JP5679255B2

JP5679255B2 - Microorganisms with enhanced oxygen tolerance and use thereof

Info

Publication number: JP5679255B2
Application number: JP2009297324A
Authority: JP
Inventors: 喜之伊藤; 佳子本目; 幸夫浅見; 伸悦片桐; 朋子塩田
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2029-12-28
Also published as: JP2011135804A

Description

本発明は、リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されていることを特徴とする、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体に関する。 The present invention relates to a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, characterized in that the riboflavin transporter gene is wholly or partially inactivated.

近年、プロバイオティクス菌を用いたヨーグルトやドリンク、粉末、タブレット、家畜用飼料等が注目されている。プロバイオティクス菌とは、生きたまま腸に到達し、宿主の腸内菌叢のバランスを改善することにより宿主に有益な作用をもたらす微生物のことである。ヒトに用いられるプロバイオティクスとしては、乳酸菌やビフィズス菌などが利用されることが多い。 In recent years, yogurts, drinks, powders, tablets, livestock feeds, etc. using probiotic bacteria have attracted attention. Probiotic bacteria are microorganisms that reach the intestine alive and have beneficial effects on the host by improving the balance of the intestinal flora of the host. As probiotics used in humans, lactic acid bacteria and bifidobacteria are often used.

しかしながら、上記のようなプロバイオティクスとして利用されることが多い乳酸菌、ビフィズス菌などは腸管(糞便)由来であることが多いため、酸素に弱く保存中に死滅しやすいことが多い。そのため、これらの微生物の保存性(生残性)を維持するべく、酸素不透過性容器などが用いられる。しかしながら、このような特殊な容器を用いることで製品コストが上昇するといった問題点があった。このような現状から、酸素耐性が高いプロバイオティクス菌の探索や、酸素に弱いプロバイオティクス菌の酸素耐性を向上させる方法などが望まれており、さまざまな検討がなされている。 However, since lactic acid bacteria, bifidobacteria, and the like that are often used as probiotics as described above are often derived from the intestinal tract (feces), they are often vulnerable to oxygen and easily killed during storage. Therefore, an oxygen-impermeable container or the like is used in order to maintain the preservation (survivability) of these microorganisms. However, the use of such a special container has a problem that the product cost increases. Under such circumstances, a search for probiotic bacteria having high oxygen tolerance and a method for improving oxygen resistance of probiotic bacteria weak to oxygen are desired, and various studies have been made.

例えば、特許文献１（特開平４−３２０６４２）は、従来、発酵乳のような低ｐＨでは生存しにくく、酸素に弱いビフィズス菌の中で、生後数ヶ月の健康な母乳栄養児の糞便から耐酸性および酸素耐性を有するビフィズス菌を選抜し、これを発酵乳のスターターとして使用できることが開示されている。また、特許文献２（特開平５−２２７９４６）では、耐酸性および酸素耐性を有するビフィズス菌をラクトバチルス・カゼイAST-8と混合培養することで、酸生成、生菌数の伸びが非常に高くなることが記載されている。 For example, Patent Document 1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-320642) discloses that acid-resistant bifidobacteria that are difficult to survive at low pH such as fermented milk and are resistant to oxygen from feces of healthy breastfeeding infants a few months after birth. It is disclosed that bifidobacteria having sex and oxygen resistance can be selected and used as a starter for fermented milk. Moreover, in patent document 2 (Unexamined-Japanese-Patent No. 5-227946), the acid production and the growth of the number of viable bacteria are very high by carrying out the mixed culture of Bifidobacterium which has acid resistance and oxygen resistance with Lactobacillus casei AST-8. It is described that it becomes.

しかしながら、特許文献１のように新たな菌株を探索することは非常に手間がかかる上、酸素耐性が向上した菌株を選抜したとしても、期待していたプロバイオティクスの効果が、これまでよりも低くなる可能性がある。また、特許文献２のように別の微生物と混合培養させることで酸素耐性を向上させる方法では、プロバイオティクスの効果を有する微生物との相互作用により効果が減弱したり、製品の風味に問題が生じたりする可能性がある。 However, searching for a new strain as in Patent Document 1 is very time-consuming, and even if a strain with improved oxygen tolerance is selected, the expected probiotic effect is higher than before. May be lower. Moreover, in the method of improving oxygen tolerance by carrying out mixed culture with another microorganism like patent document 2, an effect is attenuated by interaction with the microorganisms which have a probiotic effect, and there is a problem in the flavor of a product. May occur.

特開平４−３２０６４２号公報JP-A-4-320642 特開平５−２２７９４６号公報JP-A-5-227946 ＷＯ２００４／０８７９６０WO2004 / 087960 ＷＯ２００９／１５０８４８WO2009 / 150848

Furusawa, M. and Doi H., 1992 J Theor Biol., 157: 127-33Furusawa, M. and Doi H., 1992 J Theor Biol., 157: 127-33

本発明は、以上の状況を鑑みてなされたものであり、その目的は、リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されていることを特徴とする、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and the object thereof is to enhance oxygen tolerance, characterized in that the riboflavin transporter gene is totally or partially inactivated. It is to provide a lactic acid bacteria mutant.

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。
まず、不均衡変異導入法を用いて、Lactobacillus gasseri OLL 2716株(寄託番号 FERM BP-6999)に変異を導入し、得られた変異株を酸素充満下低温保存することにより、酸素存在下での生残性が向上した（酸素耐性を保持した）変異株のスクリーニングを行った。その結果、OR1-9株、OR2-5株と命名した2株の生残性が、野生株OLL 2716よりも著しく高いことが明らかとなった（図２、図３）。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted intensive research.
First, using the unbalanced mutagenesis method, mutation was introduced into Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain (deposit number FERM BP-6999), and the resulting mutant strain was stored at low temperature under oxygen-filled conditions. Screening was performed for mutants with improved survival (holding oxygen tolerance). As a result, it was revealed that the survival of the two strains named OR1-9 and OR2-5 was significantly higher than that of the wild strain OLL 2716 (FIGS. 2 and 3).

次に、これらの変異株について、ゲノムDNA配列を解析することによって、変異部位を特定したところ、2株に共通して、リボフラビン・トランスポーター遺伝子内に、両株で異なる位置でのフレームシフト変異が導入されていることが明らかとなった（図４）。 Next, when these mutants were identified by analyzing the genomic DNA sequence, frame shift mutations at different positions in the two riboflavin transporter genes were common to the two strains. It became clear that was introduced (Fig. 4).

リボフラビン・トランスポーター遺伝子のフレームシフト変異が実際に生残性に関与していることを確認するために、OR2-5株の変異リボフラビン・トランスポーター遺伝子をOLL 2716株に導入したところ、この遺伝子交換株（OR_1141株）も、OR2-5株と同様に酸素耐性を保持していることが明らかとなった（図６）。 In order to confirm that the frameshift mutation of the riboflavin transporter gene was actually involved in survival, the mutant riboflavin transporter gene of OR2-5 was introduced into OLL 2716. It was revealed that the strain (OR_1141 strain) also maintained oxygen tolerance like the OR2-5 strain (FIG. 6).

また、OLL 2716株からリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失させた遺伝子破壊株（d1141株）を作製したところ、当該変異株もOR2-5株と同様に酸素耐性を保持していることが明らかとなった（図８）。 In addition, when a gene disruption strain (d1141 strain) in which the entire riboflavin transporter gene was deleted from OLL 2716 strain was produced, it was clear that the mutant strain retained oxygen tolerance as well as the OR2-5 strain. (Fig. 8).

さらに、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11株染色体DNA上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失させた遺伝子破壊株（d0726株）を作製したところ、d0726株はT-11株に比較して、酸素充満下での生残性が向上していることが明らかとなった（図９、図１０）。 Furthermore, when a gene disruption strain (d0726 strain) in which the entire riboflavin transporter gene on the chromosomal DNA of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11 strain was deleted was prepared, the d0726 strain was compared to the T-11 strain, It became clear that the survival property under oxygen filling was improved (FIGS. 9 and 10).

即ち、本発明者らは、Lactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌において、リボフラビン・トランスポーター遺伝子に変異を導入することにより、酸素充満下低温保存時の生残性が向上する変異株の作製に成功し、これにより本発明を完成するに至った。 That is, the present inventors, in Lactobacillus gasseri bacterium or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus bacterium, by introducing a mutation into the riboflavin transporter gene, to produce a mutant strain that improves survival at low temperature storage under oxygen-filled As a result, the present invention was completed.

