JP5648822B2

JP5648822B2 - Modification of rice anthranilate synthase using homologous recombination

Info

Publication number: JP5648822B2
Application number: JP2009177959A
Authority: JP
Inventors: 啓明雑賀; 精一土岐
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: JP2010051310A

Description

本発明は、高濃度のトリプトファンを含有する植物体の製造方法及び当該方法により製造される植物体、並びにその利用に関する。 The present invention relates to a method for producing a plant containing a high concentration of tryptophan, a plant produced by the method, and use thereof.

アントラニル酸合成酵素（AS）は、トリプトファン合成の鍵酵素として知られており、高濃度のトリプトファンによって負に制御されていることが知られている。ASはα及びβサブユニットからなる4量体であるが、そのうち、高濃度のトリプトファンによってフィードバック阻害を受けるのはαサブユニットである。イネにおいて、ASのαサブユニットをコードする遺伝子は2コピー存在し、それぞれOASA1、OASA2遺伝子と名付けられている(非特許文献１)。OASA2遺伝子は、OASA1遺伝子と比較してイネ組織で広く発現しているが、高濃度のトリプトファンに対する感受性はOASA2の方がOASA1より高い（非特許文献２）。また、OASA2合成タンパク質を利用した生化学的な研究から、2アミノ酸を置換した改変型OASA2（S126F/L530D）やOASA2（Y367A/L530D）は、高濃度のトリプトファンに対して感受性が低下するだけでなく、酵素活性自体も非常に高くなることが分かっている（非特許文献３）。例えば、変異型OASA2遺伝子（S126F/L530D）を大量に発現させた形質転換イネカルスでは、非形質転換体の300-400倍ものトリプトファンが蓄積することが示されている（非特許文献４）。 Anthranilate synthase (AS) is known as a key enzyme for tryptophan synthesis and is known to be negatively controlled by a high concentration of tryptophan. AS is a tetramer composed of α and β subunits, of which α subunit is subject to feedback inhibition by a high concentration of tryptophan. In rice, there are two copies of the gene encoding the α subunit of AS, which are named OASA1 and OASA2 genes, respectively (Non-patent Document 1). The OASA2 gene is more widely expressed in rice tissues than the OASA1 gene, but OASA2 is more sensitive to OASA1 than OASA1 (Non-patent Document 2). In addition, from biochemical studies using OASA2 synthetic protein, modified OASA2 (S126F / L530D) and OASA2 (Y367A / L530D) substituted with 2 amino acids are only less sensitive to high concentrations of tryptophan. It is known that the enzyme activity itself is very high (Non-patent Document 3). For example, it has been shown that in a transformed rice callus in which a large amount of mutant OASA2 gene (S126F / L530D) is expressed, tryptophan is accumulated 300 to 400 times that of non-transformants (Non-patent Document 4).

相同組換えを利用した遺伝子ターゲッティング（ジーンターゲッティング、GT）は、従来の遺伝子導入方法とは異なり、標的遺伝子だけを改変することができる非常に有用な技術である。従来の遺伝子導入方法は、ゲノム中のランダムな位置に外来DNAが挿入されるが、GTでは標的遺伝子だけを思い通りに改変することができるため、より「クリーン」な遺伝子改変技術であるといえる。酵母などの微生物やマウスなどの哺乳動物において、GTを利用した標的遺伝子の改変が広く行われている。それに対し、イネなどの高等植物においては、相同組換えの効率が非常に低い。植物細胞に導入したDNA配列が相同組換えを起こす確率は、その配列がランダムに植物ゲノム中に挿入される確率の10^-3-10^-5であるといわれている。そのため、GTによる標的遺伝子の改変は容易ではない。 Gene targeting (gene targeting, GT) using homologous recombination is a very useful technique capable of modifying only a target gene, unlike conventional gene introduction methods. The conventional gene transfer method inserts foreign DNA at random positions in the genome, but GT can modify only the target gene as desired, so it can be said to be a “cleaner” gene modification technique. Modification of target genes using GT is widely performed in microorganisms such as yeast and mammals such as mice. On the other hand, in higher plants such as rice, the efficiency of homologous recombination is very low. The probability that a DNA sequence introduced into a plant cell undergoes homologous recombination is said to be 10 ^-3 -10 ^-5, which is the probability that the sequence will be randomly inserted into the plant genome. Therefore, modification of target genes with GT is not easy.

最近になり、モデル高等植物であるイネやシロイヌナズナにおいて、GTによる内性遺伝子の改変に成功したという報告がなされている。イネにおけるGTの最初の成功例は、Waxy遺伝子をノックアウトしたものである（非特許文献５）。この方法は、GT個体を選抜するためのマーカーとしてハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を利用している。よって、その他の遺伝子にも適用することが可能であり、ADH2遺伝子も同様な方法でノックアウトすることに成功している（非特許文献６）。一方、内在性遺伝子自身が選抜マーカーとして利用できる場合は、抗生物質を利用することなくGT個体を選抜することが可能である。イネALS遺伝子は、点変異を導入することによって除草剤であるビスピリパック（BS）に対して耐性型となることが報告されている。これを利用して、GTに成功した細胞だけがBS耐性を示すような選抜を行い、ALS遺伝子に目的の点変異を導入することに成功している（非特許文献７）。また、従来の遺伝子組換え技術によってBS耐性型ALS遺伝子を大量に発現させた個体は、内在性のBS感受性ALS遺伝子が発現しているために、高濃度のBSを処理すると感受性を示す。それに対し、GTによって野生型のBS感受性ALS遺伝子を排除した個体（すなわち、GTによってホモでBS耐性型ALS遺伝子を持つ個体）は、BSに対する完全な耐性を獲得していることが明らかになった（非特許文献７）。これは、GTによって内在性のALS遺伝子を完全に排除することができたためであると考えられた。 Recently, it has been reported that endogenous genes have been successfully modified by GT in model higher plants such as rice and Arabidopsis thaliana. The first successful example of GT in rice is a knockout of the Waxy gene (Non-patent Document 5). This method uses a hygromycin phosphotransferase gene as a marker for selecting GT individuals. Therefore, it can be applied to other genes, and the ADH2 gene has been successfully knocked out by the same method (Non-patent Document 6). On the other hand, if the endogenous gene itself can be used as a selection marker, it is possible to select GT individuals without using antibiotics. It has been reported that the rice ALS gene becomes resistant to the herbicide Bispyripac (BS) by introducing a point mutation. Using this, only cells that have succeeded in GT have been selected to exhibit BS resistance, and the target point mutation has been successfully introduced into the ALS gene (Non-patent Document 7). In addition, individuals who have expressed a large amount of BS-resistant ALS gene by a conventional gene recombination technique are sensitive to the treatment of a high concentration of BS because the endogenous BS-sensitive ALS gene is expressed. On the other hand, it was revealed that individuals who eliminated the wild-type BS-sensitive ALS gene by GT (that is, individuals that were homozygous by GT and had a BS-resistant ALS gene) acquired complete resistance to BS. (Non-patent document 7). This was thought to be because the endogenous ALS gene could be completely eliminated by GT.

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Abstracts of the 50th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiology 雑賀啓明, 小野寺治子, 土岐精一、ジーンターゲッティングを利用したイネアントラニル酸合成酵素遺伝子の改変、農業生物資源研究所研究成果発表会（2008年10月21日）Hiroaki Saiga, Haruko Onodera, Seiichi Toki, Modification of Rice Anthranilate Synthase Gene Using Gene Targeting, Agricultural Bioresource Research Institute Research Results Presentation (October 21, 2008) Towards a highly efficient gene targeting system in higher plants H. Saika and S. Toki S, Japan Agricultural Research Quarterly. 43,81-85(2009)Towards a highly efficient gene targeting system in higher plants H. Saika and S. Toki S, Japan Agricultural Research Quarterly. 43, 81-85 (2009)

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、遺伝子ターゲッティング法による高濃度のトリプトファンを含有する植物体の製造方法及び当該方法により製造される植物体等を提供することにある。 This invention is made | formed in view of such a condition, The subject of this invention is providing the plant body etc. which are manufactured by the manufacturing method of the plant body containing the high concentration tryptophan by gene targeting method, the said method, etc. There is to do.

