JP5652843B2 - DNA amplification method - Google Patents
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Description
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、鋳型核酸からのDNA複製およびさらなるDNA増幅に有用な新規の組成物および方法に関する。本発明は、具体的には、鎖置換型DNA合成酵素を利用するDNA増幅方法、例えばマルチプルディスプレースメント増幅法（multiple displacement amplification：MDA）およびマルチプリープライムローリングサークル増幅法（mulitiply-primed rolling circle amplification：MPRCA）に有用な新規の反応液組成物および方法に関する。 The present invention belongs to the field of molecular biology. The present invention relates to novel compositions and methods useful for DNA replication from template nucleic acids and further DNA amplification. Specifically, the present invention relates to DNA amplification methods using strand displacement type DNA synthase, such as multiple displacement amplification (MDA) and multiple prime-rolling circle amplification (mulitiply-primed rolling circle amplification). : MPRCA), the present invention relates to a novel reaction solution composition and method useful.
遺伝子解析は、病態の解明や新規有用遺伝子の探索などに有用な大量の生物学的情報を入手し得る方法であり、現在の医学および生物学にとって最も重要な手法となっている。しかし、医療、犯罪捜査、研究、産業などの分野においては、臨床における生体採取材料、法医学材料、絶滅危惧種、または培養方法が確定していない微生物など、得られるDNA量が限られている場合が頻繁にある。そして、多くの場合、遺伝子解析に必要とされるDNA量は、得られるDNA量に比べてかなり多い。そのため、得られたDNA全体をまんべんなく増幅（全ゲノム増幅）することが、これまでに数多く試みられてきた。 Genetic analysis is a method for obtaining a large amount of biological information useful for elucidating disease states and searching for new useful genes, and is the most important method for current medicine and biology. However, in the fields of medical care, criminal investigation, research, industry, etc., when the amount of DNA that can be obtained is limited, such as biologically collected materials in clinical practice, forensic materials, endangered species, or microorganisms for which culture methods are not established There are often. In many cases, the amount of DNA required for gene analysis is considerably larger than the amount of DNA obtained. Therefore, many attempts have been made so far to amplify the entire obtained DNA evenly (whole genome amplification).
DNAの増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：PCR）法が有名であり、このPCR法を基盤とした様々な全ゲノム増幅方法が考え出され、広く使用されてきた。しかし、PCRを基盤とした従来の方法には、（１）増幅されるDNAの長さが比較的短い（平均1kbp程度）、（２）DNAの網羅率に偏りが出る、（３）繰り返し配列が増幅され易い、（４）鋳型となったDNA以外の非特異産物が増幅されるなど、増幅以降の解析方法や使用方法に制限や解析結果の偏りがもたらされることがわかってきた。 As a method for amplifying DNA, the polymerase chain reaction (PCR) method is well known, and various whole genome amplification methods based on this PCR method have been devised and widely used. However, conventional methods based on PCR include: (1) the length of the amplified DNA is relatively short (average of about 1 kbp), (2) the coverage of DNA is biased, (3) repetitive sequences It has been found that analysis methods and usage methods after amplification are limited and biased in analysis results, such as (4) amplification of non-specific products other than template DNA.
近年、鎖置換型DNA合成酵素とランダムプライマーとを用いたDNA増幅方法であるマルチプルディスプレースメント増幅（MDA）法（図１）が開発された（非特許文献１）。この方法によれば、PCRをベースとして開発された増幅法の諸問題のうち、（１）増幅されるDNAの長さが比較的短いこと、（２）DNAの網羅率に偏りが出ること、および（３）繰り返し配列が増幅され易いことが改善されており、現在では全ゲノム増幅方法の主流となっている。 In recent years, a multiple displacement amplification (MDA) method (FIG. 1), which is a DNA amplification method using a strand displacement type DNA synthase and a random primer, has been developed (Non-patent Document 1). According to this method, among the problems of the amplification method developed based on PCR, (1) the length of DNA to be amplified is relatively short, (2) the coverage rate of DNA is biased, And (3) it has been improved that repeat sequences are easily amplified, and is currently the mainstream of whole genome amplification methods.
また、特に鋳型DNAが少量の場合、上記問題点（４）の克服は依然として困難であったが、RNAプライマーを利用することにより、鋳型が環状DNAであれば、疑似増幅産物を抑制することが可能となった（特許文献１）。しかしながら、この環状DNA増幅の反応条件では、直鎖状DNAの増幅効率および増幅配列の忠実度が低下するという問題があった。 In addition, the above problem (4) is still difficult to overcome, especially when the amount of template DNA is small, but by using an RNA primer, if the template is circular DNA, pseudo-amplification products can be suppressed. This has become possible (Patent Document 1). However, this circular DNA amplification reaction condition has a problem that the amplification efficiency of linear DNA and the fidelity of the amplified sequence are lowered.
またMDA法では、一般に鋳型DNAが微量の場合、プライマーダイマー由来と思われる非特異的DNA増幅が過剰に起こり、その結果、目的のDNAが合成されず、増幅後のDNAの組成がオリジナル（鋳型DNAのソース）のDNAとは異なるものとなり、増幅後の解析、例えば配列決定時に、誤った結果を生じるという問題点があった。従って、MDA法は、現時点では、再入手が困難な生体サンプルおよびフィールドサンプルなど希少なDNAの増幅には用いることができなかった。 In addition, in the MDA method, generally, when the amount of template DNA is small, non-specific DNA amplification that seems to be derived from primer dimer occurs excessively. As a result, the target DNA is not synthesized, and the composition of the amplified DNA is the original (template DNA source) is different from the DNA of the DNA, and there is a problem that an erroneous result is generated in the analysis after amplification, for example, sequencing. Therefore, at present, the MDA method cannot be used for amplification of rare DNA such as biological samples and field samples that are difficult to obtain again.
MDA法の増幅効率の改善は、これまでに主に反応時間の増加により行われていたが、原理的に限界点が存在する。MDA法の効率は鋳型の長さにある程度依存するが、1〜10分子（コピー）のDNAから増幅することは不可能である。これは、環状DNAを鋳型として繰り返し使用するマルチプリープライムローリングサークル増幅（MPRCA）法（非特許文献2）とは異なり、MDA法において直鎖状DNAを鋳型として用いる場合は初期鋳型を再利用できないためである。 The improvement of the amplification efficiency of the MDA method has been performed mainly by increasing the reaction time so far, but there is a limit point in principle. The efficiency of the MDA method depends to some extent on the length of the template, but it is impossible to amplify from 1 to 10 molecules (copy) of DNA. This is different from the multi-prime rolling circle amplification (MPRCA) method (Non-Patent Document 2), which uses circular DNA as a template repeatedly, and the initial template cannot be reused when linear DNA is used as a template in the MDA method. Because.
図１は、MDA法におけるDNA増幅の模式図である。（１）変性した一本鎖DNAにランダムにプライマーがアニールする。（２）アニールしたプライマーからDNA合成が開始され、合成方向に存在する他のプライマーによって先に合成されている相補鎖DNAを鋳型DNA鎖からはがしながら、DNA合成が続く。また、剥がされたDNA鎖にも新たにプライマーがアニールする。（３）剥がされたDNA鎖にアニールしたプライマーからもDNA合成が行われ、これら一連の反応が連鎖的に起きる。初期鋳型は最も３’末端からの合成が終了した後、二度と使用されることはない。これは剥がされたDNA鎖でも同様である。 FIG. 1 is a schematic diagram of DNA amplification in the MDA method. (1) The primer anneals randomly to the denatured single-stranded DNA. (2) DNA synthesis is started from the annealed primer, and DNA synthesis continues while the complementary strand DNA previously synthesized by other primers existing in the synthesis direction is peeled off from the template DNA strand. The primer also anneals to the peeled DNA strand. (3) DNA synthesis is also performed from the primer annealed to the peeled DNA strand, and a series of these reactions occur in a chain. The initial template is never used again after the synthesis from the 3 'end is complete. The same applies to the peeled DNA strand.
DNA合成における増幅効率は、反応初期に使用されるプライマーの数に大きく依存するため、アニール効率の低い短いプライマーの場合には、より多量のプライマーを利用する必要がある。反応初期において十分な量のプライマーがアニールするためには、初期鋳型の長さが少なくとも50 kbp以上であることが要求され、さらに鋳型が長ければ長いほど増幅効率は上昇する。しかしながら、物理的に扱えるDNAの長さはほぼ500 kbp〜1 Mbp程度であり、それ以上の長さではピペットで扱う際に物理的に非常に切断されやすく、実際に鋳型に用いることは不可能であった。
したがって、本発明は、上記の問題点に鑑み、DNAを効率良く増幅できる方法、特に、MDA法において、直鎖状DNAを鋳型とする場合や、鋳型DNAが微量である場合であっても、特異的に効率よく増幅することができる方法を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the above problems, the present invention is a method capable of efficiently amplifying DNA, particularly in the MDA method, when linear DNA is used as a template, or even when the amount of template DNA is very small, An object is to provide a method capable of specifically and efficiently amplifying.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、環状DNA増幅の反応条件では、直鎖状DNAを鋳型としたMDA法においては、鋳型DNAのコピー数が、DNAプライマーを用いる場合103コピー未満、RNAプライマーを用いる場合106コピー未満で、増幅効率が低下し、また増幅の忠実度も低下するという問題があることを新たに見出した。本発明者らは、この問題を解決するためにさらに研究を進め、反応液中の塩化物イオン（Cl-）が、鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応において、特に酵素の活性部位の構造特性に阻害作用を及ぼしているという知見を得た。このことは、従来、DNA増幅のための反応液組成物中に添加される電解質塩については、陽イオンにのみ焦点が当てられ、対イオンとなる陰イオンについては検討された例が無いことからみても意外なことであった。本発明者らは、さらに研究を進めた結果、塩化物イオン（Cl-）を反応組成液から可能な限り排除し、反応液組成を細胞内条件に模倣することにより、DNA合成反応が阻害されず、さらに、従来の反応組成液に比べて高濃度の一価の陽イオンおよび二価の陽イオンを提供することが可能になり、DNA増幅効率を飛躍的に向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。 In the MDA method using linear DNA as a template under the circular DNA amplification reaction conditions, the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems. It was newly found that when using less than 10 3 copies and when using an RNA primer, less than 10 6 copies, the amplification efficiency decreases and the fidelity of amplification also decreases. In order to solve this problem, the present inventors have further studied, and chloride ions (Cl − ) in the reaction solution are used in the DNA amplification reaction via the strand displacement type DNA synthase, particularly in the active site of the enzyme. It was found that it has an inhibitory effect on the structural properties of This is because the electrolyte salt added to the reaction solution composition for DNA amplification has hitherto been focused on only the cation and there has been no study on the anion serving as a counter ion. It was surprising to see. As a result of further research, the present inventors eliminated chloride ions (Cl − ) as much as possible from the reaction composition solution, and mimicking the reaction solution composition to intracellular conditions, thereby inhibiting the DNA synthesis reaction. Furthermore, it has become possible to provide higher concentrations of monovalent cations and divalent cations compared to conventional reaction composition solutions, and has found that DNA amplification efficiency can be dramatically improved. It came to be completed.
すなわち、本発明は、一価および／または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる反応液組成物中での鎖置換型DNA合成反応によるDNA増幅方法であって、前記陰イオンが、塩化物イオン以外の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供される、前記方法に関する。 That is, the present invention is a DNA amplification method by strand displacement type DNA synthesis reaction in a reaction solution composition in which an electrolyte that provides monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved, The method relates to the method, wherein the anion is an anion other than a chloride ion and is provided at a concentration that does not inhibit the strand displacement type DNA synthesis reaction.
