of the present invention comprises a first expression cassette capable of expressing a transcription factor comprising a DNA construct in which a DNA sequence encoding a transcription factor is linked downstream of a specific promoter. A second expression cassette comprising a DNA construct with a minimal promoter and target gene linked downstream of the GAL4 protein binding site is included. The second expression cassette can express the target gene by the action of the transcription factor expressed by the first expression cassette. The present invention is also a DNA construct comprising the first expression cassette and the second expression cassette described above. In the system of the present invention, the first expression cassette and the second expression cassette may be included as different separate DNA constructs, and one DNA construct in which the first expression cassette and the second expression cassette are linked. May be included.
Specific promoters are also referred to as selective promoters and include any specific promoter known to date or that may be reported in the future. Examples include tissue or organ-specific promoters, tumor-specific promoters, developmental or differentiation-specific promoters, promoters having promoter activity in specific tissues or organs, and promoter activity in specific developmental stages such as cells. Promoter, a promoter having promoter activity in tumor cells. Of these, tissue or organ-specific promoters and tumor-specific promoters are preferred. Tissue- and organ-specific promoters include NkX2.5, GATA4, MLC (myosin light chain) 2v, cardiac ankyrin repeat, ANF, BNP (brain native factor), ANP (atrial natriuretic) GFAP promoter, synapsin 1 promoter, tubulin α1 promoter, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II promoter, neuron-specific enolase promoter, PDGF (platelet-derived growth-batch-factor-batch-factor Brain-specific promoters such as terpolymers and the like. Moreover, as a tumor specific promoter, human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter, prostate specific antigen (PSA) promoter, carcinoembryonic antigen (CEA) promoter, α-fetoprotein (AFP) promoter, cyclooxygenase-2 (COX) -2) Promoters, tyrosinase promoters and the like. The promoter may be a core promoter portion consisting of a minimal sequence having promoter activity. The core promoter refers to a promoter region having a function of inducing accurate transcription initiation, and may include a TATA box. The sequence of the core promoter of hTERT is shown in SEQ ID NO: 2. Usually, specific promoters have low transcriptional activity and it has been difficult to increase the expression level of specific target genes. However, the improved promoters of the present invention have been known to date or will be reported in the future. The activity of any specific promoter that can be increased can be increased.
The first expression cassette is a glucosylated with DNA encoding a DNA binding domain (GAL4 DBD) of GAL4, which is a transcriptional activator of yeast, or DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP). The DNA includes a DNA encoding a corticoid receptor (GR) and a DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16 which is a transcriptional regulator of HSV1 (herpes simplex virus). In the conventional TSTA system, a fusion DNA of a DNA encoding the GAL4 DNA binding domain and a DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16 is used. In the present invention, a polyglutamine (Polyglutamine (Polyglutamine) between these DNAs is used. Q) or DNA encoding a glucocorticoid receptor (Rat GR) into which DNA encoding polyproline (PolyP) has been inserted. Although the origin species of the glucocorticoid receptor is not limited, for example, those derived from rats are used. The number of glutamine residues of polyglutamine or proline residues of polyproline inserted into the glucocorticoid receptor is 10 to 80, preferably 20 to 70, more preferably 30 to 50, particularly preferably 40. Glutamine is encoded by CAA or CGA, and the DNA encoding polyglutamine may contain only CAA or CGA, or may contain both. Proline is encoded by CCT, CCC, CCA, or CCG, and the DNA encoding polyproline may include one, two, three, or four of these triplets. In addition, polyglutamine or polyproline may be inserted into any part of the glucocorticoid receptor. For example, it is inserted after the 4th Tyr of the amino acid sequence of the glucocorticoid receptor.
The DNA binding domain of GAL4 is a fragment of amino acids 1 to 147 of the GAL4 protein. For example, the base sequence of DNA encoding the GAL4 binding domain is shown in SEQ ID NO: 4. For example, a DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) into which a DNA encoding polyglutamine (Poly Q) has been inserted is represented by SEQ ID NO: 5. Further, for example, DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16 is shown in SEQ ID NO: 6.
The second expression cassette has a structure in which a minimal promoter and a target gene are linked downstream of a GAL4 binding domain (GAL4 binding domain) that is a GAL4 response element. A structure in which a minimal promoter is connected downstream of a GAL4 binding site (GAL4 binding domain) is also referred to as an inducible promoter containing a GAL4 binding site, and is expressed by GAL4 / TATA. 5 to 20, preferably 5 to 10, and more preferably 5 GAL4 binding sites are linked. The promoter located downstream of the GAL4 binding domain is an inducible promoter that is responsive to the transcription factor expressed by the first expression cassette, and uses a GAL4 responsive promoter, a TATA minimal promoter, and an adenovirus EIIb minimal promoter. Can do. For example, the base sequence of DNA encoding the GAL4 binding site is shown in SEQ ID NO: 7, and the base sequence of the minimal promoter is shown in SEQ ID NO: 8.
The target gene is a target gene to be finally expressed by the improved TSTA system of the present invention, and a reporter gene that can be used for diagnosis of a disease such as cancer or a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease such as cancer. Can be mentioned.
In the DNA construct that is the first expression cassette and the DNA construct that is the second expression cassette, the promoter and the like are operably linked, and may further contain regulatory sequences such as an enhancer, terminator, and poly A sequence.
Reporter genes include luciferase (LUC) gene (SEQ ID NO: 10), fluorescent protein genes such as green fluorescent protein (GFP), fluorescent protein genes such as red fluorescent protein (DsRed), and β-glucuronidase (GUS) gene. Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, β-galactosidase (LacZ) gene, and the like. A PET (positron tomography) reporter gene such as a herpesvirus thymidine kinase (HSV-tk) gene can also be used. Examples of therapeutic genes that can be used for the treatment of specific diseases include REIC / Dkk-3 (SEQ ID NO: 21), tumor suppressor genes such as p53 and Rb, interleukin 1 (IL-1), IL-2, and IL-3. IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, α A physiologically active substance such as interferon, β-interferon, γ-interferon, angiostatin, thrombospondin, endostatin, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, tumor necrosis factor Examples thereof include a gene encoding, a DNA encoding siRNA or miRNA having an RNA interference action, and the like.
By introducing the first expression cassette and the second expression cassette into cells or tumor cells of a specific tissue, a specific promoter is activated, and the GAL4 DNA binding domain (GAL4 DBD) and polyglutamine (Poly Q) are activated. Alternatively, a transcription factor that is a fusion protein of a glucocorticoid receptor (GR) into which polyproline (PolyP) is inserted and a transcription activation domain is expressed. The transcription factor binds to the GLA4 binding site of the second expression cassette, the promoter containing the GAL4 responsive element is activated, and expression of the target gene existing downstream occurs. The target gene expression is amplified by a two-step reaction. That is, the improved TSTA system acts, the transcription activity of a specific promoter is increased, and the target gene is expressed with high efficiency in the cell. As a result, when a reporter gene is used as a target gene, a specific target tissue or target cell can be detected by luminescence, PET (positron tomography) or the like. In addition, when a therapeutic gene is used as a target gene, the therapeutic gene is expressed in specific cells or tissues such as cancer cells related to the disease and exhibits a therapeutic effect. The first expression cassette and the second expression cassette can be inserted into a vector, for example, and introduced into a cell via the vector. In the present invention, a vector comprising a first expression cassette and a second expression cassette is referred to as a vector holding a system comprising a first expression cassette and a second expression cassette. Examples of the vector include plasmids, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, Sendai virus vectors and other non-viral vectors such as biodegradable polymers. What is necessary is just to introduce | transduce into the cell by infection etc. the vector which introduce | transduced the said expression cassette.