本発明者らはまず、遺伝子ターゲッティング法に用いるベクターを設計した。ベクターの設計にあたり本発明者らは、S126Fの点変異がライトボーダー側に位置するよう工夫した。S126Fの変異はベクターの末端から約0.2kbの距離に位置するが、通常、遺伝子ターゲティング法において相同配列領域を短く設定すると、相同組換え効率が低下する。しかし本発明者らは、S126Fの変異をT-DNAのライトボーダー（RB）側に配置することにより、相同配列領域が短くならざるを得ない場合でも、効率よく遺伝子ターゲッティング個体が得られることを見出した。
本発明者らは次に、作製したベクターをアグロバクテリウム法によってイネカルスに導入した。本発明者らは、OASA2遺伝子の遺伝子ターゲッティングに成功した個体を効率よく選抜するために、5MTの濃度検定を行った。その結果、これまでに報告されていた濃度より高い500μMの5MTを利用することが、OASA2遺伝子の遺伝子ターゲッティングに成功した個体の選抜に効果的であることを見出した。
本発明者らは、このようにして得られた遺伝子ターゲッティング個体では、イネ葉身において約8.62nmol/mgの遊離トリプトファンが蓄積していることを見出した。これは野生型の遊離トリプトファン含量の約130倍であった。
本発明は、本発明者らがこのような知見を見出したことに基づくものであり、以下〔１〕〜〔２４〕を提供するものである。
〔１〕下記（ａ）又は（ｂ）に記載のDNAで形質転換された植物体であって、高濃度のトリプトファンを含有する植物体；
（ａ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA、
〔２〕内在性のアントラニル酸合成酵素αサブユニットを含有しない、〔１〕に記載の植物体、
〔３〕植物が単子葉植物である、〔２〕に記載の植物体、
〔４〕単子葉植物がイネ科植物である、〔３〕に記載の植物体、
〔５〕イネ科植物がイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、えん麦、イネ科牧草からなる群より選択される、〔４〕に記載の植物体、
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の植物体から単離された細胞、
〔７〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の植物体の繁殖材料、
〔８〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の植物体から単離された器官、
〔９〕下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、トリプトファンを含有する植物体の製造方法；
（ａ）遺伝子ターゲティング法により下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA、
〔１０〕植物が内在性のアントラニル酸合成酵素αサブユニットを含有しない、〔９〕に記載の方法、
〔１１〕植物が単子葉植物である、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕単子葉植物がイネ科植物である、〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕イネ科植物がイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、えん麦、イネ科牧草からなる群より選択される、〔１２〕に記載の方法、
〔１４〕ベクターが配列番号：７から１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターから選択される、〔１３〕に記載の方法、
〔１５〕下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、植物にトリプトファンを含有させる方法；
（ａ）遺伝子ターゲティング法により下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA、
〔１６〕植物が内在性のアントラニル酸合成酵素αサブユニットを含有しない、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕植物が単子葉植物である、〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕単子葉植物がイネ科植物である、〔１７〕に記載の方法、
〔１９〕イネ科植物がイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、えん麦、イネ科牧草からなる群より選択される、〔１８〕に記載の方法、
〔２０〕ベクターが配列番号：７から１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターから選択される、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物に高濃度のトリプトファンを含有させるための薬剤；
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA、
〔２２〕配列番号：７から１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターのうち少なくとも1種類を有効成分として含有する、植物に高濃度のトリプトファンを含有させるための薬剤、
〔２３〕下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、トリプトファンの製造方法；
（ａ）〔９〕から〔２０〕のいずれかに記載の方法で、トリプトファンを含有する植物体を取得する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で取得された植物体からトリプトファンを回収する工程、
〔２４〕〔９〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法によって得られる形質転換植物体。 The inventors first designed a vector for use in gene targeting. In designing the vector, the present inventors devised the point mutation of S126F to be located on the right border side. The mutation of S126F is located at a distance of about 0.2 kb from the end of the vector. Usually, when the homologous sequence region is set short in the gene targeting method, the homologous recombination efficiency decreases. However, the present inventors have found that by placing the S126F mutation on the right border (RB) side of T-DNA, even when the homologous sequence region has to be shortened, gene targeting individuals can be obtained efficiently. I found it.
Next, the present inventors introduced the prepared vector into rice callus by the Agrobacterium method. The present inventors conducted a 5MT concentration test in order to efficiently select individuals who succeeded in gene targeting of the OASA2 gene. As a result, it was found that the use of 500 μM 5MT higher than the concentration reported so far was effective in selecting individuals who succeeded in gene targeting of the OASA2 gene.
The present inventors have found that about 8.62 nmol / mg free tryptophan is accumulated in rice leaf blades in the gene targeting individuals thus obtained. This was about 130 times the wild-type free tryptophan content.
The present invention is based on the discovery of such findings by the present inventors, and provides the following [1] to [24].
[1] A plant transformed with the DNA according to (a) or (b) below, which contains a high concentration of tryptophan;
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(B) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3,
[2] The plant according to [1], which does not contain an endogenous anthranilate synthase α subunit,
[3] The plant according to [2], wherein the plant is a monocotyledonous plant,
[4] The plant body according to [3], wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant,
[5] The plant body according to [4], wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oat, and grass.
[6] A cell isolated from the plant according to any one of [1] to [5],
[7] Plant propagation material according to any one of [1] to [5],
[8] An organ isolated from the plant according to any one of [1] to [5],
[9] A method for producing a plant body containing tryptophan, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of introducing the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant into which the DNA or vector has been introduced in step (a) A process of regenerating plant bodies from cells,
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3,
[10] The method according to [9], wherein the plant does not contain an endogenous anthranilate synthase α subunit,
[11] The method according to [10], wherein the plant is a monocotyledonous plant,
[12] The method according to [11], wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.
[13] The method according to [12], wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oat, and grass.
[14] The method according to [13], wherein the vector is selected from vectors comprising the nucleotide sequence according to any of SEQ ID NOs: 7 to 10,
[15] A method of adding tryptophan to a plant, comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of introducing the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant into which the DNA or vector has been introduced in step (a) A process of regenerating plant bodies from cells,
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3,
[16] The method according to [15], wherein the plant does not contain an endogenous anthranilate synthase α subunit,
[17] The method according to [16], wherein the plant is a monocotyledonous plant,
[18] The method according to [17], wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant,
[19] The method according to [18], wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oat, and grass.
[20] The method according to [19], wherein the vector is selected from vectors comprising the nucleotide sequence according to any of SEQ ID NOs: 7 to 10,
[21] An agent for containing a plant with a high concentration of tryptophan, comprising the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA as an active ingredient;
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3,
[22] An agent for containing a plant with a high concentration of tryptophan, comprising as an active ingredient at least one of vectors comprising the base sequence of SEQ ID NO: 7 to 10,
[23] A method for producing tryptophan, comprising the following steps (a) and (b):
(A) A step of obtaining a plant body containing tryptophan by the method according to any one of [9] to [20], and (b) a step of recovering tryptophan from the plant body obtained in step (a). ,
[24] A transformed plant obtained by the method according to any one of [9] to [14].

本発明により、高濃度のトリプトファンを含有する植物体の製造方法及び当該方法により製造される植物体が提供された。本発明の植物体は、従来の遺伝子導入法で得られ得る植物体よりも高濃度のトリプトファンを含有するため、飼料米や高栄養米用の品種として有用である。
また本発明の植物体は、標的遺伝子だけが改変されているため、その他の領域は野生型と同じ塩基配列であると考えられる。それに対し、従来の遺伝子組換え技術ではゲノムDNA中のランダムな領域にT-DNAが挿入するため、予想外の変異が生じる可能性が高い。また、本発明で用いたT-DNAは、イネゲノムの配列をそのまま利用したものである。以上のことから、遺伝子組換え技術を利用しているが、遺伝子ターゲッティングにより得られた個体は突然変異個体と同等であると考えられる。このことから、一般消費者に受容されやすいと考えられる。
従来の遺伝子組換え個体では選抜マーカーとしてイネ以外の遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなど）を利用することが多い。従来の組換え個体を栽培種の野生型イネと交配した場合、選抜マーカー遺伝子が種子に導入されてしまうため、抗生物質耐性イネが環境中に拡散していく可能性がある。それに対し、本発明においては標的遺伝子そのものを選抜マーカーとして利用した。このことから、野生型イネと交配しても抗生物質耐性イネが環境中に拡散することは無く、自然環境に対して負荷が少ないと考えられる。
なお本発明の植物体の製造方法は、主要穀物のイネ、トウモロコシ、ムギのアントラニル酸合成酵素遺伝子の遺伝子ターゲッティングによる改変に広く利用することが可能である。 According to the present invention, a method for producing a plant containing a high concentration of tryptophan and a plant produced by the method are provided. Since the plant body of the present invention contains tryptophan at a higher concentration than the plant body that can be obtained by a conventional gene transfer method, it is useful as a variety for feed rice or high-nutrition rice.
In the plant of the present invention, since only the target gene is modified, other regions are considered to have the same base sequence as the wild type. In contrast, conventional gene recombination techniques insert T-DNA into a random region in genomic DNA, which is likely to cause unexpected mutations. In addition, the T-DNA used in the present invention uses the rice genome sequence as it is. From the above, although genetic recombination technology is used, it is considered that individuals obtained by gene targeting are equivalent to mutant individuals. From this, it is thought that it is easy for general consumers to accept.
Conventional transgenic individuals often use genes other than rice (such as hygromycin phosphotransferase) as selection markers. When a conventional recombinant individual is crossed with a cultivated wild-type rice, a selective marker gene is introduced into the seed, so that antibiotic-resistant rice may diffuse into the environment. In contrast, in the present invention, the target gene itself was used as a selection marker. This suggests that antibiotic-resistant rice does not diffuse into the environment even when crossed with wild-type rice, and the burden on the natural environment is low.
In addition, the manufacturing method of the plant body of this invention can be widely utilized for the modification | change by gene targeting of the anthranilate synthase gene of the main grain rice, corn, and wheat.

