JP5726729B2

JP5726729B2 - Ｈｉｖ−１感染のヒト補因子のゲノムワイド目視同定

Info

Publication number: JP5726729B2
Application number: JP2011515210A
Authority: JP
Inventors: エマンス，ニール; ジェノヴェジオ，オーギュスト; ヴィンディシュ，マルク・ペー; クォン，ヨン・ジュン; チョン，ソンヨン; キム，ヒ・チョル; キム，ナミョル; ヨン，チェ・ソ; ネバス，ウルフ
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur Korea
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur Korea
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: AU2009262492B2; US20110183313A1; JP2011525364A; WO2009156162A3; EP2307568A2; KR20110065425A; AU2009262492A8; WO2009156162A2; CN102131939B; CA2729133C; AU2009262492A1; CA2729133A1; KR101517556B1; CN102131939A; EP2307568B1; WO2009156162A8

Description

本発明は、ＨＩＶ感染の初期段階に関与するヒト宿主因子の同定に関する。さらに、本発明は、ＨＩＶ感染の機序の解明のための、薬物ターゲットとしての、およびＨＩＶの処置に有用な化合物を同定するための、同定された遺伝子の使用に関する。

発明の背景
慢性疾病および感染の大半は、細胞の組込みレベルで顕現する。生細胞イメージングによる疾病進行の検査は、分子的な疾病機序および遺伝子変化に対するその応答の可視化と共に、高度の解像を可能とする。このタイプのアプローチは個々の実験においては非常に成功を収めたが、体系的なゲノムワイド解析に対しては概して困難なままであった。

進化の間にＨＩＶはその生活環の大部分をヒト宿主因子に下請けに出すことを学んだ。ここ十年間で、いくつかのこのような宿主因子が、複数のアプローチを通して同定された（概説については^１を参照）。宿主因子の同定におけるアプローチの殆どが体系的なものではなく、これまでどれも網羅的ではなかった。しかしながら、宿主因子を入手できることは、ＨＩＶ生活環の完全理解にとって重要なだけではない。ウイルス宿主因子を採掘するための効果的な方法はさらに、ＨＩＶサブタイプの互いに対するまたはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）に対する因子特異性の比較を可能とし、これにより感染の顕現における重要な機序および可能性ある治療ターゲットが指摘される。

本発明の目的は、ＨＩＶ感染の機序の解明において使用するための、薬物ターゲットとしての、およびＨＩＶの処置に有用な化合物を同定するための、ＨＩＶ感染の初期段階に関与するヒト宿主因子を同定することであった。

発明の記載
本発明の目的は、配列番号４６によって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列によって解決され、前記部分配列は、
ａ）ＨＩＶ感染の機序の解明において；
ｂ）薬物ターゲットとして；または
ｃ）ＨＩＶの処置に有用な化合物の同定において
使用するための少なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む。

本発明の目的はまた、配列番号１もしくは配列番号２によって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列によって解決され、前記部分配列は、
ａ）ＨＩＶ感染の機序の解明において；
ｂ）薬物ターゲットとして；または
ｃ）ＨＩＶの処置に有用な化合物の同定において
使用するための少なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む。

本発明の目的はまた、配列番号５によって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列によって解決され、前記部分配列は、
ａ）ＨＩＶ感染の機序の解明において；
ｂ）薬物ターゲットとして；または
ｃ）ＨＩＶの処置に有用な化合物の同定において
使用するための少なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む。

本発明の目的はまた、配列番号３〜４および６〜４５のいずれかによって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列によって解決され、前記部分配列は、
ａ）ＨＩＶ感染の機序の解明において；
ｂ）薬物ターゲットとして；または
ｃ）ＨＩＶの処置に有用な化合物の同定において
使用するための少なくとも２０個連続したヌクレオチドを含む。

本明細書において使用した用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指すことを意味する。

本明細書において使用した用語「前記核酸または前記部分配列に対して相補的な配列」はまた、対応する（相補的な）ＲＮＡ配列または部分配列を指す。

前記部分配列の２０個連続したヌクレオチドの最短長によりその特異性が確保される。好ましい態様において、前記部分配列は少なくとも２１個、さらにより好ましい態様において少なくとも２２個の連続したヌクレオチドを含む。

本明細書において使用した用語「薬物」は、ＨＩＶの処置に適した薬学的製剤を指すことを意味する。

（ａ）ターゲットタンパク質への結合、（ｂ）ターゲットタンパク質の活性、または（ｃ）ターゲットタンパク質の発現を阻害する化合物の初めての同定は、実験的に達成できるか、またはターゲットに関する入手可能な情報に基づき得る。（ａ）および（ｂ）を阻害する化合物は、タンパク質レベルで活性である。（ｃ）を阻害する化合物は、前記タンパク質をコードするかまたは調節機能を有する核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）に指向される。化合物がタンパク質に結合する能力は、競合的および非競合的結合アッセイなどの技術を使用して決定することができる。このようなアッセイは、例えば、標識化合物（直接的な測定）またはそれぞれの化合物に結合する検出可能な試薬（間接的な測定）を使用して実施することができる。同定されたターゲットタンパク質のコード核酸配列（例えば、配列番号１〜４６、好ましくは配列番号４６、１〜２または５によって示される遺伝子／核酸）は、核酸にハイブリダイゼーションできる化合物のためのターゲットを提供する。このような化合物の例は、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸を含む。

好ましくは、配列番号１〜４６のいずれか、好ましくは配列番号４６、１〜２または５によって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列を（前記部分配列は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む）、薬物ターゲットとして、またはＷＯ２００８/０３４６２２^２８に概略が示された方法によるＨＩＶの処置に有用な化合物の同定において使用する。

