JP5704295B2

JP5704295B2 - Process for producing α-methylene-γ-butyrolactone

Info

Publication number: JP5704295B2
Application number: JP2009178453A
Authority: JP
Inventors: 加藤　康夫; 康夫加藤; 範行中島; 荻田　信二郎; 信二郎荻田; 幸生佐藤; 和明荘司
Original assignee: Toyama Prefecture
Current assignee: Toyama Prefecture
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: JP2010207211A

Description

本発明は、酵素反応を活用したα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing α-methylene-γ-butyrolactone utilizing an enzymatic reaction.

α−メチレン−γ−ブチロラクトン類は、耐熱性透明樹脂の原材料，各種生理活性物質の中間体，害虫忌避剤及び抗変異原性剤等の多くの利用価値がある。
従来、α−メチレン−γ−ブチロラクトン類は、化学合成にて製造されていた（特許文献１）。
しかし、化学合成による製造方法は、専用設備が必要となるだけでなく、多大なエネルギーを消費するものであり、環境負荷が大きいものであった。 α-methylene-γ-butyrolactone has many utility values such as raw materials for heat-resistant transparent resins, intermediates of various physiologically active substances, pest repellents and antimutagenic agents.
Conventionally, α-methylene-γ-butyrolactone has been produced by chemical synthesis (Patent Document 1).
However, the production method by chemical synthesis requires not only dedicated equipment but also consumes a lot of energy and has a large environmental load.

本願発明者らは、これまでに植物中には下記化学式（１）に示すチューリッポシド−Ａ（Ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅ−Ａ）及びその類縁体又は化学式（２）に示すチューリッポシド−Ｂ（Ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅ−Ｂ）及びその類縁体等の多量のチューリッポシド類が存在し、これらのチューリッポシド類は抗菌性を有するが、チューリップ組織の中にはチューリッポシド類よりさらに抗菌性の強い化学式（３）及び化学式（４）に示すα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に変換する酵素を見い出し、本発明に至った。
本明細書では、この酵素をチューリッポシド変換酵素と称し、その後の研究でチューリップ以外の植物組織にも存在することが明らかになった。
なお、化学式（３）に示すα−メチレン−γ−ブチロラクトンは、チューリッパリン−Ａとも称され、化学式（４）に示すα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、チューリッパリン−Ｂとも称される。

The inventors of the present invention have so far found that in plants, Tuliposide-A (Tuliposide-A) represented by the following chemical formula (1) and analogs thereof or Tulipposide-B (Tuliposide-B) represented by Chemical Formula (2) ) And its analogs and the like, and these turliposides have antibacterial properties, but some tulip tissues have a more antibacterial chemical formula (3). And the enzyme which converts into (alpha) -methylene-gamma-butyrolactone shown to Chemical formula (4) was discovered, and it reached to this invention.
In the present specification, this enzyme is referred to as a tulipposide converting enzyme, and subsequent studies have revealed that it exists in plant tissues other than tulips.
Note that α-methylene-γ-butyrolactone represented by the chemical formula (3) is also referred to as tulipperin-A, and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone represented by the chemical formula (4) is also referred to as tulipperin-B. Is done.

特開平１０−２９８１７２号公報JP 10-298172 A

本発明は、植物中に多種の形態で存在するチューリッポシド類を植物組織に存在する酵素による酵素反応を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン類を製造する方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing α-methylene-γ-butyrolactone by using an enzymatic reaction of an enzyme present in plant tissue with turliposides present in various forms in a plant.

本発明に係る下記一般式（５）で示されるα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法は、植物組織内に存在するチューリッポシド類に植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応をさせることを特徴とする。

（式中、Ｒ_１，Ｒ_２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ_３，Ｒ_４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
α−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法としては、植物組織内に存在するチューリッポシド−Ａ［化学式（１）］及びその類縁体又はチューリッポシド−Ｂ［化学式（２）］及びその類縁体を植物組織から抽出したチューリッポシド変換酵素を用いてα−メチレン−γ−ブチロラクトン［化学式（３）］及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン［化学式（４）］を生成し、分別抽出してもよい。
原材料となる植物体は、組織内にチューリッポシド−Ａ及びその類縁体が存在すると、α−メチレン−γ−ブチロラクトンが得られ、チューリッポシド−Ｂ及びその類縁体が存在するとα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンが得られる。
そのような植物体としては、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａｓｐｐ．）が好ましく、α−メチレン−γ−ブチロラクトンを製造するには、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａｓｐｐ．）、セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓｊａｐｏｎｉｃａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＰｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体にチューリッポシド変換酵素を用いた酵素反応により製造することができる。
また、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造するには、植物体は、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａｓｐｐ．）、シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＰｕｒｓｈ．）のうち、いずれかの植物体にチューリッポシド変換酵素を用いて酵素反応させるのがよい。
チューリッポシド変換酵素は、分子量約７０，２００、サブユニット分子量約３４，９００，至適温度２５〜３０℃、至適ｐＨ６．５〜７．０、エステラーゼやフォスファターゼの阻害剤である重金属、ＮａＦ、ＰＭＳＦにより阻害され、チューリッポシド−Ａ及びＢに基質特異性を有することを特徴とする。
ここで、チューリッポシド変換酵素を抽出する植物組織が、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａｓｐｐ．）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａｓｐｐ．）、カタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＰｕｒｓｈ．）のうち、いずれかに由来する植物組織であってよい。 The production method of α-methylene-γ-butyrolactones represented by the following general formula (5) according to the present invention uses a tulipposide converting enzyme extracted from a plant tissue to a tulipposide present in the plant tissue. It is characterized by causing an enzyme reaction.