本発明はまた、DNA増幅方法が、マルチプリープライムローリングサークル増幅法（MPRCA）、またはマルチプルディスプレースメント増幅法（MDA）である、前記のDNA増幅方法に関する。
また、本発明は、鋳型DNAが直鎖状である、前記のDNA増幅方法に関する。
The present invention also relates to the above DNA amplification method, wherein the DNA amplification method is a multiple prime rolling circle amplification method (MPRCA) or a multiple displacement amplification method (MDA).
The present invention also relates to the above DNA amplification method, wherein the template DNA is linear.
本発明はまた、DNA合成反応に配列の全てまたは一部にRNAを含むプライマーを用いる、前記のDNA増幅方法に関する。
また、本発明は、RNAプライマーと新規に合成されたDNAとの間にRNase Hによりニックを形成する反応をさらに含む、前記のDNA増幅方法に関する。
さらに、本発明は、DNA合成反応とニック形成反応とを同時に行う、前記のDNA増幅方法に関する。
The present invention also relates to the above DNA amplification method using a primer containing RNA in all or part of the sequence in a DNA synthesis reaction.
The present invention also relates to the above DNA amplification method, further comprising a reaction of forming a nick with RNase H between the RNA primer and the newly synthesized DNA.
Furthermore, the present invention relates to the above DNA amplification method in which a DNA synthesis reaction and a nick formation reaction are simultaneously performed.
また、本発明は、一価および／または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる鎖置換型DNA合成反応に用いる反応液組成物であって、前記陰イオンが、塩化物イオンより、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない陰イオンである、前記組成物に関する。 The present invention also provides a reaction solution composition used in a strand displacement DNA synthesis reaction in which an electrolyte that provides monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved, wherein the anions are: It is related with the said composition which is an anion which does not exert an inhibitory effect on the said strand displacement type DNA synthesis reaction from a chloride ion.
本発明はさらに、一価および／または二価の陽イオンの濃度が5 mM以上である、前記組成物に関する。
本発明はまた、一価および二価の陽イオンを含み、該一価および二価の陽イオンがそれぞれ異なる陰イオンと対形成している、前記組成物に関する。
The present invention further relates to the composition, wherein the concentration of monovalent and / or divalent cations is 5 mM or more.
The invention also relates to said composition comprising monovalent and divalent cations, said monovalent and divalent cations being each paired with different anions.
また、本発明は、陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される１または２以上を含む、前記組成物に関する。
本発明はまた、陽イオンが、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、およびマンガンイオンからなる群より選択される１または２以上を含む、前記組成物に関する。
The present invention also relates to the above composition, wherein the anion comprises one or more selected from glutamate ion, aspartate ion and acetate ion.
The present invention also relates to the above composition, wherein the cation comprises one or more selected from the group consisting of potassium ion, sodium ion, magnesium ion, and manganese ion.
本発明はまた、鎖置換型DNA合成酵素およびRNase Hの双方の活性を促進する、前記組成物に関する。
本発明はまた、pH調製剤をさらに含み、該pH調製剤が塩化物イオンを含まない、前記組成物に関する。
The present invention also relates to the composition that promotes the activities of both strand displacement DNA synthase and RNase H.
The present invention also relates to said composition further comprising a pH adjusting agent, wherein said pH adjusting agent is free of chloride ions.
また、本発明は、鎖置換型DNA合成反応によるDNA増幅方法に用いるプライマーであって、該プライマーに含まれる塩基の全てまたは一部がRNAであり、塩基の全てまたは一部がチオリン酸エステル結合により結合されている、前記プライマーに関する。
さらに、本発明は、５’末端から少なくとも1塩基がRNAである、前記プライマーに関する。
The present invention also relates to a primer used in a DNA amplification method based on a strand displacement-type DNA synthesis reaction, wherein all or part of the base contained in the primer is RNA, and all or part of the base is thiophosphate ester bond. Relates to the primer bound by
Furthermore, the present invention relates to the primer, wherein at least one base from the 5 ′ end is RNA.
本発明はまた、３’末端から少なくとも３塩基が非修飾RNA塩基である、前記プライマーに関する。
本発明はまた、５’末端から少なくとも1塩基が非修飾RNAまたは修飾RNA塩基である、前記プライマーに関する。
また、本発明は、ランダムプライマーである、前記プライマーに関する。
The present invention also relates to the above primer, wherein at least 3 bases from the 3 ′ end are unmodified RNA bases.
The present invention also relates to the above primer, wherein at least one base from the 5 ′ end is an unmodified RNA or a modified RNA base.
The present invention also relates to the primer, which is a random primer.
また、本発明は、前記のプライマーのいずれかの、前記のDNA増幅方法のいずれかへの使用に関する。 The present invention also relates to the use of any of the above primers in any of the above DNA amplification methods.
また、本発明は、前記のDNA増幅方法のためのキットであって、前記の組成物のいずれか、および／または前記のプライマーのいずれかを含む、キットに関する。 The present invention also relates to a kit for the above DNA amplification method, comprising any of the above compositions and / or any of the above primers.
本発明により、第一に、従来では不可能と考えられていた、１〜数分子のDNAの検出や増幅が可能になる。さらに、本発明にしたがってRNAを含むプライマーを用いることにより、目的DNAからのみDNA伸長反応を起こすことが可能になり、かつ目的外のDNAの増幅を抑制することができる。 According to the present invention, first, it becomes possible to detect and amplify DNA of one to several molecules, which has been considered impossible in the past. Furthermore, by using a primer containing RNA according to the present invention, it becomes possible to cause a DNA extension reaction only from the target DNA, and it is possible to suppress amplification of DNA other than the target.
また、本発明により、直鎖状DNAの増幅効率を著しく改善することができ、従来では不可能とされてきた、染色体DNAを染色体毎に個別に増幅して染色体特異的ゲノムライブラリーを作成することが可能となり、ゲノム配列決定において、ショットガン配列決定法の欠点であるDNA配列の再構築の複雑性を大幅に回避することができる。 In addition, the amplification efficiency of linear DNA can be remarkably improved by the present invention, and a chromosome-specific genomic library is created by amplifying chromosomal DNA individually for each chromosome, which has been impossible in the past. In genome sequencing, the complexity of DNA sequence reconstruction, which is a drawback of shotgun sequencing, can be greatly avoided.
また、本発明の方法により、従来では不可能とされてきた、培養不可能な微生物の微量なゲノムDNAを個別に増幅して解析することも可能となり、培養に必要な情報（代謝関連遺伝子群）を直接ゲノムから得て必須栄養素等を推測することによりこれら微生物の培養方法の開発が可能となるだけでなく、これまで困難であった遺伝子情報からの新規有用遺伝子の直接探索を実現することができる。 In addition, the method of the present invention makes it possible to individually amplify and analyze a small amount of genomic DNA of microorganisms that cannot be cultivated, which has been impossible in the past, and information necessary for culture (metabolism-related gene group) ) Directly from the genome and inferring essential nutrients, etc., it will not only be possible to develop a method for culturing these microorganisms, but also to realize a direct search for new useful genes from genetic information that has been difficult to date. Can do.
以下、本発明によるDNA増幅方法およびDNA増幅方法のための反応液組成物について、詳細に説明する。 Hereinafter, the DNA amplification method and the reaction solution composition for the DNA amplification method according to the present invention will be described in detail.
本発明は、一態様において、一価および／または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる反応液組成物中での鎖置換型DNA合成反応によるDNA増幅方法であって、前記陰イオンが、塩化物イオン以外の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供されることを特徴とする。 In one aspect, the present invention is a DNA amplification method by strand displacement type DNA synthesis reaction in a reaction solution composition in which an electrolyte providing monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved. The anion is an anion other than chloride ion, and is provided at a concentration that does not exert an inhibitory effect on the strand displacement type DNA synthesis reaction.
一般に、DNA合成反応に用いる反応液組成物中には、一価の陽イオン、二価の陽イオン、pH調製剤などが塩の形態で添加される。一価の陽イオン、例えばナトリウムイオン（Na+）またはカリウムイオン（K+）は、核酸に作用して核酸の融解温度（Tm）を規定するため、高濃度であればあるほどTmが上昇し、したがって、低温における核酸のアニール率が高くなる。また、二価の陽イオン、例えばマグネシウムイオン（Mg2+）またはマンガンイオン（Mn2+）は、MPRCA法およびMDA法を含むほぼすべてのDNA合成酵素の活性に必須であるのみならず、核酸の二本鎖形成の安定にも関与するので、酵素に混入している大腸菌由来のDNAの二本鎖状態を安定させ、目的のDNA以外のDNAからの増幅を抑制する。 In general, a monovalent cation, a divalent cation, a pH adjusting agent and the like are added in the form of a salt to the reaction solution composition used for the DNA synthesis reaction. Monovalent cations, such as sodium ions (Na + ) or potassium ions (K + ), act on nucleic acids to define the melting temperature (Tm) of the nucleic acids, so the higher the concentration, the higher the Tm. Therefore, the annealing rate of nucleic acid at a low temperature is increased. In addition, divalent cations such as magnesium ion (Mg 2+ ) or manganese ion (Mn 2+ ) are not only essential for the activity of almost all DNA synthases, including MPRCA and MDA methods, but also nucleic acids It is also involved in the stability of double-strand formation, so that the double-stranded state of E. coli-derived DNA mixed in the enzyme is stabilized and amplification from DNA other than the target DNA is suppressed.
これら陽イオンは陰イオンと対形成した塩として反応液中に添加され、例えば、一般にMDAに使用される反応組成液は、pH調製剤としてのトリス塩酸、核酸に作用する一価の陽イオンとしての塩化カリウム（KCl）、ポリメラーゼ酵素活性に必須な二価の陽イオンとしての塩化マグネシウム（MgCl2）、酵素が2本鎖の核酸に結合するための補要素としての硫酸アンモニウムで構成されている。 These cations are added to the reaction solution as a salt paired with an anion. For example, a reaction composition solution generally used for MDA is a tris-hydrochloric acid as a pH adjusting agent, a monovalent cation acting on nucleic acid. Potassium chloride (KCl), magnesium chloride (MgCl 2 ) as a divalent cation essential for polymerase enzyme activity, and ammonium sulfate as a complement for the enzyme to bind to double-stranded nucleic acids.
しかしながら、本発明者らは、上記のような陽イオンの塩を過剰に添加することが、むしろ増幅効率に阻害作用を奏し、特にMDA増幅反応においては、塩化カリウムの濃度は60 mMが上限であり、塩化カリウムを60 mM添加した場合、塩化マグネシウムの濃度は15 mMが上限であることを見出した。従来、これらの一価の陽イオンおよび／または二価の陽イオンの対イオンとなる陰イオンについて検討された例はなかった。これらの陽イオンは、通常、試薬入手の容易さと価格の点で研究室に常備される塩化物イオン（Cl-）との無機塩として反応液に使用されてきたが、本発明者らは、通常用いられる塩化物イオンの塩により提供される塩化物イオンが、鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応において、特に酵素の活性部位の構造特性を阻害することに起因することを見出した。本発明においては、本来は細胞内に殆ど存在しない塩化物イオンを反応液の組成から排除し、反応液の組成を細胞内条件に模倣することにより、塩化物イオンによりDNA合成反応が阻害されることがなくなり、さらに、従来の反応組成液に比べて高濃度の一価の陽イオンおよび／または二価の陽イオンを提供することが可能になるので、DNA増幅効率を飛躍的に向上できる。 However, the inventors of the present invention added an excess of the cation salt as described above, but rather had an inhibitory effect on the amplification efficiency. Especially in the MDA amplification reaction, the upper limit of the potassium chloride concentration was 60 mM. Yes, when 60 mM of potassium chloride was added, the concentration of magnesium chloride was found to be 15 mM. Heretofore, there has been no example in which an anion serving as a counter ion of these monovalent cations and / or divalent cations has been studied. These cations have been used in reaction solutions as inorganic salts with chloride ions (Cl − ) that are usually available in laboratories in terms of easy reagent availability and cost. We found that chloride ions provided by commonly used salts of chloride ions were caused by inhibition of structural properties of the active site of the enzyme, particularly in DNA amplification reactions via strand displacement DNA synthase. . In the present invention, the DNA synthesis reaction is inhibited by chloride ions by eliminating chloride ions that are essentially not present in the cells from the composition of the reaction solution and imitating the composition of the reaction solution to the intracellular conditions. In addition, since it is possible to provide a higher concentration of monovalent cations and / or divalent cations compared to conventional reaction composition solutions, DNA amplification efficiency can be dramatically improved.
