JP5641939B2 - Mutant reverse transcription DNA polymerase - Google Patents
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Description
本発明は、変異型逆転写DNAポリメラーゼに関する。また本発明は、変異型逆転写DNAポリメラーゼを用いRNAを鋳型としてcDNAを合成又は増幅する方法に関する。 The present invention relates to a mutant reverse transcription DNA polymerase. The present invention also relates to a method of synthesizing or amplifying cDNA using mutant reverse transcription DNA polymerase using RNA as a template.
RNAを鋳型としてそれに相補的なDNA（complementary DNA；cDNA）を合成する反応が知られており、この反応は逆転写反応と呼ばれる。DNAポリメラーゼのうちこの逆転写反応を触媒する活性（逆転写活性）を有するものは逆転写酵素と呼ばれる。 A reaction for synthesizing complementary DNA (cDNA) using RNA as a template is known, and this reaction is called reverse transcription reaction. A DNA polymerase having an activity to catalyze this reverse transcription reaction (reverse transcription activity) is called reverse transcriptase.
mRNAに対応するcDNAの合成は分子生物学分野の研究活動において非常に重要であり、逆転写酵素がこのために広く利用されている。 Synthesis of cDNA corresponding to mRNA is very important in research activities in the field of molecular biology, and reverse transcriptase is widely used for this purpose.
また、RNAを鋳型としてcDNAを迅速かつ正確に数千倍から数万倍に増幅する、逆転写PCR（Reverse Transcription-PCR: RT-PCR）は、組織や細胞における遺伝子発現研究のための強力なツールとして活用されており、逆転写酵素がこのためにも広く利用されている。 Reverse transcription-PCR (RT-PCR) is a powerful tool for gene expression studies in tissues and cells that can rapidly and accurately amplify cDNA from thousands to tens of thousands of times using RNA as a template. It is used as a tool, and reverse transcriptase is also widely used for this purpose.
従来、逆転写酵素としてはレトロウイルス（retrovirus）由来の逆転写活性を有するDNAポリメラーゼが用いられてきた。しかしながら、これらの逆転写酵素はタンパク質変性を起こしやすく不安定であった。そのため、これらの逆転写酵素を使用する場合はそのタンパク質変性を回避するために比較的低温での逆転写反応を余儀なくされるが、そのような低温条件下ではRNAの高次構造が維持されたままとなるため逆転写反応が進みにくいという問題点があった。 Conventionally, DNA polymerase having reverse transcription activity derived from retrovirus has been used as a reverse transcriptase. However, these reverse transcriptases are prone to protein denaturation and are unstable. Therefore, when these reverse transcriptases are used, reverse transcription reaction at a relatively low temperature is required in order to avoid protein denaturation, but the higher order structure of RNA was maintained under such low temperature conditions. As a result, the reverse transcription reaction is difficult to proceed.
そこで、逆転写活性と耐熱性とを兼ね備える逆転写酵素が求められている。そのような逆転写酵素として、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来のDNAポリメラーゼ、及びそのアミノ酸置換体が報告されている（特許文献１）。また、Thermus sp Z05由来DNAポリメラーゼとThermotoga maritima由来のDNAポリメラーゼとからなるキメラタンパク質のアミノ酸置換体が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、これらのDNAポリメラーゼは逆転写活性及び耐熱性の面でさらに改良すべき点があった。 Therefore, there is a need for a reverse transcriptase that has both reverse transcription activity and heat resistance. As such reverse transcriptase, DNA polymerase derived from Thermotoga maritima and amino acid substitution products thereof have been reported (Patent Document 1). An amino acid substitution product of a chimeric protein comprising a DNA polymerase derived from Thermus sp Z05 and a DNA polymerase derived from Thermotoga maritima has been reported (Non-patent Document 1). However, these DNA polymerases should be further improved in terms of reverse transcription activity and heat resistance.
本発明は、逆転写活性及び耐熱性に優れるDNAポリメラーゼを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a DNA polymerase excellent in reverse transcription activity and heat resistance.
また、本発明は、効率性に優れるcDNA合成方法又は増幅方法を提供することも別の課題とする。 Another object of the present invention is to provide a cDNA synthesis method or amplification method that is excellent in efficiency.
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討した結果、配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている変異型DNAポリメラーゼが、逆転写活性と耐熱性に優れていることを見出した。また、本発明者らは、326番目、408番目、及び438番目アミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている変異型DNAポリメラーゼが、逆転写活性と耐熱性に加えて3’-5’エキソヌクレアーゼ活性にも優れていることも見出した。本発明者らは、とりわけ326番目と408番目のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている変異型DNAポリメラーゼは、逆転写活性と耐熱性、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性いずれにも優れていることも見出した。さらに本発明者らは、当該変異型DNAポリメラーゼがcDNA合成及びcDNA増幅において有用であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。
As a result of investigations to solve the above problems, the present inventors have selected from the group consisting of
１．ポリペプチド（変異型逆転写DNAポリメラーゼ）
（１−１）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−２）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−３）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、329番目及び／又は384番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−４）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−５）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、408番目、及び438番目アミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−６）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目及び408番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−７）以下の(A)又は(B)のポリペプチド：
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目のアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。
（１−８）(B)のポリペプチドが、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、(A)のアミノ酸置換が維持された状態で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチドである、（１−１）〜（１−７）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１−９）(B)のポリペプチドが、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において(A)のアミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して95％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチドである、（１−１）〜（１−７）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１−１０）(B)のポリペプチドが、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において(A)のアミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して97％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチドである、（１−１）〜（１−７）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１−１１）(B)のポリペプチドが、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において(A)のアミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して99％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチドである、（１−１）〜（１−７）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１−１２）逆転写酵素である、（１−１）〜（１−１１）いずれかに記載のポリペプチド。 1. Polypeptide (mutant reverse transcription DNA polymerase)
(1-1) The following polypeptide (A) or (B):
(A) Poly in which at least one amino acid selected from the group consisting of the 326th, 329th, 384th, 388th, 408th, and 438th amino acids is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 peptide;
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-2) The following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide in which at least one amino acid selected from the group consisting of
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-3) The following polypeptide (A) or (B):
(A) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 329th and / or 384th amino acid is substituted with alanine, and at least one selected from the group consisting of the 388th, 408th, and 438th amino acids A polypeptide in which the amino acid is replaced by alanine;
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-4) The following polypeptide (A) or (B):
(A) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 326th amino acid is substituted with alanine, and at least one amino acid selected from the group consisting of the 388th, 408th, and 438th amino acids is substituted with alanine The polypeptide being treated;
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-5) The following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide in which at least one amino acid selected from the group consisting of
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-6) The following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide in which at least one amino acid selected from the group consisting of
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-7) The following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide in which the 326th amino acid is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution, and having reverse transcription activity peptide.
(1-8) In the polypeptide of (B), one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the amino acid substitution of (A). The polypeptide according to any one of (1-1) to (1-7), which is a polypeptide having an amino acid sequence and having reverse transcription activity.
(1-9) In the polypeptide of (B), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution of (A) in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) Thus, a polypeptide comprising an amino acid sequence modified within the range of homology of 95% or more with respect to the amino acid sequence of the polypeptide of (A) and having reverse transcription activity (1-1) to The polypeptide according to any one of (1-7).
(1-10) In the polypeptide of (B), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution of (A) in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) Thus, a polypeptide comprising an amino acid sequence modified within the range of homology of 97% or more to the amino acid sequence of the polypeptide of (A) and having reverse transcription activity (1-1) to The polypeptide according to any one of (1-7).
(1-11) In the polypeptide of (B), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution of (A) in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) Thus, it is a polypeptide comprising an amino acid sequence modified within a range of homology of 99% or more with respect to the amino acid sequence of the polypeptide of (A) and having reverse transcription activity (1-1) to The polypeptide according to any one of (1-7).
(1-12) The polypeptide according to any one of (1-1) to (1-11), which is a reverse transcriptase.
２．cDNA合成キット
（２−１）（１−１）〜（１−１２）いずれかに記載のポリペプチドを含むcDNA合成キット。2. cDNA synthesis kit (2-1) A cDNA synthesis kit comprising the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-12).
３．RT-PCRキット
（３−１）（１−１）〜（１−１２）いずれかに記載のポリペプチドを含むRT-PCRキット。3. RT-PCR kit (3-1) An RT-PCR kit comprising the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-12).
４．cDNA合成方法
（４−１）RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼによりcDNAを合成する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして（１−１）〜（１−１２）いずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする方法。
（４−２）マグネシウムイオン存在下でcDNAを合成する（４−１）に記載の方法。
（４−３）マグネシウムイオン0.5〜3.0mM存在下でcDNAを合成する（４−１）に記載の方法。
（４−４）高次構造を形成するRNAを鋳型としてcDNAを合成する方法である（４−１）に記載の方法。4). cDNA synthesis method (4-1) A method of synthesizing cDNA using RNA as a template by reverse transcription DNA polymerase, wherein the polypeptide according to any one of (1-1) to (1-12) is used as the reverse transcription DNA polymerase The method characterized by using.
(4-2) The method according to (4-1), wherein cDNA is synthesized in the presence of magnesium ions.
(4-3) The method according to (4-1), wherein cDNA is synthesized in the presence of 0.5 to 3.0 mM magnesium ion.
(4-4) The method according to (4-1), which is a method of synthesizing cDNA using RNA that forms a higher-order structure as a template.
５．cDNA増幅方法
（５−１）RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼを利用したRT-PCRによりcDNAを増幅する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして（１−１）〜（１−１２）いずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする方法。
（５−２）マグネシウムイオン存在下でcDNAを増幅する（５−１）に記載の方法。
（５−３）マグネシウムイオン0.5〜3.0mM存在下でcDNAを合成する（５−１）に記載の方法。
（５−４）高次構造を形成するRNAを鋳型としてcDNAを増幅する方法である（５−１）に記載の方法。5. cDNA amplification method (5-1) A method of amplifying cDNA by RT-PCR using reverse transcription DNA polymerase using RNA as a template, wherein any of (1-1) to (1-12) is used as the reverse transcription DNA polymerase A method comprising using the polypeptide according to any one of the above.
