JP5683216B2 - Target substance detection method and apparatus - Google Patents
Target substance detection method and apparatus Download PDFInfo
- Publication number
- JP5683216B2 JP5683216B2 JP2010250339A JP2010250339A JP5683216B2 JP 5683216 B2 JP5683216 B2 JP 5683216B2 JP 2010250339 A JP2010250339 A JP 2010250339A JP 2010250339 A JP2010250339 A JP 2010250339A JP 5683216 B2 JP5683216 B2 JP 5683216B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- target substance
- channel
- substance
- membrane
- hole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、標的物質の検出方法及び装置に関する。本発明は、例えば麻薬や環境物質等の、種々の物質の検出に有用である。 The present invention relates to a target substance detection method and apparatus. The present invention is useful for detecting various substances such as narcotics and environmental substances.
近年、コカインをはじめとする麻薬の使用に関する犯罪が社会的に大きな関心を集めており、その薬物の迅速な分析法が求められている。これまでのコカイン分析では、主に、1)被検者の尿等の体液を試料とし、抗コカイン抗体を用いた免疫測定の一種であるイムノクロマト法により判定する簡易判定法、及び2)被検者の毛髪を試料としたガスクロマトグラフィー装置による高精度な計測、の2つの方法が行われている。 In recent years, crimes related to the use of narcotics such as cocaine have attracted great social interest, and a rapid analysis method for such drugs is required. In cocaine analysis so far, mainly, 1) a simple determination method in which a body fluid such as urine of a subject is used as a sample and judged by an immunochromatography method which is a kind of immunoassay using an anti-cocaine antibody, and 2) a test Two methods of high-precision measurement using a gas chromatography apparatus using human hair as a sample are performed.
1)の方法は、簡便ではあるが検出感度が低いため、麻薬摂取後からの経過時間が数分から数日までの短期間内に採取された試料でないと検出が困難である。また、より格段に高精度である2)の分析では、検体採取が容易であること、さらに麻薬摂取後の経過時間が1)よりも長時間であっても検出が可能であり、詳細な分析を要するケースで実施されてきた。しかしながら、ガスクロマトグラフィー装置が必要であり、分析に長時間を要する。 Although the method 1) is simple but has low detection sensitivity, detection is difficult unless the sample has been collected within a short period of time from several minutes to several days after taking the narcotic. In addition, in the analysis of 2), which is much more accurate, it is easy to collect samples, and even if the elapsed time after taking the narcotic is longer than 1), it can be detected, and detailed analysis It has been implemented in cases that require However, a gas chromatography device is required, and analysis takes a long time.
一方、本願発明者らは先に、脂質二重膜中にチャネルタンパクを保持し、膜を介するイオンチャネルを形成することに成功している(非特許文献1)。しかしながら、これを物質の検出に応用することは全く記載されていない。 On the other hand, the inventors of the present application have previously succeeded in holding a channel protein in a lipid bilayer and forming an ion channel via the membrane (Non-patent Document 1). However, it is not described at all that this is applied to the detection of a substance.
本願発明の目的は、検出すべき標的物質を簡便、迅速、高感度に検出することができる、標的物質の検出方法及びそのための装置を提供することである。 An object of the present invention is to provide a target substance detection method and apparatus for detecting a target substance to be detected simply, rapidly and with high sensitivity.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、標的物質と特異的に結合する、例えばアプタマーのような特異結合性物質は通過できるが、これが標的物質と特異的に結合した結合物はそのサイズの故に通過できない大きさの透孔を有する膜を利用し、標的物質と特異結合性物質との結合物によってこの透孔が閉塞されるか否かを指標とすることにより、簡便、迅速、高感度に標的物質を検出することが可能であることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive research, the inventors of the present invention can pass a specific binding substance such as an aptamer that specifically binds to the target substance, but the bound substance that specifically binds to the target substance is because of its size. By using a membrane with a through-hole that cannot pass through and using as an index whether or not the through-hole is blocked by the binding substance of the target substance and the specific binding substance, it is simple, quick, and highly sensitive. The present inventors have found that a target substance can be detected and completed the present invention.
すなわち、本発明は、標的物質の検出方法であって、
検出すべき標的物質と特異的に結合する特異結合性物質と、前記標的物質を含むかもしれない被検試料とを接触させる工程と、
所定のサイズの透孔を有する膜の一方側に前記工程で得られた混合物を接触させる工程と、
前記透孔が閉塞されるか否かを調べる工程を含み、
前記所定のサイズは、前記標的物質と結合していない前記特異結合性物質は通過できるが、前記標的物質と結合した前記特異結合性物質は通過できないサイズであり、
前記透孔が、チャネルタンパクのチャネルであり、
前記特異結合性物質が、その一端に、同一の塩基が15個〜50個連続する同一塩基の繰り返し領域を有するアプタマーである、標的物質の検出方法を提供する。
That is, the present invention is a method for detecting a target substance,
Contacting a specific binding substance that specifically binds to a target substance to be detected with a test sample that may contain the target substance;
Contacting the mixture obtained in the above step with one side of a membrane having pores of a predetermined size;
Examining whether or not the through hole is closed,
Wherein the predetermined size is the said specific binding substance not bound to the target substance can pass, said specific binding substance bound to the target substance Ri Ah size that can not pass through,
The through hole is a channel of a channel protein;
It said specific binding substance is, at one end, the same bases Ru aptamer der having repeat region of 15 to 50 contiguous identical bases, provides a method of detecting a target substance.
また、本発明は、検出すべき標的物質と結合していない特異結合性物質は通過できるが、標的物質と結合した特異結合性物質は通過できないサイズの透孔を持つ膜を具備する標的物質の検出装置であって、前記透孔が、チャネルタンパクのチャネルであり、前記特異結合性物質が、その一端に、同一の塩基が15個〜50個連続する同一塩基の繰り返し領域を有するアプタマーである、標的物質の検出装置を提供する。 The present invention also provides a target substance comprising a membrane having a pore having a size that allows a specific binding substance that is not bound to a target substance to be detected to pass through, but cannot pass a specific binding substance that is bound to the target substance. In the detection apparatus , the through-hole is a channel of a channel protein, and the specific binding substance is an aptamer having a repeating region of the same base in which 15 to 50 identical bases are continuous at one end thereof. An apparatus for detecting a target substance is provided.
本発明の方法によれば、コカイン等の麻薬や、ATP等の環境物質等、広範囲の所望の物質を簡便、迅速、高感度に検出することができる。 According to the method of the present invention, a wide range of desired substances such as narcotics such as cocaine and environmental substances such as ATP can be detected simply, rapidly and with high sensitivity.