また、MDA法において直鎖状DNAを鋳型として用いる場合、増幅効率および増幅配列の忠実度が低下する問題点があったが、環状DNA増幅に用いられていた反応条件では、Tmに影響を与える塩化カリウム及び塩化マグネシウムは、既に、ほぼ上限の濃度で使用しているため、これらの電解質の添加量をさらに増加することはできず、Tm値の改変による増幅効率の改善は困難であった。しかし、本発明によって、塩化物イオンを反応液の組成から排除し、反応液の組成を細胞内条件に模倣することにより、プライマーのTm値および直鎖状DNAを鋳型として用いるMDA法においても、DNA合成酵素が阻害されず、陽イオン濃度の増大により、Tm値を高め、酵素に混入する成分に由来する非特異的反応を抑制することができるため、増幅効率を高めることが可能となる。 In addition, when linear DNA was used as a template in the MDA method, there was a problem that the amplification efficiency and the fidelity of the amplification sequence were lowered. However, the reaction conditions used for circular DNA amplification affected Tm. Since potassium chloride and magnesium chloride have already been used at a concentration almost at the upper limit, the amount of these electrolytes added cannot be further increased, and it has been difficult to improve amplification efficiency by modifying the Tm value. However, according to the present invention, by removing chloride ions from the composition of the reaction solution and imitating the composition of the reaction solution to the intracellular conditions, in the MDA method using the Tm value of the primer and linear DNA as a template, Since the DNA synthase is not inhibited and the cation concentration is increased, the Tm value can be increased and the nonspecific reaction derived from the components mixed in the enzyme can be suppressed, so that the amplification efficiency can be increased.
また、RNAプライマーを用いる場合はさらに、一価の陽イオンおよび／または二価の陽イオン濃度の増加により、RNAプライマーのTm値を改善し、RNAプライマーに対するDNA合成酵素の活性を高めることができるため、増幅効率を高めることが可能となる。本発明により、RNAプライマーを用いて直鎖状DNAを増幅することが、実質的に初めて可能となる。 In addition, when RNA primers are used, the Tm value of RNA primers can be improved and the activity of DNA synthase against RNA primers can be increased by increasing the concentration of monovalent cations and / or divalent cations. Therefore, it is possible to increase the amplification efficiency. The present invention makes it possible for the first time to amplify linear DNA using RNA primers.
特に、初期段階におけるプライマーのアニール数が増幅効率に影響を与えるMPRCA法およびMDA法においては、高濃度の一価の陽イオンの存在は、増幅効率を上昇させるために有効であると考えられる。本発明のDNA増幅方法は、好ましくは、マルチプリープライムローリングサークル増幅法（mulitiply-primed rolling circle amplification：MPRCA）、およびマルチプルディスプレースメント増幅法（multiple displacement amplification：MDA）に基づくDNA増幅方法である。 In particular, in the MPRCA method and the MDA method in which the number of primer anneals in the initial stage affects the amplification efficiency, the presence of a high concentration of monovalent cations is considered to be effective for increasing the amplification efficiency. The DNA amplification method of the present invention is preferably a DNA amplification method based on a multiple-primed rolling circle amplification method (MPRCA) and a multiple displacement amplification method (MDA).
また、本発明の方法によるDNA増幅反応の効率の改善は、特に、鋳型がゲノムDNAなどの直鎖状DNAである場合や、鋳型DNAが微量しか存在しない場合に、極めて高い効果を発揮する。 In addition, the improvement of the efficiency of the DNA amplification reaction by the method of the present invention exhibits a very high effect particularly when the template is a linear DNA such as genomic DNA or when the template DNA is present in a very small amount.
また、本発明の方法によるDNA増幅反応は、DNA合成において、配列の全てまたは一部にチオリン酸エステル結合を有するRNAプライマーとRNase Hとを用いて鋳型DNAを再利用する場合に、極めて有用である。この反応においては、具体的には、チオリン酸エステル結合RNAプライマーとプライマーから伸長したDNAとの間のリン酸エステル結合部位にRNase Hによりニックを形成し、鎖置換型DNA合成酵素により、プライマーのニック部位から、既に合成されている相補鎖DNAを鋳型DNAから解離させつつ新たなDNA合成を行うことにより、鋳型に結合したRNAプライマーおよび初期鋳型DNAを再利用することで、目的DNAの増幅効率を向上させる。本発明の方法においては、陰イオンが、塩化物イオン以外の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供され、一価および／または二価の陽イオンが高濃度において提供されることにより、RNAプライマーのTm値およびDNA合成酵素活性の問題を克服し、同時にDNA合成酵素およびRNase Hの両方の活性を促進するので、１回の増幅反応でその後の解析に十分なDNAを提供することを可能とする。 In addition, the DNA amplification reaction according to the method of the present invention is extremely useful in DNA synthesis when a template DNA is reused by using an RNA primer having a thiophosphate ester bond in all or part of the sequence and RNase H. is there. Specifically, in this reaction, a nick is formed by RNase H at the phosphate ester binding site between the thiophosphate ester-binding RNA primer and the DNA extended from the primer, and the strand displacement type DNA synthase is used to form the primer. Amplification efficiency of the target DNA is achieved by reusing the RNA primer and initial template DNA bound to the template by synthesizing new DNA from the nick site while dissociating the previously synthesized complementary DNA from the template DNA. To improve. In the method of the present invention, the anion is an anion other than a chloride ion, and is provided at a concentration that does not exert an inhibitory effect on the strand displacement-type DNA synthesis reaction, and is a monovalent and / or divalent cation. Is provided at a high concentration, which overcomes the problems of Tm value of RNA primer and DNA synthase activity, and at the same time promotes the activity of both DNA synthase and RNase H. It is possible to provide sufficient DNA for analysis.
また、本発明は、別の態様において、一価および／または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる鎖置換型DNA合成反応に用いる反応液組成物に関する。本発明の組成物は、DNAを合成する酵素反応においてDNA合成に対する阻害効果を有する陰イオン物質を除外することを特徴とし、より具体的には、前記電解質により提供される陰イオンが、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない、塩化物イオン（Cl-）以外のイオンであることを特徴とする。 In another aspect, the present invention relates to a reaction solution composition for use in a strand displacement type DNA synthesis reaction in which an electrolyte that provides monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved. The composition of the present invention is characterized by excluding an anionic substance having an inhibitory effect on DNA synthesis in an enzymatic reaction for synthesizing DNA, more specifically, the anion provided by the electrolyte is the chain. It is an ion other than a chloride ion (Cl − ) that does not exert an inhibitory effect on the substitutional DNA synthesis reaction.
本発明の反応液組成物は、一価の陽イオン、例えばカリウムイオンを、塩化物イオン以外の陰イオンと対形成した電解質として用いることにより、DNA増幅反応を阻害することなく、高濃度、例えば50 mM以上、好ましくは70 mM以上、より好ましくは100 mM以上、さらに好ましくは150 mM以上の終濃度で提供することができる。これによって、プライマーのTmを上昇させてアニール効率を改善することが可能となり、非特異的なDNA合成を抑え、且つ目的DNAのみを効率良く増幅することが可能となる。 The reaction solution composition of the present invention uses a monovalent cation, such as potassium ion, as an electrolyte paired with an anion other than chloride ion, thereby preventing the DNA amplification reaction from being inhibited, for example, at a high concentration. It can be provided at a final concentration of 50 mM or more, preferably 70 mM or more, more preferably 100 mM or more, and even more preferably 150 mM or more. This makes it possible to increase the Tm of the primer and improve the annealing efficiency, suppress non-specific DNA synthesis, and efficiently amplify only the target DNA.
DNA増幅反応における一価の陽イオンの至適濃度は、使用するDNA合成酵素、鋳型、増幅する配列およびプライマーの種類や長さなどに依存して変化するが、例えば、RNAを含むプライマーを用いる鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応においては、一価の陽イオンは、好ましくは約100〜150 mM、より好ましくは約125 mMで使用する。 The optimal concentration of monovalent cations in the DNA amplification reaction varies depending on the DNA synthase used, the template, the sequence to be amplified, and the type and length of the primer. For example, using primers containing RNA In the DNA amplification reaction via the strand displacement type DNA synthase, the monovalent cation is preferably used at about 100 to 150 mM, more preferably about 125 mM.
また、本発明の反応液組成物は、二価の陽イオン、例えばマグネシウムイオンを、塩化物イオン以外の陰イオンと対形成した電解質として用いることにより、DNA増幅反応を阻害することなく、高濃度、例えば5 mM以上、好ましくは10 mM以上、より好ましくは15 mM以上、さらに好ましくは20 mM以上の終濃度で使用できる。これによって、反応系に含まれる酵素の活性を増大させることが可能となり、DNA合成酵素の活性が低い条件でのDNA増幅、例えばRNAを含むプライマーを用いる場合であっても、充分な増幅が得られる。また、高濃度のマグネシウムイオンにより、酵素に混入している大腸菌由来のDNAの二本鎖状態を安定させ、目的のDNA以外のDNAの合成を抑制することができる。 In addition, the reaction solution composition of the present invention uses a divalent cation such as magnesium ion as an electrolyte paired with an anion other than chloride ion, thereby preventing a high concentration of the DNA amplification reaction. For example, it can be used at a final concentration of 5 mM or more, preferably 10 mM or more, more preferably 15 mM or more, and even more preferably 20 mM or more. This makes it possible to increase the activity of the enzyme contained in the reaction system, and sufficient amplification can be obtained even when DNA amplification under conditions where the activity of the DNA synthase is low, for example, when using primers containing RNA. It is done. In addition, a high concentration of magnesium ions can stabilize the double-stranded state of E. coli-derived DNA mixed in the enzyme and suppress synthesis of DNA other than the target DNA.
DNA増幅反応における二価の陽イオンの至適濃度は、使用するDNA合成酵素、鋳型、増幅する配列およびプライマーの種類や長さなどに依存して変化するが、例えば、RNAを含むプライマーを用いる鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応においては、二価の陽イオンは、好ましくは約20〜35mM、より好ましくは約27mMで使用する。 The optimal concentration of the divalent cation in the DNA amplification reaction varies depending on the DNA synthase used, the template, the sequence to be amplified, the type and length of the primer, etc., for example, using a primer containing RNA. In the DNA amplification reaction via the strand displacement type DNA synthase, the divalent cation is preferably used at about 20 to 35 mM, more preferably about 27 mM.