(5-2) The method according to (5-1), wherein cDNA is amplified in the presence of magnesium ions.
(5-3) The method according to (5-1), wherein cDNA is synthesized in the presence of magnesium ion 0.5 to 3.0 mM.
(5-4) The method according to (5-1), which is a method of amplifying cDNA using RNA that forms a higher-order structure as a template.
本発明のポリペプチドは、好熱性細菌由来のDNAポリメラーゼにアミノ酸変異を導入して得られた変異型逆転写DNAポリメラーゼであり、逆転写活性及び耐熱性を備えている。 The polypeptide of the present invention is a mutant reverse transcription DNA polymerase obtained by introducing an amino acid mutation into a DNA polymerase derived from a thermophilic bacterium, and has reverse transcription activity and heat resistance.
また、本発明のcDNAキット及びRT-PCRキットは、上のような変異型逆転写DNAポリメラーゼを利用することにより、効率性に優れたcDNA合成方法及びcDNA増幅方法を提供することができる。 Moreover, the cDNA kit and RT-PCR kit of the present invention can provide a cDNA synthesis method and a cDNA amplification method excellent in efficiency by using the above-described mutant reverse transcription DNA polymerase.
さらに、本発明のcDNA合成方法及びcDNA増幅方法は、上のような変異型逆転写DNAポリメラーゼを利用することにより、効率性に優れたcDNA合成方法及びcDNA増幅方法を提供することができる。 Furthermore, the cDNA synthesis method and the cDNA amplification method of the present invention can provide a cDNA synthesis method and a cDNA amplification method excellent in efficiency by using the above-described mutant reverse transcription DNA polymerase.
そのため、本発明は効率性に優れたcDNA合成方法及びcDNA増幅方法を提供できる。 Therefore, the present invention can provide a cDNA synthesis method and a cDNA amplification method excellent in efficiency.
１．本発明のポリペプチドについて
本発明のポリペプチドは、以下のポリペプチド（以下、「ポリペプチド(A1)」という。）である：
配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド。1. Regarding the Polypeptide of the Present Invention The polypeptide of the present invention is the following polypeptide (hereinafter referred to as “polypeptide (A1)”):
A polypeptide in which at least one amino acid selected from the group consisting of
配列番号１のアミノ酸配列は、本発明者らによって新規に分離された嫌気性好熱性細菌Thermotoga sp. K4から単離されたDNAポリメラーゼ（以下、「K4 DNAポリメラーゼ」という。）のアミノ酸配列である。Thermotoga sp. K4は、Thermotoga petrophila RKU-1との間における16S rRNA遺伝子塩基配列の相同性が非常に高い（99％）。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of a DNA polymerase (hereinafter referred to as “K4 DNA polymerase”) isolated from the anaerobic thermophilic bacterium Thermotoga sp. K4 newly isolated by the present inventors. . Thermotoga sp. K4 has very high homology of the nucleotide sequence of 16S rRNA gene with Thermotoga petrophila RKU-1 (99%).
K4 DNAポリメラーゼは以下の特性を有しているDNAポリメラーゼである。 K4 DNA polymerase is a DNA polymerase having the following characteristics.
K4 DNAポリメラーゼは5’-3’ ポリメラーゼ活性の他に3’-5’エキソヌクレアーゼ活性をも有している。 K4 DNA polymerase has 3'-5 'exonuclease activity in addition to 5'-3' polymerase activity.
K4 DNAポリメラーゼは逆転写活性を有さない。 K4 DNA polymerase has no reverse transcription activity.
本明細書において「逆転写活性」とは、RNAを鋳型としてそれと相補的なDNA（complementary DNA；cDNA）を合成する反応（逆転写反応）を触媒する活性をいう。本明細書において「逆転写活性を有する」という場合における逆転写活性の程度は、特に限定されないが、例えば常法に従い逆転写反応を行わせた場合に、微生物由来の逆転写酵素として知られる種々の酵素と同等又はそれ以上のcDNAを生成する程度であれば好ましい。逆転写反応としては、RT-PCRを例示することができる。RT-PCRにおいて鋳型となるRNA、プライマー、及びPCRサイクル等の諸条件は当該DNAポリメラーゼの特性に応じて適したものが使用される。RT-PCRは例えば実施例３の方法に従って行うこともできる。また、逆転写反応としてcDNA合成も例示することができる。微生物由来の逆転写酵素としては、Tth DNAポリメラーゼ（Tth DNA polymerase）を例示することができる。Tth DNAポリメラーゼとしては例えば、Tth DNA Polymerase（Roche）等を使用することができる。 As used herein, “reverse transcription activity” refers to an activity that catalyzes a reaction (reverse transcription reaction) for synthesizing complementary DNA (cDNA) using RNA as a template. In the present specification, the degree of reverse transcription activity in the case of “having reverse transcription activity” is not particularly limited. For example, when a reverse transcription reaction is performed according to a conventional method, there are various known reverse transcriptases derived from microorganisms. It is preferable if it is a grade that produces cDNA equivalent to or higher than the above enzyme. An example of the reverse transcription reaction is RT-PCR. Various conditions such as RNA, primers, and PCR cycle used as a template in RT-PCR are used according to the characteristics of the DNA polymerase. RT-PCR can also be performed according to the method of Example 3, for example. Moreover, cDNA synthesis can also be illustrated as a reverse transcription reaction. An example of the reverse transcriptase derived from a microorganism is Tth DNA polymerase (Tth DNA polymerase). As Tth DNA polymerase, for example, Tth DNA Polymerase (Roche) can be used.
K4 DNAポリメラーゼはまた、耐熱性を有している。 K4 DNA polymerase is also thermostable.
本明細書において「耐熱性」とは、少なくとも68℃、好ましくは85℃で30分間の熱処理を経てもDNAポリメラーゼ活性（逆転写活性を含む。）を保持しており完全には失活しない性質をいう。 As used herein, “heat resistance” means the property that DNA polymerase activity (including reverse transcription activity) is retained and not completely inactivated even after heat treatment at least at 68 ° C., preferably 85 ° C. for 30 minutes. Say.
「3’-5’エキソヌクレアーゼ活性」は、DNAポリメラーゼのDNA合成反応を触媒する部位とは別の部位によって触媒される。DNAポリメラーゼが触媒するDNA合成反応は、DNA複製における鋳型鎖と対を形成しているポリヌクレオチド鎖（プライマー鎖）の3’-OH末端にデオキシリボヌクレオチドを1個ずつ付加する反応である。本明細書において「3’-5’エキソヌクレアーゼ活性」とは、DNAポリメラーゼが触媒するDNA合成において、プライマー鎖の3’-OH末端に塩基対を形成していない塩基が存在する場合に、その塩基を切り取る性質をいう。この3’-5’エキソヌクレアーゼ活性により、DNA合成時に誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除く、いわゆる校正（proof reading）機能をDNAポリメラーゼは発揮することができる。 The “3′-5 ′ exonuclease activity” is catalyzed by a site other than the site catalyzing the DNA synthesis reaction of DNA polymerase. The DNA synthesis reaction catalyzed by DNA polymerase is a reaction in which deoxyribonucleotides are added one by one to the 3'-OH end of a polynucleotide strand (primer strand) that forms a pair with a template strand in DNA replication. As used herein, “3′-5 ′ exonuclease activity” refers to DNA synthesis catalyzed by DNA polymerase, when there is a base that does not form a base pair at the 3′-OH end of the primer strand. This refers to the property of cutting off the base. This 3'-5 'exonuclease activity allows the DNA polymerase to exhibit a so-called proof reading function that removes nucleotides mistakenly incorporated during DNA synthesis.
ポリペプチド(A1)は後述するように、本来逆転写活性を有さないK4 DNAポリメラーゼにおいて、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目及び、438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸をアラニンに置換することによって、逆転写活性を獲得している。 Polypeptide (A1) is selected from the group consisting of the 326th, 329th, 384th, 388th, 408th, and 438th amino acids in K4 DNA polymerase, which does not originally have reverse transcription activity, as described later. Reverse transcription activity has been obtained by substituting at least one amino acid with alanine.
ポリペプチド(A1)は、上記置換を含みつつ耐熱性を維持している。耐熱性の程度はK4 DNAポリメラーゼと同等又はそれ以上である必要はなく、それ以下であってもよい。 The polypeptide (A1) maintains heat resistance while including the above substitution. The degree of heat resistance need not be equal to or higher than that of K4 DNA polymerase, and may be lower.
ポリペプチド(A1)としては、例えば具体的には、次のポリペプチドが挙げられる：
配列番号１のアミノ酸配列において、326番目のトレオニン（T326）がアラニンに置換されているポリペプチド（T326A）；
配列番号１のアミノ酸配列において、329番目のロイシン（L329）がアラニンに置換されているポリペプチド（L329A）；
配列番号１のアミノ酸配列において、384番目のグルタミン（Q384）がアラニンに置換されているポリペプチド（Q384A）；
配列番号１のアミノ酸配列において、388番目のフェニルアラニン（F388）がアラニンに置換されているポリペプチド（F388A）；
配列番号１のアミノ酸配列において、408番目のメチオニン（M408）がアラニンに置換されているポリペプチド（M408A）； 及び
配列番号１のアミノ酸配列において、438番目のチロシン（Y438）がアラニンに置換されているポリペプチド（Y438A）。Specific examples of the polypeptide (A1) include the following polypeptides:
A polypeptide (T326A) wherein threonine (T326) at
A polypeptide (L329A) in which the 329th leucine (L329) is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
A polypeptide (Q384A) in which the 384th glutamine (Q384) is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
A polypeptide (F388A) in which the 388th phenylalanine (F388) is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a polypeptide (M408A) in which the 408th methionine (M408) is substituted with alanine; and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 438th tyrosine (Y438) is substituted with alanine. Polypeptide (Y438A).