即ち、本発明は以下〔１〕〜〔１１〕の発明に係るものである。
〔１〕リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されていることを特徴とする、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体。
〔２〕リボフラビン・トランスポーター遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、〔１〕に記載の乳酸菌変異体。
〔３〕前記乳酸菌が、Lactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌であることを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載の乳酸菌変異体。
〔４〕Lactobacillus gasseri OR_1141（NITE BP-840）またはLactobacillus gasseri d1141（NITE BP-839）である、〔１〕または〔２〕に記載の乳酸菌変異体。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および／またはその処理物を含む、Helicobacter pyloriの除菌用および感染防御用の飲食品。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および／またはその処理物を含む、Helicobacter pylori感染症の予防および／または治療用の医薬品。
〔７〕下記（１）〜（３）の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法。
（１）乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
（２）（１）で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程および
（３）乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程
〔８〕〔７〕（１）の工程において、不均衡変異導入法により乳酸菌に変異を導入することを特徴とする、〔７〕に記載のスクリーニング方法。
〔９〕下記（１）〜（３）の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法。
（１）乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
（２）（１）で得られた乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子において、変異を検出する工程、および
（３）（２）において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。
〔１０〕〔９〕（２）において、フレームシフト変異を検出することを特徴とする、〔９〕に記載のスクリーニング方法。
〔１１〕〔９〕（２）において、配列番号：１の184番目または176番目に、1塩基挿入または１塩基欠損を含む変異が存在するかを検出することを特徴とする、〔９〕に記載のスクリーニング方法。 That is, the present invention relates to the following [1] to [11].
[1] A lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, wherein the riboflavin transporter gene is inactivated in whole or in part.
[2] The lactic acid bacterium mutant according to [1], wherein the expression of a riboflavin transporter gene is suppressed.
[3] The lactic acid bacterium mutant according to [1] or [2], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri bacterium or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus bacterium.
[4] The lactic acid bacterium mutant according to [1] or [2], which is Lactobacillus gasseri OR_1141 (NITE BP-840) or Lactobacillus gasseri d1141 (NITE BP-839).
[5] A food and drink for Helicobacter pylori sterilization and infection prevention, comprising the lactic acid bacterium according to any one of [1] to [4], the lactic acid bacterium-containing product, and / or a processed product thereof.
[6] A pharmaceutical product for preventing and / or treating Helicobacter pylori infection, comprising the lactic acid bacterium according to any one of [1] to [4], the lactic acid bacterium-containing product, and / or a processed product thereof.
[7] A screening method for a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) A step of storing the lactic acid bacterium mutant and the lactic acid bacterium wild strain obtained in (1) at a low temperature under oxygen-filled conditions, and (3) a step of isolating a lactic acid bacterium mutant having higher survival than the lactic acid bacterium wild strain [8]. [7] The screening method according to [7], wherein in the step (1), a mutation is introduced into lactic acid bacteria by an unbalanced mutation introduction method.
[9] A screening method for a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) a step of detecting a mutation in the riboflavin transporter gene of the lactic acid bacterium mutant obtained in (1), and (3) a lactic acid bacterium mutation in which the mutation was detected in comparison with the lactic acid bacteria wild strain in (2) Isolating the strain.
[10] [9] The screening method according to [9], wherein the frameshift mutation is detected in (2).
[11] In [9] (2), it is detected whether a mutation containing a single base insertion or single base deletion exists at position 184 or 176 of SEQ ID NO: 1, The screening method described.

本発明によって、Lactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌において、リボフラビン・トランスポーター遺伝子に変異を導入することにより、酸素耐性の増強された乳酸菌変異体の提供が可能となった。腸管由来でプロバイオティクスとして利用されることが多い乳酸菌、ビフィズス菌等は、概して酸素に弱く保存中に死滅しやすいことから、これらの菌の保存性（生残性）を上げるため、現状では酸素不透過性容器や脱酸素剤などを用いる必要がある。本発明の乳酸菌変異体は、これらを使用しなくとも保存性（生残性）を確保することができ、製品製造において低コスト化を図ることができる。また、本発明の乳酸菌変異体は、酸素耐性が増強されていることから、発酵乳のスターターとして有用である。 According to the present invention, in Lactobacillus gasseri or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, a lactic acid bacterium mutant having enhanced oxygen tolerance can be provided by introducing a mutation into the riboflavin transporter gene. Lactic acid bacteria, bifidobacteria, etc. that are often used as probiotics from the intestinal tract are generally vulnerable to oxygen and are likely to die during storage, so in order to increase the preservation (survivability) of these bacteria, It is necessary to use an oxygen-impermeable container or an oxygen scavenger. The lactic acid bacteria mutant of the present invention can ensure storage (survivability) without using these, and can reduce costs in product production. In addition, the mutant of lactic acid bacteria of the present invention is useful as a starter for fermented milk because oxygen resistance is enhanced.

OLL 2716株染色体DNA上のpol3（DNAポリメラーゼIII）遺伝子へのアミノ酸置換変異導入の概略を示す図である。Ａ. OLL 2716株にpMpol3プラスミドを形質転換し、エリスロマイシン存在下、32℃で培養する。pol3遺伝子中の縦線は校正機能変異を示す。Ｂ. 39℃で培養することにより、pMpol3プラスミドが自律複製できなくなり、染色体上のpol3遺伝子と相同組換えして染色体に組み込まれる。Ｃ. 32℃、エリスロマイシン非存在下で培養することによって、pol3間で再度相同組換えが起こる。その結果、変異が染色体上のpol3に移行し、染色体から遊離したプラスミドはエリスロマイシンによる選択がないために脱落する。結果、校正機能変異を含むpol3遺伝子を染色体上に持つ2716M株を取得した。It is a figure which shows the outline of the amino acid substitution mutation introduction | transduction to pol3 (DNA polymerase III) gene on OLL 2716 strain | chromosome DNA. A. OLL 2716 strain is transformed with pMpol3 plasmid and cultured at 32 ° C. in the presence of erythromycin. Vertical lines in the pol3 gene indicate proofreading function mutations. B. By culturing at 39 ° C., the pMpol3 plasmid cannot replicate autonomously, and is homologously recombined with the pol3 gene on the chromosome and integrated into the chromosome. C. By culturing at 32 ° C. in the absence of erythromycin, homologous recombination occurs again between pol3. As a result, the mutation is transferred to pol3 on the chromosome, and the plasmid released from the chromosome is dropped because there is no selection by erythromycin. As a result, 2716M strain having pol3 gene containing proofreading function mutation on the chromosome was obtained. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、MRS培地中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。OLL 2716：Lactobacillus gasseri OLL 2716株野生株。OR1-9、OR2-5：2716M株由来の変異株。It is a figure which shows the survival property when a lactic acid bacteria mutant strain and a lactic acid bacteria wild strain are cryopreserved in MRS culture medium under oxygen filling. OLL 2716: Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain wild strain. OR1-9, OR2-5: Mutant strain derived from 2716M strain. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、ガンマ線滅菌したヨーグルト中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。OLL 2716：Lactobacillus gasseri OLL 2716株野生株。OR1-9、OR2-5：2716M株由来の変異株。It is a figure which shows the survival property at the time of cryopreserving the lactic acid bacteria mutant strain and the lactic acid bacteria wild strain in the gamma sterilized yogurt under oxygen filling. OLL 2716: Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain wild strain. OR1-9, OR2-5: Mutant strain derived from 2716M strain. リボフラビン・トランスポーター遺伝子における変異位置を示す図である。OR1-9株およびOR2-5株で異なる位置にフレームシフト変異が入り、両株とも同遺伝子は短く終端していた。It is a figure which shows the variation | mutation position in a riboflavin transporter gene. A frameshift mutation was introduced at different positions in the OR1-9 and OR2-5 strains, and the same gene was terminated shortly in both strains. OLL 2716株染色体DNA上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子をOR2-5株由来のフレームシフト変異遺伝子に交換し、OR_1141株を取得する概略を示す図である。Ａ. OLL 2716 株にpOR_RT1プラスミドを形質転換し、エリスロマイシン存在下、32℃で培養する。リボフラビン・トランスポーター遺伝子中の縦線はフレームシフト変異を示す。Ｂ. 39℃で培養することにより、pOR_RT1プラスミドが自律複製できなくなり、染色体上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子と相同組換えして染色体に組み込まれる。Ｃ. 32℃、エリスロマイシン非存在下で培養することによって、リボフラビン・トランスポーター間で再度相同組換えが起こる。その結果、変異が染色体上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子に移行し、染色体から遊離したプラスミドはエリスロマイシンによる選択がないために脱落する。結果、フレームシフト変異したリボフラビン・トランスポーター遺伝子を染色体上に持つOR_1141株を取得した。It is a figure which shows the outline which replaces the riboflavin transporter gene on OLL 2716 stock | strain chromosomal DNA with the frameshift mutant gene derived from OR2-5 strain | stump | stock, and acquires OR_1141 strain | stump | stock. A. The OLL 2716 strain is transformed with the pOR_RT1 plasmid and cultured at 32 ° C. in the presence of erythromycin. The vertical line in the riboflavin transporter gene indicates a frameshift mutation. B. By culturing at 39 ° C., the pOR_RT1 plasmid cannot autonomously replicate, and is homologously recombined with the riboflavin transporter gene on the chromosome and integrated into the chromosome. C. By culturing in the absence of erythromycin at 32 ° C., homologous recombination occurs again between riboflavin transporters. As a result, the mutation is transferred to the riboflavin transporter gene on the chromosome, and the plasmid released from the chromosome is dropped because there is no selection by erythromycin. As a result, OR_1141 strain having a riboflavin transporter gene with a frameshift mutation on the chromosome was obtained. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、MRS培地中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。OLL 2716：Lactobacillus gasseri OLL 2716株野生株。OR_1141：OLL 2716株のリボフラビン・トランスポーター遺伝子をOR2-5株由来のフレームシフト変異遺伝子に交換した株。OR2-5：OR2-5変異株。It is a figure which shows the survival property when a lactic acid bacteria mutant strain and a lactic acid bacteria wild strain are cryopreserved in MRS culture medium under oxygen filling. OLL 2716: Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain wild strain. OR_1141: A strain obtained by exchanging the riboflavin transporter gene of OLL 2716 strain with a frameshift mutant gene derived from OR2-5 strain. OR2-5: OR2-5 mutant. OLL 2716株染色体DNA上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子を欠失させ、d1141株を取得する概略を示す図である。Ａ. OLL 2716 株にpDeltaRT1プラスミドを形質転換し、エリスロマイシン、32℃で培養する。リボフラビン・トランスポーター遺伝子前後の四角は、同遺伝子の前後のノンコーディング配列を示す。Ｂ. 39℃で培養することにより、pDeltaRT1プラスミドが自律複製できなくなり、染色体上のノンコーディング配列領域と相同組換えして染色体に組み込まれる。Ｃ. 32℃、エリスロマイシン非存在下で培養することによって、ノンコーディング配列領域間で再度相同組換えが起こる。その結果、染色体上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子が欠失し、染色体から遊離したプラスミドはエリスロマイシンによる選択がないために脱落する。結果、染色体上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子が欠失したd1141株を取得した。It is a figure which shows the outline which deletes the riboflavin transporter gene on OLL 2716 stock | strain chromosomal DNA, and acquires d1141 strain | stump | stock. A. The pDeltaRT1 plasmid is transformed into OLL 2716 strain and cultured at erythromycin at 32 ° C. Squares before and after the riboflavin transporter gene indicate non-coding sequences before and after the gene. B. By culturing at 39 ° C., the pDeltaRT1 plasmid cannot autonomously replicate, and is homologously recombined with the noncoding sequence region on the chromosome and integrated into the chromosome. C. By culturing in the absence of erythromycin at 32 ° C., homologous recombination occurs again between the non-coding sequence regions. As a result, the riboflavin transporter gene on the chromosome is deleted, and the plasmid released from the chromosome is dropped because there is no selection by erythromycin. As a result, the d1141 strain lacking the riboflavin transporter gene on the chromosome was obtained. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、MRS培地中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。OLL 2716：Lactobacillus gasseri OLL 2716株野生株。OR_1141：OLL 2716のリボフラビン・トランスポーター遺伝子を OR2-5 由来フレームシフト変異遺伝子に交換した株。d1141：OLL 2716のリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失させた株。It is a figure which shows the survival property when a lactic acid bacteria mutant strain and a lactic acid bacteria wild strain are cryopreserved in MRS culture medium under oxygen filling. OLL 2716: Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain wild strain. OR_1141: A strain obtained by exchanging the OLL 2716 riboflavin transporter gene with an OR2-5-derived frameshift gene. d1141: A strain in which the entire riboflavin transporter gene of OLL 2716 has been deleted. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、MRS培地中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。T-11： Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11野生株。T-11_d0726：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11のリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失した株。It is a figure which shows the survival property when a lactic acid bacteria mutant strain and a lactic acid bacteria wild strain are cryopreserved in MRS culture medium under oxygen filling. T-11: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11 wild strain. T-11_d0726: A strain lacking the entire riboflavin transporter gene of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11. 乳酸菌変異株および乳酸菌野生株を、スキムミルク培地中で酸素充満下低温保存した際の生残性を示す図である。T-11： Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11野生株。T-11_d0726：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11のリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失した株。It is a figure which shows the survival property at the time of cryopreserving a lactic acid bacteria mutant and a lactic acid bacteria wild strain in a skim milk culture medium under oxygen filling. T-11: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11 wild strain. T-11_d0726: A strain lacking the entire riboflavin transporter gene of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11.