一価の陽イオンおよび二価の陽イオンの両方が塩化物イオンを含まない電解質により提供されることが好ましいが、一価の陽イオンまたは二価の陽イオンいずれか一方のみが塩化物イオンを含まない電解質により提供されてもよい。具体的には、例えば一価イオンが塩化物イオンを含まない電解質により提供される場合、二価イオンが塩化物イオンを含む電解質により提供されても、本発明の組成物はなお効果を発揮する。 Preferably, both monovalent and divalent cations are provided by an electrolyte that does not contain chloride ions, but only either monovalent or divalent cations can contain chloride ions. It may be provided by an electrolyte that does not contain. Specifically, for example, when monovalent ions are provided by an electrolyte that does not contain chloride ions, the composition of the present invention is still effective even if divalent ions are provided by an electrolyte that contains chloride ions. .
また、１種類の陰イオンで反応液を構成するより、複数の陰イオンを用いた方が、より良好な結果を得ることができる。例えば、一価の陽イオンと二価の陽イオンとを、それぞれ異なる陰イオンと対形成した形で使用することが好ましい。また、１種類の陽イオンを、複数の異なる陰イオンとの塩の混合物の形で使用してもよい。 In addition, it is possible to obtain a better result by using a plurality of anions than when the reaction liquid is constituted by one kind of anions. For example, it is preferable to use a monovalent cation and a divalent cation paired with different anions. One kind of cation may be used in the form of a mixture of salts with a plurality of different anions.
本発明の反応液組成物に用いられる塩化物イオン（Cl-）以外の陰イオンとして、生体内に存在する陰イオンで優位を占める陰イオンが好ましく、例えば、ハロゲンイオン以外の陰イオン、好ましくはカルボン酸のイオン、より好ましくは酢酸イオンおよび／または酸性アミノ酸イオンが用いられ、最も好ましくはグルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンまたは酢酸イオンが用いられる。好ましいイオンの組合せの例としては、例えば、陽イオンがカリウムまたはナトリウムイオンである場合、陰イオンがグルタミン酸またはアスパラギン酸イオンであり、陽イオンがマグネシウムイオンである場合、陰イオンが酢酸イオンである。 The anion other than the chloride ion (Cl − ) used in the reaction liquid composition of the present invention is preferably an anion that dominates the anion present in the living body, for example, an anion other than a halogen ion, preferably Carboxylic acid ions, more preferably acetate ions and / or acidic amino acid ions are used, most preferably glutamate ions, aspartate ions or acetate ions. Examples of preferred ion combinations include, for example, when the cation is potassium or sodium ion, the anion is glutamate or aspartate ion, and when the cation is magnesium ion, the anion is acetate ion.
本発明の反応液組成物に用いられる陽イオンは、核酸のTmを改善するか、DNA合成酵素およびRNase Hなどの他の酵素の活性を増大させる陽イオンであれば特に限定されないが、一般に、一価および／または二価の陽イオン、例えば、カリウムイオン（K+）、ナトリウムイオン（Na+）、マグネシウムイオン（Mg2+）およびマンガンイオン（Mn2+）などが用いられる。 The cation used in the reaction solution composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a cation that improves Tm of nucleic acid or increases the activity of other enzymes such as DNA synthase and RNase H. Monovalent and / or divalent cations such as potassium ion (K + ), sodium ion (Na + ), magnesium ion (Mg 2+ ) and manganese ion (Mn 2+ ) are used.
本発明の反応液組成物は、DNA合成酵素を用いるDNA増幅反応初期におけるプライマーのアニール効率を改善し、それにより非特異的反応を抑制するので、鋳型となるDNAが微量である場合や、直鎖DNAを鋳型とする場合において特に有用である。 The reaction solution composition of the present invention improves the primer annealing efficiency in the initial stage of the DNA amplification reaction using DNA synthase, thereby suppressing non-specific reaction. This is particularly useful when a strand DNA is used as a template.
直鎖DNAを鋳型として増幅を行う場合、鋳型が微量である場合は特に、DNA増幅効率はプライマーの初期アニール効率に依存する。本発明の組成物を用いることにより、プライマーのTm値が上昇し、DNA増幅効率を改善することができるので、直鎖DNAを鋳型にした場合においても非特異的なDNA合成を抑え、かつ、極微量の鋳型DNAからの目的DNAの増幅が可能となる。特に、配列の全てまたは一部にRNAを含むプライマーを使用する場合には、本発明の組成物を用いることにより、RNAプライマーのTm値およびDNA合成酵素活性に起因する増幅効率の問題を解決することができる。 When amplification is performed using linear DNA as a template, the DNA amplification efficiency depends on the initial annealing efficiency of the primer, especially when the template is a very small amount. By using the composition of the present invention, the Tm value of the primer is increased and the DNA amplification efficiency can be improved, so that non-specific DNA synthesis is suppressed even when linear DNA is used as a template, and The target DNA can be amplified from a very small amount of template DNA. In particular, when using a primer containing RNA in all or part of the sequence, the composition of the present invention is used to solve the problem of amplification efficiency due to the Tm value of the RNA primer and the DNA synthase activity. be able to.
本発明の反応液組成物は、鎖置換型DNA合成酵素を利用するDNA増幅反応において、配列の全てまたは一部にRNAを有するプライマーを用いる場合に、特に有用である。本発明の反応液組成物は、RNAプライマーのTm値の低さの問題およびRNAプライマーを用いた場合のDNA合成酵素活性の低さの問題の両方を克服するので、RNAプライマーを用いての鎖置換型DNA酵素によるDNA増幅効率を著しく改善する。 The reaction solution composition of the present invention is particularly useful when a primer having RNA in all or part of a sequence is used in a DNA amplification reaction using a strand displacement type DNA synthase. The reaction solution composition of the present invention overcomes both the problem of low Tm value of RNA primer and the problem of low DNA synthase activity when RNA primer is used. Significantly improves the efficiency of DNA amplification by substitutional DNA enzymes.
また、本発明の反応液組成物は、鎖置換型DNA合成酵素を利用するDNA増幅反応において、配列の全てまたは一部にチオリン酸エステル結合を有するRNAプライマーとRNase Hとを用いて鋳型DNAを再利用する場合に、極めて有用である。この反応においては、具体的には、チオリン酸エステル結合RNAプライマーとプライマーから伸長したDNAとの間のリン酸エステル結合部位にRNase Hによりニックを形成し、鎖置換型DNA合成酵素により、プライマーのニック部位から、既に合成されている相補鎖DNAを鋳型DNAから解離させつつ新たなDNA合成を行うことにより、鋳型に結合したRNAプライマーおよび初期鋳型DNAを再利用することで、目的DNAの増幅効率を向上させる。本発明の組成物は、RNAプライマーのTm値およびDNA合成酵素活性の問題を克服し、同時にDNA合成酵素およびRNase Hの両方の活性を促進するので、１回の増幅反応でその後の解析に十分なDNAを提供することを可能とする。本発明のこの態様については、本明細書において後述のプライマーの項でより詳細に説明する。 In addition, the reaction solution composition of the present invention is a DNA amplification reaction using a strand displacement type DNA synthase, and a template DNA is prepared using an RNA primer having a thiophosphate bond in all or part of the sequence and RNase H. This is extremely useful when reusing. Specifically, in this reaction, a nick is formed by RNase H at the phosphate ester binding site between the thiophosphate ester-binding RNA primer and the DNA extended from the primer, and the strand displacement type DNA synthase is used to form the primer. Amplification efficiency of the target DNA is achieved by reusing the RNA primer and initial template DNA bound to the template by synthesizing new DNA from the nick site while dissociating the previously synthesized complementary DNA from the template DNA. To improve. The composition of the present invention overcomes the problems of RNA primer Tm value and DNA synthase activity, and at the same time promotes the activity of both DNA synthase and RNase H, so that a single amplification reaction is sufficient for subsequent analysis. New DNA can be provided. This aspect of the invention is described in more detail in the primer section later in this specification.
本発明の反応液組成物は、この態様において、鎖置換型DNA合成酵素およびRNase Hの双方の活性を促進するものであることが好ましい。 In this embodiment, the reaction solution composition of the present invention preferably promotes the activities of both the strand displacement type DNA synthase and RNase H.
本発明の方法において使用する反応液組成物は、pH調製剤をさらに含むことが好ましく、pH調製剤としては、塩化物イオン（Cl-）を含まず、生体分子に対する影響の小さいグッドバッファーが好ましい。かかるpH調製剤の例として、ADA、PIPES、POPSO、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、BicineおよびTAPSが挙げられ、RNAを含むプライマーを用いる鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応ににおいては、例えば、至適pHで使用できるヘペス（HEPES）が好ましい。HEPESの濃度は、好ましくは約20〜50 mM、より好ましくは約35 mMである。本発明の方法において使用する反応液組成物のpHを調製する場合、塩化物イオンを含む塩を用いないことが好ましく、例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを用いることが好ましい。 The reaction solution composition used in the method of the present invention preferably further contains a pH adjusting agent, and the pH adjusting agent is preferably a good buffer that does not contain chloride ions (Cl − ) and has little influence on biomolecules. . Examples of such pH adjusters include ADA, PIPES, POPSO, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine and TAPS, and primers containing RNA. In the DNA amplification reaction via the strand displacement type DNA synthase to be used, for example, HEPES that can be used at an optimum pH is preferable. The concentration of HEPES is preferably about 20-50 mM, more preferably about 35 mM. When adjusting the pH of the reaction solution composition used in the method of the present invention, it is preferable not to use a salt containing chloride ions, for example, sodium hydroxide or potassium hydroxide is preferably used.
本発明の至適組成物の例としては、35 mM HEPES、125 mMグルタミン酸カリウム、27 mM酢酸マグネシウムで構成された反応液組成物が、RNAを含むプライマーを用いる鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応に良好な結果を与える。 As an example of the optimal composition of the present invention, a reaction solution composition composed of 35 mM HEPES, 125 mM potassium glutamate, and 27 mM magnesium acetate is mediated by a strand displacement type DNA synthase using a primer containing RNA. Gives good results to DNA amplification reactions.
DNA伸長反応の副産物として生成されるピロリン酸は反応液中のマグネシウムイオンと反応し、好ましいマグネシウムイオン濃度を維持できなくなるため、反応液中にピロホスファターゼ（Pyrophosphatase）を加えることは必須である。具体的には、ピロホスファターゼは約0.02 U／反応、添加することが好ましい。また、鎖置換型DNA酵素が二本鎖の核酸に結合するために一定量のアンモニウム塩の添加が必須である場合がある。しかし、前記のピロホスファターゼは3.2Mという高濃度の硫酸アンモニウム液の懸濁液中で提供されることが多いため、その場合、反応液組成に新たにアンモニウム塩を追加する必要はない。 Since pyrophosphate produced as a by-product of the DNA extension reaction reacts with magnesium ions in the reaction solution and cannot maintain a preferable magnesium ion concentration, it is essential to add pyrophosphatase to the reaction solution. Specifically, pyrophosphatase is preferably added at about 0.02 U / reaction. In addition, a certain amount of ammonium salt may be indispensable for the strand displacement type DNA enzyme to bind to a double-stranded nucleic acid. However, since the above-mentioned pyrophosphatase is often provided in a suspension of ammonium sulfate solution having a high concentration of 3.2 M, it is not necessary to add a new ammonium salt to the reaction solution composition.
