JP5704916B2 - 肺炎連鎖球菌血清型６ｄ - Google Patents

Description

本発明は、国立衛生研究所 （the National Institutes of Health）によって委託されたコントラクト番号ＡＩ−３００２１およびＡＩ−０３１４７３の下、米国政府支援でなされた。

この出願は、２０００８年５月２８日に出願されたＰＣＴ出願番号ＵＳ０８／０６４９５１ならびに、双方とも２００７年５月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／９２４,７０３号および第６０／９２４,７０４号に関連し、それらの利益を主張する。

本発明は、細菌学、免疫学および疫学に関する。より詳しくは、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ （Streptococcus pneumoniae）の新たに明らかになった血清型ならびに、それらの血清型を同定するのに有用なアッセイおよびモノクローナル抗体に関する。

ストレプトコッカス・ニューモニアエはよく知られたヒト病原体であり、主に幼児および老齢者において、肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症の主たる病因物質である。エス・ニューモニアエ （S. pneumoniae）は、血清学的に明確な炭化水素莢膜の発現に基づき９０の血清型に分類されてきた。莢膜多糖類（ＰＳ）に対する抗体は、同一の莢膜血清型を発現する肺炎連鎖球菌に対抗する保護を提供する。現在入手可能な肺炎連鎖球菌ワクチンは、複数の血清型の莢膜ＰＣの混合物を含有する。例えば、ひとつの肺炎連鎖球菌ワクチン（ＰＳワクチンという。）は、２３種の共通して見出される血清型由来の莢膜ＰＳを含有する。ごく最近開発されたタイプのワクチン（コンジュゲートワクチンという。）は、タンパク分子にコンジュゲートされた７から１３種の血清型由来の莢膜ＰＳを含有する。７価コンジュゲートワクチンは、２０００年に米国で臨床用に導入され、子供および成人における侵襲性肺炎連鎖球菌感染症の発症を減少させてきた。

肺炎連鎖球菌血清型の区分はワクチン効果を評価するのに有用である。理想的には、効果的な肺炎連鎖球菌ワクチンは、ワクチンに含まれる血清型を発現する肺炎連鎖球菌の有病率を減じ、かつ、非ワクチン血清型を発現する肺炎連鎖球菌の有病率はそのままにする。現実には、非ワクチン型の有病率はワクチン血清型を発現するそれらを置き換える程に増加する。さらに、特定の血清型の有病率は未知の理由により経時変化するかもしれない。結果的に、正確かつ効率的な肺炎連鎖球菌単離の血清型分類が肺炎連鎖球菌ワクチンの有効性をモニターするのに重要である。実際に、明らかになった肺炎連鎖球球菌血清型を同定すること、および、より有効な肺炎連鎖球菌ワクチンを製造することには、公衆健康における重大な目的が残っている。

本発明の具体例は、新規かつ新出の肺炎連鎖球菌血清型の同定およびその同定手段を提供する。より詳しくは、本発明は、血清型６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに密に関連する新規肺炎連鎖球菌血清型を提供し、ここでは、それを血清型６Ｄと定義する。

さらなる特徴は、細菌指定 (bacterium designated)ストレプトコッカス・ニューモニアエ6Dの単離培養物を提供する。

もうひとつの具体例は、繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ新規肺炎連鎖球菌莢膜多糖類を提供し、それはエス・ニューモニアエ血清型6Dに対応する。関連する具体例は、新規6D多糖類を含む抗原性組成物を提供する。もうひとつの具体例は、抗体のごとき、血清型6Dまたは血清型6D多糖類に特異的な抗原結合タンパク質に関する。

もうひとつの特徴は、新出肺炎連鎖球菌血清型を同定するのに有用なモノクローナル抗体（mAb）、特に、血清型6Dを識別し、ここでは、mAb Hyp6BM6、mAb Hyp6BM7、およびmAb Hyp6BM8と定義されるモノクローナル抗体を提供する。

図１は、インヒビションＥＬＩＳＡの結果を図示する。肺炎連鎖球菌ライゼートの希釈（Ｘ軸）に対する肺炎連鎖球菌血清型6A-被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合する抗体（Ｙ軸）。ライゼートは、３つの6C単離物（連続線が付された黒塗り記号）、３つの6A単離物（点線が付された白抜き記号）、および２つの6B単離物（破線）を含む。このアッセイに用いた抗体は、Hyp6AG1（パネルＡ）、Hyp6AM3（パネルＢ）、ウサギ・プール血清Ｑ（パネルＣ）およびウサギ「因子6b」血清（パネルＤ）であった。 図２は、様々な肺炎連鎖球菌のオプソニン作用アッセイデータを図示する。測定した生存細菌数を、オプソニン作用アッセイ反応の非常に初期に反応物に添加した細菌の割合として（Ｙ軸）として、オプソノファーゴサイトシス・キリング・アッセイ (an opsonophagocytosis killing assay)に用いるヒト血清の希釈（Ｘ軸）に対してプロットした。このアッセイは、ひとつの6B単離物（白抜き丸）、２つの6A単離物（白抜き四角、白抜き三角）、および７つの6C単離物（破線で結ぶデータポイント）を含む様々な肺炎連鎖球菌を用いた。前記７つの6C単離物は、ブラジル、韓国および米国からのものを含む。 図３は、オプソニン作用力価比較を例示する。6A亜型についてのオプソニン作用力価（Ｙ軸）対6B血清型についてのオプソニン作用力価（Ｘ軸）。丸および三角は、それぞれ、6A（6Aαと表示）または6C（6Aβと表示）についてのオプソニン作用力価を示す。この実験は、ワクチン接種していない２０人の成人（左パネル）またはコンジュゲートワクチン（黒塗り記号）若しくは２３価多糖類ワクチン（白抜き記号）でワクチン接種した２０人の成人（右パネル）からの血清を用いた。各ワクチン群の対象者は１０人であった。このアッセイの検出限界は４であり、検出不能のオプソニン作用力価のサンプルは力価２を有するものとした。一箇所に複数のデータポイントがある場合、データポイント数が分かるように意図的にずらしている。 図４は、様々な肺炎連鎖球菌単離物由来のwciP遺伝子の部分のＤＮＡ配列を表示する（血清型6Cは6Aβと表示）。 図５は、6A単離物（レーン１〜９）および６つの6C（6Aβと表示）単離物（レーン１０〜１５）で得られたＰＣＲ産物を示すアガロースゲルの写真である。２つの「Ｍ］レーンはＤＮＡサイズマーカーを示す。これら２つのレーンは、ゲルの右側の分子が左側の分子よりも速く移動したことを示す。肺炎連鎖球菌ＰＣＲ産物の上下の２つのマーカーバンドは、それぞれ、2.036Kbおよび1.636Kb長である。6Aおよび6Cは、それぞれ、約2Kbおよび1.8Kb長のＰＣＲ産物を生じた。 図６は、単離物AAU9（中央バー）およびST745（２つの部分からなる下部バー）の肺炎連鎖球菌莢膜遺伝子座のwchA、wciN、wciO領域のダイアグラムを示す。比較のため、CR931638（GenBankエントリー）に基づく肺炎連鎖球菌莢膜遺伝子座のwchA、wciN、wciO領域のダイアグラムを上部バーに示す。遺伝子wchA、wciN、およびwciOは、その長さに沿って上部バーの上に表示している。ヌクレオチド配列位置は上部バーの下に示し、ここに示す配列位置１は、CR931638の配列位置4902に対応する。ST745株配列は193塩基対という短さで、この短さは、位置2398と2591との間のギャップで示されている。 図７は、過ヨウ素酸塩処理前後の6A（上部２つのパネル）および6C（6Aβ、下部２つのパネル）由来の莢膜ＰＳの炭化水素比較（パネルＡ）を示す。こららの単糖類は上部クロマトグラムで同定されている。このGLC分析において、単糖類は特徴的な保持時間および相対比率を持つ複数のピークを生じ得る。例えば、ガラクトースは３つのピーク：第１ピーク（低）第２ピーク（最高）、および第３ピーク（中）を有しているはずである。パネルＢは、6A（灰色バー）および6C（6Aβ、黒色バー）に対する各単糖類の規格化ピーク面積を示す。各PS由来のすべての単糖類のピーク面積は、関連するラムノースのピーク面積に対して規格化する。6Cはガラクトースピークを示さないが、6Aが示す２倍のグルコースを示す。 図８は、6A（パネルＡ）および6C（パネルＢ、6Aβと表示）の繰返し単位ならびに娘イオン（それぞれ、パネルCおよびD）の質量スペクトルを図示する。質量電荷比（ｍ／ｚ）は小数点二桁に四捨五入した。 図９は、酸化還元後の6C PSの繰返し単位（パネルＡ）およびそれらの娘イオン（パネルBおよびC）の質量スペクトルを示す。パネルＢに用いたサンプルはNaBH₄で還元し、パネルＣに用いたサンプルはNaBD₄で還元した。質量電荷比（ｍ／ｚ）は小数点２桁で四捨五入した。（パネルBおよびC中の）Ｒ１およびＲ２は、それらのピークが逆方向フラグメンテーションによって誘導されたイオンに対応することを示している。デルタ記号の後の数字は、ピーク間のｍ／ｚ単位差を示し、それらのフラグメントの名前に関連している。パネルＣ中の全ピークはパネルＢ中のピークに対応するが、例外は136.98のピークであり、それはパネルＢには再現されないので、おそらく不純物であろう。 図１０は、6C莢膜多糖類の提唱化学構造およびその開裂生成物の構造を示す。6C繰返し単位の提唱構造はパネルＣに示す。パネルＡおよびＢは、リン酸基がリビトールに結合しているときの、および、リン酸ジエステルがグルコース１の第２炭素に連結しているときの可能性のある分子イオンを示す。パネルＤ、Ｅ、およびＦは、リン酸ジエステルがグルコース１の第２炭素（パネルＤ）、第４炭素（パネルＥ）、または第６炭素（パネルＦ）に連結しているときの、繰返し単位の可能性のある開裂パターンを示す。水和物を示し、水和に関与する残基を括弧で示す。過ヨウ素酸塩感受性部位を太字で示し、開裂生成物をパネルＡおよびＦ中に示す。可能性のある分子イオンを、原子量単位とともに矢印付き点線で示す。GxおよびGyは可能性のあるグルコース１フラグメントであり、Ｒｘは、酸化還元反応後の残ったリボースフラグメントである。それらの原子量単位を括弧で示す。 図１１は、wciN領域交換実験ダイアグラムを示す：ステップＡにおいて、TIGR6A4のwchA/wciNα/wciO-P領域をカセット１で置換した。カセット１は、３つの部分（中心コアと２つのフランキング領域）を有し、各部分は約１ｋｂ長である。中心コアは抗菌剤感受性遺伝子、kanRおよびrpsL⁺を有する。これら２つのフランキング領域は、AAU33株由来のwchAおよびwciO-P領域からなる。ステップＢにおいて、TIGR6AXのカセット１をカセット２で置換した。カセット２は、6C株由来のwciNβ遺伝子、wchAおよびwciO-P領域（CHPA388、Aβで表示する領域）を有する。TIGR6C4はカセット２が挿入された後で得られる最終産物を示す。PCRプライマーにおけるXbaIおよびBamHI部位は、遺伝子操作を簡単にするために導入され、それらが示されている。 図１２は、6Aおよび6C単離物のwciN領域のＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。このＰＣＲに用いたプライマーは5106および3101であり、それらは、それぞれ、wchAおよびwciO遺伝子中に位置する。Ｍと記されたレーンはＤＮＡラダーを有する。2000および650bpの標準マーカーは左に示された。レーン１〜１３は6C単離物のＰＣＲ産物を含有し、それらは、CHPA37（レーン１）、CHPA388（レーン２）、BG2197（レーン３）、BZ17（レーン４）、BZ39（レーン５）、BZ86（レーン６）、BZ650（レーン７）、KK177（レーン８）、CH66（レーン９）、CH158（レーン１０）、CH199（レーン１１）、MX-67（レーン１２）、およびACA-C21（レーン１３）である。レーン１４〜１８は6A単離物のＰＣＲ産物を含有し、それらは、CHPA67（レーン１４）、CHPA78（レーン１５）、BZ652（レーン１６）、KK58（レーン１７）およびAAU33（レーン１８）である。 図１３は、wciNβ（時には、wciN_6Cという。）ORFのヌクレオチド配列を、wchAの3'末端およびwciO遺伝子の5'末端のヌクレオチド配列と共に示す。wciNβ ORFの可能性のあるアミノ酸配列をそのヌクレオチド配列の下に示す。wchAおよびwciNβの推定終止部位ならびにwciNβおよびwciO遺伝子の推定開始部位も示す。このwciO遺伝子はふたつの可能性のある開始部位を有する。 図１４は、6A株（GenBank CR931638）および6C株（CHPA388）のwciNαおよびwciNβ領域のＤＮＡ配列を示す。wciNの配列の非相同的中央領域（約９００〜１１１０塩基）は示していない。ＰＣＲプライマー（5106、3101、5114、および3113）の部位を示す。wchAおよびwciNβの可能性のある終止部位；ならびにwciNβおよびwciOの可能性のある開始部位も示す。 図１５は、6Aおよび6C単離物のwciN遺伝子を取り巻く莢膜遺伝子座の遺伝子マップを示す。このマップは、wchA（斜線）、wciN（横縞または黒色）、wciO（チェック）、およびwciP（波線）遺伝子を示す。6A座は、２つの予期せぬＤＮＡフラグメント（矢印で示す。）を、wciNα（時には、wciN_6Aという。）遺伝子に対して上流（９５塩基長）または下流（３１２塩基長）に有する。wciO遺伝子の代替的な開始部位は、示された開始部位（6Aについて位置2721）に対して３２塩基上流にある。6C単離物に関して、wciNα領域における旧DNA（1222塩基、横縞の領域）を新DNA（1029塩基、黒色領域）で置換する。この置換により、１１２５塩基を有する新ORF（wciNβと称する）が生じる。 図１６（パネルＡ〜Ｄ）は、6C血清型（単離物CHPA388）莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。 図１７は、肺炎連鎖球菌血清型6A、6B、6C、および6Dの多糖類繰返し単位の化学構造を示す。 図１８は、6A（GenBank CR931638）および6C血清型（株CHPA388）の莢膜遺伝子座を図示する。莢膜合成に関与する全オープンリーディングフレーム（ORF）を横矢印で示し、それらの方向は転写方向を示す。6Aおよび6C座の双方に関して、推定転写部位（屈曲矢印）および推定終止部位（黒塗り丸付き垂直線）を、モルクエスト (molquest)のウェブサイトで入手可能なfgenesB、BPROMおよびFindTerm （Softberry Inc.）を用いて同定した。トランスポゼース配列（「tnp」と表示するブラックボックス）が莢膜遺伝子座の両末端に見られる。２つの莢膜遺伝子座は全く異なるwciN遺伝子（丸で示す）を有する。6A（および6B）血清型のwciN遺伝子はwciNαと表示され、6CのwciNはwciNβと表示される。 図１９は、wciNβ遺伝子交換を用いる6D株の生成を示す概略図である。カセット３のターゲットＤＮＡは、ヤヌスカセットのカナマイシン耐性（kanA^R）（時には、kan^Rという。）かつストレプトマイシン感受性（rpsL⁺）遺伝子を含有する。カセット３の２つのフランキング領域は6B株（株DS2212-94）由来のwchAおよびwciO-P遺伝子を有し、それは、この図に示されるプライマー対を用いるＰＣＲによって得られた。ついで、カセット３の３つのＤＮＡフラグメントを、制限酵素での消化に引き続きT4 DNAリガーゼ（New England BioLabs, Beverly, MA）でのライゲーションによって連結した。ついで、ライゲーション産物を、プライマー5113および3102を用いるＰＣＲによって増幅した。カセット２は、プラマー5113および3102を用いる、CHPA388 （6C株、GenBank登録番号EF538714: 6522.7646）DNAのＰＣＲによって調製した。 図２０は、異なる莢膜ＰＳを含有する細菌上清の種々の希釈物（Ｘ軸）の存在下、6B PS−被覆ＥＬＩＳＡプレートへのモノクローナル抗体の結合（Ｙ軸）を示す。各実験に用いたモノクローナル抗体の名称を各パネルの上部に示している。TIGR6A、TIGR6B（またはTIGR6B4）、TGR6C、およびTIGR6Dは、それぞれ、6A、6B、6C、および6D莢膜ＰＳを産生する。これらの株は、TIGR4の莢膜座を、それぞれ、血清型6A、6B、6C、および6Dの莢膜座で置換することによって調製した。TIGR6BX（または「TIGR6B-JS」）は、wciN遺伝子のないTIGR6Bの変異体を示す。 図２１。パネルＡは、6D莢膜ＰＳの繰返し単位の水和物の構造を示す。理論分子量は７０１ＡＭＵである。パネルＢは、繰返し単位の質量分子量を示す。６８３．３ｍ／ｚおよび７０１．３ｍ／ｚのピークは、それぞれ、繰返し単位の無水物および水和物に対応する。パネルＣは、パネルＢで示される６８３．３ＡＭＵのイオンの娘イオンである。娘イオンはパネルＣの株で同定される。２７０．８２５、５７４．７５８、および６３２．７５６ＡＭＵのピークならびにそれらのサテライトピーク（塩化物同素体のため2AMU離れている）は塩化ナトリウムクラスターを表す。２７０．８２５のピークは（NaCl）₄Cl^-.を表す。５７４．７５８ＡＭＵのピークは、おそらく、別の塩クラスター、有機溶媒分子が付いた塩クラスターのように、水分子が付いた（NaCl）₉Cl^-を表す。６３２．７のピークは、５７４．７５８ＡＭＵのピーク以外のもうひとつのNaCl（すなわち、５８ＡＭＵ）を有する。 図２２は、ＰＳを様々な時間（Ｘ軸）で加水分解した後、ＥＬＩＳＡプレートへのmAbの結合を阻害する種々の莢膜ＰＳ（２mg/ml）の能力（Ｙ軸）を図示する。「力価」は、結合を５０％阻害するのに必要なサンプルの希釈を意味する。6Aおよび6C PSに関して、ＥＬＩＳＡプレートを6A PSで被覆し、mAb Hyp6AG1を用いる。6Bおよび6D PSに関して、ＥＬＩＳＡプレートを6B PSで被覆し、mAb Hyp6BM8を用いる。

