JP5671339B2 - Yeast producing ethanol from xylose - Google Patents
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Description
本発明は、キシロースからエタノールを生産する酵母に関する。 The present invention relates to a yeast that produces ethanol from xylose.
近年，地球温暖化防止のためCO2排出削減の方策として、再生可能な資源であるバイオマスからのエタノール生産が脚光を浴びている。
従来はエタノール生産には糖蜜やデンプン資源が主として用いられてきたが、食糧競合の問題からリグノセルロースからのエタノール生産が注目されており、多くの研究開発がなされている。
リグノセルロースの構成糖は、グルコースやマンノースなどのC6糖のほか、キシロースやアラビノースなどのC5糖であり、バイオマス資源の有効利用のためには、C6糖のみならずC5糖からエタノールを効率よく生産する微生物の開発が必要である。In recent years, ethanol production from biomass, a renewable resource, has attracted attention as a measure to reduce CO 2 emissions to prevent global warming.
Conventionally, molasses and starch resources have been mainly used for ethanol production, but ethanol production from lignocellulose has attracted attention due to the problem of food competition, and much research and development has been done.
The constituent sugars of lignocellulose are C6 sugars such as glucose and mannose, as well as C5 sugars such as xylose and arabinose. For effective use of biomass resources, ethanol is efficiently produced from C5 sugars as well as C6 sugars. It is necessary to develop microorganisms that can be used.
現在、エタノール生産にはサッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）に代表される酵母が主に使用されている。サッカロマイセス・セレビシアはC6糖からのエタノール生産能が高く、エタノールに対する高い耐性を有している。
しかしながら、サッカロマイセス・セレビシアはC5糖を利用することができないため、現状ではピキア・スティピティス（Pichia stipitis）に代表されるキシロース資化能を有する酵母のキシロース分解にかかわる酵素遺伝子（キシロース還元酵素（XR）遺伝子、キシリトール脱水素酵素（XDH）遺伝子）をサッカロマイセス・セレビシアに導入して、キシロース利用能をもつ組み換え体を作製する研究が主流である（例えばHo et al. Appl.Environ. Microbiol. 64, 1852 (1998)（非特許文献１））。ピキア・スティピティスではXR, XDHをコードする遺伝子はそれぞれXYL1, XYL2と命名されている。Currently, yeasts represented by Saccharomyces cerevisiae are mainly used for ethanol production. Saccharomyces cerevisiae has high ability to produce ethanol from C6 sugar and has high tolerance to ethanol.
However, since Saccharomyces cerevisia cannot use C5 sugar, it is an enzyme gene (xylose reductase (XR)) related to xylose degradation of yeast having the ability to utilize xylose represented by Pichia stipitis at present. Research into the production of recombinants having the ability to use xylose by introducing a gene, xylitol dehydrogenase (XDH) gene, into Saccharomyces cerevisiae (for example, Ho et al. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1852). (1998) (Non-Patent Document 1)). In Pichia stipitis, the genes encoding XR and XDH are named XYL1 and XYL2, respectively.
しかし、これらの遺伝子はサッカロマイセス・セレビシアにとって外来遺伝子であるので、上記の方法で作製した酵母は組み換え体に該当し、外界への菌体の漏出を防ぐ手段が必要になるなど、その利用に様々な制約が生じるため好ましいものではない。 However, since these genes are foreign genes for Saccharomyces cerevisiae, the yeast produced by the above method corresponds to a recombinant, and there are various uses for it such as a means for preventing leakage of bacterial cells to the outside world. This is not preferable because of the limitations.
ところで、サッカロマイセス・セレビシアはキシロースを利用できないが、キシロースを分解するための酵素遺伝子を有している。DNAデータベース上でピキア・スティピティスのキシロース分解酵素遺伝子と相同性を有する遺伝子、すなわち、XYL1と相同性を有する遺伝子6種類（GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124w）、XYL2と相同性を有する遺伝子3種類（YLR070c, SOR1, SOR2）が報告されている。しかし、サッカロマイセス・セレビシアでは、キシロース分解にかかわるこれらの遺伝子群の発現は非常に弱いか、もしくは発現していないと考えられている。なお、サッカロマイセス・セレビシアはキシルロースを炭素源として生育できるので、キシルロースリン酸化酵素遺伝子（XKS1遺伝子）は酵母細胞内で機能していると考えられている。 By the way, Saccharomyces cerevisia cannot use xylose, but has an enzyme gene for decomposing xylose. 6 genes homologous to Pichia stippitis xylose degrading enzyme gene in the DNA database, that is, 6 genes homologous to XYL1 (GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124w), homologous to XYL2 Three types of genes (YLR070c, SOR1, SOR2) have been reported. However, in Saccharomyces cerevisiae, the expression of these genes involved in xylose degradation is considered to be very weak or not expressed. Since Saccharomyces cerevisiae can grow using xylulose as a carbon source, the xylulose kinase gene (XKS1 gene) is considered to function in yeast cells.
サッカロマイセス・セレビシア自身の有するキシロース分解遺伝子群を用いたキシロースからのエタノール生産の研究例としてはToivariらの報告（Toivari et al. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3681(2004)（非特許文献２））がある。この研究では、キシロース分解酵素遺伝子としてGRE3及びYLR070cが使用されている。これらの遺伝子はキシロース資化能を有するピキア・スティピティスのキシロース分解酵素遺伝子との相同性から選択されたものである。しかしながら、この研究によれば、作製された酵母はキシロース分解能を有するがエタノールを生産せず、キシリトールを顕著に蓄積するという問題点がある。
本発明は、サッカロマイセス・セレビシアなどの酵母自身に由来するキシロース分解酵素をコードする遺伝子を利用することにより、好ましくは組み換え体ではない、キシロース利用能を有する酵母（キシロース資化性酵母）、ひいてはキシロースからのエタノール生産能に優れた酵母を提供することを目的とする。 The present invention uses a gene encoding a xylose-degrading enzyme derived from a yeast such as Saccharomyces cerevisiae, and is preferably not a recombinant yeast having xylose-utilizing yeast (xylose-utilizing yeast), and thus xylose. It aims at providing the yeast excellent in the ethanol production ability from.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、宿主酵母に導入する遺伝子につき、キシロース分解酵素の一つであるキシリトール脱水素酵素遺伝子として、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を利用すれば、驚くべきことに従来のYLR070c酵素遺伝子を導入した場合よりもキシリトール脱水素酵素活性が高い酵母が得られることを見出した。また、宿主酵母が本来有する（内因性の）ソルビトール脱水素酵素遺伝子の発現を活性化させることにより、上記と同様、キシリトール脱水素酵素活性が高い酵母が得られることを見出した。そして、このようにして得られた酵母は、キシロース利用能を有する酵母（キシロース資化性酵母）であり、キシロースからエタノールを生産するのに使用することができることを見出して、本発明を完成した。 As a result of intensive research in order to solve the above problems, the present inventors have encoded sorbitol dehydrogenase as a xylitol dehydrogenase gene, which is one of the xylose degrading enzymes, for genes to be introduced into host yeast. Surprisingly, it was found that a yeast having a higher xylitol dehydrogenase activity than that obtained by introducing the conventional YLR070c enzyme gene can be obtained. Further, it has been found that by activating the expression of the endogenous (endogenous) sorbitol dehydrogenase gene inherent in the host yeast, a yeast having high xylitol dehydrogenase activity can be obtained as described above. The yeast thus obtained is a yeast having xylose utilization ability (xylose-utilizing yeast) and found that it can be used to produce ethanol from xylose, thereby completing the present invention. .
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入され又は当該遺伝子の発現が活性化され、キシリトールからキシルロースへの変換活性が前記導入又は前記活性化前よりも増強された形質転換酵母。
上記(1)の酵母としては、例えば、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入され、キシリトールからキシルロースへの変換活性が当該導入前よりも増強された酵母が好ましく挙げられる。
上記(1)の酵母としては、例えば、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものが挙げられ、具体的には、当該染色体上のLEU2の下流に挿入されたものが挙げられる。
上記(1)の酵母において、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、例えば、SOR1又はSOR2が挙げられる。また、当該遺伝子としては、例えば、宿主酵母に由来するものが挙げられる。That is, the present invention relates to the following.
(1) A transformed yeast in which a gene encoding sorbitol dehydrogenase is introduced so that it can be expressed or the expression of the gene is activated, and the conversion activity from xylitol to xylulose is enhanced compared with that before the introduction or activation .
Preferred examples of the yeast of (1) above include yeasts into which a gene encoding sorbitol dehydrogenase has been introduced so that it can be expressed, and the conversion activity from xylitol to xylulose has been enhanced more than before the introduction.
Examples of the yeast of (1) above include those in which a gene encoding sorbitol dehydrogenase has been inserted so that it can be expressed on the chromosome of the host yeast, specifically, downstream of LEU2 on the chromosome. The inserted one is listed.
In the yeast of (1) above, examples of the gene encoding sorbitol dehydrogenase include SOR1 and SOR2. In addition, examples of the gene include those derived from host yeast.
上記(1)の酵母としては、例えば、さらに、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入され又は当該遺伝子の発現が活性化されたものが挙げられる。ここで、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又は前記キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されていてもよく、具体的には、当該染色体上のLEU2の下流に挿入されていてもよい。また、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又は前記キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、宿主酵母に由来するものが挙げられる。
上記(1)の酵母としては、例えば、キシロース、キシリトール及びキシルロースを、それぞれ、キシリトール、キシルロース及びキシルロース５リン酸に変換する能力を有するものが挙げられる。
上記(1)の酵母としては、例えば、キシロースからエタノールを生産する能力を有するものが挙げられる。
上記(1)の酵母において、宿主となる酵母としては、例えば、六炭糖資化能を有するが五炭糖資化能を有しないものが挙げられ、具体的には、サッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。Examples of the yeast of (1) above include those in which a gene encoding xylose reductase and / or a gene encoding xylulose phosphorylase is introduced so as to be expressed or the expression of the gene is activated. Can be mentioned. Here, the gene encoding xylose reductase and / or the gene encoding xylulose phosphorylase may be inserted so as to be capable of expression on the chromosome of the host yeast, for example, specifically, the chromosome It may be inserted downstream of the upper LEU2. Examples of the gene encoding xylose reductase and / or the gene encoding xylulose phosphorylase include those derived from host yeast.
Examples of the yeast of (1) above include those having the ability to convert xylose, xylitol and xylulose into xylitol, xylulose and xylulose pentaphosphate, respectively.
Examples of the yeast of (1) above include those having the ability to produce ethanol from xylose.
In the yeast of the above (1), examples of yeast serving as a host include those having hexose sugar utilization ability but not having pentose sugar utilization ability, specifically, yeast belonging to the genus Saccharomyces Is mentioned.
（２）ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むプラスミド。
上記(2)のプラスミドにおいて、ソルビトール脱水素酵素としては、例えば、以下の(a)又は(b)のタンパク質が挙げられる。
(a) 配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質
上記(2)のプラスミドにおいて、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、例えば、以下の(c)又は(d)のDNAが挙げられる。
(c) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
ここで、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、具体的には、SOR1又はSOR2が挙げられる。
上記(2)のプラスミドとしては、例えば、キシロース還元酵素をコードする遺伝子をさらに含むものが挙げられる。ここで、当該遺伝子としては、例えば、GRE3、YJR096w、YPR1、GCY1、ARA1及びYDR124wからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
上記(2)のプラスミドとしては、例えば、キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子をさらに含むものが挙げられる。ここで、当該遺伝子としては、例えば、XKS1が挙げられる。
上記(2)のプラスミドとしては、例えば、LEU2（ロイシン合成遺伝子）をさらに含み、かつ当該LEU2の下流にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものが挙げられる。(2) A plasmid containing a gene encoding sorbitol dehydrogenase.
In the plasmid (2), examples of the sorbitol dehydrogenase include the following protein (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16
(b) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16, and having sorbitol dehydrogenase activity; Examples of the gene encoding sorbitol dehydrogenase in the plasmid include the following DNA (c) or (d).
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15
(d) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 and encodes a protein having sorbitol dehydrogenase activity
Here, specific examples of the gene encoding sorbitol dehydrogenase include SOR1 and SOR2.