ジチオスレイトール（DTT）もまた、用いられるDNA合成酵素によってはその活性に必須である。その場合、好ましくは約0.5〜8mM、より好ましくは約5mM程度添加する。 Dithiothreitol (DTT) is also essential for its activity, depending on the DNA synthase used. In that case, it is preferably added at about 0.5 to 8 mM, more preferably about 5 mM.
DNA伸長反応の基質となるdNTP混合物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）の濃度は、好ましくは約0.5〜5 mM、より好ましくは約1 mMである。この他、反応液中には伸長反応の安定化を目的とした添加物を添加してもよい。例えば、BSA（好ましくは約0〜0.02%、より好ましくは約0.01%）、Tween 20（好ましくは約0〜2%、より好ましくは約0.1%）、Triton X100（好ましくは約0〜0.2%、より好ましくは約0.1%）等が挙げられる。 The concentration of the dNTP mixture (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) serving as a substrate for the DNA extension reaction is preferably about 0.5 to 5 mM, more preferably about 1 mM. In addition, an additive for the purpose of stabilizing the extension reaction may be added to the reaction solution. For example, BSA (preferably about 0-0.02%, more preferably about 0.01%), Tween 20 (preferably about 0-2%, more preferably about 0.1%), Triton X100 (preferably about 0-0.2%, More preferred is about 0.1%).
dNTP混合物中に、その誘導体である、α−チオ−dNTP類、ビオチン−dUTP、シゴキシゲニン−dUTP、または蛍光物質で標識されたdNTP等を加えることにより、増幅DNAを標識することも可能である。ただし、α−チオ−dNTP類はRNAプライマーとDNA鎖との間にチオリン酸エステル結合を生じるので、合成効率が低下する場合がある。 It is also possible to label amplified DNA by adding α-thio-dNTPs, biotin-dUTP, sigoxygenin-dUTP, or dNTPs labeled with a fluorescent substance to the dNTP mixture. However, since α-thio-dNTPs generate a thiophosphate ester bond between the RNA primer and the DNA strand, the synthesis efficiency may decrease.
本発明は、一態様において、上記のDNA増幅反応に用いるプライマーである。本発明の方法に使用されるプライマーは、DNAプライマー、RNAプライマー、DNA／RNAキメラプライマー、RNA／DNAキメラプライマーのいずれであってもよいが、本発明の方法は、RNAを塩基配列中に含むプライマーを用いる場合に特に効果的であり、塩基配列中にRNAを含むプライマーを用いて鎖置換型DNA合成酵素を介したDNA増幅反応を行う場合に極めて有用である。RNA（リボヌクレオチド）とは、糖部分がD−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）を有するものが挙げられる。 In one aspect, the present invention is a primer used in the above DNA amplification reaction. The primer used in the method of the present invention may be any of a DNA primer, an RNA primer, a DNA / RNA chimera primer, and an RNA / DNA chimera primer, but the method of the present invention includes RNA in the base sequence. This is particularly effective when using a primer, and is extremely useful when performing a DNA amplification reaction via a strand displacement type DNA synthase using a primer containing RNA in the base sequence. RNA (ribonucleotide) is a nucleotide whose sugar moiety is composed of D-ribose, and whose base moiety has adenine (A), cytosine (C), guanine (G), or uracil (U). Can be mentioned.
塩基の全てまたは一部がRNAであるプライマーは、少なくとも５’末端から１塩基、好ましくは３塩基以上のRNAを含有するプライマーであることが、プライマー同士のセルフアニールによる目的外DNAの増幅を低減させるため、陰性対照（ネガティブコントロール）の設定の簡便さなどの観点から好ましい。好ましくは、プライマーの塩基配列中のすべての塩基がRNAである。 Primers in which all or part of the bases are RNA should be at least one base from the 5 ′ end, preferably 3 bases or more, to reduce amplification of undesired DNA due to self-annealing between primers. Therefore, it is preferable from the viewpoint of simplicity of setting a negative control (negative control). Preferably, all bases in the base sequence of the primer are RNA.
本発明の一態様において、鎖置換型DNA酵素を用いるDNA増幅方法、特にMDA法において、RNAプライマーを利用し、さらにRNase Hを反応液中に加えることにより、RNAプライマーとプライマーから伸長して新規に合成されたDNAとの間のリン酸エステル結合部位にニックを形成させ、初期鋳型を再利用することが、初めて可能となる。 In one embodiment of the present invention, an RNA primer is used in a DNA amplification method using a strand displacement type DNA enzyme, particularly an MDA method, and RNase H is further added to the reaction solution to extend from the RNA primer and the primer. For the first time, it becomes possible to form a nick at the phosphate ester binding site between the DNA synthesized in the first step and reuse the initial template.
図6に、本発明による、RNase Hを用いての鋳型DNAの再利用法の模式図を示す。（ａ）変性した一本鎖DNAにRNAプライマーがアニールし、（ｂ）アニールしたプライマーからDNA合成が開始され、（ｃ）チオリン酸エステル結合RNAプライマーとプライマーから伸長したDNAとの間のリン酸エステル結合部位にRNase Hによりニックを形成し、（ｄ）および（ｅ）プライマーのニック部位から、鎖置換型DNA合成酵素により、既に合成されている相補鎖DNAを鋳型DNAから解離させつつ新たなDNA合成を行う。（ｂ）〜（ｅ）の反応を反応液中で繰り返すことにより、初期鋳型DNAおよび初期鋳型に結合したRNAプライマーを繰り返し再利用し、目的DNAの増幅効率を向上させる。 FIG. 6 shows a schematic diagram of a method for reusing template DNA using RNase H according to the present invention. (A) RNA primer anneals to denatured single-stranded DNA, (b) DNA synthesis starts from annealed primer, (c) Phosphate between thiophosphate ester-bound RNA primer and DNA extended from primer A nick is formed at the ester bond site by RNase H, and (d) and (e) from the nick site of the primer, a strand-displacing DNA synthase is used to dissociate the previously synthesized complementary strand DNA from the template DNA, and a new one is generated. Perform DNA synthesis. By repeating the reactions (b) to (e) in the reaction solution, the initial template DNA and the RNA primer bound to the initial template are repeatedly reused to improve the amplification efficiency of the target DNA.
本発明のこの態様に使用されるRNAプライマーは、その３’末端から少なくとも１塩基、好ましくは３’末端から少なくとも３塩基においてRNAを含有するプライマーである。また、この方法においては、RNAプライマー自体がRNase Hにより分解されないよう、プライマーの少なくとも一部が、化学修飾などによりRNase Hから保護されていることが重要である。具体的には、例えば、本発明のDNA増幅方法に、RNAを含む塩基間のすべてまたは一部がチオリン酸エステル結合により結合されているチオリン酸エステル結合RNAプライマーが好ましい。このようなチオリン酸化エステル結合は、プライマーの配列内でRNase Hによりニックが入ることを防止し、RNAプライマー自体の分解を防ぎつつ、RNAプライマーと、該プライマーから連続して合成されたDNA相補鎖との間のリン酸エステル結合のみにニックを形成することを可能とする。 The RNA primer used in this aspect of the invention is a primer that contains RNA at least 1 base from its 3 'end, preferably at least 3 bases from its 3' end. In this method, it is important that at least a part of the primer is protected from RNase H by chemical modification or the like so that the RNA primer itself is not degraded by RNase H. Specifically, for example, in the DNA amplification method of the present invention, a thiophosphate ester-bound RNA primer in which all or part of the bases containing RNA are bound by a thiophosphate ester bond is preferable. Such a thiophosphorylated ester bond prevents nicking by RNase H in the primer sequence and prevents degradation of the RNA primer itself, while simultaneously synthesizing the RNA primer and a DNA complementary strand synthesized from the primer. It is possible to form a nick only in the phosphate ester bond between the two.
本発明のこの態様に使用されるプライマーは、プライマーの３’末端から少なくとも3塩基が非修飾RNA塩基であることが好ましいが、該プライマーの３’末端から１塩基、好ましくは３’末端から３塩基以外のRNAは、他の修飾によりRNase Hから保護されていてもよく、例えば、２−Ｏ−メチルRNAなどの修飾RNA塩基などを使用することもできる。このように修飾RNAを用いることにより、RNAプライマー自体がRNaseによって分解されることを防ぐことが可能となる。したがって、本発明の方法に使用されるプライマーは、５’末端から少なくとも１塩基が非修飾RNAまたは修飾RNA塩基であってもよい。 The primer used in this embodiment of the present invention is preferably at least 3 bases from the 3 ′ end of the primer are unmodified RNA bases, but 1 base from the 3 ′ end of the primer, preferably 3 from the 3 ′ end. RNA other than the base may be protected from RNase H by other modifications. For example, a modified RNA base such as 2-O-methyl RNA can also be used. By using the modified RNA in this way, it is possible to prevent the RNA primer itself from being degraded by RNase. Accordingly, the primer used in the method of the present invention may be an unmodified RNA or a modified RNA base at least one base from the 5 'end.
RNAプライマーのアニール効率およびRNAプライマーを用いる場合のDNA合成酵素の活性は、陰イオンが塩化物イオン以外のイオンである電解質が溶解してなる本発明の反応液組成物を用いて高濃度の一価および／または二価の陽イオンを反応液中に提供することによって、改善することができる。 The annealing efficiency of the RNA primer and the activity of the DNA synthase when using the RNA primer have a high concentration using the reaction solution composition of the present invention in which an electrolyte whose anion is an ion other than chloride ion is dissolved. This can be improved by providing valent and / or divalent cations in the reaction.
この態様においては、一つの反応系中で、鎖置換型DNA合成酵素によるDNA合成反応とRNase Hによるニック形成反応とが同時に行なわれることが好ましく、反応液中に提供される一価および／または二価の陽イオンは、鎖置換型DNA合成酵素およびRNase Hの双方の活性を促進するものであることが好ましい。 In this embodiment, it is preferable that the DNA synthesis reaction by the strand displacement type DNA synthase and the nick formation reaction by RNase H are performed simultaneously in one reaction system, and the monovalent and / or provided in the reaction solution The divalent cation is preferably one that promotes the activities of both the strand displacement type DNA synthase and RNase H.
本発明のプライマーには、好ましくは５’及び３’末端以外の部分において、LNA（BNAとも呼ばれる）などの特殊DNAを使用することもできる。このような特殊DNAを用いることにより、プライマーの配列特異性を高めることができる。 For the primer of the present invention, a special DNA such as LNA (also referred to as BNA) can be preferably used at a portion other than the 5 'and 3' ends. By using such special DNA, the sequence specificity of the primer can be increased.
また、本発明のプライマーは、適宜、プライマーの配列の塩基間のすべてまたは一部がチオリン酸エステル結合により結合されていてもよい。チオリン酸化エステル結合は、プライマーの安定化に寄与するため、さらに好ましい。 In addition, in the primer of the present invention, all or part of the base sequence of the primer sequence may be bound by a thiophosphate bond. A thiophosphorylated ester bond is more preferred because it contributes to the stabilization of the primer.
本発明のプライマーの長さは、６ヌクレオチド〜９ヌクレオチドの長さ、好ましくは、６ヌクレオチドの長さである。また、ランダムプライマーを用いることが好ましい。 The length of the primer of the present invention is 6 to 9 nucleotides, preferably 6 nucleotides. Moreover, it is preferable to use a random primer.
反応系に添加するプライマーの量（濃度）は、鋳型量、鋳型の鎖長に応じて適宜調節するが、例えば、好ましくは約5〜100μM、より好ましくは約50μMである。 The amount (concentration) of the primer added to the reaction system is appropriately adjusted according to the amount of template and the chain length of the template, and is, for example, preferably about 5 to 100 μM, more preferably about 50 μM.