本発明は、ここに記載された特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されず、変化することを理解すべきである。ここで用いる用語は特定の具体例を説明するための目的であり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ規定される。

ここにおよび特許請求の範囲において用いられるとき、単数形の「a」、「an」、および「the」は、内容が明確に異ならない限りにおいて、複数形を含むものとする。かくして、例えば、抗体についての言及は、１以上のそうような抗体についての言及であり、当業者に知られているそれらの等価物を含む。具体例において、または異なるように指示がある場合を除き、ここで用いられる成分は反応条件を表すすべての数値は、すべての場合において、「約」なる用語によって修正されると理解されるべきである。示されたすべての特許その他の刊行物は、例えば、本発明と結びついて用いられるであろうそのような刊行物に記載された方法論を記載し開示する目的で、出典明示して明確に本明細書に含まれる。これらの刊行物は、単に、本出願の出願日以前の開示のために提供される。この観点において、発明者らが、先行発明のためまたはその他のいずれかの理由によって、当該開示に対して先の日付を享受しないことを自認したと、理解されるべきではない。その日付についてのすべての言明またはそれらの書類の内容についての表現は、出願人に入手可能な情報に基づくものであり、その日付やそれらの書類の内容の正確さについていかなる自認をするものでもない。

異なって定義しない限り、ここで用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者が共通して理解する内容と同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、いかなる公知の方法、装置および材料を用いることができるが、この観点において、方法、装置および材料をここに記載する。

本発明は、新規多糖類莢膜層を持つストレプトコッカス・ニューモニアエを提供する。簡単には、エス・ニューモニアエの血清群６は２つの血清型を含み、それらは、高度に相同的な莢膜遺伝子座を持つ6Aおよび6Bと名付けられる。近年およびここに記載するように、血清型6Cが同定された。6Aおよび6B莢膜遺伝子座は、一貫して、wciP遺伝子における１つのヌクレオチドで互いに異なる。さらに、6A莢膜遺伝子座はガラクトシルトランスフェラーゼを有するが、6C莢膜遺伝子座はグルコシルトランスフェラーゼを有する。本発明は「6D」と称された新たな血清型を提供し、そこでは、6B莢膜遺伝子座のガラクトシルトランスフェラーゼが6Cのグルコシルトランスフェラーゼで置換されている。遺伝子導入は生存能力のある肺炎連鎖球菌株を生じ、この株からの莢膜多糖類は予測した化学構造および6B血清型の莢膜多糖類に血清学的な類似性を有する。この新たな株（すなわち、血清型6D）は、膨張反応（quellung reaction）によって6Bに分類されるが、6B多糖類に対するモノクローナル抗体を持つ6B株から区別され得る。古典的な型分類法で以前6Bと分類された２６４個の肺炎連鎖球菌単離物を再調査したところ、血清型6Dを発現する単離物がないことが明らかになった。

ここで提供される新規6D単離物は、化学的に明確な莢膜多糖類（PS）構造を有する。より詳しくは、6D PSの繰返し単位は、見かけ上、ひとつのリビトール、ひとつのラムノースおよびふたつのグルコース部分を含有する。これは、血清型6Cと同一の内容であるが、炭化水素部分の科学的リンケージがこれらの血清型とは異なる。さらに、ＰＳの明確な化学構造は抗原学的に明確である。血清型6Dは、かくして、すでに認識されている９０種の肺炎連鎖球菌血清型［Henrichsen, 33 J. Clin. Microbiol. 2759-62 (1995)］および９１番目の血清型を表す6C血清型と併せて、９２番目の肺炎連鎖球菌血清型を表す。

重要なことは、ここで提供される新規6D血清型は、ワクチン開発にとって、重要な代替ＰＣを提供することである。より詳しくは、現行の肺炎連鎖球菌ワクチンは、6A PSではなく、むしろ6B PSを含有する。なぜならば、ある意味、6A PSはワクチン製剤中ではあまり安定でなかったからである。この化学的な不安定さは、6A PS中のラムノースとリビトールとの間の1→3リンケージによる。6B PSの1→4リンケージは6A PSの1→3リンケージよりも安定なので、6B PSは6A PSよりも安定である。ここで提供される6Cリンケージはより不安定な1→3リンケージを有し、6D PSはより安定な1→4リンケージを有する。かくして、6D PSは6C PSよりも、ワクチンにおいてより一層有用であることが証明されたといえる。

ワクチンの重要性に関して、エス・ニューモニアエはよく知られたヒト病原体であり、主に幼児や老齢者における肺炎、髄膜炎、中耳炎ならびに敗血症の主たる病因物質である。［Fedson, VACCINES, 271-99 (Plotkin & Mortimer eds., W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1988)］。肺炎連鎖球菌の最も顕著な病原性因子は莢膜多糖類（PS）であり、それは細菌の表面を被覆して、表面部分への結合からの抗体および補体ならびに貪食細胞に認識されることを阻害する。［Avery & Dubos, 54 J. Exp. Med. 73-89 (1931)］。より詳しくは、この莢膜は、細菌細胞のC3bオプソニン作用を防止することによって、食作用に干渉する。抗−肺炎連鎖球菌ワクチンは、高度に有病率な株から誘導された種々の莢膜（多糖類）抗原の調製物を基礎とする。

エス・ニューモニアエは、PS莢膜の血清学的に明確な化学の発現に基づいて、９１種の血清型に分けられてきた。［Henrichsen, 1995; Park et al., 45 J. Clin. Microbiol. 1225-33 (2007)］。PSに対する抗体は注射からの血清型-特異的保護を提供し、肺炎連鎖球菌に対する現行のワクチンは最も蔓延している株の莢膜ＰＳを包含する。［Cole, 61 JAMA, 663-66 (1913)］。血清群6株は、侵襲性肺炎連鎖球菌症において最もありふれたものであり、現行のワクチンは血清群6感染に対する保護のための調製物である。［Hausdorff et al., 30 Clin. Infect. Dis. 100-21 (2000）］。

肺炎連鎖球菌単離物の正確に効率的に血清型分類することは、肺炎連鎖球菌ワクチンの有効性を測定するのに重要である。新たな肺炎連鎖球菌ワクチンの導入後、そのワクチンに含まれ、その血清型を発現する肺炎連鎖球菌はあまり一般的ではなくなり、一方、非ワクチン型を発現する肺炎連鎖球菌の有病率は同じままである。いくつかの場合、非ワクチン型を発現する肺炎連鎖球菌はワクチン血清型を発現するそれに置き換わり、非ワクチン型の有病率はより高くなる。［Pelton, 19(1) Vaccine S96-S99 (2000)］。さらに、血清型の有病率は、理由は不明だが、経時変化する。［Finland & Barnes, 5 J. Clin. Microbiol. 154-66 (1977)］。これらの変化はワクチンの臨床学的有効性に影響するので、多数の肺炎連鎖球菌単離物の血清型分類は肺炎連鎖球菌ワクチンをモニターする重要な部分である。

その上、エス・ニューモニアエ血清型6Aに関して、現行のワクチン製剤は6A PSを持たないが、6B PSを持ち、6Bに対して生起した抗体は6Aに対して交差反応すると考えられる。この現象は１００％ではないが、6B PSを含むいくつかのワクチンは6Aに対して抗体を生起しない。［Yu et al., 180(5) J. Infect. Dis. 1569-76 (1999)］。実際に、6Aのごとき非ワクチン血清型は、依然として、ワクチン接種した子供において病気を引き起こしているようだ。［Clover & Klein, Strategies for Prevention & Treatment of Pneumococcal Disease, 44th Ann. ICAAC Meeting (Washington, DC, 2004)］。ゆえに、さらなる６群血清型の新出は一層重要になるであろう。

さらに、6Aおよび6B血清型は、それぞれ、侵襲性肺炎連鎖球菌症の4.7%および7%を占める。［Robbins et al., 148 J. Infect. Dis. 1136-59 (1983)］。生物化学的研究により、血清型6Aおよび6B PSは、４つの単糖類：ラムノース、リビトール、ガラクトース、およびグルコースを含有する繰り返し単位の線状ポリマーであることが分かった。［Kamerling, in S. PNEUMONIAE: MOLECULAR BIO. & MECHANISMS OF DIS. 81-114 (Tomasz, ed., Mary Ann Liebert, Inc., Larchmont, NY, 2000)］。上記のごとく、6A PSは、ラムノースからリビトールへの1→3リンケージを有し、6B PSはラムノースからリビトールへの1→4リンケージを有する。［前出］。

当該技術分野において、様々な血清型分類法が周知であるが、それらは、大抵、手動であり、遅く、しかも、実施するのが退屈である。改良された血清型分類「マルチビーズアッセイ」はすでに記載され、フローサイトメーターが付随して半自動的に実行できる多重型イムノアッセイに基づく。［Park et al., 7 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 486-89 (2000)］。このマルチビーズアッセイの特異性は、９０の既知の血清型の全てを代表する肺炎連鎖球菌株を用いて、すでに、十分に確立されている。［Yu et al., 43(1) J. Clin. Microbiol. 156-62 (2005)］。このアッセイは、優れた特異性を提供し、肺炎連鎖球菌莢膜ＰＳに特異的な多くのmAbを用い、大いに自動化され、さらに、高いスループットを提供し得る。結果として、このアッセイは多くの疫学研究において有用であろう。

このマルチビーズアッセイは特に有利である。なぜならば、モノクローナル抗体はポリクローナル試薬よりも特異的だからである。6A血清型に関して、ほとんどの「6A」単離物（膨張反応およびポリクローナル試薬によって定義される）は、6A-特異的モノクローナル抗体（Hyp6AG1、Hyp6AM6、およびHyp6AM3）と反応し、いくつかの「6A」単離物はひとつのmAb （Hyp6AG1）と反応するが、それ以外（Hyp6AM6またはHyp6AM3）とは反応しない。ここに記載される他の試験により、Hyp6AM6またはHyp6AM3と反応しない6A単離物は、依然同定されていなかった6A亜型であることが確認された。換言すれば、そのモノクローナル抗体は、6A血清型の中の亜型を認識した。［Lin et al., 44(2) J. Clin. Microbiol. 383-88 (2006)］を参照。最初、双方のmAbに反応する単離物は6Aαと同定され、Hyp6AG1にのみ反応するものは6Aβと表示されたが、その後、6Aαは6Aのままとして、新たな血清型を6Aβではなく、6Cと同定することが提案された。［前出、Park et al., 45 J. Clin. Microbiol. 1225-33 (2007)］。かくして、6Aβおよび6Cの双方をここで用いることがあり、それらは等価である。6Dを同定するのに有用なモノクローナル抗体はAb Hyp6BM6、mAb Hyp6BM7、およびmAb Hyp6BM8と称されるものを含む。

さらに、6Cに関して、新たな血清型を同定する上での考慮は、ヒト抗体との結合特性である。様々な6A、6C、および6B単離物は、オプソニン作用アッセイおよび高レベルの抗−6B抗体を持つヒト血清を用いて比較された。ヒト血清は6Bおよび6Aをオプソニン化するが（図２）、ブラジル、韓国、および米国からの７つの異なる6C単離物をオプソニン化しなかった（図２）。このことは、6C単離物は明確であるが均一な血清型特徴を示すことを示唆している。

遺伝子研究は、6Aまたは6B血清型のいずれかを発現する肺炎連鎖球菌は、サイズが約17.5Kbのほぼ同一の莢膜遺伝子座（CGL）を有することを報告する。配列情報は、オンライン、例えば、ザ・サンガー・インスティチューツ・シーケンシング・ゲノミック・プロジェクツ (the Sanger Institute's Sequencing Genomics Projects)のサイトから入手可能である。ラムノシルトランスフェラーゼをコードするwciP遺伝子には一貫した差異がある。［Mavroidi et al., 186 J. Bacteriol. 8181-92 (2004)］。血清型6A wciP遺伝子は、残基１９５にセリンをコードするが、血清型6B遺伝子はその残基にアスパラギンをコードする。［前出］。

遺伝子研究によって、6C単離物が、実際には、6A血清型（密接に関連する6B血清型でもいくかのその他の非関連の血清型でもない。）のメンバーであることも確認された。ブラジル、韓国、および米国から収集した１０個の単離物の研究において、6Cと同定された１０個すべての単離物は、残基１９５にセリンを有し、血清型6AにおけるwciP遺伝子と一致した。いくつかの肺炎連鎖球菌単離物のwciP遺伝子のＤＮＡ配列を、図４に図示する。トランスフェラーゼ遺伝子wciNおよびwciOの遺伝子配列も比較した。プライマー5016および3101を用いるＰＣＲによってwciN領域を調査したら、調査した９つすべての6A単離物は、調査した６つすべての（韓国、米国、およびブラジルからの）6C単離物がもたらすものよりも、約２００塩基対（bp）長い生成物を生じる（図５）。

ひとつの6A単離物（AAU9）およびひとつの6C単離物（ST745）由来のＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を比較した（図１４）。AAU9 ＰＣＲ産物中の位置１２０３から２９５９までのすべての塩基（１７５７塩基）を配列決定し、GenBankデータベースにおいて6A単離物の莢膜座配列であると報告されているCR931638に相同的であることが分かった。対照的に、ST745（6C）配列は、位置１３６８までと、そして、位置２５９１から再び始まる6Aのものとほぼ同一であることが分かった。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９から２３９７まで）は、6Aのものと全く異なる。この介在配列は、エス・サーモフィラス (S thermophilu)による多糖類合成に用いられるトラスフェラーゼ（EpsG）に類似する約９８ｂｐを含有する。

6Cの莢膜遺伝子座は、wciN遺伝子を除き、6A座と非常に類似することに留意すべきである：6A株はwciNα遺伝子を有するが、6C株はwciNβ遺伝子を有する。これら２つの遺伝子は、サイズが異なり、かくして、6Aおよび6C血清型はＰＣＲによって容易に区別できる。wciNα遺伝子は、３１４個のアミノ酸のWCINαをコードし、wciNβ遺伝子は１１２５塩基長のＯＲＦを産生し、その産物WCINβは３７４個のアミノ酸を有する。さらに、これら２つのタンパク質はアミノ酸レベルではたいして相同性を有しない。

推定wciN遺伝子産物の配列は、それらのグリコシルトランスフェラーゼ機能を示唆する。WCINβは、ブドウ球菌capH遺伝子産物に対して類似性を有し、グリコシルトランスフェラーゼ群１ファミリーに属する１６０アミノ酸長トランスフェラーゼドメインを有する。対照的に、WCINαは、グリコシルトランスフェラーゼファミリー８（ex）に属し、それは、多くのガラクトシルトランスフェラーゼを含む。［Campbell et al., 326 Biochem. J. 929-39 (1997)］。本研究は、wciNが6Aおよび6C細菌の間の差異の要因であることを示した。相同組換えによるwciN6A（6AのwciN）のwciN6C（6CのwciN）への置換が血清型を6Aから6Cに変更したように見えるからである。［Park et al., 75 Infect. Immun. 4482-89 (2007)］。実際に、wciNα遺伝子をwciNβ遺伝子に置換することによって、6A株を6C株に転換できる。

興味深いことに、6Aおよび6Cに関して観察されるガラクトース／グルコース交換は、他の肺炎連鎖球菌血清型に見出される。肺炎連鎖球菌の9L血清型PSはガラクトース分子を有するが、9N PSはグルコース分子を有する。9Lおよび9N血清型の莢膜遺伝子座は互いに類似するが、ひとつの遺伝子遺伝子wcjAにおいて相違し、それは、9Lについてガラクトシルトランスフェラーゼをコードし、9Nについてグルコシルトランスフェラーゼをコードする。9Lおよび9N血清型のwcjA遺伝子は非常に類似し；ひとつのものが別のものから突然変異によって生じるようである。

対照的に、wciNαおよびwciNβ遺伝子は非常に異なり、wciNβ遺伝子はデータベースから入手可能ないずれの他の肺炎連鎖球菌遺伝子とも相同的ではない。おそらく、wciNβ遺伝子は、肺炎連鎖球菌以外の有機物を起源としたのであろう。相同組換えに参与し、肺炎連鎖球菌における相同組換えに重要であることが知られているwciNβ遺伝子のふたつのフランキング領域によって支持される見解である。［Prudhomme et al., 99 P.N.A.S. USA 2100-05 (2002)］。さらに、抗菌耐性遺伝子の研究により、エス・ニューモニアエと細菌種との間に水平遺伝子トランスフェラーゼが示された。例えば、［Feil et al., 151(6) Res. Microbiol. 465-69 (2000); Muller-Graf et al., 145(11) Microbiol. 3283-93 (1999); Coffey et al., 5(9) Mol. 2255-60 (1991)］を参照。

さらに、wciNβ遺伝子の一部が、エス・サーモフィラスによる菌体外多糖類の合成に関与する遺伝子であるEpsG遺伝子に類似する（８１％相同性）。相同性は非常に短いＤＮＡの断片でのみ見出されたが、かくして、エス・サーモフィラスはwciNβの起源ではないであろう。WCINβのタンパク配列はイー・コリ(E. coli) K-12株のwaaG （rfaG）遺伝子産物に類似し、いくつかの肺炎連鎖球菌遺伝子は、グラム陰性有機物からきたのであろう。かくして、wciNβ遺伝子はグラム陰性種からきたという可能性がある。それにも関わらず、エス・サリバリウス (S. salivarius)、エス・ミティス (S. mitis)、およびエス・オラリス (S. oralis)は、リーディング候補である。なぜならば、それらは、肺炎連鎖球菌とともに口腔内に共存し、多くの抗菌耐性遺伝子がエス・オラリスに連結しているからである。

複数の6C単離物についてwciNβ領域を調査したところ、それらのクロスオーバーポイントおよびフランキング領域配列は同等であることが分かった。また、それらの莢膜遺伝子座プロファイルは、多くの異なる莢膜遺伝子座プロファイルを有する6A単離物とは対象的に、９−１０−１に高度に制限されている。［Mavroidi et al., 2004］。さらに、この９−１０−１莢膜遺伝子プロファイルは、6Aおよび6B単離物の莢膜遺伝子プロファイルのなかでは普通ではなく、かつ、それらから大きく分離され、発見は、wciNβ遺伝子の捕捉が起こらなければならないこと、および、すべての6C単離物が世界中で発見されることを示し、元来6Cになった単一の細菌に由来する莢膜遺伝子座を有する多くのタイプの病気を引き起こす。6Cは外来遺伝子捕捉の独特かつ明確な例を提供することができるで、それは細菌遺伝子進化を研究するにはいいモデルでああろう。これは、抗菌耐性遺伝子とは異なり、安定した変化も構築する。