本発明において、「乳酸菌」は特に限定されるものではないが、好ましくは「Lactobacillus 属」の乳酸菌を例示することができる。Lactobacillus 属は、乳酸菌の代表的な属の一つで、80種以上の種を含む。Lactobacillus属に含まれる種の例として、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus helveticus subsp. jugurti、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus oris、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevisを挙げることができる。 In the present invention, the “lactic acid bacterium” is not particularly limited, but a lactic acid bacterium belonging to the genus “Lactobacillus” is preferably exemplified. The genus Lactobacillus is one of the typical genus of lactic acid bacteria, and includes more than 80 species. Examples of species contained in the genus Lactobacillus include Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Lactobacillus paracasei subsp. Examples include gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus oris, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus brevis.

本発明の「Lactobacillus 属」の乳酸菌は、リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されていることにより酸素耐性が増強されている限りいずれの種であってもよいが、好ましくはLactobacillus gasseri菌またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus菌の変異株を例示することができ、より好ましくはLactobacillus gasseri OLL 2716株（LG21株：特許番号第 3046303 号）の変異株またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11株の変異株を例示することができる。 The lactic acid bacterium of the genus `` Lactobacillus '' of the present invention may be any species as long as the riboflavin transporter gene is totally or partially inactivated so that oxygen tolerance is enhanced, Preferably, a mutant of Lactobacillus gasseri or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus can be exemplified, more preferably a mutant of Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 strain: Patent No. 3046303) or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T -11 strains can be exemplified.

本発明の「酸素耐性が増強された乳酸菌変異体」の具体例として、受託番号：NITE BP-840またはNITE BP-839で特定されるLactobacillus gasseri OLL 2716由来変異株を挙げることができる。
（１）NITE BP-840
（イ）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（所在地：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８郵便番号292-0818）
（ロ）寄託日：2009年11月18日
（ハ）受託番号：Lactobacillus gasseri OR_1141株（受託番号NITE BP-840）
（２）NITE BP-839
（イ）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（所在地：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８郵便番号292-0818）
（ロ）寄託日：2009年11月18日
（ハ）受託番号：Lactobacillus gasseri d1141株（受託番号NITE BP-839） Specific examples of the “lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance” of the present invention include a Lactobacillus gasseri OLL 2716-derived mutant strain identified by the accession number: NITE BP-840 or NITE BP-839.
(1) NITE BP-840
(I) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (Location: 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan Postal Code 292-0818)
(B) Date of deposit: November 18, 2009 (c) Deposit number: Lactobacillus gasseri OR_1141 strain (Accession number NITE BP-840)
(2) NITE BP-839
(I) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (Location: 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan Postal Code 292-0818)
(B) Date of deposit: November 18, 2009 (c) Deposit number: Lactobacillus gasseri d1141 strain (Accession number NITE BP-839)

本発明のLactobacillus 属乳酸菌変異株を培養するには、一般的に乳酸桿菌の培養に適した培地であれば良く、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、スクロース、マンノース、セロビオース等の炭素源、肉エキス、ペプトン、イーストエキストラクト、カゼイン、ホエータンパク質等の窒素源、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等の無機栄養素を含む培地を用いることができる。好適な例の一つとして、Lactobacilli MRS Broth (Difco)を挙げることができる。培養条件は、腸内乳酸菌が生育し得る条件であれば、特に制限はないが、好ましい条件としては、例えば、 pH5.0〜pH8.0、温度20℃〜45℃であり、より好ましい条件としては、嫌気性、pH5.0〜pH7.0、温度30℃〜40℃である。 In order to culture the Lactobacillus genus lactic acid bacteria mutant strain of the present invention, it is generally sufficient to use a medium suitable for culturing lactobacilli, carbon sources such as glucose, lactose, galactose, fructose, trehalose, sucrose, mannose, cellobiose, A medium containing a nitrogen source such as meat extract, peptone, yeast extract, casein, whey protein, and inorganic nutrients such as magnesium sulfate, iron sulfate, and manganese sulfate can be used. One suitable example is Lactobacilli MRS Broth (Difco). The culture conditions are not particularly limited as long as the intestinal lactic acid bacteria can grow. Preferred conditions include, for example, pH 5.0 to pH 8.0, and a temperature of 20 ° C. to 45 ° C. Is anaerobic, pH 5.0 to pH 7.0, temperature 30 ° C to 40 ° C.

本発明において、「リボフラビン・トランスポーター遺伝子が、全体的にまたは部分的に不活化されている」とは、リボフラビン・トランスポーター活性（リボフラビン：ビタミンB2を菌体内に取り込む活性）が一時的に若しくは部分的に低下していること、または全体的に活性が無くなっていることをいう。不活化の要因は特に制限されるものではないが、リボフラビン・トランスポーター遺伝子（リボフラビン・トランスポーターをコードする塩基配列および／またはその発現を制御する塩基配列）への変異導入を、不活化の要因として例示することができる。本発明において、「変異」とは、上記遺伝子の発現量を変化させる、mRNAの安定性等の性質を変化させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を変化させるような変異であることが多いが、特に制限されない。 In the present invention, “the riboflavin transporter gene is inactivated in whole or in part” means that the riboflavin transporter activity (riboflavin: the activity of taking vitamin B2 into cells) is temporarily or It is partially reduced or totally inactive. The inactivation factor is not particularly limited, but the inactivation of mutation introduction into the riboflavin transporter gene (base sequence encoding riboflavin transporter and / or base sequence controlling its expression) It can be illustrated as. In the present invention, the term “mutation” refers to a mutation that changes the expression level of the gene, changes properties such as mRNA stability, or changes the activity of the protein encoded by the gene. There are many, but not particularly limited.