これらのポリペプチド(A1)の中ではT326A、F388A、M408A、及びY438Aからなる群より選択される１つが好ましく、T326A、F388A、M408A、及びY438Aからなる群より選択される１つがより好ましい。特に、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性に優れるという点では、T326A、及びM408A、からなる群より選択される１つが好ましく、T326A及びM408Aからなる群より選択される１つがより好ましく、T326Aがさらに好ましい。 Among these polypeptides (A1), one selected from the group consisting of T326A, F388A, M408A, and Y438A is preferable, and one selected from the group consisting of T326A, F388A, M408A, and Y438A is more preferable. In particular, in terms of excellent 3′-5 ′ exonuclease activity, one selected from the group consisting of T326A and M408A is preferable, one selected from the group consisting of T326A and M408A is more preferable, and T326A is further preferable.
またポリペプチド(A1)は、逆転写活性を有する限り、上記アミノ酸置換が単独でなされていてもよく、また複数組み合わせてなされていてもよい。後述するように、配列番号１のアミノ酸配列において、T326、L329、Q384、F388、M408、及びY438からなる群より選択される１つをアラニンに置換した各ポリペプチドはいずれも耐熱性を維持しつつ逆転写活性を獲得することができるので、これら置換箇所のうち任意の複数箇所を同時にアラニンに置換したポリペプチドも、同様に耐熱性を維持しつつ逆転写活性を獲得することができる。 The polypeptide (A1) may have the above amino acid substitutions alone or in combination, as long as it has reverse transcription activity. As will be described later, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, each polypeptide in which one selected from the group consisting of T326, L329, Q384, F388, M408, and Y438 is substituted with alanine maintains heat resistance. Since reverse transcription activity can be acquired, a polypeptide in which any of these substitution sites are simultaneously substituted with alanine can also acquire reverse transcription activity while maintaining heat resistance.
アミノ酸置換が複数組み合わせてなされているポリペプチド(A1)としては、L329及び／又はQ384がアラニンに置換されており、かつT326、F388、M408、及びY438からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチドが好ましい。 The polypeptide (A1) in which a plurality of amino acid substitutions are combined includes at least one amino acid selected from the group consisting of T326, F388, M408, and Y438, wherein L329 and / or Q384 are substituted with alanine A polypeptide in which is substituted with alanine is preferred.
そのようなポリペプチド(A1)としては、例えば具体的には、次のポリペプチドが挙げられる：
配列番号１のアミノ酸配列において、L329がアラニンに置換されており、かつT326がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、L329がアラニンに置換されており、かつF388がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、L329がアラニンに置換されており、かつM408がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、L329がアラニンに置換されており、かつY438がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、Q384がアラニンに置換されており、かつT326がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、Q384がアラニンに置換されており、かつF388がアラニンに置換されているポリペプチド；及び
配列番号１のアミノ酸配列において、Q384がアラニンに置換されており、かつM408がアラニンに置換されているポリペプチド；
配列番号１のアミノ酸配列において、Q384がアラニンに置換されており、かつY438がアラニンに置換されているポリペプチド。Specific examples of such a polypeptide (A1) include the following polypeptides:
A polypeptide wherein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 L329 is substituted with alanine and T326 is substituted with alanine;
A polypeptide in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has L329 substituted with alanine and F388 substituted with alanine;
A polypeptide wherein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 L329 is substituted with alanine and M408 is substituted with alanine;
A polypeptide wherein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 L329 is substituted with alanine and Y438 is substituted with alanine;
A polypeptide wherein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Q384 is substituted with alanine and T326 is substituted with alanine;
A polypeptide in which Q384 is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and F388 is substituted with alanine; and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Q384 is substituted with alanine, and M408 is A polypeptide substituted with alanine;
In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, Q384 is substituted with alanine, and Y438 is substituted with alanine.
アミノ酸置換が複数組み合わせてなされているポリペプチド(A1)としては、L329及び／又はQ384がアラニンに置換されており、かつL329、F388、M408、Y438らなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチドがより好ましく、L329及び／又はQ384がアラニンに置換されており、かつF388、M408、及びY438からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチドがさらに好ましい。 As the polypeptide (A1) in which a plurality of amino acid substitutions are combined, L329 and / or Q384 are substituted with alanine, and at least one amino acid selected from the group consisting of L329, F388, M408, Y438 and the like More preferred is a polypeptide substituted with alanine, L329 and / or Q384 are substituted with alanine, and at least one amino acid selected from the group consisting of F388, M408, and Y438 is substituted with alanine More preferred are polypeptides.
さらに、本発明のポリペプチドは、逆転写活性を有する限り、上記アミノ酸置換（本明細書において、「逆転写活性関連アミノ酸置換」と表記することがある。）に加えて他のアミノ酸が欠失、置換、又は付加（本明細書において、総称して「改変」と表記することがある。）されていてもよい。そのようなポリプチドは、ポリペプチド(A1)のアミノ酸配列において、逆転写化活性関連アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド（以下、「ポリペプチド(B1)」という。）である。 Furthermore, as long as the polypeptide of the present invention has reverse transcription activity, other amino acids are deleted in addition to the amino acid substitution described above (in the present specification, sometimes referred to as “reverse transcription activity-related amino acid substitution”). , Substitution, or addition (in this specification, they may be collectively referred to as “modification”). Such a polypeptide is composed of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are modified while maintaining the reverse transcription activity-related amino acid substitution in the amino acid sequence of the polypeptide (A1), and has reverse transcription activity. It is a polypeptide (hereinafter referred to as “polypeptide (B1)”).
ポリペプチド(B1)としては、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、逆転写化活性関連アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチドを例示することができる。 Polypeptide (B1) is composed of an amino acid sequence in which one or several amino acids are modified in the amino acid sequence of the polypeptide of (A) while maintaining the reverse transcription activity-related amino acid substitution, and reverse transcription. A polypeptide having activity can be exemplified.
本発明において、「数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、２〜９個のアミノ酸が改変されたことを意味する。 In the present invention, “several amino acids have been deleted, substituted or added” means that 2 to 9 amino acids have been modified.
「数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、他にも、２〜５個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列、及び２〜３個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を例示することができる。 In addition, the amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted or added includes an amino acid sequence in which 2 to 5 amino acids are modified, and an amino acid sequence in which 2 to 3 amino acids are modified. Can be illustrated.
ポリペプチド(B1)としては、逆転写化活性関連アミノ酸置換が維持された状態でポリペプチド(A1)のアミノ酸配列に対して70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、又は90%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写活性を有するポリペプチドを例示することができる。 As the polypeptide (B1), 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more of the amino acid sequence of the polypeptide (A1) with the reverse transcription activity-related amino acid substitution maintained. A polypeptide having an amino acid sequence modified within a homology range of at least% and having reverse transcription activity can be exemplified.
ポリペプチド(B1)の好ましい例としては、逆転写化活性関連アミノ酸置換が維持された状態でポリペプチド(A1)のアミノ酸配列に対して95％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写活性を有するポリペプチドを挙げることができる。 As a preferred example of the polypeptide (B1), 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 99%, with respect to the amino acid sequence of the polypeptide (A1) in a state where the reverse transcription activity-related amino acid substitution is maintained. A polypeptide having an amino acid sequence modified within a homology range of at least% and having reverse transcription activity can be mentioned.
ポリペプチド(B1)は、先述の通り逆転写化活性関連アミノ酸置換を有する。ポリペプチド(B1)は、好ましくは、逆転写化活性関連アミノ酸置換がなされていない状態に比べて逆転写活性が向上しているものである。ポリペプチド(B1)は、より好ましくは、逆転写化活性関連アミノ酸置換がなされていない状態では逆転写活性を有さなかったものである。 The polypeptide (B1) has a reverse transcription activity-related amino acid substitution as described above. The polypeptide (B1) preferably has improved reverse transcription activity compared to a state in which no reverse transcription activity-related amino acid substitution has been made. More preferably, the polypeptide (B1) has no reverse transcription activity in the state where no reverse transcription activity-related amino acid substitution has been made.
アミノ酸の改変は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じることもある。また、常法に従って人為的手段により改変することもできる。人為的手段としては、例えば部位特異的突然変異導入（site-directed mutagenesis）（Methods in Enzymology, 154: 350, 367-382 (1987)；同100: 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12; 9441 (1984)；続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編、p. 105 (1986)）等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法等の化学合成手段（J. Am. Chem. Soc., 89: 4801 (1967)；同91: 3350 (1969)；Science, 150: 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22: 1859 (1981)；同24: 245 (1983)）及びこれらの組み合わせ等が例示できる。 Amino acid alterations may occur in nature, for example, by mutation or post-translational modification. Moreover, it can also be modified by artificial means according to a conventional method. Artificial means include, for example, site-directed mutagenesis (Methods in Enzymology, 154: 350, 367-382 (1987); 100: 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12; 9441 (1984); Biochemistry Experiment Course 1 “Gene Research Method II”, edited by Japanese Biochemical Society, p. 105 (1986)), etc., Chemistry such as phosphate triester method and phosphate amidide method Synthetic means (J. Am. Chem. Soc., 89: 4801 (1967); 91: 3350 (1969); Science, 150: 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22: 1859 (1981); 245 (1983)) and combinations thereof.
ポリペプチド(B1)が有する逆転写活性の程度は、ポリペプチド(A1)と同等又はそれ以上である必要はなく、それ以下であってもよい。 The degree of reverse transcription activity of the polypeptide (B1) is not necessarily equal to or higher than that of the polypeptide (A1), and may be lower.
ポリペプチド(A1)及びポリペプチド(B1)は、いずれも逆転写酵素として使用することができる。具体的には、逆転写酵素として、cDNA合成、RT-PCR等において使用される。特にポリペプチド(A)及びポリペプチド(B)は耐熱性を有することから、cDNA合成及びRT-PCRにおいて好適に使用される。 Both polypeptide (A1) and polypeptide (B1) can be used as reverse transcriptase. Specifically, it is used as a reverse transcriptase in cDNA synthesis, RT-PCR and the like. In particular, polypeptide (A) and polypeptide (B) are suitable for use in cDNA synthesis and RT-PCR because they have heat resistance.