(In the _formula, R 1, _{R 2} represents hydrogen, a hydroxyl group or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms _{independently,} R 3, _{R 4} represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms independently. )
As a method for producing α-methylene-γ-butyrolactones, there may be mentioned chulipposide-A [Chemical Formula (1)] and its analog or turipposide-B [Chemical Formula (2)] existing in plant tissues and the like. Α-methylene-γ-butyrolactone [Chemical Formula (3)] and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone [Chemical Formula (4)] are produced using a chulipposide converting enzyme extracted from plant tissue. Separation and extraction may be performed.
The plant as a raw material is obtained when α-methylene-γ-butyrolactone is obtained when turipposide-A and its analog are present in the tissue, and α-methylene- when turipposide-B and its analog are present. β-hydroxy-γ-butyrolactone is obtained.
As such a plant, tulipa (Tulipa spp.) Is preferable, and in order to produce α-methylene-γ-butyrolactone, Alstroemeria (Alstromeria spp.), Seriba auren (Coptis japonica), Yukiyanagi (Spiraea thunbergii), Ji (Spiraea prunifolia), Pink snow willow (Spiraea thunbergii), Katakuri (Erythronium japonicum Decne.), Kibana Katakuri (Erythronium grandiflorum) Can do.
Moreover, in order to produce α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone, plants are prepared from tulipa spp., Spiraea prunifolia, Spiraea thunbergii, Spiraea thibergi, Spiraea thi (Erythronium japonicum Decne.), Erythronium grandiflorum Pursh., Any of the plants may be subjected to an enzymatic reaction using a tulipposide converting enzyme.
The tulipposide converting enzyme has a molecular weight of about 70,200, a subunit molecular weight of about 34,900, an optimum temperature of 25-30 ° C., an optimum pH of 6.5-7.0, a heavy metal that is an inhibitor of esterase and phosphatase, NaF Inhibited by PMSF, and has substrate specificity for chulipposide-A and B.
Here, the plant tissues from which the tulipposide converting enzyme is extracted are Tulipa spp., Alstroemeria spp. It may be a plant tissue derived from.

本発明に係るα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の製造方法においては、チューリップ等の植物体を原材料とし、酵素反応により製造するものであることから従来の化学合成に比較して、エネルギー消費が少なく、安全である。
これまでは、チューリップの花弁等が富山県内分推定で約１００トン／年強も廃棄されている現状からすると、石油に依存しない優れた製造方法となる。 In the method for producing α-methylene-γ-butyrolactone according to the present invention, the plant body such as tulip is used as a raw material, and it is produced by an enzymatic reaction, so that it consumes less energy compared to conventional chemical synthesis. , Safe.
Up to now, tulip petals, etc., are estimated to be about 100 tons / year in Toyama Prefecture.

チューリッポシド−Ａの検量線を示す。The calibration curve of turipposide-A is shown. チューリッポシド−Ｂの検量線を示す。The calibration curve for chulipposide-B is shown. α−メチレン−γ−ブチロラクトンの検量線を示す。A calibration curve of α-methylene-γ-butyrolactone is shown. α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの検量線を示す。A calibration curve of α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone is shown.

本発明は、植物体に有するチューリッポシド−Ａ又はＢ及びその類縁体から、α−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを製造する点に特徴があり、類縁体には例えば化学式（６）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６５（２００４）７３１−７３９；ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ（２００５）４６：１２５−１３１）、化学式（７）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１），１５２−１５４，１９９９）、、化学式（８）（ＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｓ５１（３），２４４−２４８（１９９７））、化学式（９）及び（１０）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４０Ｎｏ．１４９−５１（１９９５））等が例として挙げられる。

The present invention is characterized in that α-methylene-γ-butyrolactone or α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone is produced from chulipposide-A or B and its analogs contained in a plant body. Examples of the body include chemical formula (6) (Phytochemistry 65 (2004) 731-739; Plant Growth Regulation (2005) 46: 125-131), chemical formula (7) (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (1), 152- 154, 1999), chemical formula (8) (Natural Medicines 51 (3), 244-248 (1997)), chemical formula (9) and (10) (Phytochemistry, Vol. 40 No. 1 49-51 (1995)). Etc. as an example That.