Examples of the plasmid (2) include those further containing a gene encoding xylose reductase. Here, examples of the gene include at least one selected from the group consisting of GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, and YDR124w.
Examples of the plasmid (2) include those further containing a gene encoding xylulose kinase. Here, examples of the gene include XKS1.
Examples of the plasmid (2) include, for example, LEU2 (leucine synthesis gene), and a gene encoding sorbitol dehydrogenase, a gene encoding xylose reductase, and xylulose kinase in the downstream of the LEU2. Examples include those containing at least one selected from the group consisting of genes to be encoded.
（３）上記(2)のプラスミドを含む形質転換酵母。
上記(3)の酵母としては、例えば、含有するプラスミド中に含まれるソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種が、宿主酵母に由来するものである酵母が挙げられる。
上記(3)の酵母としては、例えば、宿主酵母が六炭糖資化能を有するが五炭糖資化能を有しない酵母であるもの挙げられ、具体的には、宿主酵母がサッカロマイセス属に属する酵母であるものが挙げられる。
（４）上記(1)または(3)の酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することを含む、エタノールの生産方法。(3) A transformed yeast comprising the plasmid of (2) above.
The yeast of (3) is selected from the group consisting of, for example, a gene encoding sorbitol dehydrogenase, a gene encoding xylose reductase, and a gene encoding xylulose phosphorylase contained in the contained plasmid. A yeast in which at least one kind is derived from the host yeast can be mentioned.
Examples of the yeast of (3) above include those in which the host yeast has hexose assimilability but not pentose utilization, and specifically, the host yeast belongs to the genus Saccharomyces. The yeast which belongs is mentioned.
(4) A method for producing ethanol, comprising culturing the yeast of (1) or (3) above and collecting ethanol from the resulting culture.
本発明によれば、キシロース分解酵素の一つであるキシリトール脱水素酵素遺伝子として、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、キシリトールからキシルロースへの変換活性が、当該遺伝子の導入前よりも増強された酵母が提供される。また、宿主酵母が本来有する（内因性の）ソルビトール脱水素酵素遺伝子の発現が活性化され、キシリトールからキシルロースへの変換活性が、当該遺伝子発現の活性化前よりも増強された酵母が提供される。SOR1などの遺伝子がコードするソルビトール脱水素酵素は、従来使用されたYLR070c酵素よりキシリトール脱水素酵素活性が高いことが明らかとなった（表２参照）。このため、ソルビトール脱水素酵素をキシリトール脱水素酵素として用いる本発明の酵母は、キシロース資化能（キシロース利用能）を有し、エタノールを生産することができる。したがって、本発明により、従来のYLR070cを使用した際に生じる問題、すなわち、キシロース分解能を有するがエタノールを生産せず、副生成物であるキシリトールを蓄積するという問題を、回避することができる。 According to the present invention, a gene encoding sorbitol dehydrogenase is introduced as a xylitol dehydrogenase gene, which is one of the xylose degrading enzymes, and the conversion activity from xylitol to xylulose is enhanced compared to that before the introduction of the gene. Yeast is provided. In addition, the expression of the intrinsic (endogenous) sorbitol dehydrogenase gene of the host yeast is activated, and a yeast in which the conversion activity from xylitol to xylulose is enhanced as compared with that before the activation of the gene expression is provided. . It was revealed that sorbitol dehydrogenase encoded by genes such as SOR1 has higher xylitol dehydrogenase activity than the conventionally used YLR070c enzyme (see Table 2). For this reason, the yeast of the present invention using sorbitol dehydrogenase as xylitol dehydrogenase has xylose utilization ability (xylose utilization ability) and can produce ethanol. Therefore, according to the present invention, the problem that occurs when using the conventional YLR070c, that is, the problem of having xylose resolution but not producing ethanol and accumulating xylitol as a by-product can be avoided.
また、本発明においては、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入することにより、より一層、キシロースからのエタノール生産能に優れた酵母を提供することができる。特に、酵母染色体上のLEU2遺伝子（アミノ酸合成系遺伝子の一種であるロイシン合成遺伝子）の下流に、ソルビトール脱水素酵素遺伝子を組み込むことにより、例えばURA3、HIS3及びTRP1といった各遺伝子の下流に組み込んだ場合に比べて、キシロースからのエタノール生産能を更に向上させた酵母を提供することができる。 Further, in the present invention, by inserting a gene encoding sorbitol dehydrogenase into a host yeast chromosome so that it can be expressed, it is possible to provide a yeast that is further excellent in ethanol-producing ability from xylose. . In particular, when a sorbitol dehydrogenase gene is incorporated downstream of the LEU2 gene (leucine synthesis gene, which is a type of amino acid synthesis gene) on the yeast chromosome, for example, when incorporated downstream of each gene such as URA3, HIS3, and TRP1. As compared with the above, it is possible to provide a yeast that further improves the ability to produce ethanol from xylose.
さらに、本発明においては、高いキシリトール脱水素活性を有するソルビトール脱水素酵素を、サッカロマイセス・セレビシアなどのサッカロマイセス属に属する酵母から見出したことにより、酵母自身の遺伝子を利用するセルフ・クローニングの系の開発が可能となるのであり、より安全なエタノール生産株を得ることができる。 Furthermore, in the present invention, a sorbitol dehydrogenase having high xylitol dehydrogenation activity has been found from yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, thereby developing a self-cloning system using the yeast's own gene. Thus, a safer ethanol production strain can be obtained.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2008-172010号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.
This specification includes the entire specification of Japanese Patent Application No. 2008-172010, which is the basis for claiming priority of the present application. In addition, all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, and publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.
１．本発明の概要
本発明は、酵母自身のキシロース分解酵素の活性を高めるために、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を発現可能に酵母に導入し、キシリトール脱水素酵素として利用することを特徴の一つとするものである。また、本発明は、酵母自身のキシロース分解酵素の活性を高めるために、当該酵母が本来有する（内因性の）ソルビトール脱水素酵素遺伝子の発現を活性化することを特徴の一つとするものである。
五炭糖資化能を有する酵母は、酵母内の種々の酵素を用いてキシロースを分解し、エタノールを生産することができる。代表的なキシロース分解酵素群として、キシロース還元酵素（XR）、キシリトール脱水素酵素（XDH）およびキシルロースリン酸化酵素（XK）があげられる（図１）。特に、ピキア・スティピティス等のピキア属に属する酵母は、キシロース分解酵素群の活性が高いため、高いキシロース資化能を有することが知られている。
一方、酵母の中には、キシロース分解酵素群が実質的に機能していない、いわゆる休眠状態にあるために、キシロースなどの五炭糖資化能を有さない酵母が存在する。例えば、サッカロマイセス属に属する酵母は、６種のキシロース還元酵素遺伝子（GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124w）、３種のキシリトール脱水素酵素遺伝子（YRL070c、ソルビトール脱水素酵素遺伝子（SOR1, SOR2））などのキシロース分解酵素群をコードする遺伝子群を有しているにも拘わらず、キシロースを利用してエタノールを生産することができない。
1. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is characterized in that a gene encoding sorbitol dehydrogenase is introduced into yeast so that it can be expressed and used as xylitol dehydrogenase in order to enhance the activity of the yeast's own xylose-degrading enzyme. It is intended. In addition, the present invention is characterized in that in order to enhance the activity of the xylose-degrading enzyme of the yeast itself, the expression of the intrinsic (endogenous) sorbitol dehydrogenase gene of the yeast is activated. .
Yeast having the ability to assimilate pentose can produce ethanol by degrading xylose using various enzymes in the yeast. Representative xylose-degrading enzyme groups include xylose reductase (XR), xylitol dehydrogenase (XDH), and xylulose kinase (XK) (FIG. 1). In particular, yeast belonging to the genus Pichia such as Pichia stipitsis is known to have a high ability to assimilate xylose because the activity of the xylose-degrading enzyme group is high.
On the other hand, some yeasts do not have pentose assimilation ability such as xylose because they are in a so-called dormant state in which the xylose-degrading enzyme group does not substantially function. For example, yeast belonging to the genus Saccharomyces has six xylose reductase genes (GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124w), three xylitol dehydrogenase genes (YRL070c, sorbitol dehydrogenase genes (SOR1, SOR2) Despite having a gene group encoding a group of xylose-degrading enzymes such as)), ethanol cannot be produced using xylose.
そこで、五炭糖資化能を有さない酵母自身が有しているキシロース分解酵素遺伝子を機能させる目的で、ピキア・スティピティスのキシロース分解酵素遺伝子に対する相同性を指標に、自身由来の遺伝子を酵母に導入する試みがなされている。具体的には、サッカロマイセス属に属する酵母において、６種のキシロース還元酵素をコードする遺伝子の内、ピキアのキシロース還元酵素遺伝子と最も相同性の高いGRE3遺伝子（相同性62％、アミノ酸での相同性57％）、及び３種のキシリトール脱水素酵素遺伝子の内、ピキアのキシリトール脱水素酵素遺伝子と有意な相同性を持つYLR070c遺伝子（相同性61％、アミノ酸での相同性46％）がサッカロマイセス属に属する酵母に導入された。しかしながら、この試みによっては、サッカロマイセス属に属する酵母は、エタノールを生産することはできなかった（Toivari et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 70, p. 3681 (2004)）。 Therefore, for the purpose of functioning the xylose-degrading enzyme gene possessed by yeast that does not have pentose utilization capability, the gene derived from itself is used as an index with the homology of Pichia stipitis to the xylose-degrading enzyme gene as an index. Attempts have been made to introduce it. Specifically, in the yeast belonging to the genus Saccharomyces, the GRE3 gene (62% homology, homology with amino acids) having the highest homology with the Pichia xylose reductase gene among the six xylose reductase encoding genes. 57%), and among the three xylitol dehydrogenase genes, the YLR070c gene (61% homology, 46% homology with amino acids) with significant homology to the Pichia xylitol dehydrogenase gene belongs to the genus Saccharomyces It was introduced into the yeast to which it belongs. However, by this attempt, yeast belonging to the genus Saccharomyces could not produce ethanol (Toivari et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 70, p. 3681 (2004)).
これに対し、本発明者らは、従来のYLR070cの代わりに、SOR1遺伝子等がコードするソルビトール脱水素酵素を利用すれば、サッカロマイセス属に属する酵母などの五炭糖資化能を有しない酵母にキシリトール脱水素酵素活性を獲得させ得ることを見出した。SOR1は、ピキア・スティピティスのキシリトール脱水素酵素に対して、酵素をコードする遺伝子配列での相同性が58%、アミノ酸配列での相同性が53％であり、YLR070cとの対比においてこれまで注目されていなかった。ところが、本発明において、SOR1酵素は、意外にも従来のYLR070c酵素よりキシリトール脱水素酵素活性が高いことが明らかとなった。これに基づき、本発明はキシリトール脱水素酵素としてYLR070c酵素の代わりにソルビトール脱水素酵素を用いることで、キシリトール脱水素酵素活性が増強され、五炭糖資化能を有するという特性をもった酵母を提供することが可能となった。具体的には、宿主酵母にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を発現可能に導入する、又は宿主酵母の内因性のソルビトール脱水素酵素遺伝子の発現を活性化することで、上記特性を有する酵母を提供することが可能となった。さらに、宿主酵母への遺伝子導入の態様として、ソルビトール脱水素酵素遺伝子を宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入することにより、特にロイシン合成遺伝子（LEU2）の下流に組み込むことにより、上記特性がより向上した酵母を提供することが得られた。 On the other hand, the present inventors can use a sorbitol dehydrogenase encoded by the SOR1 gene or the like instead of the conventional YLR070c, to a yeast having no pentose utilization ability such as a yeast belonging to the genus Saccharomyces. It has been found that xylitol dehydrogenase activity can be acquired. SOR1 has 58% homology in the gene sequence encoding the enzyme and 53% homology in the amino acid sequence with respect to Pichia stippitis xylitol dehydrogenase. It wasn't. However, in the present invention, it was unexpectedly revealed that the SOR1 enzyme has higher xylitol dehydrogenase activity than the conventional YLR070c enzyme. Based on this, the present invention uses a sorbitol dehydrogenase in place of the YLR070c enzyme as a xylitol dehydrogenase, thereby enhancing the xylitol dehydrogenase activity and the ability to utilize pentoses. It became possible to provide. Specifically, by introducing a gene encoding sorbitol dehydrogenase into the host yeast so that it can be expressed, or by activating the expression of the endogenous sorbitol dehydrogenase gene of the host yeast, a yeast having the above characteristics can be obtained. It became possible to provide. Furthermore, as a mode of gene introduction into the host yeast, the above characteristics can be further improved by inserting the sorbitol dehydrogenase gene into the host yeast chromosome so that it can be expressed, in particular, downstream of the leucine synthesis gene (LEU2). It was obtained to provide improved yeast.