6C血清型は１または２の莢膜遺伝子座プロファイルのみを有するが、6Aおよび6B血清型は、多様な莢膜遺伝子座プロファイルを有する。［Mavroidi et al., 2004］。かくして、6C莢膜遺伝子座は、近年、6Aまたは6B莢膜遺伝子座と比較して、より一層多く出現している6Cは２７年前と比較してより一層多く出現しているが、これらの発見は、6C血清型莢膜遺伝子座が、「近年」、一箇所で出現し、かつ、世界中に迅速に広がったことを示している。遺伝子が強力な生存優位性を与えるとき、その遺伝子は世界中に迅速に広がる。例えば、抗菌耐性遺伝子はたったの一年で世界中に広がるであろう。おそらく、天然のヒト抗体は、6Aまたは6Bに対するよりも6Cに対してはあまり有効でない。6C莢膜遺伝子座が、6Aまたは6Bよりもより高い生存優位性を与えるかどうが調査されるであろう。

MLS研究は、6C多重依存性がSTを発現することを示し、かくして、6C莢膜遺伝子座は様々な肺炎連鎖球菌単離物の間で交換されてきたに違いない。6C莢膜遺伝子座が、さらなる生存優位性を与えるSTと結合するか否かが調査されるであろう。6Cの広がりおよび多重抵抗性遺伝子を有する国際株の中での6C莢膜座の新出はモニターされるべきである。

上記したように、6C肺炎連鎖球菌単離物は化学的に明確な構造を有する。より詳しくは、単糖類分析は6A莢膜ＰＳに見出されるガラクトースが6C PSに存在せず、その代わり、グルコースを含有することを示した。6C PSの繰返し単位は、見かけ上、ひとつのリビトール、ひとつのラムノース、およびふたつのグルコース部分を含有する。血清型6Cは、血清型6Aに対する血清学的および構造学的関係から、血清群６の第３のメンバーであり、９１番目の肺炎連鎖球菌血清型である。

ガラクトースおよびグルコース分子は、それらの第４炭素に結合するヒドロキシル基の向きのみにおいて異なり、6Aおよび6C PSの繰返し単位は、ひとつのヒドロキシル基の向きのみにおいて異なる。この小さな構造的差異は、なぜ6Cが以前ポリクローナル抗血清で同定されなかったかを説明する。化学構造の調査で、6Cは、炭化水素組成分析によって、または、アノマープロトンの単一プロトンＮＭＲによって、6Aから生化学的に識別され得る。［Abeygunawardana et al., 279 Anal. Biochem. 226-40 (2000)］。6A NMRと6C NMRとはパターンが異なるが、6CのアノマープロトンのＮＭＲパターンは、6Aのそれに非常に類似する。化学的および遺伝子学的試験を用いることができるが、血清学的方法は、吸収によって特異的に作成されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清のいずれかをを用いて6Cを同定するのに最も有用な手法である。

血清群６は３つのエピトープ：６ａ、６ｂおよび６ｃを含有することが知られている。［Henrichsen, 1995］。エピトープ６ａは、血清型6Aおよび6Bの双方に存在し、、一方、エピトープ６ｂおよび６ｃは、それぞれ、血清型6Aまたは6Bのいずれにしか存在しないことが知られている。6C血清型の発見は、血清群６のなかにさらなるエピトープが存在することを示唆している。6Aおよび6Bを認識するが、6Cを認識しないmAb Hyp6AM3は、エピトープ６ｂを認識すべきである。mAb Hyp6AG1は6Aおよび6Cを認識するので、新たなエピトープ「６ｄ」を認識すると規定されるであろう。３つすべての血清型（6A、6B、および6C）に結合するもうひとつのmAbおよび共有エピトープは、「６ｅ」と規定されるであろう。血清型６Ａおよび６Ｂに対する高次構造依存性エピトープもすでに記載されている。［Sun et al., 69 Infect. Immun. 336-44 (2001)］。血清群６に対するとても多くのエピトープの観察は、シアル酸の単純線状ホモポリマーでさえ少なくとも３つのエピトープを有し得るという以前の観察と一致する。［Rubenstein & Stein, 141 J. Immunol. 4357-62 (1988)］。実際に、肺炎連鎖球菌PSは、以前規定されたよりも多くのエピトープを有し［Henrichsen, 1995］、多くのエピトープの存在が、肺炎連鎖球菌コンジュゲートワクチンの製造中にエピトープを変化させる機会を増大する。

血清型6Cの発見は全く予期されていなかった。なぜならば、血清群６は、１９２９年に発見されて以降、広範な研究がなされてきたからである。［Heidelberger & Rebers, 1960］。したがって、十分に確立されかつ広範に特徴付けられた血清型のなかでさえもさらなる亜型（すなわち血清型）が存在する可能性を考慮しなければならない。例えば、血清型１９Aの中に亜型が存在する可能性を考慮する必要がある。なぜならば、19A莢膜ＰＳに対してふたつの化学構造が報告されているからである。［Kamerling, Pneumococcal polysaccharides: a chemical view, in MOL. BIOL. & MECHANISMS OF DISEASE 81-114 (Mary Ann Liebert, Larchmont, 2000)］。１９Aの亜型が見つかれば、それらの存在は、肺炎連鎖球菌コンジュゲートワクチンの導入後に見られる血清型「１９A」の有病率の急速な増大を説明するであろう。［Pai et al., 192 J. Infect. Dis. 1988-95 (2005)］。さらに、6Cが最近発生したであろう可能性を考慮すべきである。この可能性と一致して、これらの遺伝子研究は、6C血清型莢膜遺伝子座は、6A座［Mavroidi et al., 2004］ほど発散しないことを示す［Lin et al., 44 J. Clin. Micro. 383- (1988)］。遠い昔（おそらく、５０〜１００年前）に採取した肺炎連鎖球菌単離物を研究することによって、6C株の起源および広がりを調査することは興味深いことである。

6Cの発見は、血清群６の新たなメンバーについての理論的可能性によって、血清群６莢膜遺伝子座の進化可能性を増大する。ここで提供される新たなメンバーは、「６D」と表示され、６BのwciPおよびwciN_6Cを含む。化学的に、6D PSはガラクトースのかわりにグルコースを有し、かつ、1→4ラムノース−リビトールリンケージを有する。本発明以前は、この新規血清型が天然に存在するか新出するかもしれないかどうかは不明であった。したがって、血清型6D株を用いて、6D株についての肺炎連鎖球菌単離物研究所コレクションを調査した。

6C血清型もワクチン有効性をモニターするのに有用である。6Aおよび6C血清型は、肺炎連鎖球菌ワクチンを要件とする疫学的研究および肺炎連鎖球菌ワクチン有効性の研究において、識別されるべきである。例えば、肺炎連鎖球菌ワクチンが6Aに対して有効であるが、6Cに対しては有効でないならば、そのワクチンは6C血清型が有病率な領域では有効でないであろう。これは事実であろう。なぜならば、肺炎連鎖球菌ワクチンは6Cをオプソニン化する抗体を偶然誘発するだけだからである。また、従来の肺炎連鎖球菌ワクチンを使用することは、6Cの有病率を十分に変化させることができ：6Cの有病率を増大させるが6Aのは減少させる。下記の予備データは、6C有病率は不変だが、6A有病率は、２０００年以降コンジュゲートワクチンの使用で減少したことを示す。これらの血清型を識別せずに、ワクチンを上手く使用するか、または、その有効性を評価することは困難であろう。現時点で、この新たな血清型は、ここに開示するように、抗体によって同定できるが、本発明によって、さらなる遺伝子学的および生化学的試験が工夫され、想定される。

その上、6C血清型の有病率または6D血清型の新出を地球規模でモニターするべきであり、肺炎連鎖球菌ワクチン配布されおよび配布されない領域における新たな肺炎連鎖球菌の新出についての価値ある情報を提供する。6C血清型も、ブラジル、カナダ、中国、韓国、メキシコ、ヨーロッパ［Hermans et al., 26 ワクチン 449-50 (2008)］、および米国で同定されている。

この目的のため、本発明のモノクローナル抗体は6C血清型を同定するのに有用である。すなわち、6Aおよび6CはどちらもmAb Hyp6AG1によって同定されるが、6C血清型はmAb Hyp6AM6またはmAb Hyp6AM3と反応しない。それゆえ、Hyp6AM6またはHyp6AM3をネガティブコントロールとして用いることができ、そこから6Aおよび6Cを同定できる。これらのモノクローナル抗体を用いて、ＣＤＣに提出された米国肺炎連鎖球菌単離物のなかでの6Aおよび6Cの有病率を分析した。おおよそ同数の肺炎連鎖球菌単離物が１９９９年から２００６年までにＣＤＣに提出された。旧式の方法で「６Ａ」と分類された標本を、ここに記載するモノクローナル抗体をい用いて再分析した。１９９９年、２００３年および２００４年に受領したほぼすべての「６Ａ」ひょうほんを再分析した。ＣＤＣが２００５年および２００６年に受領したサンプルはフラクションのみ再分析した。表から分かるように、６Ａの有病率は減少したが、６Ｃの有病率は同じままであった。このことは、現在入手可能な肺炎連鎖球菌ワクチンは６Ｃに対しては有効でないかもしれないことを示している。

血清型6Cは、ブダペスト条約により、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the American Type Culture Collection)に寄託されている。

肺炎連鎖球菌莢膜多糖類の実際の合成は、多数の異なる遺伝子産物間の協働を必要とする。例えば、新たなグリコシルトランスフェラーゼにより作成されたあらたな繰返し単位は、新たな莢膜として発現される前に、現在あるフリッパーゼならびにポリメラーゼと適合しなければならない。かくして、血清型6Dを発現する新たな株（TIGR6Dと称する）を、6B莢膜遺伝子座にwciN_6Cを挿入することによって、生成した。この新規株は、予想した構造の莢膜多糖類を生じ、６Ｂに対して血清学的類似性を提示し血清群６の他のメンバーと同じく、様々な成長条件で成長できる。かくして、血清型６Ｄは論理的だけではなく生物学的にも可能であり、天然に存在し得る。

丁度、６Ｃが古典的な型分類法［Lin et al., 2006; Park et al., 2007］によって「６Ａ」と以前分類されたように、膨張反応法は、新たな6D株を血清型6Bと分類していた。かくして、血清型6Dを発現する天然単離物を同定するために、古典的には６Ｂと規定された単離物を、mAbを用いて再調査した。以前６Ｂと分類された２５０を超える単離物を試験したにもかかわらず、6D単離物が天然に存在することは見出されなかった。さらに、古典的な型分類法で「６Ｂ」と血清型分類されたＣＤＣ単離物の中にwciN_6Cは検出されなかった。かくして、血清型6Dを発現する肺炎連鎖球菌単離物は転々に存在することは見出されていない。あるいは、血清型6Dが天然に存在するならば、その有病率は非常に低い（6B有病率の＜１％）。

天然に明らかに存在しないにもかかわらず、6D血清型はふたつの可能性のあるメカニズムのうちのひとつによって天然に新出し得る。一方のメカニズムは6CのwciP遺伝子の突然変異を要件とする。なぜならば、６Ａおよび６Ｂ血清型間の唯一の差異はwciP遺伝子における１つのヌクレオチドのようだからである。肺炎連鎖球菌についての突然変異率は〜１×１０^−８であり［del Campo et al., 43 J. Clin. Microbiol. 2207-14 (200); Fedson, 1988; Morosini et al., 47 Antimicrob. Agents. Chemother. 1464-67 (2003)］、安定肺炎のCOPD患者は、痰１ｍLあたり2.6 x 10⁸ CFUの肺炎連鎖球菌を有しているであろう。［Sethi et al., 176 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 356-61 (2007)］。かくして、正しい突然変異は6C肺炎のほぼすべての場合に生じ、細菌負荷の少ない他の６C感染で頻繁である。代替的なメカニズムは、ここで提供したように、6C株から6B株へのwciNの水平遺伝子伝達を要件とする。この状況は、実際に天然で発生する。なぜならば、複数の肺炎連鎖球菌血清型の輸送は子供の間で比較的高く［Gratten et al., 50 Biol. Neonate 114-20 (1986); Hill et al., 46 Clin. Infect. Dis. 807-14 (2008)］、血清型6Bおよび6Cは、世界のいくつかの地域（例えば、ブラジル）ではかなりありふれている［Lin et al., 2006; Park et al., 2007］。さらに、相同組換えは容易に発生する。なぜならば、6Bおよび6Cの17kbの莢膜遺伝子座は、wciN遺伝子を除き、ほぼ同一だからである。これらの考察は、天然に、６D血清型を創出する環境があることを強く示唆している。

６Dを創出する環境が天然にあると考えると、それがないことの理由を検討することは興味深い。６Dに対する天然免疫バリアがある可能性があるが、明らかに、免疫前ヒト血清はTIGR6Dを殺しもしないし、オプソニン化もしない。あるいは、６Ｄが現れるのに十分な時間がなかったので、6Cが最近現れたのであろう。6Dが現れる物理的な時間を見積もるのは困難であるが、6Cは数十年存在し、いくつかの大陸で見出されている。もっともそれらしい説明は、6A、6B、または6Cを乗り越えて6Dを選択するための十分な生物学的圧力がなかったということである。生存優位性の不存在下、（上記したように、6C感染のほぼすべての場合において）6D血清型は天然に出現したが、6A、6B、または6C血清型との競合のため、繁殖しなかった。同様に、抗菌剤を臨床使用され、抗菌剤を中止したときに消滅する場合、抗菌耐性株は生存し、繁殖する。例えば、［Katsunuma et al., 102 J. Appl. Microbiol. 1159-66 (2007)］を参照せよ。

6A PSは元の１４価PSワクチンに含まれていたが、１９８３年に２３価ワクチンが利用可能になると、6B PSに取って代わられた。なぜならば、とりわけ、6B PSは、6A PSと比べて、加水分解による破壊に対して非常に抵抗性があるからである。［Zon et al., 37 Infect. & Immun. 89-103 (1982)］。ここに提供される研究は、6D PSは6B PSと同じくらいに化学的に安定であり、6C PSと比べて、加水分解に対してより一層抵抗性である。6D PSは6C PSと交差反応する抗体を誘発しそうなので、6Dはワクチンとして6C PSよりも有用であろう。

肺炎連鎖球菌の最も重要な病原性因子をコードする莢膜遺伝子剤の進化を理解することは興味深い。たったふたつの血清型が知られているだけで、血清群６の進化は広範に研究されている［Mavroidi et al., 2004; Robinson et al., 2002］。血清型6Cの発見後、血清群６はより興味深いものになった：今や、この血清群は血清型６Ｄでの進化研究がより一層興味深い。

しかも、現在利用可能な２３価肺炎連鎖球菌ワクチンは6B PSを含有するが、旧式の１４価肺炎連鎖球菌ワクチンは6A PSを含有する。PSは２３価肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて置き換えられている。なぜならば、6A PSはワクチン製剤中で安定ではなく、6B PSは、しばしば、6A PSと交差反応する抗体を誘発するからである。［Robbins et al., 1983］。調査により、6AのPS化学的不安定性はラムノースおよびリビトール間の1→3リンケージによることが分かった。［Zon et al., 1982］。6B PSに見出された1→4リンケージは6A PSの1→3リンケージよりも安定である。6D PSの推定構造は、6C PSが不安定な1→3リンケージを有し、6D PSがより安定な1→4リンケージを有することを除き、6C PSのものと同一である。かくして、この安定性のため、6D PSは、ワクチンにおいて6C PSよりもかなり有用であることが証明された。

重要なことは、ここに提供されるこれらの新規血清型6Cおよび6Dは、ワクチンに、または肺炎連鎖球菌ワクチン開発に有用であろう。例えば、6D PS、そのPSの一部、またはそのPSの模倣体を肺炎連鎖球菌ワクチンに包含させることができる。連鎖球菌および肺炎連鎖球菌PSを含むコンジュゲートワクチンが当該分野においてよく知られている例えば、［米国特許第6,248,570号；第5,866,135号；第5,773,007号］を参照せよ。多糖類分子のタンパク質またはペプチド模倣体のごときPSミモトープも代替的な抗原または免疫原として可能である。例えば、［Pincus et al., 160. J. Immunol. 293-98 (1998); Shin et al., 168 J. Immunol. 6273-78 (2002)］を参照せよ。さらに、6Cおよび／または6Dのタンパク質または核酸は、ワクチンまたは当該分野で知られているいずれかの数の技術を用いるワクチン開発において抗原または免疫原として機能することができる。例えば、［米国特許第6,936,252号］を参照せよ。１以上の補助剤をそのようなワクチンに含ませることができる。非経口、経粘膜その他の投与のいずれかによる肺炎連鎖球菌ワクチンのデリバリーおよびそのようなワクチンの設計、モニタリングおよび投薬計画が当該分野でよく知られている。

さらに、6Cおよび6D血清型はワクチン開発において有用である。なぜならば、当該細菌を、試験ワクチンで生起した血清または抗体を用いるオプソニン作用またはＥＬＩＳＡアッセイにおける標的として用いるからである。6Cおよび6D血清型の抗原を能動的保護に用いることができる抗体を生起するのに用いることもできる。そのような方法は当該分野でよく知られている。

さらに、6Cおよび6Dの同定は、抗6C抗体sおよび抗6D抗体の生成および単離を提供する。これらは、この明細書に照らし、当該分野でよく知られている従来手段によって調製し得る。この点において、抗体なる用語は、無傷イムノグロブリン分子ならびに部分、フラグメント、ペプチドおよび、例えば、Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, CDR領域、または6C抗遺伝子エピトープ、もしくはミモトープに結合することができるイムノグロブリン分子のいずれかの部分もしくはペプチド配列のごときそれらの誘導体の双方を含み、それらのすべてを「抗原結合分子」ともいう。抗体または抗原結合分子は、抗原と特異的に反応し、それによって、その抗原を抗体または抗原結合分子に結合させることができるならば、「抗原に結合することができる」といえる。例えば、［WO/US2006/014720; WO/US2006/015373］を参照せよ。