リボフラビン・トランスポーター遺伝子への変異導入方法としては、リボフラビン・トランスポーターをコードするDNA（例えば配列番号：１に記載の塩基配列）において、1つ以上の塩基を欠損、置換および／または挿入する方法、リボフラビン・トランスポーターをコードするDNAを全て欠損する方法を挙げることができる。これらの変異には、1つ以上の塩基を欠損、置換および／または挿入することによって、フレームシフト変異が起こること、またはリボフラビン・トランスポーターの発現が抑制されることも含まれる。 As a method for introducing a mutation into a riboflavin transporter gene, a method of deleting, substituting and / or inserting one or more bases in a DNA encoding the riboflavin transporter (for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 1) And a method of deleting all DNAs encoding riboflavin transporters. These mutations also include deletion of, substitution and / or insertion of one or more bases to cause frameshift mutations or suppression of riboflavin transporter expression.

本発明において、「酸素耐性」とは、酸素存在下の保存においても乳酸菌が死滅しにくいこと、または酸素存在下で培養を行っても増殖を示すことを意味する。本発明において、「酸素耐性が増強された」とは、乳酸菌野生株と比較した場合に、乳酸菌変異株が酸素存在下でより死滅しにくくなっていること、またはより増殖能を保持していることを意味する。本発明の酸素耐性の増強については、一定期間または一定範囲における酸素耐性の増強も含まれる。より具体的には、同一条件で比較した場合、野生株の生残率が10-7未満となる時点において野生株の100倍以上の生残がある場合、酸素耐性が増強されたものと認定することができる。 In the present invention, “oxygen tolerance” means that lactic acid bacteria are not easily killed even during storage in the presence of oxygen, or that growth is exhibited even when cultured in the presence of oxygen. In the present invention, “oxygen tolerance is enhanced” means that a lactic acid bacterium mutant is less likely to be killed in the presence of oxygen or has a more proliferative ability when compared to a wild strain of lactic acid bacteria. Means that. The enhancement of oxygen tolerance of the present invention includes enhancement of oxygen tolerance for a certain period or a certain range. More specifically, when compared under the same conditions, if the survival rate of the wild strain is less than 10-7, if the survival rate is more than 100 times that of the wild strain, it is recognized that the oxygen tolerance is enhanced. can do.

酸素耐性の判定方法は公知方法によって可能であり、一例を示せば、本実施例の方法により可能である。具体的には、酸素充満下で低温保存を行い、乳酸菌変異体の生残性（生残数、生残率）を検出することにより、酸素耐性を判定することができる。より具体的には、アネロパック用の酸素不透過性バッグ中に入れ、酸素を吹き込んだ後バッグを密閉し、チューブの蓋を閉じて4℃にて保存した後に、アネロパックによる嫌気条件下37℃48時間培養後に生じたコロニーを計数することによって、酸素耐性を判定することができる。 The determination method of oxygen tolerance can be performed by a known method. For example, the method of this embodiment can be used. Specifically, oxygen tolerance can be determined by performing low-temperature storage under oxygen fullness and detecting the survival (number of survival, survival rate) of lactic acid bacteria mutants. More specifically, it is placed in an oxygen-impermeable bag for anero pack, oxygen is blown, the bag is sealed, the tube lid is closed and stored at 4 ° C. Oxygen tolerance can be determined by counting colonies generated after time culture.

本発明の乳酸菌変異株（一例としてLactobacillus gasseri OLL 2716変異株）は、Helicobacter pyloriの除菌用および感染防御用の飲食品または医薬品の製造に用いることができる。 The lactic acid bacteria mutant of the present invention (for example, Lactobacillus gasseri OLL 2716 mutant) can be used for the production of Helicobacter pylori sterilizing foods and foods or medicines for infection protection.

本発明の乳酸菌変異株を用いて作る飲食品は、カテゴリーや種類に制限はなく、機能性食品、特定保健用食品、健康食品、介護用食品でも良く、また、菓子、乳酸菌飲料、チーズやヨーグルト等の乳製品、調味料等であっても良い。飲食品の形状についても制限はなく、固形、液状、流動食状、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、通常流通し得るあらゆる飲食品形状をとることができる。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる。上記飲食品の製造においては、乳酸菌生育を妨げない限り、糖質、タンパク質、脂質、食物繊維、ビタミン類、生体必須微量金属（硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カリウム、等）、香料やその他の配合物を添加することもできる。 Foods and beverages made using the lactic acid bacteria mutant of the present invention are not limited in category or type, and may be functional foods, foods for specified health use, health foods, foods for nursing care, confectionery, lactic acid bacteria drinks, cheese and yogurt Such as dairy products and seasonings. There is no restriction | limiting also about the shape of food / beverage products, It can take all the food / beverage product forms which can distribute | circulate normally, such as solid, liquid, liquid food form, jelly form, tablet form, granule form, and capsule form. Manufacture of the said food / beverage products can be performed by those skilled in the art. In the production of the above food and drink, as long as the growth of lactic acid bacteria is not hindered, carbohydrates, proteins, lipids, dietary fibers, vitamins, biologically essential trace metals (manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium chloride, potassium carbonate, etc.), flavors, Other blends can also be added.

本発明の乳酸菌変異株、これらの該乳酸菌含有物および／またはその処理物（例えば、培養物、濃縮物、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物、希釈物、破砕物）は、上記の通り乳製品・発酵乳を含む一般飲食品に加工できる他、ヨーグルトやチーズ等の乳製品・発酵乳の製造用スターターとして利用することも可能である。スターターとする場合は、本発明の乳酸菌変異株の生息・増殖に支障がない限り、また、乳製品製造に支障がない限り、他の微生物が混合されていても良い。例えば、ヨーグルト用乳酸菌として主要な菌種であるStreptococcus thermophilus、Lactobacillus acidophilus等と混合しても良く、その他、一般にヨーグルト用やチーズ用として用いられる菌種と混合してスターターとすることができる。上記スターターによる乳製品、発酵乳の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、加温・混合・均質化・殺菌処理後に冷却した乳または乳製品に、上記スターターを混合し、発酵・冷却することにより、プレーンヨーグルトを製造することができる。 Lactic acid bacteria mutants of the present invention, these lactic acid bacteria-containing products and / or processed products thereof (for example, cultures, concentrates, pasted products, spray-dried products, freeze-dried products, vacuum-dried products, drum-dried products, liquid products, In addition to being able to be processed into general foods and drinks including dairy products and fermented milk as described above, the diluted products and crushed products can also be used as starters for producing dairy products and fermented milk such as yogurt and cheese. In the case of a starter, other microorganisms may be mixed as long as there is no hindrance to the growth and growth of the lactic acid bacterium mutant of the present invention and as long as the production of dairy products is not hindered. For example, it may be mixed with Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, etc., which are the main bacterial species as lactic acid bacteria for yogurt, and in addition, it can be mixed with bacterial species generally used for yogurt or cheese to form a starter. Production of dairy products and fermented milk using the starter can be performed according to a conventional method. For example, plain yogurt can be produced by mixing the above starter with milk or a dairy product cooled after heating, mixing, homogenizing, and sterilizing, and then fermenting and cooling.

本発明の乳酸菌変異株は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができるが、好ましい投与方法は、経口投与である。経口投与製剤としては、周知の各種剤型とすることができ、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、トローチ剤等の剤型とすることができる。また、当業者に周知の方法で腸溶性製剤とすることにより、胃酸の効果を受けることなく、本発明の乳酸菌変異株をより効率的に腸まで運ぶことも可能である。 The lactic acid bacterium mutant of the present invention can be mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like and administered orally or parenterally as a pharmaceutical composition. Oral administration. Oral preparations can be in various known dosage forms, such as granules, powders, tablets, pills, capsules, solutions, syrups, emulsions, suspensions, lozenges, and the like. can do. In addition, by making an enteric preparation by a method well known to those skilled in the art, the lactic acid bacterium mutant of the present invention can be more efficiently transported to the intestine without being affected by gastric acid.

本発明の乳酸菌変異株を用いて製造された医薬品および飲食品は、飲食品中の同菌の作用によって、Helicobacter pyloriの除菌効果および感染防御効果を発揮するものと期待できる。 The pharmaceuticals and foods and drinks produced using the lactic acid bacterium mutant of the present invention can be expected to exhibit Helicobacter pylori sterilization effect and infection protection effect by the action of the bacteria in the food and drink products.

本発明は、下記（１）〜（３）の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法に関する。
（１）乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
（２）（１）で得られた乳酸菌変異体および乳酸菌野生株を酸素充満下低温保存する工程、および
（３）乳酸菌野生株よりも生残性の高い乳酸菌変異株を単離する工程 The present invention relates to a method for screening a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3).
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) A step of storing the lactic acid bacterium mutant and the lactic acid bacterium wild strain obtained in (1) at a low temperature under oxygen, and (3) a step of isolating a lactic acid bacterium mutant having higher survival than the lactic acid bacterium wild strain.

本発明において用いられる乳酸菌は、公知方法によって単離することができる。例えば、ヒト等の哺乳類の糞便から菌を培養し、培養した菌の形状、生理学的特徴等から乳酸菌を分離することができる。 The lactic acid bacteria used in the present invention can be isolated by a known method. For example, bacteria can be cultured from feces of mammals such as humans, and lactic acid bacteria can be separated from the shape, physiological characteristics, etc. of the cultured bacteria.