10 パラキシレン系ポリマー(商品名パリレン)から成るフィルム
12 脂質二重膜
14 チャネルタンパク
16 チャンバ
18 流路
20 電極
22 直流電源
24 DNAアプタマー
26 標的物質
10 Film made of paraxylene polymer (trade name Parylene) 12
本発明の方法により検出される標的物質としては、これと特異的に結合できるアプタマーのような特異結合性物質を作出可能な物質であれば何ら限定されるものではなく、例えばコカインのような麻薬、ATP、ADP、AMP等のヌクレオチドような環境物質(環境中のこれらの濃度が生物汚染の指標として用いられている)、感染症の診断や環境汚染の評価において測定される種々の病原体、種々の病気の診断等において測定される種々の生体物質等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。 The target substance detected by the method of the present invention is not limited as long as it is a substance capable of producing a specific binding substance such as an aptamer that can specifically bind to the target substance. For example, a narcotic such as cocaine , Environmental substances such as nucleotides such as ATP, ADP and AMP (these concentrations in the environment are used as indicators of biological pollution), various pathogens measured in diagnosis of infectious diseases and evaluation of environmental pollution, various Various biological substances and the like measured in the diagnosis of illness can be exemplified, but are not limited thereto.
本発明の方法では、標的物質と特異的に結合する物質(本発明において「特異結合性物質」と呼ぶ)が用いられる。ここで、「特異的に結合する」とは、標的物質とは結合するが、標的物質以外の物質とは結合しないか、又は少なくとも標的物質以外の物質であって被検試料中に存在する可能性がある他の物質とは結合しないことを意味する。なお、標的物質は、互いに区別することを意図しない一群の類似物質である場合も包含される。 In the method of the present invention, a substance that specifically binds to a target substance (referred to as “specific binding substance” in the present invention) is used. Here, “specifically binds” means that it binds to a target substance but does not bind to a substance other than the target substance, or at least a substance other than the target substance and exists in the test sample. This means that it does not bind to other substances that have sex. The target substance includes a group of similar substances that are not intended to be distinguished from each other.
特異結合性物質は、標的物質と特異的に結合でき、結合後の結合物のサイズが結合前の特異結合性物質のサイズよりも大きくなる物質である。 Specific binding substance, the target substance and can specifically bind, Ru larger substance der than the size of the specific binding substance before the size of the binding material after binding the binding.
特異結合性物質はアプタマーである。アプタマーは、DNAやRNA等のポリヌクレオチド(安定性の観点から好ましくはDNA)から成るものであり、特定の物質と特異的に結合するものである。アプタマーは、通常、数十〜百数十のヌクレオチドから成るポリヌクレオチドであり、市販の核酸合成機を用いて任意の塩基配列を有するものを容易に化学合成できるので、抗体よりも容易、安価、迅速に製造することができる。このため、種々の免疫測定における抗体に代わるものとして近年盛んに研究されている。 The specific binding substance is an aptamer . The aptamer is composed of a polynucleotide (preferably DNA from the viewpoint of stability) such as DNA or RNA, and specifically binds to a specific substance. Aptamers are usually polynucleotides consisting of several tens to one hundred and several tens of nucleotides, and those having an arbitrary base sequence can be easily chemically synthesized using a commercially available nucleic acid synthesizer. It can be manufactured quickly. For this reason, research has been actively conducted in recent years as an alternative to antibodies in various immunoassays.
任意の物質と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献4)。SELEX法自体は既に周知であり、これに基づき、様々な物質と特異的に結合するアプタマーが既に得られている。また、所望の物質と特異的に結合するアプタマーを効率良く作出する、SELEX法の改良法も種々提案されている。SELEX法は、核酸の自動合成装置を用いてランダムな塩基配列を有する非常に多数のポリヌクレオチドのライブラリーを形成し、固相に結合した標的物質とこのライブラリーを反応させ、標的物質に結合したポリヌクレオチドを回収し、これをPCRにより増幅して再び標的物質を固定化した固相に添加するという工程を10回〜数十回程度繰り返して標的物質との結合力が高いポリヌクレオチドを濃縮していく方法であり、偶然を積極的に利用する方法であるので、ほとんど全ての物質に対して特異的に結合可能なアプタマーを作出することができると考えられている。標的物質に特異的に結合するアプタマーが得られ、その塩基配列を決定した後には、その塩基配列を持つポリヌクレオチドは、自動合成装置により容易に化学合成することができる。また、SELEX法によれば、所望の物質と特異的に結合するアプタマーは、通常、複数種類得られるので、その中から、標的物質と未結合の状態で後述する透孔を通過できるものを選択することも可能である。 Aptamers that specifically bind to any substance can be produced by a method called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) (Non-patent Document 4). The SELEX method itself is already well known, and based on this, aptamers that specifically bind to various substances have already been obtained. In addition, various improved methods of the SELEX method have been proposed for efficiently producing an aptamer that specifically binds to a desired substance. The SELEX method uses a nucleic acid automatic synthesizer to form a library of a large number of polynucleotides having random base sequences, reacts the target substance bound to a solid phase with this library, and binds to the target substance. The process of collecting the obtained polynucleotide, amplifying it by PCR and adding it again to the solid phase on which the target substance is immobilized is repeated about 10 to several tens of times to concentrate the polynucleotide having a high binding force to the target substance. Since this is a method that actively uses chance, it is considered that aptamers that can specifically bind to almost all substances can be produced. After an aptamer that specifically binds to a target substance is obtained and its base sequence is determined, a polynucleotide having the base sequence can be easily chemically synthesized by an automatic synthesizer. In addition, according to the SELEX method, a plurality of aptamers that specifically bind to a desired substance are usually obtained. From these, select one that can pass through a through-hole described later in an unbound state with a target substance. It is also possible to do.
特異結合性物質として用いられるアプタマーは、その一端に、同一の塩基が15個〜50個、さらに好ましくは20個〜40個連続する同一塩基の繰り返し領域を有する。このような同一塩基の繰り返し領域は、アプタマー分子内の他の領域や他のアプタマー分子とハイブリダイズすることがほとんどなく、標的物質と結合後も直線状で存在するので、標的物質と結合後、この領域が後述する透孔に突き刺さって、透孔が標的物質とアプタマーの結合物により閉塞されやすくなるので好ましい。同一塩基としては特にシトシン(c)が好ましい。これは、ポリグアニン(g)は化学合成されないので、同一塩基がシトシンであれば、繰り返し領域が同一分子内又は他分子内の領域とハイブリダイズする可能性を排除できるからである。一端にこのような繰り返し領域を持つアプタマーは、標的物質と特異的に結合するアプタマーの一端にこのような繰り返し領域を単に付加することにより通常得ることができるし、上記したSELEX法に用いられるライブラリーとして、一端に繰り返し領域を有するものを用いることによっても作出することができる。 The aptamer used as a specific binding substance has a repeating region of the same base in which 15 to 50, more preferably 20 to 40, the same base continues at one end. Such repeated regions of the same base rarely hybridize with other regions in the aptamer molecule or other aptamer molecules, and exist linearly after binding to the target substance. This region is preferable because it pierces a later-described through-hole, and the through-hole is likely to be blocked by a combination of the target substance and the aptamer. As the same base, cytosine (c) is particularly preferable. This is because polyguanine (g) is not chemically synthesized, so if the same base is cytosine, it is possible to eliminate the possibility that the repeated region hybridizes with the region in the same molecule or in another molecule. An aptamer having such a repeating region at one end can be usually obtained by simply adding such a repeating region to one end of an aptamer that specifically binds to the target substance, and can be used in the live SELEX method described above. It can also be created by using a rally having a repeating region at one end.