本発明の具体例を、ここからは、非限定的な実施例によって、さらに説明する。

実施例１ 肺炎連鎖球菌血清型の同定
肺炎連鎖球菌ライゼートのコレクション：肺炎連鎖球菌血清型6Aβ（［Lin et al., 44 J. Clin. Micro. 383-88 (2006)］を参照せよ。）を、４９５の臨床単離物を用いる盲試験において単離した：５０の単離物はメキシコから、１００はデンマークから、そして３４５はブラジル由来のものであった。２２の単離物は上咽頭における肺炎連鎖球菌の無症状保菌者からのものであり、４７５の単離物は、髄膜炎および敗血症のごとき、侵襲性肺炎連鎖球菌感染した患者由来のものであった。さらに、血清型11A、11B、11C、11D、および11Fを発現するコントロール肺炎連鎖球菌株は、スタテンス・セールム・インスティトゥート (Statens Serum Institut) (Copenhagen, Denmark)から購入した。

臨床単離物のライゼートを起源の国で調製した。0.5%酵母抽出物を含む３００マイクロリットルのTodd-Hewitt培地（THY培地）を肺炎連鎖球菌の単一コロニーで接種した。３７℃で一晩インキュベーションした後、５０μｌの溶解溶液（0.2%デオキシコール酸ナトリウム、0.02%SDS、0.1%アジ化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.8）で細胞を溶解した。ブラジルにおいて、４００μｌのTHY培地を細菌成長に用い、１００μｌを取り出して細菌を凍結保存し、その後、残りの３００μｌと５０μｌの溶解溶液と混合した。デンマークにおいて、３２５μｌのTHY培地および２５μｌの溶解溶液を用いた。細菌は、３７℃にて混合物をインキュベートすることによって溶解した。ライゼートをコード化し、血清学試験用に、アラバマ大学バーミンガム校（University of Alabama at Birmingham；UAB）研究所に通常のメールで外気温度にて発送した。

マルチビーズアッセイ用に細菌ライゼートの遠方からUABへの発送を簡略するために、室温（ＲＴ）または３７℃で保存下後、細菌ライゼートの安定性を比較した。この実験により、細菌ライゼートは、ＲＴにて一ヶ月間まで、３７℃にて数日間、マルチビーズアッセイに影響することなく保存できることを明らかになった。かくして、この研究において、通常の郵便メールシステムを用いて、いかなる熱的保護をすることなく、外気温度にてすべてのライゼートを発送した。

血清学試薬：すべてのポリクローナル血清型分類血清はウサギで作成し、スタテンス・セールム・インスティトゥートから入手した。それらは、血清群分類用に１２の血清プールおよび様々な型または因子特異的抗血清を含む。［Sorensen, 31 J. Clin. Microbiol. 2097-2100 (1993)］。すべてのmAbsは記載するように作成し、ハイブリドーマ培養上清を用いた。［Yu et al., 2005］。

マルチビーズアッセイ：このアッセイは、記載するように、２つの異なるラテックスビーズを用いて行った。［Yu et al., 2005］。一方のビーズセット（セット１）は１４種の異なるラテックスビーズの混合物であり、各々がひとつの肺炎連鎖球菌PS抗原でコートされていた。これらの１４種の肺炎連鎖球菌PS抗原は、血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、9F、および23Fであった。ビーズセット２は、１０種のビーズタイプの各々を１０種の異なる肺炎連鎖球菌PS（血清型2、8、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F、および33F）のうちのひとつでコートすることによって作成された。

セット１ビーズは、５倍または２０倍希釈の細菌ライゼートのいずれか一方および前記ビーズ上に含有される肺炎連鎖球菌莢膜ＰＳに特異的な複数のmAbの混合物と混合された。インキュベーションおよび洗浄後、このビーズ混合物をフルオレッセイン−コンジュゲーティド抗マウスイムノグロブリン抗体と反応させた。ポリクローナルウサギ抗血清（スタテンス・セールム・インスティトゥート）およびフルオレッセイン−コンジュゲーティド抗ウサギイムノグロブリン抗体の混合物を用いた以外は、セット１ビーズと同じ様に、セット２ビーズを用いた。インキュベーション後、各ビーズタイプの蛍光量をフローサイトメーター（FACSCalibur, Beckton Dickinson, San Jose CA）で定量した。そして、各ビーズタイプの蛍光を用いて、その血清型を決定した。６７％よりも大きな蛍光阻害をもって陽性とした。

ノイフェルト試験 (Neufeld's test)：このアッセイを、デンマーク、ブラジル、およびメキシコの参照研究所によって、標準血清群分類［Sorensen, 1993］およびスタテンス・セールム・インスティトゥートからの血清型分類用ウサギ抗血清を用いて、記載［Henrichsen, 33 J. Clin. Microbiol. 2759-62 (1995); Konradsen, 23 Vaccine 1368-73 (2005); Lund, 23 Bull.Wld Hlth Org. 5-13. (1960)］されるように行った。

ドットブロットアッセイ：一致しない結果を調査するために、このアッセイを、以下の血清群／血清型：１、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１４、１８、および２３に対する、スタテンス・セールム・インスティトゥートからの肺炎連鎖球菌抗血清を用いて、記載［Fenoll et al., 35 J. Clin. Micro. 764-76 (1997)］するように行った。6A（Hyp6AM3）および18C（Hyp18CM1）に特異的なモノクローナル抗体も同じケースに用いた。簡単に言うと、THY培地中で成長させた熱死肺炎連鎖球菌をニトロセルロース膜のストリップにスポットした。乾燥後、これらのストリップをブロックし、洗浄した。ついて、ストリップを希釈抗血清またはmAb溶液中で１時間インキュベートし、洗浄し、ついで、希釈ヤギ抗−ウサギまたはマウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼコンジュゲートに暴露した。室温にて１時間インキュベートした後、これらのストリップを洗浄し、３−アミノ−９エチルカルバゾール溶液に暴露した。スポットが現れたら、これらのストリップを洗浄し、評価した。

ＰＣＲ反応：肺炎連鎖球菌をTHY培地中で、６５０ｎｍにて０．８のＯＤにまるまで成長させた。Invitrogen EASY-DNAキットを用いて、所定のインストラクションに従い、THY−成長肺炎連鎖球菌の４ｍｌサンプルを１ｍｌにまで濃縮することから始めて（Invitrogen, Carlsbad, CA）、染色体ＤＮＡを調製した。血清群６決定について、テンプレートとして染色体ＤＮＡを、ならびにプライマーwciP-アップ、5'-ATG GTG AGA GAT ATT TGT CAC-3'およびwciP-ダウン、5'-AGC ATG ATG GTA TAT AAG CC-3'を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ熱サイクル条件は、［Mavroidi et al., 2004］に記載する通りであった。Qiagen PCRクリーンアップカラム（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、過剰なプライマーをＰＣＲ反応から除去し、PCRをDNAテンプレートとして、wciP-アッププライマーを用いる自動化ＤＮＡ配列決定に付した。Sequencher（GeneCodes, Inc., Ann Arbor, MI）およびthe MacVector Sequence Analysis (Accelyrs, San Diego, CA)の援助により、結果を解析した。

血清型１１Ａ決定について、莢膜遺伝子座の部分のＰＣＲを、テンプレートとして染色体ＤＮＡ、１μｌの順方向プライマー（５０ｐｍｏｌ）および１μｌの逆方向プライマー（５ｐｍｏｌ）を用いて、記載［Mavroidi et al., 2004］されるように行った。プライマーは、１１Ａ順方向5'-GGA CAT GTT CAG GTG ATT TCC CAA TAT AGT G-3'および１１Ａ逆方向5'-GAT TAT GAG TGT AAT TTA TTC CAA CTT CTC CC-3'であった。PCRサイクルは、９４℃にて５分間から開始し、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間および７２℃にて２分間の３０サイクル、引き続き、７２℃にて１０分間の最終伸張であった。これらのＰＣＲ反応生成物をアガロースゲル電気泳動（トリス酢酸塩バッファー０．８％アガロース）によって解析して、アンプリコンサイズを決定した。

メキシコからの５０の単離物の研究：メキシコからの５０の単離物をTHY培地中で成長させ、溶解し、型分類のためＵＡＢに送付した。マルチビーズアッセイの結果をノイフェルト試験結果と比較すると、１０サンプルの結果が一致しなかった。８つの不一致サンプルの新たなライゼートを入手し、盲検で再調査すると、すべての結果が合致し、これらの不一致は表示ミスが大きな要因であったことを示している。ノイフェルト試験により血清型３および１０Ａと分類されたふたつの単離物（MX24およびMX37）は、元々、マルチビーズアッセイによって分類不可（ＮＴ）と分類された。これらふたつの血清型はマルチビーズアッセイによっ同定されているはずなので、さらなる研究用に、これらのふたつの細菌単離物をＵＡＢに送付した。そこで、それらは、ＴＨＹ培地中で十分に成長することが分かり、新たなライゼートはノイフェルト試験結果と合致する結果を生じた。かくして、これらふたつの単離物は、おそらく、肺炎連鎖球菌の不十分な成長のため、当初、マルチビーズアッセイによって陰性であると誤って同定された。

デンマークからの１００の単離物の研究：１００のデンマーク単離物のマルチビーズアッセイ結果を、ノイフェルト試験結果と比較すると、ノイフェルト試験結果の表記において４つのエラーが見つかり、ひとつの株（DK94）は、ノイフェルト試験では血清型２０と分類され、マルチビーズアッセイではＮＴと分類された（テーブル１）。

DK94単離物をＴＨＹで再成長させ、再調査したところ、１：５希釈にてほとんど阻害を生じなかった（９％）が、より高い希釈ではより大きな阻害を生じた（１：２０希釈にて３５％および１：３２０希釈にて５０％）。この予期せぬ挙動は、この特異的単離物のライゼート中に非特異的結合物質が存在することを示唆する。このライゼート中のＰＳを７０％エタノールで沈殿させ、エタノール沈殿物をマルチビーズアッセイで調査すると、この沈殿物は、血清型２０に対して明らかな阻害を生じた（１：５希釈にて８６％および１：２０希釈にて８１％）。かくして、初期の不一致は非特異的結合によるものであり、それはポリクローナル血清で行うアッセイにときおり観察され、アッセイ感度および臨床単離物との特異性において本質的な問題はない。

ブラジルからの３４５のサンプルの研究：ふたつのアッセイ方法で得られた３４５のブラジル単離物を比較し、３８のミスマッチがあった。これらの３８のサンプルを試験記録を調査することによって再調査し、ブラジルでノイフェルト試験によって再試験すると、１７のミスマッチは型分類間違いまたはサンプルの同定間違いであると説明がつく。１７のミスマッチのうちのひとつは株BZ652であった。これは、当初、１８Ｂと分類されていたが、６Ａと決定された。なぜならば、ノイフェルト試験で弱く６Ａであると分類され、ポリクローナル抗血清およびmAb Hyp6AM3を用いるドットブロットアッセイによって血清群６であると分類されたからである。残り２１のミスマッチサンプルをＴＨＹ培地中で再成長させ、マルチビーズアッセイによって再試験すると、１３の単離物の新たな結果はノイフェルト試験結果と合致した。これら１３の単離物の元々のマルチビーズアッセイ結果を再調査すると、元々のマルチビーズで適当な血清型について、３つの単離物が弱く不完全な阻害（阻害は６７％未満であった）を生じた。１２の単離物が当初ＮＴと分類されたが、ひとつの単離物（BZ52）は、当初、型３に分類された。２番目のサンプルはＮＴと再分類され、結果はノイフェルト試験結果と一致した（テーブル１、上掲）。

これらの再調査の後、８つの不一致が再現され、いまだに説明がついていない（テーブル２およびテーブル３）：５つの単離物がノイフェルト試験で６Ａと分類されたが、マルチビーズアッセイではＮＴと分類され、ふたつの単離物（BZ435およびBZ705）がノイフェルト試験で１１Ａと分類されたが、マルチビールアッセイではＮＴと分類され、ひとつの単離物（BZ438）はノイフェルト試験でＮＴと分類されたが、マルチビーズアッセイでは１８Ｃと分類された。ノイフェルト試験では、BZ438は血清群分類用Poolsera AおよびQ［Sorensen, 1993］のいくつかのロットと反応せず、それらは血清群１８肺炎連鎖球菌と反応すべきであった。それは、また、血清群１８に特異的な、または因子１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、および１８ｆに特異的な抗血清のいくつかの異なるロットにも反応しなかった。BZ438は、しかしながら、血清群１８−特異的ポリクローナル血清に対して、または、mAb Hyp18CM1に対して、陽性のドットブロット結果を生じなかった［Yu et al., 2005］。かくして、BZ438単離物は１８Ｃと考えられた。

株BZ435およびBZ705は、ノイフェルト試験で１１Ａと考えられたが、マルチビーズアッセイでは１１Ａ、１１Ｄまたは１１Ｆと考えられなかった。標準マルチビーズアッセイは血清群１１に対するポリクローナル抗血清を用いるので［Yu et al., 2005］、これらふたつの株は、血清型１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｆに特異的であって、ＵＡＢ研究所で最近生じたふたつのmAbs （Hyp11AM1およびHyp11AM2）で調査した（テーブル２）。興味深いことに、Hyp11AM1はBZ435を認識するがBZ705を認識しない。興味深いことに、Hyp11AM2はいずれの株も認識せず、１１Ａ血清型を発現する株の間の異質性を示す。ＰＣＲ試験は、１１Ａ、１１Ｄ、および１１Ｆについての株で４６３塩基対のアンプリマーを生じるが、１１Ｂおよび１１Ｃについては生じない（テーブル２）。両方の株をこのＰＣＲで試験すると、BZ435は陽性であったが、BZ705は違った。ノイフェルト試験は、両方の株が因子１１ｃに特異的な抗血清と反応することを示したが、ノイフェルト試験はそれらの間の違い：Poolserum T ［Sorensen, 1993］と、血清群１１抗血清と、または１１ｆ因子血清と反応するのはBZ435であってBZ705ではないことも明らかにした。BZ705は１１ｂ発現について不明りょうな結果を生じ、それは血清型１１Ｄであろうことが示唆された。ウサギ型分類用血清を用いた血清群１１についてのドットブロット試験においては、しかしながら、BZ435は陽性であったが、BZ705は陰性であった。これらの結果すべてを考慮すると、BZ435は11A株であり、BZ705は11A、11D、または11Fではないようである。BZ705は、１１Ｃ血清型に属するのであろう。なぜならば、BZ705は、１１Ｂ株には発現されない１１ｃエピトープを発現（および１１ｃ抗血清と反応）するからである。

６Ａであった残りの不一致株を調査するために、wciP遺伝子のＤＮＡ配列を調べた。最近の研究は、６Ａおよび６Ｂの莢膜ＰＳはリビトールに連結されたラムノースの繰返し単位を有することを報告する。そのリンケージは、６Ａについては１−３であり、６Ｂについては１−４である。この研究は、ラムノシルトランスフェラーゼが、おそらく、莢膜座におけるwciP遺伝子によってコードされること、６Ａについて、wciPが残基１９５にてセリンをコードすること、および６Ｂについて、wciPが残基１９５にてアスパラギンをコードすることを見出した［Mavroidi et al., 2004］。また、wciP対立遺伝子１、２、７、９および１１は、専ら、血清型６Ａに関連し、対立遺伝子３、４、５、６、８、および１２は血清型６Ｂに関連する。［Mavroidi et al., 2004］。

6AならびにBZ652と表示する５つの単離物から細菌ＤＮＡを得た。それはノイフェルト試験でほんのわずかに６Ａと考えられた。このＤＮＡをＰＣＲによってwciP遺伝子の一部に増幅し、アンプリコンを配列決定し、その配列（６４５塩基対）を調査した。５つのサンプルの増幅が成功し、それらの配列は、６Ａ血清型と一致した。なぜならば、それらは６Ａ血清型と関連する対立遺伝子を発現し（テーブル３）、アミノ酸残基１９５にてセリンを発現したからである。対立遺伝子２ wciPのプロトタイプ配列と比較すると、BZ652のwciP配列は、３つの潜在的なアミノ酸置換を生じる５つの塩基対変化を有していた。３つの単離物（BZ17、BZ39、およびBZ86）は、対立遺伝子#9のプロトタイプ配列からひとつの同一ヌクレオチド変化を持つ同一wciP遺伝子配列を発現し、それゆえ、クローン上関連するであろう（テーブル３）。

ＤＮＡ研究はこれらの単離物が６Ａ血清型に属するであろうことを示唆したので、ポリクローナル抗血清を用いるマルチビーズアッセイで、これらの単離物を調査した。６つの単離物すべてが６Ａと分類された（テーブル３）。それらを、Hyp6AM3に加えて、１９の異なる６Ａ特異的mAbに分類すると、１つのmAb（Hyp6AG1）が６つの単離物を６Ａと同定した（テーブル３）。Hyp6AG1を用いて、４６の６Ａ単離物を再試験すると（２１はこの研究から、２４はアラバマ大学バーミンガム校研究所コレクションから）、このmAbはこれらすべてを６Ａと同定したこと、および、６Ｂ血清型を発現する４３の単離物を含む８９の非−６Ａ血清型のいずれをも認識しなかったことが分かった。かくして、これら６つの単離物すべてが６Ａであること、およびHyp6AG1はすべての６Ａ単離物を認識することは明確である。また、mAb Hyp6AM3は6A単離物のサブセットを認識するが、そのサブセットは非常に大きい

実施例２．様々な国からの肺炎連鎖球菌血清型６Ｃ単離物は、６Ａに関連する分子的特徴を有する。
上記したように、以前は血清型６Ａに関連した両方のmAbと反応しなかったブラジル単離物は、wciP対立遺伝子を調査することによって６Ａ血清型に属することが示された。かくして、発明者らは、地理的に離れた地域からの１０の６Ｃ単離物のwciP遺伝子を調査した。２００３年および２００４年に収集したブラジル単離物および米国単離物および韓国からのひとつの単離物を調査した。それらの配列は、１０の単離物すべてが６Ａ血清型に関連する遺伝子的特徴を有することを、明確に示した。