The first expression cassette and the second expression cassette can be linked to produce a single DNA construct. The DNA construct encodes a specific promoter, DNA encoding GAL4 DNA binding domain (GAL4 DBD), glucocorticoid receptor (GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP). And DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16 which is a transcriptional regulator of HSV1 (herpes simplex virus), a GAL4 binding site, a minimal promoter and a target gene were linked in this order from upstream. It has a structure. In this case, a DNA construct containing the first expression cassette and the second expression cassette is introduced into one vector.
The DNA construct containing the first expression cassette and the second expression cassette of the present invention can be used for experiments using cells in vitro, or introduced into non-human animals for animal experiments. It can also be used for disease detection and treatment.
In addition, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, the sequence consisting of the 1st to 3738th bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, ie, SEQ ID NO: 1 (corresponding to the 1st to 6th bases of SEQ ID NO: 14 ), SEQ ID NO: 2 (hTERT core promoter sequence; corresponding to nucleotides 7 to 461 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 3 (corresponding to nucleotides 462 to 467 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 4 (GAL4 DNA binding) DNA sequence encoding a domain; corresponding to nucleotides 468 to 911 of SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 5 (coding rat glucocorticoid receptor (Rat GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q)) DNA sequence; corresponding to nucleotides 912 to 1163 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 6 (transcription activation domain of VP16) DNA sequence to be encoded; corresponding to nucleotides 1164 to 1298 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 7 (DNA sequence encoding GAL4 binding site; corresponding to nucleotides 1299 to 1463 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 8 ( Minimum promoter sequence; corresponding to nucleotides 1464 to 1474 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 9 (corresponding to nucleotides 1475 to 1593 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 10 (DNA sequence encoding luciferase; SEQ ID NO: 14 Of SEQ ID NO: 14 (corresponding to the 3247th to 3259th bases of SEQ ID NO: 14) and SEQ ID NO: 12 (polyA sequence; corresponding to the 3260th to 3738th bases of SEQ ID NO: 14). The ligated one contains hTERT as a specific promoter and le as a reporter gene. Corresponding to a nucleotide sequence of DAN construct connecting the first expression cassette and a second expression cassette of the aforementioned improved TSTA system including a luciferase gene. Among these, the sequence consisting of the 1st to 1298th bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 is included in the first expression cassette, and the sequence consisting of the 1299th to 3246th bases is included in the second expression cassette. .
Further, the sequence consisting of the 1st to 3122th bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20, ie, SEQ ID NO: 1 (corresponding to the 1st to 6th bases of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 2 (hTERT core promoter sequence; SEQ ID NO: 20 corresponding to bases 7 to 461), SEQ ID NO: 3 (corresponding to bases 462 to 467 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 4 (DNA sequence encoding GAL4 DNA binding domain; 468 to 911)), SEQ ID NO: 5 (DNA sequence encoding rat glucocorticoid receptor (Rat GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q); 912 to 1163 of SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 6 (DNA sequence encoding the transcriptional activation domain of VP16; 1 of SEQ ID NO: 20) 64 to 1298 base), SEQ ID NO: 7 (DNA sequence encoding GAL4 binding site; corresponding to bases 1299 to 1463 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 8 (minimum promoter sequence; 1464 of SEQ ID NO: 20) ~ Corresponding to the 1474th base), SEQ ID NO: 15 (corresponding to the 1475th ~ 1544th base of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 16 (DNA sequence encoding 6 × His in the human REIC / Dkk-3 gene DNA sequence) Added sequence; corresponding to nucleotides 1545 to 2621 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 17 (corresponding to nucleotides 2622 to 2643 of SEQ ID NO: 20) and SEQ ID NO: 18 (polyA sequence; 2644 to 3122 of SEQ ID NO: 20) (Corresponding to the second base), which contains hTERT as a specific promoter, This corresponds to the nucleotide sequence of the DAN construct in which the first expression cassette and the second expression cassette of the improved TSTA system containing the human REIC / Dkk-3 gene as a gene are linked. Among these, the sequence consisting of the 1st to 1298th bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 is included in the first expression cassette, and the sequence consisting of the 1299th to 2621st bases is included in the second expression cassette. .
The present invention further includes a DNA encoding a GAL4 DNA binding domain (GAL4 DBD), a DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) inserted with a DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP). And a DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16, which is a transcriptional regulator of HSV1 (herpes simplex virus), is a fusion DNA fused in this order, and includes a DNA construct encoding the transcriptional activation factor. The DNA construct consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22, for example.
The improved TSTA system of the present invention can increase the transcriptional activity of any specific promoter. The present invention also includes a method for increasing the transcriptional activity of a specific promoter using the improved TSTA system. In this method, the first expression cassette and the second expression cassette described above are introduced into a cell in which a specific promoter is active. In the cell, a specific promoter operates, a transcription factor is expressed, the transcription factor binds to a GAL4-responsive element, the expression of a target gene located downstream of the element is amplified, and the activity of the specific promoter increases. To do. By using the improved TSTA system of the present invention, the specific promoter activity is at least 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 50% or more, compared to the case where the conventional TSTA system is used. More preferably, it rises twice or more. Promoter activity can be measured by the method described in the Examples below.
The present invention further includes an adeno-associated virus (AAV) vector having a first expression cassette and a second expression cassette, which are the above-described DNA construct for the improved TSTA system. The vector enables specific diagnosis or treatment of diseases such as cancer. The vector can be prepared by inserting the first expression cassette and the second expression cassette into an adeno-associated virus. At this time, a DNA construct in which the first expression cassette and the second expression cassette are linked may be inserted. Alternatively, it may be inserted into two different adeno-associated virus vectors. In this case, the two types of vectors may be introduced into the cells.
Adeno-associated virus is a parvovirus genus single-stranded DNA virus, and has the characteristics of (1) gene long-term expression, (2) low toxicity, and (3) gene transfer into dividing and non-dividing cells. The formation of concatamers (complexes in which single-stranded DNAs are linked) is the cause of long-term gene expression. Regarding toxicity, there is little hepatotoxicity known as adenovirus.