本発明の方法においては、標的物質と結合していない前記特異結合性物質は通過できるが、前記標的物質と結合した前記特異結合性物質は通過できないサイズの透孔を有する膜が用いられる。特異結合性物質としてアプタマーを用いるため、透孔の内径は1nm〜5nm程度が好ましい。もっとも、透孔のサイズは、用いる特異結合性物質や標的物質の種類により適宜選択することができ、必ずしも上記範囲に限定されるものではない。 In the method of the present invention, a membrane having a pore having a size that allows the specific binding substance that is not bound to the target substance to pass therethrough but cannot pass the specific binding substance bound to the target substance is used. For use aptamers as specific binding substance, the inner diameter of the hole is approximately 1nm~5nm are preferred. However, the size of the through-hole can be appropriately selected depending on the type of specific binding substance or target substance to be used, and is not necessarily limited to the above range.
透孔としては、チャネルタンパクのチャネルを利用する。チャネルタンパクは、分子内にチャネルと呼ばれる透孔を有するタンパク質であり、生体内ではこのチャネルを介して各種イオン等の輸送が行われる。チャネルタンパクとしては、α−ヘモリシン、外膜タンパク質(Outer membrane protein) F (OmpF)、マイコバクテリウム・スメグマチスポリン(Mycobacterium smegmatis porin) A (MspA)、ストレプトリジンO等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 A channel protein channel is used as the through- hole . A channel protein is a protein having a pore called a channel in a molecule, and various ions and the like are transported through the channel in a living body. Examples of channel proteins include α-hemolysin, Outer membrane protein F (OmpF), Mycobacterium smegmatis porin A (MspA), streptridine O, and the like. It is not limited to.
チャネルタンパクは、好ましくは脂質二重膜中に保持することができる。そして、この脂質二重膜は、自己支持性フィルムに設けられた微小な貫通孔を塞ぐ形で形成することが安定性の観点から好ましい。すなわち、自己支持性フィルムの微小な貫通孔を塞ぐ形で脂質二重膜を形成し、この脂質二重膜にチャネルタンパクを保持し、このチャネルタンパクのチャネルを本発明における透孔として利用することが好ましい。 The channel protein can preferably be retained in the lipid bilayer. And it is preferable from a stability viewpoint that this lipid bilayer membrane is formed in the form which plugs up the fine through-hole provided in the self-supporting film. That is, a lipid bilayer membrane is formed so as to block the minute through-holes of the self-supporting film, the channel protein is retained in the lipid bilayer membrane, and the channel of the channel protein is used as a through hole in the present invention. Is preferred.
自己支持性フィルムの微小な貫通孔を塞ぐ形で脂質二重膜を形成し、この脂質二重膜にチャネルタンパクを保持する方法は、特願2010-012300として既に出願しており、非特許文献1でも開示しているが、以下に説明する。 A method of forming a lipid bilayer membrane in a form that closes the microscopic through-holes of the self-supporting film and retaining the channel protein in this lipid bilayer membrane has already been filed as Japanese Patent Application No. 2010-012300. 1 is disclosed, but will be described below.
自己支持性フィルムの材質としては、孔径数μm程度の貫通孔を開けることができ、蒸着により化合物(後述)を被着することができるものであれば、何ら限定されるものではない。たとえばガラスや金属の小孔に蒸着を行うことにより、ナノメートルサイズの微小孔の作製が可能である。蒸着する化合物と同じ材料でフィルムを構成すると、フィルムを一体的に形成することができ、フィルムの耐久性や取扱性が高まるので好ましい。もっとも、蒸着する化合物以外の材料でフィルムを形成することも可能であり、この場合の材料の例としては、例えば、スピンコート可能な高分子材料(ポリオレフィン系、ポリエチレン系)等を挙げることができる。 The material of the self-supporting film is not limited as long as it can open a through hole having a pore diameter of about several μm and can deposit a compound (described later) by vapor deposition. For example, nanometer-sized micropores can be produced by vapor deposition in small holes of glass or metal. It is preferable that the film is made of the same material as the compound to be deposited because the film can be formed integrally and the durability and handling of the film are increased. However, it is also possible to form a film with a material other than the compound to be deposited, and examples of the material in this case include a spin coatable polymer material (polyolefin type, polyethylene type) and the like. .
上記自己支持性フィルムは、以下の方法により製造することができる。 The self-supporting film can be produced by the following method.
まず、孔径が数μm、好ましくは2μm〜8μm程度の貫通孔を有する自己支持性フィルムを準備する。この程度の孔径の貫通孔であれば、フォトリソグラフィー等の公知の方法で形成可能であり、この方法については下記実施例に具体的に記載する。なお、次の工程で、フィルム全体に蒸着を施す場合には、蒸着前のフィルムの膜厚は、通常、1μm〜20μm程度、好ましくは2μm〜10μm程度である。 First, a self-supporting film having a through hole having a pore diameter of several μm, preferably about 2 μm to 8 μm is prepared. If it is a through-hole of such a hole diameter, it can be formed by a known method such as photolithography, and this method will be specifically described in the following examples. In the next step, when vapor deposition is performed on the entire film, the film thickness of the film before vapor deposition is usually about 1 μm to 20 μm, preferably about 2 μm to 10 μm.
次に、自己支持性フィルム上に被着可能な化合物を、蒸着により少なくとも前記貫通孔の内壁上に被着させ、それによって前記貫通孔の孔径を1μm未満に縮小する。蒸着する化合物は、蒸着により、先に準備した貫通孔を有する自己支持性フィルム上に被着することができる化合物であればいずれの化合物であってもよく、好ましい例として、パラキシリレン系ポリマーを挙げることができる。これらのうち、パラキシレン系ポリマーは、等方蒸着が可能であり、貫通孔の内壁にもフィルムの両面にも均一にポリマーが被着(堆積)していく性質を有しており、また、耐熱性及び耐薬品性に優れているので好ましい。さらに、上記のとおり、蒸着に供される自己支持性フィルムも同種のパラキシレン系ポリマーで形成しておくと、蒸着後の自己支持性フィルムは一体的であり、耐久性及び取扱性が優れている。 Next, a compound that can be deposited on the self-supporting film is deposited on at least the inner wall of the through hole by vapor deposition, thereby reducing the diameter of the through hole to less than 1 μm. The compound to be vapor-deposited may be any compound as long as it is a compound that can be deposited on the self-supporting film having a through-hole prepared previously by vapor deposition, and a preferred example is a paraxylylene-based polymer. be able to. Among these, the paraxylene-based polymer can be isotropically vapor-deposited, and has the property that the polymer is uniformly deposited (deposited) on both the inner wall of the through hole and on both sides of the film. Since it is excellent in heat resistance and chemical resistance, it is preferable. Furthermore, as described above, if the self-supporting film to be subjected to vapor deposition is also formed of the same kind of para-xylene polymer, the self-supporting film after vapor deposition is integrated, and has excellent durability and handleability. Yes.
