JP5691278B2 - Method for providing anchor peptide for protein immobilization - Google Patents
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Description
本発明は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインAのEドメイン遺伝子にランダムミューテーションを導入したライブラリからストレプトアビジン（SA）を用いてセレクションされたタンパク質分子であり、SAに対する結合性を利用した、ビオチンを利用しない精製・固定化用蛋白質に関するものである。 The present invention is a protein molecule selected using streptavidin (SA) from a library in which random mutation is introduced into the E domain gene of protein A derived from Staphylococcus aureus. It relates to proteins for purification and immobilization that are not used.
目的とする蛋白質を色素等を用いて識別する一般的な方法として、ストレプトアビジン(SA)およびビオチンを利用した系が存在する。 There is a system using streptavidin (SA) and biotin as a general method for identifying a target protein using a dye or the like.
一方、目的とする蛋白質を精製または固定化するための方法として、世の中に多数存在する（特許文献１、２）。 On the other hand, there are many methods for purifying or immobilizing a target protein (Patent Documents 1 and 2).
しかし、背景技術に記載の精製または固定化方法では、精製用および固定化用として各々の結合蛋白質が必要であるという問題があった。 However, the purification or immobilization method described in the background art has a problem that each binding protein is required for purification and immobilization.
そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、目的の蛋白質の精製ができ、さらに基盤へ固定化できる精製・固定化用ペプチド蛋白質を提供することを目的とする。 In view of the above-described conventional problems, an object of the present invention is to provide a peptide protein for purification / immobilization that can purify a target protein and can be immobilized on a substrate.
上記従来の課題を解決するために、蛋白質（抗体、プロテインＡなど）を精製および固定化するために、精製・固定化用ペプチド融合蛋白質を作製する。 In order to solve the above conventional problems, a peptide fusion protein for purification / immobilization is prepared in order to purify and immobilize proteins (antibodies, protein A, etc.).
この精製・固定化用ペプチド蛋白質は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインAのEドメインを基にした。 This peptide protein for purification / immobilization was based on the E domain of protein A derived from Staphylococcus aureus.
黄色ブドウ球菌由来のプロテインAのEドメインを基にした理由は、遺伝子レベルで変異を導入したとしても、蛋白質として発現したとき、機能を発揮するために必要な構造を保持できると考えたからである。 The reason based on the E domain of protein A derived from S. aureus is that even if a mutation was introduced at the gene level, it was thought that it could retain the structure necessary for its function when expressed as a protein. .
本発明の精製・固定化用ペプチド蛋白質は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインAのEドメイン遺伝子へランダムに変異を導入したライブラリから、SAを用いてセレクションを行うことで獲得した蛋白質である。 The peptide protein for purification / immobilization of the present invention is a protein obtained by performing selection using SA from a library in which mutations are randomly introduced into the E domain gene of protein A derived from Staphylococcus aureus.
本発明によれば、一つのアミノ酸配列だけを融合することで、目的とする蛋白質を精製および固定化することができる、精製および固定化が可能である精製・固定化用ペプチド蛋白質を提供することができる。 According to the present invention, there is provided a peptide protein for purification / immobilization capable of purification and immobilization, which can purify and immobilize a target protein by fusing only one amino acid sequence. Can do.
以下において、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
（実施例１）
図１の＃７（配列番号：１）および＃８（配列番号：２）は、精製・固定化用ペプチド蛋白質の配列を示す。
Example 1
# 7 (SEQ ID NO: 1) and # 8 (SEQ ID NO: 2) in FIG. 1 show the sequence of the peptide protein for purification / immobilization.
次に、上記配列を獲得する具体的方法を示す。 Next, a specific method for obtaining the sequence will be described.
（１．ランダム変異導入遺伝子ライブラリの作製）
テンプレート遺伝子としてプロテインAのEドメインを使用した。
(1. Preparation of random mutation transgene library)
The E domain of protein A was used as a template gene.
図２に、プロテインAのEドメインの遺伝子を導入するためのプラスミドベクター（pCDNA3.1(+);Invitrogen社）を示す。 FIG. 2 shows a plasmid vector (pCDNA3.1 (+); Invitrogen) for introducing a protein A E domain gene.
プロテインAのEドメイン遺伝子は以下の塩基配列を用いた。 The following base sequence was used for the E domain gene of protein A.
GCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCTCAAGCTCCAAAA（配列番号：３）
プロテインAのEドメインの遺伝子周辺にランダムな変異を導入した。
GCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCTCAAGCTCCAAAA (SEQ ID NO: 3)
A random mutation was introduced around the gene of the E domain of protein A.
