JP5647781B2 - Gene transcription control method - Google Patents
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Description
本発明は、標的遺伝子の発現を制御するための方法に関する。 The present invention relates to a method for controlling the expression of a target gene.
微生物による有用物質の工業的生産は、食品、医薬や、洗剤、化粧品等の原料、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野で行われている。微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その手法として、近年、遺伝子工学技術により微生物の遺伝子やプロモーターを改変して目的物質の発現を制御する方法が注目されている。 Industrial production of useful substances by microorganisms is performed in a wide range of fields, from raw materials such as foods, medicines, detergents and cosmetics to various chemical raw materials. In industrial production of useful substances by microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues. In recent years, attention has been paid to a method for controlling the expression of a target substance by modifying a microbial gene or promoter by genetic engineering techniques.
遺伝子の転写に必要なプロモーターに関する研究は数多く行なわれており、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合、ｌａｃプロモーター、キシロースプロモーター、アラビノースプロモーター等が遺伝子の発現誘導に用いられている。これらのプロモーターは、リプレッサーが制御配列から外れることによって活性化されて遺伝子の発現を誘導する、ネガティブレギュレーターによって制御される系である。 Many studies have been conducted on promoters necessary for gene transcription. In the case of Bacillus subtilis , lac promoter, xylose promoter, arabinose promoter, and the like are used for inducing gene expression. These promoters are systems controlled by negative regulators that are activated when the repressor deviates from the regulatory sequence to induce gene expression.
一方、枯草菌には、ポジティブレギュレーターに制御されるプロモーター系もまた存在する。枯草菌ＬｉａＲ及びＬｉａＳ（あるいはＹｖｑＣ及びＹｖｑＥ）は、細胞壁ストレスに応答する二成分制御系であることが示唆されている。二成分制御系とは、刺激に対するレセプター且つヒスチジンキナーゼとして働くセンサータンパク質と、そのセンサーからのリン酸シグナルを受けて活性化し、遺伝子発現を制御するレギュレータータンパク質とで構成される環境応答機構である。従来の研究では、ＬｉａＲＳ二成分制御系においてＬｉａＳは細胞壁に作用するいくつかの抗生物質に応答してＬｉａＲをリン酸化し、リン酸化されたＬｉａＲは、ｌｉａＩＨ上流とｙｈｃＹ上流に結合してその発現を制御すること（図１）、二成分制御系ＬｉａＲＳは、これらの遺伝子を活性化させるポジティブレギュレーターとして働くことが提唱されていた（非特許文献１〜５）。 On the other hand, Bacillus subtilis also has a promoter system controlled by a positive regulator. Bacillus subtilis LiaR and LiaS (or YvqC and YvqE) have been suggested to be two-component regulatory systems that respond to cell wall stress. The two-component control system is an environmental response mechanism composed of a sensor protein that acts as a receptor for stimulation and histidine kinase, and a regulator protein that is activated by receiving a phosphate signal from the sensor and controls gene expression. In previous studies, LiaS phosphorylates LiaR in response to several antibiotics acting on the cell wall in the LiaRS binary control system, and the phosphorylated LiaR binds to liaIH upstream and yhcY upstream and its expression. It has been proposed that the two-component control system LiaRS acts as a positive regulator that activates these genes (Non-Patent Documents 1 to 5).
ＬｉａＲＳ等の二成分制御系は、特定の遺伝子に対して強いポジティブレギュレーションを及ぼし得ることが報告されている（特許文献１、非特許文献６）。当該二成分制御系を利用した抗生物質の探索方法や抗生物質に対する耐性の探索方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、二成分制御系が実際にプロモーターにどのように作用し、遺伝子発現を制御するのかについての詳細な解析は行われていなかった。また、有用物質の工業的生産のために二成分制御系を利用する試みも、これまでなされていなかった。 It has been reported that a two-component control system such as LiaRS can exert strong positive regulation on a specific gene (Patent Document 1, Non-Patent Document 6). A method for searching for antibiotics using the two-component control system and a method for searching for resistance to antibiotics have been proposed (Patent Document 1). However, a detailed analysis of how the two-component control system actually acts on the promoter and controls gene expression has not been performed. In addition, no attempt has been made to use a two-component control system for industrial production of useful substances.
本発明は、標的遺伝子の発現を特異的に制御するための方法を提供することに関する。また本発明は、目的遺伝子産物を効率的に生産するための組み換え微生物、および当該微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法の提供に関する。 The present invention relates to providing a method for specifically controlling the expression of a target gene. The present invention also relates to a recombinant microorganism for efficiently producing a target gene product, and a method for producing the target gene product using the microorganism.
本発明者らは、枯草菌二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳの系が、驚くべきことに、ｌｉａＩＨ遺伝子プロモーターに対して非常に特異的に結合していることを見出した。また本発明者らは、このＬｉａＲＳ系による遺伝子発現誘導が、特定の抗生物質によってさらに顕著に向上することを見出した。これらの知見に基づき、本発明らは、ｌｉａＩＨプロモーターの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、そして二成分制御系ＬｉａＲＳを抗生物質によって活性化することで、当該標的遺伝子の発現を極めて特異的に誘導することができることを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have surprisingly found that the Bacillus subtilis binary control system LiaR and LiaS are very specifically bound to the liaIH gene promoter. In addition, the present inventors have found that the gene expression induction by the LiaRS system is further remarkably improved by a specific antibiotic. Based on these findings, the present inventors have operably linked a target gene downstream of the liaIH promoter, and activate the two-component regulatory system LiaRS with antibiotics to make the expression of the target gene extremely specific. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
（２）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１）記載の方法。
（３）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（２）記載の方法。
（４）微生物がバチルス属細菌である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（４）に記載の方法。
（６）標的遺伝子が異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物。
（８）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とが組み込まれた発現ベクターを有する（７）記載の組換え微生物。
（９）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とがゲノムに組み込まれている（７）記載の組換え微生物。
（１０）微生物がバチルス属細菌である、（７）〜（９）のいずれか１に記載の組換え微生物。
（１１）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（１０）に記載の組換え微生物。
（１２）（７）〜（１１）のいずれか１に記載の組換え微生物に細胞壁ストレスを負荷する工程を特徴とする、目的遺伝子産物の生産方法。
（１３）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１２）記載の方法。
（１４）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（１３）記載の方法。
That is, the present invention provides the following.
(1) A method for promoting transcription of a target gene in a microorganism, wherein the liaIH promoter DNA is a microorganism having a gene encoding LiaR and LiaS or a gene corresponding thereto, and a liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto. Or a step of operably linking the target gene downstream of the DNA corresponding thereto, and applying cell wall stress to the microorganism to activate the expression of the genes encoding LiaR and LiaS or the genes corresponding thereto. A method comprising the steps.
(2) The method according to (1), wherein the cell wall stress is an antibiotic.
(3) The method according to (2), wherein the antibiotic is enduracidin.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the microorganism is a Bacillus bacterium.
(5) The method according to (4), wherein the Bacillus bacterium is Bacillus subtilis or a mutant strain thereof.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the target gene is a gene encoding a heterologous protein or polypeptide.
(7) a gene encoding LiaR and LiaS or a gene corresponding thereto, and a liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto, and encoding a target gene product downstream of the liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto. Recombinant microorganisms to which the genes to be operably linked are linked.
(8) The recombinant microorganism according to (7), which has an expression vector in which the liaIH promoter DNA or DNA corresponding thereto and a gene encoding the target gene product are incorporated.
(9) The recombinant microorganism according to (7), wherein the liaIH promoter DNA or DNA corresponding thereto and the gene encoding the target gene product are integrated into the genome.
(10) The recombinant microorganism according to any one of (7) to (9), wherein the microorganism is a Bacillus bacterium.
(11) The recombinant microorganism according to (10), wherein the Bacillus bacterium is Bacillus subtilis or a mutant strain thereof.
(12) A method for producing a target gene product, comprising a step of applying cell wall stress to the recombinant microorganism according to any one of (7) to (11).
(13) The method according to (12), wherein the cell wall stress is an antibiotic.
(14) The method according to (13), wherein the antibiotic is enduracidin.