パラキシレン系ポリマーは、下記一般式で表わされる繰返し単位から成るポリマーであり、パリレン(Parylene)の商品名で市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。 The paraxylene-based polymer is a polymer composed of repeating units represented by the following general formula, and is commercially available under the trade name of Parylene, so that a commercially available product can be preferably used.
(式中、Xは水素原子又はフッ素原子、R1及びR2は互いに独立して水素原子又は塩素原子を表す)。 (In the formula, X represents a hydrogen atom or a fluorine atom, and R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a chlorine atom).
パラキシレン系ポリマーは、そのモノマーを真空チャンバー内で支持体に蒸着すると、支持体上で重合が起きてポリマーとなる。ポリマーの分子量は、蒸着量や蒸着時間に依存して変化し、最大50万程度である。モノマーは、蒸着により、種々の材質から成る支持体上に被着(堆積)することができ、支持体がパラキシリレン系ポリマーから形成されている場合のみならず、上記した種々の材質の支持体上に被着可能である。 When the paraxylene-based polymer is vapor-deposited on a support in a vacuum chamber, polymerization occurs on the support to become a polymer. The molecular weight of the polymer varies depending on the deposition amount and the deposition time, and is about 500,000 at the maximum. The monomer can be deposited (deposited) on a support made of various materials by vapor deposition, and not only when the support is made of a paraxylylene polymer, but also on the support made of various materials described above. It can be attached to.
蒸着は、蒸着される化合物を少なくとも前記貫通孔の内壁上に被着させればよいが、蒸着前の自己支持性フィルム全体に蒸着を施すことが簡便で好ましい。自己支持性フィルム全体に蒸着を施すと、貫通孔の内壁上に化合物が被着されるので、貫通孔の孔径が縮小され、これと同時に自己支持性フィルムの両側の表面にも被着されるので、フィルムの膜厚も同時に大きくなる。 The vapor deposition may be performed by depositing at least the compound to be vapor deposited on the inner wall of the through hole, but it is simple and preferable to deposit the entire self-supporting film before vapor deposition. When vapor deposition is performed on the entire self-supporting film, the compound is deposited on the inner wall of the through-hole, so that the diameter of the through-hole is reduced, and at the same time, it is also deposited on both surfaces of the self-supporting film. Therefore, the film thickness increases simultaneously.
パラキシレンモノマーを真空チャンバー内で自己支持性フィルム上に蒸着する場合、パリレン(商品名)の使用説明書に記載された方法に従って蒸着を行うことができ、蒸着温度は、通常室温、蒸着時間は通常30分間〜180分間、好ましくは30分間〜60分間である。 When paraxylene monomer is deposited on a self-supporting film in a vacuum chamber, deposition can be performed according to the method described in the instruction manual of Parylene (trade name). The deposition temperature is usually room temperature and the deposition time is Usually, it is 30 minutes to 180 minutes, preferably 30 minutes to 60 minutes.
本発明の脂質二重膜は、孔径が1μm未満の貫通孔の内壁にその周縁部が接し、該貫通孔を塞ぐ脂質二重膜である。該貫通孔は、必ずしも自己支持性フィルムに形成された貫通孔でなくてもよく、他の支持体上に支持されている層であってもよい。もっとも、上記した本発明の自己支持性フィルムに設けられた貫通孔であれば、該フィルムを任意の場所に単独で移動させることができ、後述する流路デバイスへの組込み等を容易に行うことができるので好ましい。 The lipid bilayer membrane of the present invention is a lipid bilayer membrane in which the peripheral edge is in contact with the inner wall of a through hole having a pore diameter of less than 1 μm and closes the through hole. The through hole is not necessarily a through hole formed in the self-supporting film, but may be a layer supported on another support. But if it is a through-hole provided in the above-mentioned self-supporting film of this invention, this film can be moved independently to arbitrary places, and the incorporation to the flow-path device mentioned later etc. will be performed easily. Is preferable.
貫通孔の内壁にその周縁部が接し、該貫通孔を塞ぐ脂質二重膜は、脂質二重膜を構成する脂質溶液を、単に貫通孔に施すだけで形成することができる。脂質二重膜を構成する脂質としては、脂質二重膜、すなわち、親水性領域と疎水性領域を1分子中に有する脂質分子が、疎水性領域を内側、親水性領域を外側に向けて2層に並んだ膜を形成できる脂質であれば特に限定されないが、生体膜における反応を模するためには、生体膜と同じか類似したものが好ましく、この分野において従来から広く用いられているリン脂質、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(diphytanoyl phosphatidylcholine, DPhPC)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(dipalmytoyl phosphatidylcholine)、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン(1-Palmitoyl 2-Oleoyl phosphatidylcholine, POPC)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(Dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC)等を好ましい例として挙げることができる。これらの多くは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。 A lipid bilayer membrane whose peripheral edge is in contact with the inner wall of the through-hole and plugs the through-hole can be formed by simply applying a lipid solution constituting the lipid bilayer membrane to the through-hole. As the lipid constituting the lipid bilayer membrane, a lipid bilayer membrane, that is, a lipid molecule having a hydrophilic region and a hydrophobic region in one molecule, has a hydrophobic region on the inside and a hydrophilic region on the outside. The lipid is not particularly limited as long as it is a lipid capable of forming a membrane arranged in layers, but in order to simulate a reaction in a biological membrane, the same or similar one as that of a biological membrane is preferable. Lipids such as diphytanoyl phosphatidylcholine (DPhPC), dipalmytoyl phosphatidylcholine, palmitoyl oleoylphosphatidylcholine (POPC), POPC A preferred example is oil phosphatidylcholine (DOPC). Since many of these are commercially available, commercially available products can be preferably used.
脂質二重膜の形成に用いられる溶液中のリン脂質の濃度は、脂質二重膜が形成可能な濃度であれば特に限定されないが、通常、5g/L〜20g/L程度、好ましくは7g/L〜15g/L程度である。また、リン脂質溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒が好ましく、n-デカンのような脂肪族炭化水素溶媒が好ましい。また、リン脂質は、この溶液中でリポソームを形成してもよく、この場合には、用いられる液はリポソーム懸濁液になる。 The concentration of the phospholipid in the solution used for forming the lipid bilayer membrane is not particularly limited as long as the lipid bilayer membrane can be formed, but is usually about 5 g / L to 20 g / L, preferably 7 g / L. It is about L-15g / L. The solvent of the phospholipid solution is not particularly limited, but an organic solvent is preferable, and an aliphatic hydrocarbon solvent such as n-decane is preferable. Phospholipids may also form liposomes in this solution, in which case the liquid used is a liposome suspension.