本発明は、さらなる態様において、本明細書において記載するプライマーの１または２以上の、本明細書において記載するDNA増幅方法の１または２以上への使用である。 In a further aspect, the present invention is the use of one or more of the primers described herein in one or more of the DNA amplification methods described herein.
本発明のプライマーを本発明のDNA増幅方法に用いることにより、鎖置換型DNA合成酵素を用いるDNA増幅、特にMDA反応において、鋳型DNAが直鎖状であり、かつ極めて微量であっても、疑似DNA合成や非特異的DNAの増幅をRNAプライマーを用いることにより完全に抑えることができ、かつ、チオリン酸エステル結合RNAプライマーとプライマーから伸長したDNAとの間のリン酸エステル結合部位にRNase Hによりニックを形成することによってRNAプライマーのニック部位から再びDNA合成を開始させ、初期鋳型を繰り返し再利用することができ、および／または、陰イオンが塩化物イオン以外の陰イオンである電解質が溶解されてなる反応液組成物中で反応を行うことによりプライマーのアニール効率および酵素活性を改善し、これらの効果により、目的DNAの増幅効率を向上させ、1回の増幅反応でその後の解析に十分なDNAを提供することが可能になる。 By using the primer of the present invention in the DNA amplification method of the present invention, even in the case of DNA amplification using a strand displacement type DNA synthase, particularly in the MDA reaction, the template DNA is linear, DNA synthesis and amplification of non-specific DNA can be completely suppressed by using RNA primers, and RNase H is added to the phosphate ester binding site between the thiophosphate ester-binding RNA primer and the DNA extended from the primer. By forming a nick, DNA synthesis can be started again from the nick site of the RNA primer, the initial template can be reused repeatedly, and / or the electrolyte whose anion is an anion other than chloride ion is dissolved. The primer annealing efficiency and enzyme activity are improved by performing the reaction in the reaction mixture composition, and the amplification of the target DNA is achieved by these effects. The efficiency can be improved, and a single amplification reaction can provide sufficient DNA for subsequent analysis.
本発明のDNA増幅方法、反応液組成物およびプライマーの効果は、鋳型となる核酸の形状には依存しないが、鋳型となる核酸がDNAであることが好ましい。鋳型DNAは、直鎖DNA及び環状DNAのいずれであってもよいが、特に、直鎖状二本鎖DNAを鋳型として増幅反応を行う場合には、本明細書において記載する方法、反応液組成物および／またはプライマーを用いることにより、増幅効率を飛躍的に高めることができる。従来のMDA法においては、直鎖状DNAを鋳型として用いる場合、増幅効率が低く、また、増幅された配列の忠実度が低いという問題があったが、本発明の方法を用いることにより、鋳型DNAの分子数が非常に少ない場合、例えば、100コピーのDNA、好ましくは10コピーのDNA、さらに好ましくは１コピーのDNAからであっても、充分に検出および／または配列決定が可能な増幅産物を得ることができる。 The effects of the DNA amplification method, reaction solution composition and primer of the present invention do not depend on the shape of the template nucleic acid, but the template nucleic acid is preferably DNA. The template DNA may be any of linear DNA and circular DNA, but particularly when performing an amplification reaction using linear double-stranded DNA as a template, the method and reaction solution composition described in this specification By using a product and / or a primer, amplification efficiency can be dramatically increased. In the conventional MDA method, when linear DNA is used as a template, amplification efficiency is low and the fidelity of the amplified sequence is low. However, by using the method of the present invention, the template is used. Amplification products that can be sufficiently detected and / or sequenced even if the number of molecules of DNA is very small, for example from 100 copies of DNA, preferably 10 copies of DNA, more preferably 1 copy of DNA Can be obtained.
直鎖状DNAは、長鎖であることが好ましく、このような長鎖DNAの例として、ゲノムDNA（ゲノム全体もしくは一部（染色体1本、あるいはさらにその一部）等）が挙げられる。長鎖DNAの長さとしては、直鎖上のDNAの場合、増幅効率の観点から、10kb以上であることが好ましいが、本願発明の方法においては、特に、RNAプライマーとRNase Hとを用いる場合、鋳型を繰り返し使用することができるため、長さに対する依存性は、従来のMDAに比べて低い。環状DNAとしては、微生物ゲノム、葉緑体DNA、ミトコンドリアDNA、BACクローン、YACクローンなどが挙げられる。環状DNAの場合、長さには依存しない。 The linear DNA is preferably a long chain, and examples of such a long chain DNA include genomic DNA (entire genome or part thereof (one chromosome or further part thereof)). The length of the long-chain DNA is preferably 10 kb or more from the viewpoint of amplification efficiency in the case of linear DNA, but the method of the present invention particularly uses an RNA primer and RNase H. Since the template can be used repeatedly, the dependency on the length is low compared to the conventional MDA. Examples of circular DNA include microbial genome, chloroplast DNA, mitochondrial DNA, BAC clone, YAC clone and the like. In the case of circular DNA, it does not depend on the length.
また、鋳型DNAとして、一本鎖および二本鎖DNAのいずれも好適に使用することができる。二本鎖DNAを鋳型とする場合は、二本鎖DNAを一本鎖に変性する前処理工程の後に本発明を実施すればよい。二本鎖DNAを変性させるには、例えば、約95℃で保持する方法（熱変性）やアルカリ処理による方法等、当業者に公知の方法を用いることができる。熱変性により二本鎖を一本鎖にする場合には、pH調製剤としてHEPES 30 mM、一価の陽イオン供給物としてグルタミン酸カリウム50 mM、および二価の陽イオン供給物として酢酸マグネシウム10 mMを含む溶液中で変性を行うことが好ましい。この反応液で変性を行った場合、反応液がその後のDNA合成反応にも持ち込まれるので、DNA合成反応時の反応液の組成が至適になるように考慮する必要がある。 Moreover, both single-stranded and double-stranded DNA can be suitably used as the template DNA. When double-stranded DNA is used as a template, the present invention may be carried out after a pretreatment step for denaturing double-stranded DNA into single strands. In order to denature the double-stranded DNA, methods known to those skilled in the art such as a method of keeping at about 95 ° C. (thermal denaturation) and a method by alkali treatment can be used. When double strands are made into single strands by heat denaturation, HEPES 30 mM as pH adjuster, potassium glutamate 50 mM as monovalent cation feed, and magnesium acetate 10 mM as divalent cation feed It is preferable to perform denaturation in a solution containing When denaturation is performed with this reaction solution, the reaction solution is brought into the subsequent DNA synthesis reaction, so it is necessary to consider so that the composition of the reaction solution during the DNA synthesis reaction is optimized.
本発明の方法において鋳型となるDNAは、DNAを含むあらゆる試料から調製または単離したものを用いることができる。DNAを含む試料には特に制限はなく、ウイルス、原核生物、真核生物の個体そのものまたはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、もしくは汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、もしくは胆汁のような体液、または、外科的にもしくは生検により生体から単離された組織または細胞、または、皮膚片もしくは体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。またこれら以外にも、ウイルス、細菌、真菌、酵母、植物、昆虫などがDNA含有試料として挙げられる。また、前記のような試料をさらに分画してその一部を取り出したものから調製したDNA含有調製物を用いてもよい。 The DNA used as a template in the method of the present invention can be prepared or isolated from any sample containing DNA. The sample containing DNA is not particularly limited, and viruses, prokaryotes, eukaryotes themselves or a part thereof can be used. For example, in vertebrates (including humans), excrements such as feces, urine, or sweat, body fluids such as blood, semen, saliva, gastric fluid, or bile, or surgically or biopsied from the living body. It may be a detached tissue or cell, or a tissue that has fallen from a living body, such as a skin piece or hair. In addition to these, viruses, bacteria, fungi, yeasts, plants, insects and the like can be cited as DNA-containing samples. Alternatively, a DNA-containing preparation prepared from a sample obtained by further fractionating the sample as described above and removing a part thereof may be used.
本発明の方法においては、好ましくは、使用されるDNA合成酵素は、DNAの鎖置換（strand displacement）活性を有する鎖置換型DNA合成酵素である。「鎖置換活性」とはDNAを複製していく過程で伸長方向に既に二本鎖のDNAが形成されている場合、相補鎖を５’側から引き剥がして鋳型を一本鎖にしながら、一本鎖となった鋳型に対して新たな相補鎖を合成してゆく活性を意味する。 In the method of the present invention, preferably, the DNA synthase used is a strand displacement type DNA synthase having a strand displacement activity of DNA. “Strand displacement activity” means that when double-stranded DNA is already formed in the elongation direction during DNA replication, the complementary strand is stripped from the 5 ′ side to make the template single-stranded. It means the activity of synthesizing a new complementary strand to a template that has become a main strand.
本発明において鎖置換型DNA合成酵素を使用する場合、鎖置換型DNA合成酵素には特に制限はなく、例えば、Phi29 DNA polymerase（各社、例えばQIAGEN）、Exonuclease Free Klenow fragment（各社、例えばAmbion）、Bst DNA polymerase（ニューイングランドバイオラブス）、BcaBEST DNA polymerase（タカラバイオ）、Sequenase（登録商標）Version 2（USB）等が挙げられる。さらに、本発明においては、３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換型DNA合成酵素が好ましく、そのような酵素の例として、Phi29 DNA polymeraseが挙げられる。 When a strand displacement type DNA synthase is used in the present invention, the strand displacement type DNA synthase is not particularly limited. For example, Phi29 DNA polymerase (each company, for example, QIAGEN), Exonuclease Free Klenow fragment (each company, for example, Ambion), Examples include Bst DNA polymerase (New England Biolabs), BcaBEST DNA polymerase (Takara Bio), Sequenase (registered trademark) Version 2 (USB), and the like. Furthermore, in the present invention, a strand displacement type DNA synthase having 3'-5 'exonuclease activity is preferable, and an example of such an enzyme is Phi29 DNA polymerase.
本発明のDNA増幅方法において、DNA伸長のために使用される鎖置換型DNA合成酵素の量（濃度）は、使用する酵素の種類によって至適化することが好ましく、これは、当業者が通常行い得る。例えば、Phi29 DNA polymeraseの場合、好ましくは終濃度約1〜50 ng/μl、より好ましくは終濃度約5〜10 ng/μlで使用する。 In the DNA amplification method of the present invention, the amount (concentration) of the strand displacement-type DNA synthase used for DNA elongation is preferably optimized depending on the type of enzyme used. Can be done. For example, in the case of Phi29 DNA polymerase, it is preferably used at a final concentration of about 1 to 50 ng / μl, more preferably at a final concentration of about 5 to 10 ng / μl.
本発明に使用されるRNase H（各社、例えばEpicenture）には特に制限がなく、使用する酵素および反応スケールに応じて至適濃度を適宜決定する。一般に、DNAの伸長反応において使用されるRNase Hの量（濃度）は、好ましくは終濃度約1〜60 units／反応、より好ましくは終濃度約1〜30 units／反応で使用する。
または、本発明の方法において、RNase Hは、好ましくは0.1〜10 units／μl、より好ましくは0.5〜1.5 units／μlの範囲において好適に用いられる。
RNase H (each company, for example, Epicenture) used in the present invention is not particularly limited, and the optimum concentration is appropriately determined according to the enzyme used and the reaction scale. In general, the amount (concentration) of RNase H used in the DNA extension reaction is preferably about 1 to 60 units / reaction at a final concentration, more preferably about 1 to 30 units / reaction at a final concentration.
Alternatively, in the method of the present invention, RNase H is preferably used in a range of preferably 0.1 to 10 units / μl, more preferably 0.5 to 1.5 units / μl.