好ましくは、ターゲットタンパク質候補（配列番号１〜４６のいずれか、好ましくは配列番号４６、１〜２または５によってコードされるタンパク質）のための小分子モデュレーター（これもまたＨＩＶの処置において有用な化合物を示す）を同定するための方法は、以下のステップを含む：
− 第一細胞が小分子モデュレーターに曝されるとシグナルを発生することのできるタイプの第一細胞を提供する、ここで、前記シグナルは、空間的に解像でき、場合により好ましくは顕微鏡によって定量できるシグナルである、
− 前記第一細胞を小分子モデュレーターに曝し、そして前記小分子モデュレーターに対する応答として前記第一細胞によって発生した第一シグナルを空間的に解像し、場合により定量する、
− 前記第一細胞と同じタイプの第二細胞を提供する、
− 以下のステップを実施する：
− マーカータンパク質をコードする第一核酸をベクターに導入する、
− 前記ターゲットタンパク質候補（その発現を検出および／または定量しようとしている）をコードする第二核酸を、前記第一核酸および第二核酸が作動可能に連結されるように、前記マーカータンパク質の発現が前記ターゲットタンパク質候補の発現の指標となるように、前記ベクターに導入する、
− 前記ベクターを前記第二細胞に導入する、
− 前記マーカータンパク質の発現を検出および／または定量する、
− 前記マーカータンパク質の前記発現を、前記ターゲットタンパク質候補の発現と関連させ、これにより前記ターゲットタンパク質候補の発現を検出および／または定量する、
− 前記第二細胞において上記ステップを実施している間、前記ベクターを前記第二細胞に導入した後、前記第二細胞を前記小分子モデュレーターに曝し、そして前記小分子モデュレーターに対する応答として前記第二細胞によって発生した第二シグナルを空間的に解像し、場合により定量する、
− 前記第一シグナルを前記第二シグナルと比較し、そして、前記第一シグナルと前記第二シグナルとの間に差異が存在すれば、前記差異を、前記第二細胞における前記ターゲットタンパク質候補の発現の結果とし、これにより前記小分子モデュレーターのターゲットタンパク質として前記ターゲットタンパク質候補を同定する。

好ましくは、前記第一細胞および前記第一細胞と同じタイプの前記第二細胞は、ＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞（ＬＴＲ＝末端反復配列）である。

好ましくは、配列番号１〜４６のいずれか、好ましくは配列番号４６、１〜２または５によって示される配列を有する核酸、またはその部分配列、または前記核酸もしくは前記部分配列に対して相補的な配列を（前記部分配列は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む）、プロテオミクス相互作用マップ、プルダウン実験（すなわちＡＰ／ＭＳ）、マイクロアレイ解析、およびコンピューターモデリング^２９を含むがこれらに限定されるわけではないネットワークまたはシステム生物学の分野の標準的な方法を使用することによってＨＩＶ感染の機序の解明に使用する。

配列番号１〜４６を表２に列挙する。

本発明者らは、ゲノムワイドＲＮＡ干渉、高密度細胞マイクロアレイ、共焦点イメージングおよび画像解析の組合せを通じて、ＨＩＶ感染の初期段階に関与するこれまで知られていなかったヒト宿主因子を同定した。彼らは、７つの光学によるゲノムワイド解析において分類指標としてＨＩＶレセプター分子ＣＤ４を使用して、ＨＩＶ−１が、その早期生活環を完了させるためにヒトゲノムの０.２１％、すなわち４４個の宿主遺伝子を使用することを示した。視覚画像の高度な情報内容と、アレイをベースとしたゲノムワイドスクリーンの迅速な再現性とを組み合わせることによって、本発明のアプローチは、高い信頼性でもってＨＩＶ−１宿主因子の同定を可能とした。

本発明者らは、細胞レベルでＨＩＶ／疾病の病気発生に関与する遺伝子を直接的に同定するために、ゲノムワイド光学ＲＮＡ干渉アプローチを開発した。それは、定量的なイメージングツール^２を使用した、生細胞内の経路および病原体の活性の自動解析として設計された。ウイルスベクターにおける小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および小分子ヘアピンＲＮＡのゲノムワイドライブラリーが、マイクロタイタープレートにおいて１遺伝子あたり１ウェルのレベルの低い解像度でスクリーニングされた^３。これを高解像度イメージングに進展させることは非常に挑戦しがいがあることが証明された。細胞マイクロアレイは、細胞事象をイメージングするための代替的で万能な解決法である^４，５。細胞をリバーストランスフェクションするｓｉＲＮＡ、ウイルス粒子または化合物をプリントされたスポットアレイ上に重ねられた細胞単層は^４〜１０、面倒なロボットスクリーニングの代替法を提供する^{４，７，８，１０〜１２}。本発明者らはこれらの利点を利用し、細胞マイクロアレイを使用してＨＩＶ感染をスクリーニングした。