チャネルタンパクを保持する脂質二重膜は、上記したリン脂質溶液にチャネルタンパクを溶解しておくことにより形成することもできるし、先に上記のとおり脂質二重膜を形成し、その後、チャネルタンパクの溶液を該脂質二重膜に施すことによっても形成することができる。リン脂質溶液がリポソームを含むリポソーム懸濁液である場合には、タンパク質を保持するリポソームの懸濁液を用いることにより形成することができる。これらの溶液中のチャネルタンパクの濃度は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができるが、通常、1nM〜1mM程度、好ましくは0.1μM〜100μM程度である。 The lipid bilayer membrane holding the channel protein can be formed by dissolving the channel protein in the phospholipid solution described above, or the lipid bilayer membrane is formed as described above, and then the channel protein This solution can also be formed by applying the solution of (1) to the lipid bilayer membrane. When the phospholipid solution is a liposome suspension containing liposomes, it can be formed by using a suspension of liposomes retaining proteins. The concentration of the channel protein in these solutions is not particularly limited and can be appropriately selected, but is usually about 1 nM to 1 mM, preferably about 0.1 μM to 100 μM.
なお、パリレン(商品名)の蒸着条件を調節することにより、孔径1〜900nm程度の貫通孔を形成することが可能である。 In addition, by adjusting the vapor deposition conditions of parylene (trade name), it is possible to form through holes having a hole diameter of about 1 to 900 nm .
本発明はまた、透孔を持つ膜を具備する標的物質の検出装置をも提供する。1枚の膜に複数の上記透孔を形成しておくと、同時に複数の被検試料について検出を行うことができるので好ましい。また、透孔はチャネルタンパクのチャネルであるため、膜の両側に直流電圧を印可する電源と、前記膜を通過する電流を測定する電流測定手段をさらに具備するものであることが好ましい。このような装置を用いれば、後述するパッチクランプ法により、透孔が閉塞したか否かを調べることができる。 The present invention also provides an apparatus for detecting a target substance comprising a membrane having through holes. It is preferable to form a plurality of the above-mentioned through holes in one film because a plurality of test samples can be detected simultaneously. Further, since the through-hole is a channel protein channel, it preferably has a power source for applying a DC voltage to both sides of the membrane and a current measuring means for measuring a current passing through the membrane. If such an apparatus is used, it can be investigated whether the through-hole was obstruct | occluded by the patch clamp method mentioned later.
上記装置は、少なくとも1つの流路を具備する流路チップの形態にあり、前記膜により前記流路が第2の流路又はチャンバーと隔てられ、前記透孔によって前記2つの流路又は前記流路と前記チャンバーが連通していることが好ましい。 The apparatus is in the form of a channel chip having at least one channel, the channel is separated from the second channel or chamber by the membrane, and the two channels or the flow are separated by the through holes. It is preferable that the channel and the chamber communicate with each other.
透孔として、パリレンフィルムに設けられた貫通孔に形成された脂質二重膜中にチャネルタンパクを保持した膜を用い、この膜により1つの流路がチャンバーと隔てられ、透孔によって流路とチャンバーが連通している装置の模式断面図を図1に示す。図1中、10がパリレンフィルム、12が脂質二重膜、14がチャネルタンパク、16がチャンバー、18が流路、20が電極、22が直流電源である。 As a through-hole, a membrane in which a channel protein is held in a lipid bilayer formed in a through-hole provided in a parylene film is used, and one channel is separated from the chamber by this membrane. A schematic cross-sectional view of an apparatus in which the chamber communicates is shown in FIG. In FIG. 1, 10 is a parylene film, 12 is a lipid bilayer membrane, 14 is a channel protein, 16 is a chamber, 18 is a flow path, 20 is an electrode, and 22 is a DC power source.
このような装置を用いて本発明の方法を実施する手順を以下に説明する。 The procedure for carrying out the method of the present invention using such an apparatus will be described below.
まず、特異結合性物質と、前記標的物質を含むかもしれない被検試料とを接触させる。これは通常、特異結合性物質の溶液と被検試料溶液を混合することにより行うことができる。被検試料としては、標的物質を含む可能性がある種々の体液やその希釈物、河川水や湖水、海水等の環境水、水道水等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。特異結合性物質の終濃度は、特に限定されないが、標的物質が存在する場合に透孔が閉塞されることを促進するために、想定される標的物質の濃度範囲の上限値の全量と結合できる量であることが好ましい。特異結合性物質の終濃度の具体的な濃度範囲は、ケースバイケースで適宜設定されるが、通常、1μM〜1mM程度である。なお、特異結合性物質と、前記標的物質の結合は、通常、室温において速やかに起きる。 First, a specific binding substance is brought into contact with a test sample that may contain the target substance. This can usually be performed by mixing a solution of a specific binding substance and a test sample solution. Examples of test samples include various body fluids that may contain the target substance and dilutions thereof, river water, lake water, environmental water such as seawater, and tap water, but are not limited thereto. Absent. The final concentration of the specific binding substance is not particularly limited, but can bind to the total amount of the upper limit value of the assumed target substance concentration range in order to promote the blockage of the pores when the target substance is present. An amount is preferred. The specific concentration range of the final concentration of the specific binding substance is appropriately set on a case-by-case basis, but is usually about 1 μM to 1 mM. The binding between the specific binding substance and the target substance usually occurs rapidly at room temperature.
次に、上記第1工程で得られた混合物を、上記膜の一方側に接触させる。これは、例えば、上記した図1に示すような装置を用いる場合、チャンバー16に上記混合物を入れることにより行うことができる。
Next, the mixture obtained in the first step is brought into contact with one side of the membrane. This can be performed, for example, by putting the mixture in the
なお、上記の通り、脂質二重膜にチャネルタンパクを保持する方法としては、先に脂質二重膜を形成し、これにチャネルタンパクの溶液を加える方法があるが、この方法を採用する場合には、上記混合物にさらにチャネルタンパクを添加しておくことも可能である。これを脂質二重膜と接触させると、脂質二重膜にチャネルタンパクが保持され、同時に、特異結合性物質と標的物質との結合物によるチャネルの閉塞が起きる。 As described above, as a method for retaining the channel protein in the lipid bilayer membrane, there is a method in which a lipid bilayer membrane is first formed and a channel protein solution is added thereto. It is also possible to add a channel protein to the above mixture. When this is brought into contact with the lipid bilayer membrane, the channel protein is retained in the lipid bilayer membrane, and at the same time, the channel is blocked by the binding substance of the specific binding substance and the target substance.
次に、透孔が閉塞されるか否かを調べる。これは、好ましくは、透孔を介して電流が流れるか否かを調べることにより行うことができる。これは、図1に示すような装置を用いる場合、直流電源22により膜の両側に直流電圧を印可し、膜を介して流れる電流を測定することにより行うことができる。チャネルタンパクを用いるため、チャネルが閉塞されていない場合には、チャネル内を特異性結合物質が通過する度にスパイク電流が生じる。チャネルが閉塞された場合には、このスパイク電流が発生しなくなるので、この電流を測定することにより、被検試料中に標的物質が存在するか否かを調べること、すなわち、被検試料中の標的物質を検出することができる。この方法は、パッチクランプ法と呼ばれる方法であり、電気生理学の分野で広く用いられている方法である(例えば非特許文献2)。
Next, it is examined whether or not the through hole is closed. This can be done preferably by examining whether current flows through the through holes. In the case of using an apparatus as shown in FIG. 1, this can be done by applying a DC voltage to both sides of the membrane by a
なお、透孔が閉塞されるまでに要する時間は、被検試料中の標的物質の濃度に依存して変化するので、既知の種々の濃度の標的物質溶液を用いて検量線を作成しておけば、透孔が閉塞されるまでに要する時間を測定することにより被検試料中の標的物質を定量することも可能である。なお、標的物質を定量すれば必然的に標的物質が検出されることになるので、標的物質を定量する場合も、本発明の「検出方法」に包含される。 Note that the time required to close the through-hole varies depending on the concentration of the target substance in the test sample, so create a calibration curve using various known concentrations of the target substance solution. For example, it is possible to quantify the target substance in the test sample by measuring the time required until the through hole is closed. Since the target substance is inevitably detected when the target substance is quantified, the case of quantifying the target substance is also included in the “detection method” of the present invention.