GT用ベクターの構造を示す図である。黒いボックスはOASA2遺伝子のコーディング配列、白いボックスはUTRを示している。また、斜線で示したボックスはOASA2遺伝子の葉緑体移行シグナルを示している。GT用ベクターには葉緑体移行シグナルから下流約7.0kbの配列、ポジティブコントロールベクターには、翻訳開始点から上流1.3kbを含む約7.5kbの配列を利用した。黒丸は点変異を導入した部位を示している。It is a figure which shows the structure of the vector for GT. The black box indicates the coding sequence of the OASA2 gene, and the white box indicates UTR. In addition, the hatched box indicates the chloroplast transfer signal of the OASA2 gene. The GT vector used a sequence of about 7.0 kb downstream from the chloroplast transfer signal, and the positive control vector used a sequence of about 7.5 kb including 1.3 kb upstream from the translation start point. Black circles indicate the site where the point mutation was introduced. 実験に用いたベクターのコンストラクトを示す図である。GT用のベクターとしてOASA2SL-GT1（配列番号：７）、OASA2SL-GT2（配列番号：８）、OASA2YL-GT1（配列番号：９）、OASA2YL-GT2（配列番号：１０）を用いた。また、選抜時のポジティブコントロールとしてOASA2SL-PC, OASA2YL-PCを、ネガティブコントロールとしてpPZP2028を用いた。It is a figure which shows the construction of the vector used for experiment. As vectors for GT, OASA2SL-GT1 (SEQ ID NO: 7), OASA2SL-GT2 (SEQ ID NO: 8), OASA2YL-GT1 (SEQ ID NO: 9), and OASA2YL-GT2 (SEQ ID NO: 10) were used. Further, OASA2SL-PC and OASA2YL-PC were used as positive controls at the time of selection, and pPZP2028 was used as a negative control. 500μMの5MTを含むN6D培地上でポジティブコントロールベクターOASA2SL-PC（右）又は空ベクターpPZP2028（左）を導入したイネカルスの生育を示す写真である。It is a photograph which shows the growth of the rice callus which introduce | transduced positive control vector OASA2SL-PC (right) or empty vector pPZP2028 (left) on N6D culture medium containing 500 micromol 5MT. 得られた5MT耐性個体を用いたCAPSマーカーの解析結果を示す写真である。（上）GTに成功した個体やGTベクターがランダム挿入した個体ではS126Fの近傍ではHindIIIサイトが新しく追加されるために、S126Fを含む0.8kbのPCR産物がHindIIIによって0.2kbと0.6kbに切断される。（下）GTに成功した個体やGTベクターがランダム挿入した個体ではL530Dの近傍ではEcoRVサイトがなくなるために、L530Dを含む0.5kbのPCR産物がEcoRVで切断されなくなる。It is a photograph which shows the analysis result of the CAPS marker using the obtained 5MT resistant individual | organism | solid. (Upper) Since the HindIII site is newly added in the vicinity of S126F in individuals who have succeeded in GT and those in which the GT vector is randomly inserted, the 0.8 kb PCR product containing S126F is cut into 0.2 kb and 0.6 kb by HindIII. The (Bottom) In individuals who have succeeded in GT or individuals in which a GT vector has been randomly inserted, the EcoRV site disappears in the vicinity of L530D, so that the 0.5 kb PCR product containing L530D is not cleaved by EcoRV. 得られたGT個体の植物体の写真である。（左）植物体全体。（右）穂。It is the photograph of the plant body of the obtained GT individual. (Left) Whole plant body. (Right) Ho. 得られた植物体から抽出したDNAをHindIIIで切断し、プローブを用いてサザン解析を行った結果を示す図及び写真である。GT用ベクターOASA2SL-GT1にはCAPSマーカーとしてHindIIIサイトを追加しているため、野生型のOASA2遺伝子では6.0kb、GTによって改変されたOASA2遺伝子では1.5kbの大きさにバンドが確認される。WT:非形質転換個体、M:λHindIIIマーカー。It is the figure and photograph which show the result of having cut | disconnected DNA extracted from the obtained plant body with HindIII, and having performed the Southern analysis using the probe. Since the HindIII site is added as a CAPS marker to the GT vector OASA2SL-GT1, a band is confirmed to be 6.0 kb for the wild-type OASA2 gene and 1.5 kb for the OASA2 gene modified by GT. WT: non-transformed individual, M: λ HindIII marker.

本発明は、アントラニル酸合成酵素αサブユニット（本明細書において、「OASA2」と称することも出来る）の改変体をコードするDNAで形質転換された植物体であって、高濃度のトリプトファンを含有する植物体を提供する。より具体的には本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のDNAで形質転換された植物体であって、高濃度のトリプトファンを含有する植物体を提供する。
（ａ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA The present invention is a plant transformed with a DNA encoding a variant of anthranilate synthase α subunit (also referred to herein as “OASA2”), which contains a high concentration of tryptophan To provide a plant body. More specifically, the present invention provides a plant transformed with the DNA described in (a) or (b) below, which contains a high concentration of tryptophan.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4
(B) DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3

本発明のOASA2の改変体としては、野生型OASA2（配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質）において、126位のセリンがフェニルアラニンに、及び530位のロイシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）を含むタンパク質が挙げられるがこれに限定されない。また本発明のOASA2の改変体として、野生型OASA2（配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質）において、367位のチロシンがアラニンに、及び530位のロイシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号：４に記載のアミノ酸配列）を含むタンパク質が挙げられるがこれに限定されない。
また本発明のOASA2の改変体をコードするDNAとして、野生型OASA2をコードするDNA（配列番号：５に記載の塩基配列を含むDNA）において、377位のシトシンがチミンに、1588位のシトシンがグアニンに、1589位のチミンがアデニンに、及び1590位のチミンがシトシンに置換された塩基配列（配列番号：１に記載の塩基配列）を含むDNAが挙げられるがこれに限定されない。またOASA2の改変体をコードするDNAとして、野生型OASA2をコードするDNA（配列番号：５に記載の塩基配列を含むDNA）において、1099位のチミンがグアニンに、1100位のアデニンがシトシンに、1588位のシトシンがグアニンに、1589位のチミンがアデニンに、及び1590位のチミンがシトシンに置換された塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を含むDNAが挙げられるがこれに限定されない。 As a modified form of OASA2 of the present invention, in wild type OASA2 (protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6), an amino acid in which serine at position 126 is substituted with phenylalanine and leucine at position 530 is replaced with aspartic acid A protein containing the sequence (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2) is exemplified, but not limited thereto. In addition, as a modified form of OASA2 of the present invention, in wild-type OASA2 (protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6), an amino acid in which tyrosine at position 367 is replaced with alanine and leucine at position 530 is replaced with aspartic acid A protein containing the sequence (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4) is exemplified, but not limited thereto.
Further, in the DNA encoding wild-type OASA2 (DNA containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 5) as the DNA encoding the modified OASA2 of the present invention, cytosine at position 377 is thymine, and cytosine at position 1588 is The guanine includes, but is not limited to, a DNA containing a base sequence (base sequence described in SEQ ID NO: 1) in which thymine at position 1589 is replaced with adenine and thymine at position 1590 is replaced with cytosine. In addition, as a DNA encoding a modified form of OASA2, in the DNA encoding wild-type OASA2 (DNA containing the base sequence described in SEQ ID NO: 5), thymine at position 1099 is guanine, adenine at position 1100 is cytosine, Examples include DNA containing a base sequence (base sequence described in SEQ ID NO: 3) in which cytosine at position 1588 is replaced by guanine, thymine at position 1589 is replaced by adenine, and thymine at position 1590 is replaced by cytosine. Not.

本発明の「OASA2の改変体をコードするDNA」は、イネ又はイネ以外の植物においてOASA2の改変体をコードしうるものであれば特に制限はない。また、OASA2の改変体をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。 The “DNA encoding a modified OASA2” of the present invention is not particularly limited as long as it can encode a modified OASA2 in rice or other plants. In addition, DNA encoding an OASA2 variant includes DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code.

トリプトファン含有量は、例えば、高速アミノ酸分析計（Wakasa, K. et al. (2006) High-level tryptophan accumulation in seeds of transgenic rice and its limited effects on agronomic traits and seed metabolite profile. J. Exp. Bot, 57. 3069-3078）を使用して測定することが可能であるが、この方法に限定されない。 Tryptophan content can be measured, for example, by a high-speed amino acid analyzer (Wakasa, K. et al. (2006) High-level tryptophan accumulation in seeds of transgenic rice and its limited effects on agronomic traits and seed metabolite profile. J. Exp. Bot, 57. 3069-3078), but is not limited to this method.

また本発明の形質転換植物体は、野生型と比較して高濃度の遊離トリプトファンを含量する。本発明の形質転換植物体は、野生型と比較して遊離トリプトファン含量が増加している限り特に限定されるものではないが、例えば野生型と比較して少なくとも100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、410倍、420倍、430倍、440倍、450倍、460倍又はそれ以上の遊離トリプトファン含量を有する形質転換植物体が挙げられる。
本発明においてトリプトファンの含有が増加する部位としては、葉、種子などが挙げられるが特に限定されない。なお植物中のトリプトファンは新しい組織に転流することが知られており、古い葉よりも新しい葉において、トリプトファン含量が多いと考えられる。またトリプトファンは最終的には種子に高濃度で蓄積すると考えられる。 The transformed plant of the present invention contains a high concentration of free tryptophan compared to the wild type. The transformed plant of the present invention is not particularly limited as long as the free tryptophan content is increased compared to the wild type, but for example, at least 100 times, 110 times, 120 times, 130x, 140x, 150x, 160x, 170x, 180x, 190x, 200x, 210x, 220x, 230x, 240x, 250x, 260x, 270x, 280x, 290x 300 times, 310 times, 320 times, 330 times, 340 times, 350 times, 360 times, 370 times, 380 times, 390 times, 400 times, 410 times, 420 times, 430 times, 440 times, 450 times, 460 times Examples include transformed plants having double or more free tryptophan content.
In the present invention, the site where tryptophan content increases includes, but is not particularly limited to, leaves and seeds. It is known that tryptophan in plants is translocated to a new tissue, and it is considered that tryptophan content is higher in new leaves than in old leaves. Tryptophan will eventually accumulate in seeds at high concentrations.