本発明によれば、目的タンパク質又はポリペプチド等の標的遺伝子産物の発現を強力且つ特異的に誘導し、それらを高効率で生産することが可能になる。さらに、本発明によれば、目的遺伝子産物の発現を極めて特異的に誘導することができ、目的以外の遺伝子産物が無駄に生産されることがないため、高純度の目的物質を得ることができるとともに、目的物質の生産に要するコストや労力を削減することが可能になる。 According to the present invention, it becomes possible to strongly and specifically induce the expression of a target gene product such as a target protein or polypeptide, and to produce them with high efficiency. Furthermore, according to the present invention, expression of the target gene product can be induced very specifically, and gene products other than the target are not produced in vain, so that a target substance with high purity can be obtained. At the same time, it is possible to reduce the cost and labor required to produce the target substance.
本明細書に記載される枯草菌遺伝子のＩＤ番号、名称、塩基配列、及びゲノム上での配置は、特に記載されない限り、ＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)に基づく。 Unless otherwise specified, the ID number, name, nucleotide sequence, and genome arrangement of the Bacillus subtilis gene described in the present specification are the NCBI Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites). / entrez? db = nucleotide).
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present invention, the identity of amino acid sequences and base sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, it is calculated by performing analysis with the parameter unit size to compare (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
ＬｉａＲ（ＢＳＵ３３０８０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５７）及びＬｉａＳ（ＢＳＵ３３０９０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９６７）は、枯草菌二成分制御系を構成するタンパク質であり、各々ＹｖｑＣ及びＹｖｑＥとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＲＳとも記載される。ＬｉａＳはヒスチジンキナーゼであって、二成分制御系のセンサーとして働き、一方ＬｉａＲは二成分制御系のレギュレーターとして働くと考えられている。また、ＬｉａＩ（ＢＳＵ３３１３０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５８）及びＬｉａＨ（ＢＳＵ３３１２０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３８５８５）は、各々ＹｖｑＩ及びＹｖｑＨとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＩＨとも記載される。ＬｉａＩＨは、それらの遺伝子の上流領域にＬｉａＲが結合することによって発現がアップレギュレートされることが知られている。ＬｉａＩは膜タンパク質と考えられており、一方ＬｉａＨはファージショックタンパク質と類似する。 LiaR (BSU33080, NCBI-GeneID: 935957) and LiaS (BSU33090, NCBI-GeneID: 935967) are proteins that constitute the Bacillus subtilis binary control system, and are also referred to as YvqC and YvqE, respectively. It is also described as LiaRS. LiaS is a histidine kinase and is thought to act as a sensor for a two-component control system, while LiaR is thought to act as a regulator for a two-component control system. LiaI (BSU33130, NCBI-GeneID: 935958) and LiaH (BSU33120, NCBI-GeneID: 935585) are also referred to as YvqI and YvqH, respectively, and are also collectively referred to as LiaIH in this specification. LiaIH is known to be upregulated by the binding of LiaR to the upstream region of these genes. LiaI is considered a membrane protein, while LiaH is similar to a phage shock protein.
本明細書において「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＳをコードする遺伝子（ｌｉａＳ又はｙｖｑＥ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＳと同様に二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＳと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。 In the present specification, “a gene corresponding to a gene encoding LiaS” is 70% or more, more preferably 80% or more, with respect to the base sequence of a gene (liaS or yvqE) encoding LiaS described in the NCBI database. More preferably, it refers to a gene encoding a histidine kinase that has a nucleotide sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and functions as a sensor of a two-component control system as in LiaS. Alternatively, a gene having homology or similarity with liaS is also a “gene corresponding to a gene encoding LiaS”.
本明細書において「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲ又はｙｖｑＣ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲと同様に二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＲと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。 In the present specification, “a gene corresponding to a gene encoding LiaR” is 70% or more, more preferably 80% or more, relative to the base sequence of a gene (liaR or yvqC) encoding LiaR described in the NCBI database. More preferably, it refers to a gene encoding a protein having a nucleotide sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and functioning as a regulator of a two-component control system in the same manner as LiaR. Alternatively, a gene having homology or similarity with liaR is also a “gene corresponding to a gene encoding LiaR”.
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子（ｌｉａＩ及びｌｉａＩＨ又はｙｖｑＩ及びｙｖｑＨ）の発現を制御するプロモーター領域のＤＮＡを指す。好ましくは、「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列を含むＤＮＡを指し、より好ましくは−９５〜＋２５領域、さらに好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域を含むＤＮＡを指す。さらにより好ましくは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列からなるＤＮＡを指し、なお好ましくは−９５〜＋２５領域、なおより好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域の塩基配列からなるＤＮＡを指す。 As used herein, “liaIH promoter DNA” refers to DNA in a promoter region that controls expression of a gene encoding liaIH (liaI and liaIH or yvqI and yvqH). Preferably, “liaIH promoter DNA” refers to a DNA comprising a base sequence of −120 to +84 region upstream of the transcription start point (+1) of the gene encoding LiaI, more preferably −95 to +25 region, still more preferably Indicates a DNA containing a -95 to +1 (transcription start point) region. Even more preferably, it refers to a DNA comprising a base sequence in the −120 to +84 region upstream of the transcription start point (+1) of the gene encoding LiaI, more preferably in the −95 to +25 region, still more preferably in the −95 to +1 range. (Transcription start point) This refers to DNA comprising the base sequence of the region.
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、上述のｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲに結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。あるいは「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子のプロモーターＤＮＡ又は当該プロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡであって、且つＬｉａＲ又はｌｉａＲ遺伝子に相当する遺伝子の発現産物に結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。ここで、「ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＩＨをコードする遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子、又はｌｉａＩＨをコードする遺伝子と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子である。 In the present specification, “DNA corresponding to liaIH promoter DNA” refers to 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% with respect to the base sequence of the liaIH promoter DNA described above. It refers to a DNA having the above identity, and more preferably having a nucleotide sequence having an identity of 98% or more, and that functions as a promoter when bound to LiaR. Alternatively, “DNA corresponding to liaIH promoter DNA” means 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% of the promoter DNA of the gene corresponding to the gene encoding LiaIH or the base sequence of the promoter DNA. % Or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more of DNA having a nucleotide sequence and binding to an expression product of a gene corresponding to the LiaR or liaR gene Refers to DNA that functions as a promoter. Here, the “gene corresponding to the gene encoding LiaIH” is 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, with respect to the base sequence of the gene encoding LiaIH described in the NCBI database. More preferably, it is a gene having a nucleotide sequence having 95% or more identity, or a gene having homology or similarity to a gene encoding liaIH.
ＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲＳ）の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡとしては、例えば、下記表１に記載の遺伝子及びＤＮＡが挙げられる。表１は、各バクテリア種の代表的な菌株とそのｌｉａＲＳ相同遺伝子を挙げたものである。表１の菌がさらに有する別の相同遺伝子及びその発現産物が結合するプロモーターＤＮＡ、ならびに表１と同種の異なる菌株が有する表１と同じ相同遺伝子又は別の相同遺伝子、及びそれらの発現産物が結合するプロモーターＤＮＡも、本発明におけるＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡに含まれる。 Examples of the gene corresponding to each of the genes encoding LiaS and LiaR (liaRS) and the DNA corresponding to the liaIH promoter DNA include the genes and DNAs listed in Table 1 below. Table 1 lists representative strains of each bacterial species and their liaRS homologous genes. Another homologous gene further possessed by the fungus of Table 1 and a promoter DNA to which its expression product binds, and the same homologous gene or another homologous gene of Table 1 possessed by a different strain of the same type as in Table 1 and their expression products bind The promoter DNA to be used is also included in the genes corresponding to each of the genes encoding LiaS and LiaR in the present invention and the DNA corresponding to the liaIH promoter DNA.