ポリペプチド(A1)及びポリペプチド(B1)は、特に、高次構造を形成するRNAを鋳型とするcDNA合成及びRT-PCRにおいて好適に使用される。本発明において、「高次構造を形成するRNA」とは、42℃以下で安定な特別な三次構造を形成する性質を有するRNAを意味する。特別な三次構造としては、例えば、ヘアピンループ構造、バルジ構造、及びインターナルループ構造等が挙げられる。高次構造を形成するRNAとしては、例えば、16S rRNA等が挙げられる。 Polypeptide (A1) and polypeptide (B1) are particularly preferably used in cDNA synthesis and RT-PCR using RNA that forms a higher-order structure as a template. In the present invention, “RNA that forms a higher-order structure” means an RNA having a property of forming a special tertiary structure that is stable at 42 ° C. or lower. Examples of the special tertiary structure include a hairpin loop structure, a bulge structure, and an internal loop structure. Examples of RNA forming a higher order structure include 16S rRNA.
２．本発明のcDNA合成キットについて
本発明のcDNA合成キットは、先述した本発明のポリペプチドを含むcDNA合成キットである。2. About the cDNA synthesis kit of the present invention The cDNA synthesis kit of the present invention is a cDNA synthesis kit containing the polypeptide of the present invention described above.
本発明のcDNA合成キットは、本発明のポリペプチドを逆転写DNAポリメラーゼとして含む。その他にもoligo(dT)プライマー、ランダムヘキサマープライマー、四種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、RNase H、及び適当な反応緩衝液のうちいずれか一種以上をさらに含有してもよい。 The cDNA synthesis kit of the present invention contains the polypeptide of the present invention as reverse transcription DNA polymerase. In addition, any one or more of an oligo (dT) primer, a random hexamer primer, four types of deoxyribonucleotide triphosphates, RNase H, and an appropriate reaction buffer may be further contained.
３．本発明のRT-PCRキットについて
本発明のRT-PCRキットは、先述した本発明のポリペプチドを含むRT-PCRキットである。3. About the RT-PCR kit of the present invention The RT-PCR kit of the present invention is an RT-PCR kit comprising the polypeptide of the present invention described above.
本発明のRT-PCRキットは、本発明のポリペプチドを逆転写DNAポリメラーゼとして含む。その他にもoligo(dT)プライマー、ランダムヘキサマープライマー、四種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、RNase H、及び適当な反応緩衝液のうちいずれか一種以上をさらに含有してもよい。 The RT-PCR kit of the present invention contains the polypeptide of the present invention as a reverse transcription DNA polymerase. In addition, any one or more of an oligo (dT) primer, a random hexamer primer, four types of deoxyribonucleotide triphosphates, RNase H, and an appropriate reaction buffer may be further contained.
４．本発明のcDNA合成方法について
本発明のcDNA合成方法は、RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼによりcDNAを合成する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする方法である。4). Regarding the cDNA synthesis method of the present invention The cDNA synthesis method of the present invention is a method of synthesizing cDNA by reverse transcription DNA polymerase using RNA as a template, wherein the polypeptide of the present invention is used as the reverse transcription DNA polymerase. It is a method to do.
本発明のポリペプチドの使用量は、cDNAが有効に合成される量であればよいが、RNA鋳型の状態、使用するプライマー、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 The amount of the polypeptide of the present invention is not limited as long as cDNA is effectively synthesized, but is appropriately set according to the state of the RNA template, the primer used, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, etc. Is done.
本発明のcDNA合成方法としては、次が例示される。
（工程１）mRNAからの第一鎖の合成を開始するためにoligo(dT)プライマーを使用する。oligo(dT)プライマーはランダムな配列を有する6 merまたは9 merのデオキシリボヌクレオチド混合物であり、末端がリン酸化されている。また、ランダムヘキサマープライマーにより、mRNAの内部から第一鎖cDNAの合成を開始してもよい。
（工程２）RNase HとDNAポリメラーゼを用いて第二鎖の合成（置き換え）を行う。Examples of the cDNA synthesis method of the present invention include the following.
(Step 1) An oligo (dT) primer is used to initiate the synthesis of the first strand from the mRNA. The oligo (dT) primer is a 6-mer or 9-mer deoxyribonucleotide mixture having a random sequence, and the end is phosphorylated. Alternatively, the synthesis of the first strand cDNA may be initiated from the inside of the mRNA using a random hexamer primer.
(Step 2) Second strand synthesis (replacement) is performed using RNase H and DNA polymerase.
使用される各種プライマー、適当な反応緩衝液については、RNA鋳型の状態、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 The various primers used and appropriate reaction buffer are appropriately set according to the state of the RNA template, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, and the like.
その他の反応条件についても、RNA鋳型の状態、使用するプライマー、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 Other reaction conditions are appropriately set according to the state of the RNA template, the primers used, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, and the like.
また、本発明のcDNA合成方法は、マグネシウムイオンまたはマンガンイオン存在下でcDNAを合成することが好ましい。マグネシウムイオンの存在量は、プライマーの特性、RNA鋳型の状態、及び当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定されるが、終濃度0.5〜3.0mMが好ましく、終濃度0.5〜1.5mMがより好ましい。マグネシウムイオン存在量が終濃度0.5〜3.0mMの範囲内であると、cDNA合成の効率がより向上する。 In the cDNA synthesis method of the present invention, it is preferable to synthesize cDNA in the presence of magnesium ions or manganese ions. The abundance of magnesium ions is appropriately set according to the characteristics of the primer, the state of the RNA template, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, etc., but the final concentration is preferably 0.5 to 3.0 mM, and the final concentration of 0.5. -1.5 mM is more preferred. When the magnesium ion abundance is within the final concentration range of 0.5 to 3.0 mM, the efficiency of cDNA synthesis is further improved.
５．本発明のcDNA増幅方法について
本発明のcDNA増幅方法は、RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼを利用したRT-PCRによりcDNAを合成する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする方法である。5. About the cDNA Amplification Method of the Present Invention The cDNA amplification method of the present invention is a method of synthesizing cDNA by RT-PCR using reverse transcription DNA polymerase using RNA as a template, wherein the polypeptide of the present invention is used as the reverse transcription DNA polymerase. It is the method characterized by using.
本発明のポリペプチドの使用量は、cDNAが有効に増幅される量であればよいが、RNA鋳型の状態、使用するプライマー、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 The amount of the polypeptide of the present invention is not limited as long as cDNA is effectively amplified, but is appropriately set according to the state of the RNA template, the primer used, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, etc. Is done.
本発明のcDNA増幅方法は、逆転写DNAポリメラーゼとしての当該ポリペプチドに加えてさらにもう一種類又は二種類以上の別の酵素を併用してもよく、また逆転写DNAポリメラーゼとしての当該ポリペプチドのみを用いてもよい。併用する酵素としては、例えばDNA依存性のDNAポリメラーゼが挙げられる。二種類以上の酵素を用いるか否かは、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜決定される。 In the cDNA amplification method of the present invention, in addition to the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, another kind or two or more different enzymes may be used in combination, or only the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase. May be used. Examples of the enzyme used in combination include DNA-dependent DNA polymerase. Whether or not to use two or more kinds of enzymes is appropriately determined according to the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase.
本発明のcDNA増幅方法としては、次が例示される。
（工程１）mRNAからの第一鎖の合成を開始するためにoligo(dT)プライマーを使用する。oligo(dT)プライマーはランダムな配列を有する6 merまたは9 merのデオキシリボヌクレオチド混合物であり、末端がリン酸化されている。また、ランダムヘキサマープライマーにより、mRNAの内部から第一鎖cDNAの合成を開始してもよい。
（工程２）RNase HとDNAポリメラーゼを用いて第二鎖の合成（置き換え）を行う。
（工程３）工程２で得られたcDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼを用いてcDNAを増幅する。Examples of the cDNA amplification method of the present invention include the following.
(Step 1) An oligo (dT) primer is used to initiate the synthesis of the first strand from the mRNA. The oligo (dT) primer is a 6-mer or 9-mer deoxyribonucleotide mixture having a random sequence, and the end is phosphorylated. Alternatively, the synthesis of the first strand cDNA may be initiated from the inside of the mRNA using a random hexamer primer.
(Step 2) Second strand synthesis (replacement) is performed using RNase H and DNA polymerase.
(Step 3) Using the cDNA obtained in
使用される各種プライマー、適当な反応緩衝液については、RNA鋳型の状態、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 The various primers used and appropriate reaction buffer are appropriately set according to the state of the RNA template, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, and the like.
サイクル条件をはじめその他の反応条件についても、RNA鋳型の状態、使用するプライマー、当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定される。 Other reaction conditions including cycle conditions are appropriately set according to the state of the RNA template, the primers used, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, and the like.
また、本発明のcDNA増幅方法は、マグネシウムイオン存在下でcDNAを増幅することが好ましい。マグネシウムイオンの存在量は、プライマーの特性、RNA鋳型の状態、及び当該ポリペプチドの逆転写DNAポリメラーゼとしての特性等に応じて適宜設定されるが、終濃度0.5〜3.0mMが好ましく、終濃度0.5〜1.5mMがより好ましい。マグネシウムイオン存在量が終濃度0.5〜3.0mMの範囲内であると、cDNA増幅の効率がより向上する。 In the cDNA amplification method of the present invention, it is preferable to amplify cDNA in the presence of magnesium ions. The abundance of magnesium ions is appropriately set according to the characteristics of the primer, the state of the RNA template, the characteristics of the polypeptide as a reverse transcription DNA polymerase, etc., but the final concentration is preferably 0.5 to 3.0 mM, and the final concentration of 0.5. -1.5 mM is more preferred. When the magnesium ion abundance is within the final concentration range of 0.5 to 3.0 mM, the efficiency of cDNA amplification is further improved.
以下に試験例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to test examples and examples, but the present invention is not limited to the following examples.
