JP5717127B2 - Aptamers that bind to hemagglutinin, a new influenza virus - Google Patents
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Description
本発明は、新型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合能を有するアプタマーに関する。 The present invention relates to an aptamer capable of binding hemagglutinin of a new influenza virus.
インフルエンザウイルスにはＡ、Ｂ、及びＣの３つの型があり、季節性インフルエンザとして毎年流行を起こすのはＡ型とＢ型であることが知られている。このうちＡ型インフルエンザウイルスは、ウイルス表面に突出したタンパク質であるヘマグルチニン（以下HAとする）とノイラミニダーゼ（以下NAとする）の組み合わせによって多くの亜型に分類されている。HAには、H1からH16の亜型、NAにはN1からN9の亜型が存在し、この組み合わせによって、例えばH1N1、H2N2、H3N2等と表現される。 There are three types of influenza viruses, A, B, and C. It is known that types A and B cause epidemics every year as seasonal influenza. Of these, influenza A viruses are classified into many subtypes depending on the combination of hemagglutinin (hereinafter referred to as HA) and neuraminidase (hereinafter referred to as NA), which are proteins protruding from the surface of the virus. There are subtypes H1 to H16 in HA and N1 to N9 subtypes in NA, and these combinations are expressed as, for example, H1N1, H2N2, H3N2, and the like.
季節性インフルエンザウイルスとして毎年流行を繰り返しているのは、Ａ型インフルエンザウイルスのH3N2亜型（香港型）、H1N1亜型（ソ連型）とＢ型インフルエンザウイルスであるが、これらは高い死亡率を示すほどの病原性は持たない。 The influenza A virus H3N2 subtype (Hong Kong type), H1N1 subtype (Soviet type), and type B influenza viruses, which have been repeated every year as seasonal influenza viruses, show high mortality rates. Not so pathogenic.
一方、季節性のインフルエンザウイルスとは別に、近年、新型インフルエンザの世界的流行が懸念されている。新型インフルエンザは、人類がこれまで感染したことのない抗原タンパク質を持っているため、多くの人々が免疫を持たず、高い確率で感染、発症し、パンデミックを引き起こす可能性がある。
新型インフルエンザの例として、1997年に香港で発生したH5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザウイルスがあり、家禽類だけでなくヒトへと感染して死亡者をだして以来、H5N1亜型の鳥インフルエンザウイルスのヒトへの感染は現在まで続いている。また、H9N2亜型の鳥インフルエンザウイルスについても、ヒトへの感染が確認されている。今後、これらのウイルスがヒトからヒトへ容易に感染しうるウイルスへ変異する可能性もあり、その対策が急がれている。実際に、2009年にパンデミックを引き起こした、豚由来の新型インフルエンザウイルス（H1N1）は、ヒトからヒトへ感染し、その伝播力は季節性インフルエンザウイルスよりも強い。幸い病原性は高くはなかったが、将来高病原性へ変異する危険性をもっている。
On the other hand, apart from seasonal influenza viruses, in recent years there has been concern about the global pandemic of new influenza. New influenza has antigen proteins that have never been infected by humans, so many people do not have immunity and can infect, develop, and cause pandemics with high probability.
An example of a new type of influenza is the H5N1 subtype highly pathogenic avian influenza virus that originated in Hong Kong in 1997. Since the infection caused humans as well as poultry, the H5N1 subtype avian influenza Infection of viruses with humans has continued to date. In addition, H9N2 subtype avian influenza virus has been confirmed to infect humans. In the future, these viruses may be mutated into viruses that can easily infect humans, and countermeasures are urgently needed. In fact, the new swine-derived influenza virus (H1N1), which caused the pandemic in 2009, can be transmitted from person to person, and its transmission is stronger than seasonal influenza viruses. Fortunately, the pathogenicity was not high, but there is a risk of mutating to a higher pathogenicity in the future.
これらの新型インフルエンザウイルスが従来の季節性インフルエンザウイルスと大きく異なる点は、本来豚インフルエンザ、鳥インフルエンザとして、豚又は鳥というそれぞれの種内のみで流行を引き起こしていたウイルスが、種の壁を乗り越えてヒトへと感染し、ヒトとヒトとの間で感染するか、あるいは感染が懸念される点である。また、新型インフルエンザに対して免疫を持たない人類にとっては、ウイルスに暴露すると高い確率で発症することが考えられる。このような点において、新型インフルエンザウイルスは季節性インフルエンザウイルスとは大きく異なる。
また、インフルエンザウイルスにおいても、種々の型・亜型が存在して、それぞれ異なる性質を持ち、同じ亜型に属するウイルスでも株の違いによって抗原性が異なる場合もあるため、インフルエンザの予防対策や治療にとって、ウイルスの型・亜型・株の識別は非常に重要な課題である。
The major difference between these new influenza viruses and conventional seasonal influenza viruses is that viruses that caused epidemics only in swine or avian species, as swine influenza and avian influenza, overcame the species barrier. Infecting humans, humans are infected between humans, or there is concern about infection. In addition, for human beings who are not immune to the new type of influenza, it is possible to develop the disease with high probability when exposed to viruses. In this respect, the new influenza virus is very different from the seasonal influenza virus.
In addition, there are various types and subtypes of influenza viruses, each of which has different characteristics, and even viruses belonging to the same subtype may have different antigenicity depending on the strain. Therefore, identification of virus types, subtypes, and strains is a very important issue.
現在、使用されている迅速診断キットは、インフルエンザウイルスの抗原を検出するキットが主流になっているが、A型かB型かの型の識別のみである。新型かどうかを区別するには、亜型・株の識別を行う必要がある。これにはインフルエンザウイルスの遺伝子を検出するRT-PCR法を用いた診断が必要であるが、設備や手間および費用の問題から日常臨床での使用には向いていない。したがって、詳しい検査が行われないまま発見が遅れると初期の段階での封じ込めを損ない、広い範囲にわたって流行が拡大するので、常にインフルエンザウイルスの有無と共に、型、亜型、株をルーチンでチェックできるようなシステムが求められる。 Currently, rapid diagnostic kits that detect influenza virus antigens are mainly used, but only type A or type B is identified. To distinguish whether it is a new type, it is necessary to identify subtypes and strains. This requires diagnosis using the RT-PCR method to detect influenza virus genes, but is not suitable for daily clinical use due to problems in equipment, labor, and cost. Therefore, if the discovery is delayed without detailed examination, the containment at the initial stage is impaired and the epidemic spreads over a wide range, so that the type, subtype, and strain can always be checked routinely with the presence or absence of influenza virus. System is required.
一方、アプタマー、特にRNAアプタマーは複雑な３次構造をとることによって、標的化合物を高度に識別して結合することが可能である（非特許文献１）。したがって、アプタマーの高識別機能は近縁のタンパク質どうしや、あるいは微生物やウイルスの型、亜型や株どうしを識別するために大変価値のある道具として使える可能性がある。
アプタマーとは、機能性核酸のことであり、抗体と類似の機能をもつが、標的化合物として、イオンのような小さいものから、ウイルスのような巨大複合体まで対象となるので、抗体よりも利用範囲が広い。
On the other hand, aptamers, in particular RNA aptamers, can take a complex tertiary structure to highly identify and bind a target compound (Non-patent Document 1). Therefore, the high discrimination function of aptamers may be used as a very valuable tool for distinguishing closely related proteins, or types, subtypes and strains of microorganisms and viruses.
Aptamers are functional nucleic acids and have similar functions to antibodies, but target compounds can range from small ions such as ions to large complexes such as viruses. Wide range.
本発明者は、既に季節性インフルエンザであるインフルエンザＡ（H3N2）およびＢのHAタンパク質に対するアプタマーを取得しており、これらのアプタマーは他の型のHAタンパク質のみならず株の違いをも識別することを報告し、季節性インフルエンザの有無と共に型、亜型、株を迅速かつ正確に判定できる診断手法を提供することができた。さらに該インフルエンザウイルスの宿主細胞表面への結合を妨げる作用をもつことも報告している。（非特許文献２，３）（特許文献１）。 The present inventor has already acquired aptamers to the influenza A (H3N2) and B HA proteins, which are seasonal influenza, and these aptamers identify not only other types of HA proteins but also strain differences. We were able to provide a diagnostic method that can quickly and accurately determine the type, subtype, and strain along with the presence or absence of seasonal influenza. Furthermore, it has also been reported that it has an effect of preventing the binding of the influenza virus to the host cell surface. (Non-patent Documents 2 and 3) (Patent Document 1).
したがって、新型インフルエンザに対しても、同様の迅速かつ正確な診断手法を提供するための優れた識別能を有するアプタマーの開発が強く望まれていた。 Therefore, there has been a strong demand for the development of aptamers having excellent discrimination ability for providing a similar rapid and accurate diagnostic technique for new influenza.
本発明は、新型インフルエンザウイルス、特に、A/California/04/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)のHAタンパク質をターゲットとするアプタマーを取得し、新型インフルエンザウイルスの検査薬を新たに提供しようとするものである。 The present invention targets novel influenza viruses, particularly the HA proteins of A / California / 04/2009 (H1N1), A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) It is intended to acquire aptamers and provide new tests for new influenza viruses.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、新型インフルエンザウイルスのA/California/04/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)のHAタンパク質に結合するアプタマーを取得した。
得られたアプタマーと各ターゲットとの親和性及び相互作用解析、亜型または株との識別には、フィルター結合定量法、及び表面プラズモン共鳴装置（GEヘルスケアバイオサイエンス社製BiacoreT100）を用いた。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that A / California / 04/2009 (H1N1), A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), and A / HongKong An aptamer that binds to the HA protein of / 1073/1999 (H9N2) was obtained.
For analysis of affinity and interaction between the obtained aptamer and each target, and identification of subtypes or strains, a filter binding quantitative method and a surface plasmon resonance apparatus (Biacore T100 manufactured by GE Healthcare Biosciences) were used.
A/California/04/2009(H1N1)をターゲットとした選別では、アプタマーD12とD26を取得した。アプタマーD12及びD26は、A/California/04/2009に対して高い親和性を示したが、
A/California/04/2009と同じ亜型H1N1に属するA/NewCaledonia/20/1999(H1N1)とA/Brevig mission/1/1918(H1N1)に対してはいずれも結合能を示さなかった。
In the selection targeting A / California / 04/2009 (H1N1), aptamers D12 and D26 were obtained. Aptamers D12 and D26 showed high affinity for A / California / 04/2009,
Neither A / NewCaledonia / 20/1999 (H1N1) and A / Brevig mission / 1/1918 (H1N1) belong to the same subtype H1N1 as A / California / 04/2009.