本発明の方法においては、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、またこの微生物に細胞壁ストレスを負荷することによって二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる。これによってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターＤＮＡがアップレギュレートされ、結果として当該プロモーターの下流に連結された該標的遺伝子の転写が促進される。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。 In the method of the present invention, in a microorganism having a gene encoding LiaR and LiaS or a gene corresponding thereto, and a liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto, the target is located downstream of the liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto. The genes are operably linked and cell wall stress is applied to the microorganism to activate the expression of genes encoding the two-component regulatory systems LiaR and LiaS or genes corresponding thereto. As a result, the liaIH promoter or a promoter DNA corresponding thereto is up-regulated, and as a result, transcription of the target gene linked downstream of the promoter is promoted. The microorganism is preferably a Bacillus bacterium, more preferably Bacillus subtilis or a mutant thereof.
標的遺伝子は特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。例えば、標的遺伝子としては、収縮タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、生体防御タンパク質、受容体タンパク質、構造タンパク質、遺伝子調節タンパク質、酵素、及び貯蔵タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。 The target gene is not particularly limited and may be an endogenous gene or a heterologous gene. For example, target genes include contractile proteins, transport proteins, signal proteins, biological defense proteins, receptor proteins, structural proteins, gene regulatory proteins, genes that encode proteins such as storage proteins, and functional RNAs. Examples include genes encoding non-coding RNA.
一態様において、標的遺伝子は、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である。異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質、構造タンパク質、各種調節などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が挙げられるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。 In one embodiment, the target gene is a gene encoding a heterologous protein or polypeptide. As a heterologous protein or polypeptide gene, any protein or polypeptide useful in various fields such as detergent, food, fiber, feed, chemicals, medicine, diagnosis, research, etc., for example, enzyme, bioactive peptide, marker, signal transduction Examples include genes encoding substances, structural proteins, and various types of regulation. The enzymes are listed according to their functions: oxidoreductase, transferase, transferase, hydrolase, lyase, isomerase, isomerase, and synthetase. / Synthetase) and the like, and preferred examples include hydrolases such as cellulase, α-amylase, and protease.
上記酵素の具体的な例としては、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。さらに具体的な例として、配列番号５３及び配列番号５４で示されるアミノ酸配列からなる、それぞれバチルス エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）又はバチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。 Specific examples of the enzyme include cellulases belonging to family 5 in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309, 1991). Among them, cellulases derived from microorganisms, particularly from bacteria belonging to the genus Bacillus. Is mentioned. More specific examples are derived from the Bacillus sp. KSM-64 strain (FERM BP-2886) or the Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875), each comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54. Examples include alkaline cellulase and cellulase comprising an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more identity with the amino acid sequence.
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピーＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。 Specific examples of α-amylase include α-amylase derived from microorganisms, and liquefied amylase derived from bacteria belonging to the genus Bacillus is particularly preferable. As a more specific example, alkaline amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55, 70%, preferably 80%, more preferably the amino acid sequence. An amylase having an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, can be mentioned.
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号５６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号５６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 Specific examples of the protease include serine protease, metal protease, and the like derived from microorganisms, particularly from Bacillus bacteria. As a more specific example, an alkaline protease derived from the Bacillus sp. KSM-KP43 strain (FERM BP-6532) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56, or 70%, preferably 80% from the amino acid sequence. %, More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more, a protein having protease activity consisting of an amino acid sequence having the identity, or 1 to 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 A protein having a protease activity comprising an amino acid sequence in which several amino acids are substituted, deleted or added.
好ましくは、上記異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、さらに分泌用シグナルペプチド領域と作動可能に連結されている。例えば、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）やＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子の分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号５３で示される塩基配列の塩基番号６０９〜６９９の塩基配列や配列番号５４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号５７３〜６６２の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが好ましい。 Preferably, the heterologous protein or polypeptide gene is further operably linked to a signal peptide region for secretion. For example, the signal peptide region for secretion of cellulase gene derived from KSM-64 strain (FERM BP-2886) or KSM-S237 strain (FERM BP-7875), more specifically, the base number of the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the base sequence of the cellulase gene consisting of the base sequence of 609 to 699 or the base sequence of the cellulase gene consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 54, and the base sequence % Or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of a DNA fragment consisting of a base sequence, or a DNA fragment consisting of a base sequence from which any of the above base sequences is deleted, It is preferably operably linked to the structural gene of the target protein or polypeptide.
別の一態様において、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子である。ノンコーディングＲＮＡは、ＤＮＡから転写された後タンパク質に翻訳されないＲＮＡである。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ，例えば、制御配列を含む非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等が挙げられる。これらのノンコーディングＲＮＡは、細胞の発現制御、発生、分化、その他生命活動に関わる多種多様なメカニズムを担っており、研究、医療、診断、創薬、品種改良や農薬生産等の農業、水産及び畜産分野、化学品製造等において利用可能である。 In another embodiment, the target gene is a gene encoding a non-coding RNA. Non-coding RNA is RNA that is transcribed from DNA and not translated into protein. Non-coding RNAs include functional RNAs such as untranslated regions including regulatory sequences, tRNAs, rRNAs, mRNA-type ncRNAs (mRNA-like non-coding RNAs), snRNAs (small nuclear RNAs), snRNAs (small nuclear RNAs). , MiRNA (microRNA), stRNA (Small Temporal RNA), siRNA (short-interfering RNA) and the like. These non-coding RNAs are responsible for a wide variety of mechanisms related to cell expression control, development, differentiation, and other life activities, including research, medicine, diagnosis, drug discovery, breeding and agricultural production such as agricultural production, It can be used in the livestock field and chemical production.
細胞壁ストレスとしては、バチルス属細菌等の微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられ、例えばＳＤＳ等の界面活性剤、エタノール等のアルコール、ＮａＣｌ、キシロース等の浸透圧変化に関わる物質、細胞壁合成阻害剤、及び細胞膜や細胞壁に障害を与える抗生物質等が挙げられ、好ましくは抗生物質である。抗生物質としては、バチルス属等のグラム陽性細菌の細胞壁に障害を与える抗生物質であれば特に限定されないが、例えばｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ｄｕｒａｍｙｃｉｎ、ｎｉｓｉｎ、ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが挙げられる。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。 Examples of cell wall stress include factors known in the art as cell wall stress for microorganisms such as Bacillus bacteria. For example, surfactants such as SDS, alcohols such as ethanol, and osmotic pressure changes such as NaCl and xylose. Examples include substances, cell wall synthesis inhibitors, and antibiotics that damage cell membranes and cell walls, and antibiotics are preferred. The antibiotic is not particularly limited as long as it is an antibiotic that damages the cell wall of Gram-positive bacteria such as Bacillus genus. And bacitracin. Among these, enduracidin, vancomycin and bacitracin are preferable, and enduracidin is more preferable.
本発明はまた、組換え微生物を提供する。本発明の組換え微生物は、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、ここで該ｌｉａＩプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流には標的遺伝子が作動可能に連結されている。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。 The present invention also provides a recombinant microorganism. The recombinant microorganism of the present invention has a gene encoding LiaR and LiaS or a gene corresponding thereto, and a liaIH promoter DNA or a DNA corresponding thereto, wherein the downstream of the liaI promoter DNA or a DNA corresponding thereto. Is operably linked to the target gene. The microorganism is preferably a Bacillus bacterium, more preferably Bacillus subtilis or a mutant thereof.
本明細書において、プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」とは、プロモーターが遺伝子の転写を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質が分泌シグナルにより分泌されるように、連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。 As used herein, “operable linkage” between a promoter and a gene or between a gene and a secretion signal means that the promoter can induce transcription of the gene, or that the protein encoded by the gene is secreted by the secretion signal. It means that it is connected. The procedure of “operable linkage” between a promoter and a gene or between a gene and a secretion signal is well known to those skilled in the art.
標的遺伝子とｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡとの連結、あるいはさらに分泌用シグナルペプチド領域との連結は、当該分野で通常用いられる方法により行うことができる。例えば、ＰＣＲ法により制限酵素切断部位を含むｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ及び標的遺伝子ＤＮＡ、または必要に応じて分泌シグナル領域ＤＮＡを増幅した後、それらを制限酵素法により互いに連結することができる。または、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）により、ｌｉａＩＨプロモーター領域下流のｌｉａ遺伝子領域と標的遺伝子、または必要に応じて分泌シグナル領域とを置換することによって、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの下流に標的遺伝子が連結したＤＮＡを構築することができる。 Ligation between the target gene and liaIH promoter DNA or DNA corresponding thereto, or further ligation with the signal peptide region for secretion can be performed by a method usually used in the art. For example, after amplification of the liaIH promoter DNA and target gene DNA including a restriction enzyme cleavage site by PCR method, or secretory signal region DNA as necessary, they can be ligated to each other by restriction enzyme method. Alternatively, by replacing the lia gene region downstream of the liaIH promoter region with the target gene or, if necessary, the secretory signal region by the SOE-PCR method (Gene, 1989, 77 (1): 61-68). A DNA in which a target gene is linked downstream of the promoter DNA can be constructed.