試験例１：嫌気性好熱性細菌由来の新規DNAポリメラーゼ（野生型）の精製
本発明者らは、鹿児島県トカラ列島小宝島の熱水硫気孔から新規の嫌気性好熱性細菌を分離し、これをThermotoga sp. K4と名付けた。Thermotoga sp. K4は、Thermotoga petrophila RKU-1との間における16S rRNA遺伝子塩基配列の相同性が99％であった。Thermotoga sp. K4株菌体より常法に従ってゲノムDNAを抽出し、DNAポリメラーゼを単離した（以下、この DNAポリメラーゼを「K4 DNAポリメラーゼ」という。）。これを発現ベクター（pET21a）へクローニングした。クローンK4 DNAポリメラーゼ（pET21a/K4 pol）を発現した発現宿主大腸菌(BL21-CodonPlus (DE3))を懸濁バッファー1(10 mM Tris HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 % グリセロール)に懸濁し、超音波破砕した。この破砕液から遠心分離によって上清を得てこれを回収した後、85 ℃にて30分間熱処理した後、再び遠心分離によって上清を回収した。この上清に終濃度70 %となるよう硫酸アンモニウムを加え、遠心分離して沈澱を回収した。この沈澱を懸濁バッファー1（10 mM リン酸バッファー（pH 8.0）、100 mM NaCl、10 mM DTT、10 % グリセロール）に溶解し、バッファー1にて透析した。 Test Example 1: Purification of a novel DNA polymerase (wild type) derived from an anaerobic thermophilic bacterium The present inventors obtained a novel anaerobic thermophilic bacterium from the hot water sulfur pores of Kotakara Island, Tokara Islands, Kagoshima Prefecture. This was separated and named Thermotoga sp. K4. Thermotoga sp. K4 had 99% homology of the 16S rRNA gene base sequence with Thermotoga petrophila RKU-1. Genomic DNA was extracted from Thermotoga sp. Strain K4 cells according to a conventional method, and DNA polymerase was isolated (hereinafter, this DNA polymerase is referred to as “K4 DNA polymerase”). This was cloned into an expression vector (pET21a). The expression host Escherichia coli (BL21-CodonPlus (DE3)) expressing clone K4 DNA polymerase (pET21a / K4 pol) is suspended in suspension buffer 1 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10% glycerol). And ultrasonically crushed. A supernatant was obtained from this crushed solution by centrifugation, and this was collected. After heat treatment at 85 ° C. for 30 minutes, the supernatant was again collected by centrifugation. Ammonium sulfate was added to the supernatant to a final concentration of 70%, and the precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was dissolved in suspension buffer 1 (10 mM phosphate buffer (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10% glycerol) and dialyzed against buffer 1.
これを陰イオン交換カラム(monoQ HR 5/5)に供し、100 mMから1 M NaClの勾配で溶出することにより、DNAポリメラーゼを含むフラクションを回収した。さらにゲルろ過カラム(Superdex 200 HR)に供し、DNAポリメラーゼを含むフラクションを回収し、これを精製K4 DNAポリメラーゼとした。この精製K4 DNAポリメラーゼを10 % SDS-PAGEに供したところ（図1）、このDNAポリメラーゼは分子量101.7 kのタンパク質であることが分かった。なお、図1の写真中「M」とあるのはマーカーを、「K4」とあるのは「K4 DNAポリメラーゼ」を、それぞれ示している。
This was applied to an anion exchange column (
さらにこのK4 DNAポリメラーゼについて常法に従って全アミノ酸配列を決定した。この全アミノ酸配列を配列表１（配列番号１）に示す。 Further, the entire amino acid sequence of this K4 DNA polymerase was determined according to a conventional method. The complete amino acid sequence is shown in Sequence Listing 1 (SEQ ID NO: 1).
試験例２：野生型K4 DNAポリメラーゼの正確性解析
K4 DNAポリメラーゼと、公知のDNAポリメラーゼ（Taq、KOD、MSB8株由来ポリメラーゼ）との間で、DNA合成の正確性を比較した。pKF3プラスミドを鋳型とし、これらのDNAポリメラーゼをそれぞれ用いて常法に従ってPCRを行った。PCR反応産物を常法に従ってエタノール沈殿し、塩を除いた後に常法に従ってT4DNAポリメラーゼを用いて塩基末端を平滑化した。T4DNAポリメラーゼを15分間80 ℃で熱処理し失活させた後、常法に従ってゲル抽出を行った。その後、常法に従ってリガーゼ処理を行い自己閉環させた。リガーゼ処理したpKF3を用いて、常法に従って宿主大腸菌(TH2)を形質転換し、LB固体培地Ａ（クロラムフェニコール12μg/mL含有）及びLB固体培地Ｂ（クロラムフェニコール 12μg/mL＋ストレプトマイシン50μg/mL含有）に塗布し37℃にて培養した。2日後それぞれのＬＢ固体培地上のコロニーを数えた。 Test Example 2: Accuracy analysis of wild type K4 DNA polymerase
The accuracy of DNA synthesis was compared between K4 DNA polymerase and known DNA polymerases (Taq, KOD, MSB8 strain-derived polymerase). PCR was performed according to a conventional method using pKF3 plasmid as a template and each of these DNA polymerases. The PCR reaction product was ethanol precipitated according to a conventional method, and after removing the salt, the base end was blunted using T4 DNA polymerase according to a conventional method. The T4 DNA polymerase was inactivated by heat treatment at 80 ° C. for 15 minutes, and then gel extraction was performed according to a conventional method. Thereafter, ligase treatment was performed according to a conventional method to cause self-ring closure. Using ligase-treated pKF3, host E. coli (TH2) was transformed according to a conventional method, and LB solid medium A (containing chloramphenicol 12 μg / mL) and LB solid medium B (chloramphenicol 12 μg / mL +
pKF3プラスミドは元来、クロラムフェニコール耐性遺伝子と、ストレプトマイシン感受性遺伝子を持つ。従って、pKF3プラスミドがPCRで正確に増幅されていれば、これにより形質転換された宿主大腸菌(TH2)はLB培地Ａにおいては生育するが、ストレプトマイシンを含有するLB培地Ｂにおいては生育しない。一方、PCRの際にストレプトマイシン感受性遺伝子が変異し、機能を失った場合これにより形質転換された宿主大腸菌(TH2)は、ストレプトマイシンを含むLB培地Ｂにおいて生育することが可能となる。すなわち、LB培地Ｂ上に観察されたコロニー数をLB培地Ａ上に観察されたコロニー数で割った割合は、全コロニー数に対する変異コロニー数の割合とみなすことができる。この指標を用いてDNAポリメラーゼのPCR反応における正確性を評価することができる。すなわち、上記の割合がより高ければ正確性がより低く、逆に上記の割合がより低ければ正確性がより高いと評価できる。 The pKF3 plasmid originally has a chloramphenicol resistance gene and a streptomycin sensitivity gene. Therefore, if the pKF3 plasmid is accurately amplified by PCR, the transformed host E. coli (TH2) grows in LB medium A but does not grow in LB medium B containing streptomycin. On the other hand, when the streptomycin-sensitive gene is mutated during PCR and loses its function, the transformed host E. coli (TH2) can grow on LB medium B containing streptomycin. That is, the ratio of the number of colonies observed on LB medium B divided by the number of colonies observed on LB medium A can be regarded as the ratio of the number of mutant colonies to the total number of colonies. This index can be used to assess the accuracy of DNA polymerase PCR reactions. That is, it can be evaluated that the higher the ratio, the lower the accuracy, and conversely, the lower the ratio, the higher the accuracy.
解析の結果を図２に示す。この結果はK4 DNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼより正確性が高いことを示している。これはK4 DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼとは異なり3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有しているためであると考えられる。 The result of the analysis is shown in FIG. This result indicates that K4 DNA polymerase is more accurate than Taq polymerase. This is presumably because K4 DNA polymerase has 3'-5 'exonuclease activity unlike Taq polymerase.
試験例３：野生型K4 DNAポリメラーゼの耐熱性評価
K4 DNAポリメラーゼと、公知の耐熱性DNAポリメラーゼであるKODポリメラーゼ（Toyobo）との間で、耐熱性を比較した。これら二種類のポリメラーゼをバッファー中にてそれぞれ85 ℃にて所定時間（30分間、60分間、120分間）熱処理した。熱処理後に各ポリメラーゼ含有バッファーを遠心分離し、得られた上清を10%SDS-PAGEに供した。図３に示す右側2枚の写真はこの電気泳動写真である。また、この上清を用いてPCR法を行い、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を測定した。PCR反応条件は次の通りである。
反応溶液：50 mM bicine/KOH、100 mM K-acetate (pH 8.2)、10 %グリセロール、0.2 mM dNTPs、1 mM MgSO4、0.6 μMプライマー１（Fw）（配列番号２）、0.6 μMプライマー２（Rv）（配列番号３）、0.4ng/μL DNA（配列番号４）、20 ng/μL各酵素
サイクル条件：94 ℃1分、（94 ℃15秒；60 ℃15 秒；68 ℃30秒）×30サイクル、4 ℃∞
増幅する遺伝子断片：459 bp Test Example 3: Evaluation of heat resistance of wild type K4 DNA polymerase
The heat resistance was compared between K4 DNA polymerase and KOD polymerase (Toyobo), which is a known heat-resistant DNA polymerase. These two kinds of polymerases were each heat-treated in a buffer at 85 ° C. for a predetermined time (30 minutes, 60 minutes, 120 minutes). After the heat treatment, each polymerase-containing buffer was centrifuged, and the resulting supernatant was subjected to 10% SDS-PAGE. The two photographs on the right side shown in FIG. 3 are the electrophoretic photographs. Moreover, PCR was performed using this supernatant, and DNA-dependent DNA polymerase activity was measured. PCR reaction conditions are as follows.