In the present invention, a DNA encoding a target cell-specific binding peptide that has directivity to a protein specifically expressed in a specific cell and binds to the cell is inserted into the outer shell (capsid) gene of the adeno-associated virus vector. And modify the outer shell. By inserting such a peptide, the capsid-modified adeno-associated virus vector is directed to a specific cell that expresses a specific protein, reaches and binds to the cell, infects and is taken in, and an expression system within the cell Acts, the target gene is expressed in the cell, and can be used for diagnosis and treatment. A peptide encoded by DAN that is inserted into the outer gene of an adeno-associated virus is a target-specific peptide that can bind to a protein that is selectively expressed in tumor cells or cells of a specific tissue or organ and is directed to the cells. is there. Examples of such peptides include peptides having directivity for tumor vascular endothelial cells, and include peptides containing the amino acid sequence represented by the amino acid sequence RGD or NGR. Peptides containing RGD include peptides that contain an RGD sequence and have binding affinity for cell surface integrins. For example, it is a peptide consisting of 5 to 20 amino acids including RGD. An example of such a peptide is 4C-RGD peptide (CDCRGDCFC: SEQ ID NO: 36). When 4C-RGD peptide is used as a peptide, since the peptide has binding affinity with integrin, for example, CHO cells, airway epithelial cells, smooth muscle cells, vascular endothelial cells, T cells, macrophages, hematopoietic stem cells, dendrites Cells and cancer cells having integrin on the cell surface (for example, human glioma cell LN444) are also directed. The peptide containing NGR includes a peptide containing an NGR sequence and having binding affinity for aminopeptidase N (CD13) on the cell surface. For example, what consists of 5-20 amino acids including NGR is preferable, and a NGR related peptide (CNGRCVSGCAGRC: sequence number 37) can be mentioned specifically, for example. When an NGR-related peptide is used as a peptide, since the peptide has binding affinity with aminopeptidase N / CD13, for example, CD13-expressing cells (for example, human glioma cells LN444) such as cancer neovascular cells are also directed. In addition, CLPSASC (SEQ ID NO: 43) directed to the kidney, such as CLSSRLDAC (SEQ ID NO: 40), CNSRLHLRC (SEQ ID NO: 41), CENWWGDVC (SEQ ID NO: 42), WRCVLREGPAGCCAWFNRHRL (SEQ ID NO: 43), which is directed to the brain, as peptides directed to the organ 44), CGAREMC (SEQ ID NO: 45), CKSTHDRLC (SEQ ID NO: 46) directed to the (articular) synovium, CGNKRTRGC (SEQ ID NO: 47) directed to tumor lymphatics, and the like. KQAGDV (SEQ ID NO: 49), LDV, KRLDGS (SEQ ID NO: 50), DG that directs integrin (integrin is a general term, there are multiple types) such as APRPG (SEQ ID NO: 48) that are directed EA (sequence number 51) etc. are mentioned. These peptides may be appropriately selected according to the cell into which the target gene is introduced and expressed. When a gene encoding these peptides is inserted into the outer shell gene, as shown in FIG. 7, a linker AS is inserted into the portion represented by the 586th to 594th amino acid sequence of the outer shell represented by SEQ ID NO: 38. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 may be inserted via the part and the ALS part. For example, using type1 as the outer shell of adeno-associated virus and using the above AS part (restriction enzyme NheI) and ALS part (restriction enzyme AflI) as linkers, the target-specific peptide can be freely changed via the linker. You can do it.
The adeno-associated virus vector can be produced by a known method. For example, US Pat. No. 5,858,351 describes a method for producing a recombinant adeno-associated virus that can be used for gene therapy (Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns “Parvoviridae). and thereplication "Fundamental Virology, 2nd edition, edited by Fields & Knipe, etc.).
FIG. 2 shows a schematic diagram of an adeno-associated virus (AAV) vector capable of expressing a target gene by the improved TSTA system of the present invention and a structural diagram of an expression cassette which is a DNA construct introduced into the vector. FIG. 2A shows a structural diagram of an expression cassette which is a DNA construct introduced into an adeno-associated virus vector containing hTERT as a specific promoter and a luciferase gene as a specific gene, and FIG. 2B shows a specific gene containing hTERT as a specific promoter. Is a diagram showing the structure of an expression cassette which is a DNA construct introduced into an adeno-associated virus vector containing the human REIC / Dkk-3 gene. These DNA constructs are inserted into the outer shell of adeno-associated virus sandwiched between ITRs (Inverted terminal repeats).
SEQ ID NO: 14 shows the base sequence contained in the outer shell of the adeno-associated virus vector containing the luciferase gene whose structure is shown in FIG. 2A, and SEQ ID NO: 20 is the adeno containing the human REIC / Dkk-3 gene whose structure is shown in FIG. 2B. The base sequence contained in the outer shell of the associated virus vector is shown. The base sequence represented by SEQ ID NO: 14 is SEQ ID NO: 1 (corresponding to the 1st to 6th bases of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 2 (hTERT core promoter sequence; corresponding to the 7th to 461st bases of SEQ ID NO: 14) ), SEQ ID NO: 3 (corresponding to nucleotides 462 to 467 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 4 (DNA sequence encoding GAL4 DNA binding domain; corresponding to nucleotides 468 to 911 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 5 (DNA sequence encoding rat glucocorticoid receptor (Rat GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q); corresponding to nucleotides 912 to 1163 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 6 (VP16 DNA sequence encoding the transcriptional activation domain; corresponding to bases 1164 to 1298 of SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 7 ( DNA sequence encoding AL4 binding site; corresponding to nucleotides 1299 to 1463 of SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 8 (minimum promoter sequence; corresponding to nucleotides 1464 to 1474 of SEQ ID NO: 14); SEQ ID NO: 9 (sequence) No. 14 corresponding to nucleotides 1475 to 1593), SEQ ID NO. 10 (DNA sequence encoding luciferase; corresponding to nucleotides 1594 to 3246 of SEQ ID NO. 14), SEQ ID NO. 11 (positions 3247 to 3259 of SEQ ID NO. 14) ), SEQ ID NO: 12 (corresponding to the 3260th to 3738th bases of SEQ ID NO: 14) and SEQ ID NO: 13 (corresponding to the 3739th to 6664th bases of SEQ ID NO: 14) To do. The base sequence represented by SEQ ID NO: 20 is SEQ ID NO: 1 (corresponding to the first to sixth bases of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 2 (hTERT core promoter sequence; 7th to 461th bases of SEQ ID NO: 20) SEQ ID NO: 3 (corresponding to nucleotides 462 to 467 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 4 (DNA sequence encoding GAL4 DNA binding domain; corresponding to nucleotides 468 to 911 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 5 (DNA sequence encoding rat glucocorticoid receptor (Rat GR) inserted with DNA encoding polyglutamine (Poly Q); corresponding to nucleotides 912 to 1163 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 6 ( DNA sequence encoding the transcriptional activation domain of VP16; corresponding to bases 1164 to 1298 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 7 (DNA sequence encoding GAL4 binding site; corresponding to nucleotides 1299 to 1463 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 8 (minimum promoter sequence; corresponding to nucleotides 1464 to 1474 of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 15 (Corresponding to the 1475th to 1544th bases of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 16 (a sequence obtained by adding a DNA sequence encoding 6 × His to the human REIC / Dkk-3 gene DNA sequence; 1545th to 2621st positions of SEQ ID NO: 20 ), SEQ ID NO: 17 (corresponding to the 2622 to 2643th bases of SEQ ID NO: 20), SEQ ID NO: 18 (polyA sequence; corresponding to the 2644 to 3122th bases of SEQ ID NO: 20) and SEQ ID NO: 19 (sequence) This corresponds to the concatenation of No. 20 3123 to 6048).