本発明の方法によるDNAの伸長反応は、好ましくは、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、一定の低温において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型DNAに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。例えば、鎖置換型DNA合成酵素としてPhi29 DNA polymeraseを使用する場合は、好ましくは25℃〜42℃、より好ましくは約30℃で反応する。 The DNA elongation reaction according to the method of the present invention is preferably carried out at a constant low temperature without the need for using a thermal cycler. The reaction temperature is appropriately set by a normal procedure based on the optimum temperature of the enzyme and the denaturation temperature based on the primer chain length (temperature range in which the primer binds (anneals) / dissociates with the template DNA). For example, when Phi29 DNA polymerase is used as the strand displacement type DNA synthase, the reaction is preferably performed at 25 ° C. to 42 ° C., more preferably at about 30 ° C.
本発明の方法により増幅されたDNAは、電気泳動などの公知の手法により検出することができ、または、塩基配列を決定することができる。また、増幅したDNA領域の配列が既知の配列である場合、定量PCR等を用いて、増幅産物が目的の配列であるか否かを確認し、さらに増幅効率を求めることができる。DNA合成においてdNTPの誘導体を含む標識dNTPを使用していた場合、標識物を利用する検出法も使用することができる。 The DNA amplified by the method of the present invention can be detected by a known technique such as electrophoresis, or the base sequence can be determined. Further, when the sequence of the amplified DNA region is a known sequence, it is possible to confirm whether or not the amplification product is the target sequence by using quantitative PCR or the like, and further obtain the amplification efficiency. When a labeled dNTP containing a dNTP derivative is used in DNA synthesis, a detection method using a labeled substance can also be used.
本発明は、さらなる態様において、本明細書において記載するDNA増幅反応のための反応液組成物を含む、DNA増幅方法のためのキットとすることができる。本発明のキットは、好ましくは、少なくとも、本明細書において記載するDNA増幅反応のための反応液組成物および／またはプライマーを含み、必要に応じて、DNA合成酵素、dNTP混合物および／またはRNase Hなどを加えることができる。 In a further aspect, the present invention may be a kit for a DNA amplification method comprising the reaction solution composition for a DNA amplification reaction described herein. The kit of the present invention preferably includes at least a reaction solution composition and / or a primer for the DNA amplification reaction described herein, and if necessary, a DNA synthase, a dNTP mixture and / or an RNase H Etc. can be added.
以下に具体的な例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例になんら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with specific examples, but the present invention is not limited to these examples.
比較例
塩化物イオン（Cl-）を含む従来の反応液組成物を用いたMDA反応
MDA法において従来一般に用いられている反応液組成物を用い、直鎖状DNAを鋳型としてDNA増幅を行った。
Comparative Example chloride ion (Cl -) MDA reaction using a conventional reaction solution composition comprising
DNA amplification was performed using linear DNA as a template, using a reaction solution composition generally used in the MDA method.
方法：
鋳型としたDNAは、濃度が既知のラムダファージDNA（和光純薬、Klenow treated lambda DNA）から段階希釈により107〜1コピーまでの濃度系列を作成したものを用い、プライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー（つくばオリゴサービス）を使用した。UltraPURE（登録商標）（Invitrogen製）蒸留水に、鋳型DNA（各希釈濃度）、ランダムRNAプライマー1 nmol、Tris-Cl（pH 7.5）30 mM、塩化カリウム50 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し室温（25℃）まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、Tris-Cl（pH 7.5）35 mM、塩化カリウム50 mM、塩化マグネシウム10 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ40 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット／反応、dNTP 1mMとし、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、制限酵素BamHI、EcoRIを用いた二重切断を行い、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図2に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、LCは制限酵素断片のコントロールとしてラムダDNAをBamHI/EcoRIで二重切断したものを、MはDNAサイズマーカーを示している。
Method:
The template DNA was a lambda phage DNA (Klenow treated lambda DNA) with a known concentration, and a series of concentrations from 10 7 to 1 copy was prepared by serial dilution. RNA primers (Tsukuba Oligo Service) were used. UltraPURE (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) was added to distilled water so that the template DNA (each dilution concentration), random RNA primer 1 nmol, Tris-Cl (pH 7.5) 30 mM, potassium chloride 50 mM, and a final volume of 10 The RNA primer was annealed to the template by heat denaturing the double-stranded DNA at 95 ° C. for 3 minutes and gradually lowering to room temperature (25 ° C.). To this, add an equal volume of DNA synthesis solution, and adjust the final concentration of each component to Tris-Cl (pH 7.5) 35 mM, potassium chloride 50 mM, magnesium chloride 10 mM, ammonium sulfate 16 mM, phi29 DNA polymerase 40 ng, pyrophosphatase The reaction was terminated at 0.002 units / reaction, dNTP 1 mM, reacted at 30 ° C. for 16 hours, and treated at 65 ° C. for 10 minutes. The reaction product was diluted 10-fold with sterilized distilled water, then double-cut with restriction enzymes BamHI and EcoRI, and the restriction enzyme fragment was confirmed by agarose electrophoresis. The result is shown in figure 2. The numbers at the top of each lane indicate the number of copies of lambda DNA used as a template, LC indicates double restriction of lambda DNA with BamHI / EcoRI as a control for restriction enzyme fragments, and M indicates a DNA size marker. ing.
結果：
MDA法による増幅産物は、鋳型に使用したDNAとほぼ同一の配列順序を示し、元の鋳型と同様にさらなる増幅において利用することが可能であるため、制限酵素断片長解析では元の鋳型と同一のバンドパターンを示すことを確認した（図2（1））。しかしながら、DNAプライマーを用いた場合、鋳型DNAのコピー数が103コピー未満となると、非特異的反応により増幅効率が低下し、また増幅の忠実度も低下することが明らかとなった（図2（2））。一方、RNAプライマーを用いる場合、鋳型DNAのコピー数が106コピー未満（図2（3））となると、増幅の忠実度が低下し、104コピー未満となると増幅が行われなくなることが明らかとなった。
result:
The amplified product by MDA method shows almost the same sequence order as the DNA used for the template, and can be used for further amplification in the same way as the original template. Therefore, the restriction enzyme fragment length analysis is the same as the original template. The band pattern was confirmed (Fig. 2 (1)). However, when DNA primers were used, it was found that amplification efficiency decreased due to non-specific reaction and amplification fidelity also decreased when the number of template DNA copies was less than 10 3 copies (Fig. 2). (2)). On the other hand, when RNA primers are used, it is clear that the amplification fidelity decreases when the number of copies of the template DNA is less than 10 6 copies (Fig. 2 (3)), and amplification is not performed when the number is less than 10 4 copies. It became.
実施例1
一価および二価の陽イオンの対イオンの効果の分析
（a）一価の陽イオンの対イオンの効果
MDA反応において、一価の陽イオンの対イオンの効果を試験した。ラムダファージDNAサンプル（和光純薬、Klenow treated lambda DNA、106コピー、10μl）、200pmolの6R5Sプライマー、30mMのHEPES-Na（pH 7.5）、8mMのMgCl2および50mMの塩化カリウム（KCl）、グルタミン酸カリウム（KGlu）または酢酸カリウム（KAc）を含む反応液を、95℃で3分間熱変性し、25℃まで30分間かけてゆっくり冷却した。2×のamplification premix（10μl）を添加し、最終濃度が、Tris-HCl（pH7.5） 35mM、MgCl2 14mM、(NH4)2SO4 26mM、dNTPs 1mM、DTT 5mM、phi29 DNAポリメラーゼ40ng、およびピロホスファターゼ0.002 U、ならびにKCl、KGluまたはKAcを、各々３ａに示す濃度（50〜300 mM）となるようにした。30℃で16時間反応を行い、その後、65℃で10分間酵素を不活化した。アガロース電気泳動による結果を、図3aに示す。
Example 1
Analysis of the effect of counter ions of monovalent and divalent cations (a) Effect of counter ions of monovalent cations
In the MDA reaction, the effect of counter ions of monovalent cations was tested. Lambda phage DNA sample (Klenow treated lambda DNA, 10 6 copies, 10 μl), 200 pmol 6R5S primer, 30 mM HEPES-Na (pH 7.5), 8 mM MgCl 2 and 50 mM potassium chloride (KCl), glutamic acid The reaction solution containing potassium (KGlu) or potassium acetate (KAc) was heat-denatured at 95 ° C. for 3 minutes and slowly cooled to 25 ° C. over 30 minutes. 2 × amplification premix (10 μl) was added and the final concentration was Tris-HCl (pH 7.5) 35 mM, MgCl 2 14 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 26 mM, dNTPs 1 mM, DTT 5 mM, phi29 DNA polymerase 40 ng, And pyrophosphatase 0.002 U, and KCl, KGlu, or KAc were adjusted to the concentrations shown in 3a (50 to 300 mM), respectively. The reaction was performed at 30 ° C. for 16 hours, and then the enzyme was inactivated at 65 ° C. for 10 minutes. The results from agarose electrophoresis are shown in FIG. 3a.
（b）RNAプライマーを用いたMDA反応において、二価の陽イオンの対イオンの効果を試験した。ラムダファージDNAサンプル（和光純薬、Klenow treated lambda DNA、106コピー、10μl）、200pmolの6R5Sプライマー、30mMのHEPES-Na（pH 7.5）、50mMのグルタミン酸カリウム（KGlu）または酢酸カリウム（KAc）および10mMの酢酸マグネシウム（MgAc）を含む反応液を、95℃で3分間熱変性し、25℃まで30分間かけてゆっくり冷却した。鋳型DNAを含まない反応においては、鋳型DNAの代わりに等量の滅菌蒸留水を用いた。2×のamplification premix（10μl）を添加し、最終濃度が、Tris-HCl（pH7.5） 35mM、KGluまたはKAc 100mM、(NH4)2SO4 16mM、dNTPs 1mM、DTT 4mM、phi29 DNAポリメラーゼ40ng、およびピロホスファターゼ0.002 U、ならびにMgCl2、MgGluまたはMgAcを各々10〜40 mMとなるようにした。30℃で16時間反応を行い、その後、65℃で10分間酵素を不活化した。アガロース電気泳動による結果を、図3bに示す。各レーンの上の数値は、それぞれの塩の最終濃度（mM）を示し、Mはサイズマーカーを示す。 (B) In the MDA reaction using an RNA primer, the effect of a counter ion of a divalent cation was tested. Lambda phage DNA sample (Wako Pure Chemical, Klenow treated lambda DNA, 10 6 copies, 10 μl), 200 pmol 6R5S primer, 30 mM HEPES-Na (pH 7.5), 50 mM potassium glutamate (KGlu) or potassium acetate (KAc) and The reaction solution containing 10 mM magnesium acetate (MgAc) was heat-denatured at 95 ° C. for 3 minutes and slowly cooled to 25 ° C. over 30 minutes. In the reaction not containing template DNA, an equal amount of sterile distilled water was used instead of template DNA. 2x amplification premix (10 μl) is added, final concentration is Tris-HCl (pH 7.5) 35 mM, KGlu or KAc 100 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 16 mM, dNTPs 1 mM, DTT 4 mM, phi29 DNA polymerase 40 ng , and pyrophosphatase 0.002 U, and was made to be each 10 to 40 mM of MgCl 2, MgGlu or MgAc. The reaction was performed at 30 ° C. for 16 hours, and then the enzyme was inactivated at 65 ° C. for 10 minutes. The result by agarose electrophoresis is shown in FIG. 3b. The numbers above each lane indicate the final concentration (mM) of each salt, where M indicates the size marker.