実施例３．様々な領域からの６Ｃ単離物は均一な血清学的特徴を有する。
定量的なやり方で６Ｃ単離物の血清学的特徴を調査するために、インヒビションアッセイを用いて単離物を調査した。このアッセイは、6A PS−被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合する様々な抗６Ａ抗体の細菌ライゼートによる阻害を測定する。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（Corning Costar Corp., Acton, MA）のウェルを、ＰＢＳ中で一晩、３７℃にて５μｇ／ｍＬの６あ莢膜ＰＳ（G. Schiffman, Brooklyn, NYの贈呈）で被覆した。プレートを０．０５％のTween 20を含有するＰＢＳで洗浄した後、予め希釈した細菌培養上清（すなわち、ライゼート）を抗６Ａ抗体とともにウェルに添加した。肺炎連鎖球菌ライゼートを、０．５％酵母抽出物で補給したTodd-Hewlett（THY）１０ｍＬ中で、振盪することなく、管が濁るまで、肺炎連鎖球菌を成長させ、ついで、それらの管を溶解バッファー（脱イオン水中の0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.01%SDS、および0.15Mクエン酸ナトリウム）で３７℃にて１５分間インキュベートすることによって調製した。Hyp6AG1 mAbは１：２５０希釈にて用い、Hyp6AM3 mAbは１：１００希釈にて用いた。スタテンス・セールム・インスティトゥート（Copenhagen, DK）からのPool Qおよび因子「6b」ウサギ抗血清は１：５００希釈にて用いた。３７℃にて加湿インキュベータでの３０分間インキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ−コンジュゲーティドヤギ抗マウスＩｇ（Sigma, St. Louis, MO）またはアルカリホスファターゼ−コンジュゲーティド−ヤギ抗−ウサギＩｇ（Biosource, Camarillo, CA）で２時間インキュベートした。ウェルに固定化した酵素量は、ジエタノールアミンバッファー中のリン酸パラニトロフェニル基質（Sigma）で定量した。４０５ｎｍにての光学濃度はマイクロプレートリーダー（BioTek Instruments Inc. Winooski, VT）で読み取った。

膨張反応の定量特質は６Ａ亜型を防止したのであろうから、それらの亜型が膨張反応の用いるウサギ血清を用いた定量アッセイで識別可能かどうかが決定された。これは、そのウサギ血清をインヒビションアッセイに適用することによって決定した。そのインヒビションアッセイにおいて、肺炎連鎖球菌ライゼートは、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された6A PSに対するウサギ抗血清の結合を阻害することが許容された（図１）。対照として、肺炎連鎖球菌ライゼートをふたつのmAbs：Hyp6AG1およびHyp6AM3の阻害につき試験した（図１Ａおよび１Ｂ）。３つの6Aα単離物（米国からのCHPA378、韓国からのKK58、およびブラジルからのST558）のライゼートが、両方のmAbを阻害し、２つの６Ｂ単離物（株ST400およびブラジルからのST518）はいずれのmAbも阻害しなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。6C単離物（ブラジルからの株BZ17およびBZ650を含む）の３つのライゼートは、１：１０００希釈にてさえも、Hyp6AG1の結合を明らかに阻害した（図１Ａ）。それらは、しかしながら、１：１０希釈にてさえも、Hyp6AM3の阻害はほとんどなかった（図１Ｂ）。

Pool Q（しばしば、血清型分類に用いられるウサギ抗血清［Sorensen, 31 J. Clin. Microbiol. 2097-2100 (1993)］）の阻害について肺炎連鎖球菌ライゼートを調査すると、6Aおよび6Cの双方ライゼートは等しく十分に阻害するが、６Bライゼートは阻害できなかった（図１C）。「６ｂ」−因子−特異的ウサギ血清を試験すると、6A、6C、および6B単離物はすべて因子血清を等しく十分に阻害した（図１Ｄ）。６ｂ−因子血清は６Ａ特異的に設計されているので、これは予期されなかった。その因子血清は膨張反応において特異的に設計されているが、このインヒビションアッセイにおいては特異的ではない。それにもかかわらず、この実験は、肺炎連鎖球菌型分類に普通に用いられるウサギ抗血清が６Ａおよび６Ｃ亜型を識別しないことを示す。

オプソニン作用アッセイおよび高いレベルの抗６Ｂ抗体を持つヒト血清を用いて、様々な6A、6C、および6B単離物を比較した。ヒト血清は、６Ｂならびに６Ａをオプソニン化したが（図２）、それは、ブラジル、韓国、および米国からの７つの異なる６Ｃ単離物をオプソニン化しなかった（図２）。

実施例４：ヒト抗血清は、6Aおよび6Cに対して等しく保護的ではない。
ヒト抗血清は、６Ａおよび６Ｂをオプソニン化できるが、6Cをオプソニン化できないので、6A、6B、および6C血清型をオプソニン化することについて、２０人の成人からの血清サンプルを調査した（図３Ａ）。どの血清提供者も、少なくとも５年間は、肺炎連鎖球菌ワクチンでワクチン接種されていない。ほとんどの個人が低いオプソニン作用力価を有するが、４人の個人が血清型６Ｂに対して１００を超えるオプソニン作用力価を有していた。その４人の個人からの血清は６Ａに対して顕著なオプソニン作用力価を有していたが、たった一人だけ６Ｃに対して顕著な力価を有していた。この観察は、この成人母集団は６Ａに対してよりも６Ｃに対して、低い天然免疫を有することを示唆する。

６Ｂでの免疫化が６Ｃと交差反応する抗体を誘発するかどうかを調査するために、肺炎連鎖球菌ワクチンで免疫化された２０人の成人からの血清を研究した（図３Ｂ）。１０人の成人を９価肺炎連鎖球菌コンジュゲートワクチン（PCV）で免疫化し、１０人を２３価PSワクチン（PPV）で免疫化した。PCVで免疫化した１０人のうち８人が、６Ｂについて高いオプソニン作用力価（＞１００）を有していた。これらの８人のうち、７人が、６Ｂ力価と等しい６Ａに対するオプソニン作用力価を有していたが、ただ一人だけ６Ｂ力価と等しい６Ｃ力価を有していた。この人の血清はほとんど６Ｂと同じ様に６Ａをオプソニン化したので、誘発された抗６Ｂ抗体は６Ｃと交差反応していたのであろう。PPVワクチンを調査すると、５人が、６Ｂに対して高いオプソニン作用力価（＞１００）を有し、２人が６Ａに対して高い力価を有していたが、６Ｃに対して高い力価を有するものはいなかった（図３Ｂ）。まとめると、これらの発見は、現在入手可能な肺炎連鎖球菌ワクチンは、６Ｃ感染に対してよりも６Ａに対して保護を提供することができる。

実施例５．肺炎連鎖球菌を同定するのに有用なモノクローナル抗体の開発
マウスハイブリドーマをすでに記載されているように作成した。［Sun et al., 69 Infect. Immun. 336-44 (2001)を引用するYu et al., 2005］。簡単に言えば、BALB/cマウスを、PS-タンパク質コンジュゲートで２回皮下免疫化し（０日目および２１日目）、５９日目に腹腔内的に１回免疫化した。７つの血清型（4、6B、9V、14、18C、19F、および23F）の免疫原はPrevnar （Wyeth Lederle Vaccines, Pearl River, NY）であった。血清型５および７Ｆに用いるコンジュゲートは米国食品医薬品局 (the U.S. Food and Drug Administration) (Bethesda, MD)で調製し、6AコンジュゲートはPorter Anderson （Rochester, NY）の贈呈であり、オブアルブミンに対する血清型１、３、および９Ｎのコンジュゲートは次のように調製した。臭化シアン−活性化PSを一晩インキュベーションの間にオブアルブミンに結合した。このPS-タンパク質コンジュゲートを分子量サイズ分別カラムで反応混合物から精製した。各用量は、血清型4、9V、18C、19F、および23Fについて１μｇのＰＳ；血清型3および6Bについて２μｇ；および血清型1、5、6A、7F、および9Nについて１０μｇ含有した。一次および二次免疫源は１μｇのQuil A （Sigma Chemical, St. Louis, MO）を含有した。

最後の免疫化から３日後、マウスを犠牲にし、それらの脾臓を収獲し、ついで、すでに記載されているように、SP2/0 Ag-14でその脾細胞を融合した。［Nahm et al., 129 J. Immunol. 1513-18 (1982)］。一次培養ウェルを所望の抗体の生成についてスクリーニングし、そのような抗体を生成するウェルを限界希釈によって２回クローン化した。ヒト−マウスハイブリドーマ、Dob9を、すでに記載されているように、２３価ＰＢワクチンで免疫化した人からの末梢血リンパ球をハイブリダイズすることによって生成した。［Sun et al., 67 Infect. Immun. 1172-79 (1999)］。

ヒト−マウスハイブリドーマは肺炎連鎖球菌血清型19Aおよび19Fに対して特異的である。すべてのハイブリドーマはIgMまたはIgG抗体のいずれかを生成するが、ひとつのIgAプロデューサーだけは例外である。Hyp6AG1はIgGであり、Hyp6AM6はIgMである。

6A血清型に対して特異的な２１のハイブリドーマの全体を単離した。多くは、同様の血清学的挙動を有し、いくつかは娘クローン（すなわち、いくつかは同一の可変領域構造を有する）。生成した６Ａ−特異的ハイブリドーマの名称は、Hyp6A1, Hyp6AM1, Hyp6AM2, Hyp6AM3, Hyp6AM4, Hyp6AM5, Hyp6AM6, Hyp6AM7, Hyp6AM8, Hyp6AM9, Hyp6AM10, Hyp6AM11, Hyp6AM12, Hyp6AM13, Hyp6AG1, Hyp6AG2, Hyp6AG3, Hyp6AG4, Hyp6AG5, Hyp6AG6, Hyp6AG7である。

実施例６．6Cの遺伝子学的研究
非莢膜肺炎連鎖球菌株は、6C単離物からの遺伝子で形質転換することができる。この発見は、6C莢膜合成が（複数ではなく）ひとつの遺伝子フラグメント、おそらくは莢膜遺伝子座を必要とすること、を示唆する。6Aβ発現を担う遺伝子を同定するために、３つのトランスフェラーゼ（wciN、wciO、およびwciP）を調査した。このwciP遺伝子は、6Aおよび6C単離物の間に等しい（上記）。プライマー5016および3101（5106: 5'-TAC CAT GCA GGG TGG AAT GT および3101: 5'-CCA TCC TTC GAG TAT TGC）を用いるPCRによってwciN領域を調査すると、調査した９つすべての6Aα単離物が、調査した６つすべての6C単離物が産生するよりも２００塩基対（ｂｐ）長い産物を生じた。これら６つの単離物は、韓国、米国、およびブラジルからの6C単離物を含む。かくして、このPCRは６A亜型についての遺伝子学的試験として使用できる。

ひとつの6A単離物（AAU9）からおよびひとつの6C単離物（ST745）からのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を次に決定した（図６）。AAU9 ＰＣＲ産物における位置１２０３から２９５９（１７５７塩基）の間のすべての塩基を配列決定し、その配列は、GenBankデータベースで報告されている６Ａ単離物の莢膜座配列であるCR931638に相同的であることが分かった。対照的に、ST745配列は、位置１３６８まで、および位置２５９１から再び始まる6Aαの配列とほぼ同一であることが分かった。介在する１０２９ｂｐ配列（１３６９から２３９７まで）は６Ａのものと全く異なる。この介在配列は、ストレプトコッカス・サーモフィリスによる多糖類合成に用いられるトランスフェラーゼに類似する約９８ｂｐを含有する。

実施例７．6C単離物は化学的に明確な莢膜を有する。ふたつの６Ｃ単離物（BZ17およびBZ650）、４つの６Ａ株（SP85、ST558、およびCHPA378）、およびふたつの６B種（ST400およびST518）を比較した。すべての肺炎連鎖球菌単離物は肺炎連鎖球菌に典型的なコロニーモルホロジーを有し、オプトヒン感受性かつ胆汁溶解性であった。亜型分類アッセイを上記の実施例３に記載するように実行した。

多糖類単離および精製：肺炎連鎖球菌株（SP85またはBZ17）を、JRH Biosciences （Lenexa, KS）からの２リットルの化学的に規定された培地［van de Rijn et al., 27 Infect. Immun. 444-49 (1980)］であって、塩化コリン、炭酸水素ナトリウムおよびシステイン−ＨＣｌで補給されたものの中で成長させ、ついで、０．０５％デオキシコリン酸塩で溶解した。遠心により細胞デブリを除去した後、ＰＳを７０％エタノールで沈殿させ、それを１２０ｍＬの０．２Ｍ ＮａＣｌに溶解することによって回収した。そのＰＳを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に透析した後、そのＰＳをＤＥＡＥ−セファロース（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）カラムに充填し（５０ｍｌ）、ＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。得られたフラクションを上記のインヒビションアッセイで6Aαまたは6Aβ PSにつき試験した。ＰＳ含有フラクションをプールし、エタノール沈殿（７０％）によって濃縮し、透析し、ついで、凍結乾燥した。凍結乾燥したＰＳを３ｍｌの水に溶解し、１２０ｍｌのセファクリルS-300 HR （Amersham Biosciences）を含有するゲル濾過カラムに充填した。このＰＳを水でカラムから溶出させ、すべてのフラクションをインヒビションアッセイで6Aβ PSにつき試験した。最初の6Aαまたは6Aβ PS ピークを含有するフラクションをプールし、凍結乾燥した。

単糖類分析：凍結乾燥した莢膜ＰＳを８０℃にて１６時間、１．５Ｍ ＨＣｌ中で化メタノール分解に付した。メタノール性ＨＣｌをエバポレートした後、室温にて２０分間、Tri-Sil試薬（Pierce Biotech. Inc. Rockford, IL）で残渣を処理した。反応生成物を、３０ｍ（直径０．２５ｍｍ）のVF-5キャピラリーカラムを取り付けたＧＬＣ／ＭＳ（Varian 4000, Varian Inc. Palo Alto, CA）で分析した。カラム温度は、５分間１００℃に維持し、ついで、２０℃／分にて２７５℃まで昇温し、最終的に５分間２７５℃に保った。溶出物をエレクトロン衝撃イオン化モードを用いる質量分析によって分析した。

酸化、還元、および加水分解：莢膜ＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、暗闇中４℃にて４日間、８０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝４）中の４０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムで処理した。過剰な過ヨウ素酸塩をエチレングリコールで中和した後、サンプルを透析し、凍結乾燥した。［Stroop et al., 337 Carbohydr. Res. 335-44 (2002)］。そのＰＳを、室温にて３時間、２００ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄）またはその重水素体（NaBD₄）で還元した。酸化／還元された6C PSを８５℃にて３０分間0.01M NaOH中で加水分解し、0.01M HClの添加により中和し、ついで、脱塩せずに、質量分析に直接用いた。

タンデム型質量分析：未処理および酸化／還元した６Ｃのタンデム型質量スペクトル分析を、アラバマ大学バーミンガム校の質量分析共有設備において、エレクトロスプレイイオン源を備えたMicromass Q-TOF2質量分析計（Micromass Ltd. Manchester, UK）で行った。それらのサンプルを蒸留水に溶解し、ハーバードシリンジポンプを用いて１μＬ／分の速度にて、ランニングバッファー（０．１％ギ酸を含有する５０／５０のアセトニトリル／水）に沿って質量分析計に注入した。注入したサンプルはエレクトロスプレイ（針電圧＝２．８ｋＶ）で負にイオン化し、ＴＯＦ質量分析計で検出した。MS/MSについて、親イオンは、アルゴンガスと衝突する前に、４０ｅＶでエネルギーを与えて娘イオンに断片化した。娘イオンをＴＯＦ質量分析計で分析した。MS/MSスペクトルをMassLynx 3.5のMax-Ent3モジュールを用いて処理した。

スミス分解およびグリセロール検出：６Ａおよび６Ｃで処理した過ヨウ素酸塩を、１Ｍ水酸化アンモニウム中の１０ｍｇ／ｍｌ重水素化ホウ素ナトリウムで１６時間還元した。過剰な重水素化ホウ素ナトリウムを表酢酸の添加によって除去し、０．５ｍｌのメタノール：酢酸（９：１）を添加した。サンプルを窒素流下で乾燥させ、０．２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥したサンプルを０．５ｍｌの１．５Ｍメタノール性ＨＣｌに懸濁し、８０℃にて１６時間インキュベートした。サンプルを窒素流下で乾燥させ、０．２５ｍｌのメタノールで２回洗浄した。乾燥したサンプルを０．１ｍｌのTri-Sil （Pierce）に懸濁し、８０℃にて２０分間インキュベートした。１μｌのサンプルを６０ｍ VF-1カラムを備えたVarian 4000ガスクロマトグラフ質量分析計（Varian Inc., Palo Alto, CA）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして１．２ｍｌ／分の定常流速にて用いた。オーブン条件は、５０℃の初期温度を２分間保ち、１５０℃まで３０℃／分にて昇温し、さらに２２０℃まで３℃／分にて昇温し、その温度を２分間保った。インジェクター温度は２５０℃に維持し、ＭＳトランスファーラインを２８０℃に維持した。ＭＳデータ獲得パラメータは、エレクトロン衝撃（ＥＩ）モードで、または、アセトニトリルを用いる化学イオン化（ＣＩ）モードで、ｍ／ｚ４０から１０００までスキャンすることを含んだ。

6A PSのクロマトグラフィーは、リビトール、ラムノース、グルコース、およびガラクトースを特徴付けるすべてのピークを示し（図７）、以前の刊行物と一致した。［Kim et al., 347 Anal. Biochem. 262-74 (2005)］。例えば、ガラクトースは１１．２および１１．６分の保持時間に現れる３つの主要ピークと最も高い第２ピークを生じる。［Kim et al. (2005)］。6C PSクロマトグラムを調査すると、リビトール、ラムノース、およびグルコースの特徴ピークは見出されるが、ガラクトースピークはなかった。各炭化水素ピークの面積をラムノースピーク面積に対して規格化し、６Ａおよび６Ｃ（図７Ｂ）と比較すると、６Ａおよび６Ｃはリビトールピークと同等の面積を有する。６Ｃのグルコースピーク面積は、しかしながら、６Ａの面積の２倍であった（図７Ｂ）。この発見は、６Ｃの繰返し単位は、６Ａと同じく、ひとつのリビトールおよびひとつのラムノースを有するが、グルコースおよびガラクトース分子ひとつずつのかわりにふたつのグルコース分子を有することを示した。かくして、６Ｃは、ガラクトースの代わりにグルコースを用いることによて６Ａにより産生されたＰＳとは化学的に異なる莢膜ＰＳを産生する。