In the present invention, the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: has a mutation in the nucleotide sequence as long as it has the activity of each DNA or the activity of the protein or polypeptide encoded by each DNA. It may be. For example, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by each SEQ ID NO., The base sequence represented by each SEQ ID NO., And BLAST (Basic Local Alignment) At least 85% when calculated using Search Tool at the National Center for Biological Information (e.g., US National Biological Information Center Basic Local Alignment Search Tool)) (e.g., using default or default parameters) DNA having homology of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, or a protein or a poly encoded by said DNA An amino acid sequence in which one, plural or several (1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2) amino acids are substituted, deleted and / or added to the amino acid sequence of peptide. DNA encoding a protein or polypeptide consisting of can also be used for the construction of the DNA construct of the present invention. Here, “stringent conditions” are, for example, conditions of about “1XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more severe conditions are “0.5XSSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” The condition is about “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”. As the hybridization conditions become more severe in this way, it can be expected to isolate DNA having a high homology with the probe sequence. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and necessary stringency can be realized by appropriately combining probe concentration, probe length, hybridization reaction time, and the like. .
In these adeno-associated virus vectors, the specific promoter sequence can be altered according to the cell to which it is directed, in which case the h-TERT core promoter sequence of SEQ ID NO: 14 or 20 is replaced with another promoter sequence. That's fine. In addition, a reporter gene used for diagnosis and a gene used for treatment can be appropriately changed. In this case, the gene of SEQ ID NO: 14 or 20 may be replaced with another gene.
The adeno-associated virus (AAV) vector capable of expressing a target gene by the improved TSTA system of the present invention can be used for disease detection or disease treatment. Examples of the disease include cancer, and the like is directed to the cell by a peptide such as RGD that selectively binds to a protein expressed in a specific cell inserted in the outer shell of an adeno-associated virus vector. Infected, the modified TSTA system acts in the cell and the target gene is expressed. When the target gene is a reporter gene such as a luciferase gene, specific cells can be detected by luminescence or the like. When a specific cell is a cancer cell, by administering to a subject, the cancer cell in a subject can be detected and it can be diagnosed that the subject is suffering from cancer. Since the adeno-associated virus vector of the present invention can detect one cell, it can be used, for example, for detection of a minute cancer.
In addition, when the target gene is a therapeutic gene, the target gene is expressed in a specific cell and can exhibit a therapeutic effect. For example, when a specific cell is a cancer cell and a cancer suppressor gene such as REIC / Dkk-3 gene is used, the gene for cancer treatment is delivered to the cancer cell of the subject by administration to the subject, and the cancer Genes are expressed in cells and exert therapeutic effects. The present invention includes a diagnostic or therapeutic viral preparation comprising such an adeno-associated viral vector. As a cancer to be treated when a tumor suppressor gene such as a human REIC / Dkk-3 gene is used as a therapeutic gene, examples of the cancer to be treated according to the present invention include brain / neural tumors, skin cancers, and the like. , Stomach cancer, lung cancer, liver cancer, lymphoma / leukemia, colon cancer, pancreatic cancer, anal / rectal cancer, esophageal cancer, uterine cancer, breast cancer, adrenal cancer, renal cancer, renal pelvic and ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, urethral cancer, penis Examples include cancer, testicular cancer, bone / osteosarcoma, leiomyoma, rhabdomyosarcoma, and mesothelioma. The adeno-associated virus vector of the present invention can be used for the treatment of primary cancer and metastatic cancer.
The adeno-associated virus vector of the present invention can be used in a gene therapy field, for example, intravascular administration such as intravenous administration or intraarterial administration, oral administration, intraperitoneal administration, intratracheal administration, intrabronchial administration, subcutaneous administration. Administration can be by administration, transdermal administration, and the like. In particular, the adeno-associated virus vector of the present invention is highly directed to specific tissues and cells, and can efficiently deliver a target gene to specific tissues and cells. Diagnosis and treatment can be performed.
The adeno-associated virus vector may be administered in a therapeutically effective amount. A therapeutically effective amount can be readily determined by one skilled in the art of gene therapy. Furthermore, the dose can be appropriately changed depending on the severity of the disease state, sex, age, weight, habits, etc. of the subject. For example, adeno-associated virus vector 11 ~ 2.0 × 10 12 virtual genome / kg body weight, preferably 1.0 × 10 11 ~ 1.0 × 10 12 virtual genome / kg body weight, more preferably 1.0 × 10 11 ~ 5.0 × 10 11 What is necessary is just to administer in the quantity of a viral genome / kg body weight. The virtual genome indicates the number of molecules of the adeno-associated virus genome (the number of virus particles), and is sometimes referred to as a particle. Contains carriers, diluents and excipients commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets. As an aqueous solution for injection, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic surfactants, etc. You may use together. As the oily liquid, sesame oil, soybean oil and the like are used, and as a solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination.