本発明において、乳酸菌に変異を導入する場合には、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、所望の位置の遺伝子に変異を導入する部位特異的突然変異技術を用いることができる。この場合、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））、あるいはPCRを利用した変異導入法(例えばLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）あるいはsplice-overlap extension法など)を用いて変異遺伝子断片を作製し、実施例に示したような方法を用いて乳酸菌遺伝子に変異を導入することができる。また、部位非特異的な変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法を挙げることもできる。また、Ｘ線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法により変異を導入してもよい。本発明の変異導入方法としては、本願実施例に記載した不均衡変異導入法を挙げることもできる。 In the present invention, methods known to those skilled in the art can be used to introduce mutations into lactic acid bacteria. For example, a site-directed mutagenesis technique for introducing a mutation into a gene at a desired position can be used. In this case, a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K or Mutant-G (both trade names, manufactured by TAKARA Bio)) or PCR-based mutagenesis (for example, LA Create mutant gene fragments using PCR in vitro Mutagenesis series kits (trade name, manufactured by TAKARA Bio) or splice-overlap extension method, and introduce mutations into lactic acid bacteria genes using the method described in the Examples. can do. In addition, site-specific mutagenesis methods include EMS (ethyl methanesulfonic acid), 5-bromouracil, 2-aminopurine, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N nitrosoguanidine, and other methods. A method using a chemical mutagen such as a cancer compound can also be mentioned. Further, mutation may be introduced by a method using radiation treatment or ultraviolet treatment such as X-ray, alpha ray, beta ray, gamma ray and ion beam. As mutagenesis method of the invention, it may also be mentioned imbalance mutagenesis method described herein Example.

本発明において、酸素充満下低温保存および乳酸菌変異株の生残性の判定は公知方法によって可能であり、一例を示せば、本実施例の方法により可能である。 In the present invention, low-temperature storage under oxygen-filling and determination of the survival of lactic acid bacteria mutants can be performed by a known method. For example, the method of this embodiment can be used.

また本発明は、下記（１）〜（３）の工程を含む、酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法に関する。
（１）乳酸菌に変異を導入し、乳酸菌変異体を得る工程、
（２）（１）で得られた乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子において、変異を検出する工程、および
（３）（２）において、乳酸菌野生株と比較し、変異が検出された乳酸菌変異株を単離する工程。 Moreover, this invention relates to the screening method of the lactic acid bacteria variant by which oxygen tolerance was enhanced including the process of following (1)-(3).
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) a step of detecting a mutation in the riboflavin transporter gene of the lactic acid bacterium mutant obtained in (1), and (3) a lactic acid bacterium mutation in which the mutation was detected in comparison with the lactic acid bacteria wild strain in (2) Isolating the strain.

本発明の酸素耐性が増強された乳酸菌変異体のスクリーニング方法は、乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする。乳酸菌変異体のリボフラビン・トランスポーター遺伝子における変異の有無は、リボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNAの長さ、またはリボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNAの塩基配列の違いを検出することにより評価することが可能である。 The screening method for lactic acid bacteria mutants with enhanced oxygen tolerance according to the present invention is characterized by detecting the presence or absence of mutations in the riboflavin transporter gene of the lactic acid bacteria mutants. The presence or absence of mutations in the riboflavin transporter gene of lactic acid bacteria mutants is evaluated by detecting the length of the DNA corresponding to the riboflavin transporter gene or the base sequence difference of the DNA corresponding to the riboflavin transporter gene. It is possible.

一つの態様としては、被検乳酸菌変異株におけるリボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNA領域と、乳酸菌野生株におけるリボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNA領域の長さを比較する方法である。 One embodiment is a method of comparing the length of a DNA region corresponding to a riboflavin transporter gene in a test lactic acid bacterium mutant and a length of a DNA region corresponding to a riboflavin transporter gene in a lactic acid bacterium wild strain.

まず、被検乳酸菌変異株からDNA試料を調製する。次いで、該DNA試料からリボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNA領域を増幅する。さらに、乳酸菌野生株におけるリボフラビン・トランスポーター遺伝子のDNA領域を増幅したDNA断片と、該DNA試料から増幅したDNA断片の長さを比較し、乳酸菌野生株よりも有意に低い場合や高い場合に被検乳酸菌変異株の酸素耐性は増強されていると判定する。 First, a DNA sample is prepared from a test lactic acid bacterium mutant. Next, a DNA region corresponding to the riboflavin transporter gene is amplified from the DNA sample. Furthermore, the length of the DNA fragment obtained by amplifying the DNA region of the riboflavin transporter gene in the wild strain of lactic acid bacteria was compared with the length of the DNA fragment amplified from the DNA sample. It is determined that the oxygen tolerance of the lactic acid bacteria mutant is enhanced.

具体的には、まず、本発明のリボフラビン・トランスポーター遺伝子のDNA領域をPCR法等によって増幅する。本発明における「リボフラビン・トランスポーター遺伝子のDNA領域」とは、リボフラビン・トランスポーター遺伝子のDNA領域（配列番号：１に記載のDNA領域）に相当する部分であり、増幅される範囲としては当該DNA領域の全長であってもよいし、一部分であってもよい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、³²P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に³²P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、³²P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。 Specifically, first, the DNA region of the riboflavin transporter gene of the present invention is amplified by a PCR method or the like. The “DNA region of the riboflavin transporter gene” in the present invention is a portion corresponding to the DNA region of the riboflavin transporter gene (the DNA region described in SEQ ID NO: 1). The entire length of the region or a part thereof may be used. Those skilled in the art can perform PCR by appropriately selecting reaction conditions and the like. During PCR, the amplified DNA product can be labeled by using a primer labeled with an isotope such as ³² P, a fluorescent dye, or biotin. Alternatively, the amplified DNA product can be labeled by adding a substrate base labeled with an isotope such as ³² P, a fluorescent dye, or biotin to the PCR reaction solution and performing PCR. Furthermore, labeling can also be performed by adding a substrate base labeled with an isotope such as ³² P, a fluorescent dye, or biotin to the amplified DNA fragment using Klenow enzyme or the like after the PCR reaction.

こうして得られた標識されたDNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素やSDSなどの変性剤を含むポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。 The labeled DNA fragment thus obtained is denatured by applying heat or the like, and electrophoresed on a polyacrylamide gel containing a denaturing agent such as urea or SDS. After electrophoresis, the mobility of the DNA fragments is detected and analyzed by autoradiography using an X-ray film, a scanner that detects fluorescence, or the like. Even when the labeled DNA is not used, the band can be detected by staining the gel after electrophoresis with ethidium bromide or silver staining.

また、リボフラビン・トランスポーター遺伝子に相当するDNA領域に相当する被検乳酸菌変異株のDNA領域の塩基配列を直接決定し、乳酸菌野生株の塩基配列と比較することにより、乳酸菌変異株の酸素耐性を判定することもできる。例えば、被検乳酸菌変異株の配列番号：１に記載の塩基配列に相当する範囲において、第１８４番目または第１７６番目に1塩基挿入または１塩基欠損を含む変異が存在する場合には酸素耐性が増強された乳酸菌変異株であるというように判定を行なうことができる。 In addition, by directly determining the nucleotide sequence of the DNA region of the test lactic acid bacterium mutant corresponding to the DNA region corresponding to the riboflavin transporter gene and comparing it with the nucleotide sequence of the lactic acid bacterium wild strain, the oxygen tolerance of the lactic acid bacterium mutant is reduced. It can also be determined. For example, in the range corresponding to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the test lactic acid bacterium mutant, oxygen tolerance is present when a mutation containing a single base insertion or single base deletion exists at the 184th or 176th position. It can be determined that the mutant strain is an enhanced lactic acid bacterium.

以下、本発明の実施例として、Lactobacillus gasseri OLL 2716株(寄託番号 FERM BP-6999)および、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11株（Satoh, E., Y. Ito, Y. Sasaki, and T. Sasaki. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63:4593-4596.）について行った結果について詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 Hereinafter, as examples of the present invention, Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain (deposit number FERM BP-6999) and Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11 strain (Satoh, E., Y. Ito, Y. Sasaki, and T. Sasaki. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4593-4596.) Will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following examples.
[Example 1]

Lactobacillus gasseri OLL 2716株から酸素存在下での生残性が向上した変異株を取得するための変異法として不均衡変異導入法を用いた。 Lactobacillus gasseri viability in the presence of oxygen from the strain OLL 2716 was used imbalance mutagenesis as mutagenesis for obtaining a mutant strain with improved.

不均衡変異導入とは、DNA複製酵素(ポリメラーゼ)遺伝子に、同酵素の校正機能(3'-→5'-エクソヌクレアーゼ活性)を低減させるような変異を導入することによってDNA複製時lagging鎖の変異率が高まる現象である（特開平８−１６３９８６）。大腸菌DNAポリメラーゼにおいてはDnaQサブユニットがDNA複製時の校正機能を司るが、アミノ酸配列の相同性からLactobacillus gasseriでは校正機能を司る領域がpol3遺伝子から発現するDNAポリメラーゼ中に含まれていると考えられた。Lactobacillus gasseri OLL 2716株pol3(4299 bp、1432アミノ酸)の校正機能を低下させるためには419番目のアミノ酸残基AspをAlaに、421番目のアミノ酸残基GluをAlaに置換すればよいと考えられた。 Imbalanced mutagenesis is the introduction of mutations that reduce the proofreading function (3'- → 5'-exonuclease activity) of the DNA replication enzyme (polymerase) gene into the DNA replication enzyme (polymerase) gene. This is a phenomenon in which the mutation rate increases (JP-A-8-163986). In Escherichia coli DNA polymerase, the DnaQ subunit is responsible for the proofreading function during DNA replication, but in Lactobacillus gasseri, the region responsible for the proofreading function is considered to be included in the DNA polymerase expressed from the pol3 gene. It was. In order to reduce the proofreading function of Lactobacillus gasseri OLL 2716 strain pol3 (4299 bp, 1432 amino acids), it is considered that the 419th amino acid residue Asp should be replaced with Ala and the 421st amino acid residue Glu should be replaced with Ala. It was.