本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、発現ベクターに組み込まれていてもよい。発現ベクターに組み込む場合、標的遺伝子とプロモーターＤＮＡとの連結、又はさらに分泌シグナルペプチド領域との連結は、ベクター導入前に行われてもよく、あるいはベクター上で行われてもよい。構築した発現ベクターを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。 In the recombinant microorganism of the present invention, the liaIH promoter DNA or DNA corresponding thereto and the target gene may be incorporated into an expression vector. When incorporated into an expression vector, the target gene and the promoter DNA may be linked to the secretory signal peptide region before the introduction of the vector, or may be performed on the vector. By incorporating the constructed expression vector into a host microorganism using a general transformation method, the recombinant microorganism of the present invention can be produced.
ベクターへのＤＮＡの導入は、当該分野で通常使用される任意の方法に従って行うことができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、上記で構築した制限酵素切断配列を端部に有するプロモーターＤＮＡを添加することによって、プロモーターＤＮＡをベクターに導入することができる（制限酵素法）。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）等が好ましい。 DNA can be introduced into a vector according to any method commonly used in the art. For example, a promoter DNA can be introduced into a vector by cleaving the vector with a restriction enzyme and adding a promoter DNA having the restriction enzyme cleavage sequence constructed as described above to the end thereof (restriction enzyme method). The vector for introduction is not particularly limited, but pHY300PLK (Takara) and the like are preferable.
あるいは本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、当該微生物のゲノム上に存在していてもよい。これらの領域、又はこれらにさらに分泌シグナルペプチド領域を連結させて構築したＤＮＡ断片と、宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合させたＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法等によって作製し、これを相同組み換えによって宿主微生物のゲノムに直接組み込むことによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。 Alternatively, in the recombinant microorganism of the present invention, the liaIH promoter DNA or DNA corresponding thereto and the target gene may be present on the genome of the microorganism. A DNA fragment constructed by linking these regions, or a DNA fragment constructed by further linking a secretory signal peptide region to these regions and an appropriate homologous region with the host microorganism genome, is prepared by the SOE-PCR method, etc. The recombinant microorganism of the present invention can be produced by direct integration into the genome of the host microorganism by recombination.
本発明の組換え微生物を用いることにより、標的遺伝子にコードされた目的遺伝子産物を効率的に生産することができる。従って、本発明はまた、当該組換え微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法を提供する。本方法においては、当該微生物を培養するとともに、当該微生物に細胞壁ストレスを負荷する。細胞壁ストレスに応じて活性化された当該微生物中のＬｉａＲＳ二成分制御系又はこれに相当する二成分制御系によってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターがアップレギュレートされ、それによって当該プロモーターの下流に連結された標的遺伝子の転写が促進されて当該遺伝子にコードされた目的遺伝子産物が発現する。培養終了後、目的遺伝子産物を採取する。必要に応じて、採取した遺伝子産物をさらに精製してもよい。 By using the recombinant microorganism of the present invention, the target gene product encoded by the target gene can be efficiently produced. Therefore, the present invention also provides a method for producing a target gene product using the recombinant microorganism. In this method, the microorganism is cultured and cell wall stress is applied to the microorganism. The liaIH promoter or the equivalent promoter is up-regulated by the LiaRS two-component control system in the microorganism activated in response to cell wall stress or the two-component control system corresponding thereto, and is linked downstream of the promoter. Transcription of the target gene is promoted, and the target gene product encoded by the gene is expressed. After completion of the culture, the target gene product is collected. If necessary, the collected gene product may be further purified.
上記方法で使用する組換え微生物の培養のための培地は、同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む、当該組換え微生物の親微生物の培養に通常使用される培地であればよい。細胞壁ストレスとしては、上述したような、微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられる。好ましくは、細胞壁ストレスは、上述したような抗生物質である。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。 The medium for culturing the recombinant microorganism used in the above method is a medium usually used for culturing the parent microorganism of the recombinant microorganism, including an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components. Good. Examples of the cell wall stress include factors known in the art as cell wall stress for microorganisms as described above. Preferably, the cell wall stress is an antibiotic as described above. Among these, enduracidin, vancomycin and bacitracin are preferable, and enduracidin is more preferable.
従来の報告では、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターのみならずｙｈｃＹプロモーターにも結合するとされてきた（例えば、特許文献３）。しかし、本発明者らの研究から、下記参考例２に示されるように、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターと極めて特異的に結合することが新たに見出された。さらに、後記実施例に示すように、二成分制御系ＬｉａＲＳによるｌｉａＩＨプロモーターのアップレギュレーションは、従来知られたｌａｃプロモーターやｘｙｌｏｓｅプロモーターと比較して非常に強力である。従って、ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとを組み合わせて利用することによって、標的遺伝子の転写を極めて特異的且つ強力に誘導することが可能となる。ＬｉａＲＳ−ｌｉａＩＨプロモーター系は、発現制御のためのツールとして非常に有用である。 According to a conventional report, LiaR has been bound not only to the liaIH promoter but also to the yhcY promoter (for example, Patent Document 3). However, as shown in Reference Example 2 below, the present inventors have newly found that LiaR binds very specifically to the liaIH promoter. Furthermore, as shown in the Examples described later, the upregulation of the liaIH promoter by the two-component control system LiaRS is very strong as compared with the conventionally known lac promoter and xyrose promoter. Therefore, by using a combination of the LiaR and liaIH promoters, it becomes possible to induce the transcription of the target gene very specifically and strongly. The LiaRS-liaIH promoter system is very useful as a tool for expression control.
従って、本発明によれば、標的遺伝子の転写を高度に特異的且つ強力に促進することができる。または本発明によれば、目的の遺伝子産物を、高度に特異的且つ高効率に生産することが可能となる。本発明の目的遺伝子産物の生産方法においては、遺伝子発現を高度且つ遺伝子特異的に制御することができるため、実質的に目的以外の遺伝子産物を生産することがなく、目的産物のみを効率よく生産することが可能となる。従って、本発明の生産方法によれば、目的産物を経済的且つ高純度で生産することが可能になる。 Therefore, according to the present invention, transcription of a target gene can be promoted highly specifically and strongly. Alternatively, according to the present invention, the target gene product can be produced with high specificity and high efficiency. In the production method of a target gene product of the present invention, gene expression can be controlled at a high level and gene-specifically, so that only a target product is efficiently produced without substantially producing a non-target gene product. It becomes possible to do. Therefore, according to the production method of the present invention, the target product can be produced economically and with high purity.
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例で使用したプライマー及び菌株の一覧を下記表２−１〜２−２及び表３に示す。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. Lists of primers and strains used in the following examples are shown in Tables 2-1 to 2-2 and Table 3 below.
実施例１ プラスミド作製
（１）ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３７と３８（配列番号３７及び３８）によって増幅したｌｉａＩの３’末端領域のＰＣＲ断片を、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ（Ishikawa et al., Mol. Microbiol., 2006, 60(6):1364-80）のＳａｌＩ、ＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって、ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ（図３参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
Example 1 Plasmid construction (1) pMutin12His-liaR
The PCR fragment of the 3 ′ end region of liaI amplified with primers 37 and 38 (SEQ ID NOs: 37 and 38) using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168 strain as a template was digested with SalI and XhoI to obtain a DNA fragment. This DNA fragment was cloned into the SalI and XhoI sites of pMutin12His (Ishikawa et al., Mol. Microbiol., 2006, 60 (6): 1364-80) to prepare pMutin12His-liaR (see FIG. 3). About the obtained clone, the insertion base sequence was confirmed by sequencing.