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
改良型ＴＳＴＡ（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムの創出
（１） 改良型ＴＳＴＡ（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムの創出
ＴＳＴＡシステムは、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｍａｉｎ）（図１においては、ＧＡＬ４とのみ表示）と強力な転写活性を有するＨＳＶ由来のＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞２ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母ＧＡＬ４とＶＰ１６を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にＧＡＬ４結合配列があり、そこにＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質が結合することにより活性化するＴＡＴＡ最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。ＴＳＴＡについては、Ｉｙｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１ Ｄｅｃ ４，９８（２５），ｐ．１４５９５−６００； Ｉｙｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００４ Ｓｅｐ，１０（３），ｐ．５４５−５２； Ｉｌａｇａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６ Ｎｏｖ １５，６６（２２），ｐ．１０７７８−８５；特表２００５−５０２６４５号公報；特表２００７−５３５１５号公報等に記載されている。
本実施例では、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合遺伝子間に４０個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター（ラット）の間に挟みこんだもの（ＧＲ ｍｏｉｅｔｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙＱと表示）を挿入した。ＴＳＴＡにおいて、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合遺伝子間に４０個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター（ラット）の間に挟みこんだもの（ＧＲ ｍｏｉｅｔｙ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙＱと表示）を挿入するシステムを改良型ＴＳＴＡシステムという。図１に従来のｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（図１Ａ）、従来のｔｗｏ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（図１Ｂ）及び本発明の改良型ｔｗｏ ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（図１Ｃ）に用いる構築物の構造を示す。図１Ｃに示すように、改良型ＴＳＴＡシステムにおいては、組織又は癌特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡの融合ＤＮＡであって、両ＤＮＡの間にラットのグルココルチコイドレセプターをコードするＤＮＡの間に４０個のグルタミンをコードするＤＮＡを挟んだＤＮＡが挿入されたＤＮＡが存在し、さらにその下流に５個のＧＡＬ４結合ドメインをコードするＤＮＡが存在し、さらにその下流にアデノウイルスの最小プロモーターが存在し、さらにその下流にレポーター遺伝子が存在する。
本実施例においては、プロモーターとして腫瘍細胞特異的に活性をもつヒトテロメアーゼのプロモーターであるｈＴＥＲＴプロモーターを用いた。
上記の改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターを作製し用いた。発現させる遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１０）又は癌抑制遺伝子であるヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子（配列番号２１）を用いた。
改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターは図３に示す工程により作製した。図４に図３の工程で用いたプライマーの配列を示す。Creation of improved TSTA (two-step transcriptional amplification) system (1) Creation of improved TSTA (two-step transcriptional amplification) system TSTA system is the DNA binding domain of GAL4 protein of yeast GALinDBd (In FIG. 1, only GAL4 is indicated) and a mammalian cell two-hybrid assay system using the transcriptional activation domain of HSV-derived VP16 protein having strong transcriptional activity. Specifically, there is a GAL4 binding sequence downstream of a fusion protein gene in which yeast GAL4 and VP16 are bound downstream of a tissue or cancer-specific promoter, and the TATA minimum activated by binding of the GAL4-VP16 fusion protein there A promoter (minimal promoter) finally translates the gene present downstream of the promoter. For TSTA, see Iyer M et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2001 Dec 4, 98 (25), p. 14595-600; Iyer M et al, Mol Ther, 2004 Sep, 10 (3), p. 545-52; Ilagan R et al, Cancer Res, 2006 Nov 15, 66 (22), p. 10778-85; Japanese translations of PCT publication No. 2005-502645; and Japanese translations of PCT publication No. 2007-53515.
In this example, 40 glutamines sandwiched between glucocorticoid receptors (rats) between GAL4-VP16 fusion genes (designated as GR moiety with polyQ) were inserted. In TSTA, a system that inserts 40 glutamines sandwiched between glucocorticoid receptors (rats) between GAL4-VP16 fusion genes (designated as GR moity with polyQ) is called an improved TSTA system. 1 shows a conventional single step transcription system (FIG. 1A), a conventional two step translation system structure (FIG. 1B), and an improved two structure structure of the present invention. As shown in FIG. 1C, in the improved TSTA system, transcriptional activation of DNA encoding the GAL4 DNA-binding domain downstream of a tissue or cancer-specific promoter and VP16, a transcriptional regulator of HSV1 (herpes simplex virus). A fusion DNA of a DNA encoding a domain, wherein a DNA in which a DNA encoding 40 glutamines is inserted between DNAs encoding a rat glucocorticoid receptor is present between both DNAs; Further downstream is DNA encoding 5 GAL4-binding domains, further downstream is the adenoviral minimal promoter, and further downstream is the reporter gene.
In this example, the hTERT promoter, which is a human telomerase promoter having activity specific to tumor cells, was used as the promoter.
An adeno-associated virus vector containing the above-described improved TSTA system DNA construct was prepared and used. As a gene to be expressed, a luciferase gene (SEQ ID NO: 10) or a human REIC / Dkk-3 gene (SEQ ID NO: 21) which is a tumor suppressor gene was used.
An adeno-associated virus vector containing a DNA construct for the improved TSTA system was prepared by the process shown in FIG. FIG. 4 shows the primer sequences used in the process of FIG.
各種癌細胞を用いての検討
プロモーターとして、ｈＴＥＲＴプロモーターを含みレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む、改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各種癌細胞（ＰＣ３、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＬＮＣａＰ、ＨｅＬａ）及び正常細胞（ＯＵＭＳ、ＰｒＥＣ）に感染させた。
（１）ｈＴＥＲＴ活性
Ｔｅｌ ＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ ＥＲＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ社）によりｈＴＥＲＴ活性を直接測定した。
図５に、相対的ｈＴＲＥＴ活性（各種癌細胞におけるｈＴＥＲＴ活性）を測定した結果を示す。ＰＣ３（前立腺癌）を１．０としたときの値をｂａｒ ｇｒａｐｈで示す。正常細胞（ＯＵＭＳ：線維芽細胞、ＰｅＥＣ：前立腺細胞）では著しく低いが、各種癌細胞では著しくｈＴＥＲＴ活性が高かった。
（２）ルシフェラーゼ発現
各癌細胞における、ルシフェラーゼの発現を公知のルミノメーターによるアッセイ法により測定した。この際、ＴＳＴＡシステムを利用せずに、ｈＴＥＲＴプロモーターのみによるルシフェラーゼ活性（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ（ｈＴＥＲＴのみ））、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いた従来のＴＳＴＡシステムによるルシフェラーゼ活性（ｔｗｏ ｓｔｅｐ（ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡ））及びｈＴＥＲＴプロモーターを用いた本発明の改良型ＴＳＴＡシステムによるルシフェラーゼ活性（ｔｗｏ ｓｔｅｐ＋ｐｏｌｙＱ（ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡ））によるルシフェラーゼ活性を測定した。
図６Ａに、結果を示す。各細胞においてｈＴＥＲＴのみのルシフェラーゼ活性を１．０とした。図６ＢはＬＮＣＣａＰの結果を示す。ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡはある種の癌細胞（ＬＮＣａｐやＨｅＬａ）ではｈＴＥＲＴプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型ＴＳＴＡ＝ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡでは全ての癌細胞でｈＴＥＲＴプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。正常細胞では、転写活性はほぼ変化が無かった。Examination using various cancer cells As a promoter, a pGL3 basic vector (Promega) containing a DNA construct for an improved TSTA system containing a hTERT promoter and a luciferase gene as a reporter gene is used for various cancer cells (PC3, Hep3B, HepG2, LNCaP, HeLa) and normal cells (OUMS, PrEC) were infected.
(1) hTERT activity hTERT activity was directly measured by Tel TAGGG telomerase PCR ERISA PLUS (Roche).
FIG. 5 shows the results of measuring the relative hTRET activity (hTERT activity in various cancer cells). The value when PC3 (prostate cancer) is 1.0 is shown by bar graph. Although it was extremely low in normal cells (OUMS: fibroblasts, PeEC: prostate cells), hTERT activity was remarkably high in various cancer cells.
(2) Luciferase expression The expression of luciferase in each cancer cell was measured by an assay method using a known luminometer. At this time, without using the TSTA system, the luciferase activity only by the hTERT promoter (single step (only for hTERT)), the luciferase activity by the conventional TSTA system using the hTERT promoter (two step (hTERT + TSTA)) and the hTERT promoter are used. The luciferase activity by the luciferase activity (two step + polyQ (hTERT + adTSTA)) by the improved TSTA system of the present invention was measured.
The results are shown in FIG. 6A. The luciferase activity of only hTERT was set to 1.0 in each cell. FIG. 6B shows the results for LNCCaP. hTERT + TSTA had lower transcriptional activity than hTERT promoter in certain cancer cells (LNCap and HeLa), but improved TSTA = hTERT + adTSTA showed higher transcriptional activity than hTERT promoter alone in all cancer cells . In normal cells, transcriptional activity was almost unchanged.