OLL 2716株染色体DNA上のpol3遺伝子への上記アミノ酸置換変異導入の概略を図１に示す。表１に示したプライマー1、2、3、4を使い、splice-overlap extension PCR法(Ho, S. N., H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, and L. R. Pease. 1989. Gene 77:51-59.、Horton, R. M., H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pullen, and L. R. Pease. 1989. Gene 77:61-68)を用いて、pol3遺伝子に変異を導入した断片を増幅した。このDNA断片をベクターpTERM09に結合し、pMpol3プラスミドを作製した。pTERM09は、pSYE2+T（Ito, Y., Y. Kawai, Y. Honme, K. Arakawa, T. Sasaki, and T. Saito. 2009. Appl. Environ. Microbiol. 75:6340-6351.)の複製タンパク質遺伝子repA中に、pG⁺host5（特許第3573347号、Biswas, I., A. Gruss, S. D. Ehrlich, and E. Maguin. 1993. J. Bacteriol. 175:3628-3635.）repAと同じ温度感受性変異が導入されたプラスミドベクターであり、pG⁺host5と同様に温度感受性の複製様式を取る。pMpol3プラスミドおよび以後の実施例における組換えプラスミドの作製には、宿主菌株としてLactococcus lactis subsp. lactis IL1403株（Chopin, A., M. C. Chopin, A. Moillo-Batt, and P. Langella. 1984. Plasmid 11:260-263.）を用い、IL1403株のDNA形質転換はHoloらの方法（Holo, H., and I. F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123.）に準じて行い、プラスミドを含む形質転換株は1%(w/v)グルコースと25μg/mlエリスロマイシンを含むM17寒天培地(ディフコ社)を用いて選択した。培養は32℃にて行った。 FIG. 1 shows an outline of the introduction of the amino acid substitution mutation into the pol3 gene on OLL 2716 chromosomal DNA. Using primers 1, 2, 3, and 4 shown in Table 1, splice-overlap extension PCR method (Ho, SN, HD Hunt, RM Horton, JK Pullen, and LR Pease. 1989. Gene 77: 51-59., Horton, RM, HD Hunt, SN Ho, JK Pullen, and LR Pease. 1989. Gene 77: 61-68) were used to amplify the fragment into which the mutation was introduced into the pol3 gene. This DNA fragment was ligated to the vector pTERM09 to prepare a pMpol3 plasmid. pTERM09 is a copy of pSYE2 + T (Ito, Y., Y. Kawai, Y. Honme, K. Arakawa, T. Sasaki, and T. Saito. 2009. Appl. Environ. Microbiol. 75: 6340-6351.) PG ⁺ host5 (patent No. 3573347, Biswas, I., A. Gruss, SD Ehrlich, and E. Maguin. 1993. J. Bacteriol. 175: 3628-3635.) RepA in protein gene repA This is a plasmid vector into which a mutation has been introduced, and adopts a temperature-sensitive replication mode similar to pG ⁺ host5. For the preparation of the pMpol3 plasmid and the recombinant plasmid in the following examples, Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 strain (Chopin, A., MC Chopin, A. Moillo-Batt, and P. Langella. 1984. Plasmid 11 : 260-263.), The DNA transformation of IL1403 strain was performed according to the method of Holo et al. (Holo, H., and IF Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55: 3119-3123.) The transformant containing the plasmid was selected using M17 agar medium (Difco) containing 1% (w / v) glucose and 25 μg / ml erythromycin. The culture was performed at 32 ° C.

（表１）
プライマー１ ATGAAGATGAAAGATGAAAC （配列番号：３）
プライマー２ AAGACCTGTTGTGGCAACGGCAAAAATCACATA （配列番号：４）
プライマー３ TATGTGATTTTTGCCGTTGCCACAACAGGTCTT （配列番号：５）
プライマー４ CCGTAATAAAAAGAGTGAGC （配列番号：６） (Table 1)
Primer 1 ATGAAGATGAAAGATGAAAC (SEQ ID NO: 3)
Primer 2 AAGACCTGTTGTGGCAACGGCAAAAATCACATA (SEQ ID NO: 4)
Primer 3 TATGTGATTTTTGCCGTTGCCACAACAGGTCTT (SEQ ID NO: 5)
Primer 4 CCGTAATAAAAAGAGTGAGC (SEQ ID NO: 6)

pMpol3プラスミドをOLL 2716株へ形質転換した（図１Ａ）。OLL 2716株へのDNA形質転換は非特許文献４に準じて行った。プラスミドを含む形質転換株の選択は、25μg/mlエリスロマイシンを含むMRS培地(ディフコ社)寒天(1.5% w/v)プレートをアネロパック・ケンキ(三菱ガス化学)を用いた嫌気培養することにより行った。pMpol3プラスミドは約35℃以下でのみ複製が可能であるため、pMpol3プラスミドによる形質転換株は32℃にて選択した。次いで形質転換株をpMpol3プラスミドが複製不可能な39℃で培養し、ゲノム上のpol3遺伝子とpMpol3プラスミド上の同遺伝子との間での相同組換えを誘起した。これにより、pMpol3プラスミドはゲノムDNAに組み込まれた(図１Ｂ)。次いで、エリスロマイシンを含まない培地で32℃にて培養することにより、ゲノムDNAに組み込まれていたpMpol3プラスミドが再度の相同組換えにより脱落し(図１Ｃ)、pMpol3プラスミド上の変異pol3遺伝子の変異部位がゲノムDNA上のpol3遺伝子に移行し、すなわちゲノムDNA中に変異pol3遺伝子を持つ株を取得した(図１Ｃ)。この株を2716M株と命名した。 The pMpol3 plasmid was transformed into OLL 2716 strain (FIG. 1A). DNA transformation into OLL 2716 strain was performed according to Non-Patent Document 4. Selection of the transformant containing the plasmid was carried out by anaerobic culture of MRS medium (Difco) agar (1.5% w / v) plate containing 25 μg / ml erythromycin using Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical). . Since the pMpol3 plasmid can replicate only at about 35 ° C. or lower, a transformant using the pMpol3 plasmid was selected at 32 ° C. The transformed strain was then cultured at 39 ° C. where the pMpol3 plasmid was unable to replicate to induce homologous recombination between the pol3 gene on the genome and the same gene on the pMpol3 plasmid. This integrated the pMpol3 plasmid into the genomic DNA (FIG. 1B). Subsequently, by culturing at 32 ° C. in a medium containing no erythromycin, the pMpol3 plasmid incorporated into the genomic DNA was removed by homologous recombination again (FIG. 1C), and the mutation site of the mutant pol3 gene on the pMpol3 plasmid Transferred to the pol3 gene on the genomic DNA, that is, a strain having a mutated pol3 gene in the genomic DNA was obtained (FIG. 1C). This strain was designated as 2716M strain.

変異率の指標として抗生物質リファンピンへの耐性変異コロニーの出現率を調べたところ、2716M株では3.9×10^-5±1.2×10^-5(4クローンの平均±標準偏差)、野生株OLL 2716では1.2×10^-7±6.3×10^-8(4クローンの平均±標準偏差)となり、2716M株の方が約300倍高かった。この結果から、2716M株ではpol3遺伝子に導入した変異によって校正機能が低下して変異率が高まっていると考えられた。2716M株をミューテーター株として以後の変異株選別に用いた。
〔実施例２〕 As an index of mutation rate, we examined the appearance rate of the resistant mutant colonies to the antibiotic rifampin, 3.9 × 10 ^-5 ± 1.2 × 10 ^-5 (average of 4 clones ± standard deviation) in the 2716M strain, and wild strain OLL 2716 1.2 × 10 ⁻⁷ ± 6.3 × 10 ⁻⁸ (average ± standard deviation of 4 clones), which was about 300 times higher for the 2716M strain. From these results, it was considered that the mutation rate was increased in the 2716M strain due to the proofreading function being lowered by the mutation introduced into the pol3 gene. The 2716M strain was used as a mutator strain for subsequent mutant selection.
[Example 2]