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとした選別では、アプタマー8-1、8-3、及び8-10を取得した。アプタマー8-1、8-3、及び8-10は、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対し、高い親和性を示した。さらに、同じ亜型(H5N1)に属するA/Indonesia/05/2005(H5N1)及びA/ Anhui/1/2005(H5N1)への親和性も調べたところ、アプタマー8-1、8-3、及び8-10は、これらの株にも結合能を有することが確認された。
これに対して、H5N1型以外の亜型との親和性を確認したところ、アプタマー8-3は、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Netherlands/219/2003(H7N7)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)に対しては結合しないか、結合したとしてもごくわずかであり、A/California/04/2009(H1N1)に対しては親和性を示したものの、そのKd値は30nMであり、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対するKd値、50pMの600倍であった。すなわち、A/California/04/2009(H1N1)への親和性は、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対するよりも600分の１程度であることが示された。
アプタマー8-1及び8-10においても、H5N1型以外の亜型との親和性は、いずれもA/California/04/2009(H1N1)、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Netherlands/219/2003(H7N7)及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)には結合しないか、結合したとしてもごくわずかであった。
In selection targeting A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), aptamers 8-1, 8-3, and 8-10 were obtained. Aptamers 8-1, 8-3, and 8-10 showed high affinity for A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1). Furthermore, when the affinity to A / Indonesia / 05/2005 (H5N1) and A / Anhui / 1/2005 (H5N1) belonging to the same subtype (H5N1) was also examined, aptamers 8-1, 8-3, and It was confirmed that 8-10 also has binding ability to these strains.
On the other hand, when the affinity with subtypes other than H5N1 type was confirmed, aptamer 8-3 was A / NewYork / 55/2004 (H3N2), A / Netherlands / 219/2003 (H7N7), and A It does not bind to / HongKong / 1073/1999 (H9N2), or even if it binds, it shows very little affinity, but it has affinity for A / California / 04/2009 (H1N1), but its Kd value Was 30 nM, a Kd value for A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), which was 600 times 50 pM. That is, it was shown that the affinity for A / California / 04/2009 (H1N1) is about 1/600 that of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1).
In aptamers 8-1 and 8-10, the affinity with subtypes other than H5N1 is A / California / 04/2009 (H1N1), A / NewYork / 55/2004 (H3N2), A / Netherlands. / 219/2003 (H7N7) and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) did not bind or very little if any.
A/HongKong/1073/1999(H9N2) をターゲットとした選別では、アプタマー10-1を取得した。アプタマー10-1は、A/HongKong/1073/1999(H9N2)に対して高い親和性を示したが、他の亜型との親和性を調べたところ、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、A/Indonesia/05/2005(H5N1)、及びA/Netherlands/219/2003(H7N7)のいずれにも結合能を示さなかった。
そして、本発明のアプタマーを取得した方法を上記以外の新型インフルエンザウイルスあるいは今後出現してくる新型インフルエンザウイルスに対して適用することで、他の新型インフルエンザウイルスに特異的なアプタマーを取得することができる。
In the selection targeting A / HongKong / 1073/1999 (H9N2), aptamer 10-1 was obtained. Aptamer 10-1 showed a high affinity for A / HongKong / 1073/1999 (H9N2), but when the affinity with other subtypes was examined, A / NewYork / 55/2004 (H3N2) , A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), A / Indonesia / 05/2005 (H5N1), and A / Netherlands / 219/2003 (H7N7) showed no binding ability.
And by applying the method of obtaining the aptamer of the present invention to a new influenza virus other than the above or a new influenza virus that will appear in the future, aptamers specific to other new influenza viruses can be obtained. .
さらに、本発明者らはアプタマー8-3を短鎖化して、アプタマー8-3Sを得た。これらはターゲットとするA/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質に対し高い親和性を保持していた。 Furthermore, the present inventors shortened aptamer 8-3 to obtain aptamer 8-3S. These retained high affinity for the HA protein of the target A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1).
また、アプタマーD12、D26、8-3SのRNAのリボース基の2’-OHをフルオロ基(2’-F)に置き換えることによって、より安定なアプタマーD12-2’FC&U、D26-2’FC&U、及び8-3S-2’FCを得ることができた。
以上の知見を得て本発明を完成した。
Moreover, by replacing 2′-OH of the ribose group of aptamer D12, D26, 8-3S RNA with a fluoro group (2′-F), more stable aptamers D12-2′FC & U, D26-2′FC & U, And 8-3S-2′FC could be obtained.
Obtaining the above knowledge, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕 配列番号４〜１０のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むRNAからなることを特徴とする、新型インフルエンザのHAタンパク質に対する結合能を有するアプタマーRNA。
〔２〕 配列番号４〜９のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むRNAが構成する２次構造において、HAタンパク質に対する結合能を有する先端領域部の構造を保持するように短鎖化された塩基配列からなるアプタマーRNA。
〔３〕 アプタマーRNAを構成するヌクレオチドのリボース部位の少なくとも１箇所が、化学修飾されていることを特徴とする、前記〔１〕及び〔２〕のいずれかに記載のアプタマーRNA。
〔４〕 前記化学修飾が、リボース部位の2’位に対するフルオロ基（2’-F）もしくはメトキシ基（2’-OMe）による修飾、又は水素による置換（2’-deoxy）であることを特徴とする、前記〔１〕及び〔２〕のいずれかに記載のアプタマーRNA。
〔５〕 アプタマーRNAの3’および／または5’末端がインバーストデオキシチミジン（idT）あるいはポリエチレングリコール（PEG）により修飾されていることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアプタマーRNA。
〔６〕 前記〔１〕又は〔２〕に記載のアプタマーRNAと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ前記〔１〕又は〔２〕に記載のアプタマーに変換可能な一本鎖DNA、二本鎖DNA又は相補的RNA。
〔７〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有する、新型インフルエンザウイルスの検出剤。
〔８〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有する、新型インフルエンザウイルス用診断剤。
〔９〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有する、新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質の亜型又は株を特定するための診断用キット。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として用いることを特徴とする新型インフルエンザウイルスの検出方法。
〔１１〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として用いることを特徴とする、新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質の亜型又は株を特定するための方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4 to 10, or an RNA comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence An aptamer RNA that has the ability to bind to the new influenza HA protein.
[2] In the secondary structure composed of the base sequence shown by any of SEQ ID NOs: 4 to 9, or RNA comprising the base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence An aptamer RNA consisting of a base sequence that has been shortened to retain the structure of the tip region that has the ability to bind to the HA protein.
[3] The aptamer RNA according to any one of [1] and [2] above, wherein at least one of the ribose sites of nucleotides constituting the aptamer RNA is chemically modified.
[4] The chemical modification is a modification with a fluoro group (2′-F) or a methoxy group (2′-OMe) on the 2 ′ position of the ribose moiety, or a hydrogen substitution (2′-deoxy). The aptamer RNA according to any one of [1] and [2].
[5] Any one of [1] to [4] above, wherein the 3 ′ and / or 5 ′ end of the aptamer RNA is modified with inburst deoxythymidine (idT) or polyethylene glycol (PEG). The aptamer RNA described in 1.
[6] It contains the same base sequence as the aptamer RNA described in [1] or [2] or a base sequence complementary to the base sequence, and can be converted into the aptamer described in [1] or [2] Single stranded DNA, double stranded DNA or complementary RNA.
[7] A novel influenza virus detection agent comprising the aptamer RNA according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
[8] A diagnostic agent for a new influenza virus containing the aptamer RNA according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
[9] A diagnostic kit for identifying a subtype or strain of a new influenza virus HA protein comprising the aptamer RNA according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
[10] A method for detecting a novel influenza virus, comprising using the aptamer RNA according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
[11] A method for identifying a subtype or strain of a new influenza virus HA protein, wherein the aptamer RNA according to any one of [1] to [5] is used as an active ingredient.
本発明により、新型インフルエンザウイルスの型・亜型・株の同定のための検査薬として用いることができるアプタマーを提供できた。これらアプタマーを用いた検出法は、今までにはなかった新型インフルエンザウイルスに対する正確で迅速なルーチン検査を可能とするものである。また、本発明のアプタマーは、新型インフルエンザウイルスの宿主細胞表面への結合を妨げる作用をもつと考えられるので、新型インフルエンザウイルスの予防及び治療薬となる可能性が高い。 According to the present invention, an aptamer that can be used as a test agent for identifying a type, subtype, or strain of a new influenza virus can be provided. The detection method using these aptamers enables an accurate and rapid routine test for a novel influenza virus that has not been available so far. In addition, since the aptamer of the present invention is considered to have an action of preventing the binding of the new influenza virus to the host cell surface, it is highly likely to be a preventive and therapeutic drug for the new influenza virus.
１．本発明のアプタマーについて
（１）本発明の「アプタマー」とは
「アプタマー」とは、一般に、ある標的、例えばウイルス、タンパク質、ペプチド、糖類、金属イオン、小分子等に特異的に結合するように人工的に創製された核酸リガンドをいうが、本発明において用いる「アプタマー」は、新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質に特異的な結合能を有する。核酸としてはRNAが好ましく、RNAを構成するリボース基が化学的に修飾されている場合も含む。
本発明のアプタマーは、周知のSELEX法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）を適用し、中央の74塩基部分をランダム化したRNAライブラリーから得られたクローン由来のものであって、典型的には配列番号４〜１０に示される塩基配列からなるRNAが挙げられる。本発明においては、ランダム領域を比較的長い74塩基配列としたことによって、より複雑な３次構造ができ、高度な識別が可能なアプタマーを提供することができたものと考えられる。
1. About the aptamer of the present invention (1) What is the “aptamer” of the present invention? The “aptamer” generally means that it specifically binds to a certain target such as a virus, protein, peptide, saccharide, metal ion, small molecule, etc. Although it is an artificially created nucleic acid ligand, the “aptamer” used in the present invention has a specific binding ability to the HA protein of a new influenza virus. As the nucleic acid, RNA is preferable, and includes a case where the ribose group constituting RNA is chemically modified.
The aptamer of the present invention is derived from a clone obtained from an RNA library obtained by applying the well-known SELEX method (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) and randomizing the central 74 base portion. Includes RNA having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 4 to 10. In the present invention, it is considered that aptamers capable of highly discriminating can be provided by forming a relatively long 74 base sequence in the random region, thereby creating a more complicated tertiary structure.
（２）「アプタマー」の構造
本発明のアプタマーの２次構造モデルは、例えば図２〜４などに示されるように、先端のループ構造とステム構造とループ構造の繰り返しが続いたステム・ループ構造となっている。実際にインフルエンザウイルスのHAタンパク質抗原と結合する部位は、ランダム領域からなる領域で、主にこのうちの先端ループを含むステム領域であると考えられるため、当該先端部領域の構造を壊さない範囲でRNA鎖を短縮化することもできる。
(2) Structure of “aptamer” The secondary structure model of the aptamer of the present invention is a stem-loop structure in which the loop structure at the tip, the stem structure, and the loop structure are repeated as shown in FIGS. It has become. The site that actually binds to the HA protein antigen of influenza virus is a region composed of random regions, and is thought to be mainly the stem region including the tip loop, so that the structure of the tip region is not damaged. The RNA strand can also be shortened.