ＲＧＤを外殻に含むアデノウイルス随伴ベクターの腫瘍細胞への感染効率の検討
αｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎ（腫瘍血管に多く発現）のリガンドとなるＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド７をＡＡＶ外殻に挿入し、その腫瘍特異的集積を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターはｈＴＥＲＴプロモーターを含む改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた。この際、コントロールとしてＲＧＤを挿入しないものを用いた。ＲＧＤを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターをａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１−ＲＧＤ）とし、ＲＧＤを挿入しないアデノ随伴ウイルスベクターをａｄＴＳＴＡ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１）とする。ＲＧＤは４Ｃ−ＲＧＤ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ：配列番号３６）を用い、リンカーとしてＡＳ及びＡＬＳを用いた（図７）。
５×１０５個のＲＧＤのリガンドであるαｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎが強発現している細胞（ＨＵＶＥＣ、ＳＫＯＶ−３及びＫ５６２）を２４ｗｅｌｌプレートに播き２４時間後に２０ＭＯＩのａｄＴＳＴＡ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１）又はａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１−ＲＧＤ）に感染させ、７２時間後にＧＦＰ陽性細胞率を判定した。
結果を図８に示す。図８Ａ、Ｂ及びＣはそれぞれ、ＨＵＶＥＣ、ＳＫＯＶ−３及びＫ５６２の結果を示す。３種類の細胞でａｄＴＳＴＡ−ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰによる有意な感染効率の上昇が認められ、それらは培養液中に添加されたＲＧＤ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＧＤＳ，Ｓｉｇｍａ：２００ｇ／ｍｌ）で中和された。
これらはａｄＴＳＴＡ−ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰによる感染効率の上昇がＲＧＤ−αｖ ｉｎｔｅｇｒｉｎ結合に由来することを示しており、ウイルス表面のＲＧＤが確実に機能していることを強く示唆している。Examination of infection efficiency of tumor cells with adenovirus-associated vector containing RGD in outer shell RGD (Arg-Gly-Asp) peptide 7 which is a ligand of αv integrin (expressed in many tumor blood vessels) is inserted into the AAV outer shell, The tumor specific accumulation was examined. As the adeno-associated virus vector, a vector containing an improved TSTA system DNA construct containing the hTERT promoter was used. In addition, GFP (Green Fluorescent Protein) was used as a reporter gene. At this time, a control without inserting RGD was used. The adeno-associated virus vector into which RGD is inserted is referred to as adTSTA / RGD-AAV-GFP (AAV1-RGD), and the adeno-associated virus vector into which RGD is not inserted is referred to as adTSTA-AAV-GFP (AAV1). RGD was 4C-RGD (CDCRGDCFC: SEQ ID NO: 36), and AS and ALS were used as linkers (FIG. 7).
Cells (HUVEC, SKOV-3 and K562) in which 5 × 10 5 RGD ligand αv integrin is strongly expressed are seeded on a 24-well plate, and 20 MOI adTSTA-AAV-GFP (AAV1) or adTSTA / RGD-AAV-GFP (AAV1-RGD) was infected, and the GFP positive cell rate was determined 72 hours later.
The results are shown in FIG. 8A, B, and C show the results for HUVEC, SKOV-3, and K562, respectively. Significant increase in infection efficiency by adTSTA-RGD-AAV-GFP was observed in three types of cells, and they were neutralized with RGD-peptide (RGDS, Sigma: 200 g / ml) added to the culture medium.
These indicate that the increase in infection efficiency by adTSTA-RGD-AAV-GFP is derived from RGD-αv integrin binding, strongly suggesting that the RGD on the virus surface functions reliably.
同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の診断
同所性肝臓癌モデルマウスを用いて、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターを用いた原発性癌モニターに関する検討を行った。
アデノ随伴ウイルスベクターはｈＴＥＲＴプロモーターを含む改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含み外殻にＲＧＤを挿入したものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼを用いた。該アデノ随伴ウイルスベクターをａｄＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃという。
５００万個のヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ３ＢをＢａｌｂｃヌードマウスの肝臓に移植し（ｄａｙ０）、その５日後に１０１０ ｐａｒｔｉｃｌｅのａｄＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを尾静脈より投与した（ｄａｙ５）。その後定期的（ｄａｙ８、ｄａｙ２０及びｄａｙ３０）に、ＩＶＩＳ ＳＰＥＣＴＲＵＭ（ＸＥＮＯＧＥＮ社）（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）にて観察した。
図９Ａに検討のスケジュールの概要及びＩＶＩＳ像を示す。
ｄａｙ８で剣状突起周囲に一点のＩＶＩＳシグナルを認めた。そのシグナルは徐々に増大し、ｄａｙ３０にはＩＶＩＳ上で認めたシグナルに一致して肝臓表面に１５×５ｍｍ大の腫瘍塊を認めた。
これらは、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが植込み直後のＨｅｐ３Ｂ（微小癌と考えられる）に取り込まれルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を発現し、その後Ｌｕｃを発現しているＨｅｐ３Ｂ細胞が増殖、腫瘍塊を形成したと考えられる。図９Ｂに腫瘍塊の写真を示す。本実施例は、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが微小癌のモニターに用いることができることを示している。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる原発性微小癌の診断及びモニターに有用である。Diagnosis of primary lesions in orthotopic liver cancer model mice Using the orthotopic liver cancer model mice, studies were conducted on a primary cancer monitor using the adeno-associated virus vector of the present invention.
As the adeno-associated virus vector, an improved TSTA system DNA construct containing the hTERT promoter and RGD inserted into the outer shell was used. Moreover, luciferase was used as a reporter gene. The adeno-associated virus vector is referred to as adAdTSTA / RGD-AAV-Luc.
Five million human liver cancer cells Hep3B were transplanted into the liver of Balbc nude mice (day 0), and 5 days later, 1010 particles of adAdTSTA / RGD-AAV-Luc were administered from the tail vein (day 5). Thereafter, observation was performed periodically (day 8, day 20 and day 30) with IVIS SPECTRUM (XENOGEN) (in vivo imaging system).
FIG. 9A shows an outline of the examination schedule and an IVIS image.
On day 8, one IVIS signal was recognized around the xiphoid process. The signal gradually increased, and a tumor mass 15 × 5 mm in size was observed on the surface of day 30 in accordance with the signal observed on IVIS.
In these, adTSTA / RGD-AAV-Luc is incorporated into Hep3B (which is considered to be a small cancer) immediately after implantation, expresses a luciferase (Luc) gene, and then Hep3B cells expressing Luc proliferate and form a tumor mass It is thought that. FIG. 9B shows a photograph of the tumor mass. This example shows that adTSTA / RGD-AAV-Luc can be used to monitor microcancer.