2716M株からの、酸素充満下低温保存で生残性が高い変異株のスクリーニングは以下のように行った。2716M株をMRS培地中37℃にて終夜培養した菌液0.1 mlを1.5 ml容の微量遠心機用チューブに入れた。蓋を開けた状態でアネロパック用の酸素不透過性バッグ中に入れ、酸素を吹き込んだ後バッグを密閉し、チューブの蓋を閉じて4℃にて保存した。菌の生残は、菌液を経日的にサンプリングし、適宜希釈後10 ml BCP加プレート寒天培地(栄研)に混釈し、アネロパックによる嫌気条件下37℃48時間培養後に生じたコロニーを計数することによって判定した。生残率が約10^-5となった時点での生残コロニー20ヶ所を選択し、MRS培地で培養後、再度同じ条件で生残性を確認した結果、うちOR1-9株、OR2-5株と命名した2株の生残性が、野生株OLL 2716よりも著しく高かった(図２)。また、MRS培地で培養した各菌をガンマ線滅菌した通常ヨーグルト中で同様に保存後生残性を確認した結果、やはりOR1-9株、OR2-5株の生残性が野生株OLL 2716よりも著しく高かった(図３)。
〔実施例３〕 Screening of mutant strains from 2716M strain with high survival at low temperature under oxygen filling was performed as follows. 0.1 ml of a bacterial solution obtained by culturing 2716M strain overnight in MRS medium at 37 ° C. was placed in a 1.5 ml microcentrifuge tube. The bag was put in an oxygen-impermeable bag for aneropack with the lid open, and the bag was sealed after blowing in oxygen, and the tube was closed and stored at 4 ° C. For the survival of the bacteria, the bacterial solution was sampled daily, diluted appropriately and mixed with 10 ml BCP-added plate agar medium (Eiken), and colonies formed after culturing at 37 ° C for 48 hours under anaerobic conditions with aneropack. Judgment was made by counting. As a result of selecting 20 survival colonies at the time when the survival rate reached about 10 ^-5 , cultivating in MRS medium and confirming the survival under the same conditions, OR1-9 strain, OR2-5 Survival of the two strains named strains was significantly higher than the wild strain OLL 2716 (FIG. 2). In addition, as a result of confirming survival after storage in normal yogurt sterilized by gamma radiation for each bacterium cultured in MRS medium, the survival of the OR1-9 and OR2-5 strains was still significantly higher than that of the wild strain OLL 2716. It was high (Figure 3).
Example 3

次いで、本変異がどの遺伝子への変異によるものかを調べた。OLL 2716株の全ゲノムDNA塩基配列は発明者らにより決定済である。変異株OR1-9、OR2-5株のゲノムDNA配列をイルミナ社Genetic Analyzer-IIを用いて解析し、OLL 2716株のゲノム配列と比較することによって変異位置を特定した。OR1-9株とOR2-5株は同等の高い生残性を持っていたため、両株で共通の変異に着目した。両株で共通の変異点および変異遺伝子は複数ヶ所認められたが、その中の1遺伝子の変異は、両株で異なる位置にフレームシフトが入ったことによる失活であったため、特に着目した。本遺伝子は、既知の遺伝子アミノ酸配列との相同性結果から、リボフラビン・トランスポーター遺伝子であると考えられた。OR1-9株では、配列番号：1に示したOLL 2716株リボフラビン・トランスポーター遺伝子DNA塩基配列中184番目の塩基位置に1塩基(G)の挿入、OR2-5株では同配列の176番目の塩基(G)の1塩基欠失があり、いずれもそのすぐ直下に終止コドンが生じて遺伝子が短く終端していた（図４)。
〔実施例４〕 Next, it was examined to which gene the mutation was caused. The entire genomic DNA base sequence of OLL 2716 strain has been determined by the inventors. The genomic DNA sequences of the mutant strains OR1-9 and OR2-5 were analyzed using Illumina Genetic Analyzer-II and compared with the genomic sequence of OLL 2716 strain to identify the mutation site. Since the OR1-9 and OR2-5 strains had the same high survival, we focused on common mutations in both strains. Although common mutation points and mutant genes were found in both strains, one of them was inactivated due to a frame shift at different positions in both strains. This gene was considered to be a riboflavin transporter gene based on homology results with known gene amino acid sequences. In OR1-9 strain, insertion of 1 base (G) at the 184th base position in the OLL 2716 riboflavin transporter gene DNA base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and in OR2-5 strain, the 176th position of the same sequence There was a single base deletion of the base (G), and in each case, a stop codon was generated immediately below and the gene was terminated shortly (FIG. 4).
Example 4

リボフラビン・トランスポーター遺伝子のフレームシフト変異が実際に生残性に関与していることを確認するために、OR2-5株の変異リボフラビン・トランスポーター遺伝子をOLL 2716株に導入した（概略を図５に示す）。表２に示したプライマー5、6を用いて、OR2-5株のゲノムDNAから上記フレームシフト変異を含むリボフラビン・トランスポーター遺伝子をPCR増幅し、ベクターpTERM09に結合してpOR-RT1プラスミドを作製した。pOR-RT1プラスミドのOLL 2716株への形質転換および二重交叉による遺伝子交換は、上記pMpol3プラスミドを用いたpol3への変異導入の場合と同様に行った（図５）。得られた遺伝子交換株は、リボフラビン・トランスポーター遺伝子中にOR2-5株と同じフレームシフト変異を持つ。この株をOR_1141株と命名した。OR_1141株のMRS培地中での生残性はOR2-5株とほぼ同等であった（図６）。この結果から、リボフラビン・トランスポーター遺伝子のフレームシフト変異によって酸素充満下低温保存時の生残性が高まることが確認された。 In order to confirm that the frameshift mutation of the riboflavin transporter gene is actually involved in survival, the mutant riboflavin transporter gene of the OR2-5 strain was introduced into the OLL 2716 strain (an outline is shown in FIG. 5). To show). Using primers 5 and 6 shown in Table 2, the riboflavin transporter gene containing the frameshift mutation was PCR amplified from the genomic DNA of the OR2-5 strain, and ligated to the vector pTERM09 to prepare the pOR-RT1 plasmid. . Transformation of the pOR-RT1 plasmid into the OLL 2716 strain and gene exchange by double crossover were performed in the same manner as in the case of introducing a mutation into pol3 using the pMpol3 plasmid (FIG. 5). The obtained gene exchange strain has the same frameshift mutation as the OR2-5 strain in the riboflavin transporter gene. This strain was named OR_1141 strain. The survival of OR_1141 strain in MRS medium was almost the same as that of OR2-5 strain (FIG. 6). From this result, it was confirmed that the frameshift mutation of the riboflavin transporter gene increased the survival at low temperature storage under oxygen fullness.

（表２）
プライマー５ TAATTCAATTGCATCCGCTGCT （配列番号：７）
プライマー６ GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC （配列番号：８） (Table 2)
Primer 5 TAATTCAATTGCATCCGCTGCT (SEQ ID NO: 7)
Primer 6 GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC (SEQ ID NO: 8)

〔実施例５〕
次いで、OLL 2716株からリボフラビン・トランスポーター遺伝子全域を欠失させた遺伝子破壊株を作製した（概略を図７に示す）。表３に示したプライマー7、8、9、10を用いたsplice-overlap extension PCR法により、OLL 2716株染色体DNAからリボフラビン・トランスポーター遺伝子コーディング領域全体を欠失したDNA断片を増幅した。このDNA断片をベクターpTERM09に結合し、pDeltaRT1プラスミドを作製した。pDeltaRT1プラスミドをOLL 2716株に形質転換し、二重交叉による遺伝子交換を上記同様に行った（図７）。最終ステップの継代培養は15μg/mlリボフラビンを含むMRS培地にて行った。得られたリボフラビン・トランスポーター遺伝子欠失株をd1141株と命名した。d1141株のMRS培地中での生残性もOR2-5株とほぼ同等であった（図８）。 Example 5
Subsequently, a gene-disrupted strain in which the entire riboflavin transporter gene was deleted from OLL 2716 strain was prepared (an outline is shown in FIG. 7). By a splice-overlap extension PCR method using primers 7, 8, 9, and 10 shown in Table 3, a DNA fragment lacking the entire riboflavin transporter gene coding region was amplified from the OLL 2716 chromosomal DNA. This DNA fragment was ligated to the vector pTERM09 to prepare a pDeltaRT1 plasmid. The pDeltaRT1 plasmid was transformed into OLL 2716 strain, and gene exchange by double crossover was performed in the same manner as above (FIG. 7). The subculture of the final step was performed in MRS medium containing 15 μg / ml riboflavin. The obtained riboflavin transporter gene deletion strain was designated as d1141 strain. The survival of the d1141 strain in the MRS medium was almost the same as that of the OR2-5 strain (FIG. 8).