また本発明の形質転換植物体は、内在性のアントラニル酸合成酵素を有さない。本発明において内在性のアントラニル酸合成酵素とは、野生型の植物体が本来有している野生型のアントラニル酸合成酵素（例えば配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質）を意味する。形質転換植物体が内在性のアントラニル酸合成酵素を有するか否かは、例えば、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができるが、これらの方法に限定されない。 The transformed plant of the present invention does not have an endogenous anthranilate synthase. In the present invention, the endogenous anthranilate synthase means a wild-type anthranilate synthase (for example, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6) inherent in a wild-type plant. Whether or not the transformed plant body has endogenous anthranilate synthase can be confirmed, for example, by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of DNA in the plant body. Yes, but not limited to these methods.

また本発明の形質転換体は、相同組換えを利用したジーンターゲティング（GT）法により作成されることを特徴とする。ジーンターゲティング（GT）法を利用することにより、目的遺伝子のみを改変することが可能である。またジーンターゲティング（GT）法により作出された形質転換植物体では、組換え遺伝子の発現量は内在性プロモーターの影響を受けるため安定である。さらに、ジーンターゲティング（GT）法を利用することにより作成される形質転換体は内在性遺伝子を有さない。そのため従来の遺伝子導入法により作出される形質転換植物体と比較し、さらに高濃度のトリプトファンを含有する。 The transformant of the present invention is characterized by being produced by a gene targeting (GT) method using homologous recombination. By using the gene targeting (GT) method, it is possible to modify only the target gene. Moreover, in the transformed plant produced by the gene targeting (GT) method, the expression level of the recombinant gene is stable because it is affected by the endogenous promoter. Furthermore, transformants generated by using the gene targeting (GT) method do not have an endogenous gene. Therefore, it contains a higher concentration of tryptophan compared to a transformed plant produced by the conventional gene transfer method.

なお本発明の形質転換植物体は、高濃度のトリプトファンを含有する限り、植物の他の形質が改変されていてもよい。他の形質の改変としては、例えば、オーキシン含量の増加、アルカロイド化合物の含量及び組成の変化、トリプトファン以外のアミノ酸の含量及び組成の変化などが挙げられるが、これらに限定されない。 As long as the transformed plant of the present invention contains a high concentration of tryptophan, other plant traits may be modified. Examples of other trait modifications include, but are not limited to, an increase in auxin content, a change in the content and composition of alkaloid compounds, a change in the content and composition of amino acids other than tryptophan, and the like.

OASA2をコードするDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できるがこれらに限定されない）を作成し、これを展開して、OASA2をコードするDNA（例えば、配列番号：５に記載の塩基配列を含むDNA）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、OASA2をコードするDNAを取得することが出来る。また、OASA2をコードするDNAに特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって、OASA2をコードするDNAを取得することが可能である。
また、OASA2をコードするcDNAを調製する場合、例えば、イネ又はイネ以外の植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 Preparation of DNA encoding OASA2 can be performed by those skilled in the art using conventional means. For example, genomic DNA is extracted from a plant, a genomic library (including but not limited to plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc.) is created and expanded to encode OASA2. DNA encoding OASA2 can be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the DNA to be prepared (for example, the DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 5) . Moreover, it is possible to obtain DNA encoding OASA2 by preparing a primer specific to DNA encoding OASA2 and performing PCR using this primer.
In addition, when preparing cDNA encoding OASA2, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from rice or plants other than rice and inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library. Can be prepared and colony hybridization or plaque hybridization can be performed in the same manner as described above, or by performing PCR.

本発明のOASA2の改変体をコードするDNAは、上述の方法によって取得したOASA2をコードするDNAに変異を導入することにより取得することが可能である。OASA2をコードするDNAに対する変異の導入は、kunkel法やPCRを利用した方法等公知の方法によって行うことが出来る。また市販のキット（例えばMutan-K、Mutan-Super Express Km、LA-PCR in vitro mutanegenesis Kit等が挙げられるがこれらに限定されない）を用いてOASA2をコードするDNAに対する変異を導入することも可能である。 The DNA encoding the modified OASA2 of the present invention can be obtained by introducing a mutation into the DNA encoding OASA2 obtained by the method described above. Mutation can be introduced into DNA encoding OASA2 by a known method such as kunkel method or PCR-based method. It is also possible to introduce mutations to DNA encoding OASA2 using commercially available kits (including but not limited to Mutan-K, Mutan-Super Express Km, LA-PCR in vitro mutanegenesis Kit, etc.). is there.

OASA2の改変体をコードするDNAを利用して形質転換植物体を作製するには、該DNAが挿入されたベクターを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞から植物体を再生させればよい。
本発明におけるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものが好ましく、例えばpMH1、pMH2などのベクターが挙げられるが、特に制限はない。本発明のベクターは、例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、ジャガイモ・キチナーゼ遺伝子SK2のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等）を有していてもよい。このようなプロモーターを使用する場合、プロモーターの下流に、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAが機能的に結合したDNAを設計する。そして設計されたDNAを含むベクターを植物細胞に導入する。これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、本発明のOASA2の改変体が発現された形質転換植物体を得ることが出来る。本発明はこのように、プロモーターの下流に、OASA2の改変体をコードするDNAが機能的に結合したDNAも提供する。ここで「機能的に結合」とは、プロモーター配列に転写因子が結合することにより、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAの発現が誘導されるように、プロモーター配列と該DNAとが結合していることを言う。
なおこれら以外にも、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。 To create a transformed plant using DNA encoding a modified OASA2, introduce the vector into which the DNA has been inserted, and regenerate the plant from the resulting transformed plant cell. You can do it.
The vector in the present invention is preferably a vector capable of expressing an inserted gene in plant cells, and examples thereof include vectors such as pMH1 and pMH2, but are not particularly limited. The vector of the present invention may have, for example, a promoter for constitutive gene expression in plant cells (for example, potato chitinase gene SK2 promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter, etc.). When such a promoter is used, a DNA is designed in which a DNA encoding a modified OASA2 of the present invention is functionally linked downstream of the promoter. Then, a vector containing the designed DNA is introduced into plant cells. By regenerating the transformed plant cell thus obtained, a transformed plant in which the modified OASA2 of the present invention is expressed can be obtained. Thus, the present invention also provides a DNA in which a DNA encoding a modified OASA2 is functionally linked downstream of a promoter. Here, “functionally bound” means that the promoter sequence and the DNA are bound so that expression of DNA encoding the OASA2 variant of the present invention is induced by binding of a transcription factor to the promoter sequence. Say that you are.
In addition to these, it is also possible to use a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus.

本発明のDNAの細胞への導入は、当業者においては、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等の公知の方法によって実施することができる。 For those skilled in the art, the DNA of the present invention is introduced into cells by a known method such as polyethylene glycol method, electroporation (electroporation), Agrobacterium-mediated method, particle gun method and the like. Can do.

また植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992）。例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta et. al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et. al., Bio/technology, 9: 957-962, 1991）及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et. al., Plant J. 6: 271-282, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。 Furthermore, regeneration of plant bodies can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells (Toki et. Al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992). For example, as a method for producing a transformed plant, a method of introducing a gene into a protoplast with polyethylene glycol and regenerating the plant (Datta et. Al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66- 74, 1995), a method of introducing a gene into a protoplast by an electric pulse to regenerate the plant body (Toki et. Al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992), a gene directly introduced into a cell by the particle gun method. A method of regenerating a plant (Christou et. Al., Bio / technology, 9: 957-962, 1991) and a method of regenerating a plant by introducing a gene through Agrobacterium (Hiei et. Al. , Plant J. 6: 271-282, 1994) have already been established and widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.

上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばNagelらの方法（Microbiol. Lett. 67: 325, 1990）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のOASA2の改変体をコードするDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、又は植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公報）等を挙げることができる。 When the Agrobacterium method is used, for example, the method of Nagel et al. (Microbiol. Lett. 67: 325, 1990) is used. According to this method, the recombinant vector is transformed into Agrobacterium, and then the transformed Agrobacterium is introduced into the cell by a known method such as a leaf disk method. The vector contains an expression promoter so that, for example, after introduction into a plant body, the DNA encoding the modified OASA2 of the present invention is expressed in the plant body. In general, a DNA encoding a modified OASA2 of the present invention is located downstream of the promoter, and a terminator is located downstream of the DNA. The recombinant vector used for this purpose is appropriately selected by those skilled in the art depending on the method of introduction into the plant or the type of plant. Examples of the promoter include CaMV35S derived from cauliflower mosaic virus, corn ubiquitin promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 2-79983), and the like.

また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。 Examples of the terminator include a terminator derived from cauliflower mosaic virus or a terminator derived from a nopaline synthase gene. However, the terminator is not limited to these as long as it is a promoter or terminator that functions in a plant body.