The model mouse used in this example is only an example of a primary microcancer, and the adeno-associated virus vector of the present invention has the property of being efficiently taken up by tumor tissue and expressing a gene only in tumor cells. Therefore, it is useful for diagnosis and monitoring of any primary microcancer.
同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果の検討
実施例４で用いた遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子からヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子（癌抑制遺伝子）に変更し、アデノ随伴ウイルスベクターの治療効果を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターをＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣという。
肝臓に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているＨｅｐ３Ｂ／Ｌｕｃ細胞を使用した。この場合、ＩＶＩＳシグナルはＨｅｐ３Ｂ／Ｌｕｃの細胞数に比例する。
細胞移植５日後に１０１０ ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを尾静脈より投与した。コントロール群ではヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の代わりにＡＦＰ（αフェトプロテイン）遺伝子を含むＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＬＰを投与した。
図１０に治療スケジュールを示す。また、図１１ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１１ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。図より明らかな通り、ＲＥＩＣ治療群ではｄａｙ３０でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
組織Ｔｕｎｎｅｌ（アポトーシス検知）より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例により、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣが同所性肝臓癌に対して治療効果があることが証明された。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またＲＥＩＣ遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる原発性癌の治療に有用であると考えられる。Examination of liver cancer therapeutic effect in orthotopic liver cancer model mice The gene used in Example 4 was changed from luciferase gene to human REIC / Dkk-3 gene (tumor suppressor gene), and the therapeutic effect of adeno-associated virus vector was examined. did. The adeno-associated virus vector is referred to as AdTSTA / RGD-AAV-REIC.
As the cells to be implanted into the liver, Hep3B / Luc cells that constantly express the luciferase gene were used. In this case, the IVIS signal is proportional to the number of Hep3B / Luc cells.
Five days after cell transplantation, 1010 particles of AdTSTA / RGD-AAV-REIC were administered from the tail vein. In the control group, AdTSTA / RGD-AAV-ALP containing AFP (α-fetoprotein) gene was administered instead of human REIC / Dkk-3 gene.
FIG. 10 shows a treatment schedule. FIG. 11B shows the result of the IVIS signal and tissue Tunnel (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-REIC. FIG. 11A shows the IVIS signal and tissue Tunnel results (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-AFP (control group). As is apparent from the figure, the signal was almost lost at day 30 in the REIC treatment group, but the signal was clearly increased in the control group.
From the tissue Tunnel (apoptosis detection), apoptosis was considered to be a major cause of therapeutic effect. This example demonstrates that adTSTA / RGD-AAV-REIC has a therapeutic effect on orthotopic liver cancer.
The model mouse used in this example is merely an example of a primary microcancer, and the adeno-associated virus vector of the present invention has a characteristic that it is efficiently incorporated into tumor tissue and expresses a gene only in tumor cells, In addition, the anti-tumor effect of the REIC gene on a wide range of tumor cells is considered useful for the treatment of all primary cancers.
腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の診断
腎臓癌ＲＥＮＣＡ細胞肺転移モデルマウスを使用し、血行性肺転移モデルにおける、診断・治療効果の検討を行った。用いたアデノ随伴ウイルスベクターは実施例４で用いたものと同じであった。
５万個のＲＥＮＣＡ細胞をＢａｌｂｃヌードマウスの尾静脈から血行性に肺に移植した（ｄａｙ０）。
その５日後に１０１０ ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを尾静脈より投与した（ｄａｙ５）。コントロール群ではＰＢＳを投与した。その後定期的（ｄａｙ８、ｄａｙ２０、ｄａｙ３０）にＩＶＩＳにて観察した。
実験スケジュールを図１２に示す。また、図１３ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１３Ａにコントロール群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。
３０日目におけるＩＶＩＳ画像より明らかなように、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕ投与群において明らかに肺転移巣に一致したシグナルを認めた。
この結果は、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが血行性肺転移のモニターに用いることができることを示す。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも腎臓癌血行性肺転移の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる血行性転移癌のモニターに有用であると考えられる。Diagnosis of Metastasis in Renal Cancer Hematogenous Lung Metastasis Model Mouse A renal cancer RENCA cell lung metastasis model mouse was used to examine the diagnosis and therapeutic effect in the hematogenous lung metastasis model. The adeno-associated virus vector used was the same as that used in Example 4.
Fifty thousand RENCA cells were transplanted into the lung hemodynamically from the tail vein of Balbc nude mice (day 0).
Five days later, 1010 particles of AdTSTA / RGD-AAV-Luc were administered from the tail vein (day 5). In the control group, PBS was administered. Thereafter, observation was performed periodically (day 8, day 20, day 30) by IVIS.
The experimental schedule is shown in FIG. FIG. 13B shows the observation result (day 30) of the IVIS signal and macropathology in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-Luc. FIG. 13A shows the observation result (day 30) of the IVIS signal and macropathology in the control group.
As is clear from the IVIS image on the 30th day, a signal clearly matching the lung metastasis was recognized in the AdTSTA / RGD-AAV-Lu administration group.
This result indicates that AdTSTA / RGD-AAV-Luc can be used to monitor hematogenous lung metastases.
The model mouse used in this example is only an example of renal cancer hematogenous lung metastasis, and the adeno-associated virus vector of the present invention has the property of being efficiently incorporated into tumor tissue and expressing a gene only in tumor cells. Therefore, it is considered useful for monitoring any hematogenous metastatic cancer.
腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果の検討
実施例５で用いたＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを用い、治療効果の検討を行った。血行性に肺に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているＲＥＮＣＡ／Ｌｕｃ細胞を使用した。この場合、ＩＶＩＳシグナルはＲＥＮＣＡ／Ｌｕｃの細胞数に比例する。
細胞移植５日後に１０１０ ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを尾静脈より投与した。コントロール群ではＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＬＰを投与した。
図１４に治療スケジュールを示す。また、図１５ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１５ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図より明らかな通り、ＲＥＩＣ治療群ではｄａｙ３０でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
組織Ｔｕｎｎｅｌ（アポトーシス検知）より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例は、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣが腎臓癌血行性肺転移に対して治療効果があることを示す。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも血行性転移癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またＲＥＩＣ遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる血行性転移癌の治療に有用であると考えられる。Examination of therapeutic effect of metastatic focus in renal cancer hematogenous lung metastasis model mouse Using AdTSTA / RGD-AAV-REIC used in Example 5, the therapeutic effect was examined. RENCA / Luc cells that constitutively express the luciferase gene were used as cells that are hematogenously implanted into the lung. In this case, the IVIS signal is proportional to the number of RENCA / Luc cells.
Five days after cell transplantation, 1010 particles of AdTSTA / RGD-AAV-REIC were administered from the tail vein. In the control group, AdTSTA / RGD-AAV-ALP was administered.
FIG. 14 shows a treatment schedule. FIG. 15B shows the results of IVIS signal and tissue tunnel (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-REIC. FIG. 15A shows the result of IVIS signal and tissue tunnel (day 30) in the group administered with AdTSTA / RGD-AAV-AFP (control group).
As is apparent from the figure, the signal was almost lost at day 30 in the REIC treatment group, but the signal was clearly increased in the control group.