図１は、細胞マイクロアレイを使用してゲノムから単一細胞までのＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞におけるＨＩＶ感染の自動ゲノムワイドスクリーニングを示す：７つの細胞マイクロアレイに４８時間細胞を重層し、固定し、そして核染色して、その後、３色自動ポイントスキャン共焦点イメージングを行なった。パネルＡは、７８％（２１，１２７）のゲノム特異的ｓｉＲＮＡおよび２２％（６０８９）の対照を含む７つのスライド（計２７，２１６スポット）上における単一ゲノムワイドスクリーンの画像を示す。パネルＢは、スクリーンからの単一のアレイ（３，８８８スポット）を示す。パネルＣは、単一アレイからの１８個のスポットを示し、アレイからの３個のスポットは中心のスポットがＣＤ４、上はＴＲＩＭ５０Ｂ、下はＦＬＪ４３３７４ｓｉＲＮＡを含んでいた。パネルＤはスポット画像を示し、Ｅは核染色、ＦはＨＩＶ感染により誘導されたＧＦＰ発現、そして、Ｇはスポット中心におけるＣＤ４ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞および前記スポットと境を接する感染対照細胞を強調するアレイからの単一スポットを示す。核を２.５μM Ｄｒａｑ５（ブルー）で染色した。スケールバー、上および中心のパネル１０mm、下のパネル１００μm。図２は、大きな高解像度の細胞マイクロアレイの画像解析を要約する：Ａは、画像境界（黒線）に対して、全アレイの傾斜、欠落しているスポットおよびｓｉＲＮＡスポットの位置（灰色のドット）でのスポットのばらつきを示す、実際のアレイ収集図を示す。Ｂは、画像境界を横切っている１画像あたり複数のスポットを含む実際の場合と比較した、１画像あたり１つのスポット（上パネル）を含む仮想の場合を示す。Ｃは、小型アレイにフィットさせるためのｓｉＲＮＡのアノテーション付けされたノード（計３，８８８個のノード）のフレキシブルなアレイグリッドモデルを示す。Ｄ〜Ｆ：フレキシブルなグリッド機能は、ノードを、そのすぐ隣との関係だけに制約し、ここで、Ｄ）２つの隣接するノード間において９０°の角度、Ｅ）予め決定されたスポット間隔（ｄ）、およびＦ）コンピューター計算された湾曲マップ上の最小値が好ましい。Ｇは、モデルを用いた小型アレイのアノテーションを示す。Ｈは、小型へのフィットから得られた座標を使用して隣接する高解像度画像から作成された高解像度複合スポット画像を示す。Ｉは、欠落しているスポットの検出および赤いｓｉＲＮＡスポット画像上へのグリッドの重層（挿入図）を示すフィットされた大きなアレイを示す。図３Ａは、白い四角において自動的に検出されたスポット領域を用いてのＣＤ４ｓｉＲＮＡスポット画像を示す。Ｂは、細胞中心の数、核輝度、ＧＦＰ輝度、細胞間の連結の最小輝度（連結の数値は、この連結の最小輝度である）、細胞の輝度間の距離、および全ＧＦＰ（計１５個の記述子）と共にそのそれぞれの標準偏差を読み出すために、スポット領域の内部および外部において細胞中心を検出するＣＤ４ｓｉＲＮＡスポット画像解析を示す。Ｃは、白い四角において検出されたスポット領域を用いてのスクランブルされたｓｉＲＮＡスポット画像を示す。Ｄは、スクランブルされたｓｉＲＮＡスポット画像解析を示す。Ｅは、今は１５次元ベクトルに減少させた１つの実験（＝１つのスポット）を示す。１つのアレイは、３，８８８個のスポット（１０８×３６グリッド）を含む。従って、各々の結果の次元を２次元グレイレベル写真として示すことができ、１ピクセルは１実験を示す。各ピクセル値は、測定された次元に相当する。第一縦列：単一アレイの３，８８８個のスポット上で測定された１５個の記述子。上から下へと：cellNumber、linkMinGFPAvg、linkMinGFPSdtdev、linkLengthAvg、linkLengthSdtdev、inTotalGFP、inIntNucleiAvg、inIntNucleiSdtdev、inIntGFPAvg、inIntGFPSdtdev、outTotalGFP、outIntNucleiAvg、outIntNucleiSdtdev、outIntGFPAvg、outIntGFPSdtdev。第二の縦列：正規化された同じ測定。こうした正規化された相対値は、ローカルヒットを保存しつつ、空間的なアレイの歪みに対してはるかにより堅固である。図４Ａは、分布間で最も際立った２次元空間上に投影された１５次元測定ＣＤ４およびＳＣＲＡＭＢＬＥＤクラウドを示す。２つのクラスを区別できることが明らかに分かる。Ｂは、この同じ視野への１９０，５１０個の実験（７×７アレイ）の投影を示し、そしてＣは、１５変数の結果に基づいた分類を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ：横：正準軸１、縦：正準軸２、カラー：クラス、輝度値：それぞれのクラス中心までの１５次元マハラノビス距離（９頁参照）。Ｄは、正準平面上での数値の生起を示すヒストグラムを示す（Ｚ軸：最も高い生起値は２５２である）。ＣＤ４クラスに該当する実験は緑色で標識され、そして全ての実験のほんの一部を示す（０．８％）。Ｅは、全実験の本体と比較して１より低い密度比を有するものであるＣＤ４クラスの実験間で選択されたヒットを示すグラフである。従って、ＣＤ４クラスの外よりも内に、比例的により多くの同遺伝子の実験が存在する。この比は迅速に０．１よりも下に下降し、これは４４ヒットの大半の密度がＣＤ４クラスの外よりも内において少なくとも１０倍高いことを示すことを注記されたい。Ｆは、ｓｉＲＮＡ実験の代表例を示す。図５は、指定されたｓｉＲＮＡを用いて２４時間かけてトランスフェクションし、その後、ＨＩＶ−ＩＩＩＢで感染させたＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞の結果を要約する。４８時間後、固定した細胞をＰ２４抗体で染色した。Ａは、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＪＭＹ、ＭＥＤ２８およびＣＤ４（陽性対照）の消失を伴うＨＩＶ感染の遮断を示す。ＧＦＰ（緑色）およびＰ２４（赤色）をＨＩＶ感染の指標として使用した。核（青色）をＤｒａＱ５で染色した。マージは、核（青色）、ＧＦＰ（緑色）およびＨＩＶＰ２４（赤色）を合わせた画像を示す。スケールバーは２０μmである。Ｂは、ＧＦＰ輝度／ピクセル／細胞に基づいたＧＦＰ発現の量を示す。Ｃは、Ｐ２４輝度／ピクセル／細胞に基づいたＰ２４発現の量を示す。Ｄは、個々のｓｉＲＮＡによるＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＭＥＤ２８およびＪＭＹｍＲＮＡ減少を示す。細胞を、指定したｓｉＲＮＡを用いて７２時間かけてトランスフェクションし、その後、ｃＤＮＡを調製し、そしてＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＭＥＤ２８およびＪＭＹｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。図６Ａにおいて、ジャーカット細胞を指定したｓｉＲＮＡを用いて７２時間かけてトランスフェクションし、その後、ＨＩＶ−１であるＩＩＩＢウイルス株（ＭＯＩ：０．１）で感染させた。９６時間後、Ｐ２４抗原を細胞培養上清中においてｐ２４ＥＬＩＡＳによって測定した。Ｂにおいて、ジャーカット細胞を指定したｓｉＲＮＡを用いて７２時間かけてトランスフェクションし、その後、ＩＩＩＢウイルス株であるＨＩＶ−１（ＭＯＩ：０．０５）で感染させた。９６時間後、Ｐ２４抗原を細胞培養上清中においてｐ２４ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃは、個々のＡｃｅｌｌｓｉＲＮＡによるＲＮＡＳＥＨ２ＡｍＲＮＡ減少を示す。ジャーカット細胞を指定したｓｉＲＮＡを用いて９６時間かけてトランスフェクションし、その後、ｃＤＮＡを調製し、そしてＲＮＡＳＥＨ２ＡｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したＲＮＡＳＥＨ２Ａノックダウンの量を示す。ＣＤ４クラスにおいてその過剰な提示を実証した０．１より低い比を示した４４個の遺伝子を同定した（表１）。４４個の遺伝子の中で３６個が、ＨＩＶ感染へのその関与について新規であるとして同定された（表２）。

実施例
共焦点イメージングを可能とし、そしてｓｉＲＮＡスポット位置およびイメージングについての機械的精度へのあらゆる依存を除外して、最小限の数のアレイにおいてヒトゲノムを網羅するような細胞マイクロアレイを作製した^７。２４×６０mmの光学ガラスウェーハ上にプリントされたアレイを、ハイスループットコンタクトプリンターを使用して大量に作製した。個々にバーコードのついたアレイは、縦列１０８×横列３６において５００μmのピッチで３００μmの直径のスポットとして３，８８８個のｓｉＲＮＡを含んだ。ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション試薬およびゼラチン^{７〜９、１２、１３}および赤色蛍光ｓｉＲＮＡを含む混合物中に封入された。赤色蛍光ｓｉＲＮＡは光学的に同定可能で個々にアドレス可能なスポットを与え、そして全アレイを細胞重層後に可視化することができた（図１）。リバーストランスフェクションを、乾燥から１〜２１日後に測定した。５日間より長い日数の間乾燥させたアレイを使用して、細胞の６０％近くがトランスフェクションされ、そしてＧＦＰノックダウンは、ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞株のトランスフェクションから４８時間後において７０％を超えていた。内因性タンパク質発現サイレンシングは、ｐ６５またはエクスポーチン１（ＸＰＯ１／ＣＲＭ＿１）の間接的な免疫標識および固定アレイの共焦点イメージングを使用して、トランスフェクションから４８時間後に６０％を超えていた。スポット同士のコンタミは最小限であり、サイレンシングは、ＧＦＰｓｉＲＮＡスポットからの距離に関係なく全ての隣接するスポットにおいて低かった（５％未満）。

ＨＩＶ感染アッセイは、ＨｅＬａＬＴＲ−ＧＦＰ細胞の２８時間のリバーストランスフェクションと、その後のＨＩＶ−１（ＭＯＩ＝０．１４）を用いての４８時間の感染を含んでいた。ＨＩＶ感染は、安定に組み込まれたＧＦＰのＴＡＴ駆動発現を可能とし、従って、ウイルス感染において早期のステップを再現した^１４。これらの条件下で、ＨＩＶ感染は、ＣＤ４ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞において有意に抑制された（図１）。

封入混合物中の、対照ｓｉＲＮＡを含む２１，１２７個の独特なヒト遺伝子の各々をターゲティングする４つの独特なｓｉＲＮＡ二本鎖に対応する８４，５０８個のｓｉＲＮＡの集合をプリントした。各アレイは６４８個の対照を含む３，８８８個のスポットを含み、そして全ヒトゲノムは７個のスライドで網羅された（図１Ａ）。アレイを、倒立自動ポイントスキャン共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。それは、ゲノムの７分の１を網羅するアレイに対して約１０ギガバイトの画像情報に等価である（１ゲノムあたり７０ギガバイト）、１，８２０８００μmの側面の３色１６ビット画像で完全なアレイを獲得した。ほぼ２０万個の個々の実験および半テラバイトのイメージングデータを包含する、合計で７個のゲノム（７×７アレイ＝４９アレイ）を獲得した。

ＨＩＶ感染についての１回の光学ゲノムワイド解析が図１に示されている。それは、ヒトゲノムｓｉＲＮＡライブラリーを含む７つのアレイから（図１Ａ）単一のアレイまでに（図１Ｂ）、そして系統的にそのアレイから、ＣＤ４サイレンシング後にＨＩＶ感染が抑制された単一スポットまでにおよぶ（図１Ｃ〜Ｇ）。画像解像度は、ハイコンテントな形態学的および表現型的解析には適しているが^１５、しかしながらアレイ画像データセットのサイズおよびトポロジーは新たな画像解析解決法を必要とした。

最初の画像解析の目標は、アレイ上のスポットを同定しアノテーションを付けることであった。ここでは、プリントされたアレイとｓｉＲＮＡアノテーションと画像配列との間には関係は全くない（図２Ａ）。さらに、画像の量は重要である（３色で１つのアレイに対して５，４６０）。単一アレイ画像は、２０倍の解像度で４つまでのスポットを含み（しばしば隣接する画像と共有する）（図２Ｂ）、スポット身元に関する内在的情報は全くない。アレイプリンティングにおける固有の機械的および配置的不正確さは、全体として傾きそしてＸＹが置換されたアレイを作製し、そして相対的な横列／縦列の間隔、スポットの配置およびアラインメントにおいてスポット間のばらつきがあった（図２Ａ）。重要なことには、アレイの圧縮されていない画像はとても大きいので、１つの連続的な画像へと集合させられると、画像を処理力の限界のために見ることができないかまたは操作することができない。専用ソフトウェアは自動的に個々の画像を収集し、そしてサーバー上に保存された高解像度の画像の空間的な情報を保持している圧縮された小型モザイクを創造した。この画像は、元のものと比較して２，５００倍圧縮されていた（４Ｍｂ対１０Ｇｂ）。アレイのフィッティングには小型画像を使用して、そのｓｉＲＮＡ身元を用いてスポットをアノテーション付けした。それは３，８８８のｘ−ｙ変数の関数を最小限にすることによって達成された（３，８８８個のスポット位置）。これは２つの制約を使用した：第一は、フレキシブルなグリッドが元のグリッドモデルからひどく歪んだ場合に高い値を示したフレキシブルなアノテーション付きのグリッドモデル（モデル制約）であった。これは、隣接するノード（図２Ｄ）と公知のスポット間距離（図２Ｅ）との間の角度を制御することによって達成され、そして値はこれらの歪みと共に次第に増加した。第二の制約は、小型の変換であり（画像制約）、スポットの中心が近付くにつれて値は減少した。これは、小型の湾曲マップをコンピューター計算することによって達成された（図２Ｆ）。アルゴリズムは大雑把な近似を規定し、その後、前記の関数を最小化して、グリッドモデルのノードを、小型のスポットにフィットさせた（図２Ｇ）。その後、各スポットをｓｉＲＮＡ身元を用いてアノテーション付けし、そして、フィッティングによって決定したスポット位置の逆変換を使用して、データーベースからの生１６ビット画像からリアルタイムで復元した（図２Ｈ）。その後、スポットのこれらの高解像度画像を画像解析に使用した（図２Ｉ）。

７個の完全ヒトゲノム、すなわち合計で４９個のｓｉＲＮＡアレイを２８時間培養して、宿主遺伝子サイレンシングを可能にした。アレイを、感染効率０．１４の生ＨＩＶ−１を用いて３時間かけて感染させ、洗浄し、そしてイメージング前に４５時間インキュベーションした。一旦グリッドがフィッティングされ、各スポットの身元が読み出されると、ＨＩＶ感染を、以下の画像およびデータ解析戦略を使用して各スポット上で独立して解析した。ＧＦＰ蛍光の測定だけでは、細胞形状、密度および細胞間の融合に関する情報は全く得られないだろう。より重要なことには、合胞体形成中のＧＦＰシグナルの希釈は、ＧＦＰ産生の抑制からは容易に識別されることができない。本発明者らは、これに対処するために、１５個の記述子を読み出したアルゴリズムを開発した。

本発明者らは、ＨＩＶ感染を定量化することができるように、ｓｉＲＮＡスポット内および前記スポット周辺の境界において細胞を測定した。これは、予測されたスポットの次元が与えられれば最善の可能なスポット位置（図３Ａ、白い四角）を規定する、スポットより大きな画像内のピクセルを無作為に測定するアルゴリズムを使用して達成された。核中心を、画像中の染色された蛍光核を大雑把にモデリングした２次元ガウス形状の鋳型マッチングによって検出した。ＧＦＰおよび核染色を、こうした核中心上に位置する小さなディスク上で測定した。この測定は、バックグラウンドまたは細胞形状の変動に対して堅固であった。合胞体の形成および細胞の分散度を測定するために、ドロネー三角形分割^１６を全核中心のセットからコンピューター計算して、独特な隣接マップを確立した。各々の独特な核：核連結に対するＧＦＰの最小値が読みだされ、そしてドロネー三角形分割はボロノイ図を与え^１７、これを使用して高密度に詰め込まれた核を分離した。アルゴリズムは、１５０ミリ秒以内に各実験／スポットに対して１５次元ベクトルを与えた(cellNumber, linkMinGFPAvg, linkMinGFPSdtdev, linkLengthAvg, linkLengthSdtdev, inTotalGFP, inIntNucleiAvg, inIntNucleiSdtdev, inIntGFPAvg, inIntGFPSdtdev, outTotalGFP, outIntNucleiAvg, outIntNucleiSdtdev, outIntGFPAvg, outIntGFPSdtdev)。図３Ｂは、アルゴリズムをＣＤ４スポットおよびＳＣＲＡＭＢＬＥＤスポットに適用した光学の結果を示す。

細胞培養にはばらつきがあるので、感染の測定をアレイ間で正規化した。アレイは、その表面にわたって不完全な細胞密度に因る空間的変動の頻度が少ない大きな実験である。完全な単一アレイに対する結果のベクトルの各次元を示すアレイ画像を図４Ａに示す。３個のスポットの半径サイズを有するメジアンフィルター（対照クラス間の分離を最大限にする半径として定義、以下参照）を使用して、結果のアレイをフィルターにかけた。この正規化は、７個のゲノムにおよぶ全ての測定に対して同程度の相対値を与えた。

本発明者らの目的は、初期段階ＨＩＶ感染の抑制において対照ＣＤ４と同じくらい強力な遺伝子を同定することであった。従って、彼らは、２１５個の個々のＣＤ４および３８９６個のＳＣＲＡＭＢＬＥＤ実験の２つの対照分布から２つのクラスの分類指標を構築した。それらは両方共１５変数のガウス分布であるため、彼らは単純で堅固な分類指標を設定し、そして図４Ｂ〜Ｅで示したように最も際立った投影をコンピューターで算出した。本発明者らは、全ての１９０，５１０個のデータポイントについてＣＤ４およびＳＣＲＡＭＢＬＥＤクラスに対して１５次元マハラノビス距離をコンピューターで算出した。マハラノビス距離は、１９３６年にＰ．Ｃ．マハラノビスによって導入された距離尺度である。それは変数間の相関に基づいており、これにより異なるパターンを同定し解析することができる。データセットの相関を考慮に入れているという点でそれはユークリッド距離とは異なる。本発明者らは、ＳＣＲＡＭＢＬＥＤよりもＣＤ４により近く、少なくとも０．９９であると選択されたゲーティング確率に対応するとしてカイ二乗（１５の自由度を有する）から決定された所定のｇの平方根より劣るＣＤ４クラス中心までの距離を同時に有する、ポイントのみを選択した（ポイントは、不正な形式の関連していないがそれにも関わらずＳＣＲＡＭＢＬＥＤよりもＣＤ４に近い実験を除外した、０．９９の確率を有するＣＤ４クラスでなければならない）。これは、ＣＤ４と潜在的に類似しているとして１６８０個の実験（０．８％）を同定した。本発明者らは、両方のクラスにおける実験密度に基づいてスコア比をコンピューターで算出した。各遺伝子について、ＣＤ４クラスの内側と外側の実験の比率間の比をコンピューターで算出した。スコアが１より低い全ての遺伝子がＣＤ４クラスにおいて異常に高い提示を有すると考えられ、スコアが低いほどその提示は強くなった。例えば、ＣＤ４は０．０４３の値を有し、これは、ＣＤ４クラス内の方が外よりも２３倍（１／０．０４３）濃いことを意味する。ＣＤ４クラスにおいてその過剰な提示を実証した０．１より低い比を示した４４個の遺伝子を同定した（表１、図４）。０．１より低いスコアは、ＣＤ４クラスの外よりも内の方が少なくとも１０倍高い密度を意味する（図４）。

これらの４４個の遺伝子の中で３６個が、ＨＩＶ感染へのその関与について新規であるとして同定された（表２参照）。残りの８個の遺伝子は以前に、直接的にまたは間接的に、ＨＩＶ感染に関与していることが示されている。近年、Brass et al.^１８による機能的ゲノムスクリーンにより、ＨＩＶ感染に必要とされるタンパク質をコードするいくつかの宿主遺伝子の３つとしてＭＥＤ２８、ＣＳＰＰ１およびＥＲＰ２７が判明した。これより前に、ＭＥＤ２８（マギシン）は、公知のＨＩＶ相互作用相手であるＦＹＮ^１９の相互作用相手としてすでに同定されていた。Ｋｕ７０は、レトロウイルス複製中間体および組込み前複合体とのその相互作用に因り、レトロウイルス感染の初期段階の周知のメディエーターである^２０。ＰＫＮ１（Ｐａｋ１としても知られる）は、ＨＩＶ補助因子Ｎｅｆと相互作用することが示され、そしてＰＫＮ１の枯渇は、複数の細胞系においてＨＩＶ感染を強く阻害した^２１。ＰＴＧＩＳをターゲティングするＦＤＡ認可の薬物のフェニルブタゾンは、ヒトおよび動物の両方のための可能性ある抗ウイルス（ＨＩＶを含む）剤として特許を取得した^２２。ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１は、ＨＩＶ感染中にＨＩＶマトリックスタンパク質ｐ１７によって誘導される炎症誘発性ケモカインをコードする^{２３、２４}。さらに、ＵＮＧ２はＨＩＶウイルス粒子にパッケージングされ、そしてウイルス逆転写酵素と物理的に会合することが以前に報告されている^２５。同定された遺伝子の２０％超が、ＨＩＶ感染の公知のエフェクターであるという事実は、本明細書において提示された全体的な結果の正当性を確証する。興味深いことに、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ遺伝子の突然変異が、神経性疾患のアイカルディ・ゴーシェ症候群（ＡＧＳ）を引き起こすことが示された^２６。

スクリーニング結果の重要性を検証するために、最終的に、ＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞における候補遺伝子の枯渇が、ＣＤ４ノックダウンによって見られるものと類似した様式でＨＩＶ複製を遮断することを証明することは必須である。これを試験するために、我々は、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＭＥＤ２８およびＪＭＹを選択し、そして対照としてＣＤ４を使用した。細胞を、個々のｓｉＲＮＡを用いて２４時間かけてトランスフェクションし、そしてＨＩＶを用いて４８時間かけて感染させた。ウイルス複製を、ＧＦＰおよびＰ２４発現細胞の外見を追跡することによって測定した^１４。細胞におけるＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＭＥＤ２８およびＪＭＹノックダウンは、ＨＩＶ感染を遮断した（図５Ａ）。これらの画像の定量は、ＧＦＰ輝度およびＰ２４発現を使用して行なわれた（図５Ｂ、５Ｃ）。ＲＮＡＳＥＨ２Ａノックダウンにより、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた個体群と比較してＨＩＶ感染のほぼ８０％の減少がもたらされた（図５Ｂ、５Ｃ）。またＭＥＤ２８およびＪＭＹノックダウンにより、ＨＩＶ感染の約５０％の減少がもたらされた（図５Ｂ、５Ｃ）。我々はまた、ターゲティングされたｍＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲによってその発現を測定することによってダウンレギュレートされたことを確証した（図５Ｄ）。それ故、ＲＮＡｓｅＨ２Ａ、ＭＥＤ２８およびＪＭＹは、ＨＩＶ感染プロセスに必要である。

スクリーニング結果の重要性をさらに確証するために、ＲＮＡＳＥＨ２Ａを、ＨＩＶ感染のためのより代表的な細胞型においてノックダウンのための代表的な遺伝子として使用した。効果的な遺伝子サイレンシングのために、個々のＲＮＡＳＥＨ２Ａ１番および２番ｓｉＲＮＡをジャーカット（Ｔリンパ球）細胞にトランスフェクションした。ターゲティングされたｍＲＮＡは、定性的（図６Ｃ）および定量的（図６Ｄ）の両方の様式においてＲＴ−ＰＣＲによってその発現によりダウンレギュレートされたことが確証された。約５０％のＲＮＡＳＥＨ２Ａがサイレンスとなった。ＲＮＡＳＥＨ２ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞を、２つの異なるＭＯＩのＨＩＶを用いて感染させ、そしてウイルス複製をＰ２４ＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ａ、Ｂ）。要約すると、ＲＮＡＳＥＨ２Ａのノックダウンは、ジャーカット細胞においてＷＴＨＩＶ１ウイルスの複製を抑止する。これらの観察は、ＲＮＡＳＥＨ２ＡがＨＩＶ感染プロセスに必要とされるという以前の所見を確認する。

材料および方法
化学物質
全ての精密化学物質を、Sigma-Aldrichから購入した。ＤＲＡＱ５はBioStatus (Shepshed, UK)からであった。全てのｓｉＲＮＡ二本鎖をDharmacon (USA)から購入した。ｓｉＲＮＡライブラリーは、２１，１２７個の独特なヒト遺伝子の各々をターゲティングする、４つの独特なｓｉＲＮＡ二本鎖に対応する８４，５０８個のｓｉＲＮＡを含む、１．０nMのDharmacon siARRAY全ヒトゲノムｓｉＲＮＡライブラリー(Thermofisher, West Lafayette, CO)を含んでいた。一次抗体はSanta Cruz Biotechnologyからであり、そして全ての蛍光二次抗体はMolecular Probes/Invitrogen (Carlsbad, CA)からであった。トランスフェクション試薬は市販の供給源からであった。

細胞株および細胞培養液
ＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞(A. Boese, Institut Pasteur Korea)を、記載^１４の野生型ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）のように作製し、そしてＧＦＰ−トーシン発現ＨｅＬａ(R. Grailhe, Institut Pasteur Korea)を、１１０mg/mLのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清(Gibco, USA)および１％ペニシリンストレプトマイシン(Invitrogen; Carlsbad, USA)の補充された高グルコースグルタマックスダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen; Carlsbad, USA)中で培養した。安定な株を、選択マーカーの補充された培地中に維持した。細胞株を、リバーストランスフェクションを定量するために１２〜７２時間かけてアレイ上で培養した。ＨＩＶ感染のために、１個のアレイ（２４×６０mm）につき６５０，０００個の細胞を播種し、５％ウシ胎児血清(Gibco, USA)および１％ペニシリンストレプトマイシン(Invitrogen; Carlsbad, USA)の補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Invitrogen; Carlsbad, USA)中で２８時間培養した。細胞を、ＭＯＩ＝０．１４のＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株(Daymoon industries; Cerritos, USA)を用いて一晩かけて接種した。５％ウシ胎児血清(Gibco, USA)および１％ペニシリンストレプトマイシン(Invitrogen; Carlsbad, USA)の補充された新鮮なＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Invitrogen; Carlsbad, USA)を次の日に添加した。細胞をさらに４５時間培養し、次いで１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドのダルベッコリン酸緩衝食塩水溶液中で固定し、そして核を２．５μM Ｄｒａｑ５(BioStatus, UK)で染色し、その後イメージングした。ジャーカットクローンＥ６−1（ＡＴＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清(Gibco, USA)、１％ペニシリンストレプトマイシン(Invitrogen; Carlsbad, USA)、１mMピルビン酸ナトリウム(Gibco, USA)、１０mM ＨＥＰＥＳの補充されたＲＰＭＩ培地１６４０(Invitrogen; Carlsbad, USA)中で培養した。

マイクロアレイプリンティング
ｓｉＲＮＡトランスフェクション溶液を本質的には記載^２７のように調製し、そして、無菌ＨＥＰＡでろ過された空気を与える特注のクリーンチャンバーに封入されたステルス（stealth）ピン(telechem, USA)およびハイスループットマイクロアレイプリンター(Genomic Solutions, USA)を使用して、２２〜２５℃、５５〜６５％ＲＨでＮｏ．１カバーガラス上に３，８８８個のスポットアレイ（１０８×３６スポット）としてプリントした。アレイは、プリントから１週間後から８カ月後まで性能に有意な変化を起こすことなくデシケーター中で保存された。７個のスライドがゲノムを網羅し、そしての１６％の対照ｓｉＲＮＡスポットを含んだ。

マイクロアレイ獲得および解析
アレイを、外部データベースに直接的に書かれた１６ビットＴＩＦＦファイルとして、ポイントスキャン共焦点読取機(Imageexpress Ultra, Molecular Devices, USA)を用いて獲得した。画像を、この目的のために設計されたソフトウェアを使用して解析のためのデータベースから直接的に読み取りした。適合性のグリッドフィッティングを適用して、全アレイ中のｓｉＲＮＡスポットを同定し、スポットをフィッティングし、そしてそれらを切り取り、その後、解析、アノテーションおよび結果の転送のために画像データを抽出した。

ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、トリゾール（Trizol）法(Invitrogen, USA)によってｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａおよび／またはジャーカット細胞から単離した。ｃＤＮＡを、３７℃で６０分間、５０pmolのオリゴ（ｄＴ）プライマーおよび２０μMのｄＮＴＰ混合物の存在下、２５μlの反応混合物中、１μgの全ＲＮＡおよびＭＭＬＶ−逆転写酵素(Promega)を使用して作製した。ＰＣＲ増幅のために、特異的オリゴヌクレオチドプライマー対（各０．２pmol）を、２５μLの反応混合物中、２００ngのｃＤＮＡ、１単位のＬＡＴａｇポリメラーゼ(Takara)、１×ＬＡＰＣＲ緩衝液２（２．５mM ＭｇＣｌ_２）および１００μM ｄＮＴＰと共にインキュベーションした。使用したプライマーの配列は以下の通りである：

ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、そして７２℃で３分間を合計４０サイクルであった。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにアプライし、そして臭化エチジウムを用いて可視化した。

フォワードｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびウイルス感染
ジャーカット細胞（４０，０００個の細胞／ウェル）を、２４ウェルプレートにおいて、選択された個々のＲＮＡＳＥＨ２Ａ１番、２番またはスクランブルに対して１μMのＡｃｅｌｌｓｉＲＮＡ(Dharmacon, USA)を用いてトランスフェクションし、その後、７２時間インキュベーションした。細胞を、ＭＯＩ＝０．５、０．０１のＨＩＶ−１のＩＩＩＢウイルス株(Daymoon industries; Cerritos, USA)を用いて感染させ、そして３時間かけて接種した。ウイルス上清を除去した後、細胞を、１０％ウシ胎児血清(Gibco, USA)、１％ペニシリンストレプトマイシン(Invitrogen; Carlsbad, USA)、１mMピルビン酸ナトリウム(Gibco, USA)および１０mM ＨＥＰＥＳの補充されたＲＰＭＩ培地１６４０(Invitrogen; Carlsbad, USA)中で９６時間培養した。ウイルス複製を、Ｐ２４ＥＬＩＳＡ(Perkin-Elmer)による細胞非含有上清中でのｐ２４ＨＩＶ−１ウイルスコア抗原の検出によって決定した。

ＬＴＲ−ＧＦＰＨｅＬａ細胞（５，０００個の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートにおいて５０nMの選択されたｓｉＲＮＡ(Dharmacon, USA)を用いてトランスフェクションし、その後、２４時間インキュベーションした。細胞をＨＩＶ−１のＩＩＩＢウイルス株(Daymoon industries; Cerritos, USA)を用いて感染させ、そして３時間かけて接種した。ウイルス上清を除去した後、細胞を増殖培地中で培養した。細胞を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドのダルベッコリン酸緩衝食塩水の水溶液中で固定し、抗Ｐ２４抗体(Abcam, USA)を用いて染色し、そして２．５μM Ｄｒａｑ５(Biostatus, UK)を用いて染色し、その後、イメージングした。

Ｐ２４免疫蛍光検出
細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中で１０分間かけて固定し、その後、ＰＢＳを用いて洗浄した。透過処理のために、細胞を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液中で１０分間インキュベーションし、その後、ＰＢＳ中で洗浄した。その後、４℃で２時間、１０％ヤギ血清のＰＢＳ溶液中のマウス抗Ｐ２４抗体の１：２００希釈液と共にインキュベーションした。プレートを、軌道式回転機でＰＢＳを用いて１０分間かけて３回洗浄した。Ａｌｅｘａ５３２ヤギ抗マウス二次抗体（１：１０００）を室温で１時間かけて細胞と共にインキュベーションし、その後、細胞を軌道式撹拌機でＰＢＳを用いて１０分間かけて３回洗浄し、その後、５μMのＤｒａＱ５のＰＢＳ溶液を室温で１０分間かけて添加した。

Claims

配列番号４６によって示される配列を有する核酸によってコードされるタンパク質への結合、その活性又は発現を阻害する化合物を同定する工程を含む、ＨＩＶの治療に有用な化合物を同定するための方法。
配列番号４６によって示される配列を有する核酸によってコードされるタンパク質の活性又は発現を阻害する化合物であって、該化合物が、ｓｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸から選択される、化合物。