6C PSに存在すると仮定されたふたつのグルコース分子をさらに調査するために、6Aおよび6C PSを隣接するグリコールを選択的に破壊する過ヨウ素酸で処理した。6A PSの公開された構造から期待されるように、6A PSのガラクトースおよびリビトールピークは検出されなくなったが、グルコースおよびラムノースピークは影響されなかった。［Kamerling, Pneumococcal polysaccharides: a chemical view, in Mol. Biol. & Mechanisms of Disease 81-114 (Mary Ann Liebert, Larchmont, 2000); Kim et al., 347 Anal. Biochem. 262-74 (2005); Rebers & Heidelberger, 83 J. Am. Chem. 3056-59 (1961)］。6C PSを過ヨウ素酸塩処理すると、そのリビトールは検出されなくなり、そのグルコースピークは約半分に減少したが、そのラムノースピークは影響されなかった（図７Ｂ）。この発見は、6A PS構造が、文献で公開された6A PS構造と同一であることを強く示している。また、6C PSは6A PSと化学的に異なること、および、6C PSはふたつのグルコース分子を有し、そのうちの一方は過ヨウ素酸塩に感受性があり、他方は感受性がないことが示唆される。

実施例８．繰返し単位内の単糖類／リビトール配列の決定
6A PSの穏和なアルカリ分解は各繰返し単位中のリン酸ジエステル結合を切断し、負電荷の繰返し単位を生じ、ついで、それをタンデム型質量分析で調査できる。（株SP85からの）6A PSの加水分解生成物は、３つのよく分裂した負電荷のピーク：683.21、701.21、および759.19質量電荷比（ｍ／ｚ）単位のピークを示した（図８Ａ）。683.21ｍ／ｚ単位のピークは、701.21ｍ／ｚ単位のピークの無水物形態を表し、759.19のピークはＮａＣｌ塩のついた701.21ｍ／ｚ単位の分子を表す。これは、繰返し単位の質量が、記載されるように683.21質量単位であることを示す。［Kamerling, 2000; Kim, 2005］。701.21ピークの娘イオン（生成物イオン）を調査すると、539.13、377.08、および212.99ｍ／ｚ単位の質量を持つ娘イオンを生じていた。それらは、それぞれ、グルコース−ラムノース−リビトール−Ｐ、ラムノース−リビトール−Ｐ、およびリビトール−Ｐのフラグメントの質量に相当する（図８C）。また、それらの無水物対応物は、701.21、539.14、377.08、および212.99ｍ／ｚ単位にある。96.94m/zおよび78.93ｍ／ｚ単位に観察されたさらなるピークは、H₂PO₄ ^-およびPO₃ ^-のイオンを表す（図８Ｃ）。

6A PSに用いたのと同じ手順を用いる6C PSの分析は、683.24、701.25、および759.22ｍ／ｚ単位に３つの主要ピークを示し、6A PSで見出された３つの主要ピークに相当する（図８Ｂ）。また、６Ｃ切断生成物は６Ａのものと同一の質量スペクトルを有していた（図８Ｄ）．この発見は、6C PSの繰返し単位の質量は683.2ｍ／ｚ単位であること、および6C繰返し単位の炭化水素配列がグルコース１−グルコース２−ラムノース−リビトール−Ｐであることを示した。ふたつのグルコースを区別するために、それらをグルコース１およびグルコース２と表示する。グルコース１は６Ａのガラクトースに対応する。かくして。６Ｃの単糖類配列は、ガラクトースがグルコース１と置換されていることを除き、６Ａのものと同一である。

実施例９．6C繰返し単位の炭化水素およびリビトール間のリンケージの決定
過ヨウ素酸塩感受性である６Ｃグルコースを同定するために、穏和なアルカリ分解によって繰返し単位にまで酸化還元し、6C PSをタンデム型質量分析で研究した。それらの質量スペクトルは６５０および７００ｍ／ｚ単位の間にいくつかの主要（かつ優勢な）ピークを示した（図９Ａ）。これらの優勢ピークは、655.23、659.73、661.24、664.25、673.25、および675.24ｍ／ｚ単位にあった。天然同素体のため、各優勢ピークは、さらに１または２の質量単位が付いたサテライトピークを有し、これらのサテライトピークを用いて、家電状態および主要ピークの質量を決定できる。［Cole, ELECTROSPRAY IONIZATION MASS SPECTROMETRY: FUNDAMENTALS, INSTRUMENTATION, & APPLICATIONS (Wiley, New York, 2000)］。例えば、661.24ｍ／ｚ単位の優勢ピークは661.57ｍ／ｚ単位のサテライトピークを有する。これらふたつのピークは0.33ｍ／ｚ単位離れているので、661.24ピークは、３つの負電荷および1983.72質量単位（すなわち、ひとつの水分子を持つ３つの繰返し単位；655.23*2 + 673.76= 1983.72）を持つ分子イオンを表す。同様に、664.25および675.24ピークは、ふたつの負電荷を持つ２つの繰返し単位を表すが、675.24ピークはプロトンと置き換わったナトリウムイオンを有する。673.25および655.23ピークは、ひとつの負電荷をもち、かつ、水分子を持ったまたは持たないひとつの繰返し単位を表す。酸化／還元前の無水物繰返し単位の質量は683.26であったので、この繰返し単位は酸化還元により２８質量単位を喪失した。リビトールおよびグルコースの過ヨウ素酸塩反応生成物を同定するために、リビトールフラグメントをＲｘフラグメントと命名し、ふたつのグルコースフラグメントをＧｘおよびＧｙフラグメントと命名した（図１０Ａ）。

娘イオンは、親イオンを673.25ｍ／ｚ単位でフラグメント化することによって得た（図９Ｂ）。フラグメント化の間、ひとつのフラグメントを別のフラグメントと１原子質量単位（ＡＭＵ）分交換することができる。［Grossert et al., 20 Rapid Commun. Mass. Spectrom. 1511-16 (2006); McLafferty 31 Anal. Chem. 82-87 (1959)］。また、分子イオンはアルゴン衝突セル内で可変的に水和状態になった。［Sun et al., 69 Infect. Immun. 336-44 (2001)］。実際に、これらの娘イオンは18ｍ／ｚ単位の差異に基づき、水和物および無水物ピークの分類できた（図９Ｂ）。673.25、581.16、509.13、347.07、および200.99ｍ／ｚ単位に見出されたピークは、水和物ピークであり、それらの各々は１８ＡＭＵ分少ない対応無水物ピークを有する。また、200.99、347.07および509.13ｍ／ｚ単位のピークは、200、346、および508AMUならびにフラグメント化の間にフラグメント部位に付着したひとつの水素原子を持つフラグメントに対応する（図１０Ｂ）。200.99ｍ／ｚ単位のピークは、過ヨウ素酸塩処理の間にリビトールがCH₂OHを喪失したことを確認する。347.07および509.13のピークは、ラムノースおよびグルコース２が過ヨウ素酸塩耐性であることを示す。581.16のピークの存在は、グルコース１が開裂されたことを示す。

過ヨウ素酸塩開裂はグルコース１をふたつの部分（それらは、図１０ＡにおいてＧｘおよびＧｙと命名された。）に分割する。これらふたつの部分の合わせた質量は１６２（無傷グルコースの質量）ではなく１６４である。なぜならば、グルコース１は炭素を喪失しないが、酸化および還元反応の間に切断部位にふたつの水素原子を獲得したからである。図９に示す質量スペクトルは、それぞれ、91および74AMUを有するＧｘおよびＧｙと一致する。581.16ｍ／ｚ単位のピークは繰返し単位がＧｘおよびひとつの余分のプロトンを喪失したことを示す（図１０）。ＧｘおよびＧｙ双方の中性的な喪失（７４ＡＭＵ）は、72ｍ／ｚ単位のさらなる喪失をもたらす。なぜならば、ＧｙはすでにＧｘに対してひとつの水素を喪失し、グルコース２とともにひとつの水素を放出するからである。同一のパターンが無水物ピーク：すなわち、655.22、563.16、および491.12ｍ／ｚ単位に見出された。さらに、6Aβ PSをNaBD₄,で還元すると、２だけ多い質量単位はグルコース１に関連した：Ｇｘフラグメントの中性的喪失は９２ではなく９３であり、Ｇｙのそれは７２ではなく７３であった（図４Ｃ）。これらの発見は、グルコース１が図１０Ａに示すサイズでＧｘおよびＧｙに開裂したことを明確に示した。

娘イオンの質量スペクトルも6Aβ PSのグルコースリンケージについての情報を提供する。グルコースおよびラムノースはそれらの第１炭素に先行する炭化水素に連結されなければならない。［Rebers & Heidelberger, 1961］。また、それらは、過ヨウ素酸塩に耐性があるためには、第３炭素に後続する炭化水素に連結されなければならない。［Rebers & Heidelberger, 1961］。かくして、6C PSは、グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→）を有しなければならない。これらの娘イオンのさらなる調査は、それらのグルコース１がその第２炭素にリン酸ジエステル結合を有することを示す。過ヨウ素酸塩感受性であるためには、グルコース１はそのリン酸ジエステルリンクを２位、４位または６位にのみ有しなければならない。リン酸ジエステル結合リンケージは６位にはない。なぜならば、６位のリンケージはグルコース１の炭素原子の喪失をもたらすからである（図１０Ｆ）。リン酸ジエステルリンケージが４位にあれば、切断は第２および第３炭素の間で発生する。ＧｘｘおよびＧｙは、それで、１２０および４２ＡＭＵを有し、581ｍ／ｚ単位のピークではなく552ｍ／ｚ単位のピークが検出されなければならない（図１０Ｅ）。

加水分解はグルコース１とのリン酸ジエステル結合を開裂するが、時折、それは、代わりに、リビトールとのリン酸ジエステルを切断する。この逆開裂生成物の調査は、リン酸ジエステルリンケージがグルコース１の第２炭素になければならないことをさらに確認した。150.95および243.00ｍ／ｚ単位のピークはグルコース１の逆開裂生成物である（図９Ｂ）。なぜならば、これらのｍ／ｚ単位の生成物は第２炭素にあるリン酸ジエステル結合を持つグルコースから生成され得（図１０Ｄ）、かつ、これらのピークは、NaBH₄ではなく、NaBD₄で還元したならば、１（150.95→151.97）または２（243.00→245.02）だけ多いｍ／ｚ単位を有するからである（図９Ｃ）。150ｍ／ｚ単位のイオンが末端メタノール基を喪失するならば、120.95ｍ／ｚ単位のイオンも得られる。これらのピークは、リン酸ジエステル結合が第４または第６炭素にあるならば、説明が付かない（図１０Ｅおよび１０Ｆ）。かくして、逆開裂生成物のデータもリン酸ジエステル結合がグルコース１の第２炭素の連結していることを示す。

質量スペクトルのさらなる調査は、ラムノース−リビトールリンケージが（1→3）でなければならないことを示した。肺炎連鎖球菌は、それらの莢膜合成に関するテイコ酸合成について生成されるCDP−５−リビトールを用いるので［Pereira & Brown 43 Biochem. 11802-12 (2004)］、リビトールおよびグルコース１の間のリンケージはリビトール（5→P→2）グルコース１でなければならない。78.94および96.94のピークはPO₃ ^-およびH₂PO₄ ^-に対応し、182.98および200.99のピークは（図９Ｂ）、PO₃ ^-およびH₂PO₄ ^-に付着したＲｘフラグメントに対応する（図１０Ａ）。かくして、リビトールは、酸化および還元反応の間に、ヒドロキシメチル基を喪失しなければならず、ラムノースおよびリビトールの間のリンケージはラムノース（1→3）リビトールでなければならない。上記をすべて考慮すると、6Aβ繰返し単位は、{P→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→3）リビトール（5→}でなければならない（図１０Ｃ）。

6A PSを分析すると、6C PSピークと同一のピークが見出され、それは、ガラクトースおよびリビトールが過ヨウ素酸塩によって破壊されたが、グルコース２およびラムノースは無傷で保たれたことを示す。かくして、6A PSの構造は、{→2）ガラクトース（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→3）リビトール（5→P）でなければならず、それは文献に公開された6A PS構造と同一である。［Kamerling, 2000; Rebers & Heidelberger, 1961］。まとめると、6Aおよび6C PSの間の構造的差異はグルコース１（またはガラクトース）の第４炭素のヒドロキシル基の向きである。

典型的に、酸化および還元された6A PSのスミス分解後にグリセロールが放出されることを実証することによって、6A PSのリン酸ジエステル結合はガラクトースの第２炭素にあることが決定された。［Rebers & Heidelberger, 1961］。この古典的手法を用いて６Ｃリン酸ジエステル結合の位置を確認するために、酸化および還元後に6Aおよび6C PSのスミス分解を上記のように行った。6Aおよび6C PSの反応生成物はふたつのPSからのグリセロールを示した。かくして、グルコース１はグルコース１の第２炭素にリン酸ジエステル結合を有する。

実施例１０．血清型6Cの遺伝子起源
細菌株および培養：6C研究に用いられた肺炎連鎖球菌株をテーブル４に列記する：

^a CSF、脳脊髄液。
^b TIGR4は、元来、血液から単離された。［Tettelin al., 293 Science, 498-506 (2001)］。

以前に報告したブラジルからの６Ｃ単離物［Lin et al., 2006］に加えて、「６Ａ」血清型として当該研究所に届いた前から存在する肺炎連鎖球菌単離物を再度型分類することによって、さらなる６Ｃ株を同定した。コレクションは、［Robinson et al., 184 J. Bacteriol. 6367-75 (2002)］および［Mavroidi, 2004］による研究に用いられた６Ａ単離物を含む。ひとつの株（BGO-2197）は、１９７９年に米国アラバマ州バーミンガムで単離された。TIGR4JS4株は、TIGR4株の非莢膜化変異体であり［Tettelin et al., 293 Science 498-506 (2001)］、４型莢膜遺伝子座をヤヌスカセット（kan^R-rpsL⁺）で置換し、３回野生型TIGR4に戻し交配することによって生成した［Trzcinski et al., 69 Micorbiol. 7364-70 (2003); Hollingshead（未公開）］。TIGR6AX、TIGR6A4、およびTIGR6C4は、それぞれ、莢膜型を発現しない、6A、または6C莢膜型を発現するTIGR4JS4変異体である。これらの変異体は以下のようにして生成した。

PCRおよびＤＮＡ配列決定：この研究に用いたすべてのＰＣＲプライマーをテーブル５に列記した。多座配列型分類（ＭＬＳＴ）に用いるプライマーは［Enright & Spratt, 144(11) Microbiol. 3049-60 (1998)］によって記載され、wciN、wciO、およびwciP遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは［Mavroidi et al., 2004］によって記載された。さらなるプライマーは、GenBankにおける６Ａおよび６Ｂ莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列（それぞれ、登録番号CR931638およびCR931639）を用いて設計した。

莢膜遺伝子座PCRに関して、反応混合物は、１０ｎｇから３０ｎｇの染色体ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの１０×バッファー溶液、０．５μｌ（２．５Ｕ）のTaqポリメラーゼ（Takara Biomedical, Shiga, Japan）、および３９．５μｌの滅菌水（Sigma, St Louis, MI）を有した。多座配列型分類用の反応混合物は、１０ｎｇないし３０ｎｇの染色体ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌストックからの１μｌの各プライマー、２μｌのMgCl₂、５μｌのQ-液（Qiagen, Chatsworth, CA）、１２．５μｌのMaster Mix（Qiagen）、および４μｌ滅菌水（Sigma）を有した。Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega, Madison, WI）を用いて、製造業者のインストラクションにしたがって、染色体ＤＮＡを単離した。熱サイクル条件は：９５℃にて３分間の初期変性、９５℃にて１分間の変性、５２℃から５８℃にて１分間のアニーリング、７２℃にて２分間の伸張を３０サイクル、および７２℃にて１０分間の最終伸張であった。多座配列型分類は３０サイクルを用い、莢膜座遺伝子PCRは３５サイクルを用いた。これらのＰＣＲ産物のサイズを１％〜１．５％アガロースゲル中の電気泳動によって決定した。

これらのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は、自動化ＤＮＡシーケンサーを用いて、アラバマ大学のゲノミック・コア・ファシリティーによって決定し、それらのＰＣＲ産物はWizard PCR Cleanup Kit （Promega）で精製した。ＤＮＡ配列は、Lasergene v. 5.1ソフトウェア(DNASTAR, Madison, WI)およびNCBI NLM NIHウェブサイトにオンラインで位置するBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で分析した。

莢膜遺伝子座からの配列を以前報告された配列［Mavroidi et al., 2004］と比較した。各配列型の対立遺伝子を、オンライン肺炎連鎖球菌多座配列型分類（MLST）ウェブサイトを用いて割り当てた。配列が異なれば、新たな対立遺伝子番号を割り当てた。すべてのwciNβ配列を、ついで、肺炎連鎖球菌ＭＬＳＴに寄託した。肺炎連鎖球菌単離物CHPA388の完全な莢膜遺伝子座はGenBankに寄託されている。

世界的出典の６Ｃ株の遺伝子プロファイルをテーブル６に提示する。

6Aおよび6C莢膜遺伝子座でのTIGR4変異体の生成：６Ｃ莢膜発現におけるの役割を調査するために、所望する遺伝子または遺伝子フラグメントを、TIGR4から誘導されるが、莢膜遺伝視座を喪失していないTIGR4JS4株に挿入した（図１１）。凍結した形質転換能力のあるTIGR4JS4のアリコートは、それをＴＨＹブロス中で、３７℃にて、６００ｎｍにての光学濃度が約０．４〜０．５になるまで成長させ；それを0.5%酵母抽出物、0.2%ウシ血清アルブミン、0.01%CaCl₂、および13%グリセロールで補給したTodd-Hewittブロス（pH7.2）で１：１００まで希釈し；ついで、２５０μｌのアリコート中でそれを−８０℃にて凍結することによって、作成した。