また、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の植物には、植物個体に加え例えば葉、根、茎、花及び種子中の胚盤等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が含まれる。 Further, the plant into which the DNA encoding the modified OASA2 of the present invention is introduced may be an explant, and cultured cells may be prepared from these plants and introduced into the obtained cultured cells. The plant of the present invention includes plant cells such as scutellum in leaves, roots, stems, flowers and seeds, callus, suspension culture cells and the like in addition to individual plants.

また、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入してもよい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及び除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。 In addition, in order to efficiently select cells transformed by introduction of DNA encoding the modified OASA2 of the present invention, the recombinant vector is a plant cell together with an appropriate selection marker gene or a plasmid vector containing the selection marker gene. May be introduced. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, hygromycin phosphotransferase gene resistant to the antibiotic hygromycin, neomycin phosphotransferase gene resistant to kanamycin or gentamicin, and acetyl resistant to the herbicide phosphinothricin. Examples include transferase genes.

組み換えベクターを導入した細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。 Cells into which the recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing an appropriate selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.

なお本発明のOASA2の改変体をコードするT-DNAは、GTのマーカー遺伝子として使用することが可能である。本発明のOASA2の改変体をコードするT-DNAが内在性のOASA2遺伝子に導入された細胞はトリプトファン耐性であるため、トリプトファンの類縁化合物を培地に添加することにより、本発明のOASA2の改変体をコードするDNAが導入されて、GTが生じた細胞のみを選抜することが可能である。
また本発明のT-DNAは葉緑体移行シグナルを含まないため、T-DNAがゲノムにランダムに挿入された場合、OASA2の改変体は機能しない。即ち本発明のT-DNAは5MT選抜を利用したGT実験におけるネガティブマーカーとして作用し、T-DNAがゲノム上にランダムに挿入した形質転換細胞は死滅する。これにより、GTに成功した細胞だけを得ることが可能である。 The T-DNA encoding the modified OASA2 of the present invention can be used as a marker gene for GT. Since the cells into which the T-DNA encoding the OASA2 variant of the present invention has been introduced into the endogenous OASA2 gene are resistant to tryptophan, the OASA2 variant of the present invention can be obtained by adding a tryptophan analog to the medium. It is possible to select only cells in which a DNA encoding is introduced and GT is produced.
Moreover, since the T-DNA of the present invention does not contain a chloroplast translocation signal, the modified OASA2 does not function when the T-DNA is randomly inserted into the genome. That is, the T-DNA of the present invention acts as a negative marker in GT experiments using 5MT selection, and transformed cells into which T-DNA is randomly inserted on the genome are killed. As a result, it is possible to obtain only cells that have succeeded in GT.

形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、高濃度のトリプトファンを含有する形質転換植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。即ち本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、トリプトファンを含有する形質転換植物体の製造方法、及び当該方法によって得られる形質転換植物体を提供する。
（ａ）遺伝子ターゲティング法により下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA。
また本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、トリプトファンを含有する形質転換植物体の製造方法、及び当該方法によって得られる形質転換植物体を提供する。
（ａ）遺伝子ターゲティング法により配列番号：７から１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程
これらの方法により、高濃度のトリプトファンを含有する形質転換植物体を取得することが可能である。 The plant body regenerated from the transformed cells is then cultured in an acclimation medium. Thereafter, when the acclimatized regenerated plant body is cultivated under normal cultivation conditions, a transformed plant body containing a high concentration of tryptophan is obtained, and seeds can be obtained by maturing and fruiting. That is, this invention provides the manufacturing method of the transformed plant body containing a tryptophan including the process of following (a) and (b), and the transformed plant body obtained by the said method.
(A) a step of introducing the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant into which the DNA or vector has been introduced in step (a) A step of regenerating a plant from cells (i) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3.
Moreover, this invention provides the manufacturing method of the transformed plant body containing a tryptophan including the process of following (a) and (b), and the transformed plant body obtained by the said method.
(A) a step of introducing a vector comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 7 to 10 into a plant cell by gene targeting method; and (b) a plant from the plant cell into which the vector was introduced in step (a). Step of Regenerating Body A transformed plant containing a high concentration of tryptophan can be obtained by these methods.

なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。再生させた植物体中に存在するOASA2の改変体をコードするDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、OASA2の改変体をコードするDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、OASA2の改変体をコードするDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。 In addition, the presence of introduced foreign DNA in a transformed plant that has been regenerated and cultivated in this way can be analyzed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of the DNA in the plant body. Can be confirmed. In this case, extraction of DNA from the transformed plant body can be performed according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). When a foreign gene comprising DNA encoding a modified OASA2 present in a regenerated plant body is analyzed using the PCR method, an amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant body as a template. Alternatively, a synthetic oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of DNA encoding a modified OASA2 can be used as a primer, and an amplification reaction can be carried out in a reaction mixture in which these are mixed. In the amplification reaction, when DNA denaturation, annealing, and extension reaction are repeated several tens of times, an amplification product of a DNA fragment containing a DNA sequence encoding a modified OASA2 can be obtained. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.

一旦、染色体内に本発明のOASA2の改変体をコードするDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから細胞や器官、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を単離し、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、OASA2の改変体をコードするDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官（例えば花、葉、根、茎等）、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官（例えば花、葉、根、茎等）、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料は、高濃度のトリプトファンを含有する形質転換植物体の作出に使用することが可能である。 Once a transformed plant is obtained in which a DNA encoding the OASA2 variant of the present invention is introduced into the chromosome, progeny can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. In addition, cells, organs, and propagation materials (eg, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) are isolated from the plant body, its progeny or clones, and the plant body is based on them. Mass production is also possible. The present invention includes a plant cell into which a DNA encoding a modified OASA2 is introduced, a plant body containing the cell, an organ of the plant body (for example, a flower, a leaf, a root, a stem, etc.), a progeny of the plant body, and The clone and the propagation material of the plant, its progeny and clones are included. These plant cells, plants containing the cells, organs of the plant (eg, flowers, leaves, roots, stems, etc.), progeny and clones of the plant, and propagation materials of the plants, progeny and clones thereof It can be used to produce transformed plants containing high concentrations of tryptophan.

なお本発明の植物としては、単子葉植物が挙げられる。このような植物には、イネ科植物が含まれる。イネ科植物としてはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、えん麦、イネ科牧草などが挙げられるがこれらに限定されない。 The plant of the present invention includes monocotyledonous plants. Such plants include gramineous plants. Examples of grasses include, but are not limited to, rice, corn, wheat, barley, sorghum, oats, and grass.

本発明はさらに、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、植物にトリプトファンを含有させる方法を提供する。
（ａ）遺伝子ターゲティング法により下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA。
この方法により、高濃度のトリプトファンを含有する形質転換植物体を取得することが可能である。 The present invention further provides a method for causing a plant to contain tryptophan, which comprises the following steps (a) and (b).
(A) a step of introducing the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant into which the DNA or vector has been introduced in step (a) A process of regenerating plant bodies from cells,
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3.
By this method, a transformed plant containing a high concentration of tryptophan can be obtained.

本発明の植物にトリプトファンを含有させる方法には、野生型の植物にトリプトファンを含有させる方法のみならず、すでに何らかの変異が導入されている植物にトリプトファンを含有させる方法も含まれる。ここで、すでに何らかの変異が導入されている植物に関して、変異の種類や程度は限定されない。
本発明において、トリプトファンを含有させる対象となる植物は特に制限されないが、例えば上述の植物を挙げることが出来る。 The method of adding tryptophan to the plant of the present invention includes not only a method of adding tryptophan to a wild type plant but also a method of adding tryptophan to a plant in which some mutation has already been introduced. Here, the kind and degree of the mutation are not limited with respect to the plant in which some mutation has already been introduced.
In the present invention, the plant to be tryptophan-containing is not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned plants.

上記方法において、OASA2の改変体をコードするDNAを含むベクターとしては、配列番号：７〜１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。またOASA2の改変体をコードするDNAを含むベクターの植物細胞への導入、及び、該植物細胞から植物体への再生は、上述の方法によって行うことが出来る。 In the above method, examples of the vector containing a DNA encoding a modified OASA2 include, but are not limited to, a vector containing the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 7 to 10. In addition, introduction of a vector containing DNA encoding a modified OASA2 into a plant cell and regeneration from the plant cell into the plant can be performed by the above-described methods.

また本発明は、OASA2の改変体をコードするDNA、又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物に高濃度のトリプトファンを含有させるための薬剤を提供する。OASA2の改変体をコードするDNAとしては、
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA、
が挙げられるがこれらに限定されない。またOASA2の改変体をコードするDNAを含むベクターとしては配列番号：７〜１０のいずれかに記載の塩基配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の薬剤は例えば、高濃度のトリプトファンを含有する植物を製造する際、又は植物に高濃度のトリプトファンを含有させる際に使用することが出来る。植物としては上述のものが挙げられるがこれらに限定されない。 The present invention also provides an agent for containing a high concentration of tryptophan in a plant, containing DNA encoding a modified OASA2 or a vector containing the DNA as an active ingredient. As DNA encoding the modified OASA2,
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3,
However, it is not limited to these. Examples of the vector containing DNA encoding a modified OASA2 include, but are not limited to, a vector containing the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 7 to 10.
The agent of the present invention can be used, for example, when a plant containing a high concentration of tryptophan is produced or when a plant contains a high concentration of tryptophan. Plants include, but are not limited to, those mentioned above.