（２）ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３９と４０（配列番号３９及び４０）によって増幅したＰｌｉａＩ (-120 to +84)のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤＬ２（Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146(Pt 7):1573-83）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)（図４参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
(2) pDL2-liaI (-120 to +84)
A PCR fragment of PliaI (-120 to +84) amplified with primers 39 and 40 (SEQ ID NOs: 39 and 40) using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168 strain as a template was digested with EcoRI and BamHI to obtain a DNA fragment. By cloning this DNA fragment into the EcoRI and BamHI cleavage sites of pDL2 (Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146 (Pt 7): 1573-83), pDL2-liaI (−120 to +84) (FIG. 4). Reference) was made. About the obtained clone, the insertion base sequence was confirmed by sequencing.
（３）ｐＸ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４１と４２（配列番号４１及び４２）によって増幅したｌｉａＨのＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＸ（Kim et al., Gene, 1996, 181:71-76）のＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＸ−ｌｉａＨ（図５参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
(3) pX-liaH
The PCR fragment of liaH amplified by primers 41 and 42 (SEQ ID NOs: 41 and 42) using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168 as a template was digested with SpeI and BamHI to obtain a DNA fragment. PX-liaH (see FIG. 5) was prepared by cloning this DNA fragment into the SpeI and BamHI cleavage sites of pX (Kim et al., Gene, 1996, 181: 71-76). About the obtained clone, the insertion base sequence was confirmed by sequencing.
（４）ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４３と４４（配列番号４３及び４４）によって増幅したＰＣＲ断片を、ｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢＰリアクションによる組み替えによって挿入した。構築されたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入し、導入株をＫｍ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
(4) pDONR-liaH
A PCR fragment amplified with primers 43 and 44 (SEQ ID NOs: 43 and 44) using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168 as a template was inserted into pDONR201 (Invitrogen) by recombination by BP reaction. The constructed plasmid was introduced into Escherichia coli DH5a strain, and the introduced strain was selected with a Km resistance marker to obtain pDONR-liaH (see FIG. 6) from the selected strain. About the obtained clone, the insertion base sequence was confirmed by sequencing.
（５）ｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ
ｐＡＰＮＣ２１３（Morimoto et al., Microbiology, 2002, 148(Pt 11):3539-52）のマルチクローニングサイトに、ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をＧａｔｅｗａｙベクターコンバージョンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって導入し、ｐＡＰＮＣＧＷ（図６参照）を作製した。このｐＡＰＮＣＧＷと上記ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨとの間で、ＬＲリアクションによる組み換え反応を行い、得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入した。導入株をＡｍｐ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはＰＣＲにより目的配列の挿入を確認した。
(5) pAPNCGW-liaH
Gateway cloning system (Invitrogen) was introduced into the multicloning site of pAPNC213 (Morimoto et al., Microbiology, 2002, 148 (Pt 11): 3539-52) by Gateway vector conversion system (Invitrogen), and pAPNCGW (see FIG. 6). ) Was produced. A recombination reaction by LR reaction was performed between this pAPNCGW and the above pDONR-liaH, and the resulting plasmid was introduced into E. coli DH5a strain. The introduced strain was selected by the Amp resistance marker, and pAPNCGW-liaH (see FIG. 6) was obtained from the selected strain. About the obtained clone, insertion of the target sequence was confirmed by PCR.
（６）ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４９と５０（配列番号４９及び５０）によって増幅したｌｉａＩコーディング領域のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩにより消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍａｒｓｈａｍ）のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位にクローニングすることによって、ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ（図７参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
(6) pGEX-liaR
The PCR fragment of the liaI coding region amplified with primers 49 and 50 (SEQ ID NOs: 49 and 50) using the genomic DNA of Bacillus subtilis 168 as a template was digested with EcoRI and SalI, and the resulting DNA fragment was pGEX-4T-1. PGEX-liaR (see FIG. 7) was prepared by cloning into the EcoRI and SalI sites of (Amarsham). About the obtained clone, the insertion base sequence was confirmed by sequencing.
実施例２ 菌株作製
（１）ＢＡＢ１〜ＢＡＢ６：ｌｉａＩＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株
ノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）に従って、下記のとおりＢＡＢ１〜ＢＡＢ６株を作製した。
Example 2 Strain preparation (1) BAB1 to BAB6: liaIHGFSR No-marker deleted strains BAB1 to BAB6 strains were prepared as described below according to the no-marker deletion method (Japanese Patent Application No. 2009-044193).
（ＢＡＢ１：ｌｉａＩノーマーカー削除株）
枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＰＮＣ−Ｆプライマー（５１）とｃｈｐＡ−Ｒプライマー（５２）（配列番号５１及び５２）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域の５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）を、それぞれプライマー１と２（配列番号１及び２）、３と４（配列番号３及び４）及び５と６（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
次に、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）、ならびにプライマー１と６（配列番号１及び６）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77(1):61-68）を行った。これにより、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡ断片（図２）を取得することができた。
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換方法（J. Bacteriol., 1967, 93(6):1925-1937）に従って、枯草菌１６８株を形質転換した。形質転換は、ＰＣＲ産物を２０μｇ以上用いて行った。
得られた形質転換体を、供与体ＤＮＡに含まれるスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。すなわち、上記形質転換処理後の細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、コロニーを得た。この培養によれば、第１相同組み換え（図２）によって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をＬＢ液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を１ｍＭ ＩＰＴＧを入れたＬＢ寒天プレートに塗布した。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換え（図２）によって、欠失対象領域とともに供与体ＤＮＡが宿主ＤＮＡから欠失したｌｉａＩノーマーカー削除株である。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＩ遺伝子の欠失を確認した。
(BAB1: liaI no marker deleted strain)
PCR was performed using APNC-F primer (51) and chpA-R primer (52) (SEQ ID NOs: 51 and 52) using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 (aprE :: spec, lacI, Pspac-chpA) as a template. went. The amplified DNA fragment is referred to as a selectable marker gene cassette. In addition, using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 as a template, the 5 ′ outer region (fragment A), 3 ′ outer region (fragment B) and upstream of the first homologous recombination region (fragment C) of the region to be deleted were respectively primer Amplification was performed by PCR using 1 and 2 (SEQ ID NOs: 1 and 2), 3 and 4 (SEQ ID NOs: 3 and 4), and 5 and 6 (SEQ ID NOs: 5 and 6).
Next, the selectable marker gene cassette obtained by PCR, 5 ′ outer region (fragment A), 3 ′ outer region (fragment B) and upstream of the first homologous recombination region (fragment C), and primers 1 and 6 (sequence) The SOE-PCR method (Gene, 1989, 77 (1): 61-68) was performed using the numbers 1 and 6). Thereby, the donor DNA fragment in which the 5 ′ outer region (fragment A), 3 ′ outer region (fragment B), selection marker gene cassette and upstream of the first homologous recombination region (fragment C) are arranged in this order (FIG. 2). Was able to get.
168 strains of Bacillus subtilis were transformed using the donor DNA obtained as described above according to the competent cell transformation method (J. Bacteriol., 1967, 93 (6): 1925-1937). Transformation was performed using 20 μg or more of PCR product.
The obtained transformant was selected using a spectinomycin resistance gene contained in the donor DNA. That is, the cells after the transformation treatment were cultured overnight at 37 ° C. on an LB agar plate medium containing 100 μg / ml spectinomycin to obtain colonies. According to this culture, only the Bacillus subtilis exhibiting resistance to spectinomycin grows by incorporating the donor DNA by the first homologous recombination (FIG. 2).
Next, the transformant selected using spectinomycin resistance as an index was cultured overnight in an LB liquid medium, and the diluted culture was applied to an LB agar plate containing 1 mM IPTG. The transformed Bacillus subtilis grown on the IPTG-containing LB agar plate is a liaI no marker deletion strain in which the donor DNA is deleted from the host DNA together with the deletion target region by the second homologous recombination (FIG. 2). About the obtained strain | stump | stock, deletion of the liaI gene was confirmed by PCR method.
（ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６：ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株）
上記（１）の選択マーカー遺伝子カセット及び表２−１〜２−２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６を作製した。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＨＧＦＳＲ各遺伝子の欠失を確認した。
(BAB2 to BAB6: liaHGFSR no-marker deleted strain)
Using the selection marker gene cassette of (1) above and the primers described in Tables 2-1 to 2-2, riaHGFSR no-marker deleted strains BAB2 to BAB6 were prepared by performing the same procedure as described above. About the obtained strain | stump | stock, deletion of each liaHGFSR gene was confirmed by PCR method.
（２）ＢＡＢ７（１６８，ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ）株
枯草菌１６８野生株を、実施例１（１）で作製したｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲにより形質転換し、０．５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株として取得した。得られたｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株は、シークエンシングによりＬｉａＲのＣ末端に１２個のＨｉｓタグが付加していることを確認した（図３）。
(2) BAB7 (168, liaR-12His) strain Bacillus subtilis 168 wild strain was transformed with pMutin12His-liaR prepared in Example 1 (1), and on an LB agar plate medium containing 0.5 μg / ml erythromycin, The cells were cultured overnight at 37 ° C., and the obtained colonies were obtained as liaR-12His strain. The obtained liaR-12His strain was confirmed to have 12 His tags added to the C-terminus of LiaR by sequencing (FIG. 3).
（３）ＢＡＢ８（１６８，ａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（２）で作製したｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)により形質転換し、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株は、ＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺが挿入されていることを確認した（図４）。
(3) BAB8 (168, amyE :: PliaI (-120 to +84) -lacZ) strain pDL2- prepared in Example 1 (2) was prepared from the BAB2 strain (liaH deleted strain) prepared in Example 2 (1). The cells were transformed with liaI (−120 to +84), cultured on LB agar plate medium containing 5 μg / ml chloramphenicol at 37 ° C. overnight, and the resulting colonies were amyE :: PliaI (−120 to +84). 84) -lacZ strain. The obtained amyE :: PliaI (-120 to +84) -lacZ strain was confirmed by PCR to have PliaI (-120 to +84) -lacZ inserted in the Bacillus subtilis amyE region (FIG. 4).
（４）ＢＡＢ９（ＢＡＢ２，ａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（３）で作製したｐＸ−ｌｉａＨにより形質転換し、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｘｙｌが挿入されていることを確認した（図５）。
(4) BAB9 (BAB2, amyE :: Pxyl-liaH) strain The BAB2 strain (liaH deleted strain) prepared in Example 2 (1) was transformed with pX-liaH prepared in Example 1 (3), and 5 μg. The LB agar plate medium containing / ml chloramphenicol was cultured overnight at 37 ° C., and the obtained colonies were obtained as amyE :: Pxyl-liaH strain. The obtained amyE :: Pxyl-liaH strain was confirmed to have Pxyl inserted into the Bacillus subtilis amyE region by PCR (FIG. 5).
（５）ＢＡＢ１０（ＢＡＢ２，ａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ）株
枯草菌１６８野生株を実施例１（５）で作製したｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨにより形質転換し、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｐｒＥ領域にＰｓｐａｃ−ｌｉａＨが挿入されていることを確認した（図６）。
(5) BAB10 (BAB2, aprE :: Pspac-liaH) strain LB agar plate medium containing Bacillus subtilis 168 wild strain transformed with pAPNCGW-liaH prepared in Example 1 (5) and containing 100 μg / ml spectinomycin Then, the cells were cultured overnight at 37 ° C., and the obtained colonies were obtained as aprE :: Pspac-liaH strain. The obtained aprE :: Pspac-liaH strain was confirmed by PCR to have Pspac-liaH inserted into the Bacillus subtilis aprE region (FIG. 6).
実施例３ ＬｉａＲＳによる標的遺伝子転写誘導
（１）ｌｉａＩ転写誘導の抗生物質間での比較
（方法）
ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの調製： Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を付加したプライマー４７、４８（配列番号４７、４８）を作製し、これらプライマー４７、４８を用いて枯草菌野生株ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｌｉａＩ配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）のマニュアルに従いジゴキシゲニン標識を行った。
抗生物質ストレス負荷： 枯草菌野生株１６８、ならびに実施例２で作製したＢＡＢ６（ΔｌｉａＲ）及びＢＡＢ２（ΔｌｉａＨ）の各菌株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ添加して、１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製した。対照として、それぞれの株について抗生物質非添加条件でＲＮＡを調製した。トータルＲＮＡの調製はIgo & Losick （J. Mol. Biol., 1986, 191, 615-624.）の方法に従って行った。
ノーザンハイブリダイゼーション： 調製したトータルＲＮＡ １μｇを１％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｇａｒｏｓｅゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ）にブロッティングを行った。ブロッティング後のメンブランはＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてクロスリンク後、上記で調製したジゴキシゲニンラベルしたＲＮＡプローブを用いて６８℃で１０時間ハイブリダイゼーションを行った。シグナルの検出にはＣＳＰＤ（登録商標）ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
ウエスタンブロッティング： 実施例２で作製したｌｉａＲ−１２ｈｉｓ株（ＢＡＢ７）をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２になるまで培養し、次いで最終濃度０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ加えた後、０、１５、３０、４５、６０、７５分後に培養液を採取し、集菌した菌体のＯＤ＝６００が、１０ ＯＤ／ｍｌになるように０．５ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを加えた１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、３７℃で１０分間処理した。その後、１／４量の５×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃で５分間処理した。得られたサンプル２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロッティングし、その後、一次抗体Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体、次いで二次抗体Ａｎｔｉ−Ｒａｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）を膜に反応させ、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを検出した。
Example 3 Target gene transcription induction by LiaRS (1) Comparison of liaI transcription induction between antibiotics (method)
Preparation of RNA hybridization probe: Primers 47 and 48 (SEQ ID NOs: 47 and 48) to which a T7 RNA polymerase recognition sequence was added were prepared, and PCR was performed using these primers 47 and 48 using Bacillus subtilis wild-type genomic DNA as a template. The liaI sequence was amplified. The obtained PCR fragment was labeled with digoxigenin according to the manual of DIG Labeling Kit (Roche).
Antibiotic stress load: Bacillus subtilis wild strain 168 and each strain of BAB6 (ΔliaR) and BAB2 (ΔliaH) prepared in Example 2 were inoculated in LB medium at OD600 = 0.01, and OD600 = 0 at 37 ° C. Incubated to 2. Next, final concentrations of 0.025 μg / ml enduracidin and 50 μg / ml bacitracin were added, and the bacteria were collected after 15 minutes to prepare total RNA. As a control, RNA was prepared for each strain with no antibiotics added. Total RNA was prepared according to the method of Igo & Losick (J. Mol. Biol., 1986, 191, 615-624.).
Northern hybridization: 1 μg of the prepared total RNA was electrophoresed on a 1% formaldehyde-agarose gel and blotted on a nylon membrane (Hybond N + , Amersham Pharmacia). The membrane after blotting was cross-linked using a UV crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene), and then hybridized at 68 ° C. for 10 hours using the digoxigenin-labeled RNA probe prepared above. CSPD (registered trademark) ready to use (Roche) was used for signal detection.
Western blotting: The liaR-12his strain (BAB7) prepared in Example 2 was inoculated in LB medium at OD600 = 0.01, cultured at 37 ° C. until OD600 = 0.2, and then a final concentration of 0.1 μg. / Ml enduracidin and 100 μg / ml bacitracin are added, and then the culture solution is collected after 0, 15, 30, 45, 60, and 75 minutes. The collected cells have an OD = 600 of 10 OD / ml. The suspension was suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) supplemented with 0.5 mg / ml lysozyme and treated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, a 1/4 amount of 5 × SDS sample buffer was added and treated at 95 ° C. for 5 minutes. 2 μl of the obtained sample was subjected to SDS-PAGE, blotted on PVDF membrane Hybond-P (Amersham), and then primary antibody Anti-His-Tag antibody and then secondary antibody Anti-Rabbit IgG HRP conjugate (BioRad) The signal was detected using ECL plus (Amersham).