（３）本発明のアプタマーを構成する核酸
本発明においては、上記配列番号で示されるRNAに限らず、これらRNAと対応する配列を有する、DNA及び、これらDNAと相補のDNA、あるいはこれら相補のDNA鎖同士が２本鎖を構成したdsDNAを包含する。さらに、上記RNAと相補の塩基配列を有するRNAも包含する。これらはそれ自体慣用の遺伝子操作手段により、たやすく本発明のアプタマーRNAに変換可能であり、本発明のアプタマー製造用中間体である。また、本発明においては、上述のように、典型的な配列番号４〜１０に示された塩基配列と共に、当該塩基配列中のヌクレオチド残基を１若しくは数個欠失、置換、あるいは付加させた改変アプタマーであっても、上記HAタンパク質と結合するものであればこれを包含する。また、後述のように、RNAを構成するリボース基を化学修飾させた修飾アプタマーも包含される。
(3) Nucleic acid constituting the aptamer of the present invention In the present invention, not only the RNA represented by the above SEQ ID No. but also DNA having a sequence corresponding to these RNA, DNA complementary to these DNA, or complementary DNA thereof. It includes dsDNA in which DNA strands constitute a double strand. Furthermore, RNA having a base sequence complementary to the above RNA is also included. These can be easily converted to the aptamer RNA of the present invention by conventional genetic manipulation means, and are the intermediates for producing the aptamer of the present invention. In the present invention, as described above, one or several nucleotide residues in the nucleotide sequence are deleted, substituted, or added together with the typical nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 10. Even modified aptamers are included as long as they bind to the HA protein. Moreover, the modified aptamer which chemically modified the ribose group which comprises RNA as mentioned later is also included.
（４）本発明のアプタマーの認識する部位とその親和性
新型インフルエンザウイルス粒子表面も季節性のＡ型インフルエンザウイルス粒子表面と同様、それぞれ約９００コピーのヘマグルチニン（HA）と約３００コピーのノイラミニダーゼ（NA）が存在すると言われている。本発明のアプタマーRNAには新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質に結合する能力がある。
本発明のアプタマーが認識する部位は、新型インフルエンザのHAタンパク質の表面に突出した領域であり、且つ、アミノ酸の変異が認められる領域であると考えられる。
また、親和性に関する実験は、後述で示すフィルター結合定量法、及び表面プラズモン共鳴装置（GEヘルスケアバイオサイエンス社製BiacoreT100）を用いて行い、本発明のアプタマーの、新型インフルエンザHAタンパク質に対する親和性は高く、且つ特異的である。（図５−１１、図１３−１５）。
(4) The site recognized by the aptamer of the present invention and its affinity The surface of the new influenza virus particle is about 900 copies of hemagglutinin (HA) and about 300 copies of neuraminidase (NA), respectively. ) Is said to exist. The aptamer RNA of the present invention has the ability to bind to a new influenza virus HA protein.
The site recognized by the aptamer of the present invention is considered to be a region protruding on the surface of a novel influenza HA protein and a region where amino acid mutation is observed.
In addition, the affinity experiment was performed using a filter binding quantification method described below and a surface plasmon resonance apparatus (Biacore T100 manufactured by GE Healthcare Bioscience), and the affinity of the aptamer of the present invention for the new influenza HA protein was High and specific. (FIGS. 5-11 and 13-15).
２．本発明のアプタマーRNAの製造方法
（１）SELEX法
本発明のアプタマーは、それ自体周知のSELEX法により得られたものである。SELEX法は、ランダム配列の核酸ライブラリーの作成から出発し、標的とするタンパク質との結合性を指標に選別して、PCR増幅するサイクルを複数回繰り返すもので、これにより、標的とするタンパク質に対し高い結合能を有する核酸のみを選別することができる。上記選別及びPCR増幅はそれぞれ、自然界における「淘汰」及び「増殖」に相当し、自然界における進化を試験管内で短時間に再現させるものである。
2. Method for producing aptamer RNA of the present invention (1) SELEX method The aptamer of the present invention is obtained by a SELEX method known per se. The SELEX method starts with the creation of a random-sequence nucleic acid library, selects the binding to the target protein as an index, and repeats the PCR amplification cycle multiple times. Only nucleic acids having a high binding ability can be selected. The above selection and PCR amplification correspond to “spider” and “growth” in nature, respectively, and reproduce the evolution in nature in a short time in a test tube.
本発明においては、試験管内選択法によって合計１０サイクルの選別を行い、その結果得られた特異的なウイルスに結合するRNAプールについてクローニングを行った。選別を経たRNAプールには各ターゲットに高い親和性を有するアプタマーが含まれていた。
具体的には、配列中央の74塩基をランダム領域とするDNAライブラリー（配列番号１）を合成し、PCR増幅した後、転写してRNAプールとし、このRNAプールに対し、上記HAタンパク質と結合するRNAを選別、増幅し、このサイクルを複数回繰り返すことにより、該HAタンパク質に対して特異性及び結合性の高い、配列番号４から９に示されるアプタマーを得たものであり、本発明においては配列番号６に示すアプタマー（アプタマー8-3）をさらに短鎖化して、配列番号１０に示される短鎖化アプタマー（アプタマー8-3S）を得ており、これはHAタンパク質に対する結合能を保持している。
In the present invention, a total of 10 cycles were selected by in vitro selection method, and the resulting RNA pool that binds to a specific virus was cloned. The selected RNA pool contained aptamers having high affinity for each target.
Specifically, a DNA library (SEQ ID NO: 1) having 74 bases in the middle of the sequence as a random region is synthesized, PCR amplified, transcribed into an RNA pool, and this RNA pool binds to the HA protein. The aptamers shown in SEQ ID NOs: 4 to 9 having high specificity and binding to the HA protein were obtained by selecting and amplifying the RNA to be amplified and repeating this cycle several times. Further shortens the aptamer shown in SEQ ID NO: 6 (aptamer 8-3) to obtain the short aptamer shown in SEQ ID NO: 10 (aptamer 8-3S), which retains the ability to bind to HA protein. doing.
（２）その他の方法
本発明のアプタマーは、上記したとおり、基本的にはSELEX法により得たものではあるが、本発明においては、アプタマーの塩基配列を明らかにしており、SELEX法によらずとも、この塩基配列から本発明のアプタマーを合成することができる。これには、例えば、それ自体周知の以下の方法を用いることができる。
インビトロ転写法：合成目的のアプタマーRNAに対応する上記DNAを化学合成し、これをPCR増幅し、増幅されたDNAからRNAポリメラーゼによる転写反応によりアプタマーRNAを合成する。例えば、T7プロモーターの下流側に上記DNAを連結してPCR増幅し２本鎖DNAを得て、該２本鎖DNAを鋳型として、T7RNAポリメラーゼ、およびATP、GTP、CTP及びUTPからなる該RNAポリメラーゼ基質を含む反応溶液中で、RNA伸長反応を行うことにより、アプタマーRNAを得ることができる。
(2) Other methods As described above, the aptamer of the present invention is basically obtained by the SELEX method. However, in the present invention, the base sequence of the aptamer is clarified, and the aptamer of the present invention is independent of the SELEX method. In any case, the aptamer of the present invention can be synthesized from this base sequence. For example, the following method known per se can be used.
In vitro transcription method: The above DNA corresponding to the aptamer RNA to be synthesized is chemically synthesized, PCR amplified, and aptamer RNA is synthesized from the amplified DNA by a transcription reaction with RNA polymerase. For example, the above DNA is linked to the downstream side of the T7 promoter and PCR amplified to obtain double-stranded DNA. Using the double-stranded DNA as a template, T7 RNA polymerase and the RNA polymerase comprising ATP, GTP, CTP and UTP Aptamer RNA can be obtained by performing an RNA extension reaction in a reaction solution containing a substrate.
この方法においては、T7プロモーター配列を含むプラスミドに上記dsDNAを連結したもの、あるいは化学合成したDNAも鋳型として用いることができる。また、上記DNAの合成においては従来公知の種々の方法で合成することが可能である。例えば、DNA合成機を用いて、dNTPを材料として、末端塩基から化学合成することができる。
化学合成法：RNAの合成には、リボース部位の2’水酸基の保護が必要であり、保護基として種々のアミダイトが開発されてきており、2-cyanoethoxymethyl(CEM)基を用いるとRNA合成時の鎖長伸長反応の効率が高くなり、100merを超える長鎖RNAの合成も可能となる。本発明のアプタマーRNAはこのような化学合成法を用いて合成することができる。
また、このほか、上記アプタマーRNAと相補のRNAからは、RNA依存RNAポリメラーゼを使用することにより本発明のアプタマーRNAを得ることも可能である。
In this method, a plasmid containing the T7 promoter sequence linked to the above dsDNA or chemically synthesized DNA can also be used as a template. In addition, the DNA can be synthesized by various conventionally known methods. For example, a DNA synthesizer can be used to chemically synthesize from a terminal base using dNTP as a material.
Chemical synthesis: RNA synthesis requires protection of the 2 'hydroxyl group of the ribose moiety, and various amidites have been developed as protecting groups. When 2-cyanoethoxymethyl (CEM) is used, The efficiency of the chain length extension reaction is increased, and it becomes possible to synthesize a long chain RNA exceeding 100 mer. The aptamer RNA of the present invention can be synthesized using such a chemical synthesis method.
In addition, the aptamer RNA of the present invention can be obtained from RNA complementary to the aptamer RNA by using RNA-dependent RNA polymerase.
３．アプタマーRNAの短縮化
アプタマーの短縮化の主な目的は、アプタマーRNAの製造コストを削減することである。本発明のアプタマーは、HAタンパク質との結合に関与するコア領域となるステム・ループ構造を残して、HAタンパク質との結合活性を保持したまま短鎖化することができた（アプタマー8-3S；図１２）。
本発明のアプタマーの短鎖化は、配列番号４〜９に示されるアプタマーに対して、一般的なアプタマーの短鎖化方法であるマッピング法（非特許文献２、特許文献１）に従って行うことができる。また、本発明の実施例５において短鎖化の対象とした配列番号６のアプタマー8-3（図３）のように、比較的単純な２次構造をとっていて、先端部のHA結合領域の予測がつきやすい場合は、マッピング法実験を省略することができる。
3. Aptamer RNA shortening The main purpose of aptamer shortening is to reduce the production cost of aptamer RNA. The aptamer of the present invention was able to be shortened while maintaining the binding activity with the HA protein, leaving a stem-and-loop structure serving as a core region involved in the binding with the HA protein (Aptamer 8-3S; FIG. 12).