また本発明は、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含むトリプトファンの製造方法を提供する。
（ａ）遺伝子ターゲティング法により下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で製造された植物体からトリプトファンを回収する工程。
（ｉ）配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｉｉ）配列番号：１又は３に記載の塩基配列を含むDNA。
本発明のトリプトファンの製造方法においてはまず、遺伝子ターゲティング法により、トリプトファンを含有する形質転換植物体を取得する。トリプトファンを含有する形質転換植物体の取得は、本明細書に記載の方法（例えば実施例に記載の方法）によって行うことが出来る。
本発明のトリプトファンの製造方法においては次に、トリプトファンを含有する形質転換植物体からトリプトファンを回収する。トリプトファンの回収は、例えばWakasa K and Widholm J.（A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, MTR1, selected in tissue culture. Theor. Appl. Genet. 74:49-54. (1987)）に記載されているように、組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収することにより行うことが可能であるが、これに限定されない。
なお本発明の植物体は、「トリプトファンに対する感受性が低下したアントラニル酸合成酵素αサブユニットを有する植物体であって、トリプトファンに感受性を示す内在性のアントラニル酸合成酵素αサブユニットを有さない植物体」と表現することが出来る。また「トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有する植物体であって、トリプトファンによってフィードバック阻害を受ける（トリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有さない）内在性のアントラニル酸合成酵素αサブユニットを有さない植物体」と表現することが出来る。 The present invention also provides a method for producing tryptophan comprising the following steps (a) to (c).
(A) a step of introducing the DNA according to (i) or (ii) below or a vector containing the DNA into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant into which the DNA or vector has been introduced in step (a) A step of regenerating the plant from the cells, and (c) a step of recovering tryptophan from the plant produced in step (b).
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4,
(Ii) DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3.
In the method for producing tryptophan of the present invention, first, a transformed plant containing tryptophan is obtained by a gene targeting method. A transformed plant containing tryptophan can be obtained by the method described in this specification (for example, the method described in Examples).
Next, in the method for producing tryptophan of the present invention, tryptophan is recovered from a transformed plant containing tryptophan. The recovery of tryptophan is described, for example, in Wakasa K and Widholm J. (A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, MTR1, selected in tissue culture. Theor. Appl. Genet. 74: 49-54. (1987)). Furthermore, it is possible to carry out by centrifuging and then recovering the soluble fraction after disrupting the tissue, but it is not limited thereto.
The plant of the present invention is a plant having an anthranilate synthase α subunit having reduced sensitivity to tryptophan and not having an endogenous anthranilate synthase α subunit exhibiting sensitivity to tryptophan. It can be expressed as “body”. In addition, “an endogenous anthranilate synthase α-substance that is resistant to tryptophan feedback inhibition in the tryptophan biosynthetic pathway and that is subject to feedback inhibition by tryptophan (not resistant to tryptophan feedback inhibition). It can be expressed as “a plant without a unit”.

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．材料と方法
１．１ GT用ベクターの作製
GT用ベクターとして図1に示したOASA2SL(ΔCP)またはOASA2YL(ΔCP)の領域、ポジティブコントロールとして図1に示したPro::OASA2SLまたはPro::OASA2YLの領域を用いた。
イネ品種日本晴（Oryza sativa L. cv Nipponbare）のゲノムDNAをテンプレートにし、OASA2遺伝子の約4.4kbの断片をPCR法によって増幅した。PCRは、プライマー
5’-CCCATCGAGGAAGAGTAAACCCAAAAA-3’（配列番号：１１）
5’-TAAACATGCAGCGAGAAGAACCATGAA-3’（配列番号：１２）
と酵素KOD-plus-（Toyobo）を用いて、キットの説明に従い行った。得られたPCR断片はEcoRI及びXhoIで切断した後、pBSベクターにクローニングした。得られたクローンに対し、PCR法を利用してS126F/L530D及びY367A/L530Dとなるような変異を導入した。PCRには、プライマー
S126F;
5’-GGAGACGCC［aAGCTT］CTCTTCGAGTtCGTCGAGC-3’（配列番号：１３）
5’-GCTCGACGaACTCGAAGAGG［AAGCTt］GGCGTCTCC-3’（配列番号：１４）
Y367A;
5’-TTGTGAACCCAAGTCCAg［cCATGG］CATATGTACAGGTAT-3’（配列番号：１５）
5’-ATACCTGTACATATG［CCATGg］cTGGACTTGGGTTCACAA-3’（配列番号：１６）
L530D;
5’-GCCTTGGAGG［GATtTC］ATTTGACGGAGACATGgacATCGC-3’（配列番号：１７）
5’-GCGATgtcCATGTCTCCGTCAAAT［GAaATC］CCTCCAAGGC-3’（配列番号：１８）
（小文字は変異を導入した塩基を示す。また、下線部分はアミノ酸置換、［］で挟まれた部分は非同義置換でGT個体を効率よく検出するためにCAPSマーカー化した配列である。）とQuickChange II XL Site-directed Mutagenesis kit（STRATAGENE）を利用した。得られたクローンをそれぞれSL-1またはYL-1とした。また、イネ品種日本晴のゲノムDNAをテンプレートにし、OASA2遺伝子を含む約9.7kbの断片をPCR法によって増幅した。PCRは、プライマー
5’-ATGGACTTGTTTACTCGGGAGTGGTTG-3’（配列番号：１９）
5’-TCCCAACCTCTCATCTCTCATTTTTCG-3’（配列番号：２０）
と酵素KOD-plus-を用いて、キットの説明に従い行った。得られたPCR断片はKpnI及びPacIで切断した後、pPZP2028ベクター（pPZP202のMCSにAscI/PacIサイトを加えた改変ベクター）にクローニングした。これをSacII/XhoIによって切断し、SacII/XhoIによってSL-1またはYL-1から切り出した約3.8kbの断片を導入した。これによって得られたベクターをSL-2またはYL-2と名付けた。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
1. Materials and methods
1.1 Production of GT vector
The OASA2SL (ΔCP) or OASA2YL (ΔCP) region shown in FIG. 1 was used as the GT vector, and the Pro :: OASA2SL or Pro :: OASA2YL region shown in FIG. 1 was used as the positive control.
Using the genomic DNA of rice cultivar Nipponrye (Oryza sativa L. cv Nipponbare) as a template, an approximately 4.4 kb fragment of the OASA2 gene was amplified by PCR. PCR primer
5′-CCCATCGAGGAAGAGTAAACCCAAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
5'-TAAACATGCAGCGAGAAGAACCATGAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
And the enzyme KOD-plus- (Toyobo), following the instructions of the kit. The obtained PCR fragment was cleaved with EcoRI and XhoI and then cloned into a pBS vector. Mutations such as S126F / L530D and Y367A / L530D were introduced into the obtained clones using PCR. PCR includes primers
S126F;
5'-GGAGACGCC [aAGCTT] CTCTTCGAG TtC GTCGAGC-3 '(SEQ ID NO: 13)
5′-GCTCGAC GaA CTCGAAGAGG [AAGCTt] GGCGTCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
Y367A;
5′-TTGTGAACCCAAGTCCA g [cC ATGG] CATATGTACAGGTAT-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
5′-ATACCTGTACATATG [CCAT Gg] c TGGACTTGGGTTCACAA-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
L530D;
5'-GCCTTGGAGG [GATtTC] ATTTGACGGAGACATG gac ATCGC-3 '(SEQ ID NO: 17)
5′-GCGAT gtc CATGTCTCCGTCAAAT [GAaATC] CCTCCAAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 18)
(Lower case letters indicate the bases into which the mutation has been introduced. The underlined portion is an amino acid substitution, and the portion between [] is a non-synonymous substitution and is a sequence converted to a CAPS marker for efficient detection of GT individuals.) QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis kit (STRATAGENE) was used. The obtained clones were designated as SL-1 or YL-1. In addition, a genomic DNA of rice cultivar Nipponbare was used as a template, and a fragment of about 9.7 kb containing the OASA2 gene was amplified by PCR. PCR primer
5'-ATGGACTTGTTTACTCGGGAGTGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 19)
5'-TCCCAACCTCTCATCTCTCATTTTTCG-3 '(SEQ ID NO: 20)
And the enzyme KOD-plus- were performed according to the instructions of the kit. The obtained PCR fragment was cleaved with KpnI and PacI and then cloned into the pPZP2028 vector (modified vector obtained by adding the AscI / PacI site to the MCS of pPZP202). This was cleaved with SacII / XhoI, and an approximately 3.8 kb fragment excised from SL-1 or YL-1 with SacII / XhoI was introduced. The vector thus obtained was named SL-2 or YL-2.