（チューリップ球根粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ（Ｔｕｌｉｐａｓｐｐ．）：「紫水晶」の球根２ｇ（生重量）をビーズショッカーにて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を２０ｍｌ加えてボルテックスで撹拌後、低温室にて１時間静置した。
遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）後、上清を１０ｍＭＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（ゲル３ｍｌ）にかけ、１０ｍＭＫＰＢ及び１００ｍＭＫＰＢ（０．１ＭＮａＣｌ）で溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップにて濃縮（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）した。
これにより、１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素５００Ｕを得ることができた。
酵素活性の測定法は以下に示す手法にて行った。
０．５ＭＫＰＢ（ｐＨ６．５）を５μｌ、酵素液を１０μｌ、Ｈ_２Ｏを３０μｌ、基質として６−ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）５μｌを加え、全量を５０μｌとし、室温にて１０分間静置、酵素反応を行った。
１０分後、メタノール１００μｌ、０．５ＭＨ_３ＰＯ_４５０μｌ、Ｈ_２Ｏ３００μｌを加えて反応を停止し、２５μｌをＨＰＬＣにインジェクションして活性を測定した。
ＨＰＬＣ分析は、流速：０．６５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２０８ｎｍ、カラム：ＲＰ−１８ＧＰ２５０×４．６（関東化学製）、溶媒：２０％メタノール（１０ｍＭＨ_３ＰＯ_４）の条件で行った。
タンパク量は、ブラッドフォード法（ＢｉｏＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ）を用いて定量した。
タンパク溶液１０μｌにブラッドフォード試薬２５０μｌを加え、３０分後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。
規定濃度溶液（１．４４ｍｇ／ｍｌ）のＢＳＡを用いて各々の濃度と吸光度の検量線を作成した。
これを元に、球根無細胞抽出液中のタンパク含量を定量した。 (Preparation of crude tulip bulb enzyme solution)
Freeze-dried tulipa (Tulipa spp.): 2 g (fresh weight) bulbs of “purple crystal” were crushed with a bead shocker, 20 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (KPB) (pH 7.0) was added, and vortexed. After stirring, the mixture was allowed to stand in a low temperature room for 1 hour.
After centrifugation (21,500 × g, 15 min, 4 ° C.), the supernatant was applied to a DEAE-Toyopearl column (3 ml of gel) equilibrated with 10 mM KPB, and eluted with 10 mM KPB and 100 mM KPB (0.1 M NaCl). The active fraction was collected and concentrated with a centriprep (4,000 × g, 40 min, 4 ° C.).
Thereby, 500 U of crude enzyme having a specific activity of 100 U / mg could be obtained.
The enzyme activity was measured by the following method.
Add 5 μl of 0.5 M KPB (pH 6.5), 10 μl of enzyme solution, 30 μl of H ₂ O, and 5 μl of 6-Tuliposide A (10 mg / ml) as a substrate to make a total volume of 50 μl, and let stand at room temperature for 10 minutes. The enzyme reaction was performed.
Ten minutes later, 100 μl of methanol, 50 μl of 0.5 MH ₃ PO _{4 and} 300 μl of H ₂ O were added to stop the reaction, and 25 μl was injected into HPLC to measure the activity.
The HPLC analysis was performed under the conditions of flow rate: 0.65 ml / min, detection: 208 nm, column: RP-18GP 250 × 4.6 (manufactured by Kanto Chemical), solvent: 20% methanol (10 mM H ₃ PO ₄ ).
The amount of protein was quantified using the Bradford method (Bio Rad Protein Assay Kit).
250 μl of Bradford reagent was added to 10 μl of protein solution, and after 30 minutes, the absorbance at 595 nm was measured.
A calibration curve of each concentration and absorbance was prepared using BSA in a normal concentration solution (1.44 mg / ml).
Based on this, the protein content in the bulb-free cell extract was quantified.

（チューリップ花弁組織からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の抽出）
チューリップ：「紫水晶」の花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍｌの冷水を加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（３１００Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、各溶媒（トルエン、酢酸ブチル、酢酸プロピル、ヘキサン、キシレン）２００μｌで２回、１００μｌで１回の計３回で溶媒抽出してＨＰＬＣ分析にて抽出効率を求めた。
なお、ＨＰＬＣ分析については、流速：０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２０８ｎｍ、カラム：ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１００Ｖ５ｍｍ４．６ｍｍ×１５ｃｍ（東ソー株式会社製）、溶媒：１０％メタノール（１０ｍＭＨ_３ＰＯ_４）、イソクラティックの条件で行った。
ここで抽出効率は、図１〜４にそれぞれ示すような既知の濃度に基づいて検量線を作成し、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換後、酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。

抽出溶媒として非極性溶媒を用いたので、ヒドロキシ基を有するα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの抽出効率が低かった。 (Extraction of α-methylene-γ-butyrolactone from tulip petal tissue)
Tulip: 1 ml of cold water was added to 100 mg (fresh weight) of petals of “purple crystal” and crushed and extracted with a bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10 times).
After cotton filtration, 490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 10 mM KPB (pH 7.0) and 5 μl of the crude enzyme solution (3100 U / ml) obtained in Example 1 were added, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. .
A saturated amount of NaCl is added to this, and solvent extraction is performed three times, each with 200 μl each solvent (toluene, butyl acetate, propyl acetate, hexane, xylene) and once with 100 μl, and the extraction efficiency is improved by HPLC analysis. Asked.
For HPLC analysis, flow rate: 0.35 ml / min, detection: 208 nm, column: TSKgel ODS-100V 5 mm 4.6 mm × 15 cm (manufactured by Tosoh Corporation), solvent: 10% methanol (10 mM H ₃ PO ₄ ) , Performed under isocratic conditions.
Here, for the extraction efficiency, a calibration curve is prepared based on the known concentrations as shown in FIGS. 1 to 4, and the tulipposide-A or B is α-methylene-γ-butyrolactone or α-methylene-β-hydroxy. The ratio of solvent extraction from the enzyme reaction solution after conversion to -γ-butyrolactone is shown.

Since a nonpolar solvent was used as the extraction solvent, the extraction efficiency of α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone having a hydroxy group was low.