また、本発明はこの酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することによるエタノールの生産方法を提供するものでもある。本発明では、副生成物として生産されるキシリトールの量を、従来法に比べて格段に少なくすることが可能である。
さらに、本発明では、形質転換対象の酵母由来のキシロース分解酵素遺伝子を用いて宿主酵母を形質転換することを特徴の一つとするものである。本発明では、高い活性を有するキシリトール脱水素酵素（XDH）をサッカロマイセス・セレビシアなどのサッカロマイセス属に属する酵母から見出したことにより、当該酵母自身の遺伝子を利用するセルフ・クローニングの系の開発が可能となる。したがって、本発明は、より安全な非組換えエタノール生産株を提供するものであり、この株を用いてエタノールを簡便に生産することができる。The present invention also provides a method for producing ethanol by culturing this yeast and collecting ethanol from the resulting culture. In the present invention, the amount of xylitol produced as a by-product can be significantly reduced as compared with the conventional method.
Furthermore, in the present invention, one of the features is that host yeast is transformed using a xylose-degrading enzyme gene derived from the yeast to be transformed. In the present invention, by finding xylitol dehydrogenase (XDH) having high activity from yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, it is possible to develop a self-cloning system using the yeast's own gene. Become. Therefore, the present invention provides a safer non-recombinant ethanol production strain, and ethanol can be easily produced using this strain.
２．本発明の酵母及びその用途
前述の通り、本発明は、キシロース資化能を有する酵母を提供するために、遺伝子導入対象となる宿主酵母にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入すること、すなわち宿主酵母をソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子で形質転換することを特徴の一つとする。また、本発明は、キシロース資化能を有する酵母を提供するために、宿主酵母の内因性のソルビトール脱水素酵素遺伝子の発現を活性化することを特徴の一つとする。このようにソルビトール脱水素酵素遺伝子が導入された酵母、又は内因性の当該遺伝子の発現が活性化された酵母においては、ソルビトール脱水素酵素がキシリトール脱水素酵素として機能し、上記導入又は上記活性化前よりもキシリトールからキシルロースへの変換活性が増強されている。
2. Yeast of the present invention and use thereof As described above, the present invention introduces a gene encoding sorbitol dehydrogenase into a host yeast as a gene transfer target in order to provide a yeast having xylose utilization capability, One of the features is that the host yeast is transformed with a gene encoding sorbitol dehydrogenase. Another feature of the present invention is to activate the expression of an endogenous sorbitol dehydrogenase gene in the host yeast in order to provide a yeast having the ability to assimilate xylose. Thus, in yeast into which the sorbitol dehydrogenase gene has been introduced, or yeast in which the expression of the endogenous gene has been activated, sorbitol dehydrogenase functions as xylitol dehydrogenase, and the introduction or activation described above. The conversion activity from xylitol to xylulose is enhanced than before.
本発明においては、遺伝子導入／形質転換等の対象となる宿主酵母は、キシロースなどの五炭糖の資化能を有していない酵母であることが好ましい。前記酵母は遺伝子導入／形質転換の前に五炭糖資化能を有していないものであればよく、グルコースなどの六炭糖の資化能を有していてもよい。「五炭糖資化能」は、キシロースなどの五炭糖を炭素源として生育する能力をいう。五炭糖資化能を有する酵母は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中で生育可能であるため、五炭糖資化能は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中における酵母の生育程度を600 nmまたは660 nmなどの波長での濁度を測定することで確認することができる。
ここで、五炭糖資化能を有していない酵母は、特に限定されるわけではないが、例えば、サッカロマイセス属に属する酵母などを挙げることができる。さらに、サッカロマイセス属に属する酵母としては、CEN.PK2-1C株などのサッカロマイセス・セレビシアを挙げることができる。In the present invention, the host yeast to be targeted for gene transfer / transformation is preferably a yeast that does not have the ability to assimilate pentoses such as xylose. The yeast may have any ability to assimilate pentose before gene introduction / transformation, and may have ability to assimilate hexose such as glucose. “5 carbon sugar assimilation ability” refers to the ability to grow using 5 carbon sugars such as xylose as a carbon source. Since yeast having pentose assimilation ability can grow in a medium to which only pentose is added as a carbon source, the pentose utilization ability is in a medium to which only pentose is added as a carbon source. The degree of yeast growth in can be confirmed by measuring turbidity at a wavelength such as 600 nm or 660 nm.
Here, the yeast having no pentose assimilation ability is not particularly limited, and examples thereof include yeast belonging to the genus Saccharomyces. Furthermore, examples of yeast belonging to the genus Saccharomyces include Saccharomyces cerevisiae such as CEN.PK2-1C strain.
本発明において、ソルビトール脱水素酵素は、例えば、SOR1酵素およびSOR2酵素を挙げることができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR1酵素は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR2酵素は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明では、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR1酵素もしくはSOR2酵素又はそれらの変異体も、ソルビトール脱水素酵素に含まれる。 In the present invention, examples of the sorbitol dehydrogenase include SOR1 enzyme and SOR2 enzyme. For example, the SOR1 enzyme derived from Saccharomyces cerevisia is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and the SOR2 enzyme derived from Saccharomyces cerevisia is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. In the present invention, SOR1 enzyme or SOR2 enzyme derived from Saccharomyces cerevisia or a mutant thereof is also included in sorbitol dehydrogenase.
SOR1酵素の変異体は、(i) 配列番号１４で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号１４で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号１４で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質などが挙げられる。 The mutant of SOR1 enzyme is (i) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. A protein in which ˜2 amino acids have been deleted, (ii) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 , More preferably 1 to 2 amino acids substituted with other amino acids, (iii) 1 to several (for example 1 to 10, preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 More preferably 1 to 3 and even more preferably 1 to 2 amino acids) and (iv) a protein in which these mutations are combined and a protein having sorbitol dehydrogenase activity. Be mentioned
SOR2酵素の変異体は、(i) 配列番号１６で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号１６で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号１６で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質などが挙げられる。
本発明において、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR1酵素の変異体は、好ましくはSOR2酵素であり、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR2酵素の変異体は、好ましくはSOR1酵素である。SOR1酵素およびSOR2酵素は互いに99.7％の相同性（アミノ酸配列）を有する。The mutant of SOR2 enzyme is (i) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. A protein in which ˜2 amino acids have been deleted, (ii) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 , More preferably 1 to 2 amino acids substituted with other amino acids, (iii) 1 to several (for example 1 to 10, preferably 1 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 More preferably 1 to 3 and even more preferably 1 to 2 amino acids) and (iv) a protein in which these mutations are combined and a protein having sorbitol dehydrogenase activity. Be mentioned
In the present invention, the mutant of the SOR1 enzyme derived from Saccharomyces cerevisia is preferably the SOR2 enzyme, and the mutant of the SOR2 enzyme derived from Saccharomyces cerevisia is preferably the SOR1 enzyme. The SOR1 enzyme and the SOR2 enzyme have 99.7% homology (amino acid sequence) to each other.
ここで、「ソルビトール脱水素酵素活性」とは、NAD+の存在下でソルビトールをフルクトースに変換する活性を意味する。本発明において、SOR1酵素又はSOR2酵素の変異体はソルビトール脱水素酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、変異体は、例えば配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約10％以上のソルビトール脱水素酵素活性を有していればよい。
タンパク質の有するソルビトール脱水素酵素活性は、公知の方法で測定することができる。また、本発明において、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は酵母内でキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子として機能すると考えられるため、ソルビトール脱水素酵素活性は、キシリトール脱水素酵素活性を解析することによっても測定できる。
キシリトール脱水素酵素活性は、補酵素としてNAD+及び／又はNADP+を用いて、キシリトールをキシルロースに変換する活性を示す。タンパク質の有するキシリトール脱水素酵素活性は、例えば、酵母から調製した細胞抽出液を用いて測定することができ、キシリトールを基質として、NADHの減少量を340 nmの吸光度を測定することによって確認することができる。Here, “sorbitol dehydrogenase activity” means the activity of converting sorbitol into fructose in the presence of NAD +. In the present invention, the mutant of SOR1 enzyme or SOR2 enzyme is not particularly limited as long as it has sorbitol dehydrogenase activity, but the mutant is, for example, a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16. As long as it has about 10% or more of sorbitol dehydrogenase activity.
The sorbitol dehydrogenase activity of the protein can be measured by a known method. In the present invention, since the gene encoding sorbitol dehydrogenase is considered to function as a gene encoding xylitol dehydrogenase in yeast, sorbitol dehydrogenase activity is determined by analyzing xylitol dehydrogenase activity. Can also be measured.
The xylitol dehydrogenase activity indicates the activity of converting xylitol into xylulose using NAD + and / or NADP + as a coenzyme. The xylitol dehydrogenase activity of proteins can be measured, for example, using a cell extract prepared from yeast, and the amount of NADH decreased by measuring absorbance at 340 nm using xylitol as a substrate. Can do.
配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じたアミノ酸配列は、これをコードするDNAによって作製することができる。このようなDNAは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））、Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz（1987）Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel（1988）Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。また、上記のような変異を有するタンパク質を調製するためにDNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16, an amino acid sequence in which a mutation such as deletion, substitution or addition has been made in one to several amino acids can be prepared by DNA encoding the same. Such DNA is described in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)), Kunkel (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6, etc. It can be prepared according to a method such as mechanical mutagenesis. In order to introduce a mutation into DNA in order to prepare a protein having the mutation as described above, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio) Can be used.
本発明において、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は、ソルビトール脱水素酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばSOR1およびSOR2を挙げることができる。SOR1は配列番号１３で示される塩基配列からなるDNAであり、配列番号１４で示されるSOR1酵素のアミノ酸配列をコードする。SOR2は配列番号１５で示される塩基配列からなるDNAであり、配列番号１６で示されるSOR2酵素のアミノ酸配列をコードする。
本発明において、ソルビトール脱水素酵素をコードするDNAは、例えば、配列番号１３又は１５で示される塩基配列を基にプライマーを設計し、酵母ライブラリー又はゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術により得ることができる。In the present invention, the gene encoding sorbitol dehydrogenase is a gene containing a base sequence encoding sorbitol dehydrogenase, and examples thereof include SOR1 and SOR2. SOR1 is a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and encodes the amino acid sequence of the SOR1 enzyme represented by SEQ ID NO: 14. SOR2 is a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and encodes the amino acid sequence of the SOR2 enzyme represented by SEQ ID NO: 16.
In the present invention, DNA encoding sorbitol dehydrogenase can be obtained from a yeast library or a genomic library by gene amplification technology by designing a primer based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, for example. .
本発明で使用されるソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は、ソルビトール脱水素酵素の変異体をコードする遺伝子を含む。ソルビトール脱水素酵素の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。
本発明において、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR1の変異体は、好ましくはSOR2であり、サッカロマイセス・セレビシア由来のSOR2の変異体は、好ましくはSOR1である。SOR1およびSOR2は互いに99.9％の相同性（遺伝子配列）を有する。The gene encoding sorbitol dehydrogenase used in the present invention includes a gene encoding a mutant of sorbitol dehydrogenase. A gene encoding a mutant of sorbitol dehydrogenase hybridizes under stringent conditions with, for example, a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, and sorbitol DNA encoding a protein having dehydrogenase activity is included.
In the present invention, the SOR1 mutant derived from Saccharomyces cerevisiae is preferably SOR2, and the SOR2 mutant derived from Saccharomyces cerevisiae is preferably SOR1. SOR1 and SOR2 have 99.9% homology (gene sequence) to each other.
このようなDNAは、配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNA又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））等を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。 Such a DNA is obtained by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. using a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 15 or a fragment thereof as a probe. Can be obtained from the library. For the method for preparing the library, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) and the like can be referred to. Commercially available cDNA libraries and genomic libraries may also be used.
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。
Hybridization can be carried out by known methods. Hybridization methods include, for example, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997)), etc. You can refer to it.
また、本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAには、例えば、配列番号１３又は１５で示される塩基配列と少なくとも90％以上、さらに好ましくは99％以上、さらに一層好ましくは99.7％以上、特に好ましくは99.9％の同一性（相同性）を有する塩基配列を含むDNAが含まれる。同一性を示す値は、BLASTなどの公知のプログラムを利用することにより算出することができる。 In the present specification, the DNA that hybridizes under stringent conditions includes, for example, at least 90 % or more, more preferably 99% or more, and still more preferably, the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15. DNA containing a base sequence having 99.7% or more, particularly preferably 99.9% identity (homology) is included. A value indicating identity can be calculated by using a known program such as BLAST.
また、配列番号１３又は１５で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、例えば、配列番号１３又は１５で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むDNAが挙げられる。このようなDNAとしては、例えば、(i) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失したDNA、(ii) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基に置換したDNA、(iii) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加したDNAおよび(iv) それらの変異が組み合わされたDNAであって、かつソルビトール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAなどが挙げられる。
なお、タンパク質の有するソルビトール脱水素酵素活性およびその測定方法については、前述の説明が同様に適用できる。In addition, the DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 is, for example, Examples thereof include DNA containing a nucleotide sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in several nucleic acids. Examples of such DNA include (i) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15, More preferably, DNA in which 1 to 2 bases are deleted, (ii) 1 to several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 DNA preferably having 1 to 3 bases, more preferably 1 to 2 bases substituted with other bases, (iii) 1 to several (for example 1 to 10) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 , Preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 and even more preferably 1 to 2 bases) and (iv) DNA in which these mutations are combined, and sorbitol dehydration Examples include DNA encoding a protein having elementary enzyme activity.
In addition, the above-mentioned description is applicable similarly about the sorbitol dehydrogenase activity which a protein has, and its measuring method.
本発明において、塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al.（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。 In the present invention, the base sequence can be confirmed by sequencing by a conventional method. For example, the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) can be used. It is also possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer.
本発明において、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を当該遺伝子の由来と同種の宿主酵母に導入することにより、酵母自身のソルビトール脱水素酵素（キシリトール脱水素酵素）の活性が遺伝子導入前よりも向上する。本発明において、キシリトール脱水素酵素だけでなく、その他のキシロース分解酵素（キシロース還元酵素、キシルロースリン酸化酵素など）をコードする遺伝子も宿主酵母に導入し、これらの酵素活性を向上させることが好ましい。
非組換え酵母を作製する場合は、宿主酵母に導入されるソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子、キシロース還元酵素をコードする遺伝子又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、宿主酵母と同種由来の遺伝子であることが必要である。In the present invention, by introducing a gene encoding sorbitol dehydrogenase into a host yeast of the same kind as the origin of the gene, the activity of the yeast's own sorbitol dehydrogenase (xylitol dehydrogenase) is improved as compared with that before gene introduction. To do. In the present invention, it is preferable to introduce genes encoding not only xylitol dehydrogenase but also other xylose degrading enzymes (xylose reductase, xylulose phosphorylase, etc.) into the host yeast to improve these enzyme activities. .
When producing non-recombinant yeast, the gene encoding sorbitol dehydrogenase, the gene encoding xylose reductase or the gene encoding xylulose kinase introduced into the host yeast is derived from the same species as the host yeast. It must be a gene.
キシロース還元酵素は、補酵素としてNADPH及び／又はNADHを用いてキシロースをキシリトールに転化する酵素である。本発明では、いずれの酵母由来のキシロース還元酵素をコードする遺伝子も用いることができるが、五炭糖資化能を有さない酵母の有する遺伝子であることが好ましい。キシロース還元酵素をコードする遺伝子は、特に限定されるわけではないが、例えばサッカロマイセス属に属する酵母由来の遺伝子、GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124wなどを挙げることができ、好ましくはGRE3である。キシロース還元酵素をコードする遺伝子は、形質転換対象の宿主酵母に由来するものを用いることが好ましい。
本発明において、キシロース還元酵素をコードする遺伝子は、キシロース還元酵素の遺伝子の変異体をコードする遺伝子を含む。
本発明においてキシロース還元酵素をコードする遺伝子は、前述のソルビトール脱水素酵素の遺伝子の調製方法と同様の方法で調製することができる。Xylose reductase is an enzyme that converts xylose into xylitol using NADPH and / or NADH as a coenzyme. In the present invention, a gene encoding a xylose reductase derived from any yeast can be used, but a gene possessed by a yeast having no pentose utilization ability is preferable. The gene encoding xylose reductase is not particularly limited, and examples thereof include genes derived from yeast belonging to the genus Saccharomyces, GRE3, YJR096w, YPR1, GCY1, ARA1, YDR124w, preferably GRE3. is there. The gene encoding xylose reductase is preferably derived from the host yeast to be transformed.
In the present invention, the gene encoding xylose reductase includes a gene encoding a mutant of the gene for xylose reductase.
In the present invention, the gene encoding xylose reductase can be prepared by the same method as the method for preparing the gene for sorbitol dehydrogenase described above.
キシルロースリン酸化酵素は、キシルロースをリン酸化して、キシルロース-5-リン酸に変換する酵素である。本発明では、いずれの酵母由来のキシロースリン酸化酵素をコードする遺伝子も用いることができるが、五炭糖資化能を有さない酵母の有する遺伝子であることが好ましい。例えば、サッカロマイセス属に属する酵母由来のXKS1を用いることができる。キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、形質転換対象の宿主酵母に由来するものを用いることが好ましい。
本発明において、キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、キシルロースリン酸化酵素の遺伝子の変異体をコードする遺伝子を含む。
本発明においてキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、前述のソルビトール脱水素酵素の遺伝子の調製方法と同様の方法で調製することができる。Xylulose phosphorylase is an enzyme that phosphorylates xylulose and converts it into xylulose-5-phosphate. In the present invention, a gene encoding xylose kinase derived from any yeast can be used, but a gene possessed by a yeast that does not have the ability to assimilate pentose is preferable. For example, XKS1 derived from yeast belonging to the genus Saccharomyces can be used. As the gene encoding xylulose kinase, it is preferable to use a gene derived from the host yeast to be transformed.
In the present invention, the gene encoding xylulose kinase includes a gene encoding a mutant of the gene for xylulose kinase.
In the present invention, a gene encoding xylulose kinase can be prepared by the same method as the method for preparing the gene for sorbitol dehydrogenase described above.
本発明において、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて、同遺伝子を同種の酵母に導入する。好ましくは、ソルビトール脱水素酵素だけでなく、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子も同様に酵母に導入する。ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子、キシロース還元酵素をコードする遺伝子及びキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子は、一つのプラスミドに含まれてもよいし、それぞれ別のプラスミドに含まれてもよい。本発明はこれら遺伝子を含有するプラスミドを含む。 In the present invention, a plasmid containing a gene encoding sorbitol dehydrogenase is used to introduce the gene into the same kind of yeast. Preferably, not only sorbitol dehydrogenase but also a gene encoding xylose reductase and / or a gene encoding xylulose phosphorylase is introduced into yeast as well. The gene encoding sorbitol dehydrogenase, the gene encoding xylose reductase, and the gene encoding xylulose phosphorylase may be contained in one plasmid or in different plasmids. The present invention includes plasmids containing these genes.
本発明のプラスミドは、酵母発現用のベクターに上記遺伝子を発現可能に挿入することで作製することができる。ベクターへの遺伝子の挿入は、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応などを利用することができる。例えば、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、得られたDNA断片を、ベクター中の適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトなどに挿入することでベクターに連結する方法などを採用することができる。 The plasmid of the present invention can be prepared by inserting the above gene into a yeast expression vector so that the gene can be expressed. The gene can be inserted into the vector using a ligase reaction, a topoisomerase reaction, or the like. For example, adopt a method in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the resulting DNA fragment is inserted into an appropriate restriction enzyme site or multicloning site in the vector and linked to the vector. Can do.
本発明で使用されるプラスミドは、その基本となるベクターの由来には特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。例えば、pGADT7、pAUR135などの市販のベクターを使用することもできる。 The plasmid used in the present invention is not particularly limited to the origin of the basic vector. For example, E. coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, and the like can be used. For example, commercially available vectors such as pGADT7 and pAUR135 can also be used.
本発明のプラスミドは、目的遺伝子を発現させ得る限り、マルチクローニングサイト、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選択マーカーカセットなどを含んでもよい。また、DNAを挿入する際に必要であれば、適宜リンカーや制限酵素部位を付加してもよい。これらの操作は、当分野でよく知られている慣用の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。 The plasmid of the present invention may contain a multicloning site, a promoter, an enhancer, a terminator, a selection marker cassette and the like as long as the target gene can be expressed. Further, if necessary when inserting DNA, a linker or a restriction enzyme site may be appropriately added. These manipulations can be performed using conventional genetic manipulation techniques well known in the art.
プロモーターは、目的遺伝子の上流に組み込むことができる。プロモーターは、形質転換体において目的タンパク質を適切に発現できるものであれば、特に限定されないが、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーターなどを使用することができる。本発明で使用されるプロモーターは、セルフ・クローニング系の開発上、酵母由来のプロモーターであることが好ましい。
ターミネーターは、目的遺伝子の下流に組み込むことができる。本発明で使用されるターミネーターは、セルフ・クローニング系の開発上、酵母由来のターミネーターであることが好ましい。
本発明において、酵母で目的遺伝子を効率よく発現させるために、本発明のプラスミドは、PGKプロモーター及び／又はPGKターミネーターを含むことが好ましい。The promoter can be incorporated upstream of the gene of interest. The promoter is not particularly limited as long as it can appropriately express the target protein in the transformant, and PGK promoter, ADH promoter, TDH promoter, ENO promoter and the like can be used. The promoter used in the present invention is preferably a yeast-derived promoter for the development of a self-cloning system.
The terminator can be incorporated downstream of the target gene. The terminator used in the present invention is preferably a yeast-derived terminator for the development of a self-cloning system.
In the present invention, the plasmid of the present invention preferably contains a PGK promoter and / or PGK terminator in order to efficiently express the target gene in yeast.
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ロイシン合成酵素遺伝子、ウラシル合成酵素遺伝子などを挙げることができる。
ベクターにロイシン、ヒスチジン、トリプトファンなどのアミノ酸合成遺伝子カセット又はウラシル合成遺伝子カセットが含まれる場合は、当該アミノ酸又はウラシルを含まない培地で酵母を培養することにより、形質転換酵母を選択することができる。Examples of the selection marker include drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene, leucine synthase gene, uracil synthase gene and the like.
When the vector contains an amino acid synthesis gene cassette such as leucine, histidine, tryptophan, or a uracil synthesis gene cassette, a transformed yeast can be selected by culturing the yeast in a medium not containing the amino acid or uracil.
本発明のプラスミドを遺伝子導入対象の宿主酵母に導入することで、形質転換酵母を作製することができる。このように作製される形質転換酵母は本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用される形質転換前の宿主酵母としては、前述のように、例えばサッカロマイセス・セレビシアなどのサッカロマイセス属に属する酵母が挙げられる。しかし必ずしもこれに限定されるものではなく、五炭糖資化能を有する酵母、例えばピキア属に属する酵母、クルイベロマイセス属に属する酵母およびカンジダ属に属する酵母を使用することができる。また、本発明のプラスミドに含まれるキシロース分解酵素をコードする遺伝子は、遺伝子を導入する宿主酵母に由来する遺伝子のほか、外来種のものも用いることができる。A transformed yeast can be produced by introducing the plasmid of the present invention into a host yeast to be transfected. The transformed yeast thus produced is included in the scope of the present invention.
Examples of the host yeast before transformation used in the present invention include yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae as described above. However, the present invention is not necessarily limited thereto, and yeast having pentose utilization ability, for example, yeast belonging to the genus Pichia, yeast belonging to the genus Kluyveromyces, and yeast belonging to the genus Candida can be used. Moreover, as the gene encoding the xylose-degrading enzyme contained in the plasmid of the present invention, a gene derived from the host yeast into which the gene is introduced, as well as a foreign species can be used.
宿主酵母に本発明のプラスミドを導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法などの公知の方法が挙げられる。これらの方法により、本発明の形質転換酵母が提供される。 The method for introducing the plasmid of the present invention into the host yeast is not particularly limited, and examples thereof include known methods such as lithium acetate method, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method and the like. . By these methods, the transformed yeast of the present invention is provided.
また、本発明は、相同組換えによりキシロース分解酵素をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれた形質転換酵母もその範囲に含む。すなわち、本発明は、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子、さらにはキシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入された形質転換酵母も含むものである。
このように宿主酵母の染色体上に遺伝子が挿入される場合、挿入部位は、限定はされないが、当該染色体上のLEU2の下流であることが、挿入遺伝子の発現をより一層亢進させることができるため、特に好ましい。なお、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子等を、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入する方法としては、限定はされず、公知の遺伝子組換え技術を利用した方法等を用いることができる。The present invention also includes a transformed yeast in which a gene encoding a xylose-degrading enzyme is integrated into the genome by homologous recombination. That is, according to the present invention, a gene encoding sorbitol dehydrogenase, further a gene encoding xylose reductase and / or a gene encoding xylulose phosphorylase is inserted into a host yeast chromosome so that it can be expressed. It also includes transformed yeast.
Thus, when a gene is inserted into the chromosome of the host yeast, the insertion site is not limited, but being downstream of LEU2 on the chromosome can further enhance the expression of the inserted gene. Is particularly preferred. The method for inserting a gene encoding sorbitol dehydrogenase or the like into a host yeast chromosome so that it can be expressed is not limited, and a method using a known gene recombination technique can be used.
さらに、本発明の形質転換酵母としては、内因性のキシロース分解酵素をコードする遺伝子の発現が活性化されたものも含まれる。すなわち、本発明は、宿主酵母の染色体上にもともと存在するソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子の発現、さらにはキシロース還元酵素をコードする遺伝子及び／又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の発現が活性化された形質転換酵母も含むものである。ここで、「キシロース分解酵素をコードする遺伝子の発現が活性化された」とは、宿主酵母内に存在する当該遺伝子が、外部からプロモーターを導入すること、又は当該遺伝子自身の持つプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより、発現可能な形で活性化され、目的タンパク質を適切に発現できる状態となっていることを意味する。
このように内因性遺伝子の発現を活性化させる方法としては、限定はされないが、目的タンパク質を適切に発現できるプロモーターを、公知の遺伝子組換え技術を用いて、染色体上に遺伝子置換により組み込む方法等が挙げられる。遺伝子置換の方法としては、Akada et al. Yeast 23: 399-405 (2006)（非特許文献）の方法を用いることができる。置換するプロモーターとしては、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーター等の公知のプロモーターを使用することができる。Furthermore, the transformed yeast of the present invention includes those in which the expression of a gene encoding an endogenous xylose-degrading enzyme is activated. That is, the present invention provides expression of a gene encoding sorbitol dehydrogenase originally present on the host yeast chromosome, and further expression of a gene encoding xylose reductase and / or a gene encoding xylulose kinase. It also includes activated transformed yeast. Here, “expression of a gene encoding a xylose-degrading enzyme is activated” means that the gene existing in the host yeast introduces a promoter from the outside, or the promoter of the gene itself is more powerful. By substituting with a proper promoter, it is activated in an expressible form and is in a state where the target protein can be appropriately expressed.
The method for activating the expression of the endogenous gene in this way is not limited, but a method for incorporating a promoter capable of appropriately expressing the target protein into the chromosome by gene replacement using a known gene recombination technique, etc. Is mentioned. As a gene replacement method, the method of Akada et al. Yeast 23: 399-405 (2006) (non-patent document) can be used. As a promoter to be replaced, a known promoter such as PGK promoter, ADH promoter, TDH promoter, ENO promoter, etc. can be used.
本発明の形質転換酵母は、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子をキシリトール脱水素酵素遺伝子として含むため、キシリトールからキシルロースへの変換活性が増強されている。また、本発明の形質転換酵母がキシロース還元酵素及び／又はキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子をさらに含む場合は、キシロースからキシリトール及び／又はキシルロースからキシルロース-5-リン酸への変換能をさらに有する。そして、このような酵素活性の増強により、本発明はキシロース利用能を有する酵母を提供することができる。本発明の形質転換酵母はキシロース資化能を有し、好ましくはキシロースからエタノールを生産することが可能となる。 Since the transformed yeast of the present invention contains a gene encoding sorbitol dehydrogenase as a xylitol dehydrogenase gene, the conversion activity from xylitol to xylulose is enhanced. Further, when the transformed yeast of the present invention further contains a gene encoding xylose reductase and / or xylulose phosphorylase, the ability to convert xylose to xylitol and / or xylulose to xylulose-5-phosphate is further increased. Have. And by such an enzyme activity enhancement, this invention can provide the yeast which has xylose utilization ability. The transformed yeast of the present invention has the ability to assimilate xylose, and preferably produces ethanol from xylose.
本発明の形質転換酵母は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って培養することができる。当業者であれば、SD培地、SCX培地、YPD培地、YPX培地などの公知の培地から適切な培地を選択し、好ましい培養条件の下で酵母を培養することができる。液体培地で酵母を培養する場合は、振盪培養が好ましい。 The transformed yeast of the present invention can be cultured according to a usual method used for yeast culture. A person skilled in the art can select an appropriate medium from known mediums such as SD medium, SCX medium, YPD medium, YPX medium, and cultivate yeast under preferable culture conditions. When culturing yeast in a liquid medium, shaking culture is preferred.
また、本発明の形質転換酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することで、キシロースからエタノールを生産させることができる。
エタノールを生産させる場合、キシロースを10〜150 g/L、好ましくは70 g/Lの存在下に本発明の形質転換酵母を培養する。本培養の前に、形質転換酵母を前培養しても良い。前培養は、例えば、本発明の形質転換酵母を少量の培地に接種し、12〜24時間培養すればよい。本培養の培養量の0.1〜10％、好ましくは1％の前培養液を本培養の培地に加え、本培養を開始する。本培養は、0.5〜200時間、好ましくは10〜150時間、より好ましくは24〜137時間、20〜40℃、好ましくは30℃で振盪培養する。
生産されたエタノールは、上記のように本発明の酵母を培養して得られる培養物から採取することができる。培養物とは、培養液（培養上清）、培養酵母または培養酵母の破砕物等を意味する。エタノールは公知の精製方法により培養物から精製し、採取することができる。本発明において、エタノールは形質転換酵母から主に培養上清中に分泌されるため、培養上清から採取することが好ましい。Moreover, ethanol can be produced from xylose by culturing the transformed yeast of the present invention and collecting ethanol from the resulting culture.
When ethanol is produced, the transformed yeast of the present invention is cultured in the presence of xylose at 10 to 150 g / L, preferably 70 g / L. Prior to the main culture, the transformed yeast may be precultured. The preculture may be performed, for example, by inoculating a small amount of the transformed yeast of the present invention and culturing for 12 to 24 hours. A preculture solution of 0.1 to 10%, preferably 1%, of the culture amount of the main culture is added to the main culture medium, and the main culture is started. In the main culture, shaking culture is performed at 20 to 40 ° C, preferably 30 ° C for 0.5 to 200 hours, preferably 10 to 150 hours, more preferably 24 to 137 hours.
The produced ethanol can be collected from a culture obtained by culturing the yeast of the present invention as described above. The culture means a culture solution (culture supernatant), cultured yeast, a disrupted culture yeast, or the like. Ethanol can be purified and collected from the culture by a known purification method. In the present invention, since ethanol is mainly secreted from the transformed yeast into the culture supernatant, it is preferably collected from the culture supernatant.
エタノールの生産量は、培地に含まれるエタノールを液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、市販のエタノール測定キットで分析することで測定できる。
また、エタノールの生産量を測定することにより、本発明の形質転換酵母のエタノール生産能を確認することができる。The amount of ethanol produced can be measured by analyzing ethanol contained in the medium with liquid chromatography, gas chromatography, or a commercially available ethanol measurement kit.
Moreover, the ethanol production ability of the transformed yeast of the present invention can be confirmed by measuring the production amount of ethanol.
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
〔GRE3、SOR1、YLR070c、XKS1、PGKプロモーターおよびPGKターミネーターのPCRによる合成〕
下記のオリゴヌクレオチド１〜１２を合成し、PCR反応のためのプライマーとして使用し、GRE3, SOR1, XKS1, PGKプロモーターおよびPGKターミネーターの各DNA断片を得た。テンプレートはサッカロマイセス・セレビシアCEN.PK2-1C株から抽出された染色体DNA、また、DNAポリメラーゼはPrimeSTAR HS DNA polymerase （タカラバイオ株式会社）を使用してPCRを行った。
PCR反応にはサーマルサイクラーPxE 0.5（サーモエレクトロン社）を使用した。
GRE3, SOR1, YLR070c, XKS1, PGKプロモーターおよびPGKターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシア由来である。GRE3は、ピキア・スティピティスのXYL1（キシロース還元酵素（XR））と相同性を有し、YLR070cおよびSOR1ピキア・スティピティスのXYL2（キシロース脱水素酵素（XDH））と相同性を有するタンパク質である。XKS1はキシルロースリン酸化酵素である。PGKプロモーターおよびPGKターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシアにおいて機能することが知られている。[Synthesis by PCR of GRE3, SOR1, YLR070c, XKS1, PGK promoter and PGK terminator]
The following oligonucleotides 1 to 12 were synthesized and used as primers for the PCR reaction to obtain DNA fragments of GRE3, SOR1, XKS1, PGK promoter and PGK terminator. PCR was performed using chromosomal DNA extracted from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C strain as a template, and PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase.
A thermal cycler PxE 0.5 (Thermo Electron) was used for the PCR reaction.
GRE3, SOR1, YLR070c, XKS1, PGK promoter and PGK terminator are derived from Saccharomyces cerevisiae. GRE3 is a protein having homology with P. staphytis XYL1 (xylose reductase (XR)) and homology with YLR070c and SOR1 Pichia staphytis XYL2 (xylose dehydrogenase (XDH)). XKS1 is a xylulose kinase. The PGK promoter and PGK terminator are known to function in Saccharomyces cerevisiae.
（GRE3）
オリゴヌクレオチド１：GGAATTCCATATGACTGACTTAACTACACAAG （配列番号１）
オリゴヌクレオチド２：CCGGAATTCTCATTCCGGGCCCTCAATG （配列番号２）
（SOR1）
オリゴヌクレオチド３：GGCCCCCGGGATGTCTCAAAATAGTAACCCTG （配列番号３）
オリゴヌクレオチド４：GGCCCCCGGGTCATTCAGGACCAAAGATAATAG （配列番号４）
(YLR070c)
オリゴヌクレオチド５：GGAATTCCAGATGACTGACTTAACTA （配列番号５）
オリゴヌクレオチド６：CCGGAATTCCTTGGATGCCAAAAGTTA （配列番号６）
(XKS1)
オリゴヌクレオチド７：GGAATTCCATATGGTTTGTTCAGTAATTCAG （配列番号７）
オリゴヌクレオチド８：CCGGAATTCTTAGATGAGAGTCTTTTCCAG （配列番号８）
(PGKプロモーター)
オリゴヌクレオチド９：GGCGGGATCCGCTTCACCCTCATACTATTA （配列番号９）
オリゴヌクレオチド１０：GGCGCGTCGACTGTTTTTATATTTGTTGTAAA （配列番号１０）
(PGKターミネーター)
オリゴヌクレオチド１１：GGCGCGTCGACATTGAATTGAATTGAAATCG （配列番号１１）
オリゴヌクレオチド１２：GGCGCCTGCAGGAATTTTCGAGTTATTAAAC （配列番号１２）(GRE3)
Oligonucleotide 1: GGAATTCCATATGACTGACTTAACTACACAAG (SEQ ID NO: 1)
Oligonucleotide 2: CCGGAATTCTCATTCCGGGCCCTCAATG (SEQ ID NO: 2)
(SOR1)
Oligonucleotide 3: GGCCCCCGGGATGTCTCAAAATAGTAACCCTG (SEQ ID NO: 3)
Oligonucleotide 4: GGCCCCCGGGTCATTCAGGACCAAAGATAATAG (SEQ ID NO: 4)
(YLR070c)
Oligonucleotide 5: GGAATTCCAGATGACTGACTTAACTA (SEQ ID NO: 5)
Oligonucleotide 6: CCGGAATTCCTTGGATGCCAAAAGTTA (SEQ ID NO: 6)
(XKS1)
Oligonucleotide 7: GGAATTCCATATGGTTTGTTCAGTAATTCAG (SEQ ID NO: 7)
Oligonucleotide 8: CCGGAATTCTTAGATGAGAGTCTTTTCCAG (SEQ ID NO: 8)
(PGK promoter)
Oligonucleotide 9: GGCGGGATCCGCTTCACCCTCATACTATTA (SEQ ID NO: 9)
Oligonucleotide 10: GGCGCGTCGACTGTTTTTATATTTGTTGTAAA (SEQ ID NO: 10)
(PGK terminator)
Oligonucleotide 11: GGCGCGTCGACATTGAATTGAATTGAAATCG (SEQ ID NO: 11)
Oligonucleotide 12: GGCGCCTGCAGGAATTTTCGAGTTATTAAAC (SEQ ID NO: 12)
PCRによる増幅条件は以下のとおりである。
得られたSOR1断片の塩基配列をABI PRISM 3730xl DNA Analyzer用いて解析した。SOR1の塩基配列（1074 bp）を配列番号１３および図７に示す。なお、当該塩基配列によりコードされるSOR1酵素のアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
The base sequence of the obtained SOR1 fragment was analyzed using ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer. The nucleotide sequence of SOR1 (1074 bp) is shown in SEQ ID NO: 13 and FIG. The amino acid sequence of the SOR1 enzyme encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
〔プラスミドの作製〕
実施例１で増幅されたPGKプロモーターをpUC18プラスミドのBamHI, SalI切断部位に、PGKターミネーターをSalI, PstI切断部位に組み込み、pUC-PGKPTプラスミドを得た。得られたpUC-PGKPTのSalI切断部位に平滑末端化した増幅XKS1断片, GRE3断片,SOR1断片（実施例１）を挿入し、それぞれpUC-XK, pUC-GRE, pUC-SORプラスミドを得た（図２）。
次に、pUC-GREをBamHI, SphIで切断し、得られた2.0 kb断片を平滑末端化し、pUC-XKのSmaI切断部位に挿入した（図３）。挿入により得られたプラスミド(pUC-GRE-XK)をBamHIで切断し平滑末端化した。この断片にBamHI, SphIで切断したpUC-SORを平滑末端化して得られた2.0kb断片を挿入し、pUC-XYLプラスミドを得た（図３）。
次に、pUC-XYLをEcoRI, SphIで切断し、GRE3,SOR1およびXKS1を含む7.0kb断片を得た。この断片をpGADT7プラスミド（Clontech, Mountain View, CA）をEcoRI, SphIで切断して得られた7.0kb断片に挿入し、pGAD-XYLプラスミドを得た（図４）。
[Preparation of plasmid]
The PGK promoter amplified in Example 1 was incorporated into the BamHI and SalI cleavage sites of the pUC18 plasmid and the PGK terminator was incorporated into the SalI and PstI cleavage sites to obtain a pUC-PGKPT plasmid. The blunt-ended amplified XKS1, GRE3, and SOR1 fragments (Example 1) were inserted into the SalI cleavage site of the obtained pUC-PGKPT to obtain pUC-XK, pUC-GRE, and pUC-SOR plasmids, respectively ( Figure 2).
Next, pUC-GRE was cleaved with BamHI and SphI, and the resulting 2.0 kb fragment was blunt-ended and inserted into the SmaI cleavage site of pUC-XK (FIG. 3). The plasmid (pUC-GRE-XK) obtained by insertion was cleaved with BamHI to make blunt ends. A 2.0 kb fragment obtained by blunting pUC-SOR cleaved with BamHI and SphI was inserted into this fragment to obtain a pUC-XYL plasmid (FIG. 3).
Next, pUC-XYL was cleaved with EcoRI and SphI to obtain a 7.0 kb fragment containing GRE3, SOR1 and XKS1. This fragment was inserted into a 7.0 kb fragment obtained by cleaving pGADT7 plasmid (Clontech, Mountain View, CA) with EcoRI and SphI to obtain a pGAD-XYL plasmid (FIG. 4).
〔pGAD-070cおよびpGAD-SORの作製と形質転換〕
実施例１に示したプライマーで増幅したYLR070c遺伝子断片とSOR1遺伝子断片とを末端平滑化した。これらの断片を、それぞれ、pGADT7プラスミドをHindIIIで切断して末端平滑化して得られた断片に挿入して、pGAD-070cプラスミドおよびpGAD-SORプラスミドを得た。
CEN.PK2-1C株への形質転換はItoらの方法（J.Bacteriol. 153, 163-168,1983）に従って行った。簡潔に述べると、初期対数期（OD660=0.4〜0.8）の酵母細胞10 mlを遠心分離にかけ、培地を除去し、2 mlのTE緩衝液で1回洗浄した。菌体を2 mlの酢酸リチウム溶液（TE緩衝液、0.1M 酢酸リチウム）に懸濁し、30℃で1時間振盪培養した。遠心分離により集菌し、上清を除き、菌体を0.6 ml酢酸リチウム-グリセロール溶液（TE緩衝液、0.1 M 酢酸リチウム、15 % w/v グリセロール）に懸濁した。0.3 mlの細胞懸濁液を滅菌した1.5 ml容エッペンドルフチューブに移し、これに1μgのプラスミドDNAを添加した。これに0.7 ml PEG溶液（50 % w/v ポリエチレングリコール4000）を添加し、よく懸濁した後、30℃で1時間静置培養を行った。この溶液100μlをロイシンを含まないSC-Leu培地（グルコース 20 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）を含有する寒天プレート上に平板化した。各々のプレートから生育してきたコロニーを1株選び、形質転換体とした。
[Production and transformation of pGAD-070c and pGAD-SOR]
The ends of the YLR070c gene fragment and SOR1 gene fragment amplified with the primers shown in Example 1 were blunted. These fragments were respectively inserted into fragments obtained by cleaving the pGADT7 plasmid with HindIII and blunt-ended to obtain pGAD-070c plasmid and pGAD-SOR plasmid.
Transformation into CEN.PK2-1C strain was performed according to the method of Ito et al. (J. Bacteriol. 153, 163-168, 1983). Briefly, 10 ml of early log phase (OD660 = 0.4-0.8) yeast cells were centrifuged, the medium was removed and washed once with 2 ml TE buffer. The cells were suspended in 2 ml of lithium acetate solution (TE buffer, 0.1 M lithium acetate) and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 hour. The cells were collected by centrifugation, the supernatant was removed, and the cells were suspended in 0.6 ml lithium acetate-glycerol solution (TE buffer, 0.1 M lithium acetate, 15% w / v glycerol). 0.3 ml of the cell suspension was transferred to a sterile 1.5 ml Eppendorf tube, and 1 μg of plasmid DNA was added thereto. To this, 0.7 ml PEG solution (50% w / v polyethylene glycol 4000) was added and suspended well, followed by stationary culture at 30 ° C. for 1 hour. 100 μl of this solution was plated on an agar plate containing SC-Leu medium (glucose 20 g / L, yeast nitrogen base (without amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution) without leucine. One colony growing from each plate was selected and used as a transformant.
〔YLR070c活性およびSOR1活性の測定〕
SC-Leu培地10 mlにpGAD-070cまたはpGAD-SOR形質転換体を植菌し、30℃で一夜培養した。酵母細胞を遠心分離にかけ、培地を除去しY-PER Yeast Protein Extraction Reagent（Pierce, Rockford, IL）を500μl加え懸濁した後、室温で20分間振盪した。14,000 rpmで10分間遠心分離をして、細胞抽出液を得た。形質転換酵母pGAD-070cおよびpGAD-SORのキシリトール脱水素酵素活性は、キシリトールを基質として、NADHの減少量を340 nmの吸光度を測定することによって測定した。１分当たり１μmolのNAD+を還元する活性を1Uとし、形質転換体の細胞抽出液中のタンパク質1 mg当たりの活性（U/mg）を求めた。酵母CEN.PK2-1C株にpGADT7、pGAD-070cおよびpGAD-SORを形質転換して得られた形質転換酵母（pGADT7、pGAD-070cおよびpGAD-SOR）のキシリトール脱水素酵素活性を表２に示す。[Measurement of YLR070c activity and SOR1 activity]
PGAD-070c or pGAD-SOR transformant was inoculated into 10 ml of SC-Leu medium and cultured overnight at 30 ° C. The yeast cells were centrifuged, the medium was removed, 500 μl of Y-PER Yeast Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL) was added and suspended, and the mixture was shaken at room temperature for 20 minutes. The cell extract was obtained by centrifugation at 14,000 rpm for 10 minutes. The xylitol dehydrogenase activity of the transformed yeasts pGAD-070c and pGAD-SOR was measured by measuring the absorbance of NADH using xylitol as a substrate and measuring the absorbance at 340 nm. The activity for reducing 1 μmol of NAD + per minute was defined as 1 U, and the activity per 1 mg of protein (U / mg) in the cell extract of the transformant was determined. Table 2 shows the xylitol dehydrogenase activity of transformed yeasts (pGADT7, pGAD-070c, and pGAD-SOR) obtained by transforming the yeast CEN.PK2-1C strain with pGADT7, pGAD-070c, and pGAD-SOR. .
この結果、SOR1酵素はYLR070c酵素よりもキシリトール脱水素酵素活性が１０倍高いことが明らかとなった。YLR070cは、ピキア・スティピティスのキシロース分解酵素（XYL2）に対する相同性がSOR1よりも高いため、YLR070c酵素の方がSOR1酵素よりも高いキシロース分解活性を示すと推測されていた。しかしながら、この結果により、驚くべきことに従来の推測とは反対に、SOR1酵素の方がYLR070c酵素よりも酵素活性が高いことが示された。
As a result, it was revealed that the SOR1 enzyme has 10 times higher xylitol dehydrogenase activity than the YLR070c enzyme. Since YLR070c has a higher homology to Pichia stipitis xylose-degrading enzyme (XYL2) than SOR1, it was estimated that YLR070c enzyme exhibits higher xylose-degrading activity than SOR1 enzyme. However, this result surprisingly showed that the SOR1 enzyme has a higher enzyme activity than the YLR070c enzyme, contrary to the conventional assumption.
〔酵母CEN.PK.2-1CのpGAD-XYLによる形質転換〕
酵母CEN.PK.2-1CのpGAD-XYLによる形質転換は、実施例３に記載された方法によって行った。
[Transformation of yeast CEN.PK.2-1C with pGAD-XYL]
Transformation of yeast CEN.PK.2-1C with pGAD-XYL was performed by the method described in Example 3.
〔形質転換体のキシロース発酵〕
500 ml容バッフル付き三角フラスコに、ロイシンを含まない液体SCX-Leu培地（キシロース20 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）100 mlを入れ、一夜同培地で前培養した形質転換体（pGAD-XYL）の種培養液を１％加えた。その後、30℃で120 rpmで振盪培養した。経時的に培養液1 mlをサンプリングし、キシロース、エタノールの含有量を下記実施例７に記載する高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフィー（GC）により測定するためのサンプルとした。
[Xylose fermentation of transformants]
In a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle, add 100 ml of liquid SCX-Leu medium (xylose 20 g / L, yeast nitrogen base (no amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution) without leucine. 1% seed culture solution of the pre-cultured transformant (pGAD-XYL) was added. Thereafter, the cells were cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm. 1 ml of the culture solution was sampled over time and used as a sample for measuring the content of xylose and ethanol by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) described in Example 7 below.
〔発酵サンプルのHPLCおよびGC分析〕
実施例６でサンプリングした培養液について、酵母の生育程度を確認するために、660 nmでの濁度（660 nmでの吸光度（OD660））を測定した。また、サンプリングした培養液を遠心分離して菌体を除き、上清をポリプロピレン製フィルター（0.2μm, ホワットマン）でろ過を行いサンプルとした。サンプル中のキシロースの含有量をHPLCにより、エタノールの含有量をHPLCまたはGCにより下記の条件で分析した。[HPLC and GC analysis of fermentation samples]
For the culture solution sampled in Example 6, turbidity at 660 nm (absorbance at 660 nm (OD660)) was measured in order to confirm the degree of yeast growth. The sampled culture solution was centrifuged to remove the cells, and the supernatant was filtered with a polypropylene filter (0.2 μm, Whatman) to obtain a sample. The xylose content in the sample was analyzed by HPLC, and the ethanol content was analyzed by HPLC or GC under the following conditions.
＜高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）＞
装置：Shimadzu RID-10A
カラム：Shodex sugar SP0810
移動相：H2O
流速：0.8 ml/min
検出：RID
カラム温度：80℃<High performance liquid chromatography (HPLC)>
Equipment: Shimadzu RID-10A
Column: Shodex sugar SP0810
Mobile phase: H 2 O
Flow rate: 0.8 ml / min
Detection: RID
Column temperature: 80 ° C
＜ガスクロマトグラフィー（GC）＞
装置：Shimadzu GC-2014
カラム：StabibiliWAX, I.D. 0.53mm, length 30m, Film Thickness 2.0mm
検出：FID
分析条件：75℃（2min）- 10℃/min- 210℃（10min）
インジェクション温度：250℃
検出温度：250℃
キャリアガス：ヘリウム<Gas chromatography (GC)>
Equipment: Shimadzu GC-2014
Column: StabibiliWAX, ID 0.53mm, length 30m, Film Thickness 2.0mm
Detection: FID
Analysis conditions: 75 ℃ (2min)-10 ℃ / min-210 ℃ (10min)
Injection temperature: 250 ℃
Detection temperature: 250 ℃
Carrier gas: helium
図５は、酵母の生育量（○および●）とサンプル中のキシロース含有量（□および■）を培養時間に対してプロットしたグラフである。コントロールである非形質転換酵母（pGADT7）はキシロースを分解できず（□）、キシロースを炭素源とする培地に生育できない（○）。これに対し、形質転換酵母(pGAD-XYL)は、キシロースを分解し（■）、キシロースを炭素源とする培地に生育する（●）ことが示された。
図６は、培養137時間後のエタノール生産量を示している。非形質転換酵母（pGADT7）はキシロースからエタノールを生産しないのに対し、形質転換酵母(pGAD-XYL)はキシロースからエタノールを生産することが示された。
これらの結果から、SOR1酵素の方が、YLR070c酵素よりもキシロース脱水素酵素活性が高いことが示された。また、キシロース分解酵素をコードする遺伝子としてSOR1を用いることにより、酵母がキシロースなどの五炭糖を利用可能となり、エタノールを生産可能となることが示された。
FIG. 5 is a graph in which the amount of yeast growth (◯ and ●) and the xylose content (□ and ■) in the sample are plotted against the culture time. The control non-transformed yeast (pGADT7) cannot degrade xylose (□) and cannot grow on a medium containing xylose as a carbon source (◯). In contrast, transformed yeast (pGAD-XYL) was shown to decompose xylose (■) and grow on a medium using xylose as a carbon source (●).
FIG. 6 shows ethanol production after 137 hours of culture. Non-transformed yeast (pGADT7) did not produce ethanol from xylose, whereas transformed yeast (pGAD-XYL) was shown to produce ethanol from xylose.
From these results, it was shown that the SOR1 enzyme has higher xylose dehydrogenase activity than the YLR070c enzyme. In addition, it was shown that by using SOR1 as a gene encoding xylose-degrading enzyme, yeast can use pentoses such as xylose and produce ethanol.
〔ADHプロモーターおよびADHターミネーターのPCRによる合成〕
下記のオリゴヌクレオチド１３及び１４を合成し、PCR反応のためのプライマーとして使用し、pGADT7を鋳型としてADHプロモーターおよびADHターミネーターを含むDNA断片を得た。ADHプロモーターおよびADHターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシアにおいて機能することが知られている。PCR反応の使用装置および使用酵素は、実施例１と同様にして行った。[Synthesis of ADH promoter and ADH terminator by PCR]
The following oligonucleotides 13 and 14 were synthesized, used as primers for the PCR reaction, and a DNA fragment containing an ADH promoter and ADH terminator was obtained using pGADT7 as a template. The ADH promoter and ADH terminator are known to function in Saccharomyces cerevisiae. The apparatus used for PCR reaction and the enzyme used were the same as in Example 1.
オリゴヌクレオチド１３：GACCCCCGGGCCTGCAGGTCGAGATCCG （配列番号１７）
オリゴヌクレオチド１４：GACCCCCGGGGGCCGGTAGAGGTGTGGT （配列番号１８）
Oligonucleotide 13: GACCCCCGGGCCTGCAGGTCGAGATCCG (SEQ ID NO: 17)
Oligonucleotide 14: GACCCCCGGGGGCCGGTAGAGGTGTGGT (SEQ ID NO: 18)
〔YIp-GRE-070c-XKおよびYIp-GRE-SOR-XKの作製と形質転換〕
実施例８において増幅されたDNA断片をpUC18プラスミドのSmaI切断部位に組み込み、HindIIIで切断し平滑化した。この平滑化断片に実施例1において平滑化された増幅YLR070c、増幅SOR1断片を挿入し、pUC-ADHPT-070cプラスミドおよびpUC-ADHPT-SOR1プラスミドを得た（図８）。次に、これらのプラスミドをSmaIで切断し、実施例１において平滑化されたpUC-GRE-XK断片に挿入して、pUC-GRE-070c-XKプラスミドおよびpUC-SOR-XKプラスミドを得た。これらのプラスミドをPvuIIで切断し、YIp5プラスミドのPvuII切断部位に挿入して、YIp-GRE-070c-XKプラスミドおよびYIp-GRE-SOR-XKプラスミドを得た（図９）。[Production and transformation of YIp-GRE-070c-XK and YIp-GRE-SOR-XK]
The DNA fragment amplified in Example 8 was incorporated into the SmaI cleavage site of pUC18 plasmid, cut with HindIII and blunted. The amplified YLR070c and amplified SOR1 fragments blunted in Example 1 were inserted into this blunted fragment to obtain pUC-ADHPT-070c plasmid and pUC-ADHPT-SOR1 plasmid (FIG. 8). Next, these plasmids were digested with SmaI and inserted into the pUC-GRE-XK fragment blunted in Example 1 to obtain pUC-GRE-070c-XK plasmid and pUC-SOR-XK plasmid. These plasmids were cleaved with PvuII and inserted into the PvuII cleavage site of YIp5 plasmid to obtain YIp-GRE-070c-XK plasmid and YIp-GRE-SOR-XK plasmid (FIG. 9).
CEN.PK2-1C株への形質転換はGietzらの方法（Methods Mol. Cell. Biol. 5, 255-269, 1995）に従って行った。簡潔に述べると、対数増殖期（OD600=0.5〜1）の酵母細胞50mlを遠心分離にかけ、培地を除去し、25mlの滅菌水で1回洗浄した。菌体を1mlの酢酸リチウム溶液（0.1M酢酸リチウム）に懸濁した。この液を滅菌した1.5ml容エッペンドルフチューブに移し、5000rpmで5分遠心し上清を除いた。菌体に0.5〜1mlの酢酸リチウム溶液（0.1M酢酸リチウム）を加え懸濁した。この液を滅菌した1.5ml容エッペンドルフチューブに50μl移し、5000rpmで5分遠心し上清を除いた。これに0.24ml PEG溶液（50% w/v ポリエチレングリコール4000）、36μl 1M 酢酸リチウム、25μl 2mg/ml サケ精子DNA（粉末状、95℃で5分間熱変性をしたもの）、50μl プラスミドDNAを加えボルテックスでよく攪拌し、30℃で30分静置した。この液に40μl ジメチルスルホキシドを加えゆっくり攪拌した。その後42℃で15〜25分静置した。5000rpmで5分遠心し上清を除いた後、YPD培地1mlを加え懸濁し、5000rpmで5分遠心し上清を除いた。菌体にYPD培地1mlを加え、30℃で１時間振盪した。5000rpmで5分遠心し上清を除いた後、菌体を滅菌蒸留水0.1mlに懸濁し、SC-Ura培地（グルコース 20 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）を含有する寒天プレート上に平板化した。各々のプレートから生育してきたコロニーを１株選び、形質転換体とした。
Transformation into CEN.PK2-1C strain was performed according to the method of Gietz et al. (Methods Mol. Cell. Biol. 5, 255-269, 1995). Briefly, 50 ml of logarithmic growth phase (OD600 = 0.5-1) yeast cells were centrifuged, the medium was removed and washed once with 25 ml of sterile water. The cells were suspended in 1 ml of lithium acetate solution (0.1 M lithium acetate). This solution was transferred to a sterilized 1.5 ml Eppendorf tube and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. 0.5-1 ml of lithium acetate solution (0.1 M lithium acetate) was added to the cells and suspended. 50 μl of this solution was transferred to a sterilized 1.5 ml Eppendorf tube and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. Add 0.24ml PEG solution (50% w / v polyethylene glycol 4000), 36μl 1M lithium acetate, 25μl 2mg / ml salmon sperm DNA (powder, heat-denatured at 95 ° C for 5 minutes), 50μl plasmid DNA Vortexed well and allowed to stand at 30 ° C. for 30 minutes. 40 μl dimethyl sulfoxide was added to this solution and stirred slowly. Thereafter, the mixture was allowed to stand at 42 ° C. for 15 to 25 minutes. After centrifuging at 5000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, 1 ml of YPD medium was added and suspended, and centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. 1 ml of YPD medium was added to the cells and shaken at 30 ° C. for 1 hour. After centrifuging at 5000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, the cells are suspended in 0.1 ml of sterilized distilled water, and SC-Ura medium (glucose 20 g / L, yeast nitrogen base (without amino acids) 6.7 g / L, amino acids The solution was flattened on an agar plate containing the solution. One colony growing from each plate was selected and used as a transformant.
〔形質転換体のキシロース発酵〕
200 ml容三角フラスコに、液体SCX培地（キシロース40 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）50 ml を入れ、一夜同培地で前培養した形質転換体（YIp-GRE-070c-XK, YIp-GRE-SOR-XK）の種培養液を１％加え、30℃、120 rpmで振盪培養した。経時的に培養液1 mlをサンプリングし、キシロース、エタノールの含有量を実施例７に記載したHPLCおよびGCにより測定するためのサンプルとした。
サンプリングした培養液を遠心分離して菌体を除き、上清をポリプロピレン製フィルター（0.2μm, ホワットマン）でろ過を行いサンプルとした。サンプル中のキシロースの含有量をHPLCにより、エタノールの含有量をHPLCまたはGCにより、実施例７に記載の条件と同条件で分析した。
図１０は培養42時間後のエタノール生産量を示している。形質転換酵母（YIp-GRE-070c-XK）はキシロースからエタノールを生産しないのに対し、形質転換酵母（YIp-GRE-SOR-XK）はキシロースからエタノールを生産することが示された。
この結果から、SOR1酵素遺伝子を使用することにより、酵母がキシロースなどの五炭糖を利用可能となり、エタノールを生産可能となることが示された。
[Xylose fermentation of transformants]
In a 200 ml Erlenmeyer flask, add 50 ml of liquid SCX medium (xylose 40 g / L, yeast nitrogen base (without amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution), and transformant (YIp) -GRE-070c-XK, YIp-GRE-SOR-XK) was added at 1%, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm. 1 ml of the culture solution was sampled over time, and used as a sample for measuring the content of xylose and ethanol by HPLC and GC described in Example 7.
The sampled culture broth was centrifuged to remove the cells, and the supernatant was filtered through a polypropylene filter (0.2 μm, Whatman) to obtain a sample. The xylose content in the sample was analyzed by HPLC, and the ethanol content was analyzed by HPLC or GC under the same conditions as described in Example 7.
FIG. 10 shows ethanol production after 42 hours of culture. Transformed yeast (YIp-GRE-070c-XK) did not produce ethanol from xylose, whereas transformed yeast (YIp-GRE-SOR-XK) was shown to produce ethanol from xylose.
From this result, it was shown that by using the SOR1 enzyme gene, yeast can use pentoses such as xylose and can produce ethanol.
〔LEU2部位組み込み株の選抜〕
実施例５に記載の形質転換により得られた形質転換体を用いて、染色体上LEU2部位にキシロース分解遺伝子群が組み込まれた形質転換酵母株の選抜を行った。具体的には、50 ml容三角フラスコに、ロイシンを含まない液体SCX-Leu培地（キシロース20 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）20 mlを入れ、一夜同培地で前培養した上記形質転換体（pGAD-XYL）の種培養液を１％加えた。その後、30℃で120 rpmで3日間振盪培養した。この培養液１％を同組成の培地に加え、30℃で120 rpmで3日間振盪培養した。
この操作を１日目の培養液のOD600値が１以上に達するまで繰り返した。この培養液を適宜希釈し、同組成の寒天プレート培地に塗布し、単一コロニーを取得し、形質転換体（pGAD-LEU-XYL）とした。
[Selection of LEU2 site integration strain]
Using the transformant obtained by the transformation described in Example 5, a transformed yeast strain in which a xylose-degrading gene group was incorporated at the LEU2 site on the chromosome was selected. Specifically, in a 50 ml Erlenmeyer flask, place 20 ml of liquid SCX-Leu medium (xylose 20 g / L, yeast nitrogen base (without amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution) without leucine overnight. 1% of the seed culture solution of the transformant (pGAD-XYL) pre-cultured in the same medium was added. Thereafter, the cells were cultured with shaking at 30 rpm at 120 rpm for 3 days. 1% of this culture solution was added to a medium having the same composition and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 3 days.
This operation was repeated until the OD600 value of the culture solution on the first day reached 1 or more. This culture solution was appropriately diluted and applied to an agar plate medium having the same composition to obtain a single colony, which was used as a transformant (pGAD-LEU-XYL).
〔YIp-URA-XYLの作製と形質転換〕
実施例２において作製したpUC-GRE-SOR-XKプラスミドをEcoRI, SphIで切断し、得られたキシロース分解遺伝子を含む断片を、YIp5プラスミドをEcoRI, SphIで切断して得られた断片と連結してYIp-URA-XYLプラスミドを得た(図１１)。このプラスミドをCEN.PK2-1C株に形質転換した。形質転換は実施例９と同様にして行った。静置培養した菌液をSC-Ura培地を含有する寒天プレート上に塗布し、生育してきたコロニーを１株選び、形質転換体（YIp-URA-XYL）とした。
[Production and transformation of YIp-URA-XYL]
The pUC-GRE-SOR-XK plasmid prepared in Example 2 was digested with EcoRI and SphI, and the resulting fragment containing the xylose degradation gene was ligated with the fragment obtained by digesting the YIp5 plasmid with EcoRI and SphI. YIp-URA-XYL plasmid was obtained (FIG. 11). This plasmid was transformed into CEN.PK2-1C strain. Transformation was performed in the same manner as in Example 9. The bacterial solution obtained by stationary culture was applied on an agar plate containing SC-Ura medium, and one strain of colonies that had grown was selected to obtain a transformant (YIp-URA-XYL).
〔形質転換体のキシロース発酵〕
200 ml容三角フラスコに、ロイシンを含まない液体SCX-Leu培地（キシロース20 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）50 mlを入れ、一夜同培地で前培養した形質転換体の種培養液を１％加えた。その後、30℃で120 rpmで振盪培養した。経時的に培養液1 mlをサンプリングし、キシロース、エタノールの含有量を実施例７に記載したHPLCおよびGCにより測定するためのサンプルとした。
[Xylose fermentation of transformants]
In a 200 ml Erlenmeyer flask, add 50 ml of liquid SCX-Leu medium without leucine (xylose 20 g / L, yeast nitrogen base (without amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution), and preculture overnight in the same medium. 1% of the seed culture solution of the transformant was added. Thereafter, the cells were cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm. 1 ml of the culture solution was sampled over time, and used as a sample for measuring the content of xylose and ethanol by HPLC and GC described in Example 7.
〔発酵サンプルのHPLCおよびGC分析〕
実施例１３でサンプリングした培養液について、酵母の生育程度を確認するために、600 nmでの吸光度（OD600）を測定した。また、サンプリングした培養液を遠心分離して菌体を除き、上清をポリプロピレン製フィルター（0.2μm, ホワットマン）でろ過を行いサンプルとした。サンプル中のキシロースの含有量をHPLCにより、エタノールの含有量をHPLCまたはGCにより、実施例７に記載の条件と同様の条件で分析した。[HPLC and GC analysis of fermentation samples]
For the culture solution sampled in Example 13, the absorbance at 600 nm (OD600) was measured in order to confirm the degree of yeast growth. The sampled culture solution was centrifuged to remove the cells, and the supernatant was filtered with a polypropylene filter (0.2 μm, Whatman) to obtain a sample. The xylose content in the sample was analyzed by HPLC, and the ethanol content was analyzed by HPLC or GC under the same conditions as described in Example 7.
図１２は、酵母の生育量（○及び●）と、サンプル中のキシロース含有量（□及び■）及びエタノール含有量（△及び▲）とを、培養時間に対してプロットしたグラフである。実施例１２で得た、コントロールである染色体上URA3部位にキシロース分解酵素遺伝子群が組み込まれた形質転換酵母（YIp-URA-XYL）（○、□、△）よりも、染色体上LEU2部位にキシロース分解遺伝子群が組み込まれた形質転換酵母（YIp-URA-XYL）（●、■、▲）の方が、生育量、キシロース消費及びエタノール生産能のいずれにおいても優れていることが示された。
この結果から、染色体上LEU2部位にキシロース分解遺伝子群が組み込まれた形質転換酵母を用いることにより、キシロースからエタノールを効率よく生産させることが可能であることが示された。
FIG. 12 is a graph in which the amount of yeast grown (◯ and ●), the xylose content (□ and ■), and the ethanol content (Δ and ▲) in the sample are plotted against the culture time. Compared to the transformed yeast (YIp-URA-XYL) (○, □, △) in which the xylose-degrading enzyme gene group was incorporated at the URA3 site on the chromosome as a control, obtained in Example 12, the xylose was placed at the LEU2 site on the chromosome. It was shown that the transformed yeast (YIp-URA-XYL) (●, ■, ▲) in which the degradation gene group was incorporated was superior in terms of growth, xylose consumption, and ethanol production ability.
From this result, it was shown that ethanol can be efficiently produced from xylose by using a transformed yeast in which a xylose-degrading gene group is incorporated at the LEU2 site on the chromosome.
〔AUR-GRE-SOR-XKの作製と実用酵母への形質転換〕
実施例２において作製したpUC-GRE-SOR-XKプラスミドをPvuIIで切断し、得られたキシロース分解遺伝子を含む断片をpAUR135プラスミドのSmaI切断部位に組込み、pAUR-GRE-SOR-XKプラスミドを得た（図１３）。清酒醸造に用いられる実用酵母であるサッカロマイセス・セレビシア協会７号を宿主酵母とし、形質転換は実施例９と同様にして行った。静置培養した菌液をオーレオバシジンA（0.5mg/L）を含有するYPD寒天プレート上に塗布し、生育してきたコロニーを１株選び、形質転換体とした。
[Production of AUR-GRE-SOR-XK and transformation into practical yeast]
The pUC-GRE-SOR-XK plasmid prepared in Example 2 was digested with PvuII, and the resulting fragment containing the xylose degradation gene was incorporated into the SmaI cleavage site of the pAUR135 plasmid to obtain the pAUR-GRE-SOR-XK plasmid. (FIG. 13). Saccharomyces cerevisiae association No. 7 which is a practical yeast used for sake brewing was used as a host yeast, and transformation was carried out in the same manner as in Example 9. The bacterial solution obtained by stationary culture was applied on a YPD agar plate containing aureobasidin A (0.5 mg / L), and one grown colony was selected as a transformant.
〔形質転換実用酵母のキシロース発酵〕
500ml容三角フラスコにYPD培地200mlを入れ、一夜同培地で前培養した形質転換体（pAUR-GRE-SOR-XK）の種培養液を１％加え、30℃、120 rpmで振盪培養した。3000rpmで5分間遠心し、沈降した酵母菌体を蒸留水に懸濁し、3000rpmで5分間遠心することにより洗浄した。沈降した酵母菌体を蒸留水5〜10mlに懸濁し、濃縮菌液とした。
200 ml容三角フラスコに液体SX培地（キシロース40 g/L, イーストナイトロジェンベース（アミノ酸なし）6.7 g/L, アミノ酸溶液）50 ml を入れ、上記濃縮菌液を加え、600nmでの濁度がおよそ20となるように調整したのち、30℃、120 rpmで振盪培養した。経時的に培養液1 mlをサンプリングし、キシロース、エタノールの含有量を実施例７と同様にHPLC及びGCにより測定した。結果を図１４に示す。
実用酵母への形質転換により得られた酵母においても、キシロースからエタノールが生産されることが確認された。[Xylose fermentation of transformed yeast]
200 ml of YPD medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, 1% of a seed culture solution of a transformant (pAUR-GRE-SOR-XK) pre-cultured overnight in the same medium was added, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm. After centrifuging at 3000 rpm for 5 minutes, the precipitated yeast cells were suspended in distilled water and washed by centrifuging at 3000 rpm for 5 minutes. The precipitated yeast cells were suspended in 5 to 10 ml of distilled water to obtain a concentrated bacterial solution.
Add 50 ml of liquid SX medium (xylose 40 g / L, yeast nitrogen base (without amino acid) 6.7 g / L, amino acid solution) to a 200 ml Erlenmeyer flask, add the above concentrated bacterial solution, and turbidity at 600 nm After adjusting to about 20, it was cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm. 1 ml of the culture solution was sampled over time, and the contents of xylose and ethanol were measured by HPLC and GC as in Example 7. The results are shown in FIG.
It was confirmed that ethanol was also produced from xylose in the yeast obtained by transformation to practical yeast.
配列番号１〜１２、１７、１８：プライマー Sequence number 1-12, 17, 18: Primer
Claims (17)
ここで、前記ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子がSOR1又はSOR2であり、
前記形質転換酵母は、キシロースからエタノールを生産する能力を有するものである、
前記形質転換酵母。 A gene encoding sorbitol dehydrogenase, a gene encoding xylose reductase, and a gene encoding xylulose phosphorylase are introduced so that they can be expressed on the chromosome of the host yeast, and the conversion activity from xylitol to xylulose is introduced before the introduction. A transformed yeast with enhanced strength,
Here, the gene encoding the sorbitol dehydrogenase is SOR1 or SOR2,
The transformed yeast has the ability to produce ethanol from xylose.
The transformed yeast.
ソルビトール脱水素酵素が以下の(a)又は(b)のタンパク質であるか：
(a) 配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号１４又は１６で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつキシリトール脱水素酵素活性を有するタンパク質
ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が以下の(c)又は(d)のDNAであるか：
(c) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１３又は１５で示される塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシリトール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
あるいは
ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子がSOR1又はSOR2である、前記プラスミド。 A plasmid comprising a gene encoding sorbitol dehydrogenase, a gene encoding xylose reductase and a gene encoding xylulose phosphorylase,
Whether the sorbitol dehydrogenase is the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16
(b) a protein sorbitol dehydrogenase comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16, and having xylitol dehydrogenase activity ; Whether the encoded gene is the following DNA (c) or (d):
(c) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15
(d) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 and encodes a protein having xylitol dehydrogenase activity
Alternatively, the plasmid, wherein the gene encoding sorbitol dehydrogenase is SOR1 or SOR2.
A method for producing ethanol, comprising culturing the yeast according to any one of claims 1 to 8 and claims 13 to 16, and collecting ethanol from the obtained culture.
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