得られたベクターSL-2またはYL-2をテンプレートにし、約7.5kbの断片をPCR法によって増幅した。PCRは、プライマー
5’-GCGTGA［GGTaCc］CCGCGGGGAAG-3’（配列番号：２１）
5’-GGGCTTAGGGGTCCTGTTGGAAACTAT-3’（配列番号：２２）
（［］で挟まれた配列は新たに付加したKpnIサイトを示す）と酵素KOD-plus-（Toyobo）を用いて、キットの説明に従い行った。得られたPCR断片はKpnI及びEcoRIで切断した後、pPZP201ベクターにクローニングした。得られたクローンをGT用のベクターとし、それぞれOASA2SL-GT1またはOASA2YL-GT1とした（図2）。
また、上記のKpnI及びEcoRIで切断したPCR断片を、pCAMBIA1304にクローニングした。得られたクローンを別のGT用のベクターとし、それぞれOASA2SL-GT2またはOASA2YL-GT2とした（図2）。また、ベクターSL-2またはYL-2をSpeIで切断した後、pCAMBIA1304またはpCAMBIA1300ベクターにクローニングした。得られたクローンをポジティブコントロール用ベクターとし、それぞれOASA2SL-PCまたはOASA2YL-PCとした（図2）。 The obtained vector SL-2 or YL-2 was used as a template, and a fragment of about 7.5 kb was amplified by PCR. PCR primer
5′-GCGTGA [GGTaCc] CCGCGGGGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
5'-GGGCTTAGGGGTCCTGTTGGAAACTAT-3 '(SEQ ID NO: 22)
(The sequence between [] indicates a newly added KpnI site) and the enzyme KOD-plus- (Toyobo) was used according to the description of the kit. The obtained PCR fragment was cleaved with KpnI and EcoRI and then cloned into the pPZP201 vector. The obtained clone was used as a vector for GT, which was OASA2SL-GT1 or OASA2YL-GT1, respectively (FIG. 2).
The PCR fragment cleaved with KpnI and EcoRI was cloned into pCAMBIA1304. The obtained clone was used as another GT vector, which was OASA2SL-GT2 or OASA2YL-GT2, respectively (FIG. 2). Further, vector SL-2 or YL-2 was cleaved with SpeI and then cloned into pCAMBIA1304 or pCAMBIA1300 vector. The obtained clones were used as positive control vectors, and OASA2SL-PC or OASA2YL-PC, respectively (FIG. 2).

今回作製したGTベクターについて、S126Fの変異はベクターの末端から約0.2kbの距離に位置している。通常、相同配列領域を短くすると相同組換え効率が低下するため、効率的にGT個体を得ることが困難であると考えられる。今回、それをできるだけ克服するために、S126Fの変異をT-DNAのライトボーダー（RB）側に配置した。レフトボーダー（LB）に対して、RB側はタンパク質によってT-DNAが保護されるために核に到達するまでDNAが削られることが少ない。これにより、S126Fの変異を効率よく導入することができたと考えられた。 In the GT vector prepared this time, the mutation of S126F is located at a distance of about 0.2 kb from the end of the vector. Usually, if the homologous sequence region is shortened, the homologous recombination efficiency decreases, and it is considered difficult to obtain GT individuals efficiently. This time, in order to overcome it as much as possible, the mutation of S126F was placed on the right border (RB) side of T-DNA. In contrast to the left border (LB), the T-DNA is protected by the protein on the RB side, so that the DNA is rarely scraped until reaching the nucleus. As a result, it was considered that the mutation of S126F could be introduced efficiently.

１．２アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法
脱頴したイネ品種日本晴の滅菌種子をN6D培地に置床し、33℃明条件下で3-4週間培養した。得られたカルスに対し、アグロバクテリウム法によって形質転換を行った。形質転換にはアグロバクテリウムEHA105株を利用した。アグロバクテリウムを処理したイネカルスを2N6AS培地に置床し、25-28℃、暗条件で3日間の共存培養を行った。その後、滅菌水及びカルベニシリン溶液でアグロバクテリウムを除菌し、500μMの5-メチルトリプトファン（トリプトファンアナログでありAS活性を阻害する、5MT）、カルベニシリンを含む選抜用N6D培地に置床した。5MT耐性カルスの選抜は、33℃明条件下で1-2ヶ月行った。途中、数回新しい培地にカルスを移植した。得られた5MT耐性カルスを300μMの5MTを含む再分化培地に置床し、33℃明条件下で約1ヶ月培養した。得られた再分化植物体は、300μMの5MTを含むホルモンフリー培地に移植し、33℃明条件下で約1ヶ月培養した。 1.2 Gene transfer method using Agrobacterium Sterilized seeds of degenerated rice cultivar Nipponbare were placed on N6D medium and cultured under light conditions at 33 ° C. for 3-4 weeks. The obtained callus was transformed by the Agrobacterium method. Agrobacterium strain EHA105 was used for transformation. Rice callus treated with Agrobacterium was placed on 2N6AS medium and co-cultured at 25-28 ° C in the dark for 3 days. Thereafter, Agrobacterium was sterilized with sterilized water and a carbenicillin solution, and placed on a selective N6D medium containing 500 μM 5-methyltryptophan (a tryptophan analog that inhibits AS activity, 5MT) and carbenicillin. Selection of 5MT resistant callus was performed for 1-2 months under 33 ° C light conditions. On the way, callus was transplanted to a new medium several times. The obtained 5MT-resistant callus was placed on a regeneration medium containing 300 μM of 5MT and cultured under light conditions at 33 ° C. for about 1 month. The obtained redifferentiated plant was transplanted to a hormone-free medium containing 300 μM of 5MT and cultured under light conditions at 33 ° C. for about 1 month.

１．３ GTによって得られた個体のCAPS解析
GTによって得られた個体の葉からDNAを抽出した。得られたDNAを用いてPCR法によって変異を導入した塩基を含む0.5-0.8kbの断片を増幅した。PCRは、プライマーS126F;
5’-GCGTGAGGTACCCCGCGGGGAAG-3’（配列番号：２１）
5’-ACGAGAACATCATCATAAAGCCCAAGG-3’（配列番号：２３）
Y367A;
5’-ACTCGGCAGTTTGGTACACCTTTGAAC-3’（配列番号：２４）
5’-ACAGTCCCAGCAAGTGGACGGTTAATA-3’（配列番号：２５）
L530D;
5’-GTTGGGACAGTGTAGCCTCTTGGTAG-3’（配列番号：２６）
5’-CTGCCTTGTTCTCGCATTCACGTT-3’（配列番号：２７）
と酵素KOD-dash-（Toyobo）を用いて、キットの説明に従い行った。得られたPCR産物は、制限酵素処理（S126F; HindIII, Y367A; NcoI, L530D; EcoRV）を行い、CAPSマーカーとしてGT用ベクターに導入しておいた変異が導入されているかを電気泳動により確認した。 1.3 CAPS analysis of individuals obtained by GT
DNA was extracted from the leaves of individuals obtained by GT. The obtained DNA was used to amplify a 0.5-0.8 kb fragment containing a base into which a mutation was introduced by PCR. PCR is primer S126F;
5'-GCGTGAGGTACCCCGCGGGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 21)
5′-ACGAGAACATCATCATAAAGCCCAAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
Y367A;
5'-ACTCGGCAGTTTGGTACACCTTTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 24)
5'-ACAGTCCCAGCAAGTGGACGGTTAATA-3 '(SEQ ID NO: 25)
L530D;
5'-GTTGGGACAGTGTAGCCTCTTGGTAG-3 '(SEQ ID NO: 26)
5'-CTGCCTTGTTCTCGCATTCACGTT-3 '(SEQ ID NO: 27)
And the enzyme KOD-dash- (Toyobo) and performed according to the description of the kit. The obtained PCR product was subjected to restriction enzyme treatment (S126F; HindIII, Y367A; NcoI, L530D; EcoRV), and it was confirmed by electrophoresis whether the mutation introduced in the GT vector as a CAPS marker was introduced. .

１．４ GTによって得られた個体の塩基配列の決定
GTによって得られた個体の葉からDNAを抽出した。DNA抽出には、NucleonPhytopure（GE）を利用した。得られたDNAを用いてPCR法によって約10.0kbの断片を増幅した。得られたPCR産物を用いたシーケンス反応は、プライマー
5’-GCGTGAGGTACCCCGCGGGGAAG-3’（配列番号：２１）
5’-GTTGGGACAGTGTAGCCTCTTGGTAG-3’（配列番号：２６）
を用いて行った。 1.4 Determination of the base sequence of individuals obtained by GT
DNA was extracted from the leaves of individuals obtained by GT. NucleonPhytopure (GE) was used for DNA extraction. A fragment of about 10.0 kb was amplified by PCR using the obtained DNA. Sequence reaction using the obtained PCR product
5'-GCGTGAGGTACCCCGCGGGGAAG-3 '(SEQ ID NO: 21)
5'-GTTGGGACAGTGTAGCCTCTTGGTAG-3 '(SEQ ID NO: 26)
It was performed using.

１．５ GTによって得られた個体のサザン解析
GTによって得られた個体の葉からDNAを抽出した。DNA抽出には、NucleonPhytopure（GE）を利用した。サザン解析には、制限酵素処理を施した1.5μgのDNAを用いた。プローブ作製には、PCR DIG probe synthesis kit（Roche）を利用した。DIGラベルされたプローブを作製するために、プライマー
5’-GATAGGTGGATGGGTCGGGTTCTTTTC-3’（配列番号：２８）
5’-ACAGGATTGAAGGAATGGGCACAGGTT-3’（配列番号：２９）
を利用した。サザン解析は定法に従って行った。 Southern analysis of individuals obtained by 1.5 GT
DNA was extracted from the leaves of individuals obtained by GT. NucleonPhytopure (GE) was used for DNA extraction. For Southern analysis, 1.5 μg of DNA subjected to restriction enzyme treatment was used. PCR DIG probe synthesis kit (Roche) was used for probe preparation. Primers to make DIG labeled probes
5'-GATAGGTGGATGGGTCGGGTTCTTTTC-3 '(SEQ ID NO: 28)
5′-ACAGGATTGAAGGAATGGGCACAGGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 29)
Was used. Southern analysis was performed according to a conventional method.