（チューリップ花弁組織からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の分別抽出）
チューリップ：「紫水晶」花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍｌの冷水を加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（５８０Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
残りの水層より、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを各溶媒（ブタノール、酢酸エチル、２−プロパノール、酢酸プロピル、イソアミルアルコール）にて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出、ＨＰＬＣ分析にて抽出効率を算出した。

α−メチレン−γ−ブチロラクトンを非極性溶媒で抽出した後に極性溶媒を用いてα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを抽出したので抽出効率が向上した。 (Fractionation extraction of α-methylene-γ-butyrolactone from tulip petal tissue)
Tulip: 1 ml of cold water was added to 100 mg (raw weight) of “purple crystal” petals, and the mixture was crushed and extracted with a bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10).
After cotton filtration, 490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 10 mM KPB (pH 7.0) and 5 μl of the crude enzyme solution (580 U / ml) obtained in Example 1 were added, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. .
A saturated amount of NaCl was added to this, and α-methylene-γ-butyrolactone was solvent extracted twice with 200 μl of toluene and once with 100 μl.
From the remaining aqueous layer, α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was subjected to solvent extraction with each solvent (butanol, ethyl acetate, 2-propanol, propyl acetate, isoamyl alcohol) twice at 200 μl and once at 100 μl. Extraction efficiency was calculated by HPLC analysis.

Extraction efficiency was improved because α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was extracted with a polar solvent after α-methylene-γ-butyrolactone was extracted with a nonpolar solvent.

（チューリップ根粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の根１．３ｇ（乾燥重量）を乳鉢にて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を１５０ｍｌ加えて低温室にて１時間攪拌した。
ガーゼにて組織を濾別後、遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）した上清に１０ｍＭＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ４ｇを加え、低温室にて１．５時間攪拌した。懸濁液を２５ｍｌの注射筒に流し入れゲルを回収した。
このゲルより各２０ｍｌの１０ｍＭＫＰＢ、１００ｍＭＫＰＢ、１００ｍＭＫＰＢ（０．１ＭＮａＣｌ）にて順次酵素を溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップ（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）及びセントリコン（１０，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、１８．７Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１７Ｕを得ることができた。 (Preparation of crude tulip root enzyme solution)
Freeze-dried tulip: 1.3 g (dry weight) roots of “purple crystal” were crushed in a mortar, 150 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (KPB) (pH 7.0) was added, and the mixture was stirred in a low temperature room for 1 hour. did.
After filtering the tissue with gauze, 4 g of DEAE-Toyopearl equilibrated with 10 mM KPB was added to the centrifuged supernatant (21,500 × g, 15 min, 4 ° C.), and the mixture was stirred for 1.5 hours in a low temperature chamber. did. The suspension was poured into a 25 ml syringe and the gel was collected.
From this gel, the enzyme was sequentially eluted with 20 ml each of 10 mM KPB, 100 mM KPB, and 100 mM KPB (0.1 M NaCl), and the active fraction was collected and then centriprep (4,000 × g, 40 min, 4 ° C.). And centricon (10,000 × g, 20 min, 4 ° C.).
As a result, about 17 U of crude enzyme having a specific activity of 18.7 U / mg could be obtained.

（チューリップ茎粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の茎２．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１１．１Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１２Ｕを得ることができた。 (Preparation of crude tulip stem enzyme solution)
Freeze-dried tulip: Purified from 2.2 g (dry weight) stem of “purple crystal” in the same manner as in Example 4 to obtain about 12 U of crude enzyme having a specific activity of 11.1 U / mg. It was.

（チューリップ葉粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の葉２．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１５．４Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約６３Ｕを得ることができた。 (Preparation of tulip leaf crude enzyme solution)
Freeze-dried tulip: Purified from 2.2 g (dry weight) of “purple crystal” in the same manner as in Example 4 to obtain about 63 U of crude enzyme having a specific activity of 15.4 U / mg. It was.

（チューリップ花弁粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の花弁１．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、６８．０Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約６０Ｕを得ることができた。 (Preparation of tulip petal crude enzyme solution)
Freeze-dried tulip: Purified from 1.2 g (dry weight) of petals of “purple crystal” in the same manner as in Example 4 to obtain about 60 U of crude enzyme having a specific activity of 68.0 U / mg. It was.

（チューリップ葯粗酵素液の調製）
凍結乾燥した「紫水晶」の葯２．０ｇ（乾燥重量）から実施例Ｂ−１と同様の手法で精製を行い、４２．１Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約７２Ｕを得ることができた。 (Preparation of tulip koji crude enzyme solution)
Purification can be performed from 2.0 g (dry weight) of freeze-dried “purple crystal” in the same manner as in Example B-1 to obtain about 72 U of a crude enzyme having a specific activity of 42.1 U / mg. It was.

（チューリップ雌しべ粗酵素液の調製）
凍結乾燥したチューリップ：「紫水晶」の雌しべ１．２ｇ（乾燥重量）から実施例４と同様の手法で精製を行い、１１．４Ｕ／ｍｇの比活性を有する粗酵素約１７Ｕを得ることができた。 (Preparation of tulip pistil crude enzyme solution)
Freeze-dried tulip: Purified from 1.2 g (dry weight) pistil of “purple crystal” in the same manner as in Example 4 to obtain about 17 U of crude enzyme having a specific activity of 11.4 U / mg. It was.