Reaction solution: 50 mM bicine / KOH, 100 mM K-acetate (pH 8.2), 10% glycerol, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO 4 , 0.6 μM primer 1 (Fw) (SEQ ID NO: 2), 0.6 μM primer 2 ( Rv) (SEQ ID NO: 3), 0.4 ng / μL DNA (SEQ ID NO: 4), 20 ng / μL Each enzyme cycle condition: 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 15 seconds; 60 ° C. for 15 seconds; 68 ° C. for 30 seconds) × 30 cycles, 4 ° C ∞
Gene fragment to be amplified: 459 bp
図３はPCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真（左側の2枚）である。なお、写真中「0、30、60、120」とあるのは、それぞれ熱処理時間（hour）を示している。また写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図３に示す通り、PCRにより増幅されるべき459 bpの遺伝子断片がいずれのレーンにおいても確認された。これらの結果は、野生型K4DNAポリメラーゼが85 ℃、120分間の熱処理を経ても活性を保持していることを示している。野生型K4 DNAポリメラーゼが高い耐熱性を有していることが分かった。 FIG. 3 is a photograph (two pieces on the left side) of electrophoresis of each reaction solution after the PCR reaction. Note that “0, 30, 60, 120” in the photograph indicates the heat treatment time (hour), respectively. In the photo, “M” indicates a marker. As shown in FIG. 3, a 459 bp gene fragment to be amplified by PCR was confirmed in any lane. These results indicate that wild-type K4 DNA polymerase retains its activity even after heat treatment at 85 ° C. for 120 minutes. It was found that wild type K4 DNA polymerase has high heat resistance.
実施例１：変異型DNAポリメラーゼの取得
以上のようにして得られた野生型K4 DNAポリメラーゼ（以下、単に「野生型DNAポリメラーゼ」という。）の特定アミノ酸部位をアラニンに変異させた変異型K4 DNAポリメラーゼ（以下、単に「変異型DNAポリメラーゼ」という。）を得た。常法に従って（Ochman et al., Genetics 120, ｐ.621, 1988； Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16, p.8186, 1988；及びSilver and Keerikatte, J. Cell. Biochem. (Suppl.) 13Ｅ, p.306, Abstract No. WH239, 1989等参照）、逆向きPCR法（インバースPCR）により各変異型DNAポリメラーゼを発現ベクター（pET21a）へクローニングした。 Example 1: Acquisition of mutant DNA polymerase The specific amino acid site of wild-type K4 DNA polymerase (hereinafter simply referred to as "wild-type DNA polymerase") obtained as described above was mutated to alanine. A mutant K4 DNA polymerase (hereinafter simply referred to as “mutant DNA polymerase”) was obtained. According to conventional methods (Ochman et al.,
逆向きPCR法は次の通り行った。まず、K4 DNAポリメラーゼの発現ベクター(pET21a/K4 pol)を鋳型として、変異導入部位に該当する位置に変異を持つ5’リン酸化DNAプライマーと逆方向のプライマーを用いてPCR反応を行った。PCR反応条件は次の通りである。
反応溶液：1×KOD plusバッファー (Toyobo)、0.2 mM dNTPs、1 mM MgSO4、0.6 μM Fw プライマー、0.6 μM Rv プライマー、0.2 ng/μL DNA、1 Unit KOD plus polymerase (Toyobo)
サイクル条件：94 ℃1分、(94 ℃15秒、60 ℃15 秒、68 ℃7分)×25サイクル、4 ℃∞Reverse PCR was performed as follows. First, using a K4 DNA polymerase expression vector (pET21a / K4 pol) as a template, a PCR reaction was carried out using a 5 ′ phosphorylated DNA primer having a mutation at a position corresponding to the mutation introduction site and a primer in the reverse direction. PCR reaction conditions are as follows.
Reaction solution: 1 × KOD plus buffer (Toyobo), 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO 4 , 0.6 μM Fw primer, 0.6 μM Rv primer, 0.2 ng / μL DNA, 1 Unit KOD plus polymerase (Toyobo)
Cycle conditions: 94 ° C for 1 minute (94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 7 minutes) x 25 cycles, 4 ° C∞
これによりPCR反応産物の目的遺伝子部位には任意の変異が導入される。PCR反応産物をリガーゼ処理した後、自己閉環（セルフライゲーション）させ、変異型K4 DNAポリメラーゼ発現ベクターを作製した。
リガーゼ処理の条件は次の通りである。
反応溶液：10μM Fw プライマー、10μM Rv プライマー、1×T4 PNK バッファー (Takara)、10 mM ATP、T4 PNK (Takara)
反応時間：37 ℃、30分間
セルフライゲーションの条件は次の通りである。
反応溶液：PCR反応産物（DNA）、1／2量Ligation high (Toyobo)
反応時間：16 ℃、30分間
変異導入アミノ酸部位は次の通りである：
329番目のロイシン（L329）
384番目のグルタミン（Q384）
387番目のリジン（K387）
388番目のフェニルアラニン（F388）
408番目のメチオニン（M408）
422番目のアスパラギン（N422）
438番目のチロシン（Y438）As a result, an arbitrary mutation is introduced into the target gene site of the PCR reaction product. The PCR reaction product was subjected to ligase treatment and then self-closing (self-ligation) to prepare a mutant K4 DNA polymerase expression vector.
The conditions for the ligase treatment are as follows.
Reaction solution: 10 μM Fw primer, 10 μM Rv primer, 1 × T4 PNK buffer (Takara), 10 mM ATP, T4 PNK (Takara)
Reaction time: 37 ° C., 30 minutes The conditions for self-ligation are as follows.
Reaction solution: PCR reaction product (DNA), 1/2 quantity Ligation high (Toyobo)
Reaction time: 16 ° C, 30 minutes The mutagenic amino acid sites are as follows:
329th leucine (L329)
384th glutamine (Q384)
387th lysine (K387)
388th phenylalanine (F388)
408th methionine (M408)
422th asparagine (N422)
438th tyrosine (Y438)
各変異体を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ常法に従って発現させ、さらに各変異タンパク質を精製した。精製された各変異タンパク質を10 % SDS-PAGEに供した（図４）。
なお、図４及び以下において、変異型DNAポリメラーゼを例えば「L329A」のように、アミノ酸変異部位（例えば「L329」）の末尾にアラニンを表す「A」を付けて表記する。なお、複数のアミノ酸変異を有する変異体は、例えば「L329A/Q384A」のように表記する。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。Expression vectors incorporating the respective mutants were expressed according to conventional methods, and each mutant protein was further purified. Each purified mutant protein was subjected to 10% SDS-PAGE (FIG. 4).
In FIG. 4 and the following, the mutant DNA polymerase is represented by adding “A” representing alanine to the end of the amino acid mutation site (for example, “L329”), for example, “L329A”. A mutant having a plurality of amino acid mutations is represented as “L329A / Q384A”, for example. “M” in the picture indicates a marker.
実施例２：変異型DNAポリメラーゼのDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の測定
以上のようにして得られた各変異型DNAポリメラーゼが、野生型DNAポリメラーゼと同様に、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を有しているかを検証した。PCR反応条件は次の通りである。
反応溶液：50 mM bicine/KOH、100 mM K-acetate (pH 8.2)、10 %グリセロール、0.2 mM dNTPs、1 mM MgSO4、0.6 μMプライマー１（Fw）（配列番号２）、0.6 μMプライマー２（Rv）（配列番号３）、0.4ng/μL DNA（配列番号４）、20 ng/μL各酵素
サイクル条件：94 ℃1分、（94 ℃15秒；60 ℃15 秒；68 ℃30秒）×30サイクル、4 ℃∞
増幅する遺伝子断片：459 bp Example 2: Measurement of DNA-dependent DNA polymerase activity of mutant DNA polymerase Each of the mutant DNA polymerases obtained as described above has DNA-dependent DNA polymerase activity similar to wild-type DNA polymerase. I verified that it is. PCR reaction conditions are as follows.
Reaction solution: 50 mM bicine / KOH, 100 mM K-acetate (pH 8.2), 10% glycerol, 0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO 4 , 0.6 μM primer 1 (Fw) (SEQ ID NO: 2), 0.6 μM primer 2 ( Rv) (SEQ ID NO: 3), 0.4 ng / μL DNA (SEQ ID NO: 4), 20 ng / μL Each enzyme cycle condition: 94 ° C. for 1 minute (94 ° C. for 15 seconds; 60 ° C. for 15 seconds; 68 ° C. for 30 seconds) × 30 cycles, 4 ° C ∞
Gene fragment to be amplified: 459 bp
図５はPCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図５に示す通り、PCRにより増幅されるべき459 bpの遺伝子断片がいずれのレーンにおいても確認された。これらの結果は、各変異型DNAポリメラーゼは、野生型DNAポリメラーゼと同様にDNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を有していることを示している。 FIG. 5 is a photograph obtained by electrophoresis of each reaction solution after the PCR reaction. “M” in the picture indicates a marker. As shown in FIG. 5, a 459 bp gene fragment to be amplified by PCR was confirmed in any lane. These results indicate that each mutant DNA polymerase has a DNA-dependent DNA polymerase activity similar to the wild-type DNA polymerase.
実施例３：変異型DNAポリメラーゼの逆転写活性の測定（１）
各変異型DNAポリメラーゼを用いてRNAを鋳型とするRT-PCR法を行い、それぞれの逆転写酵素活性を測定した。PCR反応条件は次の通りである。
反応溶液：50 mM bicine/KOH（Nacalai tesque）、100 mM K-acetate (pH 8.2)（Wako）、10 %グリセロール（Wako）、0.2 mM dNTPs（Toyobo）、1 mM MgSO4（Toyobo）、0.6 μMプライマー３（Fw）（配列番号５）、0.6 μMプライマー４（Rv）（配列番号６）、0.5 ng/μL （Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来Total RNA）、20 ng/μL各酵素
サイクル条件：94 ℃1分、60 ℃15 秒、68 ℃30分、(94 ℃15秒、60 ℃15 秒、68 ℃30秒) ×30サイクル、4 ℃∞
サーマルサイクラー：PC707（製造元ASTEC）
増幅する遺伝子断片：178bp Example 3: Measurement of reverse transcription activity of mutant DNA polymerase (1)
RT-PCR was performed using each mutant DNA polymerase and RNA as a template, and the respective reverse transcriptase activities were measured. PCR reaction conditions are as follows.