次に、ランダム変異を導入するために、２つのプライマーと変異導入酵素（GeneMorpho II Random Mutagenesis Kit; Stratagene）を用い、PCRを３回行った。 Next, in order to introduce a random mutation, PCR was performed three times using two primers and a mutation-introducing enzyme (GeneMorpho II Random Mutagenesis Kit; Stratagene).
図３にPCRの条件を示す。 FIG. 3 shows the PCR conditions.
これにより、変異導入酵素の特性から計算上4.7ｘ10e24の多様性を持つプロテインAのEドメインランダム変異遺伝子ライブラリを作製した。 As a result, a protein A E domain random mutant gene library having a computational diversity of 4.7 × 10e24 was created from the characteristics of the mutagenesis enzyme.
上記遺伝子ライブラリをプラスミドベクターへ導入するため、プライマーとして遺伝子ライブラリ、テンプレートとしてプロテインAのEドメイン遺伝子が導入されたプラスミドベクター、酵素としてPrimeSTAR HS（タカラバイオ株式会社）を用いてPCRによって行った。 In order to introduce the gene library into a plasmid vector, PCR was performed using a gene library as a primer, a plasmid vector into which an E domain gene of protein A was introduced as a template, and PrimeSTAR HS (Takara Bio Inc.) as an enzyme.
PCR後、テンプレートのプラスミドベクターがライブラリに混入することが無いよう、酵素DpnIにて処理を行い、テンプレートを細かく切断した。 After PCR, the template plasmid vector was treated with the enzyme DpnI so as not to be mixed into the library, and the template was cut into small pieces.
図４にPCRの条件を示す。 FIG. 4 shows the PCR conditions.
SA結合性Eドメイン変異体の選択
細胞への形質転換
上記PCRにより獲得したプロテインAのEドメイン変異遺伝子ライブラリが導入されたプラスミドベクター群をエレクトロポレーション法により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入した。
Selection of SA-binding E domain mutants Transformation into cells The plasmid vector group into which the protein A E domain mutant gene library obtained by PCR was introduced was introduced into HEK293T cells by electroporation.
形質転換する方法としてカチオン性脂質による方法を採用した。 A cationic lipid method was adopted as a method for transformation.
形質転換試薬には、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was used as a transformation reagent.
プロテインAのEドメインを細胞表面に発現する細胞とプロテインAのEドメイン変異体を細胞表面に発現する細胞ライブラリを培養し、おのおのマウスIgG2aとの相互作用をFACS（BD社）により解析したところ、 オリジナルのEドメインは36.7%※の細胞がIgG2aと相互作用し、Eドメイン変異体は9.7%に減少していることから、ランダム変異が導入されたことによりIgG2aへの相互作用を失っている、つまりランダム変異を含むライブラリが作製できていることが確認された。 A cell library that expresses the protein A E domain on the cell surface and a cell library that expresses the protein A E domain mutant on the cell surface were cultured, and each interaction with mouse IgG 2a was analyzed by FACS (BD). The original E domain has 36.7% * of cells interacting with IgG 2a, and the E domain mutant has been reduced to 9.7%, so the random mutation has been introduced to lose interaction with IgG 2a . That is, it was confirmed that a library containing random mutations could be created.
ＥドメインはマウスIgG2aとの相互作用があるが、100%にならないのは細胞周期によるタンパク質発現の有無によると考えられる。また、EドメインはマウスIgG1とはほぼ相互作用しないことが一般的である。 The E domain interacts with mouse IgG 2a , but it does not become 100% because of the presence or absence of protein expression by the cell cycle. In general, the E domain hardly interacts with mouse IgG1.
磁気ビーズを用いたSA結合性Eドメイン変異体の選択方法を利用した。 The selection method of SA-binding E domain mutant using magnetic beads was used.
磁気ビーズには、MACS磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を用いた。 MACS magnetic beads (Miltenyi Biotec) were used as magnetic beads.
磁気ビーズ表面には、SAが結合されている。 SA is bound to the magnetic bead surface.
選択方法の概略を以下に示す。 The outline of the selection method is shown below.
１． プロテインAのE ドメインランダム変異体細胞ライブラリとStreptavidinマイクロビーズ(MACS, Miltenyi Biotec)を反応させる。 1. A protein A E domain random mutant cell library is reacted with Streptavidin microbeads (MACS, Miltenyi Biotec).