１．６トリプトファン量の測定
トリプトファンを含む遊離アミノ酸を定量するために、イネの葉身をサンプリングし、液体窒素で凍結した。凍結させた試料は、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて粉砕した。粉砕試料約2mgに2%スルホサリチル酸200μLを添加した後、試料をすりつぶし、超音波処理5分を2回行った。0.22μmのフィルターでろ過した抽出液のうち25μLを分析に用いた。各種アミノ酸の定量には生体液分析/ニンヒドリン発色を利用し、アミノ酸分析計（日立、L-8800A）を用いて行った。 1.6 Measurement of tryptophan amount To quantify free amino acids containing tryptophan, rice leaf blades were sampled and frozen in liquid nitrogen. The frozen sample was pulverized using a multi-bead shocker (Yasui Kikai). After adding 200 μL of 2% sulfosalicylic acid to about 2 mg of the ground sample, the sample was ground and sonicated twice for 5 minutes. 25 μL of the extract filtered through a 0.22 μm filter was used for analysis. The quantification of various amino acids was performed using a biological fluid analysis / ninhydrin coloring and using an amino acid analyzer (Hitachi, L-8800A).

２．結果
２．１ GTによるOASA2遺伝子の改変個体の獲得
GTによるOASA2遺伝子の改変個体を得るために、GT実験系のデザインを行った。これまでの報告からイネカルスにおいて、改変型OASA1遺伝子を利用した選抜を行う際に300μMの5MTを利用したという報告がある（Yamada et al, 2004）。そこで、空ベクターpPZP2028、ポジティブコントロールベクターOASA2SL-PCまたはOASA2YL-PCを導入したイネカルスを、300-600μMの5MTを含むN6D選抜培地に置床し、33℃明条件下で培養した。その結果、ポジティブコントロールベクターを導入したカルスでは5MT耐性カルスが増殖するのに対し、空ベクターを導入したカルスではカルスが死滅する5MTの濃度条件は500μMが適当であることが明らかになった（図3）。 2. result
2.1 Acquisition of modified OASA2 gene by GT
In order to obtain modified individuals of OASA2 gene by GT, we designed a GT experimental system. From previous reports, there was a report that 300μM 5MT was used in rice callus when selecting using modified OASA1 gene (Yamada et al, 2004). Thus, rice callus introduced with the empty vector pPZP2028 and the positive control vector OASA2SL-PC or OASA2YL-PC was placed on an N6D selection medium containing 300-600 μM of 5MT and cultured under light conditions at 33 ° C. As a result, it became clear that 5MT-resistant callus proliferates in the callus introduced with the positive control vector, while 500μM is appropriate as the 5MT concentration condition for killing the callus in the callus introduced with the empty vector (Fig. 3).

この選抜条件でGTベクターを利用したGT実験を行った。OASA2SL-GT1またはOASA2YL-GT1を用いたGT実験の結果、それぞれ1系統のGTに成功したと思われる個体を獲得することに成功した。以下、OASA2SL-GT1を利用したGT成功個体の獲得について説明する。
3週間培養したイネカルス850個に対し、GT用ベクターOASA2SL-GT1を導入したアグロバクテリウムの感染を行った。除菌後、500μMの5MTを含むN6D培地上で選抜を行ったところ、152系統の5MT耐性カルスを得ることに成功した。それらを再分化培地に置床して培養したところ、25系統の5MT耐性植物体を得ることに成功した。それらについて、CAPSマーカーを利用して再分化植物体に改変型OASA2遺伝子が存在しているかどうかを確認した。その結果、GTに成功したと予想される、もしくはGTベクターがランダム挿入したと予想される個体を1系統獲得することに成功した。
また、得られた個体についてS126FおよびL530D近傍の塩基配列を確認したところ、変異を導入した配列については、野生型と改変型の2種類のピークを確認することができた。得られた個体は大きな形態的な変化は見られず、種子を得ることができた（図5）。 A GT experiment using a GT vector was conducted under these selection conditions. As a result of the GT experiment using OASA2SL-GT1 or OASA2YL-GT1, we succeeded in acquiring individuals that seemed to succeed in one GT each. The following explains how to acquire successful GT individuals using OASA2SL-GT1.
850 rice calluses cultured for 3 weeks were infected with Agrobacterium introduced with GT vector OASA2SL-GT1. After sterilization, selection was carried out on N6D medium containing 500 μM of 5MT. As a result, 152 5MT-resistant calli were successfully obtained. When they were placed on a regeneration medium and cultured, 25 lines of 5MT-resistant plants were successfully obtained. About them, it was confirmed whether the modified OASA2 gene was present in the redifferentiated plant using a CAPS marker. As a result, we succeeded in obtaining one strain of individuals who were expected to succeed in GT, or who were expected to have randomly inserted GT vectors.
Further, when the nucleotide sequence of S126F and L530D in the vicinity of the obtained individual was confirmed, two types of peaks, a wild type and a modified type, were confirmed for the sequence into which the mutation was introduced. The obtained individuals did not show significant morphological changes and could obtain seeds (Fig. 5).

２．２ GTによるOASA2遺伝子の改変個体のサザン解析
GTベクターOASA2SL-GT1を用いて得られたT₀個体、及びその後代T₁個体を用いて、サザン解析を行った。サザン解析の結果、T₀個体では6.0kb及び1.5kbのバンドが確認された。このことから、T₀個体のOASA2遺伝子は野生型と改変型のヘテロであることが示された。これは上記の塩基配列の結果と一致していた。また、T₁個体7系統を用いて同様のサザン解析を行ったところ、系統番号2及び6において、1.5kbのバンドのみが確認された。このことから、今回得られた個体は、内在性OASA2遺伝子を改変することに成功していることが示された。 2.2 Southern analysis of modified OASA2 gene by GT
Southern analysis was performed using T ₀ individuals obtained using the GT vector OASA2SL-GT1 and its progeny T ₁ individuals. As a result of Southern analysis, bands of 6.0 kb and 1.5 kb were confirmed in the T ₀ individuals. This indicates that the OASA2 gene of T ₀ individuals is a heterozygous of wild type and modified type. This was consistent with the result of the above base sequence. Further, when similar Southern analysis was performed using 7 lines of T ₁ individuals, only a 1.5 kb band was confirmed in line numbers 2 and 6. From this, it was shown that the individual obtained this time has succeeded in modifying the endogenous OASA2 gene.

２．３ OASA2SL-GT1を用いて得られた遺伝子ターゲッティング個体におけるトリプトファン量の測定
得られたGT個体の遊離トリプトファン含量を測定したところ、イネ葉身において約8.62nmol/mgの遊離トリプトファンが蓄積していることが明らかとなった。これは、野生型の遊離トリプトファン含量の約130倍であった。また、これは、全アミノ酸の約16%を占めていた。このことから、GTによるOASA2遺伝子の改変によって、トリプトファンの蓄積量を増大させることが可能であると示された。 2.3 Measurement of tryptophan content in gene targeting individuals obtained using OASA2SL-GT1 When free tryptophan content in the obtained GT individuals was measured, about 8.62 nmol / mg free tryptophan accumulated in rice leaf blades. It became clear that This was about 130 times the wild type free tryptophan content. This accounted for about 16% of all amino acids. From this, it was shown that the amount of tryptophan accumulated can be increased by modifying the OASA2 gene with GT.

Claims

A transformed plant obtained by a method comprising the following steps (a) and (b), wherein the plant contains a high concentration of tryptophan and does not contain an endogenous anthranilate synthase α subunit ;
(A) a step of introducing a vector consisting of the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 7 to 10 into a plant cell by gene targeting method; and
(B) A step of regenerating a plant from the plant cell into which the vector has been introduced in step (a) .

The plant body according to claim 1 , wherein the plant is a monocotyledonous plant.

The plant body according to claim 2 , wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.

The plant body according to claim 3 , wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oats, grass.

A cell isolated from the plant according to any one of claims 1 to 4 .

The propagation material of the plant body in any one of Claim 1 to 4 .

An organ isolated from the plant according to any one of claims 1 to 4 .

A method for producing a plant body containing tryptophan and containing no endogenous anthranilate synthase α subunit , comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of introducing a vector comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 7 to 10 into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant cell into which DNA or a vector has been introduced in step (a) The process of regenerating a plant body.

The method according to claim 8 , wherein the plant is a monocotyledonous plant.

The method according to claim 9 , wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.

The method according to claim 10 , wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oats, grass.

A method of containing tryptophan in a plant containing no endogenous anthranilate synthase α subunit , comprising the following steps (a) and (b):
(A) a step of introducing a vector comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 7 to 10 into a plant cell by a gene targeting method, and (b) a plant cell into which DNA or a vector has been introduced in step (a) The process of regenerating a plant body.

The method according to claim 12 , wherein the plant is a monocotyledonous plant.

14. The method according to claim 13 , wherein the monocotyledonous plant is a gramineous plant.

15. The method according to claim 14 , wherein the gramineous plant is selected from the group consisting of rice, corn, wheat, barley, sorghum, oats, grass.

A drug for containing a high concentration of tryptophan in a plant, containing as an active ingredient at least one of the vectors consisting of the base sequence of SEQ ID NOs: 7 to 10.

A method for producing tryptophan, comprising the following steps (a) and (b):
(A) The method of acquiring the plant body containing tryptophan by the method in any one of Claims 8 to 15 , and the process of collect | recovering tryptophan from the plant body acquired by the (b) process (a).