The aptamer of the present invention can be shortened according to a mapping method (Non-patent Document 2, Patent Document 1) which is a general aptamer shortening method for the aptamers shown in SEQ ID NOs: 4 to 9. it can. Moreover, it has a relatively simple secondary structure, such as the aptamer 8-3 of SEQ ID NO: 6 (FIG. 3), which is the target of shortening in Example 5 of the present invention, and has an HA binding region at the tip. If it is easy to predict, the mapping method experiment can be omitted.
４．アプタマーRNAの化学修飾
本発明のアプタマーRNAにおいては、リボヌクレアーゼ耐性を付加するために、その配列中に化学修飾（modified）したヌクレオチドを有していても良い。このようなアプタマーRNAは、例えば、アプタマーRNA中のヌクレオチドのリボース部位の2’-OH基を、常法によりフロオロ基（2’-F）にまたはメトキシ基（2’-OMe）に、あるいは同リボース部位の２’位を水素に置換（2’-deoxy）することにより得られる。この化学修飾は、ピリミジンヌクレオチド部位がリボヌクレアーゼにより分解されやすいので、ピリミジンヌクレオチドに対してより有効である。
このような化学修飾は、ヘマグルチニンとの結合に関与する部位のヌクレオチドに対しては行わない。それ以外のヌクレオチドであれば全て修飾することも可能であるが、一般的にはループ領域のピリミジンヌクレオチドのリボース基について行う。
4). Chemical modification of aptamer RNA The aptamer RNA of the present invention may have a chemically modified nucleotide in its sequence in order to add ribonuclease resistance. Such aptamer RNA is, for example, a 2′-OH group of a ribose site of a nucleotide in aptamer RNA, a fluoro group (2′-F) or a methoxy group (2′-OMe) by the usual method, or the same. It is obtained by replacing the 2 ′ position of the ribose site with hydrogen (2′-deoxy). This chemical modification is more effective for pyrimidine nucleotides because the pyrimidine nucleotide sites are susceptible to degradation by ribonucleases.
Such chemical modification is not performed on nucleotides at sites involved in binding to hemagglutinin. Although it is possible to modify all other nucleotides, it is generally performed on the ribose group of the pyrimidine nucleotide in the loop region.
本発明においては、さらにアプタマーRNAの3’及び／又は5’末端をインバーストデオキシチミジン（idT）あるいはポリエチレングリコール（PEG）により修飾することもでき、これらにより、アプタマーRNAのリボヌクレアーゼ耐性はさらに向上し、生体中での分解による活性の低下を抑制することができる。され、生体内で有効な抗ウイルス作用を発揮させることが可能となる。 In the present invention, the 3 ′ and / or 5 ′ end of the aptamer RNA can be further modified with inburst deoxythymidine (idT) or polyethylene glycol (PEG), which further improves the ribonuclease resistance of the aptamer RNA. The decrease in activity due to degradation in the living body can be suppressed. Thus, it is possible to exert an effective antiviral effect in vivo.
５．アプタマーRNAを用いた新型インフルエンザウイルスの検出法
（１）標識化されたアプタマーRNAを用いる方法
本発明のアプタマーRNAは新型インフルエンザウイルスの検査薬の検出剤として用いられる。例えば、本発明のアプタマーRNAをフルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素で標識し、被験試料と接触、結合反応を行い、結合しなかったものを除去した後、蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより、新型インフルエンザウイルスの検出、あるいはその量を測定できる。この際、例えば、標識アプタマーRNAあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことができる。
また、結合時に蛍光発光する物質を用いて、本発明のアプタマー及び被験試料のいずれかを標識して、結合時の蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより行うことも可能である。このような蛍光色素としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等が挙げられる。
5. Detection Method of New Influenza Virus Using Aptamer RNA (1) Method Using Labeled Aptamer RNA The aptamer RNA of the present invention is used as a detection agent for a test agent for new influenza virus. For example, the aptamer RNA of the present invention is labeled with a fluorescent dye such as fluorescein, rhodamine, Texas red, etc., contacted with a test sample, subjected to a binding reaction, removed unbound, and then detected fluorescence or its intensity, By measuring, it is possible to detect a new influenza virus or the amount thereof. In this case, for example, it can be performed using a substrate on which either the labeled aptamer RNA or the test sample is immobilized.
It is also possible to use a substance that fluoresces when bound to label either the aptamer of the present invention or the test sample, and detect and measure the fluorescence upon binding or its intensity. Examples of such fluorescent dyes include fluorescein, rhodamine, and Texas red.
（２）表面プラズモン共鳴法（SPR）
また、本発明においては、蛍光色素を標識せずに、新型インフルエンザウイルスを検出することも可能である。これには、例えば、表面プラズモン共鳴法（SPR）がある。すなわち、分子間の結合反応を、センサー表面でおこる分子間の結合時の微細な質量変化を表面プラズモン共鳴とよばれる光学現象を採用することで測定することができる。SPR法を利用した装置として、GEヘルスケアバイオサイエンス社製BiacoreT100がある。測定はセンサーチップの金薄膜表面に本発明のアプタマーRNAあるいは被験試料のいずれかを周知の方法で固定化し、これに被験試料あるいはアプタマーRNAを供給し、結合反応をリアルタイムでモニタリングしながら行う。
(2) Surface plasmon resonance (SPR)
In the present invention, it is also possible to detect a new influenza virus without labeling the fluorescent dye. This includes, for example, surface plasmon resonance (SPR). That is, the intermolecular binding reaction can be measured by adopting an optical phenomenon called surface plasmon resonance, which is a fine mass change upon intermolecular binding occurring on the sensor surface. As a device using the SPR method, there is Biacore T100 manufactured by GE Healthcare Bioscience. The measurement is performed while immobilizing either the aptamer RNA of the present invention or the test sample on the gold thin film surface of the sensor chip by a well-known method, supplying the test sample or aptamer RNA thereto, and monitoring the binding reaction in real time.
６．本発明のアプタマーを用いた診断方法及び診断用キット
本発明は、新型インフルエンザウイルスで発現するHAタンパク質に結合するアプタマーを、新型インフルエンザウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることによって、サンプル中に目的の新型インフルエンザウイルスが存在すること、あるいは存在しないことが確認できる。
また、本発明においては、新型インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／又は株で発現するHAタンパク質と特異的に結合するアプタマーを提供することができたので、これらアプタマーを用いて、新型インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／又は株を識別し、判定することができる。
そして、本発明は、新型インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／又は株で発現するHAタンパク質と特異的に結合するアプタマーを備えた新型インフルエンザウイルス診断用キットを提供する。
診断剤、診断用キットを製造するに際しては、適宜、周知の薬学的に許容可能な希釈剤、安定化剤、その他の担体などと組み合わせて用いる。
本発明の診断用キットの対象となるサンプルとしては、例えば、被験者の咽頭拭い液、鼻汁等の採取検体等や、それら検体を培養細胞やニワトリ受精卵に与えて感染・増殖の工程によって得た溶液等が挙げられる。
また、本発明の方法により、新型インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／又は株を識別し、判定することができるから、例えばヒトへの感染やパンデミックが発生する前に、豚や鳥類において実際に流行しているインフルエンザウイルスの亜型及び／又は株をモニタリングし、将来のヒトへの感染やパンデミック予測に用いることができる。
6). Diagnostic method and diagnostic kit using aptamer of the present invention The present invention is to contact an aptamer that binds to an HA protein expressed in a new influenza virus with a sample containing or possibly containing the new influenza virus. By this, it can be confirmed that the target new influenza virus is present or absent in the sample.
Further, in the present invention, since an aptamer that specifically binds to a HA protein expressed in a specific subtype and / or strain of a new influenza virus can be provided, these aptamers can be used to Specific subtypes and / or strains can be identified and determined.
The present invention also provides a novel influenza virus diagnostic kit comprising an aptamer that specifically binds to a HA protein expressed in a specific subtype and / or strain of a novel influenza virus.
When producing diagnostic agents and diagnostic kits, they are appropriately used in combination with known pharmaceutically acceptable diluents, stabilizers and other carriers.
Samples to be used in the diagnostic kit of the present invention include, for example, collected samples such as throat swabs, nasal discharge, etc. of subjects, and these samples were given to cultured cells and chick fertilized eggs by infection and proliferation processes. Examples include solutions.
In addition, since the method of the present invention can identify and determine a specific subtype and / or strain of a new influenza virus, it can actually be used in pigs and birds before, for example, human infection or pandemic occurs. Epidemic influenza virus subtypes and / or strains can be monitored and used to predict future human infections and pandemics.
本発明におけるアプタマーは、抗体に匹敵する特異性を有し、現在新型インフルエンザウイルスの検出のために使用されている抗体を用いた迅速診断キットと同様の用途に使用することができる。臨床上、新型インフルエンザであるか、又は単なる季節性インフルエンザ、感冒等のその他のかぜ症候群の疾患であるかを迅速に診断することは、治療上、また予防上においても非常に重要である。また、インフルエンザであっても、ウイルスの型により、また亜型により、症状が異なり、種類が異なることでワクチンの効果が得られない場合もあり、治療に用いる医薬の決定、ワクチンの選択等においても、その識別は重要な意味を有する。更に、新型インフルエンザの流行状況をモニタリングすることで、将来の流行予測、ワクチンの製造の上でも有用な情報を得ることができ、更に研究用の試薬としても利用することができる。 The aptamer in the present invention has a specificity comparable to that of an antibody, and can be used in the same application as a rapid diagnostic kit using an antibody currently used for detection of a new influenza virus. It is very important in terms of treatment and prevention to quickly diagnose clinically whether it is a new type of influenza or just a disease of other cold syndromes such as seasonal influenza and cold. In addition, even if it is influenza, symptoms may vary depending on the type of virus or subtype, and the effect of the vaccine may not be obtained due to different types. In determining the medicine to be used for treatment, selecting the vaccine, etc. However, the identification has an important meaning. Furthermore, by monitoring the epidemic situation of the new influenza, useful information can be obtained for future epidemic prediction and vaccine production, and it can be used as a research reagent.
使用の際には、上記のようにして得られた１種のアプタマーを単独で用いても良いが、場合によっては、同じウイルスまたはタンパク質に結合し得るアプタマー、または異なるウイルスまたはタンパク質に結合し得るアプタマーを複数混合して用いても良い。 In use, one aptamer obtained as described above may be used alone, but in some cases, it may bind to the same virus or protein, or to different viruses or proteins. A plurality of aptamers may be mixed and used.