（チューリップ各組織由来粗酵素を用いたα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
チューリップ：「紫水晶」の花弁（乾重量１ｇ）を乳鉢で破砕し、冷メタノール５０ｍｌを加え低温室（４℃）にて３０分間撹拌抽出した。
ろ過後、ろ液をシロップ状になるまで減圧濃縮し、メタノールと同量の冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
このものを均等に分け、酵素反応に供した。
抽出液４９０μｌを量りとり、１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各組織由来粗酵素液（球根１０００Ｕ／ｍｌ、葉６３０Ｕ／ｍｌ、茎１２３Ｕ／ｍｌ、根１７１Ｕ／ｍｌ、葯７１９Ｕ／ｍｌ、花弁６０１Ｕ／ｍｌ、雌しべ１６７Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ２回、１００μｌ１回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ２回、１００μｌ１回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表３に示す。
ここで変換率は、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換した割合を示し、抽出効率は酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。

(Preparation of α-methylene-γ-butyrolactones using crude enzymes derived from tulip tissues)
Tulip: Petal of “purple crystal” (dry weight 1 g) was crushed in a mortar, 50 ml of cold methanol was added, and the mixture was stirred and extracted for 30 minutes in a cold room (4 ° C.).
After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure until it became a syrup, and redissolved in cold water (4 ° C.) in the same amount as methanol to obtain an extract.
This was divided equally and subjected to enzymatic reaction.
490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 1M KPB (pH 7.0), crude enzyme solution derived from each tissue (bulb 1000 U / ml, leaf 630 U / ml, stem 123 U / ml, root 171 U / ml, moth 719 U / ml, petal 601 U / Ml, pistil 167 U / ml) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, α-methylene-γ-butyrolactone was added to toluene (200 μl twice, 100 μl once), α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was added to butanol / acetone = 1/1 (200 μl 2 times, 100 μl once), and the concentrations of α-methylene-γ-butyrolactone and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone were determined by HPLC.
Table 3 shows the conversion rate and extraction efficiency by the enzyme.
Here, the conversion rate indicates the ratio of turipposide-A or B converted to α-methylene-γ-butyrolactone or α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone, and the extraction efficiency can be solvent extracted from the enzyme reaction solution. The ratio is shown.

（比較例１）
（市販リパーゼを用いたα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
実施例１０同様の抽出液を用い、このものを均等に分け、酵素反応に供した。
抽出液４９０μｌを量りとり、１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各種リパーゼ１０ｍｇを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ２回、１００μｌ１回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ２回、１００μｌ１回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表４に示す。

この結果、チューリップ組織から抽出したチューリッポシド変換酵素の方が市販のリパーゼよりも優れていることが明らかになった。 (Comparative Example 1)
(Preparation of α-methylene-γ-butyrolactones using commercially available lipase)
Using the same extract as in Example 10, this was equally divided and subjected to an enzymatic reaction.
490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 1M KPB (pH 7.0) and 10 mg of various lipases were added, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, α-methylene-γ-butyrolactone was added to toluene (200 μl twice, 100 μl once), α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was added to butanol / acetone = 1/1 (200 μl 2 times, 100 μl once), and the concentrations of α-methylene-γ-butyrolactone and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone were determined by HPLC.
Table 4 shows the conversion rate and extraction efficiency by the enzyme.

As a result, it was revealed that the tulipposide converting enzyme extracted from the tulip tissue was superior to the commercially available lipase.

（チューリップ各組織中からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の調製）
チューリップ：「紫水晶」の各組織（球根２５０ｍｇ、葉１００ｍｇ、茎１００ｍｇ、根１００ｍｇ、葯５０ｍｇ、花弁１００ｍｇいずれも生重量）に冷水１ｍｌを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、抽出液４９０μｌを量りとり、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、粗酵素液（１０００Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ２回、１００μｌ１回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００ μｌ２回、１００μｌ１回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表５に示す。

(Preparation of α-methylene-γ-butyrolactone from tulip tissues)
Tulip: 1 ml of cold water was added to each tissue of “purple crystal” (bulb 250 mg, leaf 100 mg, stem 100 mg, root 100 mg, cocoon 50 mg, petal 100 mg all raw weight), and bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10 times).
After cotton filtration, 490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 10 mM KPB (pH 7.0) and 5 μl of crude enzyme solution (1000 U / ml) were added, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, α-methylene-γ-butyrolactone was added to toluene (200 μl twice, 100 μl once), α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was butanol / acetone = 1/1 (200 (μl twice, 100 μl once), and the concentrations of α-methylene-γ-butyrolactone and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone were determined by HPLC.
Table 5 shows the conversion rate and extraction efficiency by the enzyme.

（アルストロメリア抽出液の調製）
アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａｓｐｐ．）植物体６０ｍｇ（乾燥重量）より冷メタノール３ｍｌにて、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕することで抽出物を得た。
綿ろ過後、ろ液を集め減圧濃縮し、ろ液と同量の冷水に再溶解して抽出液とした。
このものを均等に分け、酵素反応に供した。
なお、抽出にはラピッドスター、マリレーン、エラの３栽培品種を用いた。 (Preparation of Alstroemeria extract)
An extract was obtained from 60 mg (dry weight) of an Alstroemeria plant by crushing with 3 ml of cold methanol with a bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10).
After cotton filtration, the filtrate was collected, concentrated under reduced pressure, and redissolved in the same amount of cold water as the filtrate to obtain an extract.
This was divided equally and subjected to enzymatic reaction.
For the extraction, three cultivars of Rapid Star, Marilane and Ella were used.

（セリバオウレン抽出液の調製）
セリバオウレン（Ｃｏｐｔｉｓｊａｐｏｎｉｃａ）植物体６００ｍｇ（乾燥重量）を乳鉢で破砕後冷メタノール３０ｍｌを加え、室温にて３０分間撹拌した。
ろ過後、ろ液をシロップ状になるまで減圧濃縮し、冷水３ｍｌに再溶解して抽出液とした。このものを均等に分け、酵素反応に供した。 (Preparation of Ceribaurene extract)
After crushing 600 mg (dry weight) of Ceribauren plant (Coptis japonica) in a mortar, 30 ml of cold methanol was added and stirred at room temperature for 30 minutes.
After filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure until it became a syrup, and redissolved in 3 ml of cold water to obtain an extract. This was divided equally and subjected to enzymatic reaction.