上記方法の原理を模式的に図2に示す。図2中の各参照番号は、図1の各参照番号と同じものを示す。24はアプタマー、26は標的物質を示す。図2の左側の図は、被検試料中に標的物質が存在しない場合を示している。標的物質が存在しない場合、直線状のアプタマーは、チャネルタンパク14のチャネルを通過し、スパイク電流が生じる。一方、被検試料中に標的物質26が存在する場合には、アプタマー24と標的物質26が結合し、結合物のサイズがチャネルの内径よりも大きくなるので、チャネルが閉塞され、スパイク電流が観察されなくなる。
The principle of the above method is schematically shown in FIG. Each reference number in FIG. 2 indicates the same as each reference number in FIG.
なお、図2に模式的に示されるように、チャネルタンパクのチャネルを透孔として利用するため、特異結合性物質であるアプタマーは、チャネルを通過しやすいように、図2に示すような直線状の形状を有するものが好ましい。また、標的物質と結合した結合物が、しっかりとチャネルに突き刺さって長時間に亘ってチャネルを閉塞することが望まれるので、標的物質と結合した結合物もチャネル内に挿入される部分、すなわち、好ましくは直線状の部分を一端に有することが好ましい。これは、上記した通り、アプタマーの一端に同一塩基の繰り返し領域を付加することにより達成することができる。 Incidentally, as schematically shown in FIG. 2, in order to use the channels of the channel protein as holes, aptamers are specific binding substance, to make it easier to pass through the channel, a linear shape shown in FIG 2 What has the shape of this is preferable. In addition, since it is desired that the binding substance bound to the target substance sticks firmly into the channel and closes the channel for a long time, the binding part bound to the target substance is also inserted into the channel, that is, It is preferable to have a linear portion at one end. As described above, this can be achieved by adding a repeating region of the same base to one end of the aptamer .
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例1
1. 貫通孔を有する自己支持性フィルムの作製
図3に模式的に示すフォトリソグラフィー法により、孔径800nmの貫通孔を有する、パラキシリレン系ポリマーから成る自己支持性フィルムを作製した。
Example 1
1. Production of self-supporting film having through-holes A self-supporting film made of a paraxylylene-based polymer having through-holes having a pore diameter of 800 nm was produced by a photolithography method schematically shown in FIG.
まず、シリコンウェハを真空チャンバー内に置き、パラキシリレン系モノマー(商品名パリレンC、上記一般式において、XがH2、R1がCl、R2がH)を蒸着してシリコンウェハ上に厚さ5μmのパラキシリレン系ポリマーから成るフィルムを形成した。蒸着温度は24℃、蒸着時間は50分であった。次に、形成したパラキシリレン系ポリマーフィルム上にアルミニウムを真空蒸着し(蒸着温度:室温、蒸着時間:1分)、厚さ5μmのアルミニウム層を形成した(図3の1)。 First, a silicon wafer is placed in a vacuum chamber, and a paraxylylene monomer (trade name Parylene C, in the above general formula, X is H 2 , R 1 is Cl, and R 2 is H) is deposited on the silicon wafer. A film composed of 5 μm paraxylylene-based polymer was formed. The deposition temperature was 24 ° C. and the deposition time was 50 minutes. Next, aluminum was vacuum-deposited on the formed paraxylylene polymer film (deposition temperature: room temperature, deposition time: 1 minute) to form an aluminum layer having a thickness of 5 μm (1 in FIG. 3).
アルミニウム層上にフォトレジストをスピンコートし、CADにより設計したマスクを用いUV光を露光することにフォトレジストを感光、その後現像し、直径5μmの孔をあけた(図3の2)。UV露光の条件は、UVの照射エネルギー量が24mW/cm2 (@405nm)、露光時間は、6.5秒であった。その後混酸処理することによりアルミニウム層にも直径5μmの孔をあけた。 A photoresist was spin-coated on the aluminum layer, and the photoresist was exposed to UV light using a CAD-designed mask and then developed, and a hole having a diameter of 5 μm was formed (2 in FIG. 3). The UV exposure conditions were a UV irradiation energy amount of 24 mW / cm 2 (@ 405 nm) and an exposure time of 6.5 seconds. Thereafter, a hole having a diameter of 5 μm was formed in the aluminum layer by performing a mixed acid treatment.
次に、パリレン層を酸素プラズマによりエッチングした(図3の3)。具体的な条件は次の通りであった。酸素量10mL/min、25W。 Next, the parylene layer was etched by oxygen plasma (3 in FIG. 3). Specific conditions were as follows. Oxygen amount 10mL / min, 25W.
次に、アルミニウム層を混酸処理(60℃、1分)により溶解除去した(図3の4)。 Next, the aluminum layer was dissolved and removed by mixed acid treatment (60 ° C., 1 minute) (4 in FIG. 3).
自己支持性フィルムの一端をピンセットで把持してシリコンウェハから剥離し、孔径5μmの貫通孔を有する自己支持性フィルムを得た(図3の5)。このように、フィルムは一端を把持して剥離して移動させることができたので、自己支持性であった。得られた自己支持性フィルムの寸法は、3mm x 3mmのものを用いた。 One end of the self-supporting film was grasped with tweezers and peeled from the silicon wafer to obtain a self-supporting film having a through hole having a hole diameter of 5 μm (5 in FIG. 3). Thus, the film was self-supporting because it was able to grip and peel off one end and move it. The obtained self-supporting film had a size of 3 mm × 3 mm.
剥離した自己支持性フィルムを真空チャンバーに入れ、上記と同じパラキシリレン系モノマーを蒸着した(室温、40分)。これにより、自己支持性フィルムの貫通孔内壁を含む全面にパラキシリレン系ポリマーがさらに被着され、貫通孔の孔径が縮小された(図3の6)。この方法により、直径400nmの貫通孔を有するパラキシリレン系ポリマーフィルム(パリレンフィルム)が得られた。 The peeled self-supporting film was placed in a vacuum chamber, and the same paraxylylene monomer as above was deposited (room temperature, 40 minutes). As a result, the paraxylylene polymer was further deposited on the entire surface including the inner wall of the through hole of the self-supporting film, and the hole diameter of the through hole was reduced (6 in FIG. 3). By this method, a paraxylylene polymer film (parylene film) having a through-hole having a diameter of 400 nm was obtained.