（結果）
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図８Ａに示す。抗生物質非添加の対照群及びｌｉａＲ削除株（ＢＡＢ６:レーン２）、ではｌｉａＩ遺伝子の転写誘導は見られなかった。一方、抗生物質を添加した野生株及びｌｉａＨ削除株（ＢＡＢ２:レーン３）では強い転写誘導が観察された。さらに、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、２０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上の転写が観察されたことから、ＬｉａＲＳ系によるｌｉａＩＨオペロンの転写誘導はｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎにより顕著に活性化されることが示された。
(result)
The result of Northern hybridization is shown in FIG. 8A. In the control group to which no antibiotic was added and the liaR-deleted strain (BAB6: lane 2), transcription induction of the liaI gene was not observed. On the other hand, strong transcriptional induction was observed in the wild strain to which antibiotics were added and the liaH deleted strain (BAB2: lane 3). Furthermore, in the enduracidin addition group, transcription equal to or higher than that in the bacitracin addition group was observed despite the addition concentration of 1/2000. Thus, the transcription induction of the liaIH operon by the LiaRS system was significantly activated by enduracidin. Rukoto has been shown.
ウエスタンブロッティングの結果を図８Ｂに示す。ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、１０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上のＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。また、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎによる転写活性化がストレス負荷後６０分程度で終息するのに対し、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、ストレス負荷後７５分を経過してもなお高いＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。 The result of Western blotting is shown in FIG. 8B. In the enduracidin addition group, the induction | guidance | derivation of the LiaR-His protein more than equivalent to a bacitracin addition group was observed irrespective of the addition density of 1/1000. In contrast, transcriptional activation by bacitracin ended about 60 minutes after stress loading, whereas in the enduracidin addition group, high induction of LiaR-His protein was observed even after 75 minutes after stress loading.
（２）異なるストレス因子間での転写誘導の比較
（方法）
細胞壁ストレス負荷： 実施例２で作製したＢＡＢ８株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養し、次いで様々な細胞壁ストレスを加え、３０分後に集菌した。細胞ストレスは０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、２μｇ／ｍｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、４％エタノール、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ならびに３０℃および４０℃の熱ショックをそれぞれ行った。対照として抗生物質非添加群を調製した。
ＬａｃＺアッセイ： ＬａｃＺアッセイはYoungman et al.（In Molecular Biology of Microbial Differentation. 1985, American Society for Microbiology Washington D.C., pp47-54）の方法に従った。細胞を１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１００μｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む、２００μｌ Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ４、０．０４Ｍ ＮａＨ2ＰＯ４、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4、０．００１Ｍ ＤＴＴ）に懸濁し、３７℃で２０分インキュベートして細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心を行い、得られた上清５０μｌに０．４ｍｇ／ｍｌ ＭＵＧ１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、９５℃で１０分間処理して反応を停止させた。４ＭＵの蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。また、上清のタンパク質量はＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、サンプル間の補正に使用した。
(2) Comparison of transcription induction between different stress factors (method)
Cell wall stress load: BAB8 strain prepared in Example 2 was inoculated in LB medium at OD600 = 0.01, cultured at 37 ° C. to OD600 = 0.2, and then various cell wall stresses were added and collected after 30 minutes. Fungus. For cell stress, 0.1 μg / ml enduracidin, 100 μg / ml bacitracin, 2 μg / ml vancomycin, 4% ethanol, 0.6 M NaCl, and heat shock at 30 ° C. and 40 ° C. were performed, respectively. As a control, an antibiotic-free group was prepared.
LacZ assay: The LacZ assay followed the method of Youngman et al. (In Molecular Biology of Microbial Differentiation. 1985, American Society for Microbiology Washington DC, pp47-54). Cells suspended in 200 μl Z buffer (0.06 M Na 2 HPO4, 0.04 M NaH 2 PO4, 0.01 M KCl, 0.001 M MgSO 4 , 0.001 M DTT) containing 10 μg / ml DNase I, 100 μg / ml lysozyme Incubate at 37 ° C for 20 minutes to lyse cells, centrifuge at 14,000 rpm for 2 minutes at 4 ° C, add 10 µl of 0.4 mg / ml MUG to 50 µl of the resulting supernatant, and react at 37 ° C for 10 minutes. After that, the reaction was stopped by treatment at 95 ° C. for 10 minutes. The fluorescence of 4MU was measured using Fluoroscan II (Labsystems). The amount of protein in the supernatant was quantified using Protein assay reagent (BioRad) and used for correction between samples.
（結果）
ＬａｃＺアッセイの結果を図９に示す。ＢＡＢ８株において、ＰｌｉａＩＨの転写量のレポーターであるＬａｃＺの活性が抗生物質によって顕著に向上した。特に、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎの１０００分の１、及びｖａｎｃｏｍｙｃｉｎの２０分の１の濃度で高い効果を示した。またエタノールによって僅かにＰｌｉａＩＨからの転写の誘導が観察された。
(result)
The results of the LacZ assay are shown in FIG. In the BAB8 strain, the activity of LacZ, which is a reporter of the transcription amount of PliaIH, was significantly improved by antibiotics. In particular, enduracidin was highly effective at concentrations of 1/1000 of bacitracin and 1/20 of vancomycin. In addition, a slight induction of transcription from PliaIH was observed with ethanol.
（３）異なるプロモーター間での転写誘導の比較
（方法）
野生株１６８株、実施例２で作製したＢＡＢ９株及びＢＡＢ１０株をそれぞれＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで、１６８株の培地には０．０５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを、ＢＡＢ９株の培地には２％ ｘｙｌｏｓｅを、ＢＡＢ１０株には１ｍＭ ＩＰＴＧをそれぞれ添加した。１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製し、（１）と同様の手順でノーザンハイブリダイゼーションを行った。
結果を図１０に示す。ＬｉａＲＳ系による転写誘導は、ＩＰＴＧやキシロースによる誘導と比較して顕著に強力であった。
(3) Comparison of transcription induction between different promoters (method)
The wild strain 168 strain and the BAB9 strain and BAB10 strain prepared in Example 2 were each inoculated in LB medium at OD600 = 0.01, and cultured at 37 ° C. until OD600 = 0.2. Subsequently, 0.05 μg / ml enduracidin was added to the medium of the 168 strain, 2% xyrose was added to the medium of the BAB9 strain, and 1 mM IPTG was added to the BAB10 strain. Bacteria were collected after 15 minutes, total RNA was prepared, and Northern hybridization was performed in the same procedure as (1).
The results are shown in FIG. Transcription induction by the LiaRS system was remarkably stronger than induction by IPTG or xylose.
参考例１ ＬｉａＲ結合領域の同定
（１）方法
（ＧＳＴ−ＬｉａＲ融合タンパク質の精製）
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に実施例１で作製したｐＧＥＸ ４．１−ｌｉａＲを導入し、ＬＢ培地で３０℃にて一晩培養した培養液を８００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ０．０１になるように殖菌し、３０℃でＯＤ０．５まで培養した。この培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに３時間培養した。この細胞を遠心機により集菌し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）２０ｍｌに再懸濁し、超音波により破砕した。この細胞破砕液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心を行い、ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥ）を用い、添付マニュアルに従い精製を行った。
（ゲルシフトアッセイ）
ＤＮＡ断片はｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５までの１２１ｂｐを、プライマー４５、４６（配列番号４５、４６）を用いてＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）と［γ32Ｐ］ＡＴＰとを３７℃で３０分反応させることにより標識した。標識したＤＮＡはＮｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。ＤＮＡとタンパク質の結合反応は２５ｐｍｏｌ（５０００ｃｐｍ）のｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ、１μｌ Ｐｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ、５×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）とＧＳＴ−ＹｖｑＣ ｐｒｏｔｅｉｎ（０−５０ｐｍｏｌ）と水をトータル１５μｌになるように混ぜ、３０℃で１５分間インキュベーションを行ったあと、５％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。シグナルはイメージングプレートとＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ）を用いて検出を行った。
Reference Example 1 Identification of LiaR binding region (1) Method (purification of GST-LiaR fusion protein)
The pGEX 4.1-liaR prepared in Example 1 was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS strain, and the culture solution cultured overnight at 30 ° C. in LB medium was adjusted to OD0.01 in 800 ml of LB medium. Inoculated and cultured at 30 ° C. to OD 0.5. IPTG having a final concentration of 1 mM was added to the culture and further cultured for 3 hours. The cells are collected by a centrifuge and resuspended in 20 ml of phosphate-buffered saline (PBS; 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , pH 7.3). And crushed by ultrasonic. The cell lysate was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and purified using GST Purification Module (GE) according to the attached manual.