（各植物体からのα−メチレン−γ−ブチロラクトン類の生成及び抽出）
上記で調製した抽出液４９０μｌを量りとり、１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５ｍｌ、球根粗酵素液（１，０６３Ｕ／ｍｌ）５ｍｌまたはＨ_２Ｏを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ２回、１００μｌ１回）にて抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素変換により生成したα−メチレン−γ−ブチロラクトンの濃度及び抽出効率を表６に示す。

(Generation and extraction of α-methylene-γ-butyrolactone from each plant)
490 μl of the extract prepared above was weighed, 5 ml of 1M KPB (pH 7.0), 5 ml of bulbous crude enzyme solution (1,063 U / ml) or H ₂ O was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, and α-methylene-γ-butyrolactone was extracted with toluene (200 μl twice, 100 μl once), and the concentration of α-methylene-γ-butyrolactone was determined by HPLC.
Table 6 shows the concentration and extraction efficiency of α-methylene-γ-butyrolactone produced by enzymatic conversion.

紫水晶の各組織（球根、葉、茎、根、葯、花弁、雌しべ）１００ｍｇ（生重量、但し球根は２５０ｍｇ、葯は５０ｍｇ）に１ｍｌのメタノールを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を減圧濃縮し、１ｍＬの冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
抽出液４９０μｌを量りとり、１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、球根粗酵素液（１，０６３Ｕ／ｍｌ）５μｌを添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
残りの水層より、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール：アセトン＝１：１にて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出した。
４つの段階（抽出直後、２時間反応後、トルエン抽出後の水層、混合溶媒抽出後の水層）に分け、ＨＰＬＣ分析を行った。
なお、ＨＰＬＣ分析条件は実施例２と同条件である。
分析結果を表７に示す。
ここで濃度は、酵素反応液における両化合物の濃度を、変換率は、チューリッポシド−Ａ又はＢがα−メチレン−γ−ブチロラクトン又はα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換した割合を示し、抽出効率は酵素反応液から溶媒抽出できた割合を示す。

1 ml of methanol was added to 100 mg of each of the quartz crystals (bulb, leaf, stem, root, bud, petal, pistil) (fresh weight, but 250 mg for bulb and 50 mg for bud), and bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 Second × 10), and after cotton filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure and redissolved in 1 mL of cold water (4 ° C.) to obtain an extract.
490 μl of the extract was weighed, 5 μl of 1M KPB (pH 7.0) and 5 μl of bulbous crude enzyme solution (1,063 U / ml) were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, and α-methylene-γ-butyrolactone was solvent extracted twice with 200 μl of toluene and once with 100 μl.
From the remaining aqueous layer, α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was subjected to solvent extraction with butanol: acetone = 1: 1, 200 μl twice, and 100 μl once.
HPLC analysis was performed by dividing into four stages (immediately after extraction, after reaction for 2 hours, aqueous layer after toluene extraction, aqueous layer after mixed solvent extraction).
The HPLC analysis conditions are the same as in Example 2.
The analysis results are shown in Table 7.
Here, the concentration is the concentration of both compounds in the enzyme reaction solution, and the conversion rate is the rate at which Tulipposide-A or B is converted to α-methylene-γ-butyrolactone or α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone. The extraction efficiency indicates the ratio of solvent extraction from the enzyme reaction solution.

これにより、植物体の各組織からの破砕抽出にメタノールを用いてもα−メチレン−γ−ブチロラクトン類を効率よく得られることが明らかになった。 As a result, it has been clarified that α-methylene-γ-butyrolactone can be efficiently obtained even when methanol is used for crushing extraction from each tissue of a plant.

チューリップの各品種（アーリーグローリー、ありさ、アルビノ、ウエディングベールエンパイヤステート、カーニバルデリオ、黄小町、クインオブナイト、グリーンランド、ゲリットファンデルボルク、ゴールデンエンパイヤステート、ゴールデンメロディー、コンプリメント、白雪姫、紫雲、ジュディレスター、スターファイター、デザインインプレッション、初桜、ハミルトン、春乙女、春万葉、バレリーナ、ピンクダイヤモンド、ピンクレディパーロット、ファンシーフリル、フライアウェイ、フランソワーゼ、紫水晶、フレーミングパーロット、メセアポゼラン、ラリベラ、ランバダ、レーンファンデルマーク、レッドウィング、レッドファボリット、ワシントン）の花弁１００ｍｇ（生重量）に１ｍＬのメタノールを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を減圧濃縮し、１ｍＬの冷水（４℃）に再溶解して抽出液とした。
上記、抽出液４９０μｌを量りとり、実施例１３と同様に反応を行い、抽出、定量を行った結果を表８に示す。
なお、濃度、変換率、抽出効率の定義は、実施例１３と同様である。

Tulip varieties (Early Glory, Arisa, Albino, Wedding Veil Empire State, Carnival Derio, Yellow Komachi, Quinn of Night, Greenland, Gerrit van der Bork, Golden Empire State, Golden Melody, Complement, Snow White, Purple Cloud, Judy Leicester, Star Fighter, Design Impression, First Cherry Blossom, Hamilton, Haru Otome, Spring Manyo, Ballerina, Pink Diamond, Pink Lady Parrot, Fancy Frill, Fly Away, Francoise, Purple Crystal, Framing Parrot, Messiapozellan, Lalibela, Lambada, Lane 1 mL of methanol is added to 100 mg (fresh weight) of petals of van der Mark, Red Wing, Red Favorite, Washington. Shocker (2500rpm, 4 ℃, × 10 30 seconds) and disrupted by, after cotton filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the extract was redissolved in cold water 1 mL (4 ° C.).
Table 8 shows the results obtained by measuring 490 μl of the extract and reacting in the same manner as in Example 13 and performing extraction and quantification.
The definitions of density, conversion rate, and extraction efficiency are the same as in Example 13.