Reaction solution: 50 mM bicine / KOH (Nacalai tesque), 100 mM K-acetate (pH 8.2) (Wako), 10% glycerol (Wako), 0.2 mM dNTPs (Toyobo), 1 mM MgSO 4 (Toyobo), 0.6 μM Primer 3 (Fw) (SEQ ID NO: 5), 0.6 μM primer 4 (Rv) (SEQ ID NO: 6), 0.5 ng / μL (Total RNA derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain), 20 ng / μL each enzyme cycle condition: 94 ° C. 1 Min, 60 ° C 15 sec, 68 °
Thermal cycler: PC707 (manufacturer ASTEC)
Amplified gene fragment: 178 bp
図６はRT-PCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図６に示す通り、RT-PCRにより増幅されるべき178bpの遺伝子断片がL329A、Q384A、K387A、F388A、M408A、N422A、及びY438Aのレーンにおいて確認された。一方、野生型DNAポリメラーゼ（WT）のレーンには178bpの遺伝子断片が確認されなかった。これらの結果は、野生型DNAポリメラーゼとは異なり、L329A、Q384A、K387A、F388A、M408A、N422A、及びY438Aが逆転写酵素活性を獲得したことを示している。また、68 ℃の熱処理を30分間経てもDNAポリメラーゼ活性を保持しており耐熱性を維持していることも示している。 FIG. 6 is a photograph obtained by electrophoresis of each reaction solution after RT-PCR reaction. “M” in the picture indicates a marker. As shown in FIG. 6, a 178 bp gene fragment to be amplified by RT-PCR was confirmed in the lanes of L329A, Q384A, K387A, F388A, M408A, N422A, and Y438A. On the other hand, a 178 bp gene fragment was not confirmed in the lane of wild type DNA polymerase (WT). These results indicate that, unlike the wild type DNA polymerase, L329A, Q384A, K387A, F388A, M408A, N422A, and Y438A acquired reverse transcriptase activity. It also shows that DNA polymerase activity is retained and heat resistance is maintained even after 30 minutes of heat treatment at 68 ° C.
したがって、これらのポリペプチドは逆転写酵素として使用でき、耐熱性をも有していることからcDNA合成及びRT-PCR等において好適に使用できることが分かった。 Therefore, it was found that these polypeptides can be used as reverse transcriptase and have heat resistance, so that they can be suitably used in cDNA synthesis and RT-PCR.
実施例４：変異型DNAポリメラーゼの逆転写活性の測定（２）
各変異型DNAポリメラーゼを用いて、RNAを鋳型とするRT-PCR法を実施例３とは異なる条件で行い、それぞれの逆転写酵素活性を測定した。PCR反応条件は次の通りである。
反応溶液：50 mM bicine/KOH（Nacalai tesque）、100 mM K-acetate (pH 8.2)（Wako）、10 %グリセロール（Wako）、0.2 mM dNTPs（Toyobo）、1 mM Mn(OAc)2（Roche）、0.6 μMプライマー３（Fw）（配列番号５）、0.6 μMプライマー４（Rv）（配列番号６）、0.5 ng/μL （Thermococcus kodakaraensis KOD1株由来Total RNA）、20 ng/μL各酵素
サイクル条件：94 ℃1分、60 ℃15 秒、68 ℃30分、(94 ℃15秒、60 ℃15 秒、68 ℃30秒) ×30サイクル、4 ℃∞
サーマルサイクラー：PC707（製造元ASTEC）
増幅する遺伝子断片：178bp Example 4: Measurement of reverse transcription activity of mutant DNA polymerase (2)
Using each mutant DNA polymerase, the RT-PCR method using RNA as a template was performed under conditions different from those in Example 3, and the respective reverse transcriptase activities were measured. PCR reaction conditions are as follows.
Reaction solution: 50 mM bicine / KOH (Nacalai tesque), 100 mM K-acetate (pH 8.2) (Wako), 10% glycerol (Wako), 0.2 mM dNTPs (Toyobo), 1 mM Mn (OAc) 2 (Roche) 0.6 μM primer 3 (Fw) (SEQ ID NO: 5), 0.6 μM primer 4 (Rv) (SEQ ID NO: 6), 0.5 ng / μL (Total RNA derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain), 20 ng / μL for each enzyme cycle condition: 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 30 minutes, (94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 30 seconds) × 30 cycles, 4 ° C∞
Thermal cycler: PC707 (manufacturer ASTEC)
Amplified gene fragment: 178 bp
図７はRT-PCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図７に示す通り、RT-PCRにより増幅されるべき178 bpの遺伝子断片がL329A、Q384A、F388A、M408A、及びY438Aのレーンにおいて確認された。一方、野生型DNAポリメラーゼ（WT）、K387A、及びN422Aのレーンには178 bpの遺伝子断片が確認されなかった。これらの結果は、このPCR反応条件においてはL329A、Q384A、F388A、M408A、及びY438Aが野生型DNAポリメラーゼとは異なり逆転写酵素活性を獲得したことを示している。また、68℃の熱処理を30分間経てもDNAポリメラーゼ活性を保持しており耐熱性を維持していることも示している。 FIG. 7 is a photograph obtained by electrophoresis of each reaction solution after the RT-PCR reaction. “M” in the picture indicates a marker. As shown in FIG. 7, a 178 bp gene fragment to be amplified by RT-PCR was confirmed in the lanes of L329A, Q384A, F388A, M408A, and Y438A. On the other hand, a 178 bp gene fragment was not confirmed in the lanes of wild type DNA polymerase (WT), K387A, and N422A. These results indicate that L329A, Q384A, F388A, M408A, and Y438A acquired reverse transcriptase activity unlike the wild-type DNA polymerase under these PCR reaction conditions. It also shows that DNA polymerase activity is retained and heat resistance is maintained even after 30 minutes of heat treatment at 68 ° C.
したがって、これらのポリペプチドは逆転写酵素として使用でき、耐熱性をも有していることからcDNA合成及びRT-PCR等において好適に使用できることが分かった。 Therefore, it was found that these polypeptides can be used as reverse transcriptase and have heat resistance, so that they can be suitably used in cDNA synthesis and RT-PCR.
実施例５：変異型DNAポリメラーゼの取得
実施例１と同様にして、次のアミノ酸部位にアラニンを導入した変異型DNAポリメラーゼを得た。
326番目のトレオニン（T326）
451番目のフェニルアラニン（F451）
329番目のロイシン（L329）及び384番目のグルタミン（Q384）
329番目のロイシン（L329）及び438番目のチロシン（Y438）
384番目のグルタミン（Q384）及び438番目のチロシン（Y438） Example 5: Obtaining mutant DNA polymerase In the same manner as in Example 1, a mutant DNA polymerase having alanine introduced at the next amino acid site was obtained.
326th threonine (T326)
451st phenylalanine (F451)
329th leucine (L329) and 384th glutamine (Q384)
329th leucine (L329) and 438th tyrosine (Y438)
384th glutamine (Q384) and 438th tyrosine (Y438)
精製された各変異タンパク質を実施例１で精製によって得られた変異タンパク質とともに実施例１と同様に10 % SDS-PAGEに供した（図８）。 Each purified mutant protein was subjected to 10% SDS-PAGE in the same manner as in Example 1 together with the mutant protein obtained by purification in Example 1 (FIG. 8).
実施例６：変異型DNAポリメラーゼのDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の測定
実施例１及び実施例５で得られた各変異型DNAポリメラーゼが、野生型DNAポリメラーゼと同様に、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を有しているかを検証した。実施例２と同様にして検証を行った。 Example 6: Measurement of DNA-dependent DNA polymerase activity of mutant DNA polymerase Each mutant DNA polymerase obtained in Example 1 and Example 5 is DNA-dependent DNA polymerase activity in the same manner as wild-type DNA polymerase. We verified whether we have. Verification was performed in the same manner as in Example 2.
図９はPCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図９に示す通り、PCRにより増幅されるべき459 bpの遺伝子断片がいずれのレーンにおいても確認された。これらの結果は、各変異型DNAポリメラーゼは、野生型DNAポリメラーゼ（「WT」のレーンを参照）と同様にDNA依存性のDNAポリメラーゼ活性を有していることを示している。 FIG. 9 is a photograph obtained by electrophoresis of each reaction solution after the PCR reaction. “M” in the picture indicates a marker. As shown in FIG. 9, a 459 bp gene fragment to be amplified by PCR was confirmed in any lane. These results indicate that each mutant DNA polymerase has a DNA-dependent DNA polymerase activity similar to wild-type DNA polymerase (see “WT” lane).
実施例７：変異型DNAポリメラーゼの逆転写活性の測定
実施例１及び実施例５で得られた各変異型DNAポリメラーゼを用いてRNAを鋳型とするRT-PCR法を行い、それぞれの逆転写酵素活性を測定した。PCR反応条件は実施例１と同様とした。 Example 7: Measurement of reverse transcription activity of mutant DNA polymerase RT-PCR method using each mutant DNA polymerase obtained in Example 1 and Example 5 using RNA as a template, and each reverse transcriptase Activity was measured. PCR reaction conditions were the same as in Example 1.
図１０はRT-PCR反応後のそれぞれの反応溶液を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。図１０に示す通り、公知の逆転写酵素Tth DNAポリメラーゼ（Tth）及びKOD DNAポリメラーゼ（KOD）の逆転写反応により増幅される178bpの遺伝子断片がT326A、L329A、Q384A、F388A、M408A、Y438A、L329A/Q384A、L329A/Y438A、L329A/Q384A及びQ384A/Y438Aのレーンにおいて確認された。一方、野生型DNAポリメラーゼ（WT）のレーンには178bpの遺伝子断片が確認されなかった。これらの結果は、野生型DNAポリメラーゼとは異なり、T326A、L329A、Q384A、F388A、M408A、Y438A、L329A/Q384A、L329A/Y438A、及びQ384A/Y438Aが逆転写酵素活性を獲得したことを示している。また、68 ℃の熱処理を30分間経てもDNAポリメラーゼ活性を保持しており耐熱性を維持していることも示している。 FIG. 10 is a photograph obtained by electrophoresis of each reaction solution after the RT-PCR reaction. “M” in the picture indicates a marker. As shown in FIG. 10, 178 bp gene fragments amplified by the reverse transcription reaction of known reverse transcriptase Tth DNA polymerase (Tth) and KOD DNA polymerase (KOD) are T326A, L329A, Q384A, F388A, M408A, Y438A, L329A. / Q384A, L329A / Y438A, L329A / Q384A and Q384A / Y438A lanes. On the other hand, a 178 bp gene fragment was not confirmed in the lane of wild type DNA polymerase (WT). These results indicate that T326A, L329A, Q384A, F388A, M408A, Y438A, L329A / Q384A, L329A / Y438A, and Q384A / Y438A acquired reverse transcriptase activity, unlike wild-type DNA polymerase. . It also shows that DNA polymerase activity is retained and heat resistance is maintained even after 30 minutes of heat treatment at 68 ° C.