７．抗ウイルス剤、又は新型インフルエンザウイルスの予防もしくは治療用組成物
本発明のアプタマーは、新型インフルエンザウイルスのHAタンパク質の表面にある突出領域に特異的に結合し、ウイルスの細胞への結合を阻害すると考えられる。特に化学修飾されたアプタマーはヌクレアーゼ抵抗性で、血中半減期も長いばかりか、生体内への抗原性も無視できるので、各種の抗ウイルス製剤として、また新型インフルエンザの予防用または治療用の医薬組成物として利用する事も可能である。投与対象はヒトのみならず、鳥や豚などに適用することができる。
抗ウイルス製剤、または医薬組成物とする場合には、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いる。非経口投与としては、典型的には注射剤であるが、噴霧剤などと共に吸入による投与も可能である。
また、直接ヒトなどに投与せずに、抗ウイルス剤として、マスクや看護用の衣服などに含浸させて用いることもできる。
7). Antiviral agent or composition for preventing or treating new influenza virus The aptamer of the present invention is considered to specifically bind to the protruding region on the surface of the HA protein of new influenza virus and inhibit the binding of the virus to cells. It is done. In particular, chemically modified aptamers are resistant to nucleases, have a long half-life in blood, and can ignore antigenicity in vivo. Therefore, they can be used as various antiviral preparations or for the prevention or treatment of new influenza. It can also be used as a composition. The administration target can be applied not only to humans but also to birds and pigs.
When it is used as an antiviral preparation or a pharmaceutical composition, it may be either oral or parenteral, and it is appropriately used in combination with a well-known pharmaceutically acceptable non-toxic carrier or diluent. Parenteral administration is typically an injection, but administration by inhalation together with a spray or the like is also possible.
Further, it can be used as an antiviral agent by impregnating it in a mask, nursing clothes, etc. without directly administering it to humans.
以下に本発明の一実施形態として、新型インフルエンザウイルスのうちで、A/California/04/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)に結合するアプタマーの選別例を挙げ、下記実施例において具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、本発明で使用されている技術的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover et al.ed.,"DNA Cloning",2nd ed.,Vol.1 to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸III（組換えDNA技術）」、東京化学同人(1992);R.Wu ed.,"Methods in Enzymology",Vol.68(Recombinant DNA),Academic Press,New York(1980);R.Wu et al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.100(Recombinant DNA,PartB) & 101(Recombinant DNA,Part C),Academic Press,New York(1983);R.Wu et al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E) & 155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、参照して本明細書の記載として組み入れるものとする。
As one embodiment of the present invention, among the new influenza viruses, A / California / 04/2009 (H1N1), A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) Examples of selecting aptamers that bind to, are specifically described in the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
Technical terms used in the present invention have meanings commonly understood by those skilled in the art unless otherwise defined. Unless otherwise specified, specific procedures and conditions such as genetic recombination techniques, PCR methods, and other techniques used in the examples of the present invention are as follows: Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); DMGlover et al.ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, ( The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995; "Lecture 1, Genetic Research Method II", Tokyo Kagaku Doujin (1986); Edited by the Japanese Biochemical Society, "Neochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology)", Tokyo Chemical Doujin (1992); R. Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol.68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R.Wu et al.ed., "Methods in Enzymology", Vol.100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Pre ss, New York (1983); R. Wu et al.ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F ), Academic Press, New York (1987) or the like, or a method described in the literature cited therein or a method substantially similar thereto.
Moreover, the description content of the prior art document or patent application specification cited in the present invention is incorporated as a description of this specification with reference.
（実施例１） A/California/04/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)に特異的なアプタマーのインビトロでの選別
（１−１）RNAランダムプールの作成
以下に示す、中央の７４塩基をランダム領域とする一本鎖DNA（ssDNA）のライブラリーを合成してテンプレートとし（配列番号１）、５’末端プライマー（配列番号２）、及び３’末端プライマー（配列番号３）を用いてPCRを行った。
〔テンプレート〕
5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGC-（N）74-GGCACCACGGTCGGATCCAC-3'（配列番号１）
〔５’末端プライマー〕
5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC-3'（配列番号２）
〔３’末端プライマー〕
5'-GTGGATCCGACCGTGGTGCC-3'（配列番号３）
Example 1 In Vitro Selection of Aptamers Specific for A / California / 04/2009 (H1N1), A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) (1 -1) Creation of RNA random pool A library of single-stranded DNA (ssDNA) having the central 74 bases as a random region shown below is synthesized as a template (SEQ ID NO: 1), 5 ′ end primer (SEQ ID NO: SEQ ID NO: PCR was performed using 2) and the 3 ′ end primer (SEQ ID NO: 3).
〔template〕
5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGC- (N) 74 -GGCACCACGGTCGGATCCAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
[5'end primer]
5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC-3 '(SEQ ID NO: 2)
[3'end primer]
5'-GTGGATCCGACCGTGGTGCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
次いでT7 Ampliscribe kit(Epicentre Technologies社製)を用いて、インビトロでの転写を行い、増幅されたDNAライブラリーをRNAライブラリーに変換した。 Subsequently, transcription was performed in vitro using a T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies), and the amplified DNA library was converted to an RNA library.
（１−２）インビトロにおける選別
上記（１）で得られたRNAライブラリー（16μg）を結合用緩衝液（0.01M HEPES,0.15M NaCl,pH7.4)に溶解させ、474≒3.57×1044通りの異なるRNA配列のコンフォメーションの平衡を促進するために、95℃で2分間処理して変性させた後に、室温で10分間冷却させた（アニーリング）。非特異的に結合するRNAを除去するためコンペティターとしてtRNA(E.coliのトータルtRNA（Boehringer-Mannheim社製))を加えた後、ターゲットとなるHAタンパク質を加えた。ターゲットとして選別に用いたHAタンパク質は、A/California/04/2009(H1N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)である。各選別サイクルで用いたRNA、タンパク質、tRNAの分子比は表１に示すとおり。
(1-2) In vitro selection The RNA library (16 μg) obtained in (1) above was dissolved in a binding buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.4), and 4 74 ≈3.57 × 10 4 In order to promote the conformational equilibrium of 44 different RNA sequences, it was denatured by treatment at 95 ° C. for 2 minutes and then cooled at room temperature for 10 minutes (annealing). To remove non-specifically binding RNA, tRNA (E. coli total tRNA (manufactured by Boehringer-Mannheim)) was added as a competitor, followed by the target HA protein. The HA proteins used for selection as targets are A / California / 04/2009 (H1N1), A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2). Table 1 shows the molecular ratio of RNA, protein, and tRNA used in each sorting cycle.
これらの混合液、50μLを室温で10分間インキュベートした後、”Pop-top”フィルターホルダー（Nucleopore社製）に装着した湿潤済みニトロセルロース・アセテート・フィルター（HA WPフィルター,0.45μm,径13.0mm,Millipore）に通し、タンパク質に結合したRNAをフィルター上に捕捉させて、フィルターを1mlの結合用緩衝液で洗浄した。フィルター上に残留したタンパク質結合RNAは溶出用緩衝液（0.01M HEPES,0.15M NaCl,7M Urea,pH7.4）で回収し、エタノールで沈殿精製後、50mM Tris-HCl（pH8.3）,50mM KCl,10mM MgCl2,0.5mM Spermidine,10mM DTT,0.4μMプライマー（配列番号３）,0.4mM dNTPs,25U AMV逆転写酵素（Wako社製）を含む20μlの反応液中で逆転写した。dNTPsと逆転写酵素は、変性及びアニーリングステップ（95℃で2分間処理後、室温で5分間インキュベート）の後、加えた。逆転写は37℃で45分間行った。 After incubating 50 μL of these mixtures at room temperature for 10 minutes, a wet nitrocellulose acetate filter (HA WP filter, 0.45 μm, diameter 13.0 mm, attached to a “Pop-top” filter holder (manufactured by Nucleopore), Millipore), protein bound RNA was captured on the filter and the filter was washed with 1 ml binding buffer. The protein-bound RNA remaining on the filter is recovered with an elution buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 7 M Urea, pH 7.4), purified by precipitation with ethanol, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM Reverse transcription was carried out in a 20 μl reaction solution containing KCl, 10 mM MgCl 2 , 0.5 mM Spermidine, 10 mM DTT, 0.4 μM primer (SEQ ID NO: 3), 0.4 mM dNTPs, 25 U AMV reverse transcriptase (manufactured by Wako). dNTPs and reverse transcriptase were added after the denaturation and annealing steps (treatment at 95 ° C. for 2 minutes and incubation at room temperature for 5 minutes). Reverse transcription was performed at 37 ° C. for 45 minutes.
＜表１＞
<Table 1>
得られたcDNAはPCRにより増幅され、次の選別ラウンドにおけるRNAを得るための鋳型として用いられた。PCRによる増幅のために、逆転写後の混合液（cDNA反応液）20μlを80μlのPCR用混合液（PrimeSTAR Max Premix(TaKaRa社製),1μMプライマー,1μMプライマー）で希釈した。反応液は95℃で30秒間加熱後、95℃、15秒；-54℃、10秒；-72℃、10秒のサイクルを、適正サイズで産物のバンドが得られるまでの回数（12-18サイクル）繰り返した。得られたPCR産物はエタノールで沈殿させて転写に用いた。試験管内転写反応はT7 Ampliscribeキットを用いて、37℃、3時間またはオーバーナイトで行った。RNA合成とDNase I処理の後、反応液を8％変性ポリアクリルアミドゲルで分画した。RNAをゲルから抽出し、エタノール沈殿により精製した後に定量し、次回の選別及び増幅サイクルに用いた。 The obtained cDNA was amplified by PCR and used as a template for obtaining RNA in the next selection round. For amplification by PCR, 20 μl of the mixed solution (cDNA reaction solution) after reverse transcription was diluted with 80 μl of PCR mixed solution (PrimeSTAR Max Premix (TaKaRa), 1 μM primer, 1 μM primer). The reaction solution was heated at 95 ° C for 30 seconds, and then subjected to a cycle of 95 ° C, 15 seconds; -54 ° C, 10 seconds; -72 ° C, 10 seconds until a product band was obtained at an appropriate size (12-18 Cycle). The obtained PCR product was precipitated with ethanol and used for transcription. In vitro transcription reactions were performed at 37 ° C. for 3 hours or overnight using the T7 Ampliscribe kit. After RNA synthesis and DNase I treatment, the reaction mixture was fractionated on an 8% denaturing polyacrylamide gel. RNA was extracted from the gel, purified by ethanol precipitation, quantified and used for the next selection and amplification cycle.
（１−３）選別及び増幅サイクル
以下においては、HAタンパク質に対する特異性と高い親和性を有するRNAを得るために、各選別サイクルを行った。表１に示したようにRNAとタンパク質比、コンペティター濃度は各選別サイクルごとに修正した。
非特異的に結合するRNAの濃縮を避けるために、第２、第４、第６及び第８の各選別サイクルでは、フィルターではなく96穴タイタープレート（Xenobind plate;xenopore社製）を使用した。Xenobind選別のために、最初に結合用緩衝液1mlあたり上記HAタンパク質10μgで各ウェルをコートし、残りの部分をBSA(0.1％ stock solution)でブロックした。次いで、各ウェルを洗浄し、選別に使用した。
(1-3) Selection and Amplification Cycle In the following, each selection cycle was performed in order to obtain RNA having specificity and high affinity for HA protein. As shown in Table 1, the RNA to protein ratio and competitor concentration were corrected for each selection cycle.