２． MSカラム(MACS, Miltenyi Biotec)へ投入する。 2. Load onto MS column (MACS, Miltenyi Biotec).
３．カラム内を１ｍｌの１％BSA入りPBSにて３回ウォッシュする。 3. Wash the column three times with 1 ml of PBS containing 1% BSA.
４．１ｍｌの１％BSA入りPBSをカラム内に入れ、MSカラム付属のプランジャを用いてSAに反応したEドメインランダム変異体細胞群を回収する。 4. Place 1 ml of PBS containing 1% BSA into the column, and collect the E domain random mutant cells that have reacted to SA using the plunger attached to the MS column.
上記手順を３回繰り返すことにより準備した磁気ビーズを含む細胞ライブラリから、MSカラム(MACS, Miltenyi Biotec)を用いて、SA特異的結合能を有するプロテインAのEドメイン変異体細胞群を選択した。 Using a MS column (MACS, Miltenyi Biotec), a protein A E domain mutant cell group having SA-specific binding ability was selected from a cell library containing magnetic beads prepared by repeating the above procedure three times.
評価は、Eドメイン変異体を細胞表面に発現した状態で行った。ゆえに、評価指標は細胞の数、または細胞の数に依存した蛍光強度で示される。 図５に、各ラウンドで得られた細胞群とSAとの結合能を、FACSort(FACS, BD社製)により測定した結果を示す。 The evaluation was performed with the E domain mutant expressed on the cell surface. Therefore, the evaluation index is indicated by the number of cells or the fluorescence intensity depending on the number of cells. FIG. 5 shows the results of measuring the binding ability between the cell group obtained in each round and SA by FACSort (FACS, manufactured by BD).
標識色素としてSA化FITC(吸収波長、495 mm)を用い、SAに結合するEドメイン変異体を発現する細胞が有するFITCの蛍光強度(520 mm)を測定することにより、ライブラリが持つ結合能を測定した。 By using SA-labeled FITC (absorption wavelength, 495 mm) as a labeling dye and measuring the fluorescence intensity (520 mm) of FITC in cells expressing E domain mutants that bind to SA, the binding ability of the library can be determined. It was measured.
このことから、Eドメイン変異体を発現する細胞群がSAに対する結合能を有しているということが示された。 From this, it was shown that the cell group which expresses E domain variant has the binding ability with respect to SA.
図６に、SAとSA-PE（蛍光色素）を用いたインヒビションアッセイの結果を示す。 FIG. 6 shows the results of an inhibition assay using SA and SA-PE (fluorescent dye).
SA結合性Eドメイン変異体を発現した細胞数を一定(約１ｘ１０5)に揃え、過剰量のSA-PEと0ug、0.01ug、0.1ug、1ug、10ugのSAを各々混合し、PEの蛍光量をFACSにより測定した。 Align the number of cells expressing SA-binding E domain mutants at a constant level (approximately 1 x 10 5 ), and mix excess SA-PE with 0 ug, 0.01 ug, 0.1 ug, 1 ug, and 10 ug of SA, respectively. The amount was measured by FACS.
測定した蛍光量の平均値をプロットしたものである。 The average value of the measured fluorescence amount is plotted.
このことからも、選択されたEドメイン変異体を発現した細胞がSAに対して結合性を有することが示された。 This also indicates that cells expressing the selected E domain mutant have binding properties to SA.
図７に、単クローン化したEドメイン変異体を発現した細胞とSAの結合性を評価したFACSの結果を示す。 FIG. 7 shows the results of FACS for evaluating the binding property between SA and cells expressing a single cloned E domain mutant.
SAとの結合性を蛍光量で測るために、SA-PEを用いた。 SA-PE was used to measure the binding to SA by the amount of fluorescence.
この結果から、単クローンであってもSAに結合性を有することが示された。 From this result, it was shown that even a single clone has binding ability to SA.
図中＃７は図１中の配列＃７（配列番号：１）と、図中＃８は図１中の配列＃８（配列番号：２）と対応する。 In the figure, # 7 corresponds to array # 7 (sequence number: 1) in FIG. 1, and # 8 in the figure corresponds to array # 8 (sequence number: 2) in FIG.
本発明の精製・固定化用融合蛋白質を用いれば、図８記載のように、目的の蛋白質を精製および固定をひとつの蛋白質で行うことができ、蛋白質作製時の簡便さ、製造時の必要部材の削減にとって有用である。 If the fusion protein for purification / immobilization according to the present invention is used, the target protein can be purified and immobilized with a single protein as shown in FIG. 8. Useful for reducing
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