これに対して、K387A、N422A、及びF451Aのレーンには178bpの遺伝子断片が確認されなかった。しかしながら、先述の通り、実施例１においてK387A及びN422Aの逆転写活性が確認されている。したがって、実施例１及び７の結果は、T326A、L329A、Q384A、F388A、M408A、Y438A、L329A/Q384A、L329A/Y438A、及びQ384A/Y438Aが、K387A及びN422Aと比べて逆転写活性の再現性がより優れていることを示している。 In contrast, a 178 bp gene fragment was not confirmed in the lanes of K387A, N422A, and F451A. However, as described above, the reverse transcription activity of K387A and N422A was confirmed in Example 1. Therefore, the results of Examples 1 and 7 show that T326A, L329A, Q384A, F388A, M408A, Y438A, L329A / Q384A, L329A / Y438A, and Q384A / Y438A have a reproducibility of reverse transcription activity compared to K387A and N422A. It shows that it is better.
実施例８：変異型DNAポリメラーゼの3’-5’エキソヌクレアーゼ活性の測定
実施例１及び実施例５で得られた本願発明の各変異型DNAポリメラーゼを用いて、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性の測定を行った。 Example 8: Measurement of 3′-5 ′ exonuclease activity of
測定は次のようにして行った。
5’末端をCy5.5で蛍光標識したオリゴDNA（配列番号７）に対して各種変異型DNAポリメラーゼを作用させ、3’末端から進行する切断の程度を評価することにより、3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性を測定した。The measurement was performed as follows.
Various mutant DNA polymerases were allowed to act on oligo DNA (SEQ ID NO: 7) fluorescently labeled with Cy5.5 at the 5 ′ end, and the degree of cleavage proceeding from the 3 ′ end was evaluated. Exonuclease activity was measured.
次の組成物に蒸留水を加えて50 μLにしたものを反応溶液とした。
5 x RT buf. 10 μL
25 mM Mn(OAc)2 2 μL
10 μM Oligo DNA 1 μL (200 nM)
各酵素 1 μL (1 μg)
上記反応溶液を68℃にて１分間処理し終濃度50 mM EDTA・Na (pH8.0)を添加することにより、反応を停止した。A reaction solution was prepared by adding distilled water to the following composition to 50 μL.
5 x RT buf. 10 μL
25 mM Mn (OAc) 2 2 μL
10 μM Oligo DNA 1 μL (200 nM)
1 μL of each enzyme (1 μg)
The reaction solution was treated at 68 ° C. for 1 minute, and the reaction was stopped by adding a final concentration of 50 mM EDTA · Na (pH 8.0).
予めプレランしておいた7.0 M 尿素-10 %アクリルアミドゲルに反応産物を供し、20 mAにて30分間電気泳動した（図１１）。電気泳動後のゲルにおけるバンドの蛍光強度から次の通り3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性を評価した。用いた反応系における全蛍光強度を1とし、3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性により切断されたホスホジエステル結合の数（切断されたDNA分子は短化するため、電気泳動において早く流れる）から3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性を次式により数値化した。 The reaction product was applied to a pre-run 7.0 M urea-10% acrylamide gel and electrophoresed at 20 mA for 30 minutes (FIG. 11). From the fluorescence intensity of the band in the gel after electrophoresis, 3'-5 'exonuclease activity was evaluated as follows. The total fluorescence intensity in the reaction system used is 1, and the number of phosphodiester bonds cleaved by 3'-5 'exonuclease activity (the cleaved DNA molecule is shortened so that it flows faster in electrophoresis). The -5 'exonuclease activity was quantified by the following formula.
3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性＝(バンドの蛍光強度×削られた塩基数)／反応時間 (min)
野生型の活性を100 %として算出した値を図１２に示す。3'-5 'exonuclease activity = (band fluorescence intensity x number of bases removed) / reaction time (min)
Values calculated with the wild-type activity as 100% are shown in FIG.
これらの結果は、全ての各変異型DNAポリメラーゼが3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有していることを示している。これらの結果は、特にT326A、L329A、Q384A、M408A、及びY438Aが比較的高い3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有していることを示している。これらの結果は、特にT326A及びM408Aが格別に高い3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有していることも示している。 These results indicate that all the mutant DNA polymerases have 3'-5 'exonuclease activity. These results indicate that T326A, L329A, Q384A, M408A, and Y438A in particular have relatively high 3'-5 'exonuclease activity. These results also indicate that T326A and M408A have particularly high 3'-5 'exonuclease activity.
実施例９：高次構造形成RNAを鋳型とする場合における変異型DNAポリメラーゼの逆転写活性の評価
実施例１及び実施例５で得られた変異型DNAポリメラーゼT326A及びL329Aを用いて、高次構造形成RNAを鋳型とする場合における逆転写活性の評価を行った。評価は次のようにして行った。 Example 9: Evaluation of reverse transcription activity of mutant DNA polymerase using higher-order structure-forming RNA as template Using higher-order structure using mutant DNA polymerases T326A and L329A obtained in Examples 1 and 5 The reverse transcription activity in the case where the formed RNA was used as a template was evaluated. Evaluation was performed as follows.
次の条件でRT-PCR反応を行った。増幅鋳型RNAは配列番号８のKOD由来16S rRNAを用いた。
反応溶液：次の組成物に蒸留水を加えて50 μLにしたものを反応溶液とした。
5 x RT buf. 10 μL
2 mMdNTPs 5 μL
25 mM Mn(OAc)2 2 μL
10 μM 16 Sプライマー 3 μL
KOD total RNA 1 μL (150 ng分)
T326A／L329A (1mg /mL) 1 μL
サイクル条件：94 ℃1 分、50 ℃30 秒、68 ℃30 分、(94 ℃15秒、55 ℃15 秒、68 ℃1分)×30サイクル、4 ℃∞RT-PCR reaction was performed under the following conditions. As the amplification template RNA, KOD-derived 16S rRNA of SEQ ID NO: 8 was used.
Reaction solution: 50 μL of distilled water was added to the following composition as a reaction solution.
5 x RT buf. 10 μL
2
25 mM Mn (OAc) 2 2 μL
10 μM 16
KOD total RNA 1 μL (150 ng)
T326A / L329A (1mg / mL) 1 μL
Cycle conditions: 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 30 minutes, (94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 1 minute) x 30 cycles, 4 ° C∞
図１４はPCR産物を電気泳動した写真である。写真中「M」とあるのはマーカーを示している。「MMLV」とあるのはMMLV由来の逆転写酵素を示している。図１４に示す通り、高次構造形成RNAを鋳型とする場合、通常用いられる逆転写酵素（「MMLV」のレーンを参照）では約150 bpの夾雑バンドが増幅されてしまうのに対して、各変異型DNAポリメラーゼT326A及びL329Aではそのような夾雑バンドの非特異的増幅が見られない。これらの結果は、各変異型DNAポリメラーゼT326A及びL329Aが高次構造形成RNAを鋳型とする場合であっても特異性の高い増幅が可能であることを示している。 FIG. 14 is a photograph obtained by electrophoresis of the PCR product. “M” in the picture indicates a marker. “MMLV” indicates a reverse transcriptase derived from MMLV. As shown in FIG. 14, when a higher-order structure-forming RNA is used as a template, a commonly used reverse transcriptase (see “MMLV” lane) amplifies an approximately 150 bp contaminating band. Mutant DNA polymerases T326A and L329A do not show such nonspecific amplification of the contaminating band. These results indicate that each mutant DNA polymerase T326A and L329A can be amplified with high specificity even when higher-order structure-forming RNA is used as a template.
Claims (9)
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90％以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (A) or (B):
(A) Poly in which at least one amino acid selected from the group consisting of the 326th, 329th, 384th, 388th, 408th, and 438th amino acids is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 peptide;
(B) In the amino acid sequence of the polypeptide of (A), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution, whereby the amino acid sequence of the polypeptide of (A) A polypeptide comprising an amino acid sequence modified within 90% or more identity and having reverse transcription activity.
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目及び408番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90％以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide in which at least one amino acid selected from the group consisting of amino acids 326 and 408 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine;
(B) In the amino acid sequence of the polypeptide of (A), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution, whereby the amino acid sequence of the polypeptide of (A) A polypeptide comprising an amino acid sequence modified within 90% or more identity and having reverse transcription activity.
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、329番目及び／又は384番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ326番目及び408番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90％以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (A) or (B):
(A) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 329th and / or 384th amino acid is substituted with alanine, and at least one amino acid selected from the group consisting of the 326th and 408th amino acids is alanine A substituted polypeptide;
(B) In the amino acid sequence of the polypeptide of (A), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution, whereby the amino acid sequence of the polypeptide of (A) A polypeptide comprising an amino acid sequence modified within 90% or more identity and having reverse transcription activity.
(A)配列番号１のアミノ酸配列において、326番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド；
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90％以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。 The following polypeptide (A) or (B):
(A) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 326th amino acid is substituted with alanine, and at least one amino acid selected from the group consisting of the 388th, 408th, and 438th amino acids is substituted with alanine The polypeptide being treated;
(B) In the amino acid sequence of the polypeptide of (A), one or more amino acids are deleted, substituted or added while maintaining the amino acid substitution, whereby the amino acid sequence of the polypeptide of (A) A polypeptide comprising an amino acid sequence modified within 90% or more identity and having reverse transcription activity.
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