2. デバイスの作製
(1) プラスチック板の加工
得られたパリレンフィルムを組み込んだ、図1に模式的に示す装置を作製した。すなわち、小型NC によりCAD でデザインした設計をポリメチルメタクリレート(PMMA) 板に切削した。その後、電極20として用いるためCr/Ag を真空蒸着により上部PMMA樹脂上に配線した。最終的に熱圧着および接着剤により全ての層を接着し、流路18にチューブを取り付けデバイスとして用いた。なお、流路18の幅及び深さは、それぞれ400μmであった。
2. Device fabrication
(1) Processing of plastic plate An apparatus schematically shown in Fig. 1 was fabricated, in which the obtained parylene film was incorporated. In other words, a design designed by CAD with a small NC was cut into a polymethylmethacrylate (PMMA) plate. Thereafter, Cr / Ag was wired on the upper PMMA resin by vacuum deposition for use as the electrode 20. Finally, all the layers were bonded by thermocompression bonding and an adhesive, and a tube was attached to the
(2) 脂質二重膜の形成
デバイス中の上部にあるチャンバ16および下部の流路18を1M KCl PBS バッファーで満たしておき、マイクロシリンジを用い下部流路18から脂質分子(DPhPC:diphytanoyl phosphatidylcholine) を溶解させたn-デカン溶液を“バッファー→脂質溶液→バッファー”の順にシークエンシャルにフローすることでパリレン孔中に脂質膜の形成を行った。なお、脂質溶液は、10mgのDPhPC(米国Avanti Polar Lipids社製)を1mLのn-デカンに溶解したものであった。また、バッファーは、1.0M KCl、10mM PBS、pH7.4であった。
(2) Formation of lipid bilayer The
(3) チャネル膜タンパク質としてα−ヘモリシン(0.3 nM)を用いた。上部チャンバ内にヘモリシンおよびコカインと複合体を形成するDNAアプタマー(非特許文献3)、コカイン溶液で満たし、脂質膜の上下に電圧を印可することでチャネル電流の変化を計測した。DNAアプタマーは2本であり、その塩基配列は、それぞれ5'-atccttcaatgaagtgggtcgaca-3'(配列番号1)及び5'-gggagacaaggaacccccccccccccccccccccccccccccc-3'(配列番号2)であった。この2本のDNAアプタマーが同時にコカインに結合する(図2の右図参照)。なお、このDNAアプタマーは、非特許文献3に記載のコカイン結合性アプタマーの一方の3'末端に30塩基のポリc領域を付加したものである。DNAアプタマーの終濃度は、50μM、コカインの終濃度は1μM〜100μMであった。また、比較のため、コカインを含まない溶液、及びコカインに代えてコカイン誘導体であるアミノベンズトロピンを含む溶液についても同様に測定した。印可電圧は、+100 mVであった。チャンバ16と流路18にそれぞれ配置した電極間の電流、すなわち、脂質二重膜を介して流れる電流(膜電流)を測定した。膜電流は、上記両電極に接続されたパッチクランプ増幅器(patch-clamp amplifier、CEZ-2400、日本光電社製)を用いて測定した。チャンバ16内に配置したAg/AgCl電極は、記録電極であり、流路18内に配置したAg/AgCl電極は、接地電極であった。電流は、デジタルデータ獲得システム(Digidata 1322A及びpCLAMP ver.9, 米国Molecular Devices社製)を用いて記録した。
(3) α-hemolysin (0.3 nM) was used as a channel membrane protein. A change in channel current was measured by filling a DNA aptamer (non-patent document 3) that forms a complex with hemolysin and cocaine in the upper chamber, a cocaine solution, and applying a voltage above and below the lipid membrane. There were two DNA aptamers, and the base sequences were 5′-atccttcaatgaagtgggtcgaca-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and 5′-gggagacaaggaacccccccccccccccccccccccccccccccc-3 ′ (SEQ ID NO: 2), respectively. These two DNA aptamers simultaneously bind to cocaine (see the right figure in FIG. 2). This DNA aptamer is a cocaine-binding aptamer described in Non-Patent Document 3 with a 30-base poly-c region added to one 3 ′ end. The final concentration of DNA aptamer was 50 μM, and the final concentration of cocaine was 1 μM to 100 μM. For comparison, a solution containing no cocaine and a solution containing aminobenztropin which is a cocaine derivative instead of cocaine were also measured in the same manner. The applied voltage was +100 mV. The current between the electrodes arranged in the
結果を図4及び図5に示す。図4の上図に示されるように、溶液がコカインを含まない場合には、DNAアプタマーがチャネルを通過できるので、スパイク電流が測定される。これに対して、溶液がコカインを含む場合には、長時間に亘ってスパイク電流が生じない(特に下図の右側半分)。これにより、コカインの検出が可能であった。コカインの終濃度が1μM〜100μMの範囲で測定が可能であった。図5中の右上のグラフは、コカインの終濃度が10μMの場合について、上記溶液とチャネルタンパクとの接触時間を横軸、閉塞確率を縦軸にとって、測定結果をプロットしたものである。25秒後には1.0の確率(すなわち100%)でチャネルの閉塞が観察された。図5中の棒グラフは、上記溶液とチャネルタンパクとの接触時間が30秒の時点での、チャネルの閉塞確率を示す。コカインが含まれる場合には、30秒後には、1.0の確率(すなわち100%)でチャネルの閉塞が観察されたが、コカイン誘導体の場合及びコカインを含まない場合(すなわち、DNAアプタマーが未結合の場合)は、チャネルの閉塞確率はほぼ0であった。これにより、本発明の方法にれば、わずか30秒(25秒でも可)で、高感度にコカインを検出することが可能であることが示された。 The results are shown in FIGS. As shown in the upper diagram of FIG. 4, when the solution does not contain cocaine, the DNA aptamer can pass through the channel, so that spike current is measured. On the other hand, when the solution contains cocaine, no spike current is generated for a long time (particularly, the right half of the lower figure). Thereby, it was possible to detect cocaine. Measurement was possible in the final cocaine concentration range of 1 μM to 100 μM. The upper right graph in FIG. 5 plots the measurement results for the case where the final concentration of cocaine is 10 μM, with the contact time between the solution and the channel protein as the horizontal axis and the occlusion probability as the vertical axis. After 25 seconds, channel blockage was observed with a probability of 1.0 (ie 100%). The bar graph in FIG. 5 shows the channel blocking probability when the contact time between the solution and the channel protein is 30 seconds. When cocaine was included, channel clogging was observed after 30 seconds with a probability of 1.0 (ie 100%), but with cocaine derivatives and without cocaine (ie with no DNA aptamer bound). Case) the channel blockage probability was almost zero. As a result, it was shown that according to the method of the present invention, cocaine can be detected with high sensitivity in as little as 30 seconds (or even 25 seconds).