(Gel shift assay)
The DNA fragment was amplified by PCR using primers 45 and 46 (SEQ ID NOs: 45 and 46) of 121 bp from −95 to +25 of the transcription start point of liaI. This PCR product was labeled by reacting T4 polynucleotide kinase (Takara) with [γ 32 P] ATP at 37 ° C. for 30 minutes. The labeled DNA was purified by Nick column (Pharmacia). The binding reaction between DNA and protein was 25 pmol (5000 cpm) of labeled DNA, 1 μl Poly dI-dC, 5 × binding buffer (100 mM Tris-Cl pH 7.4, 25 mM MgCl 2 , 250 mM KCl, 250 μg / ml BSA, 10 μg / ml salmon) Sperm DNA, 50% glycerol, 1 mM EDTA), GST-YvqC protein (0-50 pmol) and water are mixed to a total of 15 μl, incubated at 30 ° C. for 15 minutes, and then subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis. went. The signal was detected using an imaging plate and BAS2000 (Fuji film).
（２）結果
ゲルシフトアッセイの結果を図１１に示す。ｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５領域（図１１Ｂ）とＬｉａＲタンパク質との結合量は、ＬｉａＲタンパク質の濃度とともに増加した（図１１Ａ）。よって当該−９５から＋２５領域とＬｉａＲタンパク質とが能動的に結合していることが示された。
(2) Results The results of the gel shift assay are shown in FIG. The amount of binding between the liaI transcription initiation point from −95 to +25 region (FIG. 11B) and the LiaR protein increased with the concentration of the LiaR protein (FIG. 11A). Therefore, it was shown that the -95 to +25 region and the LiaR protein were actively bound.
参考例２ ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとの結合の特異性
（１）方法
（ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐアッセイ）
ＣｈＡＰ法によるＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の精製は、Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法（Ishikawa et al., DNA Res. 2007, 14(4) 155-168）の方法を改変して行った。ＬＢ液体培地、３７℃で一晩培養した１６８ ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株を４００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１になるように殖菌し、Ｏ．Ｄ６００＝０．２まで培養した後に最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌのｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを加えた。対照として、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ非添加群を作製した。さらに３０分培養後、最終濃度１％のホルムアルデヒドを加え、３７℃で３０分間クロスリンク処理を行った。その後、細胞を遠心して集菌し、３ｍｌのＵＴ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波により破砕した。この細胞液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、上清からＮｉビーズを用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓの精製を行った。その後、上記Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従い、枯草菌用に作られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（ＢＳＴＩＬＥ２ｂ520515F）を用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の枯草菌ＤＮＡ結合部位の解析を行い、結果をＩＭＣ ＡＥ（Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｂｉｏｌｏｇｙ）プログラムにより視覚化した。
Reference Example 2 Specificity of LiaR and LiaIH Promoter Binding (1) Method (ChAP-chip assay)
Purification of the LiaR-12His protein by the ChAP method was performed by modifying the method of Ishikawa et al. (Ishikawa et al., DNA Res. 2007, 14 (4) 155-168). The 168 liaR-12His strain cultured overnight at 37 ° C. in LB liquid medium was inoculated to 400 ml of LB medium so that OD600 = 0.01. After culturing to D600 = 0.2, enduracidin at a final concentration of 0.025 μg / ml was added. As a control, an enduracidin non-added group was prepared. After further incubation for 30 minutes, formaldehyde with a final concentration of 1% was added, and a cross-linking treatment was performed at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, suspended in 3 ml of UT buffer, and disrupted by ultrasonic waves. This cell solution was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and LiaR-12His was purified from the supernatant using Ni beads. After that, according to the method of Ishikawa et al., The bacterium Bacillus subtilis DNA binding site of LiaR-12His protein was analyzed using Affymetrix GeneChip (BSTILE2b520515F) prepared for Bacillus subtilis, and the result was analyzed by IMC AE (In silico biology) program. Visualized.
（２）結果
ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを負荷した場合、ｙｖｑＩ（ｌｉａＩ）から下流において遺伝子の転写が強力に誘導された。一方、対照群においてはｙｖｑ（ｌｉａ）遺伝子の転写誘導は見られなかった（図１２Ａ）。これらの結果は、上記ノーザンハイブリダイゼーション及びＬａｃＺ解析の結果と一致する。また、ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐ解析（図１２Ｂ）により、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が枯草菌ｌｉａＩＨプロモーター領域に特異的に結合することが示された。ゲノム全体における解析において、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が結合する箇所は上記ｌｉａＩＨプロモーター領域のみであった。
(2) Results When enduracidin was loaded, gene transcription was strongly induced downstream from yvqI (liaI). On the other hand, no transcriptional induction of the yvq (lia) gene was observed in the control group (FIG. 12A). These results are in agreement with the results of the Northern hybridization and LacZ analysis. Moreover, ChAP-chip analysis (FIG. 12B) showed that the LiaR-12His protein specifically binds to the Bacillus subtilis liaIH promoter region. In the analysis of the whole genome, the location where the LiaR-12His protein binds was only the liaIH promoter region.
Claims (12)
ｌｉａＲ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、ｌｉａＳ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡとを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに
該微生物にｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを添加して該ｌｉａＲ遺伝子又はこれに相当する遺伝子及び該ｌｉａＳ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程
を含み、
該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡが、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つ該ｌｉａＲ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現産物に結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡであり、
該ｌｉａＲ遺伝子に相当する遺伝子が、該ｌｉａＲ遺伝子の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲＳ二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ｌｉａＳ遺伝子に相当する遺伝子が、該ｌｉａＳ遺伝子の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲＳ二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子である、
方法。 A method of promoting transcription of a target gene in a microorganism,
a gene corresponding to liaR gene or which, the gene corresponding to liaS gene or which, in a microorganism having the DNA corresponding to liaIH promoter DNA or this target downstream of DNA corresponding to the liaIH promoter DNA or this step operably linked to a gene, as well as viewing including the step of activating the expression of genes corresponding to genes and the liaS gene or which corresponds to said liaR gene or which was added to enduracidin the microorganism,
DNA corresponding to the liaIH promoter DNA has a base sequence having 90% or more identity to the base sequence of the liaIH promoter DNA, and is bound to the expression product of the liaR gene or a gene corresponding thereto. DNA that functions as a promoter,
The gene corresponding to the liaR gene has a base sequence having 90% or more identity to the base sequence of the liaR gene, and encodes a protein that functions as a regulator of the LiaRS binary control system ,
The gene corresponding to the liaS gene has a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence of the liaS gene, and encodes a histidine kinase that functions as a sensor of the LiaRS binary control system. is there,
Method.
ｌｉａＲ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、ｌｉａＳ遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡとを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に標的遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物に、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを添加する工程を含み、
該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡが、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つ該ｌｉａＲ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現産物に結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡであり、
該ｌｉａＲ遺伝子に相当する遺伝子が、該ｌｉａＲ遺伝子の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲＳ二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子であり、
該ｌｉａＳ遺伝子に相当する遺伝子が、該ｌｉａＳ遺伝子の塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲＳ二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子である、
方法。 A method for producing a gene product encoded by a target gene, comprising:
a gene corresponding to liaR gene or which, the gene corresponding to liaS gene or which has a DNA corresponding to liaIH promoter DNA or this, and the target gene downstream of the liaIH promoter DNA or equivalent DNA to Adding enduracidin to a recombinant microorganism to which is operably linked ,
DNA corresponding to the liaIH promoter DNA has a base sequence having 90% or more identity to the base sequence of the liaIH promoter DNA, and is bound to the expression product of the liaR gene or a gene corresponding thereto. DNA that functions as a promoter,
The gene corresponding to the liaR gene has a base sequence having 90% or more identity to the base sequence of the liaR gene, and encodes a protein that functions as a regulator of the LiaRS binary control system ,
The gene corresponding to the liaS gene has a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence of the liaS gene, and encodes a histidine kinase that functions as a sensor of the LiaRS binary control system. is there,
Method.
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