In order to avoid concentration of non-specifically binding RNA, 96-well titer plates (Xenobind plate; manufactured by xenopore) were used instead of filters in the second, fourth, sixth and eighth sorting cycles. For Xenobind selection, each well was first coated with 10 μg of the HA protein per ml of binding buffer, and the remaining portion was blocked with BSA (0.1% stock solution). Each well was then washed and used for sorting.
前のサイクルで得たRNAプールを、結合用緩衝液中で95℃、2分間変性させた。続いて、室温で10分間冷却した後、tRNAを加え、HAタンパク質でコートされたウェルに充填した。10分間インキュベートした後、結合用緩衝液400μl（第６及び第８回目の選別サイクルでは1mL）で洗浄し、未吸着のRNAを除いた。その後、タンパク質結合RNAを、加熱した溶出用緩衝液（0.01M HEPES,0.15M NaCl,7M Urea,pH7.4）で回収し、エタノールで沈殿精製後、逆転写、PCR及びインビトロにおける転写により再生した。 The RNA pool obtained in the previous cycle was denatured in binding buffer at 95 ° C. for 2 minutes. Subsequently, after cooling at room temperature for 10 minutes, tRNA was added and filled into wells coated with HA protein. After incubating for 10 minutes, it was washed with 400 μl of binding buffer (1 mL in the sixth and eighth selection cycles) to remove unadsorbed RNA. Subsequently, the protein-bound RNA was recovered with a heated elution buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 7 M Urea, pH 7.4), purified by precipitation with ethanol, and regenerated by reverse transcription, PCR and in vitro transcription. .
高親和性のアプタマーが濃縮されていく進行状況とその特異性を評価するため、第４回目の選別サイクルと第８回目の選別サイクルにおけるRNAプールの結合活性をフィルター結合定量法で解析した。[α-32P]ATPを使用して放射性標識（ラベル）したRNAを調製し、以前報告した方法（非特許文献３，４，５）に従ってフィルター結合分析を行った。結合反応では、モル濃度で10倍過剰の大腸菌tRNAを非特異的競争阻害剤として加え、RNAとHAタンパク質を1対4のモル比で混合し結合させた後、フィルターを通した。フィルターは1mlの上記結合用緩衝液で洗浄し、空気中で乾燥し、フィルターに残留した標識RNAの放射活性を画像解析装置（BAS2500,富士フイルム社製）で定量した。結合活性は、反応液に入れたRNA全量の内、フィルター結合したRNA量のパーセンテージで表した（図１）。第８回目の選別サイクル後のフィルターに捕捉されたRNAの割合は、A/California/04/2009(H1N1)のHAタンパク質をターゲットとした場合、HAタンパク質濃度400nM及び800nMにおいて、48％及び49％、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質をターゲットとした場合、HAタンパク質濃度100nM及び200nMにおいて21％及び33％、さらに、A/HongKong/1073/1999(H9N2)の場合では、HAタンパク質濃度100nM及び200nMにおいて12％及び15％であった。 In order to evaluate the progress of the high-affinity aptamer enrichment and its specificity, the binding activity of the RNA pool in the 4th and 8th sorting cycles was analyzed by a filter binding assay. Radiolabeled (labeled) RNA was prepared using [α- 32 P] ATP, and a filter binding analysis was performed according to a previously reported method (Non-Patent Documents 3, 4, and 5). In the binding reaction, a 10-fold excess of E. coli tRNA at a molar concentration was added as a nonspecific competitive inhibitor, RNA and HA protein were mixed and bound at a molar ratio of 1: 4, and then passed through a filter. The filter was washed with 1 ml of the above binding buffer, dried in air, and the radioactivity of the labeled RNA remaining on the filter was quantified with an image analyzer (BAS2500, manufactured by Fuji Film). The binding activity was expressed as a percentage of the amount of RNA bound to the filter out of the total amount of RNA added to the reaction solution (FIG. 1). The ratio of RNA captured by the filter after the 8th selection cycle is 48% and 49% at the HA protein concentration of 400 nM and 800 nM when targeting the HA protein of A / California / 04/2009 (H1N1). When targeting the HA protein of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), 21% and 33% at HA protein concentrations of 100 nM and 200 nM, and in the case of A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) 12% and 15% at protein concentrations of 100 nM and 200 nM.
（１−４）アプタマーの分析
個別のアプタマーを得るために、第１０回目の選別サイクルで得たPCR産物をTAクローニング・ベクター（Invitrogen社製）に導入し、サブクローニングした後、大腸菌にトランスフォームした。プラスミドDNAの個々のクローンをプラスミド精製キット（Promega社製）で単離し、DNA塩基配列をDye Terminator Sequencing kit（Applied Biosystems Inc.社製）とDNAシークエンサー（Model 373A,Applied Biosystems Inc.社製）を用いて配列を解読し、そのDNA塩基配列に相当するRNA塩基配列を求めた。配列が解読されたRNAのクローンは配列によって幾つかのクラスに分類された。
(1-4) Aptamer Analysis In order to obtain individual aptamers, the PCR product obtained in the 10th selection cycle was introduced into a TA cloning vector (Invitrogen), subcloned, and then transformed into Escherichia coli. . Individual clones of plasmid DNA are isolated using a plasmid purification kit (Promega), and the DNA base sequence is determined using a dye terminator sequencing kit (Applied Biosystems Inc.) and a DNA sequencer (Model 373A, Applied Biosystems Inc.). The sequence was deciphered by using it, and the RNA base sequence corresponding to the DNA base sequence was determined. RNA clones whose sequences were decoded were classified into several classes according to their sequences.
A/California/04/2009(H1N1)をターゲットとして選別されたRNAの塩基配列は、３つの主要なクラスに分類された。このうち、アプタマーD12（配列番号４）は、全体の19％を占めるクラス２に分類され、また、アプタマーD26（配列番号５）は、全体の9％を占めるクラス３に分類された。二次構造解析ソフト「BayesFold」（version 1.01、http://bayes.colorado.edu/Bayes/上で解析可能）を用いて得られたアプタマーの二次構造予測を行ったところ、それぞれ異なる二次構造の形成が予測された（図２）。 RNA base sequences selected for A / California / 04/2009 (H1N1) as targets were classified into three major classes. Among these, the aptamer D12 (SEQ ID NO: 4) was classified into class 2 occupying 19% of the whole, and the aptamer D26 (SEQ ID NO: 5) was classified into class 3 occupying 9% of the whole. Secondary structure prediction of aptamers obtained using secondary structure analysis software “BayesFold” (version 1.01, can be analyzed on http://bayes.colorado.edu/Bayes/) Formation of the structure was predicted (FIG. 2).
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとして選別されたRNAの塩基配列は、大きく３つのクラスに分類された。クラス1は、全体の42.9％を占め、配列番号６で示す塩基配列を得た（アプタマー8-3）。また、クラス２は全体の25.7％、クラス３は11.4％を占め、各塩基配列を、アプタマー8-1（配列番号７）及び8-10（配列番号８）とした。BayesFoldを用いてアプタマー8-1、8-3、及び8-10の二次構造予測を行ったところ、それぞれ異なる二次構造の形成が予測された（図３）。 The base sequences of RNA selected with A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) as the target were roughly classified into three classes. Class 1 accounted for 42.9% of the total, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 was obtained (aptamer 8-3). Class 2 accounted for 25.7% and class 3 accounted for 11.4%. Aptamers 8-1 (SEQ ID NO: 7) and 8-10 (SEQ ID NO: 8) were used as the base sequences. When the secondary structures of aptamers 8-1, 8-3, and 8-10 were predicted using BayesFold, formation of different secondary structures was predicted (FIG. 3).
A/HongKong/1073/1999(H9N2)をターゲットとして選別されたRNAの塩基配列は、３つの主要なクラスを含み、このうち最も大きい割合を占めたクラス1は、全体の26.5％であり、この塩基配列をアプタマー10-1（配列番号９）とした。BayesFoldを用いてアプタマー10-1の二次構造予測を行ったところ、図４に示す二次構造が得られた。 The base sequence of RNA selected with A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) as the target includes three major classes. Of these, class 1 accounted for the largest proportion, accounting for 26.5% of the total. The base sequence was designated as aptamer 10-1 (SEQ ID NO: 9). When the secondary structure of the aptamer 10-1 was predicted using BayesFold, the secondary structure shown in FIG. 4 was obtained.
（実施例２） フィルター結合定量法によるアプタマーと各ターゲットHAタンパク質との親和性解析
実施例１で選別されたアプタマーとHAタンパク質との結合効率をフィルター結合定量法（非特許文献２に記載の方法による。）によって求めた。
(Example 2) Affinity analysis between aptamer and each target HA protein by filter binding quantification method The binding efficiency between the aptamer selected in Example 1 and the HA protein is determined by the filter binding quantification method (the method described in Non-Patent Document 2). ).
A/California/04/2009(H1N1)をターゲットとして選別されたアプタマーD12及びD26は、A/California/04/2009(H1N1)のHAタンパク質濃度に依存した結合がみられた。HAタンパク質濃度100nM及び200nMにおける、フィルターに捕捉されたRNAの割合は、D12が40％及び58％、D26が39％及び66％であった（図５）。 Aptamers D12 and D26 selected with A / California / 04/2009 (H1N1) as the target showed binding depending on the HA protein concentration of A / California / 04/2009 (H1N1). At the HA protein concentrations of 100 nM and 200 nM, the ratios of RNA trapped on the filter were 40% and 58% for D12 and 39% and 66% for D26 (FIG. 5).
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとして選別されたアプタマー8-1、8-3及び8-10はA/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質濃度に依存した結合がみられた。HAタンパク質濃度100nM及び200nMにおける、フィルターに捕捉されたRNAの割合は、8-1が12％及び25％、8-3が13％及び25％、8-10が23％及び41％であった（図６）。 Aptamers 8-1, 8-3 and 8-10 selected with A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) as the target showed binding depending on the HA protein concentration of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1). It was. At the HA protein concentrations of 100nM and 200nM, the percentage of RNA captured by the filter was 12% and 25% for 8-1, 13% and 25% for 8-3, 23% and 41% for 8-10. (FIG. 6).