参考例1
コカインに代えてATPを用いて実施例1と同様な実験を行った。ATP結合性DNAアプタマーとしては、5'-tttttttttcactgacctgggggagtattgcggaggaaggt-3'(配列番号3)を用いた。また、比較のため、ATPの類似物質としてGTPも同様に測定した。
Reference example 1
The same experiment as in Example 1 was performed using ATP instead of cocaine. As an ATP-binding DNA aptamer, 5′-tttttttttcactgacctgggggagtattgcggaggaaggt-3 ′ (SEQ ID NO: 3) was used. For comparison, GTP was also measured as a similar substance to ATP.
結果を図6に示す。図6中のa)に示されるように、ATPではチャネルの閉塞時間がGTPの場合の10倍長かった。また、スパイク電流の発生頻度は、図6中のb)に示されるようにATPの濃度依存的に減少した。c)に示すように、横軸にATP濃度、縦軸に閉塞速度の逆数(reciprocal event rate)をとると、ATPの濃度依存的に変化した。 The results are shown in FIG. As shown in a) of FIG. 6, in ATP, the channel blocking time was 10 times longer than in GTP. Further, the frequency of occurrence of spike current decreased depending on the concentration of ATP as shown in b) of FIG. As shown in c), when the ATP concentration is taken on the horizontal axis and the reciprocal event rate is taken on the vertical axis, it changed depending on the concentration of ATP.
なお、実施例1では、より長時間に亘ってチャネルを閉塞できるように、一方のアプタマーの3'末端側に30塩基のポリc領域を付加したので、チャネルの閉塞が参考例1よりもさらに確実であった。
In Example 1, so that it can close the channel over a longer period of time, since the addition of the poly c region of 30 bases at the 3 'end side of one of the aptamer, obstruction of the channel is more than Reference Example 1 It was certain.
Claims (14)
検出すべき標的物質と特異的に結合する特異結合性物質と、前記標的物質を含むかもしれない被検試料とを接触させる工程と、
所定のサイズの透孔を有する膜の一方側に前記工程で得られた混合物を接触させる工程と、
前記透孔が閉塞されるか否かを調べる工程を含み、
前記所定のサイズは、前記標的物質と結合していない前記特異結合性物質は通過できるが、前記標的物質と結合した前記特異結合性物質は通過できないサイズであり、
前記透孔が、チャネルタンパクのチャネルであり、
前記特異結合性物質が、その一端に、同一の塩基が15個〜50個連続する同一塩基の繰り返し領域を有するアプタマーである、標的物質の検出方法。 A method for detecting a target substance,
Contacting a specific binding substance that specifically binds to a target substance to be detected with a test sample that may contain the target substance;
Contacting the mixture obtained in the above step with one side of a membrane having pores of a predetermined size;
Examining whether or not the through hole is closed,
Wherein the predetermined size is the said specific binding substance not bound to the target substance can pass, said specific binding substance bound to the target substance Ri Ah size that can not pass through,
The through hole is a channel of a channel protein;
It said specific binding substance is, at one end, the same bases Ru aptamer der having repeat region of 15 to 50 contiguous identical bases, the method for detecting a target substance.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010250339A JP5683216B2 (en) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Target substance detection method and apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010250339A JP5683216B2 (en) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Target substance detection method and apparatus |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012103055A JP2012103055A (en) | 2012-05-31 |
JP5683216B2 true JP5683216B2 (en) | 2015-03-11 |
Family
ID=46393644
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010250339A Active JP5683216B2 (en) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Target substance detection method and apparatus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5683216B2 (en) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5155021A (en) * | 1989-02-09 | 1992-10-13 | Eastman Kodak Company | Method and kit for determination of herpes simplex viral antigen by direct binding to polymeric particles |
JP3249308B2 (en) * | 1993-10-07 | 2002-01-21 | 松下電器産業株式会社 | Label dyes and their precursors, methods for their synthesis, methods for using label dyes, and cocaine or methamphetamine detection devices using label dyes |
JP4953044B2 (en) * | 2005-05-09 | 2012-06-13 | 財団法人生産技術研究奨励会 | Method and apparatus for forming lipid bilayer membrane |
JP5441142B2 (en) * | 2007-11-26 | 2014-03-12 | 国立大学法人 東京大学 | Microfluidic planar lipid bilayer array and analytical method using the planar lipid bilayer membrane |
GB0808856D0 (en) * | 2008-05-15 | 2008-06-25 | Univ Warwick | Fabricated nanopores and micropores for chemical and biochemical analysis |
-
2010
- 2010-11-08 JP JP2010250339A patent/JP5683216B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2012103055A (en) | 2012-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Nakane et al. | Nanopore sensors for nucleic acid analysis | |
Schmidt | Stochastic sensors | |
Uram et al. | Noise and bandwidth of current recordings from submicrometer pores and nanopores | |
Roman et al. | Functionalized solid-state nanopore integrated in a reusable microfluidic device for a better stability and nanoparticle detection | |
US20080025875A1 (en) | Chemical, Particle, and Biosensing with Nanotechnology | |
Nehra et al. | A biosensing expedition of nanopore: a review | |
Li et al. | Strong differential monovalent anion selectivity in narrow diameter carbon nanotube porins | |
Yasaki et al. | Substantial expansion of detectable size range in ionic current sensing through pores by using a microfluidic bridge circuit | |
Huang et al. | Solid-state nanochannels for bio-marker analysis | |
Shoji et al. | Spatially resolved chemical detection with a nanoneedle-probe-supported biological nanopore | |
Schmidt | Membrane platforms for biological nanopore sensing and sequencing | |
Shoji et al. | Recessed Ag/AgCl microelectrode-supported lipid bilayer for nanopore sensing | |
Jeong et al. | Alpha-Hederin nanopore for single nucleotide discrimination | |
EP2473849A1 (en) | Nanopored silicon nitride chip for the analysis of gene expression profiles | |
Spangler et al. | Anomalous freezing behavior of nanoscale liposomes | |
US20240118269A1 (en) | High Throughput Stochastic Bio-Molecular Sensor | |
Wang et al. | Peering into Biological Nanopore: A Practical Technology to Single‐Molecule Analysis | |
JP5345078B2 (en) | Lipid bilayer membrane, self-supporting film used to form it, and microchannel device comprising the same | |
JP5683216B2 (en) | Target substance detection method and apparatus | |
Hussein et al. | Silver Nanoneedle Probes Enable Sustained DC Current, Single-Channel Resistive Pulse Nanopore Sensing | |
Zhang et al. | Role of outer surface probes on bullet-shaped asymmetric solid-state nanochannels for lysozyme protein sensing | |
Feng et al. | Label-free microchannel immunosensor based on antibody–antigen biorecognition-induced charge quenching | |
Nobukawa et al. | Electrical detection of pesticide vapors by biological nanopores with DNA aptamers | |
Pan et al. | Molecular structure of phosphatidylglycerol bilayers: fluid phase lipid areas and bilayer thicknesses as a function of temperature | |
Bearden et al. | Optimizing Nucleic Acid Biomarker Detection in a Solid-State Nanopore Through Probabilistic Modeling |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130527 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20131114 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131203 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140303 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140306 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140530 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150113 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5683216 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |