JP5669054B2 - Preventive and therapeutic agent for pancreatitis - Google Patents

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Description

本発明は、トリプシノーゲン活性化抑制剤や、膵炎の予防・治療剤等に関する。   The present invention relates to a trypsinogen activation inhibitor, a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis, and the like.

近年、食文化の欧米化が進んだ結果、脂肪分や酒類の過剰摂取による急性及び慢性の膵炎の患者が増加している。膵炎の発症メカニズムは完全には判明していないが、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化されて炎症を起こすという点では共通している。本来、膵臓トリプシンの不活性前駆体であるトリプシノーゲンは、膵液中に分泌され、膵管を通って十二指腸に達し、そこで発現されているエンテロキナーゼによって活性化される。ところが何らかの原因によりトリプシノーゲンが膵臓中で早期に活性化されてトリプシンに変化すると、そのトリプシンが膵臓中の他のプロテアーゼ前駆体（例えば、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼ、プロカルボキシペプチダーゼ、及び、プロテアーゼにより活性化されるレセプター等（非特許文献１及び２））を連鎖的に活性化し、活性化されたプロテイナーゼが膵臓細胞の破壊を誘導することによって、急性膵炎を発症する。また、このような炎症がより緩やかに繰り返し長期間にわたって起こると、膵臓の正常な細胞が徐々に破壊されていき、慢性膵炎を発症する。   In recent years, as the food culture has become westernized, the number of patients with acute and chronic pancreatitis due to excessive intake of fat and alcohol is increasing. The onset mechanism of pancreatitis is not completely understood, but it is common in that the pancreas itself is digested and inflamed by digestive enzymes of the pancreatic juice. Originally, trypsinogen, an inactive precursor of pancreatic trypsin, is secreted into the pancreatic juice, reaches the duodenum through the pancreatic duct, and is activated by enterokinase expressed therein. However, if for some reason trypsinogen is activated early in the pancreas and converted to trypsin, the trypsin is converted to other protease precursors in the pancreas (for example, trypsinogen, chymotrypsinogen, proelastase, procarboxypeptidase, and protease). The activated receptor or the like (Non-patent Documents 1 and 2) is activated in a chain, and the activated proteinase induces the destruction of pancreatic cells, thereby causing acute pancreatitis. In addition, when such inflammation occurs more slowly and repeatedly over a long period of time, normal cells of the pancreas are gradually destroyed and chronic pancreatitis develops.

これら膵炎の予防・治療剤として、様々なトリプシン阻害剤が開発されている。例えば特許文献１には、ウイッチヘーゼル、ローズマリー、レンギョウ、ムクゲ、チョウジ、バナバ、フウ、セイヨウヤマハッカ及びザクロから成る群より選ばれる少なくとも１種類の植物又はその抽出物を含有するトリプシン阻害剤が記載されており、また、特許文献２には、グアニジノ安息香酸誘導体からなるトリプシン阻害剤が記載されている。さらに、他のトリプシン阻害剤として、「フオイパン」（登録商標）としても知られ、慢性膵炎における急性症状の緩解や術後逆流性食道炎に対して主に用いられるカモスタットメシル酸塩や、「エフオーワイ」（登録商標）としても知られ、急性膵炎、汎発性血管内血液凝固症に対して主に用いられるガベキサートメシル酸塩が知られている。しかし、天然成分由来のトリプシン阻害剤では、未だ十分な効果が得られているとはいえず、また、フオイパン等の合成化合物からなるトリプシン阻害剤においては、副作用の問題があり、改善の余地があった。   Various trypsin inhibitors have been developed as preventive and therapeutic agents for these pancreatitis. For example, Patent Document 1 describes a trypsin inhibitor containing at least one plant selected from the group consisting of witch hazel, rosemary, forsythia, mugweed, clove, banaba, fu, wild mint and pomegranate, or an extract thereof. In addition, Patent Document 2 describes a trypsin inhibitor composed of a guanidinobenzoic acid derivative. Furthermore, as other trypsin inhibitors, known as “Fuypan” (registered trademark), camostat mesylate mainly used for relieving acute symptoms in chronic pancreatitis and postoperative reflux esophagitis, Gabexate mesylate, also known as “registered trademark”, is mainly used for acute pancreatitis and generalized intravascular blood coagulation. However, trypsin inhibitors derived from natural ingredients have not yet been sufficiently effective, and trypsin inhibitors composed of synthetic compounds such as huypan have a problem of side effects, and there is room for improvement. there were.

一方、本発明者らは、ウシの膵臓のトリプシン（ＢＰＴ）やブタのそれ（ＰＰＴ）と、糖タンパク質のＮ−グリカンとの結合性を調べた。非特許文献３には、その結果として、ＢＰＴ及びＰＰＴのいずれも、１７種類の糖−ビオチニルポリアクリルアミド（ＢＰ）プローブ（ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブ；例えばα−マンノースＢＰプローブについて図５参照）のうち、α−マンノース（α−Ｍａｎ）；α−マンノース−６−リン酸（α−Ｍａｎ−６Ｐ）；Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，６ガラクトースβ１，４グルコース（Ｎｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）；α−ガラクトース（α−Ｇａｌ）；又は、β−グルコース（β−Ｇｌｃ）；のプローブには、高い結合力を示したが、ＢＰＴ及びＰＰＴのいずれもα−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ＧａｌＮＡｃ）等には結合しなかった、と記載されている（非特許文献３の３２ページの“RESULTS”の第１段落）。 On the other hand, the present inventors examined the binding property of bovine pancreatic trypsin (BPT) or porcine (PPT) with N-glycan of glycoprotein. As a result, Non-Patent Document 3 discloses that both BPT and PPT have 17 types of sugar-biotinyl polyacrylamide (BP) probes (a -CONH 2 group of a polyacrylamide skeleton, a short spacer (-OCH 2 CH 2 CH Among the probes in which sugars are covalently bonded via glycoside bonds via 2- ); for example, α-mannose (α-Man); α-mannose-6-phosphate (α -Man-6P); N-acetylneuraminic acid α2,6 galactose β1,4 glucose (Neu5Acα2,6Galβ1,4Glc); α-galactose (α-Gal); or β-glucose (β-Glc); However, both BPT and PPT exhibited α-N-acetylgalactosamine (α-G alNAc) and the like (the first paragraph of “RESULTS” on page 32 of Non-Patent Document 3).

以上のような非特許文献３の結果を考慮すると、ＢＰＴやＰＰＴのいずれにも結合しなかった「α-ＧａｌＮＡｃの１位にスペーサーが結合した化合物」（α−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がブトキシ基に置換された化合物）をはじめとする、α−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がアルコキシ基に置換された化合物等が、トリプシノーゲンやトリプシンの活性の阻害剤や促進剤として機能する可能性はきわめて低いと考えられた。   Considering the results of Non-Patent Document 3 as described above, “a compound in which a spacer is bonded to the 1-position of α-GalNAc” that was not bonded to either BPT or PPT (the hydroxy group at the 1-position of α-GalNAc is It is possible that compounds in which the hydroxy group at the 1-position of α-GalNAc is substituted with an alkoxy group, such as compounds substituted with a butoxy group, function as inhibitors or promoters of trypsinogen or trypsin activity. It was considered very low.

特開２００５−０５３８１８号公報JP 2005-053818 A 特公昭６０−４９１８５号公報Japanese Patent Publication No. 60-49185

Pancreas, 21, 57-62 (2000)Pancreas, 21, 57-62 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 713-720 (1992)Curr. Opin. Struct. Biol., 2, 713-720 (1992) J. Biol. Chem., 281, 8528-8538 (2006)J. Biol. Chem., 281, 8528-8538 (2006)

本発明の課題は、生体に投与しても副作用の懸念がほとんどなく、かつ、十分なトリプシノーゲン活性化抑制作用（又はトリプシン阻害作用）を発揮するトリプシノーゲン活性化抑制剤、あるいは、膵炎の予防・治療剤等を提供することにある。   An object of the present invention is to prevent trypsinogen activation or to prevent pancreatitis, which has almost no fear of side effects even when administered to a living body and exhibits a sufficient trypsinogen activation inhibitory action (or trypsin inhibitory action). It is to provide an agent.

本発明者らは、ＢＰＴやＢＰＴＧ（ウシトリプシノーゲン）と、糖との結合性を調べるために、非特許文献３と同様に、糖−ＢＰプローブを用いたアッセイを行なった。この糖−ＢＰプローブとは、前述したように、ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブである。非特許文献３のアッセイでは糖としてα−ＧａｌＮＡｃを用いた糖−ＢＰプローブ（α−ＧａｌＮＡｃ ＢＰプローブ）はＢＰＴに結合しなかったが、今回の実験では、予想に反して、その糖ＢＰプローブが、ＢＰＴやＢＰＴＧに対して高い結合性、しかもα−Ｍａｎよりも高い結合性を有していることを見い出した。さらに、本発明者らは、ＢＰＴによるＢＰＴＧからＢＰＴへの分解（ＢＰＴＧの活性化）に対して、Ｍｅ-ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌＮ（ガラクトサミン）、及びβ−ＧａｌＮＡｃが顕著な抑制効果を有していることを見い出し、本発明を完成するに至った。なお、α−ＧａｌＮＡｃ ＢＰプローブに関するアッセイの結果が、非特許文献３における結果と逆になった理由は定かではないが、非特許文献３で用いたα−ＧａｌＮＡｃＢＰプローブ（現在入手不可）に何らかの問題があった可能性が考えられる。また、非特許文献３で用いている糖はすべてＤ体であった。 The present inventors conducted an assay using a sugar-BP probe in the same manner as in Non-Patent Document 3 in order to examine the binding property between BPT and BPTG (bovine trypsinogen) and sugar. As described above, this sugar-BP probe is a probe in which a sugar is covalently bonded to a -CONH 2 group of a polyacrylamide skeleton through a short spacer (-OCH 2 CH 2 CH 2- ) via a glycoside bond. . In the assay of Non-Patent Document 3, a sugar-BP probe (α-GalNAc BP probe) using α-GalNAc as a sugar did not bind to BPT. However, in this experiment, the sugar BP probe was contrary to expectation. It has been found that it has a high binding property to BPT and BPTG, and has a higher binding property than α-Man. Furthermore, the present inventors show that Me-GalNAc, GalN (galactosamine), and β-GalNAc have a remarkable inhibitory effect on the degradation of BPTG to BPT (activation of BPTG) by BPT. As a result, the present invention has been completed. Although the reason why the results of the assay relating to the α-GalNAc BP probe are opposite to the results in Non-Patent Document 3 is not certain, there is some problem with the α-GalNAc BP probe (not currently available) used in Non-Patent Document 3. There is a possibility that there was. Moreover, all the sugars used in Non-Patent Document 3 were D-forms.

すなわち本発明は、（１）ガラクトサミン又はその誘導体を含有することを特徴とするトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤や、（２）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（１）に記載のトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤に関する。
That is, the present invention is (1) a preparation for inhibiting trypsinogen activation , comprising galactosamine or a derivative thereof , wherein the derivative is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; N A compound in which the hydroxy group at the 1-position of acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain; the N-acetyl group at the 2-position of N-acetylgalactosamine is an N-sulfate group , A compound substituted with a free amino group or an N-glycolyl group; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine is a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide A compound substituted with a chain; methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and a salt thereof A-option the compounds, and formulations for trypsinogen activation suppressing, (2) derivatives of galactosamine, alpha-N- acetylgalactosamine; beta-N- acetylgalactosamine; hydroxy group of N- acetylgalactosamine 1-position of the Min is, Compound substituted with alkoxy group; Compound wherein N-acetyl group at 2-position of N -acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group ; 3-position, 4-position of N -acetylgalactosamine or 6-position hydroxy groups sulfate group, O- acetyl group, a phosphoric acid group, compounds substituted in the sugar residue or oligosaccharide chains; and characterized in that a compound selected from; and the hydrochloride salt of galactosamine This relates to the preparation for inhibiting trypsinogen activation as described in (1) above.

また本発明は、（３）ガラクトサミン誘導体を含有することを特徴とする膵炎の予防・治療剤であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、膵炎の予防・治療剤や、（４）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（３）に記載の膵炎の予防・治療剤に関する。
The present invention also provides (3) a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis comprising a galactosamine derivative, wherein the derivative is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; N-acetylgalactosamine. A compound in which the hydroxy group at position 1 is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain; the N-acetyl group at position 2 of N-acetylgalactosamine is an N-sulfate group, a free amino group Compound substituted with a group or N-glycolyl group; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain Pancreatitis, a compound selected from the group consisting of: methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof Prevention and or therapeutic agent, (4) a derivative of galactosamine, alpha-N-acetylgalactosamine; beta-N-acetylgalactosamine; N- acetylgalactosamine 1-position hydroxy group of Min A compound which is substituted with alkoxy; N- A compound in which the N-acetyl group at the 2-position of acetylgalactosamine is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group ; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N -acetylgalactosamine is a sulfate group; A compound selected from an O-acetyl group, a phosphate group, a sugar residue or an oligosaccharide chain ; and a hydrochloride salt of galactosamine ; It relates to preventive and therapeutic agents.

さらに本発明は、（５）トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤の製造におけるガラクトサミン又はその誘導体の使用であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用に関する。
The present invention further relates to (5) use of galactosamine or a derivative thereof in the manufacture of a preparation for inhibiting trypsinogen activation , wherein the derivative is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; N-acetylgalactosamine. A compound in which the hydroxy group at position 1 is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain; the N-acetyl group at position 2 of N-acetylgalactosamine is an N-sulfate group, a free amino group Compound substituted with a group or N-glycolyl group; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain Selected from the group consisting of: methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof Compounds, to the use.

また本発明は、（６）膵炎の予防・治療剤の製造におけるガラクトサミン誘導体の使用であって、前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用や、（７）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（５）に記載の使用や、（８）ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする上記（６）に記載の使用に関する。
The present invention also relates to (6) use of a galactosamine derivative in the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis , wherein the derivative is the first position of α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; N-acetylgalactosamine. A compound in which the hydroxy group is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain; the N-acetyl group at the 2-position of N-acetylgalactosamine is an N-sulfate group, a free amino group or N A compound substituted with a glycolyl group; a compound in which the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine is substituted with a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group, a sugar residue or an oligosaccharide chain ; methyl α- galactosaminidic; and methyl β- galactosaminidic; and a compound selected from the group consisting of salts, and used, ( ) Derivatives of galactosamine, alpha-N- acetylgalactosamine; beta-N- acetylgalactosamine; N- acetylgalactosamine 1-position hydroxy group of Min A compound which is substituted with alkoxy; N- acetylgalactosamine 2-position of Ming N- A compound in which an acetyl group is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group ; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N -acetylgalactosamine is a sulfate group, an O-acetyl group or a phosphate group , compounds substituted in the sugar residue or oligosaccharide chains; and the hydrochloride salt of the galactosamine; use or according to (5) which is a compound selected from derivatives of (8) galactosamine , Α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; Compound substituted with alkoxy group; Compound wherein N-acetyl group at 2-position of N-acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group; 3-position, 4-position of N-acetylgalactosamine Or a compound in which the hydroxy group at the 6-position is substituted with a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group, a sugar residue or an oligosaccharide chain; and a hydrochloride salt of galactosamine, This relates to the use described in (6) above .

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、生体分子に基づく成分を有効成分としているため生体に投与しても副作用の懸念がほとんどなく、かつ、十分なトリプシノーゲン活性化抑制効果（及び／又はトリプシン阻害効果）を発揮することができる。また、本発明の膵炎の予防・治療剤は、副作用の懸念がほとんどなく、かつ、膵炎に対する十分な予防・治療効果を発揮することができると考えられる。   Since the trypsinogen activation inhibitor of the present invention has a biomolecule-based component as an active ingredient, there is little concern about side effects even when administered to a living body, and a sufficient trypsinogen activation inhibitory effect (and / or trypsin inhibitory effect) ). In addition, it is considered that the preventive / therapeutic agent for pancreatitis of the present invention has almost no fear of side effects and can exert a sufficient preventive / therapeutic effect on pancreatitis.

ＢＰＴＧからＢＰＴへの変化に対する糖の影響を調べるために行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。Ａ：Ｍｅ−α−Ｇａｌ、Ｂ：Ｍｅ−β−Ｇａｌ、Ｃ：Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｄ：Ｍｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ、Ｅ：Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ、Ｆ：ＧａｌＮ・ＨＣｌ、Ｇ：ＧａｌＮＡｃ、Ｈ：Ｌ−Ｆｕｃ、Ｉ：Ｄ−Ｆｕｃ、但し「＊」は０．１Ｍ Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ（２０ｍｉｎ）の結果を示す。It is a figure which shows the result of SDS-PAGE performed in order to investigate the influence of the saccharide | sugar with respect to the change from BPTG to BPT. A: Me-α-Gal, B: Me-β-Gal, C: Me-α-Man, D: Me-α-GlcNAc, E: Me-α-GalNAc, F: GalN · HCl, G: GalNAc, H: L-Fuc, I: D-Fuc, where “*” indicates the result of 0.1 M Me-α-GalNAc (20 min). 種々の糖存在下におけるＢＰＴＧ活性化率の推移を示す図である。It is a figure which shows transition of the BPTG activation rate in presence of various saccharides. ＢＰＴＧ又はＢＰＴと、Ｄ−ＧａｌＮＡｃとのプレインキュベーションによる活性化抑制効果の比較を示す図である。It is a figure which shows the comparison of the activation inhibitory effect by the preincubation of BPTG or BPT, and D-GalNAc. ロットの異なるＢＰＴＧおよびＢＰＴと、α−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰ又はα−Ｍａｎ−ＢＰとの結合（ｐＨ７．５）を、ＥＬＩＳＡにより検出した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having detected the coupling | bonding (pH7.5) of BPTG and BPT from which lots differ, and (alpha) -GalNAc-BP or (alpha) -Man-BP. α−Ｍａｎを持つ糖−ＢＰ−プローブの構造を示す図である。It is a figure which shows the structure of the sugar-BP-probe which has (alpha) -Man. 糖−ＢＰプローブを用いたＥＬＩＳＡによるＢＰＴＧの糖結合性（ｐＨ７．５とｐＨ５．５）の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the sugar-binding property (pH7.5 and pH5.5) of BPTG by ELISA using a sugar-BP probe. ＳＰＲによるＢＰＴＧ固定化センサーチップへの糖の結合の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the coupling | bonding of the sugar to the BPTG immobilization sensor chip by SPR. ＢＰＴのＢＡＰＡを基質とした酵素活性への糖の影響の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of the influence of the saccharide | sugar on the enzyme activity which used BAPA of BPT as a substrate. ＢＰＴＧ、ＢＰＴと、アプロチニン（ＢＰＴＩ）との結合に与える糖の影響を示す図である。It is a figure which shows the influence of the saccharide | sugar which gives to the coupling | bonding of BPTG and BPT, and aprotinin (BPTI).

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、ガラクトサミン（以下、「ＧａｌＮ」ともいう。）又はその誘導体を含有する限り特に制限されず、本発明における「ＧａｌＮ」とは、Ｄ体のＧａｌＮ、Ｌ体のＧａｌＮのいずれであってもよいが、Ｄ体のＧａｌＮが好ましい。また、上記ＧａｌＮとしては、本発明におけるトリプシノーゲン活性化抑制効果（又はトリプシン阻害効果）を有している限り、α−ＧａｌＮ、β−ＧａｌＮのいずれであってもよい。さらに、上記のＧａｌＮの誘導体としては、本発明におけるトリプシノーゲン活性化抑制効果（又はトリプシン阻害効果）を有している限り特に制限されず、例えば、α−ＧａｌＮＡｃ；β−ＧａｌＮＡｃ；ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基が、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基、フェニルオキシ基、p−ニトロフェニルオキシ基等のアルコキシ基；ニトロ基；アミノ基; Ｆｍｏｃ基；種々の糖残基又はオリゴ糖鎖などに置換された化合物や、ＧａｌＮＡｃの２位のＮ−アセチル基が、遊離アミノ基；Ｎ−硫酸基；Ｎ−グリコリル基などに置換された化合物や、ＧａｌＮＡｃの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が、硫酸基；Ｏ−アセチル基；リン酸基；種々の糖残基又はオリゴ糖鎖などに置換された化合物や、メチルα−ガラクトサミニド、メチルβ−ガラクトサミニドなどの化合物や、これらの化合物の塩などを好適に例示することができる。上記の化合物の塩としては、例えば、化合物の塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩を例示することができ、中でも酸付加塩を好適に例示することができ、中でも塩酸塩をより好適に例示することができる。本発明において特に好ましいＧａｌＮ又はその誘導体としては、Ｄ体のＧａｌＮ及びその塩や、Ｄ体のα−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がメトキシ基に置換された化合物（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ）及びその塩や、Ｄ体のα−ＧａｌＮＡｃの１位のヒドロキシ基がフェニル基又はニトロフェニル基に置換された化合物及びその塩等を挙げることができ、さらに好ましいものとして、Ｄ体のＧａｌＮの塩酸塩（ＧａｌＮ・ＨＣｌ）や、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃを挙げることができる。   The trypsinogen activation inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it contains galactosamine (hereinafter also referred to as “GalN”) or a derivative thereof, and “GalN” in the present invention refers to D-form GalN, L-form. Any of GalN may be used, but D-form GalN is preferable. Moreover, as said GalN, as long as it has the trypsinogen activation inhibitory effect (or trypsin inhibitory effect) in this invention, either (alpha) -GalN and (beta) -GalN may be sufficient. Furthermore, the GalN derivative is not particularly limited as long as it has the trypsinogen activation inhibitory effect (or trypsin inhibitory effect) in the present invention. For example, α-GalNAc; β-GalNAc; Hydroxy group is substituted with alkoxy group such as methoxy group, ethoxy group, butoxy group, phenyloxy group, p-nitrophenyloxy group; nitro group; amino group; Fmoc group; various sugar residues or oligosaccharide chains A compound in which the N-acetyl group at the 2-position of GalNAc is substituted with a free amino group; N-sulfuric acid group; N-glycolyl group, or the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of GalNAc , Sulfate group; O-acetyl group; phosphate group; compounds substituted with various sugar residues or oligosaccharide chains, and methyl α-galactosamini , It can be preferably exemplified and compounds such as methyl β- galactosaminidic, and salts of these compounds. Examples of the salt of the above compound include, for example, hydrochloride, phosphate, nitrate, sulfate, acetate, propionate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, Acid addition salts such as malate and metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt can be exemplified, among which acid addition salts can be preferably exemplified, and among them, hydrochloride is more preferably exemplified. can do. Particularly preferred GalN or a derivative thereof in the present invention includes D-form GalN and a salt thereof, a compound in which the hydroxy group at the 1-position of D-form α-GalNAc is substituted with a methoxy group (Me-α-GalNAc) and the derivatives thereof. Examples thereof include salts and compounds in which the hydroxy group at the 1-position of α-GalNAc in D form is substituted with a phenyl group or a nitrophenyl group, and salts thereof, and more preferred are D form GalN hydrochloride ( (GalN · HCl) and Me-α-GalNAc.

また、本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤に含有されるＧａｌＮ又はその誘導体の形態としては、特に制限されず、ＧａｌＮ又はその誘導体自体であってもよいし、ＧａｌＮ又はその誘導体同士がα結合及び／又はβ結合により結合する糖鎖の形態であってもよいし、ＧａｌＮ又はその誘導体やその糖鎖が、ＧａｌＮ又はその誘導体以外の糖、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質等の他の生体分子と結合する生体分子複合体であってもよいが、特に優れたトリプシノーゲン活性化抑制効果が期待できる点で、ＧａｌＮ又はその誘導体同士がα結合により結合する糖鎖の形態や、該糖鎖を含む生体分子複合体、すなわちオリゴ糖鎖、糖タンパク質、糖脂質、または多糖鎖などの形態であることが好ましい。   In addition, the form of GalN or a derivative thereof contained in the trypsinogen activation inhibitor of the present invention is not particularly limited, and may be GalN or a derivative thereof itself. Alternatively, it may be in the form of a sugar chain that binds by a β bond, or GalN or a derivative thereof or a sugar chain thereof binds to other biomolecules such as sugars, proteins, peptides, nucleic acids, lipids other than GalN or its derivatives. In view of the fact that a particularly excellent trypsinogen activation inhibitory effect can be expected, the form of a sugar chain in which GalN or its derivatives are bonded by an α bond, or a biomolecule containing the sugar chain The complex is preferably in the form of an oligosaccharide chain, glycoprotein, glycolipid, or polysaccharide chain.

本発明において「トリプシノーゲン活性化抑制効果」とは、トリプシンによる、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）を抑制する効果を意味し、トリプシノーゲンに結合して保護作用を示すことによって、トリプシンへの分解を抑制する効果の他、トリプシンに結合することによって、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解を抑制する効果も含まれる。あるＧａｌＮ又はその誘導体がトリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているかどうかは、例えば、後述の実施例１記載の「糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験」と同様の実験によって容易に確認することができる。具体的には、後述の実施例１記載の実験と同様の実験において、トリプシン溶液の添加から２０分間経過後のサンプル中の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」（以下、単に「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」ともいう。）が、そのＧａｌＮ又はその誘導体を添加した場合に、それを添加していない場合に比べて、低いときは、そのＧａｌＮ又はその誘導体はトリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているといえる。本発明における「トリプシノーゲン活性化抑制効果」の好ましい程度としては、後述の実施例１記載の実験と同様の実験において、ＧａｌＮ又はその誘導体を添加した場合の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」が、ＧａｌＮ又はその誘導体を添加していない場合の「ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ」に対する割合として６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下、最も好ましくは３０％以下である場合を例示することができる。   In the present invention, the “trypsinogen activation inhibitory effect” means an effect of inhibiting the trypsin degradation from trypsinogen to trypsin (activation of trypsinogen). By binding to trypsinogen and showing a protective action, trypsin In addition to the effect of inhibiting the degradation of, the effect of inhibiting the degradation of trypsinogen to trypsin by binding to trypsin is also included. Whether a certain GalN or a derivative thereof has a trypsinogen activation inhibitory effect can be easily confirmed, for example, by an experiment similar to the “Experiment for inhibiting trypsinogen activation by sugar” described in Example 1 described later. Specifically, in an experiment similar to the experiment described in Example 1 described later, “BPT / BPTG + BPT” (hereinafter, also simply referred to as “BPT / BPTG + BPT”) in the sample 20 minutes after the addition of the trypsin solution. However, when the GalN or its derivative is added, compared to the case where it is not added, it can be said that the GalN or its derivative has a trypsinogen activation inhibitory effect. As a preferable degree of the “trypsinogen activation inhibitory effect” in the present invention, “BPT / BPTG + BPT” when GalN or a derivative thereof is added in the same experiment as that described in Example 1 described later is GalN or a derivative thereof. As an example, the ratio with respect to “BPT / BPTG + BPT” when no is added is 60% or less, more preferably 50% or less, still more preferably 40% or less, and most preferably 30% or less.

上記のトリプシノーゲンとしては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳類由来のトリプシノーゲンやそれらのアイソフォームを好適に例示することができ、中でもヒト由来のトリプシノーゲンやそのアイソフォームをより好適に例示することができ、上記のトリプシンとしては、前述の哺乳類由来のトリプシンやそれらのアイソフォームを好適に例示することができ、中でもヒト由来のトリプシンやそのアイソフォームをより好適に例示することができる。なお、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体は、いずれか１種類のトリプシノーゲンに対して、その活性化抑制効果を有していればよい。   As the above trypsinogen, trypsinogen derived from mammals such as humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, pigs, horses, rabbits, sheep, goats, cats, dogs, etc. and their isoforms are preferably exemplified. Among them, human trypsinogen and isoforms thereof can be exemplified more preferably. As the above trypsin, the aforementioned trypsin derived from mammals and their isoforms can be exemplified preferably. It is possible to more suitably exemplify trypsin and its isoform. In addition, GalN or its derivative | guide_body in this invention should just have the activation inhibitory effect with respect to any one type of trypsinogen.

上記のＧａｌＮの入手方法としては、市販のものを用いてもよいし、ガラクトースから公知の方法で誘導してもよい。また、ＧａｌＮの誘導体についても、導入する置換基の部位や置換基の種類等に応じて適宜製造することができる。また、ＧａｌＮ又はその誘導体が結合した糖鎖や、ＧａｌＮ又はその誘導体を含む生体高分子複合体などについても、同様に適宜製造することができる。   As a method for obtaining the above GalN, a commercially available product may be used, or it may be derived from galactose by a known method. In addition, a derivative of GalN can be appropriately produced according to the site of the substituent to be introduced, the type of substituent, and the like. In addition, a sugar chain to which GalN or a derivative thereof is bound, a biopolymer complex containing GalN or a derivative thereof, and the like can be appropriately produced in the same manner.

本発明の膵炎の予防・治療剤は、ＧａｌＮ又はその誘導体を含有する限り特に制限がされず、このＧａｌＮ又はその誘導体や、その好ましい態様については前述したとおりである。なお、本明細書の背景技術においても述べたように、膵炎は、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化されて炎症を生じるものであるので、トリプシノーゲン活性化抑制効果を有しているＧａｌＮ又はその誘導体を用いれば、膵炎の予防効果や治療効果を得ることができる可能性が極めて高い。本発明における「膵炎の予防効果」とは、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を投与しない場合に比べて、それを投与した場合に、膵炎の発症の程度が軽減又は抑止される効果を意味し、本発明における「膵炎の治療効果」とは、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を投与しない場合に比べて、それを投与した場合に、膵炎の程度が改善又は治癒する効果を意味する。膵炎の発症の程度や膵炎の程度は、膵臓の組織の状態や血中のアミラーゼの濃度等を基準に適宜評価することができる。   The prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis of the present invention is not particularly limited as long as it contains GalN or a derivative thereof, and the GalN or a derivative thereof and a preferred embodiment thereof are as described above. As described in the background art of the present specification, pancreatitis is caused by digestion enzyme of pancreatic juice, and the pancreas itself is digested to cause inflammation. Therefore, GalN having a trypsinogen activation inhibitory effect or If the derivative is used, it is very likely that a prophylactic effect or a therapeutic effect for pancreatitis can be obtained. The “preventive effect of pancreatitis” in the present invention means an effect that the degree of onset of pancreatitis is reduced or suppressed when it is administered as compared with the case where GalN or a derivative thereof is not administered. The “therapeutic effect of pancreatitis” in the present invention means an effect that the degree of pancreatitis is improved or cured when it is administered, compared with the case where GalN or a derivative thereof is not administered. The degree of onset of pancreatitis and the degree of pancreatitis can be appropriately evaluated based on the state of pancreatic tissue, the concentration of amylase in blood, and the like.

上記の本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤や膵炎の予防・治療剤（以下、両剤を併せて「本発明の剤」ともいう。）は、ＧａｌＮ又はその誘導体による、トリプシノーゲンからトリプシンへの活性化抑制効果や膵炎の予防・治療効果が得られる限り、ＧａｌＮ又はその誘導体の他に、他のトリプシノーゲン活性化抑制剤や、アプロチニン等のトリプシン阻害剤や、他の膵炎の予防・治療剤などの任意成分を含んでいてもよい。   The above trypsinogen activation inhibitor and pancreatitis preventive / therapeutic agent of the present invention (hereinafter, both agents are also referred to as “the agent of the present invention”) suppress the activation of trypsinogen to trypsin by GalN or its derivatives. In addition to GalN or its derivatives, other ingredients such as other trypsinogen activation inhibitors, trypsin inhibitors such as aprotinin, and other pancreatitis preventive / therapeutic agents can be used as long as the effect and preventive / therapeutic effect of pancreatitis are obtained. May be included.

本発明の剤に含有されるＧａｌＮ又はその誘導体は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、特にインビボにおける膵炎の予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの注射用の液剤や、注射用のゲル剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＧａｌＮ又はその誘導体を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができ、前述のゲル剤の製造方法としては、例えばＧａｌＮ又はその誘導体をゼラチンと混和する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤などの任意成分を配合することができる。   GalN or a derivative thereof contained in the agent of the present invention can be made into an appropriate preparation by a conventional method. The preparation may be a solid preparation such as a powder or a granule, but from the viewpoint of obtaining an effect of preventing or treating pancreatitis in vivo, an injectable solution such as a solution, an emulsion or a suspension, or an injection It is preferable to use a gel agent. As a method for producing the above-mentioned liquid agent, for example, a method of mixing GalN or a derivative thereof with a solvent, and a method of further mixing a suspending agent or an emulsifier can be preferably exemplified. For example, a method of mixing GalN or a derivative thereof with gelatin can be preferably exemplified. As described above, when the formulation of GalN or a derivative thereof according to the present invention is used, an appropriate pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a binder, a solvent, Optional components such as adjuvants, suspending agents, emulsifiers, tonicity agents, buffers, stabilizers, soothing agents, preservatives, antioxidants, and coloring agents can be blended.

前述の溶剤としては、精製水、生理的食塩水、リンゲル液、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、マクロゴールなどの親水性溶剤や、オリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ツバキ油、ナタネ油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、高級脂肪酸エステル、流動パラフィンなどの油性溶剤を例示することができ、また、前述の懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アラビアゴム、ベントナイトなどを例示することができ、さらに、前述の乳化剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、コレステロール，卵黄、ベントナイト、ビーガム、セタノール、モノステアリン酸グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ステアリン酸などを例示することができる。   Examples of the above-mentioned solvents include purified water, physiological saline, Ringer's solution, ethanol, propylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, macrogol and other hydrophilic solvents, olive oil, peanut oil, sesame oil, camellia oil, rapeseed oil, fatty acid monoglyceride Oily solvents such as fatty acid diglycerides, higher fatty acid esters, liquid paraffin, and the like, and the aforementioned suspending agents include stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzil chloride Luconium, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose , Hydroxypropylcellulose, polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, gum arabic, bentonite and the like. Further, as the above-mentioned emulsifier, gum arabic, gelatin, lecithin, cholesterol, egg yolk, bentonite, bee gum Cetanol, glyceryl monostearate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, stearic acid and the like.

前述の溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどを例示することができ、また、前述の賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、コーンスターチ、Ｄ−マンニトール、デキストリン、結晶セルロース、アラビアゴム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、血清アルブミンなどを例示することができ、さらに、前述の結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどを例示することができる。   Examples of the aforementioned solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, sodium acetate and the like. Examples of the aforementioned excipient include lactose, sucrose, D-sorbitol, starch, pregelatinized starch, corn starch, D-mannitol, dextrin, crystalline cellulose, gum arabic, low-substituted hydroxypropylcellulose Carboxymethylcellulose sodium, methylcellulose, serum albumin and the like, and examples of the binder include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, gum arabic, Examples thereof include roulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, trehalose, dextrin, pullulan, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and polyvinyl alcohol.

前述の等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、サッカロース、グリセリン、尿素などを例示することができ、また、前述の緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、グリセリンなどを例示することができ、さらに、前述の防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などを例示することができる。前述の安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミンなどを例示することができ、また、前述の無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどを例示することができ、さらに、前述の抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを例示することができる。また、前述の着色剤としては、タール系色素、カラメル、ベンガラ、二酸化チタン、エリス・アンド・エベラールド社のＦＤ＆Ｃブルー２号ならびにＦＤ＆Ｃレッド４０号などのＦＤ＆Ｃ染料などを例示することができる。   Examples of the isotonic agent include sodium chloride, potassium chloride, glucose, fructose, mannitol, sorbitol, lactose, saccharose, glycerin, urea and the like, and examples of the buffer include sodium citrate. In addition, glycerin and the like can be exemplified, and as the above-mentioned preservatives, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like can be exemplified. Examples of the stabilizer include polyethylene glycol, sodium dextran sulfate, amino acids, and human serum albumin. Examples of the soothing agent include glucose, calcium gluconate, and procaine hydrochloride. In addition, examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid. Examples of the colorant include tar dyes, caramel, bengara, titanium dioxide, and FD & C dyes such as FD & C Blue 2 and FD & C Red 40 manufactured by Ellis and Everald.

本発明の剤を膵炎の予防や治療に用いる場合における、本発明の剤の投与方法としては、膵炎の予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与や膵臓の炎症部位への直接投与、経口投与、腹腔内投与を例示することができる。また、本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、膵炎の状態や患者の体重等に応じて、適宜調節することができる。   In the case where the agent of the present invention is used for the prevention or treatment of pancreatitis, the method of administration of the agent of the present invention is not particularly limited as long as the effect of preventing or treating pancreatitis is obtained, and is administered intravenously or to the inflammation site of the pancreas. Direct administration, oral administration, and intraperitoneal administration can be exemplified. In addition, the dose, the number of doses, and the dose concentration of the agent of the present invention can be appropriately adjusted according to the state of pancreatitis, the weight of the patient, and the like.

本発明の膵炎の予防・治療剤の対象となる膵炎としては、膵液の消化酵素によって、膵臓自体が消化される炎症に関連している限り、急性膵炎であっても慢性膵炎であってもよいが、急性膵炎を特に好適に例示することができる。また、膵炎に対して予防・治療効果を発揮する結果として、敗血症、膵臓の周囲の臓器（腎臓、大腸、胃など）の炎症、膵仮性嚢胞、膵壊死、感染性膵壊死などの、膵炎の合併症に対しても、予防・治療効果を発揮する。   The pancreatitis that is the target of the preventive / therapeutic agent for pancreatitis of the present invention may be acute pancreatitis or chronic pancreatitis as long as it is related to inflammation in which the pancreas itself is digested by pancreatic juice digestive enzymes. However, acute pancreatitis can be particularly preferably exemplified. Moreover, as a result of exerting preventive and therapeutic effects on pancreatitis, pancreatitis such as sepsis, inflammation of organs around the pancreas (kidney, large intestine, stomach, etc.), pancreatic pseudocyst, pancreatic necrosis, infectious pancreatic necrosis, etc. Effective for preventing and treating complications.

また、本発明には、トリプシノーゲン活性化抑制剤の製造におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体をトリプシノーゲン活性化抑制剤として使用する方法や、トリプシノーゲンの活性化抑制におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、膵炎の予防・治療剤の製造におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体を膵炎の予防・治療剤に使用する方法や、膵炎の予防・治療におけるＧａｌＮ又はその誘導体の使用や、ＧａｌＮ又はその誘導体を哺乳動物（特にヒト）に投与することを特徴とする膵炎の予防・治療方法も含まれる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。   In addition, the present invention includes the use of GalN or a derivative thereof in the production of a trypsinogen activation inhibitor, a method of using GalN or a derivative thereof as a trypsinogen activation inhibitor, GalN or a derivative thereof in inhibiting the activation of trypsinogen. Use, use of GalN or a derivative thereof in the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis, use of GalN or a derivative thereof as a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis, use of GalN or a derivative thereof in the prevention / treatment of pancreatitis, And a method for preventing and treating pancreatitis, which comprises administering GalN or a derivative thereof to a mammal (particularly a human). The contents of the words in these uses and methods and the preferred embodiments thereof are as described above.

本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、膵炎の予防や治療の他に、腸内での消化抑制剤、腸管細胞の増殖・分化の調節剤、組織溶解抑制剤等として用いることができる。なお、本発明におけるＧａｌＮ又はその誘導体のトリプシノーゲン活性化抑制効果が、ＧａｌＮ又はその誘導体がトリプシンに結合することによって、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解を抑制（すなわち、トリプシンのセリンプロテアーゼ活性を抑制）することにより発揮される場合は、また、本発明のトリプシノーゲン活性化抑制剤は、トリプシノーゲンが存在しない条件下でもトリプシン阻害剤として利用することができる他、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、トロンビン、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、トリプターゼ、マトリプターゼ及びプロテアーゼにより活性化されるレセプター、の活性化抑制剤としても利用することができる。   In addition to prevention and treatment of pancreatitis, the trypsinogen activation inhibitor of the present invention can be used as a digestive inhibitor in the intestine, a regulator of intestinal cell proliferation / differentiation, a tissue dissolution inhibitor, and the like. In addition, the trypsinogen activation inhibitory effect of GalN or a derivative thereof in the present invention suppresses the decomposition of trypsinogen into trypsin by binding GalN or a derivative thereof (that is, suppresses the serine protease activity of trypsin). In addition, the trypsinogen activation inhibitor of the present invention can be used as a trypsin inhibitor even in the absence of trypsinogen, chymotrypsin, elastase, carboxypeptidase, thrombin, plasmin, plasminol It can also be used as an activation inhibitor for gen activators, tryptases, matriptases and receptors activated by proteases.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

１．［糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。なお、カッコ内にはコード番号を示す。
ウシ膵臓トリプシノーゲン（ＢＰＴＧ）は、MP Biomedicals, Inc.製のもの（101195）を用い、ウシ膵臓トリプシン（ＢＰＴ）は、和光純薬株式会社製のもの（204-13951）を用い、Phenylmethylsulfonyl Fluoride（ＰＭＳＦ）は、Nacalai Tesque, INC.製のもの（27327-52）を用い、Methyl-α-D-galactopyranoside（Ｍｅ−α−Ｇａｌ）は、Sigma-Aldrich Corporation製のもの（M1379-25MG）を用い、1-O-Methyl-β-D-galactopyranoside（Ｍｅ−β−Ｇａｌ）は、Nacalai Tesque, INC.製のもの（22526-34）を用い、Methyl-α-D-Mannopyranoside（Ｍｅ−α−Ｍａｎ）は、和光純薬株式会社製のもの（131-08021）を用い、Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucosaminide（Ｍｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ）は、Sigma-Aldrich Corporation製のもの（M0257-100MG）を用い、Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-galactosaminide（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ）は、Toronto Research Chemicals, Inc.製のもの（M275310）を用い、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（ＧａｌＮ・ＨＣｌ）は、生化学工業製のもの（Lot.S6701）を用い、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、Toronto Research Chemicals Inc.製のもの（A17700）を用い、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）は、Fluka AG, Chem. Fabrik製のものを用い、Ｄ−フコース（Ｄ−Ｆｕｃ）は、和光純薬株式会社製のものを用いた。 1. [Experiment on inhibition of trypsinogen activation by sugar]
(1) Material The following materials were used for this experiment. The code number is shown in parentheses.
Bovine pancreatic trypsinogen (BPTG) was made by MP Biomedicals, Inc. (101195), bovine pancreatic trypsin (BPT) was made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (204-13951), and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ) Is from Nacalai Tesque, INC. (27327-52), Methyl-α-D-galactopyranoside (Me-α-Gal) is from Sigma-Aldrich Corporation (M1379-25MG) 1-O-Methyl-β-D-galactopyranoside (Me-β-Gal) is manufactured by Nacalai Tesque, INC. (22526-34), and Methyl-α-D-Mannopyranoside (Me-α-Man) Is manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (131-08021), and Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucosaminide (Me-α-GlcNAc) is manufactured by Sigma-Aldrich Corporation ( M0257-100MG) and Methyl-N-acetyl-2-deoxy-α-D-galactosaminide (Me-α-GalNAc) manufactured by Toronto Research Chemicals, Inc. (M275310), D-galactosamine hydrochloride (GalN · HCl) manufactured by Seikagaku Corporation (Lot. S6701) was used, and N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) was manufactured by Toronto Research Chemicals Inc. L-fucose (L-Fuc) is from Fluka AG, Chem. Fabrik, and D-fucose (D-Fuc) is from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. It was.

（２）方法及び結果
トリプシンによるトリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）に対して、糖がどのような影響を与えるかを調べるために、ＢＰＴＧをＢＰＴ及び糖存在下でアッセイした場合の、ＢＰＴＧ量やＢＰＴ量の変化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の変化によって確認した。具体的には、以下の方法で行なった。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ、及び上記１．（１）記載の９種類の各糖を、それぞれ別のエッペンチューブに分取し、さらにそれぞれのエッペンチューブにＴＢＳ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ］を添加して、５．０ｍｇ／ｍｌのＢＰＴＧ溶液、３．７ｍｇ／ｍｌのＢＰＴ溶液、及び０．３Ｍの各糖溶液を調製した。 (2) Methods and results In order to examine the effect of sugar on trypsin degradation from trypsinogen to trypsin (activation of trypsinogen), BPTG was assayed in the presence of BPT and sugar. The change in the amount of BPTG and the amount of BPT was confirmed by the change in molecular weight by SDS-PAGE. Specifically, the following method was used.
BPTG, BPT, and 1. (1) Each of the nine sugars described in the above is dispensed into separate Eppendorf tubes, and a TBS solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl] is further added to each Eppendorf tube. A 0.0 mg / ml BPTG solution, a 3.7 mg / ml BPT solution, and a 0.3 M sugar solution were prepared.

１種類の糖溶液に関して、新たな５００μｌエッペンチューブを１２本用意し、１２本すべてに前述のＢＰＴＧ溶液を１６０μｌずつ分取した後、さらに、その１２本のうち６本のエッペンチューブには前述のＴＢＳを１１０μｌずつ添加し、残りの６本のエッペンチューブにその１種類の糖溶液を１１０μｌずつ添加して撹拌した。その後、氷上で２０〜３０分間インキュベートした。その後、これら１２本のエッペンチューブにＢＰＴ溶液を３０μｌずつ添加して攪拌し、３７℃で反応させた。この状態での反応液はいずれもｐＨ ４．６となるように調整した。ＢＰＴ溶液の添加から０分後、２分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後の各時点で、糖溶液を含むエッペンチューブ（ＢＰＴＧ＋糖溶液＋ＢＰＴ）と、糖溶液を含まないエッペンチューブ（ＢＰＴＧ＋ＴＢＳ＋ＢＰＴ）をそれぞれ１本ずつ氷上に移すとともに、５０ｍＭ ＰＭＳＦ（トリプシン阻害剤）を含むＴＢＳ溶液を３．２μｌ加え混合し、反応を停止させた。これらの一連の操作を、他の８種類の糖溶液に関しても行なった。   For one type of sugar solution, prepare 12 new 500 μl Eppendorf tubes, dispense 160 μl of the above-mentioned BPTG solution to all 12 pieces, and then add 6 of the 12 Eppendorf tubes to the above-mentioned Eppendorf tube. 110 μl of TBS was added to each of the remaining six Eppendorf tubes, and 110 μl of each sugar solution was added to each of the remaining six Eppendorf tubes and stirred. Thereafter, it was incubated on ice for 20-30 minutes. Thereafter, 30 μl of the BPT solution was added to each of these 12 Eppendorf tubes, stirred, and reacted at 37 ° C. The reaction liquid in this state was adjusted to have a pH of 4.6. At each point of time 0 minutes, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, and 20 minutes after the addition of the BPT solution, the Eppendorf tube containing the sugar solution (BPTG + sugar solution + BPT) and the sugar solution One Eppendorf tube (BPTG + TBS + BPT) not included was transferred onto ice, and 3.2 μl of TBS solution containing 50 mM PMSF (trypsin inhibitor) was added and mixed to stop the reaction. These series of operations were also performed on the other eight sugar solutions.

このようにして得られた各サンプルから、１サンプルあたり４０μｌずつ分取し、そこにサンプルバッファー（５ｘ）を１０μｌずつ添加した後、１００℃で５分ボイルして泳動用サンプルを調製した。それらの泳動用の各サンプル（７μｇ）について、ポリアクリルアミドゲル（濃縮ゲルにおいてはＰＡＧ濃度３％、泳動ゲルにおいてはＰＡＧ濃度１２％）を用い、２５ｍＡ／ｇｅｌで１．５時間、Laaemmli法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のポリアクリルアミドゲルをCoomassie brilliant blue染色液中で約１０分間染色した後、脱色液中で過剰な色素を脱染した。その後、その泳動ゲルをスキャナーで読み取り、各糖における各時間のサンプル中のＢＰＴＧやＢＰＴ量の推移を調べた。その結果を図１に示す。図１の各パネルにおける「＋」は、その糖を添加したサンプル（その糖の存在下におけるサンプル）であることを意味し、「−」は、その糖を添加していないサンプル（その糖の非存在下におけるサンプル）を意味する。また、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＢＰＴＧやＢＰＴのバンドの染色強度は、各タンパク質の量に比例するので、図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＢＰＴＧやＢＰＴのバンドの染色強度を、Image J (1.37v, National Institutes of Health)のソフトウエアを利用して数値化し、ＢＰＴＧがＢＰＴに変化した割合を算出した。具体的には、図１の各糖における各時間のサンプル中のＢＰＴＧとＢＰＴの量の和に対するＢＰＴの割合（ＢＰＴ／ＢＰＴＧ＋ＢＰＴ；以下、「ＢＰＴＧの活性化率」ともいう。）を算出し、その「ＢＰＴＧの活性化率」の推移をグラフ化した。その結果を図２に示す。   From each sample thus obtained, 40 μl was sampled per sample, 10 μl of sample buffer (5 ×) was added thereto, and then boiled at 100 ° C. for 5 minutes to prepare a sample for electrophoresis. For each sample (7 μg) for electrophoresis, polyacrylamide gel (PAG concentration of 3% in the concentrated gel and PAG concentration of 12% in the electrophoresis gel) was used at 25 mA / gel for 1.5 hours by the Laaemmli method. SDS-PAGE was performed. The polyacrylamide gel after electrophoresis was stained in Coomassie brilliant blue staining solution for about 10 minutes, and then the excess dye was destained in the decoloring solution. Thereafter, the electrophoretic gel was read with a scanner, and the transition of the amount of BPTG and BPT in the sample at each time for each sugar was examined. The result is shown in FIG. “+” In each panel in FIG. 1 means a sample to which the sugar is added (a sample in the presence of the sugar), and “−” denotes a sample to which the sugar is not added (of the sugar). Sample in the absence). Further, since the staining intensity of the BPTG and BPT bands in the SDS-PAGE of FIG. 1 is proportional to the amount of each protein, the staining intensity of the BPTG and BPT bands in the SDS-PAGE of FIG. , National Institutes of Health) was used for quantification, and the ratio of BPTG to BPT was calculated. Specifically, the ratio of BPT to the sum of the amounts of BPTG and BPT in each time sample in each saccharide in FIG. 1 (BPT / BPTG + BPT; hereinafter also referred to as “BPTG activation rate”) is calculated. The transition of the “BPTG activation rate” was graphed. The result is shown in FIG.

図１及び図２の結果から、Ｍｅ−α−ＧａｌとＭｅ−α−ＧｌｃＮＡｃ、Ｌ−ＦｕｃならびにＤ−Ｆｕｃにおいては、糖の添加の有無にかかわらず、時間の経過と共にＢＰＴＧが分解されて、ＢＰＴへと変化していることが示され、また、Ｍｅ−β−ＧａｌやＭｅ−α−ＭａｎやＧａｌＮＡｃにおいては、時間の経過と共にＢＰＴＧが分解されてはいるものの、糖の添加によって、わずかではあるが、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解が抑制されていることが示され、さらに、ＧａｌＮ・ＨＣｌでは糖の添加によって、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解がかなり抑制されていることが示され、また、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃにおいては、糖の添加により、２０分経過後でもＢＰＴＧはほとんど分解せず、ＢＰＴＧからＢＰＴへの分解が顕著に抑制されていることが示された。Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃやＧａｌＮ・ＨＣｌによるトリプシノーゲンの分解抑制（活性化抑制）のメカニズムの詳細は未だ明らかではないが、トリプシノーゲンに結合した糖がトリプシノーゲンの不活性構造を保護する可能性、又は、トリプシンに結合した糖がトリプシンのタンパク質分解活性を阻害する可能性が考えられる。なお、０．１Ｍ Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃでは、糖とＢＰＴＧを氷上で２０分間プレインキュベートした直後の０ｍｉｎにおいて、ＢＰＴＧのバンドが常に薄くなったが、その後３７℃の保温でバンドの濃さは復活した。この原因は不明であるが、ＢＰＴＧの構造変化により、０℃付近での溶解度が変化した可能性も考えられる。また、ＧａｌＮ・ＨＣｌは、溶液中ではＧａｌＮのα体とβ体が生じ、ＧａｌＮＡｃは、溶液中ではＧａｌＮＡｃのα体とβ体が生じる。   From the results of FIG. 1 and FIG. 2, in Me-α-Gal, Me-α-GlcNAc, L-Fuc and D-Fuc, BPTG was decomposed over time regardless of the addition of sugar, In Me-β-Gal, Me-α-Man, and GalNAc, although BPTG is decomposed over time, the addition of sugar does not cause a slight change. However, the degradation of BPTG to BPT is shown to be suppressed, and further, GalN · HCl shows that the addition of sugar significantly suppresses the degradation of BPTG to BPT, and Me In -α-GalNAc, addition of sugar hardly decomposes BPTG even after 20 minutes, and the decomposition of BPTG to BPT is remarkably suppressed. Rukoto has been shown. The details of the mechanism of inhibiting the degradation of trypsinogen (inhibition of activation) by Me-α-GalNAc or GalN · HCl is not yet clear, but the possibility that the sugar bound to trypsinogen protects the inactive structure of trypsinogen, or trypsin There is a possibility that the sugar bound to the protein inhibits the proteolytic activity of trypsin. In addition, in 0.1M Me-α-GalNAc, the BPTG band was always thinned at 0 min immediately after sugar and BPTG were preincubated on ice for 20 minutes, but after that, the density of the band was restored by incubation at 37 ° C. did. The cause of this is unknown, but the solubility at around 0 ° C. may have changed due to the structural change of BPTG. In addition, GalN · HCl produces GalN α and β forms in solution, and GalNAc produces GalNAc α and β forms in solution.

さらに、前述の[糖によるトリプシノーゲン活性化抑制実験]において、ＢＰＴＧを０．１Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃの存在下、氷上で２０分間プレインキュベーションする過程を行わず、代わりに３０μｌのＢＰＴ溶液に１１０μｌの０．３Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃ(終濃度０．２４Ｍとなる)又は１１０μｌの糖を含まないＴＢＳ溶液を加えて混合し、氷上で２０分間プレインキュベーションしてから、糖とプレインキュベーションしていないＢＰＴＧ溶液１６０μＬを加え、同様に活性化実験を行った。同時に実施例１の条件でも活性化実験を行い、両者の結果を比較した。その結果を図３に示す。図３の結果から、ＢＰＴを０．１Ｍ Ｄ−ＧａｌＮＡｃとプレインキュベーションした場合、ＢＰＴＧはコントロール（糖非存在下）と同様に活性化され、活性化抑制が起こらなかった。すなわち糖による阻害作用はＢＰＴＧとのプレインキュベーションによってのみ起こることが示された。したがってＤ−ＧａｌＮＡｃによる活性化抑制効果は、ＢＰＴＧと糖の結合によって、トリプノーゲンの不活性構造が安定化され、ＢＰＴＧのＮ末端にある活性化ペプチドが切断されにくくなるためと考えられ、トリプシンと糖の結合によるものではないことが示された。すなわち、トリプシン活性阻害剤を基本とするこれまでの膵炎抑制剤とは異なり、本薬剤はトリプシノーゲンに作用して活性化を抑制するという新規なメカニズムに基づいてトリプシノーゲン等のプロ酵素の活性化を抑制することがわかった。本化合物は特にトリプシン阻害剤が効かないような場合の新規な膵炎の治療・予防方法に用い得る可能性が高い。   Further, in the above-mentioned [Experimental inhibition of trypsinogen activation by sugar], BPTG was not preincubated for 20 minutes on ice in the presence of 0.1M D-GalNAc, and 110 μl of 0.1 μl in 30 μl of BPT solution was used instead. Add 3M D-GalNAc (final concentration 0.24M) or 110 μl sugar-free TBS solution, mix, preincubate on ice for 20 minutes, then add 160 μL BPTG solution not pre-incubated with sugar Similarly, an activation experiment was performed. At the same time, an activation experiment was performed under the conditions of Example 1, and the results of both were compared. The result is shown in FIG. From the results of FIG. 3, when BPT was preincubated with 0.1M D-GalNAc, BPTG was activated in the same manner as the control (in the absence of sugar), and activation suppression did not occur. That is, it was shown that the inhibitory action by sugar occurs only by preincubation with BPTG. Therefore, the activation suppression effect by D-GalNAc is thought to be because the inactive structure of trypogen is stabilized by the binding of BPTG and sugar, and the activated peptide at the N-terminus of BPTG is less likely to be cleaved. It was shown that it was not due to sugar binding. In other words, unlike conventional pancreatitis inhibitors based on trypsin activity inhibitors, this drug inhibits the activation of proenzymes such as trypsinogen based on a novel mechanism of acting on trypsinogen to suppress activation. I found out that There is a high possibility that this compound can be used in a novel method for treating or preventing pancreatitis, particularly when trypsin inhibitor does not work.

２．［ＥＬＩＳＡ法による糖結合性分析］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ及びＰＭＳＦは、実施例１で用いたものと同様のものを用い、糖-biotinylated polyacrylamide probes（糖−ＢＰ プローブ）は、GlycoTech Co.（Gaithersburg, Maryland 20879）製のもの（ポリアクリルアミド骨格の−ＣＯＮＨ２基に、短いスペーサー（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）を介して糖をグリコシド結合で共有結合させたプローブ；例えばα−マンノースＢＰプローブについて図４参照）を用い、avidin-biotin-horseradish peroxidase complex（ＡＢＣ−ＨＲＰ）は、ＳＩＧＭＡ社製のもの（S5512）を用い、o-phenylene diamine（ＯＰＤ）は、和光純薬株式会社製のもの（161-11851）を用いた。 2. [Sugar binding analysis by ELISA method]
(1) Material The following materials were used for this experiment.
BPTG, BPT, and PMSF were the same as those used in Example 1, and the sugar-biotinylated polyacrylamide probes (sugar-BP probes) were manufactured by GlycoTech Co. (Gaithersburg, Maryland 20879) (polyacrylamide skeleton). Avidin-biotin using a probe in which a sugar is covalently bonded to the -CONH 2 group of the saccharide through a short spacer (-OCH 2 CH 2 CH 2- ); for example, an α-mannose BP probe; -horseradish peroxidase complex (ABC-HRP) was made by SIGMA (S5512), and o-phenylene diamine (OPD) was made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (161-11851).

（２）方法及び結果
実施例１で示された、トリプシノーゲンからトリプシンへの分解（トリプシノーゲンの活性化）に対する糖の抑制効果が、ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性と関連があるかどうかを調べるために、以下のようなＥＬＩＳＡ法による糖結合性分析を行なった。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴをそれぞれ３ｍｇ計り取り、２．９４ｍｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）と６０μｌの０．２Ｍ ＰＭＳＦ溶液を加えて溶解し、４℃で１時間、プレインキュベーションして、１ｍｇ／ｍｌのＢＰＴＧ溶液、及び、ＢＰＴ溶液を調製した。これらの溶液を１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で０．１〜１５μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレート（Immulon 1B，Thermo Scientific社製）の各ウエルにそれぞれ１００μｌずつ添加した。４℃、２時間インキュベーションすることによりＢＰＴＧ及びＢＰＴをプレートに固定化した。各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した後、各３００μｌの３％ ＢＳＡ（１０ｍＭ ＴＢＳ，ｐＨ７．５）を添加して、４℃で一晩ブロッキングした。１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）に、各糖（α−Ｍａｎ、α−Ｍａｎ−６−リン酸、α−Ｇａｌ、α−ＧａｌＮＡｃ、α−ＮｅｕＡｃ、β−Ｇａｌ又はＬａｃ）−ＢＰ プローブ又は糖を持たないＰＡＡプローブを１０μｇ／ｍｌとなるように加えた溶液を１００μｌずつ各ウエルに添加して、１時間室温で反応させた。各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した後、各１００μｌの０．７μｇ／ｍｌ ＡＢＣ−ＨＲＰを添加して、室温で１時間結合反応させた後、各３００μｌの１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で各ウエルを３回洗浄した。次に、各２００μｌの発色液［ＯＰＤ ８ｍｇ，５０ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ５．０）２０ｍｌ，３０％Ｈ２Ｏ２ ８μｌ］を各ウエルに添加して、室温で２５分間発色させた後、各５０μｌの２．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各ウエルに添加して発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−８０，Bio-Rad社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。以上の結合実験を、ＴＢＳの代わりに１０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いても、全く同様の手順で行った。 (2) Method and Results In order to examine whether or not the inhibitory effect of sugar on the degradation of trypsinogen to trypsin (activation of trypsinogen) shown in Example 1 is related to the sugar binding properties of BPTG and BPT The sugar binding analysis was performed by the ELISA method as follows.
Measure 3 mg each of BPTG and BPT, add 2.94 ml of 10 mM TBS (pH 7.5) and 60 μl of 0.2 M PMSF solution, dissolve, preincubate for 1 hour at 4 ° C., and then add 1 mg / ml of BPTG. Solutions and BPT solutions were prepared. These solutions were diluted to 0.1 to 15 μg / ml with 10 mM TBS (pH 7.5), and 100 μl was added to each well of a microtiter plate (Immulon 1B, manufactured by Thermo Scientific). BPTG and BPT were immobilized on the plate by incubation at 4 ° C. for 2 hours. Each well was washed three times with 300 μl of 10 mM TBS (pH 7.5), and then 300 μl of 3% BSA (10 mM TBS, pH 7.5) was added and blocked at 4 ° C. overnight. Each saccharide (α-Man, α-Man-6-phosphate, α-Gal, α-GalNAc, α-NeuAc, β-Gal or Lac) -BP probe or saccharide is contained in 10 mM TBS (pH 7.5). 100 μl of a solution containing 10 μg / ml of a non-PAA probe was added to each well and allowed to react for 1 hour at room temperature. Each well was washed 3 times with 300 μl of 10 mM TBS (pH 7.5), 100 μl of 0.7 μg / ml ABC-HRP was added, and the mixture was allowed to bind at room temperature for 1 hour, and then 300 μl of 10 mM of 10 mM TBS (pH 7.5). Each well was washed 3 times with TBS (pH 7.5). Next, 200 μl of each color developing solution [OPD 8 mg, 50 mM citrate phosphate buffer (pH 5.0) 20 ml, 30% H 2 O 2 8 μl] was added to each well, followed by color development at room temperature for 25 minutes. Color development was stopped by adding 50 μl of each 2.5 N H 2 SO 4 to each well. Absorbance at 490 nm was measured using a microplate reader (MPR-80, manufactured by Bio-Rad). The above binding experiment was carried out in exactly the same procedure using 10 mM acetic acid-sodium acetate buffer (pH 5.5) instead of TBS.

その結果を図４ならびに図６に示す。
図４からわかるように、ＢＰＴＧとＢＰＴは、α‐Ｍａｎを持つ糖ＢＰ−プローブには糖を持たないＰＡＡプローブより高い結合性を示し、α−ＧａｌＮＡｃを持つ糖−ＢＰプローブには、顕著に高い結合性を示した。また、ＢＰＴＧについて別ロットの製品を用いて同様の実験を行なったが、同様の結果であった。 The results are shown in FIG. 4 and FIG.
As can be seen from FIG. 4, BPTG and BPT show higher binding to sugar BP-probe with α-Man than PAA probe without sugar, and notably to sugar-BP probe with α-GalNAc. High binding was shown. In addition, the same experiment was performed on products of BPTG using products of different lots, and similar results were obtained.

また、図６に示すように、十二指腸内のｐＨであるｐＨ７．５において、ＢＰＴＧについて、ＧａｌＮＡｃを含む糖鎖を中心に、他の糖ＢＰ−プローブとの結合活性を調べたところ、ＢＰＴＧがα−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対してだけでなく、β−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対する結合活性を持っていることが新たに明らかになった。ｐＨ７．５において、α−ＮｅｕＡｃ，β−Ｇａｌ，又はＬａｃを持つ糖−ＢＰプローブには、糖を持たないＰＡＡプローブと同程度以下の低い結合性しか示さなかった。したがって、ｐＨ７．５においてもＢＰＴＧへのＧａｌＮ及びその誘導体の結合と、ＢＰＴＧ活性化抑制効果があると考えられ、実際にｐＨ５．５および実施例１のｐＨ ４．６と同様に、ｐＨ７．５においてもＢＰＴＧ活性化抑制効果が観測されている(データ示さず)。一方、チモーゲン顆粒内のｐＨであるｐＨ５．５において、ＢＰＴＧのα−ＧａｌＮＡｃ−ＢＰに対する結合量は、ｐＨ７．５の結果と同様に、ＢＰＴＧ濃度に依存して増強した。図６の結果から、ｐＨ５．５においては、ｐＨ７．５の場合と比べてα−Ｍａｎ−６−Ｐ及びα−Ｇａｌ−ＢＰに対する結合活性がほとんど消失し、対照的にα−ＮｅｕＡｃ−ＢＰに対する結合活性がｐＨ７．５の時と比べて著しく増強した。それ以外の結合する糖の種類にはほとんど差がみられなかった。ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性の高低に関するこれらの結果（ＢＰＴＧに関する図４Ａ、Ｂおよび図６）の傾向は、実施例１における糖（Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ、Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−α−Ｇａｌ、Ｍｅ−β−Ｇａｌ）のＢＰＴＧ活性化抑制効果の高低の結果の傾向と一致していた。   Further, as shown in FIG. 6, when BPTG was examined for binding activity with other sugar BP-probes centering on sugar chains containing GalNAc at pH 7.5, which is the pH in the duodenum, It was newly revealed that it has a binding activity not only to -GalNAc-BP but also to β-GalNAc-BP. At pH 7.5, the sugar-BP probe with α-NeuAc, β-Gal, or Lac showed only a low binding ability comparable to or less than the PAA probe without sugar. Therefore, it is considered that there is a binding effect of GalN and its derivatives to BPTG and an effect of suppressing BPTG activation even at pH 7.5. In fact, as in pH 5.5 and pH 4.6 of Example 1, pH 7.5 BPTG activation-inhibiting effect was also observed (data not shown). On the other hand, the binding amount of BPTG to α-GalNAc-BP was enhanced depending on the BPTG concentration at pH 5.5, which is the pH in the zymogen granule, as in the case of pH 7.5. From the results of FIG. 6, the binding activity to α-Man-6-P and α-Gal-BP almost disappeared at pH 5.5 compared to pH 7.5, in contrast to α-NeuAc-BP. The binding activity was remarkably enhanced compared to that at pH 7.5. There was almost no difference in the type of other linking sugars. The tendency of these results (FIG. 4A, B and FIG. 6 regarding BPTG) regarding the level of saccharide binding of BPTG and BPT is similar to the saccharide (Me-α-GalNAc, Me-α-Man, Me-α- in Example 1). (Gal, Me-β-Gal) was consistent with the trend of high and low BPTG activation inhibitory effect.

３．［ＳＰＲによるＢＰＴＧと糖との相互作用解析］
ＳＰＲを用いて、ＢＰＴＧと糖との相互作用解析を行なった。操作は全てBIACORE2000（GE Healthcare Bio-Sciences KK）を用い、付属のマニュアルに従って操作を行った。リガンドの固定化はアミンカップリング法を用いて、１０μｌ／ｍｉｎで各ステップを１４分間ずつ行った。ランニング緩衝液には、ＨＢＳ−ＥＰ ｂｕｆｆｅｒに終濃度０．２ｍＭになるように０．２Ｍ ＰＭＳＦ−エタノール溶液を加えて使用した。ＣＭ５センサーチップをランニング緩衝液で平衡化した後、アミンカップリングキットにより、チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した。リガンドに用いたＢＰＴＧやＢＰＴは、あらかじめ２ｍｇ秤りとった後、９６０μｌの１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に溶解し、０．２Ｍ ＰＭＳＦ−エタノール溶液を４０μｌ加え（終濃度８ｍＭ）、４℃、１時間振盪した（プレインキュベーション）。これを１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に、保護糖としてＭｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−α−Ｇａｌ又はＤ−ＧａｌＮＡｃを終濃度が各０．２ Ｍになるように加えた緩衝液を用いて１０μｇ／ｍｌに希釈した後、センサーチップにインジェクトして固定化を行った。残っているN-hydroxysuccinimide esterを１．０Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）でブロックした後、１０ｍＭ ＨＣｌで１分間洗浄してから測定に使用した。固定化されたＢＰＴＧは３７４３．６ＲＵ、ＢＰＴは８０１４．９ＲＵであった。リファレンスセル（対照セル）には、タンパク質溶液を固定化せずに、同様のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化と１．０Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によるブロッキングを行ったフローセルを用いた。アナライトには、Ｍｅ−α−Ｍａｎ，Ｌａｃ，Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ，Ｍｅ−β−Ｇａｌを、それぞれ０．０５，０．１，０．１５，０．２，０．２５，０．３Ｍの濃度になるように、ランニング緩衝液を用いて調製した。アナライトの糖類を含むランニング緩衝液をＢＰＴＧ固定化センサーチップ上に２０μＬ／ｍｉｎの流速で９０秒間インジェクトし、次にＴＢＳで溶出を行った。この実験の結果を図７に示す。 3. [Interaction analysis of BPTG and sugar by SPR]
Using SPR, interaction analysis between BPTG and sugar was performed. All the operations were performed using BIACORE2000 (GE Healthcare Bio-Sciences KK) according to the attached manual. For immobilization of the ligand, each step was carried out for 14 minutes at 10 μl / min using an amine coupling method. As the running buffer, a 0.2 M PMSF-ethanol solution was added to HBS-EP buffer to a final concentration of 0.2 mM. After equilibrating the CM5 sensor chip with a running buffer, the chip surface was activated with EDC / NHS using an amine coupling kit. BPTG and BPT used for the ligand are weighed in advance to 2 mg, dissolved in 960 μl of 10 mM CH 3 COOH-CH 3 COONa buffer (pH 6.0), and 40 μl of 0.2M PMSF-ethanol solution is added (final concentration). 8 mM) and shaken at 4 ° C. for 1 hour (preincubation). This was added to 10 mM CH 3 COOH-CH 3 COONa buffer (pH 6.0) as a protective sugar, such as Me-α-Man, Me-α-Gal or D-GalNAc so that the final concentration was 0.2 M each. The solution was diluted to 10 μg / ml with the buffer solution, and then injected into the sensor chip for immobilization. The remaining N-hydroxysuccinimide ester was blocked with 1.0 M ethanolamine · HCl (pH 8.0), washed with 10 mM HCl for 1 minute, and used for measurement. The immobilized BPTG was 3743.6 RU, and the BPT was 8014.9 RU. For the reference cell (control cell), a flow cell in which the same EDC / NHS activation and blocking with 1.0 M ethanolamine · HCl (pH 8.0) were performed without immobilizing the protein solution was used. For the analyte, Me-α-Man, Lac, Me-α-GalNAc, and Me-β-Gal were respectively 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3M. It was prepared using a running buffer so that the concentration of The running buffer containing the saccharide of the analyte was injected onto the BPTG-immobilized sensor chip at a flow rate of 20 μL / min for 90 seconds, and then eluted with TBS. The result of this experiment is shown in FIG.

図７に示すように、Ｍｅ−α−Ｍａｎ，Ｌａｃ，Ｍｅ−β−Ｇａｌをアナライトとして添加した際には、インジェクト終了とともに全てのアナライトが解離していた。一方、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃをアナライトとして添加したところ、フローセルに固定化したＢＰＴＧおよびＢＰＴ（ＢＰＴについては結果を示していない）とＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃの結合は、インジェクト終了後もほとんど解離せず、濃度依存的にＢＰＴＧやＢＰＴとの結合が示された。ＢＰＴＧやＢＰＴの最大結合量をもとに速度論的解析を行ったところ、ＢＰＴＧとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとのＫＡは１×１０６（Ｍ−１）、ＢＰＴとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとのＫＡは２×１０６（Ｍ−１）と算出された。これは、多くのレクチンと特異的な単糖とのＫＡが１０４〜５（Ｍ−１）の範囲であることを考慮すると、ＢＰＴＧとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとの間の結合や、ＢＰＴとＭｅ−α−ＧａｌＮＡｃとの間の結合はかなり強力で有意なものであると考えられる。 As shown in FIG. 7, when Me-α-Man, Lac, Me-β-Gal was added as an analyte, all the analytes were dissociated with the completion of the injection. On the other hand, when Me-α-GalNAc was added as an analyte, the binding between BPTG and BPT immobilized on the flow cell (results not shown for BPT) and Me-α-GalNAc was almost unresolved even after the injection was completed. It was not separated, and binding to BPTG and BPT was shown in a concentration-dependent manner. Was subjected to kinetic analysis based on the maximum amount of binding BPTG and BPT, K A is 1 × 10 6 (M -1) of BPTG and Me-α-GalNAc, the BPT and Me-α-GalNAc 's K a was calculated to be 2 × 10 6 (M -1) . This, considering that the K A with many lectin specific monosaccharides in the range of 10 4~5 (M -1), coupling or between BPTG and Me-α-GalNAc, BPT The binding between Me-α-GalNAc appears to be fairly strong and significant.

４．［トリプシン酵素活性への影響］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴ（Bovine pancreatic trypsin）は、Sigma-Aldorich社製のT1426を用い、ＢＡＰＡ（N-α-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride）は、株式会社ペプチド研究所製のものを用い、Ｍｅ−α−Ｍａｎ（Methyl-α-mannoside）は、Sigma-Aldorich社製のものを用い、ＧａｌＮ・ＨＣｌ（D-Galactosamine hydrochloride）は、生化学工業株式会社製のものを用い、ＧａｌＮＡｃ（N-Acethyl-D-galactosamine）は、和光純薬工業株式会社製の013-12821を用い、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ（o-Methyl-N-Acetyl-2-deoxy-D-galactosamine）は、Tronto Research Chemicals Inc.社製のM275310を用いた。 4). [Influence on trypsin enzyme activity]
(1) Material The following materials were used for this experiment.
BPT (Bovine pancreatic trypsin) uses T1426 manufactured by Sigma-Aldorich, and BAPA (N-α-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride) uses a product manufactured by Peptide Institute, Inc. α-Man (Methyl-α-mannoside) is manufactured by Sigma-Aldorich, GalN · HCl (D-Galactosamine hydrochloride) is manufactured by Seikagaku Corporation, and GalNAc (N-Acethyl- As D-galactosamine), 013-12821 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used, and Me-α-GalNAc (o-Methyl-N-Acetyl-2-deoxy-D-galactosamine) was manufactured by Tronto Research Chemicals Inc. M275310 made by the company was used.

（２）方法および結果
各種の糖について、基質濃度を変化させてＢＰＴの酵素反応速度を測定し、Lineweaver-Burk plotにより解析して、各種の糖のトリプシン酵素活性に与える影響について調べた。
トリプシンの酵素活性測定には、基質としてＢＡＰＡを用いた。ＢＡＰＡを１４．２ｍｇ秤量し、１０６５μｌのＤＭＳＯに完全に溶解した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．９）−２０ｍＭ ＣａＣｌ２−３０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ−Ｃａ）を２２００μｌ加えて、あらかじめ１０ｍＭ ＢＡＰＡ溶液を調製した。次いで、このＢＡＰＡ溶液をさらに希釈して０ｍＭから３ｍＭの各濃度の基質ＢＡＰＡ溶液を調製した。ＢＰＴは２．４ｍｇを秤量し、酸性で安定であるため、１ｍＭ ＨＣｌ−２０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液０．５ｍｌに溶解し、２００μＭのＢＰＴ溶液を調製した。このＢＰＴ溶液からさらに希釈して６μＭのトリプシン酵素溶液を調製した。Ｍｅ−α−Ｍａｎ、ＧａｌＮ・ＨＣｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃ についてＴＢＳ−Ｃａを加えて、１ｍＭ から０．２Ｍの各糖溶液を数段階調製した。糖溶液１４０μｌと６μＭ トリプシン溶液１０μｌをあらかじめ混合して１５分間３７℃でプレインキュベートした。マイクロプレートに、３７℃でプレインキュベートした各濃度の基質ＢＡＰＡ溶液を１ウエルあたり１５０μｌ加え、次に、３７℃でプレインキュベートした糖−トリプシン混合溶液を１ウエルあたり１５０μｌずつ加えた。素早く撹拌後、マイクロプレートリーダーVient X（DS Pharma Biomedical）を用いて、３０秒おきに５分間４１０ｎｍで吸光度を測定した。基質濃度の逆数１／［Ｓ］を横軸に、反応速度の逆数１／［ｖ］を縦軸にとり、Lineweaver Burk Plotにより解析して、各種の糖のＢＰＴ酵素活性に与える影響について考察した。その結果を図８に示す。 (2) Methods and Results For various sugars, the enzyme reaction rate of BPT was measured by changing the substrate concentration, and analyzed by Lineweaver-Burk plot to examine the influence of various sugars on the trypsin enzyme activity.
BAPA was used as a substrate for the measurement of trypsin enzyme activity. After 14.2 mg of BAPA was weighed and completely dissolved in 1065 μl of DMSO, 2200 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.9) -20 mM CaCl 2 -30 mM NaCl (TBS-Ca) was added, and 10 mM BAPA was previously added. A solution was prepared. Next, this BAPA solution was further diluted to prepare a substrate BAPA solution having a concentration of 0 mM to 3 mM. Since BPT weighed 2.4 mg and was acidic and stable, it was dissolved in 0.5 ml of 1 mM HCl-20 mM CaCl 2 solution to prepare a 200 μM BPT solution. A 6 μM trypsin enzyme solution was prepared by further diluting from this BPT solution. TBS-Ca was added to Me-α-Man, GalN · HCl, GalNAc, and Me-α-GalNAc to prepare several steps of 1 mM to 0.2 M sugar solutions. A sugar solution (140 μl) and a 6 μM trypsin solution (10 μl) were mixed in advance and preincubated at 37 ° C. for 15 minutes. 150 μl of each concentration of the substrate BAPA solution preincubated at 37 ° C. was added to the microplate, and then 150 μl of the sugar-trypsin mixed solution preincubated at 37 ° C. was added per well. After rapid stirring, the absorbance was measured at 410 nm for 5 minutes every 30 seconds using a microplate reader Vient X (DS Pharma Biomedical). Taking the reciprocal 1 / [S] of the substrate concentration on the horizontal axis and the reciprocal 1 / [v] of the reaction rate on the vertical axis, analysis by Lineweaver Burk Plot was conducted to examine the influence of various sugars on the BPT enzyme activity. The result is shown in FIG.

図８の結果から分かるように、ＧａｌＮ・ＨＣｌ濃度を０ｍＭから１００ｍＭに上げると、わずかながらＫｍは増加し、Ｖｍａｘが８２％（（６．８×１００）／８．３）に減少した。この変化は非拮抗型の活性阻害に近い変化である（図８Ａ）。一方、０−１００ｍＭの範囲のＧａｌＮＡｃ存在下では、ＢＰＴの酵素活性はＶｍａｘで８％（１００−［（７．７×１００）／８．４］）の減少にすぎず、Ｋｍはほとんど変化がなかった（図８Ｂ）。対照的にＭｅ−α−Ｍａｎの存在下ではＫｍの減少傾向が示された。Ｍｅ−α−ＧａｌＮＡｃについては、５ｍＭ以下までの濃度範囲でしか実験できなかったが、Ｋｍの増加（１３％）と、僅かなＶｍａｘの増加が示唆された。以上、結合性の高い糖によるＢＰＴ酵素活性への影響はいずれも小さく、トリプシノーゲンの活性化抑制効果を完全に説明することはできないと考えられた。また、最も影響のあったＧａｌＮ・ＨＣｌの結果をDixon plotにより解析すると、非拮抗型（または非拮抗・不拮抗混合型）の阻害形式が示された。参考値として、阻害定数Ｋｉは約３００ｍＭと求められた。これはＧａｌＮ・ＨＣｌのＢＰＴＧ活性化抑制作用が、ＢＰＴに対する阻害によるものではなく、ＢＰＴＧに結合してタンパク質分解から保護する効果が主であることと矛盾しない結果であると考えられる。   As can be seen from the results of FIG. 8, when the GalN · HCl concentration was increased from 0 mM to 100 mM, Km slightly increased and Vmax decreased to 82% ((6.8 × 100) /8.3). This change is close to non-antagonistic activity inhibition (FIG. 8A). On the other hand, in the presence of GalNAc in the range of 0-100 mM, the enzyme activity of BPT is only a 8% decrease in Vmax (100-[(7.7 × 100) /8.4]), and Km changes little. There was no (Figure 8B). In contrast, Km decreased in the presence of Me-α-Man. For Me-α-GalNAc, experiments could be performed only in the concentration range up to 5 mM, but an increase in Km (13%) and a slight increase in Vmax were suggested. As described above, it was considered that the effect of inhibiting the activation of trypsinogen could not be completely explained because the influence of the highly binding sugar on the BPT enzyme activity was small. Moreover, when the result of GalN · HCl having the most influence was analyzed by Dixon plot, a non-antagonistic type (or a non-antagonistic / non-antagonistic mixed type) inhibition type was shown. As a reference value, the inhibition constant Ki was determined to be about 300 mM. This is considered to be a result that is consistent with the effect that GalN · HCl suppresses BPTG activation by inhibiting BPTG and mainly protects against BPTG binding to proteolysis.

