JP5704708B2 - イネ収量のオゾン影響評価方法 - Google Patents
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Description
(1)被検イネ
被検イネとして、日本型(japonica)品種のきらら397、コシヒカリ及び日本晴を、インド型(indica)品種のタカナリ、カサラス及びスファンブリ90を選択した。
群馬県県前橋市の(財)電力中央研究所赤城試験センターに設置されているオープントップチャンバー(間口3.6m、奥行3.6m、高さ2.4m、以下、OTCと記す)内に、あらかじめ1/2000aワグネルポットをブロック配置しておき、約3週間ガラス室内で育苗したイネをこのワグネルポットに定植して、高濃度オゾンの暴露処理を開始した。
イネの止葉は、品種ごとに出穂の1週間後に採取し、液体窒素で凍結後、分析に供するまで−80℃で保存した。止葉から可溶性タンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行った。画像解析ソフトにより、二次元電気泳動パターンを比較し、オゾン処理区と浄化空気区との間のタンパク質の発現量の差を品種ごとに解析した。発現量に有意な差があったタンパク質スポットをゲルから切り出し、ゲル内消化によってペプチドフラグメントとした後、質量分析計により解析し、タンパク質を同定した。
収穫は、イネの籾が80%以上黄色になった段階で行った。穂から外した全籾を自動種子選別機(藤原製作所製FV-459A)を用いて稔実籾と不稔実籾に選別し、稔実籾の重量を収量とした。
上記した6品種のイネを、育苗用培土(クレハ園芸培土、株式会社クレハ)を用い、人工気象チャンバー(12時間明期、明期28℃/暗期23℃、相対湿度60〜70%、光強度400μmol/m2/s)で生育させた。播種後14日目のイネ幼苗を0ppb、40ppb、80ppbのオゾン濃度で3日間オゾン暴露処理した。但し、オゾンへの暴露は1日のうち明期の12時間のみとした。尚、日本晴、カサラス、スファンブリ90については、オゾン暴露処理を0ppbと40ppbのオゾン濃度のみで実施した。
短期オゾン暴露処理したイネの葉0.1gからタンパク質を抽出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルよりPVDF膜に転写装置を用いて転写した。転写したPVDF膜をブロッキング後、各候補タンパク質に対する以下の特異抗体と反応させた。
・Anti-Heat Shock Protein 60(Acris Antibodies GmbH,Herford,Germany)
・Anti-ATP Synthase, CF1βSubunit(AntiProt,Pullach i. Isartal,Germany)
・Anti-Enolase(Aviva Systems Biology,San Diego,USA)
(1)オゾンの影響によるイネ収量の変化
2007年〜2010年に実施した長期オゾン暴露処理によるイネ収量への影響について検討した結果を図1に示す。尚、図1の縦軸の値は、空気浄化区(日中12時間の平均オゾン濃度4ppb)におけるイネ収量(精籾収量)に対するオゾン処理区(日中12時間の平均オゾン濃度37ppb、75ppb)におけるイネ収量(精籾収量)の相対値である。また、図12に、各種オゾン濃度(日中12時間の平均オゾン濃度)におけるイネ収量(精籾収量)について、各種イネ品種にて検討した結果を示す。縦軸の値は、図1と同様である。オゾン処理区における平均収量は、浄化空気区における収量と比較すると、きらら397では80%、タカナリでは86%、カサラスでは88%に低下した。一方、コシヒカリ、日本晴、スファンブリ90では、収量に変化は見られなかった。
長期オゾン暴露処理の有無によるイネ止葉タンパク質の二次元電気泳動パターンの違いについて検討した結果を図2に示す。画像解析の結果、タンパク質の発現量に有意な差が見られた。さらに、変化量が1.5倍以上であるタンパク質スポットが、きらら397では31個、コシヒカリでは18個、タカナリでは11個検出された。これらの変化したタンパク質スポットにおいて、3品種で共通して検出されたスポットはKi−13だけであった。
Ki−13スポットから消化・抽出されたペプチドフラグメントを質量分析計にて解析した結果を表1に示す。表1中、「スコア」はMascotスコアであり、「C」はアミノ酸配列の一致度であり、「MP」は一致したペプチド断片数であり、「MW」は分子量であり、「pI」は等電点である。
60kDaシャペロニン、ATP合成酵素及びエノラーゼが、早期に実験室レベルで利用できるマーカーであるかを確認するため、人工気象チャンバーにて、被検イネの幼苗に対し、短期オゾン暴露処理を実施し、60kDaシャペロニン、ATP合成酵素及びエノラーゼの発現量の変化について検討した。
すべての品種における短期オゾン暴露処理後のタンパク質相対発現量と同等の濃度で収穫まで長期オゾン暴露処理した時の相対収量との相関を算出した。その結果、60kDaシャペロニンにおいて、r=0.8597と極めて高い正の相関が認められた(図6)。また、ATP合成酵素とエノラーゼもそれぞれr=0.7413、r=0.7502と高い正の相関が認められた(図7、図8)。一方、RuBisCO LSUでは有意な相関が認められなかった(図9)。これらのタンパク質のうち、特に60kDaシャペロニンが収量予測のマーカーとして重要であることが明らかとなった。
Claims (3)
- オゾン暴露処理した被検イネ品種におけるCPN−60(60kDaシャペロニン)、ATP合成酵素及びエノラーゼからなる群より選択される1又は2以上のタンパク質の発現量に基づき、前記被検イネ品種のオゾンによる収量への影響を評価することを特徴とするイネ収量のオゾン影響評価方法。
- 前記オゾン暴露処理を前記被検イネ品種の幼苗に対して実施する請求項1に記載のイネ収量のオゾン影響評価方法。
- 請求項1又は2に記載のイネ収量のオゾン影響評価方法を用いて、オゾンによりイネ収量が低下しない又は低下しにくいイネ品種を選抜することを特徴とするイネ品種の選抜方法。
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