これにより、チューリップの品種によらずにα−メチレン−γ−ブチロラクトン類が得られることが明らかになった。 This revealed that α-methylene-γ-butyrolactone can be obtained regardless of tulip varieties.

シジミバナ（Ｓｐｉｒａｅａｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ）、ユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ピンクユキヤナギ（Ｓｐｉｒａｅａｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、カタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＰｕｒｓｈ．）植物体５０ｍｇ（乾燥重量）に冷メタノール１ｍｌを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０）で破砕し、綿ろ過後、ろ液を集め減圧濃縮し、ろ液と同量の冷水に再溶解して抽出液とした。
植物抽出液４９０μｌを量りとり、実施例１３と同様に反応を行い、抽出、定量を行った結果を表９に示す。
なお、濃度、抽出効率の定義は、実施例１３と同様である。

White spruce (Spiraea prunifolia), Snow willow (Spiraea thunbergii), Pink snow willow (Spiraea thunbergii), Cranberry (Erythronium japonicum decne.) After crushing at (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10) and cotton filtration, the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure, and redissolved in the same amount of cold water as the filtrate to obtain an extract.
Table 9 shows the results of measuring 490 μl of plant extract, performing the reaction in the same manner as in Example 13, and performing extraction and quantification.
The definitions of concentration and extraction efficiency are the same as in Example 13.

これにより、植物組織中にチューリッポシド−β及びその類縁体が存在すると、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得ることができることも明らかになった。 This also revealed that α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone can be obtained when turipposide-β and its analogs are present in plant tissues.

実施例１０で調製した紫水晶花弁抽出液４９０μｌに、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、実施例１にて得られた粗酵素液（５８０Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加、無添加下で、各種溶媒にて２００μｌで各回数抽出することで、α−メチレン−γ−ブチロラクトン類を溶媒抽出した。
ＨＰＬＣ分析にて抽出効率を算出した結果を表１０に示す。

To 490 μl of the purple crystal petal extract prepared in Example 10, 5 μl of 10 mM KPB (pH 7.0) and 5 μl of the crude enzyme solution (580 U / ml) obtained in Example 1 were added, respectively, at room temperature for 2 hours. Left to stand.
The α-methylene-γ-butyrolactone was extracted with a solvent by adding 200 μl each time with various solvents with or without a saturated amount of NaCl added thereto.
Table 10 shows the results of calculating the extraction efficiency by HPLC analysis.

実施例１３と同様の酵素反応後、ベンゾトリフルオリドにてα−メチレン−γ−ブチロラクトンを抽出（ＮａＣｌ無添加、２００μｌ×５回抽出）した残りの水層にＮａＣｌを飽和量添加し、２，２，２−トリフルオロエタノールまたは２，２，３，３−テトラフルオロ−１−プロパノールにて２００μｌで２回、１００μｌで１回溶媒抽出したところ、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを９４．７及び９５．８％の効率で抽出できた。 After enzymatic reaction similar to Example 13, α-methylene-γ-butyrolactone was extracted with benzotrifluoride (no NaCl added, 200 μl × 5 times extraction), and a saturated amount of NaCl was added to the remaining aqueous layer, When solvent extraction with 2,2-trifluoroethanol or 2,2,3,3-tetrafluoro-1-propanol was performed twice with 200 μl and once with 100 μl, α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was obtained. Extraction was possible with an efficiency of 94.7 and 95.8%.

アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｍｅｒｉａｓｐｐ．）植物体２００ｍｇ（乾燥重量）を乳鉢にて破砕し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）を１５ｍｌ加えて低温室にて１時間攪拌した。
ガーゼにて組織を濾別後、遠心分離（２１，５００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）した上清に１０ｍＭＫＰＢにて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ１ｇを加え、低温室にて１．５時間攪拌した。
懸濁液を１０ｍｌの注射筒に流し入れゲルを回収した。
このゲルより各５ｍｌの１０ｍＭＫＰＢ、１００ｍＭＫＰＢ、１００ｍＭＫＰＢ（０．１ＭＮａＣｌ）にて順次酵素を溶出し、活性のあるフラクションを回収後、セントリプレップ（４，０００×ｇ，４０ｍｉｎ，４℃）及びセントリコン（１０，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、８．９Ｕ／ｍｇの比活性を有する「エラ」粗酵素約５．６Ｕ、７．５Ｕ／ｍｇの比活性を有する「マリレーン」粗酵素約２．３Ｕ、３．５Ｕ／ｍｇの比活性を有する「ラピッドスター」粗酵素約１．２Ｕを得ることができた。 200 mg (dry weight) of an Alstroemeria spp. Plant was crushed in a mortar, 15 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (KPB) (pH 7.0) was added, and the mixture was stirred in a cold room for 1 hour.
After filtering the tissue with gauze, 1 g of DEAE-Toyopearl equilibrated with 10 mM KPB was added to the supernatant centrifuged (21,500 × g, 15 min, 4 ° C.), and stirred for 1.5 hours in a low temperature chamber. did.
The suspension was poured into a 10 ml syringe and the gel was collected.
From this gel, the enzyme was sequentially eluted with 5 ml each of 10 mM KPB, 100 mM KPB, and 100 mM KPB (0.1 M NaCl), and the active fraction was collected and then centriprep (4,000 × g, 40 min, 4 ° C.). And centricon (10,000 × g, 20 min, 4 ° C.).
This gives a ratio of about 5.6 U of “Ella” crude enzyme having a specific activity of 8.9 U / mg, a ratio of about 2.3 U, 3.5 U / mg of “Malilane” crude enzyme having a specific activity of 7.5 U / mg. About 1.2 U of “Rapid Star” crude enzyme with activity could be obtained.

カタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍＤｅｃｎｅ．）、キバナカタクリ（ＥｒｙｔｈｒｏｎｉｕｍｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＰｕｒｓｈ．）植物体５０ｍｇ（乾燥重量）に１ｍｌの１０ｍＭＫＰＢを加え、ビーズショッカー（２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒×１０回）で破砕抽出した。
綿ろ過後、得られた酵素液をマイクロコン（８，０００×ｇ，２０ｍｉｎ，４℃）にて濃縮した。
これにより、８５．３Ｕ／ｍｇの比活性を有するカタクリ粗酵素約４．９Ｕ、１２６Ｕ／ｍｇの比活性を有するキバナカタクリ粗酵素約７．７Ｕを得ることができた。 1 ml of 10 mM KPB was added to 50 mg (dry weight) plant body of erythronium japonicum decne, Erythronium grandiflorum Pursh., And crushed and extracted with a bead shocker (2500 rpm, 4 ° C., 30 seconds × 10 times).
After cotton filtration, the resulting enzyme solution was concentrated with a microcon (8,000 × g, 20 min, 4 ° C.).
As a result, about 4.9 U of a crude enzyme with a specific activity of 85.3 U / mg and about 7.7 U of a crude enzyme with a specific activity of 126 U / mg were obtained.

実施例１０に用いた抽出液４９０μｌを量りとり、１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５μｌ、各植物由来粗酵素液（アルストロメリア「エラ」１１２Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「マリレーン」４７Ｕ／ｍｌ、アルストロメリア「ラピッドスター」２４Ｕ／ｍｌ、カタクリ９２Ｕ／ｍｌ、キバナカタクリ１５３Ｕ／ｍｌ）５μｌを各々添加し、常温にて２時間静置した。
このものにＮａＣｌを飽和量添加し、α−メチレン−γ−ブチロラクトンをトルエン（２００μｌ２回、１００μｌ１回）、α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンをブタノール／アセトン＝１／１（２００μｌ２回、１００μｌ１回）にて分別抽出し、ＨＰＬＣにてα−メチレン−γ−ブチロラクトン及びα−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの濃度を求めた。
酵素による変換率と抽出効率を表１１に示す。

490 μl of the extract used in Example 10 was weighed out, 5 μl of 1M KPB (pH 7.0), each plant-derived crude enzyme solution (Alstroemeria “Ella” 112 U / ml, Alstroemeria “Malilane” 47 U / ml, Alstroemeria “Rapid Star”. 24 U / ml, Katakuri 92 U / ml, Kibana Katakuri 153 U / ml) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
A saturated amount of NaCl was added to this, α-methylene-γ-butyrolactone was added to toluene (200 μl twice, 100 μl once), α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone was added to butanol / acetone = 1/1 (200 μl 2 times, 100 μl once), and the concentrations of α-methylene-γ-butyrolactone and α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone were determined by HPLC.
Table 11 shows the enzyme conversion and extraction efficiency.

これにより、チューリッポシド変換酵素はチューリップのみならず、アルストロメリア、カタクリ、キバナカタクリ等の植物組織にも存在することが明らかになった。 As a result, it has been clarified that the tulipposide converting enzyme is present not only in tulips but also in plant tissues such as alstroemeria, katakuri and kibana katakuri.

Claims

To an extract obtained by crushing and extracting a plant tissue containing turipposides represented by the following chemical formulas (1) and (2) with water, or an extract obtained by redissolving in water after crushing and extracting with methanol,
An enzymatic reaction using a tulipposide converting enzyme;
Solvent-extracting α-methylene-γ-butyrolactone from the resulting enzyme reaction solution using a nonpolar solvent;
A step of solvent-extracting α-methylene-β-hydroxy-γ-butyrolactone from the aqueous layer after the solvent extraction using a polar solvent ;
The nonpolar solvent is toluene or xylene;
The method for producing α-methylene-γ-butyrolactone is characterized in that the polar solvent is any one of butanol, a 1: 1 mixed solvent of butanol and acetone, and 2-propanol .

Plant tissues containing the tulipposides are Tulipa spp., Alstroemeria spp., Coptis japonica, Spiraea thunbergii, Spirae suna suna. 2. The production of α-methylene-γ-butyrolactone according to claim 1, wherein the α-methylene-γ-butyrolactone is a plant tissue from any of the following plants: erythronium japonicum Decne. Method.

The tulipposide converting enzyme disrupts plant tissue derived from any one of tulipa spp. , Erythronium japonicum decne, and erythronium grandiflorum Pursh. Potassium phosphate buffer. The method for producing α-methylene-γ-butyrolactone according to claim 1, wherein the α-methylene-γ-butyrolactone is purified by extraction and chromatography.