５．［ＥＬＩＳＡ法によるＢＰＴＧとアプロチニンの結合分析と糖の影響］
（１）材料
本実験には以下の材料を用いた。
ＢＰＴＧ、ＢＰＴ、糖及びＰＭＳＦは、実施例１と同様の物を用い、アプロチニンはウシ膵臓由来の物をSIGMA社から購入して用い、ＮＨＳ−ビオチン（PIERCE社製）を用いてマニュアル通りにビオチン標識して使用した。ＥＬＩＳＡに必要な試薬は実施例２と同様の物を用いた。 5. [Binding analysis of BPTG and aprotinin by ELISA method and effect of sugar]
(1) Material The following materials were used for this experiment.
BPTG, BPT, sugar, and PMSF are the same as in Example 1, and aprotinin is purchased from SIGMA from bovine pancreas, and biotin is used according to the manual using NHS-biotin (manufactured by PIERCE). Used after labeling. The same reagents as in Example 2 were used as reagents necessary for the ELISA.

（２）方法及び結果
膵臓由来の内在性トリプシン阻害剤として知られているアプロチニン（ＢＰＴＩ）との結合が、ＢＰＴＧやＢＰＴの糖結合性に影響があるかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡ法による結合性分析を行なった。
実施例２と同様にして、ＰＭＳＦ処理を行ったＢＰＴＧ溶液、及び、ＢＰＴ溶液を調製し、これらの溶液を１０ｍＭ ＴＢＳ（ｐＨ７．５）で希釈し、マイクロタイタープレート（Immulon 1B，Thermo Scientific社製）の各ウエルに添加して、ＢＰＴＧ及びＢＰＴをプレートに固定化した。実施例２と同様にしてＴＢＳ（ｐＨ７．５）を緩衝液に用いて洗浄した後、ＢＳＡによるブロッキングを行った。０．１Ｍの各糖（Ｍｅ−α−Ｍａｎ、Ｍｅ−β−Ｇａｌ又はＧａｌＮ・ＨＣｌ）のＴＢＳ（ｐＨ７．５）溶液を１００μｌずつ各ウエルに添加して、１時間室温で反応させた。各３００μｌの緩衝液で各ウエルを３回洗浄した後、各１００μｌのビオチン化アプロチニン１０μｇ／ｍｌを添加して、室温で１時間結合反応させた。その後、各３００μｌの緩衝液で３回洗浄した後、各１００μｌの０．７μｇ／ｍｌのＡＢＣ−ＨＲＰを添加して、室温で１時間結合反応させた後、各３００μｌの緩衝液で３回洗浄した。次に、各２００μｌの発色液［ＯＰＤ ８ｍｇ，５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌ，３０％Ｈ２Ｏ２ ８μｌ］を各ウエルに添加して、室温で２５分間発色させた後、５０μｌの２．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を停止させた。各ウエル中の液体について、マイクロプレートリーダー（MPR-80，Bio-Rad社製）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図９に示す。 (2) Method and Results In order to examine whether binding with aprotinin (BPTI), which is known as an endogenous trypsin inhibitor derived from pancreas, affects the sugar binding properties of BPTG and BPT, binding by ELISA method Sex analysis was performed.
In the same manner as in Example 2, PMSF-treated BPTG solution and BPT solution were prepared, these solutions were diluted with 10 mM TBS (pH 7.5), and microtiter plate (Immulon 1B, manufactured by Thermo Scientific) BPTG and BPT were immobilized on the plate. After washing with TBS (pH 7.5) as a buffer as in Example 2, blocking with BSA was performed. 100 μl of 0.1 M TBS (pH 7.5) solution of each sugar (Me-α-Man, Me-β-Gal or GalN · HCl) was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Each well was washed three times with 300 μl of each buffer, and then 100 μl of 10 μg / ml of biotinylated aprotinin was added and allowed to bind at room temperature for 1 hour. Then, after washing three times with 300 μl each of the buffer, 100 μl each of 0.7 μg / ml ABC-HRP was added, and the mixture was allowed to bind at room temperature for 1 hour, and then washed three times with each 300 μl buffer. did. Next, 200 μl of each color developing solution [OPD 8 mg, 50 mM citrate phosphate buffer (pH 5.0) 20 ml, 30% H 2 O 2 8 μl] was added to each well, and color was allowed to develop for 25 minutes at room temperature. 50 μl of 2.5N H 2 SO 4 was added to stop color development. For the liquid in each well, absorbance at 490 nm was measured using a microplate reader (MPR-80, manufactured by Bio-Rad). The result is shown in FIG.

図９の結果から分かるように、ＧａｌＮ・ＨＣｌが存在することによって、ＢＰＴＧとアプロチニンとの結合が増強することが示された。一方、ＢＰＴＧと結合しないＭｅ−β−Ｇａｌや、結合するが活性化阻害をほとんど示さないＭｅ−α−Ｍａｎでは、糖を含まないコントロールと差が無い結果であった。これらの結果から、ＧａｌＮ誘導体は、上記実施例１〜４で示されたトリプシノーゲンを安定化してトリプシンによる分解から保護する効果に加えて、アプロチニン（トリプシンに対する膵臓の内在性阻害剤）とトリプシノーゲンとの結合を増強することにより、活性トリプシンを阻害することによってもトリプシノーゲンを保護する機構が膵細胞内で起こることが予測される。すなわち膵臓内のアプロチニン存在下では、ＧａｌＮ誘導体による膵炎抑制効果はさらに高まることが推測される。   As can be seen from the results in FIG. 9, it was shown that the presence of GalN · HCl enhances the binding between BPTG and aprotinin. On the other hand, Me-β-Gal that does not bind to BPTG and Me-α-Man that binds but shows little inhibition of activation showed no difference from the control containing no sugar. From these results, in addition to the effect of stabilizing the trypsinogen shown in the above Examples 1 to 4 and protecting it from degradation by trypsin, the GalN derivative is a combination of aprotinin (an endogenous inhibitor of pancreas against trypsin) and trypsinogen. By enhancing binding, it is expected that a mechanism that protects trypsinogen by inhibiting active trypsin also occurs in pancreatic cells. That is, in the presence of aprotinin in the pancreas, it is presumed that the pancreatitis suppressing effect by the GalN derivative is further enhanced.

Claims (8)

ガラクトサミン又はその誘導体を含有することを特徴とするトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤。 A formulation for inhibiting trypsinogen activation, comprising galactosamine or a derivative thereof ,
In the derivative, α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain. Compound: Compound in which N-acetyl group at 2-position of N-acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group; hydroxy group at 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine Selected from the group consisting of: a compound in which is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain; methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof A preparation for inhibiting trypsinogen activation, which is a compound . ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項１に記載のトリプシノーゲン活性化抑制用の製剤。 A derivative of galactosamine is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; a compound in which the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group; N- acetyl at position 2 of N -acetylgalactosamine A compound in which the group is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group ; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N -acetylgalactosamine is a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group; sugar residue or compounds substituted in the oligosaccharide chains; and the hydrochloride salt of the galactosamine; preparations for trypsinogen activation suppressing according to claim 1, characterized in that a compound selected from. ガラクトサミン誘導体を含有することを特徴とする膵炎の予防・治療剤であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、膵炎の予防・治療剤。 A prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis characterized by containing a galactosamine derivative ,
In the derivative, α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain. Compound: Compound in which N-acetyl group at 2-position of N-acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group; hydroxy group at 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine Selected from the group consisting of: a compound in which is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain; methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof A prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis, which is a compound . ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項３に記載の膵炎の予防・治療剤。 A derivative of galactosamine is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; a compound in which the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group; N- acetyl at position 2 of N -acetylgalactosamine A compound in which the group is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group ; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N -acetylgalactosamine is a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group; sugar residue or compounds substituted in the oligosaccharide chains; and the hydrochloride salt of the galactosamine; prophylactic or therapeutic agent for pancreatitis according to claim 3, characterized in that a compound selected from. トリプシノーゲン活性化抑制用の製剤の製造におけるガラクトサミン又はその誘導体の使用であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用。 Use of galactosamine or a derivative thereof in the manufacture of a preparation for inhibiting trypsinogen activation ,
In the derivative, α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain. Compound: Compound in which N-acetyl group at 2-position of N-acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group; hydroxy group at 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine Selected from the group consisting of: a compound in which is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain; methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof Use, which is a compound . 膵炎の予防・治療剤の製造におけるガラクトサミン誘導体の使用であって、
前記誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；メチルα−ガラクトサミニド；及び、メチルβ−ガラクトサミニド；並びに、これらの塩からなる群から選択される化合物である、使用。 Use of a galactosamine derivative in the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for pancreatitis ,
In the derivative, α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a sugar residue or an oligosaccharide chain. Compound: Compound in which N-acetyl group at 2-position of N-acetylgalactosamine is substituted with N-sulfate group, free amino group or N-glycolyl group; hydroxy group at 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine Selected from the group consisting of: a compound in which is substituted with a sulfate group, O-acetyl group, phosphate group, sugar residue or oligosaccharide chain; methyl α-galactosaminide; and methyl β-galactosaminide; and salts thereof Use, which is a compound . ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の使用。 A derivative of galactosamine is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; a compound in which the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group; N- acetyl at position 2 of N -acetylgalactosamine A compound in which the group is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group ; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N -acetylgalactosamine is a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group; sugar residue or compounds substituted in the oligosaccharide chains; and the hydrochloride salt of the galactosamine; use according to claim 5, characterized in that a compound selected from. ガラクトサミンの誘導体が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン；β−Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｎ−アセチルガラクトサミンの１位のヒドロキシ基が、アルコキシ基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの２位のＮ−アセチル基がＮ−硫酸基、遊離アミノ基又はＮ−グリコリル基に置換された化合物；Ｎ−アセチルガラクトサミンの３位、４位又は６位のヒドロキシ基が硫酸基、Ｏ−アセチル基、リン酸基、糖残基又はオリゴ糖鎖に置換された化合物；及び、ガラクトサミンの塩酸塩；から選択される化合物であることを特徴とする請求項６に記載の使用。A derivative of galactosamine is α-N-acetylgalactosamine; β-N-acetylgalactosamine; a compound in which the hydroxy group at position 1 of N-acetylgalactosamine is substituted with an alkoxy group; N-acetyl at position 2 of N-acetylgalactosamine A compound in which the group is substituted with an N-sulfate group, a free amino group or an N-glycolyl group; the hydroxy group at the 3-position, 4-position or 6-position of N-acetylgalactosamine is a sulfate group, an O-acetyl group, a phosphate group; The use according to claim 6, which is a compound selected from a compound substituted with a sugar residue or an oligosaccharide chain; and a hydrochloride salt of galactosamine.
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