TIGR4JS4を形質転換するために、凍結した細菌アリコートを解凍し、５０ｎｇの能力刺激ペプチド変異体２ (competence-stimulating peptide variant 2)と混合した。［Trzcinski et al., 2003］。３７℃にて１４分間のインキュベーション後、１００μｌのTIGR4JS4を１０μｌの細菌ライゼート（AAU33株）または１００ｎｇのDNAカセットと混合した。３７℃にて２時間のインキュベーション後、それらの細菌を２００μｇ／ｍｌカナマイシンまたは３００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するヒツジ血寒天プレート上に塗布し、キャンドルジャー内で３７℃にてインキュベートした。抗菌性培地で成長している形質転換体のコロニーを収穫し、ＤＮＡ受容能細菌で３回戻し交配した。

形質転換用のAAU33の細菌ライゼートを調製するために、１０ｍｌのＴＨＹブロスをAAU33株で接種し、６００ｎｍにての光学濃度が〜０．４−０．５になるまで、３７℃にて約５時間培養した。このＴＨＹブロスを遠心して、細菌ペレットを得、このペレット0.1%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.01%硫酸ドデシルナトリウムを含有する0.1mlのクエン酸ナトリウムバッファー（0.15M, pH 7.5）に再懸濁することによって、それを溶解し、ついで、３７℃にて１０分間それをインキュベートした。このライゼート（０．１ｍｌ）は、ついで、0.015Mクエン酸ナトリウム入りの０．９ｍｌの規格化サリンバッファー（pH7.0）と混合し、６５℃にて１５分間熱不活性化した。

TIGR6A4のwciNα遺伝子領域をCHPA388由来のwciNβ遺伝子領域で置換するために、図１１でカセット１およびカセット２と表示するふたつの異なるＤＮＡカセットを調製した。各カセットは３つの部分：標的ＤＮＡを含有する中央コアおよびふたつのフランキングＤＮＡを有する。これらふたつのフランキングＤＮＡが相同組み換え用であり、各々約１Ｋｂであって、wchAまたはwciO-P遺伝子のいずれかから得た。カセット１の中央コアはカナマイシン抵抗性（kanA^R）かつストレプトマイシン感受性（rpsL⁺）遺伝子であり、TIGR4JS4株DNAをテンプレートとして用いるＰＣＲによって得る。これらのフランキングＤＮＡフラグメントはAAU33の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いるＰＣＲによって得た。図１１およびテーブル５に示すすべてのプライマーは、制限酵素部位を有し、３つのＤＮＡフラグメントを連結させるのが容易である。これら３つのＤＮＡフラグメントは適当な制限酵素にで消化し、T4 DNAリガーゼ（New England BioLabs, Beverly, MA）でライゲーションすることによって互いに連結させた。このライゲーション産物をプライマー5113および3102を用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をWizard PCR Cleanup Kit （Promega）で精製し、ヌクレオチド配列決定に付した。ついで、このＰＣＲ産物を形質転換においてドナーＤＮＡとして用いた

カセット２を用いて、抗菌セレクション遺伝子をwciNβ遺伝子で置換した。中央コアはCHPA388からのwciNβ遺伝子を有する。wchAおよびwciO-P ＤＮＡフラグメントは、カセット１について記載するように、AAU33からＰＣＲによって得た（図１１）。

「６Ａ」コレクション中のさらなる６Ｃ株の同定：様々な地域からの６Ｃ血清型の代表コレクションを得るために、「６Ａ」のすでに存在するコレクションを膨張反応［Mavroidi et al., 2004; Robinson et al., 2002］により再試験し、３つの異なる大陸の５つの国々から９つのさらなる６Ｃ単離物を同定した（テーブル４）。これらの単離物は、髄液、血液、および上咽頭サンプルから得、６Ｃは、侵襲性肺炎連鎖球菌感染ならびに無症状保菌者に関連し得ることを示した。ひとつの単離物（BGO2197）はアラバマ州バーミンガムで１９７９年に得た。この発見は、ここに記載するように
初めて同定され単離された６Ｃ血清型は、２７年以上前から存在し、いまや、世界中で見出されることを示している。

多くの6C株は同一の莢膜遺伝子座プロファイルを有するが、異なる配列型を有する：血清型６Ｃについての遺伝子ベースの調査を開始するために、１２の単離物の莢膜遺伝子座プロファイルおよび配列型（ＳＴ）を調査した。ブラジル6C単離物について以前観察されたものと同様に［Lin et al., 2006］、すべての６Ｃ単離物は、ヌクレオチドの違いがないかまたはひとつの違いを持つwciP遺伝子の対立遺伝子９を有する。同様に、すべての６Ｃ単離物は、ヌクレオチドの違いがないかまたはひとつの違いを持つwzx遺伝子の対立遺伝子１を有する。すべての６Ｃ単離物の制限的莢膜遺伝子座プロファイルと対照的に、多座配列型分類は６Ｃ単離物が多様なＳＴを発現することを示す。６Ｃが（ひとつの単離物を除き）複数のＳＴに関連するがひとつの単一莢膜遺伝子座プロファイルとは関連しないという発見は、６Ｃ血清型を担う遺伝子は、おそらく、莢膜遺伝子座あることを示唆する。

6Aおよび6Cの莢膜遺伝子座は、wchAおよびwciO遺伝子の間の領域において異なる：血清型6Aおよび6Cの間の遺伝子学的差異が、血清型６Ａおよび６Ｂの間の差異を担う同一の遺伝子であるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるというのは仮説であった。ＰＣＲを用いてそれらのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を比較すると、それらのwciN遺伝子のサイズが異なることが分かった。すべての６Ｃ単離物のwciN ＰＣＲ産物は約１．８ｋｂ長であり、一方、すべての６Ａ単離物のwciN ＰＣＲ産物は約２ｋｂ長であった（図１２）。6Aおよび6C血清型からのふたつのwciN遺伝子を区別するために、それらを、それぞれ、wciNαおよびwciNβと命名した。

wciNβ遺伝子をさらに調査するために、５つの6C株（BZ17、BZ86、CHPA388、KK177、およびST 260）由来のwchAおよびwciO遺伝子を含むwciNβ遺伝子領域のＤＮＡ配列を比較した。それらの配列はほぼ同一であったので、CHPA388についてのみ実際のＤＮＡ配列を示し（図１３）、他の単離物の配列はGenBankに寄託した。ついで、CHPA388からのwciNβ遺伝子の配列を、GenBankで入手可能な対応する領域の６Ａ配列（No. CR931638）と比較した（図１３）。比較のまとめを図１４に示す。

配列比較により、wciNαおよびwciNβ遺伝子における明確な差異が明らかになった：６Ｃ血清型は、６Ａにおける１２２２ｂｐ長ＤＮＡのかわりに１０２９ｂｐ長ＤＮＡを有する（図１４および図１５）。これらふたつのwciN遺伝子は完全に異なり、配列相同性はたった約５０％である。ＤＮＡ差異は、wchA遺伝子（位置1368）の終端の直後から始まり、wciO遺伝子の開始（6Cについて位置2398および6Aについて位置2631）の上流１３０塩基で終了する（図１４および図１５）。置換遺伝子に隣接するＤＮＡ配列を６Ａおよび６Ｃの間で比較すると、そのフランキング領域に、ふたつのフランキング領域外部よりも著しく多くのＤＮＡ多型が見出された。例えば、置換遺伝子お上流３００塩基は２５の異なるヌクレオチドを有するが、その３００塩基の上流すぐに位置する１５０塩基はたった１つの異なる塩基しか有さない（フィッシャー抽出試験により、p<0.001）（図１５）。同様に、3'方向において、近位の１１０塩基には２０塩基の差異があるが、つぎの３００塩基にはたったの１塩基の差異しかない（フィッシャー抽出試験により、p<0.001）（図１５）。これらの発見は、この特定の6A配列（CR931638）に特有ではない。なぜならば、同様の結果が７つの異なる６Ａ株AAU33、D020-1B、HS3050、CHPA78、KK65、ST19、およびST558の配列で得られたからである。これらの発見は、これらふたつのフランキング領域が６Ａに挿入されて６Ｃを創出した新たな遺伝子の部分であることを示唆する。

これらのフランキング領域は６Ａ莢膜座へのwciNβ遺伝子の相同組換えに関与していたのであろう。さらに、すべての６Ｃ単離物は同一のフランキング領域配列を有する。これは、遺伝子置換がたったの１回だけ発生すること、および、すべての６Ｃ単離物は、この単一創始細菌の子孫でなければならないことを示唆する。

この遺伝子置換で、wciNβは、1125塩基長であって、374アミノ酸のペプチドをコードする新たなオープンリーディングフレーム（ORF）を有し、それはWCINβタンパク質と命名された（図１３）。新たなORFの終止コドンは、wciO遺伝子についてふたつの可能性のある開始コドンの間にあり、それらは6Cの位置2497および2528に位置する。wciNβ遺伝子の配列をデータベースにある配列と比較すると、６Ｃの１１０塩基（６Ｃの１６２７から１７３６まで）は、ストレプト・サーモフィラス株CNRZ1066［Bolotin et al., 22 Nat. Biochem. 1554-58 (2004)］の菌体外多糖類合成遺伝子の９０塩基と８１％相同性を示した（図１３）。また、wciNβ遺伝子の翻訳配列は、スタフィロコッカス・アウレウスのcapH遺伝子の翻訳配列に対して２２％アミノ酸同一性および４４％類似性を有する。［Lin et al., 176 J. Bacteriol. 7005 16 (1994)］。wciNβ遺伝子産物はwaaGファミリーのメンバーである。偶然にも、イー・コリ (E. coli) K-12のwaaG遺伝子産物は、ＬＰＳ合成に関与するα1,3-グルコシルトランスフェラーゼである。［Heinrichs et al., 30 Mol. Microbiol. 221-32 (1998)］。

6Aおよび6C血清型の莢膜遺伝子座の配列は、wciN遺伝子以外の領域においてほんのわずかに異なるだけである：6Aおよび6C莢膜遺伝子座がwciN領域においてのみ異なるのかを決定するために、6C単離物（CHPA388）の莢膜座全体を、６つの重複ｄｎａフラグメントにおけるdexBおよびaliA座間の莢膜遺伝子座全体を増幅するＰＣＲによって分析した。図１６は莢膜遺伝子座の遺伝子マップを示す。CHPA388座全体を図１６に提示する。１４のＯＲＦに含有される６ｃ莢膜遺伝子座は莢膜ＰＳ合成に関与した。これらのＯＲＦは転写方向であり、６Ａ莢膜遺伝子座に見出されたものと正確に対応した。６ＣのＯＲＦは5'末端にてcpsA遺伝子で開始し、3'末端にてrmlD遺伝子で終止する。図１７に示すように、6C莢膜遺伝子座の仮定プロモーター結合領域および転写開始部位はcpsA遺伝子に対する5'であることが分かり、仮定転写ターミネーター部位はrmlD遺伝子に対する3'であることが分かった。さらに、多くの肺炎連鎖球菌莢膜遺伝子に共通して見られるように、座莢膜遺伝子座の両末端の挿入エレメント（または、「tnp」もしくは「トランスポゼース」）配列がある。［Bentley et al., PLoS 遺伝子t 2:e31 (2006)］。座全体のヌクレオチド配列はGenBankに寄託されている。

その配列を6A株の莢膜遺伝子座（GenBank登録番号CR31638）と比較すると、上記wciN領域を除き、６Ｃの莢膜遺伝子座は６Ａのそれに対して非常に相同的（〜９８％）であった。また、相同性は、cpsA ORFの中央で約６０ｂｐと著しく低く（約７８％）、莢膜遺伝子座のいずれかの末端に見出される「tnp」は6Aおよび6C莢膜遺伝子座の間で異なる。6C莢膜遺伝子座は、いくつかの6Aまたは6B莢膜遺伝子座においてwciO遺伝子の上流に存在するINDELを有しない。［Mavroidi et al., 2004］。これらの差異にかかわらず、6Aおよび6C莢膜遺伝子座の間の最も優勢な差異はwciN領域に見出される。

wciN遺伝子領域は、6Aから6Cへの血清型の転換を担う。莢膜遺伝子座の上記比較は、主たる差異がwciN領域にあることを示したが、些細な差異は莢膜遺伝子領域（例えば、cpsA ORF）全体に存在する。莢膜座の外部のいくつかの他の小さな遺伝子的差異は６Ｃ発現に関与し得る。wciN領域のみが関与することを示すために、wciNα領域とwciNβ領域との交換が6A血清型を6C血清型（図１１）に転換するかどうかを調査した。TIGR6Aは、TIGR4の莢膜座を株AAU33由来の6A莢膜遺伝子座で置換することによって生成した。このwciNα遺伝子を、ついで、カセット１でそれを形質転換することによってTIGR6Aから取り出した。得られた株は、TIGR6AXと命名され、莢膜化されず、ＰＣＲで、位置１３２５および２５１８の間でwciNα遺伝子を喪失していることが分かった。このwciNβ領域を、ついで、カセット２を用いてTIGR6AXに挿入し、それは、CHPA388由来のwciNβ遺伝子を含有していた。ＰＣＲにより、得られた株TIGR6Cは予想した場所にwciNβを有することが確認された。TIGR6Cは、血清型６Ｃを発現することが分かり、これは、wciNβ遺伝子領域は血清型転換に十分であることが確認された。

実施例１１．新規肺炎連鎖球菌血清型6D
血清型６Ａおよび６Ｂ莢膜多糖類（PS）の化学構造についての以前の研究は、それらが、ガラクトース、グルコース、ラムノースおよびリビトールのリン酸塩を含有する繰返し単位のポリマーであることを示した（図１７）。６Ａおよび６Ｂ ＰＳの化学的差異は、ラムノースおよびリビトールの間のリンケージにある：6A PSは1→3リンケージを有するが、6B PSは1→4リンケージを有する。6A PSの形成を担う遺伝子の研究を図１８にまとめた。6A PSの合成に関与するすべての遺伝子はひとつの遺伝子座（「莢膜遺伝子座」という。）にあり、それは約１７ｋｂ長であって、１４の遺伝子を含有する。６Ａおよび６Ｂ莢膜遺伝子座の間に一貫する遺伝子的差異は、wciP遺伝子の位置５８４の単一のヌクレオチドのようである（584G←→A; S195N [Ser←→Asn]）。［Mavroidi et al., 2004］。この遺伝子変化は、wciPによりコードされるラムノシルトランスフェラーゼを、6A PSについて１→３リンケージを形成する能力を有することから、6B PSについて１→４リンケージを形成する能力を有することへと転換することにあると考えられる。

ここで議論したように、6C PSは、6A PSのガラクトース残基の代わりに、グルコース残基を有し（図１７）、6C莢膜遺伝子座は、異なるwciN遺伝子を除き、莢膜遺伝子座とほぼ同一である（図１８）。6AのwciNをwciNαと再命名し、6CのwciNをwciNβと再命名した。上記のように、この研究は、6A莢膜遺伝子座が、wciNα遺伝子をwciNβ遺伝子で置換することによって、6C莢膜遺伝子座になっていたことを示唆する。

６Ａおよび６Ｂ莢膜遺伝子座も、wciP遺伝子におけるひとつのヌクレオチド差異を除き、ほぼ同一であるので、6B莢膜遺伝子座は、丁度6Aのように、wciNαを有する。6B莢膜遺伝子座はwciNβ遺伝子を捕捉することができ、新たな莢膜ＰＳを形成することができ、６Ｄと命名された。６Ｄ血清型が天然に存在するかどうかを知られていなかった。なぜならば、天然単離物のなかの６Ｄの調査はされていなかったからである。

現在入手可能な２３価肺炎連鎖球菌ワクチンは6B PSを含有するが、旧式の１４価肺炎連鎖球菌ワクチンは6A PSを含有する。このＰＳは２３価肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて置換されていた。なぜならば、6A PSはワクチン製剤中ではあまり安定ではなく、6B PSは6A PSへと交差反応する抗体を誘発するからである。［Robbins et al., 1983］。調査により、この構造的不安定は、ラムノースおよびリビトールの間の１→３リンケージのせいであることが分かった。［Zon et al., 1982］。6B PSに見出される１→４リンケージは6A PSの１→３リンケージよりも安定なので、6B PSは6A PSよりも安定である。6D PSの仮定構造は、6C PSが不安定な1→3リンケージを有するところ、6D PSがより安定な1→4リンケージを有していることを除き、6C PSのものと同一であるべきである。かくして、6D PSは、おそらく、6C PSよりもワクチン中でより有用であろう。

PCRおよびＤＮＡ配列決定：
ＰＣＲ反応混合物は、38.8μlの滅菌水、2μlの各5-pmolプライマー、2μlの10mM dNTP、5μlの10Xバッファー溶液、および0.μlのLA Taqポリメラーゼ（2.5U/μl, Takara Biomedical, Shiga, Japan）を含有していた。テンプレートについて、WizardゲノムDNA精製キット（Promega, Madison, WI）で単離された染色体ＤＮＡまたは血液寒天プレート上で成長させたコロニーのいずれかを用いた。熱サイクル条件は用いたプライマーセットに応じて変化させた。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中の電気泳動により分析した。用いたプライマーをテーブル７に列記する。ＰＣＲ産物はWizard PCR Clean-up System （Promega）を用いて精製し、ＤＮＡ配列決定はアラバマ大学バーミンガム校（ＵＡＢ）のゲノミック・コア・ファシリティーによって行った。ＤＮＡ配列はLasergene v. 5.1ソフトウェア（DNASTAR, Madison, WI）で解析し、GenBankの6Bおよび6C cps座の以前に報告された配列（それぞれ、登録番号CR931639, EF538714）と比較した。［Mavroidi et al., 2004］。

遺伝子操作による６Ｄの創出：莢膜合成は多くの遺伝子の協働を要件とする。例えば、6D PSの繰返し単位を細菌の外部に輸出して莢膜ＰＳの長鎖に組み込まれなければ、その繰返し単位は細菌中に蓄積し、6D血清型についての莢膜遺伝子座を持つ細菌に対する致命的な条件を作り出す。そうであれば、おそらく、６Ｄ血清型は天然には存在しないであろう。かくして、６Ｄ血清型が生物学的に可能であることを実証することが重要である。