From the tissue Tunnel (apoptosis detection), apoptosis was considered to be a major cause of therapeutic effect. This example shows that AdTSTA / RGD-AAV-REIC has therapeutic effects on renal cancer hematogenous lung metastases.
The model mouse used in this example is merely an example of hematogenous metastatic cancer, and the adeno-associated virus vector of the present invention has a characteristic that it is efficiently incorporated into tumor tissue and expresses a gene only in tumor cells, In addition, the anti-tumor effect of the REIC gene on a wide range of tumor cells is considered useful for the treatment of all hematogenous metastatic cancers.
実施例２と同様に、各種癌細胞を用いて検討を行った。用いた癌細胞は、ＮＣＣＩＴ（精巣腫瘍細胞）、ＭＤＡ２３１（乳癌細胞）、Ａ５４９（肺癌細胞）、Ｈ２８（悪性中皮腫細胞）、ＫＰＫ１（腎臓癌細胞）、２１１Ｈ（悪性中皮腫細胞）、Ｊ８２（膀胱癌細胞）及びＡ４３１（類表皮癌細胞）であった。図１６に結果を示す。各細胞においてｈＴＥＲＴのみのルシフェラーゼ活性を１．０とした。ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡはある種の癌細胞（Ａ５４９、Ｈ２８、２１１Ｈ、Ｊ８２、Ａ４３１）ではｈＴＥＲＴプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型ＴＳＴＡ＝ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡでは全ての癌細胞でｈＴＥＲＴプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。本実施例の結果は、実施例２の結果を併せて、本発明のシステムが癌細胞全般において有用であることを示す。 As in Example 2, various cancer cells were used for examination. The cancer cells used were NCCIT (testicular tumor cells), MDA231 (breast cancer cells), A549 (lung cancer cells), H28 (malignant mesothelioma cells), KPK1 (kidney cancer cells), 211H (malignant mesothelioma cells), J82 (bladder cancer cells) and A431 (epidermoid carcinoma cells). FIG. 16 shows the result. The luciferase activity of only hTERT was set to 1.0 in each cell. hTERT + TSTA sometimes had lower transcriptional activity than the hTERT promoter in certain cancer cells (A549, H28, 211H, J82, A431), but improved TSTA = hTERT + adTSTA compared to the hTERT promoter alone in all cancer cells Transcriptional activity increased. The results of this example, combined with the results of Example 2, indicate that the system of the present invention is useful in general cancer cells.
実施例に示すように、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムは、従来のＴＳＴＡシステムに比べ飛躍的に特異的プロモーター活性を上昇させ、特定の組織や細胞での所定の標的遺伝子の発現を増大させる。標的遺伝子として、疾患の検出や治療に用い得る遺伝子を用いることにより、優れた検出、治療システムとして利用することができる。また、上記改良型ＴＳＴＡシステムを組込み外殻に標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞を強く指向し、該組織、細胞に到達し、該組織細胞中での特異的プロモーターの活性が上昇し、所定の標的遺伝子の発現を増大させる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、疾患の検出用又は治療用ウイルス製剤として用いることができる。
従来のＴＳＴＡシステムを用いたプラスミドでの癌治療の検討や癌治療例は散見されるがウイルスベクターでの成功例は少なく（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓなどで若干例）、アデノ随伴ウイルスでの成功例は世界発である。As shown in the Examples, the improved TSTA system of the present invention dramatically increases the specific promoter activity as compared with the conventional TSTA system, and increases the expression of a predetermined target gene in a specific tissue or cell. By using a gene that can be used for disease detection and treatment as a target gene, it can be used as an excellent detection and treatment system. In addition, the adeno-associated virus vector in which the improved TSTA system is incorporated and a target-specific peptide is inserted into the outer shell is strongly directed to a specific tissue or cell, reaches the tissue or cell, and is specific in the tissue cell. Promoter activity is increased, increasing the expression of a given target gene. The adeno-associated virus vector of the present invention can be used as a virus preparation for detecting or treating a disease.
Examination of cancer treatment with plasmids using the conventional TSTA system and cases of cancer treatment are occasionally seen, but there are few successful cases with viral vectors (several cases with lentivirus, HSV, adenovirus, etc.), and successful cases with adeno-associated virus. Is from the world.
配列番号１〜２０及び２２〜５１ 合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
SEQ ID NOs: 1-20 and 22-51 Synthesis All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
[Sequence Listing]
Claims (14)
(ii) ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii) VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA、
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAをhTERTプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記hTERTプロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。 (i) DNA encoding the GAL4 DNA binding domain,
(ii) DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) into which DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) is inserted;
(iii) DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16,
(I), (ii) and (iii) in this order, the DNA of (ii) sandwiched between the DNAs of (i) and (iii) and fused to the downstream of the hTERT promoter. 1 is an expression cassette that is a fusion protein of GAL4 DNA-binding domain (GAL4 DBD) and glucocorticoid receptor (GR) inserted with polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) and transcription activation domain A first expression cassette capable of expressing a transcription factor, and a second expression cassette responsive to the transcription factor and linked to a target gene downstream of an inducible promoter (GAL4 / TATA) containing a GAL4 binding site A system for increasing the transcriptional activity of the hTERT promoter.
１〜３のいずれか１項に記載のシステム。 The system according to any one of claims 1 to 3, wherein the target gene is a reporter gene or a therapeutic gene that can be used for treatment of a disease.
(ii) ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii) VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAからなる転写因子をコードするDNA配列をhTERTプロモーターの下流に連結した構造を有するDNA構築物。 (i) DNA encoding the GAL4 DNA binding domain,
(ii) DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) into which DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) is inserted;
(iii) DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16
A DNA sequence encoding a transcription factor comprising DNA fused in the order of (i), (ii) and (iii), wherein the DNA of (ii) is sandwiched between the DNAs of (i) and (iii) A DNA construct having a structure in which is linked to the downstream of the hTERT promoter.
(ii) ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii) VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA、
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAをhTERTプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを前記hTERTプロモーターが活性である細胞に導入することにより、hTERTプロモーターの活性をin vitroで上昇させる方法。 (i) DNA encoding the GAL4 DNA binding domain,
(ii) DNA encoding a glucocorticoid receptor (GR) into which DNA encoding polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) is inserted;
(iii) DNA encoding the transcriptional activation domain of VP16,
(I), (ii) and (iii) in this order, the DNA of (ii) sandwiched between the DNAs of (i) and (iii) and fused to the downstream of the hTERT promoter. 1 is an expression cassette that is a fusion protein of GAL4 DNA-binding domain (GAL4 DBD) and glucocorticoid receptor (GR) inserted with polyglutamine (Poly Q) or polyproline (PolyP) and transcription activation domain the first expression cassette capable of expressing a transcription factor, and is responsive to the transcription factor, the second expression cassette linked to a target gene downstream of an inducible promoter (GAL4 / TATA) containing GAL4 binding sites A method of increasing the activity of the hTERT promoter in vitro by introducing it into a cell in which the hTERT promoter is active.
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