結果：
一価の陽イオンの対イオンとして塩化物イオンを用いた場合、最終濃度が50 mMを超えるとDNA増幅が行われなくなることが明らかとなった（図3a、KCl）。一方、一価の陽イオンを供給する塩としてグルタミン酸カリウム（KGlu）または酢酸カリウム（KAc）を用いた場合、各々200mM、250mMの高濃度において、DNA増幅が行われることが明らかとなった（図3a、KGluおよびKAc）。
また、二価の陽イオンの対イオンとして酢酸を用いた場合、例えば35mMの高濃度においてDNA増幅が行い得、二価の陽イオンの濃度が高くなるにつれて、鋳型に由来しない非特異的な増幅が抑制されることが明らかとなった（図3b）。
result:
When chloride ions were used as counter ions for monovalent cations, it was revealed that DNA amplification could not be performed when the final concentration exceeded 50 mM (FIG. 3a, KCl). On the other hand, when potassium glutamate (KGlu) or potassium acetate (KAc) was used as a salt supplying monovalent cations, it was revealed that DNA amplification was performed at high concentrations of 200 mM and 250 mM, respectively (Fig. 3a, KGlu and KAc).
In addition, when acetic acid is used as a counter ion for a divalent cation, DNA amplification can be performed at a high concentration of 35 mM, for example. As the divalent cation concentration increases, non-specific amplification that does not originate from the template Was found to be suppressed (Fig. 3b).
実施例2
RNAプライマーを用いたMDA反応に対するDNA合成反応液組成の効果
方法：
鋳型としたDNAは、濃度が既知のラムダファージDNA（和光純薬、Klenow treated lambda DNA）から段階希釈により107〜1コピーまでの濃度系列を作成したものを用いた。プライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー（つくばオリゴサービス）を使用した。UltraPURE（登録商標）（Invitrogen製）蒸留水に、鋳型DNA（上記各希釈濃度）、ランダムRNAプライマー1 nmol、HEPES-Na（pH 7.5）30 mM、グルタミン酸カリウム50mM、酢酸マグネシウム10 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し、室温（25℃）まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、HEPES-Na（pH 7.5）35 mM、グルタミン酸カリウム125 mM、酢酸マグネシウム27 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ90 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット／反応、dNTP 1mMとし、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、制限酵素BamHI、EcoRIを用いた二重切断を行い、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図4に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、Lは制限酵素断片のコントロールとしてラムダDNAをBamHI/EcoRIで二重切断したものを、MはDNAサイズマーカー、Ｎは鋳型非添加を示している。
Example 2
Effect of composition of DNA synthesis reaction solution on MDA reaction using RNA primer
The template DNA used was a lambda phage DNA (Klenow treated lambda DNA) with a known concentration, which was prepared as a concentration series from 10 7 to 1 copy by serial dilution. As a primer, a 6-base random RNA primer (Tsukuba Oligo Service) was used. UltraPURE (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) in distilled water so that the template DNA (each dilution concentration above), random RNA primer 1 nmol, HEPES-Na (pH 7.5) 30 mM, potassium glutamate 50 mM, magnesium acetate 10 mM In addition, the RNA primer was annealed to the template by heat denaturing the double-stranded DNA at 95 ° C. for 3 minutes and gradually decreasing to room temperature (25 ° C.) with a final volume of 10 ul. To this, add an equal volume of DNA synthesis solution, and adjust the final concentration of each component to HEPES-Na (pH 7.5) 35 mM, potassium glutamate 125 mM, magnesium acetate 27 mM, ammonium sulfate 16 mM, phi29 DNA polymerase 90 ng, pyrophosphatase The reaction was terminated at 0.002 units / reaction, dNTP 1 mM, reacted at 30 ° C. for 16 hours, and treated at 65 ° C. for 10 minutes. The reaction product was diluted 10-fold with sterilized distilled water, then double-cut with restriction enzymes BamHI and EcoRI, and the restriction enzyme fragment was confirmed by agarose electrophoresis. The results are shown in FIG. The numbers shown at the top of each lane indicate the number of copies of lambda DNA used as a template, L is a lambda DNA double-cut with BamHI / EcoRI as a restriction enzyme fragment control, M is a DNA size marker, N Indicates no addition of template.
結果：
僅か100コピーのラムダDNA（約5フェムトグラム、4.5Mbp）を鋳型とした反応液から、元のラムダDNAとほぼ同じ制限酵素断片を確認できた。このDNA量はほぼ一般的な微生物のゲノム1個の量に等しい。また、鋳型DNAを含まない反応液からは増幅産物が確認できなかった。以上の結果から、塩化物イオンを排除した反応液組成物を用いることにより、RNAプライマーを用いたMDA反応において、極めて少量の直鎖状の鋳型DNAから十分なDNA増幅効率を得、かつプライマーダイマーに起因する非特異的増幅を完全に抑えることができることが明らかとなった。また、制限酵素断片解析の結果から、元の鋳型DNAとほぼ同一の配列を示すことが明らかとなった。
result:
From the reaction solution using only 100 copies of lambda DNA (about 5 femtograms, 4.5 Mbp) as a template, almost the same restriction enzyme fragment as the original lambda DNA could be confirmed. This amount of DNA is almost equal to the amount of one genome of a general microorganism. In addition, amplification products could not be confirmed from the reaction solution containing no template DNA. From the above results, by using a reaction solution composition from which chloride ions have been eliminated, sufficient DNA amplification efficiency was obtained from a very small amount of linear template DNA in an MDA reaction using RNA primers, and primer dimer It was revealed that non-specific amplification caused by can be completely suppressed. Moreover, it became clear from the result of the restriction enzyme fragment analysis that it shows almost the same sequence as the original template DNA.
実施例3
MDA反応における、RNase Hの添加の効果
MDA反応において修飾RNAプライマーを使用した場合と、修飾プライマーを用いてさらにRNase Hを添加した場合とにおける増幅効率の違いを、1〜105コピーの間で変化させた鋳型λDNAを用いて確認した。
Example 3
Effect of RNase H addition in MDA reaction
The difference in amplification efficiency between using a modified RNA primer in the MDA reaction and adding RNase H using the modified primer was confirmed using a template λDNA changed between 1 and 10 5 copies. .
方法：
鋳型DNAは、ラムダファージDNA（和光純薬、商品名Lambda DNA (Klenow fragment treated)）から段階希釈により1〜105コピーまでの濃度系列を作成したものを用いた。修飾RNAプライマーは、6塩基のランダムRNAプライマー（つくばオリゴサービス、6R5S）を用いた。UltraPURE（登録商標）（Invitrogen製）蒸留水に、鋳型DNA（各希釈濃度）、ランダムRNAプライマー1 nmol、HEPES-Na（pH 7.5）30 mM、グルタミン酸カリウム50mM、酢酸マグネシウム10 mMになるように加え、最終容積10 ulとし、95℃で3分間、二本鎖DNAを熱変性し、室温（25℃）まで徐々に低下させることによりRNAプライマーを鋳型にアニールさせた。これに等量のDNA合成液を加え、各成分の最終濃度を、HEPES-Na（pH 7.5）35 mM、グルタミン酸カリウム125 mM、酢酸マグネシウム27 mM、硫酸アンモニウム16 mM、phi29 DNAポリメラーゼ90 ng、ピロフォスファターゼ0.002ユニット／反応、dNTP 1mMとし、さらにRNase H（和光純薬）を30 U加え、30℃で16時間反応させ、65℃で10分間処理することにより反応を停止した。反応産物は、10倍に滅菌蒸留水で希釈後、アガロース電気泳動で制限酵素断片を確認した。結果を図5に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型として使用したラムダDNAのコピー数を示し、MはDNAサイズマーカー、Ｎは鋳型非添加を示している。
Method:
The template DNA used was a series of lambda phage DNA (Wako Pure Chemicals, trade name Lambda DNA (Klenow fragment treated)) prepared from 1 to 10 5 copies by serial dilution. As the modified RNA primer, a 6-base random RNA primer (Tsukuba Oligo Service, 6R5S) was used. UltraPURE (registered trademark) (manufactured by Invitrogen) In distilled water, add template DNA (each diluted concentration), random RNA primer 1 nmol, HEPES-Na (pH 7.5) 30 mM, potassium glutamate 50 mM, magnesium acetate 10 mM The RNA primer was annealed to the template by heat denaturing the double-stranded DNA at 95 ° C. for 3 minutes and gradually lowering to room temperature (25 ° C.) with a final volume of 10 ul. To this, add an equal volume of DNA synthesis solution, and adjust the final concentration of each component to HEPES-Na (pH 7.5) 35 mM, potassium glutamate 125 mM, magnesium acetate 27 mM, ammonium sulfate 16 mM, phi29 DNA polymerase 90 ng, pyrophosphatase The reaction was stopped by adding 0.002 units / reaction, dNTP 1 mM, 30 U of RNase H (Wako Pure Chemical Industries), reacting at 30 ° C. for 16 hours, and treating at 65 ° C. for 10 minutes. The reaction product was diluted 10-fold with sterilized distilled water, and then the restriction enzyme fragment was confirmed by agarose electrophoresis. The results are shown in FIG. The numbers shown at the top of each lane indicate the copy number of lambda DNA used as a template, M indicates a DNA size marker, and N indicates no template addition.
結果
RNase H非添加では1000コピーのλDNA（約50フェムトグラム）から明らかな増幅産物が確認された。RNase Hの添加は増幅効率をさらに改善し、僅か10コピーのλDNA（約500アトグラム）を増幅することを可能にすることが明らかとなった。この量は、現時点で確認されている最小のゲノムを持つ微生物カルソネラ（約160kbp）のゲノム3分子とほぼ等量である。
result
When RNase H was not added, a clear amplification product was confirmed from 1000 copies of λDNA (about 50 femtograms). It was revealed that the addition of RNase H further improved the amplification efficiency and allowed amplification of only 10 copies of λDNA (about 500 attograms). This amount is almost equal to the 3 genomes of the microorganism Calsonella (about 160 kbp) having the smallest genome confirmed at present.
Claims (16)
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される１または２以上の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供され、
前記鎖置換型DNA合成反応に配列の全てまたは一部にRNAを含むプライマーを用い、
前記RNAプライマーと新規に合成されたDNAとの間にRNase Hによりニックを形成する反応を含む、前記DNA増幅方法。 A DNA amplification method by strand displacement type DNA synthesis reaction using phi29 DNA polymerase in a reaction solution composition in which an electrolyte providing monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved,
The anion is one or more anions selected from glutamate, aspartate and acetate ions , provided at a concentration that does not inhibit the strand displacement DNA synthesis reaction ;
Using a primer containing RNA in all or part of the sequence in the strand displacement type DNA synthesis reaction,
The DNA amplification method comprising a reaction of forming a nick by RNase H between the RNA primer and newly synthesized DNA .
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される１または２以上の陰イオンである、前記反応液組成物。 5. A reaction solution composition for use in the DNA amplification method according to any one of claims 1 to 4 , wherein an electrolyte providing monovalent and / or divalent cations and anions is dissolved. And
The reaction solution composition, wherein the anion is one or more anions selected from glutamate ion, aspartate ion and acetate ion .
請求項5〜10のいずれか一項に記載の組成物、および／または
請求項11〜15のいずれか一項に記載のプライマー
を含む、前記キット。 A kit for the DNA amplification method according to any one of claims 1 to 4 ,
A composition according to any one of claims 5-10, and / or a primer according to any one of claims 11-15, wherein the kit.
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