TIGR6Dを創出するストラテジーを図１９に図示する。最初に、すでに詳細に記載されたようにヤヌスカセットシステムを用いて6B莢膜遺伝子座領域をTIGR4遺伝子バックグラウンドに挿入することによって、まず、血清型６Ｂを発現するTIGR6Bを調製する。［Park et al., 45 J. Clin. Microbiol. 1225-33 (2007)］。次に、wciN遺伝子を、カセット１でそれを形質転換し、カナマイシン耐性単離物を選択することによって、TIGR6Bから取り出す。カセット１はヤヌスカセットを有し、それは、カナマイシン耐性遺伝子（kanA^R）およびストレプトマイシン感受性遺伝子（rpsL⁺）、および、6B莢膜遺伝子座に対する相同組換え用に設計されたふたつのフランキング領域を含有する。カナマイシン耐性株を得、TIGR6Bに３回戻し交配させた。得られた株は、TIGR6BXと表示し、wciNを喪失し、莢膜ＰＳを生成しなかった。wciN_6Cを挿入するために、TIGR6BXをカセット２で形質転換した。カセット１およびカセット２の双方をTIGR6AXのゲノムＤＮＡおよびCHPA388から、それぞれ、プライマーセット5113および3102を用いて調製した。カセット２は、wciN_6Cに加えて、wciPの部分を含有するが、６Ａおよび６Ｂ血清型の区別を担うwciPコドンを含有しなかった（図１９）。ストレプトマイシン耐性の選択およびTIGR6Bに対する３回戻し交配の後、ストレプトマイシン耐性株をTIGR6Dと表示した。TIGR6Dの莢膜遺伝子座をwchAからwciPまで配列決定すると、その配列は、意図した通り、wciN_6BがwciN_6C遺伝子で置換されたことを示した。この配列決定について、プライマーセット5114〜141、5138〜3104、および5106〜3105を用いて、アンプリコンを作成し、プライマー5103、5108、および5129を配列決定に用いた。

TIGR6D配列をGenbankに寄託した（登録番号EU714777）。TIGR6Dは、血液寒天プレート上で成長させたとき、モルホロジー上、TIGR6Bと識別不可能であった。また、TIGR6Dは、他の肺炎連鎖球菌株と同様にTHYブロス中で成長した。

膨張反応：血液寒天プレートからの細菌コロニーを少量のリン酸バッファードサリン（ＰＢＳ）中に懸濁させ、2μlのこのブロスを、2μlの血清および2μlのメチレンブルー染色溶液（滅菌水中の3mg/mLメチレンブルーおよび1.5mg/mL NaCl）と、ガラス顕微鏡スライド上で合わせた。カバーガラスを載せたあと、混合物を１００倍の油浸レンズを用いて明視野顕微鏡法で調査した。血清型６Ａおよび６Ｂに特異的なウサギ抗血清をＣＤＣによって調製した。

実施例１２．血清型6Bおよび6Dを区別するのに用いたインヒビションＥＬＩＳＡ
これらふたつの血清型は、インヒビション型ＥＬＩＳＡを用いて区別した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（Corning Costar Corp., Acton, MA）のウェルを、5μg/mLの6B莢膜ＰＳ（ATCC, Manassas, VA）で、３７℃にて一晩、ＰＢＳ中で被覆した。プレートを、0.05% Tween 20を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、50μlの予め希釈した細菌培養上清（すなわち、ライゼート）を50μlの抗6B mAbと一緒にウェルに添加した。肺炎連鎖球菌を1mlのTHYブロス中で一晩振盪することなく成長させ、ついで、チューブを１５分間３７℃にて溶解バッファー（脱イオン水中の0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.01%硫酸ドデシルナトリウム、および0.15Mクエン酸ナトリウム）と共にインキュベートすることによって、肺炎連鎖球菌ライゼートを調製した。6B-特異的ハイブリドーマHyp6BM7およびHyp6BM8の培養上清を、それぞれ、１：５０および１：１００の希釈にて用いた。３７℃にて湿式インキュベーター中で３０分間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、アルカリホスファターゼ−コンジュゲーティドヤギ抗マウスイムノグロブリン（Sigma, St. Louis, MO）と共に３０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ついで、ジエタノールアミンバッファー中、１mg/mlの濃度の100μlのリン酸パラニトロフェニル基質（Sigma）を添加し、室温にて１〜２時間インキュベートさせた。４０５ｎｍにての光学濃度をマイクロプレートリーダー（BioTek Instruments Inc, Winooski, VT）で読み取った。

実施例１３．6D莢膜ＰＳの精製およびキャラクタリゼーション
血清型6Dを発現する莢膜ＰＳを２つの異なるやり方で精製した。ひとつの方法（エタノール沈殿法）は、すでに記載されたように、そのＰＳをエタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよび分子量サイズ分類クロマトグラフィーによって精製することである。［Park et al., 45 J. Clin. Microbiol. 1225-33 (2007)］。もうひとつの方法は、一番目の方法よりも速く、プロトプラストを除去した後に莢膜ＰＳを精製することであり、以下に記載する。TIGR6Dを、１リッターのTHYブロス中で振盪することなく、培養が〜０．４のOD₆₀₀に達するまで、成長させた。この培養を、ついで、15,000gにて１０分間遠心した。細胞ペレットを1L PBSで２回洗浄し、20U/mLの濃度のムタノリシン（Sigma）と共に、30mLのプロトプラストバッファー{脱イオン水中の20%スクロース、5mMトリス-HCl（pH7.4）中に懸濁させ、室温にて一晩インキュベートさせた。翌日、細菌細胞を位相差顕微鏡で調査して、「プロトプラスト」が発生したことを確認し、ついで、プロトプラストを27,000gにて１５分間遠心することによって除去した。上清を０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌し、脱イオン水中に１：１希釈し、２ｍｌ総容積のDEAE-セファロースカラム（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）に充填した。カラムを４ｍｌの50mM酢酸アンモニウムで洗浄し、ＰＳを４ｍｌの500mM酢酸アンモニウムで溶出した。凍結乾燥後、溶出したＰＳを１３０ｍＬの総容積のセファクリルS-300 HRカラム（Amersham Biosciences）に充填し、ＰＳを10mMトリス-HCl（pH7.4）で溶出した。Hyp6BM8を用いるインヒビションアッセイによって、ＰＳの存在につき、フラクションを試験した。最初の１ｍＬのフラクションは、大部分のＰＳを含有し、それらをプールして凍結乾燥した。

ＰＳの単糖類組成分析：プロトプラスト法で調製した1mgの凍結乾燥した莢膜ＰＳを500μlの１Ｍ HClに溶解し、８０℃にて１６時間インキュベートした。サンプルを窒素流下で乾燥した後、残りのＰＳを250μlのメタノールで２回洗浄した。そのサンプルを、次いで、200μlのTri-Sil Reagent（Pierce Biotech Inc., Rockford, IL）と共にインキュベートしてすべての単糖類をトリメチルシリル化した。反応生成物を、30-m（0.25-mm-diameter）VF-5キャピラリーカラムを取り付けたガス−液体クロマトグラフ/質量分析計（GLC/MS）（Varian 4000; Varian Inc., Palo Alto, CA）で分析した。カラム温度は１００℃にて５分間維持し、ついで２０℃／分にて２７５℃まで昇温し、最終的に、２７５℃にて５分間保持した。エレクトロン衝撃イオン化モードを用いる質量分析法（ＭＳ）で溶出物を分析した。GLC/MS中の各単糖類ピークの面積はVarian MS Workstation v6.5ソフトウェアを用いて決定した。

タンデム型質量分析によるＰＳの分析：エタノール沈殿法によって調製した無傷莢膜ＰＳを、質量分析による分析前にそれらの繰返し単位にまで加水分解した。ＰＳの２ｍｇアリコートを1mLの10mM NaOH中、８５℃にて１２０時間加水分解し、その後、50mM NaOHで８５℃にて１２０時間さらに加水分解した。加水分解の終わりに、すべてのサンプルを0.1M HClで中和した。

タンデム型質量分析（MS/MS）は、UABの質量分析共有施設でエレクトロスプレイイオン源を備えたMicromass Q-TOF2質量分析計（Micromass Ltd., Manchester, United Kingdom）で行った。蒸留水に溶解させたサンプルを、ハーバードシリンジポンプを用いて、１μｌ／分の速度のランニングバッファー（50/50アセトニトリル−0.1%ギ酸含有水）で質量分析系に注入した。注入したサンプルをエレクトロスプレイで負にイオン化し、飛行時間質量分析計で検出した。MS/MSについて、親イオンは、アルゴンガスと衝突する前に、35eVまたは40eVのいずれかでエネルギーを与えて娘イオンに断片化した。娘イオンを飛行時間質量分析系で分析した。MS/MSスペクトルをMassLynx 2.5のMax-Ent3モジュールを用いて処理した。この研究により、リビトールおよびグルコース１は過ヨウ素酸塩で開裂されるが、グルコース２およびラムノース２はされないことが示された。娘イオンの質量は、リン酸ジエステル結合がグルコース１の２番目の位置に形成され、すべての他のグリコシル結合が6B PSと同じであるとことを示した。このMS/MS研究は、図２１Ａに示した提案構造を支持した。

より詳しくは、6D PSの単糖類配列が図２１Ａで提案されているものであるかどうかを決定するために、リン酸ジエステル結合を切断し、繰返し単位を生成する穏和なアルカリ分解を用いた。6C PSについて観察されるように、この加水分解は、同一の質量を有するふたつのタイプの繰返し単位を生じ、ひとつはリン酸イオンがリビトールに連結したものであり（正方向フラグメンテーションと表示）、もうひとつはグルコースに連結したものである（逆方向フラグメンテーションと表示）。リン酸イオンは、負電荷の繰返し単位を与える。アルカリ分解生成物をMS/MSによって負イオンにつき分析すると、結果は６８３および７０１ＡＭＵのふたつの主要ピークを示し（図２１Ｂ）、それらは、それぞれ、6D PSの予測した繰返し単位の無水物および水和物の質量と同一である（図２１A）。２６０．９０２ＡＭＵのピークは、他のMS/MS試験にはなく、不純物を表しているのであろう。

さらに、683AMUのイオン（すなわち、無傷繰返し単位）をアルゴン衝突に付し、その娘イオンをMS/MS分析で同定した。娘イオンは、５２１、３５９、および２１３ＡＭＵに観察され、それらは、それぞれ、第１グルコース、第２グルコースおよびラムノースを喪失した娘イオンを表している（図２１Ｃ）。ピークは、５４９、４０３、および２４１ＡＭＵにも観察され、それらも、それぞれ、リビトール、リビトール−ラムノース、およびリビトール−ラムノース−グルコース２を喪失することによる逆方向フラグメンテーション後に形成された娘イオンに対応する（図２１Ｃ）。113、127、および145ＡＭＵの３つのピークは、他のMS/MS試験にはなく、不純物を表しているのであろう（図２１Ｃ）。かくして、6D PS繰返し単位の単糖類配列は、図２１Ａで提案するように、グルコース１−グルコース２−ラムノース−リビトールである。これらふたつのグルコース残基を明確にするために１および２と表示した。

ＰＳの酸化還元：莢膜ＰＳを、１ｍｇ／ｍＬの濃度にて、８０ｍＭナトリウムバッファー（ｐＨ４）に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウムをこのＰＳ溶液に添加して最終濃度を４０ｍＭにし、反応混合物を暗闇中４℃にて７２時間インキュベートした。エチレングリコールを添加して、過剰な過ヨウ素酸塩を破壊した。酸化された莢膜ＰＳの無傷単糖類を決定するために、ＰＳを凍結乾燥し、ついで、上記したように、GLC/MSを用いて分析した。グリコシド結合を調査するために、サンプルは、すでに記載されているように［Park et al., 45 J. Clin. Microbiol. 1225-33 (2007)］、水素化ホウ素ナトリウムまたは重水素化ホウ素ナトリウムで還元し、その後、上記したように、MS/MSに付した。6D PSをプロトプラスト法で調製し、6B PSをATCCから入手した。

加水分解安定性アッセイ：0.9mLの水中2mg/mL PSを0.1mLの0.1M NaOHと混合し、この溶液をふたつのエッペンドルフ管に分け、８５℃にてインキュベートした。表記する時刻に、これらのサンプルから０．１ｍＬを取り出し、0.1M HClで中和し、ついで、インヒビションＥＬＩＳＡに用いるまで４℃にて保存した。上記のインヒビションアッセイについて記載したものと同一のバッファーおよびインキュベーション条件を用いて、プレートを100μlの5μg/mL 6A、6B、6C、または6D PSで被覆した。ＥＬＩＳＡは、それら各々のＰＳで被覆したプレート上、加水分解サンプルについて行った。6Aおよび6C PSについて、Hyp6AG1を一次抗体として用い（［Park et al., 2007］で行われたように）、6Bおよび6Dについて、Hyp6BM8を（上記するように）用いた。示されたデータは、重複して行ったサンプルの平均である（図２２）。

質量分析のためのアルカリ分解実験の間、6D PSはアルカリ分解に対して非常に抵抗性であった。加水分解に対する抵抗性を測定するために、6A、6B、6Cおよび6D PSが、様々な時間のアルカリ分解の後の（6Bおよび6D PSについて）Hyp6BM8、（6Aおよび6C PSについて）Hyp6AG1の標的ＰＳに対する結合を阻害す能力を比較した。6Aおよび6C PSは、たった一時間の加水分解の後、阻害する能力を完全に喪失した。対照的に、6B PSは８時間後にその阻害脳の９０％を喪失し、6D PSがその阻害能力を９０％喪失するのに、１００時間以上の加水分解が必要であった（図２２）。かくして、6D PSはアルカリ分解に対して、6Aおよび6C PSよりもかなり抵抗性である。

実施例１４．単離物中の血清型６Ｄの存在についてのスクリーニング
６Ｄが天然に存在するかどうかを決定するために、古典的な手段によって以前「６Ｂ」と血清型分類された２６４の肺炎連鎖球菌単離物を、mAbを用いて、血清型６Ｂまたは６Ｄにつき、再度血清型分類した。これらの単離物は、アラバマ大学バーミンガム校の６Ｂ単離物の研究用コレクションの一部であり、それらは、アフリカ、アジア、オーストラリア、南アメリカ、およびヨーロッパを起源とするものである。これらに加えて、６Ａ型莢膜、無莢膜、および６Ｃ型莢膜を発現するTIGR4の同質遺伝子株である、TIGR6A、TIGR6AX、およびTIGR6C［Park et al., 75. Infect. Immun. 4482-89 (2007)］を、アッセイ対照またはＤＮＡ源として用いた。さらなるTIGR4変異体、TIGR6B、TIGR6BX、およびTIGR6Dを下記するように調製した。すべての細菌を、0.5%酵母抽出物で補給したTodd-Hewittブロス（BD Biosciences, San Jose, CA）（THY）中で成長させ、使用するまで−８０℃にて保存した。

ポリクローナルウサギ抗血清を用いる膨張反応によって、TIGR6Dの血清学的特性を調査すると、６Ｂ型と分類された。インヒビションＥＬＩＳＡを用いて６Ａおよび６Ｂに対する様々なmAbを結合させることについてTIGR6D PSを調査すると、それは6B PSに対する多くのmAbと反応性であった。例えば、TIGR6Dは、Hyp6BM8が6B PSに結合することを阻害した。これらの観察により、6D PSは血清学的に6B PSに非常に近いことが明確に実証された。対照的に、6B PSに特異的なmAb（Hyp6BM7）は、6D PSと反応性ではなかった（図２０）。かくして、6D PSは血清学的に6B PSと区別される。

上記の血清学的研究は、6D PSを発現する肺炎連鎖球菌単離物が天然に存在するならば、それらは６Ｂ血清型と分類されてきたであろうことを示した。天然の血清型６Ｄ単離物の存在を探すために、６Ｄおよび６Ｄ血清型を区別できるインヒビションＥＬＩＳＡを用いて、以前血清型６Ｂと分類された２６４の肺炎連鎖球菌単離物を調査した（図２０）。これらの6B単離物は六大陸（北アメリカ、南アメリカ、ヨーロッパ、アジア、アフリカ、およびオーストラリア）から来たものであり、菌血症、髄膜炎、肺炎、および中耳炎の患者ならびに健康保菌者から単離した。２６４の6B株のいずれも６Ｄの抗体結合プロファイルを示さなかった（図８）。かくして、血清型６Ｄの有病率は、存在するならば、６Ｂの有病率よりも相当少ない。

Claims (9)

1. 繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ莢膜多糖類を有することを特徴とする、ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dの単離培養物。
2. ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dから精製され、繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ多糖類を含むワクチン。
3. 繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}からなることを特徴とする精製された多糖類。
4. 繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}からなることを特徴とする多糖類を含むワクチン。
5. 繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ莢膜多糖類であるストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dから精製された多糖類のポルクローナルまたはモノクローナル抗体の作成のための使用。
6. 繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ精製された多糖類のポルクローナルまたはモノクローナル抗体の作成のための使用。
7. ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dを識別する遺伝子学的試験であって、前記血清型のゲノム中、wciN_6C遺伝子およびwciP遺伝子の存在を検出し、ここに、前記wciP遺伝子はアミノ酸残基１９５位にアスパラギンをコードすることを特徴とする、遺伝子学的試験方法。
8. ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dを識別する化学的試験であって、繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ莢膜多糖類を検出することを特徴とする、化学的試験方法。
9. ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型6Dを識別する免疫学的試験方法であって、
   （ａ）ポリクローナルウサギ抗血清を用いる膨張反応またはHyp6BM8によるインヒビションＥＬＩＳＡによって、肺炎連鎖球菌単離物の血清学的特性を調査して陽性と分類された単離物を選択し；次いで
   （ｂ）Hyp6BM7によるインヒビションＥＬＩＳＡによって、前記（ａ）で選択された単離物の血清学的特性を調査して陰性と分類された単離物を選択して、
   繰返し単位{→2）グルコース１（1→3）グルコース２（1→3）ラムノース（1→4）リビトール（5→リン酸}を持つ莢膜多糖類を検出することを特徴とする、免疫学的試験方法。

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