（表３）
プライマー７ GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC （配列番号：９）
プライマー８ CTTTTAGAAAATATTGATGATTCCTCCATA （配列番号：１０）
プライマー９ TATGGAGGAATCATCAATATTTTCTAAAAG （配列番号：１１）
プライマー１０ TGCCGACTTCAACTCCCTGC （配列番号：１２） (Table 3)
Primer 7 GGGCTGGGTTGATTATAGTTGC (SEQ ID NO: 9)
Primer 8 CTTTTAGAAAATATTGATGATTCCTCCATA (SEQ ID NO: 10)
Primer 9 TATGGAGGAATCATCAATATTTTCTAAAAG (SEQ ID NO: 11)
Primer 10 TGCCGACTTCAACTCCCTGC (SEQ ID NO: 12)

〔実施例６〕
他の乳酸菌種でも同様の効果が認められるかを確認するため、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusについて検討した。Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus T-11株染色体DNA上のリボフラビン・トランスポーター遺伝子の塩基配列を配列番号：２に示した。リボフラビン・トランスポーター遺伝子を欠失させるため、表４に示したプライマー11、12、13、14を用いたsplice-overlap extension PCR法により、T-11株染色体DNAからリボフラビン・トランスポーター遺伝子コーディング領域全体を欠失したDNA断片を増幅した。このDNA断片をベクターpSG⁺E2に結合し、pDeltaLBRT1プラスミドを作製した。pSG⁺E2は、pSYE2(非特許文献5)の複製タンパク質遺伝子repA中に、上記pTERM09と同じ温度感受性変異が導入されたプラスミドベクターである。Serrorらの方法（Serror, P., T. Sasaki, S. D. Ehrlich, and E. Maguin. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:46-52.）により、pDeltaLBRT1プラスミドをT-11株に形質転換した。プラスミドを含む形質転換株の選択は25μg/mlエリスロマイシンを含むMRS寒天培地プレートを用い、32℃、アネロパックによる嫌気条件下での培養にて行った。二重交叉による遺伝子交換は、上記OLL 2716株からのd1141株の作製（図７）と同様に行った。こうして得られたリボフラビン・トランスポーター遺伝子欠失株をT-11_d0726株と命名した。T-11_d0726株はT-11株に比較して、MRS培地中での酸素充満下での生残性が向上した（図９）。また、T-11_d0726株とT-11株をスキムミルク培地（10% (w/v)スキムミルク、0.1% (w/v)酵母エキス）で37℃終夜培養し、凝固した培地をそのまま酸素充満下で保存したところ、やはりT-11_d0726株はT-11株に比較して、生残性が向上していた（図１０）。以上の結果から、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusにおいても、リボフラビン・トランスポーター遺伝子を欠失(失活)させることによって酸素充満下低温保存時の生残性を向上できることが示された。 Example 6
Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus was examined in order to confirm whether similar effects were observed in other lactic acid bacteria species. The base sequence of the riboflavin transporter gene on the chromosomal DNA of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus T-11 strain is shown in SEQ ID NO: 2. In order to delete the riboflavin transporter gene, the entire riboflavin transporter gene coding region was obtained from the T-11 strain chromosomal DNA by splice-overlap extension PCR using primers 11, 12, 13, and 14 shown in Table 4. A DNA fragment lacking was amplified. This DNA fragment was ligated to the vector pSG ⁺ E2 to prepare a pDeltaLBRT1 plasmid. pSG ⁺ E2 is a plasmid vector in which the same temperature sensitive mutation as pTERM09 is introduced into the replication protein gene repA of pSYE2 (Non-patent Document 5). The pDeltaLBRT1 plasmid was transformed into the T-11 strain by the method of Serror et al. (Serror, P., T. Sasaki, SD Ehrlich, and E. Maguin. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68: 46-52.) . Selection of the transformant containing the plasmid was carried out using an MRS agar medium plate containing 25 μg / ml erythromycin and culturing under anaerobic conditions at 32 ° C. and aneropack. Gene exchange by double crossover was performed in the same manner as in the production of the d1141 strain from the OLL 2716 strain (FIG. 7). The riboflavin transporter gene deletion strain thus obtained was designated as T-11_d0726 strain. The survival of the T-11_d0726 strain under the oxygen filling in the MRS medium was improved compared to the T-11 strain (FIG. 9). In addition, the T-11_d0726 and T-11 strains were cultured overnight at 37 ° C in skim milk medium (10% (w / v) skim milk, 0.1% (w / v) yeast extract), and the coagulated medium was left under oxygen-filled conditions. When preserved, the survival of T-11_d0726 strain was improved compared to the T-11 strain (FIG. 10). From the above results, it was shown that Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus can also improve survival at low temperature storage under oxygen-filled condition by deleting (inactivating) riboflavin transporter gene.

（表４）
プライマー１１ TTGGCCGCTTGGACTACGAC （配列番号：１３）
プライマー１２ ATTTGTCTTTTCGCAATTAGCATACCTCCA （配列番号：１４）
プライマー１３ TGGAGGTATGCTAATTGCGAAAAGACAAAT （配列番号：１５）
プライマー１４ TGTCGATATAAACGAACGAC （配列番号：１６） (Table 4)
Primer 11 TTGGCCGCTTGGACTACGAC (SEQ ID NO: 13)
Primer 12 ATTTGTCTTTTCGCAATTAGCATACCTCCA (SEQ ID NO: 14)
Primer 13 TGGAGGTATGCTAATTGCGAAAAGACAAAT (SEQ ID NO: 15)
Primer 14 TGTCGATATAAACGAACGAC (SEQ ID NO: 16)

先に述べたOLL 2716株からの酸素充満下低温保存で生残性が高い変異株の取得実施例では、pol3遺伝子に校正機能低下変異を導入して変異率を高めたミューテーター株(2716M株)を用いたが、それに限定されるものではなく、変異誘発処理として通常用いられるアルキル化剤などの変異剤、あるいは紫外線やＸ線照射などの方法を用いても構わない。 In the above-mentioned example of obtaining a mutant strain having high survival from low temperature storage under oxygen-filled OLL 2716 strain, a mutant mutant strain (2716M strain) in which mutated mutation was introduced into pol3 gene to increase mutation rate. However, the present invention is not limited thereto, and a mutagen such as an alkylating agent ordinarily used as a mutagenesis treatment, or a method such as ultraviolet ray or X-ray irradiation may be used.

以上の結果から、Lactobacillus gasseriおよびLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusにおいて、リボフラビン・トランスポーターの変異により酸素充満下低温保存時の生残性が向上することが確認された。現在までにゲノム情報が公開されているLactobacillus属乳酸菌13種18株について調べたところ、全てにリボフラビン・トランスポーターと考えられる遺伝子が存在している。このため本技術は実施例に示した2種のLactobacillusに限定されるものではなく、広くLactobacillus属乳酸菌種に応用できる可能性が高い。 From the above results, in Lactobacillus gasseri and Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, it was confirmed that the survival at the time of low-temperature storage under oxygen-filling was improved by mutation of riboflavin transporter. As a result of examining Lactobacillus genus Lactobacillus 13 species and 18 strains whose genome information has been disclosed so far, all genes that are considered to be riboflavin transporters exist. For this reason, this technique is not limited to two types of Lactobacillus shown in the Example, It is highly likely that it can be widely applied to Lactobacillus genus lactic acid bacteria.

Claims

Lactobacillus gasseri with enhanced oxygen tolerance characterized by having a gene having a base sequence in which guanine is inserted at the 184th position and / or guanine at the 176th position is deleted in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Lactic acid bacteria mutant.

A lactic acid bacterium mutant having enhanced oxygen tolerance, wherein the gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 is deleted, wherein the lactic acid bacterium mutant is a Lactobacillus gasseri lactic acid bacterium mutant or Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus lactic acid bacteria mutant, lactic acid bacteria mutant.

The lactic acid bacteria variant of Claim 1 or 2 which is Lactobacillus gasseri OR_1141 (NITE BP-840) or Lactobacillus gasseri d1141 (NITE BP-839).

A lactic acid bacterium mutant according to any one of claims 1 to 3 , a lactic acid bacterium mutant-containing product and / or a processed product thereof, for eradication of Helicobacter pylori and food and drink for infection protection.

A pharmaceutical product for preventing and / or treating Helicobacter pylori infection, comprising the lactic acid bacterium mutant according to any one of claims 1 to 3 , the lactic acid bacterium mutant-containing product, and / or a processed product thereof.

A method for screening a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
Mutation SEQ ID NO: guanine defects in insertion and / or 176 and guanine in 184 th gene having the nucleotide sequence set forth in 1, wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri bacteria METHODS
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) A step of storing the lactic acid bacterium mutant and the lactic acid bacterium wild strain obtained in (1) at low temperature under oxygen-filling, and
(3) A step of isolating a lactic acid bacterium mutant having a higher survival than a wild lactic acid bacterium .

A method for screening a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
Mutation SEQ ID NO:. A deficiency of a gene having a nucleotide sequence of 1 or 2, wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri bacteria or Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus bacteria, METHODS
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) A step of storing the lactic acid bacterium mutant and the lactic acid bacterium wild strain obtained in (1) at low temperature under oxygen-filling, and
(3) A step of isolating a lactic acid bacterium mutant having a higher survival than a wild lactic acid bacterium .

A method for screening a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
Mutation SEQ ID NO: guanine defects in insertion and / or 176 and guanine in 184 th gene having the nucleotide sequence set forth in 1, wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri bacteria METHODS
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) a step of detecting a mutation in the gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 of the lactic acid bacteria mutant obtained in (1); and
(3) In (2), the process of isolating the lactic acid bacteria mutant strain in which the mutation was detected as compared with the wild strain of lactic acid bacteria .

A method for screening a lactic acid bacterium mutant with enhanced oxygen tolerance, comprising the following steps (1) to (3):
Mutation SEQ ID NO:. A deficiency of a gene having a nucleotide sequence of 1 or 2, wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri bacteria or Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus bacteria, METHODS
(1) introducing a mutation into lactic acid bacteria to obtain a lactic acid bacteria mutant,
(2) a step of detecting a mutation in the gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 of the lactic acid bacteria mutant obtained in (1), and
(3) In (2), the process of isolating the lactic acid bacteria mutant strain in which the mutation was detected as compared with the wild strain of lactic acid bacteria .