A/HongKong/1073/1999(H9N2)をターゲットとして選別されたアプタマー10-1はA/HongKong/1073/1999(H9N2)のHAタンパク質濃度に依存した結合がみられ、HAタンパク質濃度100nM及び200nMにおける、フィルターに捕捉されたRNAの割合は、それぞれ4％及び9％であった（図７）。 Aptamer 10-1 selected with A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) as a target showed binding depending on the HA protein concentration of A / HongKong / 1073/1999 (H9N2), at HA protein concentrations of 100 nM and 200 nM The percentages of RNA captured by the filter were 4% and 9%, respectively (FIG. 7).
（実施例３） BiacoreT100による各アプタマーとターゲットHAタンパク質との相互作用解析
実施例１で選別されたアプタマーとHAタンパク質との親和性や特異性をBiacoreT100（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）によって測定した。
(Example 3) Analysis of interaction between each aptamer and target HA protein by BiacoreT100 The affinity and specificity between the aptamer selected in Example 1 and HA protein were measured by BiacoreT100 (manufactured by GE Healthcare Biosciences). .
HBS-P+緩衝液（0.01M HEPES,0.15M NaCl,0.05％ v/v Surfactant P20,pH7.4）に溶解した5μMのビオチン化オリゴdT（24ヌクレオチド長）[5'-(dT)24-3']を、ストレプトアビジンでコートされたセンサーチップ（Series S Sensor Chip SA Certified,GEヘルスケアバイオサイエンス社製）に流速10μl/minで、2分間添加し、固定化を行った。次いで、3'-端に24ヌクレオチド長のオリゴ・アデニン（A）を延長させたアプタマー(30-60μM）を流速2μl/minで10分間添加し、オリゴdTに結合させた。 5 μM biotinylated oligo dT (24 nucleotides long) [5 '-(dT) 24 -3 dissolved in HBS-P + buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05% v / v Surfactant P20, pH 7.4) '] Was added to a sensor chip coated with streptavidin (Series S Sensor Chip SA Certified, manufactured by GE Healthcare Biosciences) at a flow rate of 10 μl / min for 2 minutes for immobilization. Subsequently, an aptamer (30-60 μM) in which oligo-adenine (A) having a length of 24 nucleotides at the 3′-end was extended was added at a flow rate of 2 μl / min for 10 minutes to bind to oligo dT.
上記のSAチップへ0.2-40nMの濃度範囲のHAタンパク質溶液を流速30μl/minで2分間添加し、固定化されたアプタマーとの相互作用解析を行った。 An HA protein solution having a concentration range of 0.2-40 nM was added to the above SA chip at a flow rate of 30 μl / min for 2 minutes, and an interaction analysis with the immobilized aptamer was performed.
A/California/04/2009(H1N1)をターゲットとして選別されたアプタマーD12及びD26はA/California/04/2009(H1N1)のHAタンパク質濃度に依存した結合が見られ、いずれも高い親和性を示した（図８）。 Aptamers D12 and D26 selected for A / California / 04/2009 (H1N1) as a target showed binding depending on the HA protein concentration of A / California / 04/2009 (H1N1), and both showed high affinity. (FIG. 8).
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとして選別されたアプタマー8-1、8-3、及び8-10は、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質濃度に依存した結合が見られ、いずれも高い親和性を示した（図９）。 Aptamers 8-1, 8-3, and 8-10 selected with A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) as a target have binding depending on the HA protein concentration of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1). All of them showed high affinity (FIG. 9).
さらに、アプタマー8-1、8-3、及び8-10は、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)と同じ亜型に属するA/Indonesia/05/2005(H5N1)（図１０）及びA/Anhui/1/2005(H5N1)にもまた結合することが確認された。 Furthermore, aptamers 8-1, 8-3, and 8-10 are A / Indonesia / 05/2005 (H5N1) belonging to the same subtype as A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) (FIG. 10) and A / It was also confirmed to bind to Anhui / 1/2005 (H5N1).
A/HongKong/1073/1999(H9N2)をターゲットとして選別されたアプタマー10-1は、A/HongKong/1073/1999(H9N2)のHAタンパク質濃度に依存した結合が見られ、高い親和性を示した（図１１）。 Aptamer 10-1 selected with A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) as the target showed high affinity with binding depending on the HA protein concentration of A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) (FIG. 11).
また、各アプタマーの結合は、糖鎖を除去していないHAタンパク質に対しても糖鎖を除去したHAタンパク質に対してもほぼ同等の親和性を示したので、HAタンパク質の糖鎖はこのRNAアプタマーとの結合には関与していないことが示された。
本研究において選別されたアプタマーの種類と各ターゲットとの解離定数(Kd)値は表２に示す通りである。
In addition, the binding of each aptamer showed almost the same affinity for the HA protein from which the sugar chain was not removed as well as the HA protein from which the sugar chain was removed. It was shown not to be involved in the binding with aptamer.
Table 2 shows the types of aptamers selected in this study and the dissociation constant (Kd) values of each target.
＜表２＞
<Table 2>
（実施例４） BiacoreT100による各アプタマーの特異性解析
（４−１）異なる亜型との相互作用解析
選別されたアプタマーと、そのターゲットとは異なる亜型のHAタンパク質との相互作用を調べるために、BiacoreT100を利用して解析を行った（表３）。
(Example 4) Specificity analysis of each aptamer by BiacoreT100
(4-1) Interaction analysis with different subtypes In order to investigate the interaction between the selected aptamer and the HA protein of a subtype different from the target, analysis was performed using BiacoreT100 (Table 3). ).
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとして選別されたアプタマー8-3と、ターゲットとは異なる亜型のHAタンパク質との相互作用を調べたところ、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Netherlands/219/2003(H7N7)及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)に対しては、結合しないか、結合したとしてもごくわずかであった。一方、A/California/04/2009(H1N1)に対しては親和性を示したものの、そのKd値は30nMであり、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対するKd値、50pMの600倍であった。すなわち、A/California/04/2009 (H1N1)への親和性は、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対するよりも600分の１程度であることが示された。 The interaction between aptamer 8-3 selected with A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) as the target and HA protein of a subtype different from the target was examined. A / NewYork / 55/2004 (H3N2) , A / Netherlands / 219/2003 (H7N7) and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) were not or very little if any. On the other hand, although it showed affinity for A / California / 04/2009 (H1N1), its Kd value is 30 nM, Kd value for A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), 600 times 50 pM. there were. That is, it was shown that the affinity for A / California / 04/2009 (H1N1) is about 1/600 that of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1).
同様に、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)をターゲットとして選別されたアプタマー8-1及び8-10は、A/California/04/2009(H1N1)、A/NewYork/55/2004(H3N2)A/Netherlands/219/2003(H7N7)及びA/HongKong/1073/1999(H9N2)には結合しないか、結合したとしてもごくわずかであった。 Similarly, aptamers 8-1 and 8-10 selected with A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) as the target are A / California / 04/2009 (H1N1), A / NewYork / 55/2004 (H3N2). It did not bind to A / Netherlands / 219/2003 (H7N7) and A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) or very little if any.
A/HongKong/1073/1999(H9N2)をターゲットとして選別されたアプタマー10-1は、ターゲットとは異なる亜型、A/California/04/2009(H1N1)、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)、A/ Indonesia/05/2005(H5N1)及びA/Netherlands/219/2003(H7N7)のいずれにも結合能を示さなかった。
＜表３＞
Aptamer 10-1 selected with A / HongKong / 1073/1999 (H9N2) as the target is a subtype different from the target, A / California / 04/2009 (H1N1), A / NewYork / 55/2004 (H3N2) A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1), A / Indonesia / 05/2005 (H5N1) and A / Netherlands / 219/2003 (H7N7) showed no binding ability.
<Table 3>
（４−２）異なる株との相互作用解析
選別されたアプタマーと、そのターゲットとは異なる株のHAタンパク質との相互作用を調べるために、BiacoreT100を利用して解析を行った。
A/California/04/2009(H1N1)をターゲットとして選別されたアプタマーD12及びD26と、それらのターゲットと同じ亜型（H1N1）に属し、異なる株であるA/New Caledonia/20/1999(H1N1)とA/Brevig mission/1/1918(H1N1)のHAタンパク質との相互作用解析を行った。その結果、アプタマーD12及びD26は、同じ亜型であってもA/New Caledonia/20/1999(H1N1)とA/Brevig mission/1/1918(H1N1)には結合せず、株間のわずかな変異も識別できることが示された（表４）。
＜表４＞
(4-2) Analysis of Interaction with Different Strains In order to examine the interaction between the selected aptamer and the HA protein of a strain different from the target, analysis was performed using BiacoreT100.
Aptamers D12 and D26 selected with A / California / 04/2009 (H1N1) as the target, and A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) which belong to the same subtype (H1N1) as those targets and are different strains And interaction analysis of A / Brevig mission / 1/1918 (H1N1) with HA protein. As a result, aptamers D12 and D26 do not bind to A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1) and A / Brevig mission / 1/1918 (H1N1) even if they are the same subtype, and there is a slight variation between strains. Were also identified (Table 4).
<Table 4>
（実施例５） 短鎖化アプタマーの作製
実施例１で選別を行った各アプタマーは74ヌクレオチドの長さを持つが、合成コストの面や様々な解析のためにはより短い方が有用であるので、HAタンパク質への結合を保持したまま、より短いアプタマーの誘導体を作製することを目標とした。本発明においてはアプタマー8-3を短鎖化して、アプタマー8-3Sを作製した。
アプタマー8-3（配列番号６）の48-91塩基の3’末端に“C”の１塩基を加えた45merの短鎖化アプタマー8-3S：5’-GGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCC-3’(配列番号１０、図１２)を、以下のテンプレートとプライマーを用いてPCR、インビトロ転写反応により調製した。
(Example 5) Preparation of shortened aptamer Each aptamer selected in Example 1 has a length of 74 nucleotides, but the shorter one is useful for the cost of synthesis and various analyses. Therefore, we aimed to produce shorter aptamer derivatives while retaining binding to the HA protein. In the present invention, aptamer 8-3 was shortened to prepare aptamer 8-3S.
Aptamer 8-3 (SEQ ID NO: 6) 48-91 base 3 'end of 45-mer short aptamer 8-3S added with one base of "C": 5'-GGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCC-3' (SEQ ID NO: 10, FIG. 12) was prepared by PCR and in vitro transcription reaction using the following template and primers.
・テンプレート：5’-GGAGCTCAGCCTTCACTGCGAGATTGTTCTGACCGAGTTGCCTAGCAGGGCAACCGCTGGAACTTGAAGTCGGTAATGCGAGCGGAAAGCCTTGGCACCACGGTCGGATCCAC-3’（配列番号１１）
・プライマー8-3S-F：
5’-AGTAATACGACTCACTATAGGGCAACCGCTGGAACTTGAA-3’（配列番号１２）
・プライマー8-3S-R：
5’-GGGCTTTCCGCTCGCATTAC-3’（配列番号１３）
-Template: 5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGCGAGATTGTTCTGACCGAGTTGCCTAGCAGGGCAACCGCTGGAACTTGAAGTCGGTAATGCGAGCGGAAAGCCTTGGCACCACGGTCGGATCCAC-3 '(SEQ ID NO: 11)
・ Primer 8-3S-F:
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGCAACCGCTGGAACTTGAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
・ Primer 8-3S-R:
5'-GGGCTTTCCGCTCGCATTAC-3 '(SEQ ID NO: 13)
得られたPCR産物はエタノール沈殿で精製させた後、T7 Ampliscribeキットを用いて、37℃、3時間またはオーバーナイトでインビトロ転写反応を行った。RNA合成とDNaseI処理の後、反応液を8％変性ポリアクリルアミドゲルで分画した。RNAをゲルから抽出し、エタノール沈殿により精製した。 The obtained PCR product was purified by ethanol precipitation, and then an in vitro transcription reaction was performed at 37 ° C. for 3 hours or overnight using a T7 Ampliscribe kit. After RNA synthesis and DNaseI treatment, the reaction solution was fractionated on an 8% denaturing polyacrylamide gel. RNA was extracted from the gel and purified by ethanol precipitation.
（実施例６） BiacoreT100による短鎖化アプタマー8-3SとA/Vietnam/1203/2004(H5N1)との相互作用解析
実施例５で得られたアプタマー8-3Sについて、実施例３と同様にして、BiacoreT100により、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質との相互作用を測定した。
図１３に示すように、アプタマー8-3Sは、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質に対して、そのタンパク質量に依存した結合が見られた。また、フィルター結合定量法によっても同様の結果を得た。このことから、短縮化アプタマー8-3Sが、A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)のHAタンパク質に対し、高い親和性を維持していることが示された。
(Example 6) Analysis of interaction between short aptamer 8-3S with Biacore T100 and A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) For aptamer 8-3S obtained in Example 5, the same manner as in Example 3 was performed. The interaction of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) with the HA protein was measured by BiacoreT100.
As shown in FIG. 13, aptamer 8-3S was found to bind to the HA protein of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) depending on the protein amount. Similar results were obtained by the filter binding quantitative method. From this, it was shown that the shortened aptamer 8-3S maintained high affinity for the HA protein of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1).
（実施例７） アプタマー8-3Sの安定化
より安定なアプタマーを得るため、アプタマー8-3Sのシチジンの2’-OH 基を、転写工程において2’-フルオロ基(2’-F)で修飾されるよう調製した（アプタマー8-3S-2’FCとする）。
実施例５と同様の方法でPCRを実施し、得られたdsDNAを、T7 Durascribe kit (Epicentre Technologies社製)を使用して、３７℃、オーバーナイトでインキュベーションを行い、インビトロ転写により安定なRNAに変換した。次いで、精製されたアプタマー8-3S-2’FCとA/Vietnam/1203/2004(H5N1)のHAタンパク質との相互作用解析をBiacoreT100を用いて行った。
A/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対するアプタマー8-3S-2’FCの親和性は8-3Sとほぼ同程度の値を示した（図１４）。すなわち、アプタマー8-3S-2’FCはA/Vietnam/1203/2004(H5N1)に対する結合能を維持していることが示された。
(Example 7) Stabilization of aptamer 8-3S To obtain a more stable aptamer, the 2'-OH group of cytidine of aptamer 8-3S was modified with a 2'-fluoro group (2'-F) in the transcription step. (Referred to as aptamer 8-3S-2′FC).
PCR was performed in the same manner as in Example 5, and the obtained dsDNA was incubated overnight at 37 ° C. using T7 Durascribe kit (manufactured by Epicentre Technologies), and converted into stable RNA by in vitro transcription. Converted. Subsequently, interaction analysis between the purified aptamer 8-3S-2′FC and the HA protein of A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) was performed using Biacore T100.
The affinity of the aptamer 8-3S-2′FC for A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1) was almost the same as that of 8-3S (FIG. 14). That is, it was shown that the aptamer 8-3S-2′FC maintains the binding ability to A / Vietnam / 1203/2004 (H5N1).
（実施例８） アプタマーD12、D26の安定化
実施例７と同様にアプタマーD12及びD26の安定化を行った。D12及びD26に対しては、シチジン及びウリジンの2’-OH基を2’-フルオロ基で修飾した（アプタマーD12-2’FC&U及びD26-2’FC&Uとする）。
PCRには、選別に用いた配列番号２のプライマーとオリゴdTを持つ配列番号３のプライマーを使用した。得られたdsDNAを、T7 Durascribe kitを使用して、３７℃、オーバーナイトでインキュベーションを行い、インビトロ転写により安定なRNAに変換した。次いで、精製されたアプタマーD12-2’FC&U及びD26-2’FC&Uと、A/California/04/2009(H1N1)のHAタンパク質との相互作用解析をBiacoreT100を用いて行った。
アプタマーD12-2’FC&U及びD26-2’FC&UはいずれもA/California/04/2009(H1N1)に対する結合能を維持していた（図１５）。
(Example 8) Stabilization of aptamers D12 and D26 Aptamers D12 and D26 were stabilized in the same manner as in Example 7. For D12 and D26, the 2′-OH groups of cytidine and uridine were modified with 2′-fluoro groups (referred to as aptamers D12-2′FC & U and D26-2′FC & U).
For PCR, the primer of SEQ ID NO: 2 used for selection and the primer of SEQ ID NO: 3 having oligo dT were used. The obtained dsDNA was incubated overnight at 37 ° C. using a T7 Durascribe kit, and converted to stable RNA by in vitro transcription. Next, interaction analysis between the purified aptamers D12-2′FC & U and D26-2′FC & U and the HA protein of A / California / 04/2009 (H1N1) was performed using BiacoreT100.
Both aptamers D12-2′FC & U and D26-2′FC & U maintained binding ability to A / California / 04/2009 (H1N1) (FIG. 15).
１．（配列番号１）RNAランダムプール用テンプレート：
5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGC-（N）74-GGCACCACGGTCGGATCCAC-3'
２．（配列番号２）RNAランダムプール用5’末端プライマー：
5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC-3'
３．（配列番号３）RNAランダムプール用3’末端プライマー：
5'-GTGGATCCGACCGTGGTGCC-3'
４．（配列番号４）アプタマーD12：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCAAAGUGCGAGGCAGUGUGGUGCUGUCCUACGAGUUCUAAAGUUCGUUAGGAAGGCAGCUCAACAUGUUUAACAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
５．（配列番号５）アプタマーD26：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCAAAAAGUUAGGCCAGCAAAUUGCGAGCUGAUCCGGUGACUGGCUACAGGAGGCCUUGUCCACGGCCGUAUUGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
６．（配列番号６）アプタマー8-3：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGAGAUUGUUCUGACCGAGUUGCCUAGCAGGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCUUGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
７．（配列番号７）アプタマー8-1：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCUGUUAGAGUUUCCUAAAAGCGAACUGGCGCCCUCGUCAGCAUCUGGCAGACGAGUGGAGACGGACUAACCACAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
８．（配列番号８）アプタマー8-10：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGGUGACCGGAGGAAUACGCGGACGGAGAAAGGGUUGGCCUCGUGGAUGGCGGAUACCCGUCCAGGGAUCUUCUAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
９．（配列番号９）アプタマー10-1：
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGAACCUCGGAUUGUCUGACCAUGCUCAAGGCGGCGGGCCAGCCAUGGCCAUUCCCUGAAUUAGUGGAAACCUUAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3’
１０．(配列番号１０)短鎖化アプタマー8-3S：
5’-GGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCC-3’
１１．（配列番号１１）短鎖化アプタマー8-3S用テンプレート：5’-GGAGCTCAGCCTTCACTGCGAGATTGTTCTGACCGAGTTGCCTAGCAGGGCAACCGCTGGAACTTGAAGTCGGTAATGCGAGCGGAAAGCCTTGGCACCACGGTCGGATCCAC-3’
１２．（配列番号１２）プライマー8-3S-F：
5’-AGTAATACGACTCACTATAGGGCAACCGCTGGAACTTGAA-3’
１３．（配列番号１３）プライマー8-3S-R：
5’-GGGCTTTCCGCTCGCATTAC-3’
1. (SEQ ID NO: 1) RNA random pool template:
5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGC- (N) 74 -GGCACCACGGTCGGATCCAC-3 '
2. (SEQ ID NO: 2) 5 ′ end primer for RNA random pool:
5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC-3 '
3. (SEQ ID NO: 3) 3 ′ end primer for RNA random pool:
5'-GTGGATCCGACCGTGGTGCC-3 '
4). (SEQ ID NO: 4) Aptamer D12:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCAAAGUGCGAGGCAGUGUGGUGCUGUCCUACGAGUUCUAAAGUUCGUUAGGAAGGCAGCUCAACAUGUUUAACAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
5. (SEQ ID NO: 5) Aptamer D26:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCAAAAAGUUAGGCCAGCAAAUUGCGAGCUGAUCCGGUGACUGGCUACAGGAGGCCUUGUCCACGGCCGUAUUGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
6). (SEQ ID NO: 6) Aptamer 8-3:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGAGAUUGUUCUGACCGAGUUGCCUAGCAGGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCUUGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
7). (SEQ ID NO: 7) Aptamer 8-1:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCCUGUUAGAGUUUCCUAAAAGCGAACUGGCGCCCUCGUCAGCAUCUGGCAGACGAGUGGAGACGGACUAACCACAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
8). (SEQ ID NO: 8) Aptamer 8-10:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGGUGACCGGAGGAAUACGCGGACGGAGAAAGGGUUGGCCUCGUGGAUGGCGGAUACCCGUCCAGGGAUCUUCUAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
9. (SEQ ID NO: 9) Aptamer 10-1:
5'-GGAGCUCAGCCUUCACUGCGAACCUCGGAUUGUCUGACCAUGCUCAAGGCGGCGGGCCAGCCAUGGCCAUUCCCUGAAUUAGUGGAAACCUUAGGCACCACGGUCGGAUCCAC-3 '
10. (SEQ ID NO: 10) Short-chain aptamer 8-3S:
5'-GGGCAACCGCUGGAACUUGAAGUCGGUAAUGCGAGCGGAAAGCCC-3 '
11. (SEQ ID NO: 11) Short-chain aptamer 8-3S template: 5'-GGAGCTCAGCCTTCACTGCGAGATTGTTCTGACCGAGTTGCCTAGCAGGGCAACCGCTGGAACTTGAAGTCGGTAATGCGAGCGGAAAGCCTTGGCACCACGGTCGGATCCAC-3 '
12 (SEQ ID NO: 12) Primer 8-3S-F:
5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGCAACCGCTGGAACTTGAA-3 '
13. (SEQ ID NO: 13) Primer 8-3S-R:
5'-GGGCTTTCCGCTCGCATTAC-3 '
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