JP5622189B2

JP5622189B2 - 単一細胞分離用プレート

Info

Publication number: JP5622189B2
Application number: JP2010017287A
Authority: JP
Inventors: 晃宏松谷; 綾子 ▲高▼田
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2010-01-28
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2030-01-28
Also published as: JP2011152108A

Description

本発明は、細胞分離用プレートに関する。本発明によれば、細胞分離用プレートの１つのウェルに１個の細胞を効率よく分離することができ、従って、単一細胞の分析を行うことが可能である。

従来、細胞をクローニングする技術としては、例えば、大腸菌ではコロニーを形成させてクローニングする技術が一般的であった。また、培養細胞では、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングするために用いられている限界希釈法が、汎用されている。これらの方法は、単一の細胞を増殖させて、コロニーを形成させる方法であるが、増殖してきたコロニーに２個以上の細胞が含まれていることもあり、完全にクローニングを行うには、２回以上のクローニングを行う必要があった。

近年、単一の細胞を操作し、単一の細胞を解析することのできる技術開発の要求が増加している。これは同一の培養液中に存在する細胞の集団は不均一であるため、従来の生化学的技術では集団全体の分析となり、多くの細胞から得られた平均値のみが情報として得られることになるためである。個々の細胞を一細胞単位で分離し、その１つの細胞の特性を分析することが可能であれば、従来得られなかった知見を得ることが可能になる。また、従来のコロニーを形成させる方法と異なり、コロニーを形成させる時間が短縮され、分析の効率が向上する。

このような、単一の細胞を分離する技術として、マイクロウェルの配列構造を有するプレートが用いられている（非特許文献１及び２）。これは材料とする基板に井戸状の構造を製作し、井戸の穴の中に細胞を捕獲しようとするものである。すなわち、微細なマイクロウェルを２次元平面内に周期的に形成することにより、マイクロウェルアレイを作製し、単一細胞の細胞培養などに用いられている。

しかしながら、従来のマイクロウェルの配列構造は、主として１０μｍ以上の大きな細胞の操作を対象にしているため、非特許文献１及び２に記載のマイクロウェルの大きさは、約５００μｍ〜１０００μｍ四方の大きなウェルであった。最近、大腸菌などの２μｍ程度の大きさの細胞の単一分離を行うためのマイクロウェル構造を有するアレイが報告されているが（非特許文献３）、それでも直径２０μｍ、及び深さ５μｍ程度であり、大腸菌の大きさと比較すると大きなものであり、確実に大腸菌を単一細胞として分離できるものではなかった。
更に、前記非特許文献１〜３に記載のマイクロウェルアレイは、分離した細胞への栄養養供給や薬剤等の添加などにはウェルの上部を半透膜でシールする構造や、ウェルの底に試薬供給孔を設けなければならないなど、構造の複雑化と製作プロセスの複雑化という問題点があった。従って、液体中に溶けている物質の供給及び循環に優れた構造を備えており、更に大腸菌のような１μｍ程度の大きさの細菌も単一細胞として分離することのできる、単一細胞分離技術の開発が必要とされていた。

「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＡＮＤＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ）」（米国）２００４年、第８８巻、ｐ．３９９〜４１５「エレクトロフォレーシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」（ドイツ）２００９年、第３０巻、ｐ．１〜６「ラブ・オン・ア・チップ（ＬａｂｏｎａＣｈｉｐ）」（英国）２００１年、第１巻、ｐ．５０〜５５

前記非特許文献３に記載のマイクロウェルアレイは、ガラス基板に直径２０μｍ及び深さ５μｍ、又は直径７０μｍ及び深さ３０μｍのアレイを配列したものであり、それぞれのアレイは独立しているものである。このアレイに、１０^７細胞／ｍＬ、１０^８細胞／ｍＬ、又は１０^９細胞／ｍＬの濃度に希釈した大腸菌の分散液を添加し、単一の細胞が入ったウェルの百分率を計算している。いずれの濃度においても、単一の細胞が分離できたウェルは、１／８程度であることが報告されている。

本発明の目的の１つは、単一細胞を効率良く分離することのできる細胞分離用プレートを提供することである。また、本発明の他の目的の１つは、分離された細胞に、物質の供給が可能であり、またそれらの物質の循環が可能な細胞分離用プレートを提供することである。
本発明者は、前記細胞分離用プレートについて、鋭意研究した結果、半導体プロセス技術（リソグラフィとエッチング）を用いて、細胞の分析の目的に応じて最適な材料の基板上に、通液可能な開口領域を有する側壁部で包囲されたウェルを作製することによって、単一細胞の分離を効率よく行うことができる細胞分離用プレートを作製することができることを見出した。特に、本発明の単一細胞分離用プレートによれば、大腸菌のような１μｍ程度の大きさの細菌の単一細胞の分離が効率的に可能であり、更にその分離された細胞に、液体中に溶けている物質の供給及び循環もできる。
本発明は、こうした知見に基づくものである。

従って、本発明は、通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む単一細胞分離用プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、分離する細胞の長径の長さの平均値に対して、１倍を超えて４倍以下である、前記プレートに関する。
また、本発明は、通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む単一細胞分離用プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、分離する細胞を１×１０^５細胞／μＬに調整した細胞懸濁液を、前記プレート上に滴下し、ウェル上にカバーガラスを載せた場合に、２０％以上のウェルに１個の細胞が分離される条件を満たす最大の内側長である、前記プレートに関する。
本発明の単一細胞分離用プレートの好ましい態様においては、通液領域を有する側壁部が、マイクロピラーからなる側壁部である。
本発明の単一細胞分離用プレートの好ましい態様においては、前記細胞が大腸菌である。

また、本発明は、通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む細胞分離プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の面積が５００μｍ^２以下である、前記プレートに関する。
本発明の細胞分離用プレートの好ましい態様においては、通液領域を有する側壁部が、マイクロピラーからなる側壁部である。
更に、本発明は、前記単一細胞分離用プレートを用いた、単一細胞の分離方法であって、（ａ）細胞懸濁液を調整する工程、及び（ｂ）細胞懸濁液を、前記単一細胞分離用プレートに添加する工程、を含む前記方法に関する。
本発明の単一細胞の分離方法の好ましい態様においては、前記細胞が、大腸菌である。
本発明のプレートは、半導体プロセス技術を用いて製造されることが好ましく、特には、前記半導体プロセス技術は、リソグラフィープロセス及びドライエッチング又はリソグラフィープロセス及びウエットエッチングが好ましい。

本発明の単一細胞分離用プレートによれば、細胞を効率よく単一細胞に分離することができる。例えば、前記非特許文献３に記載のように、従来のマイクロウェルアレイを用いた場合、１つのウェルに１個の細胞が入る確率は、約１／８（１２．５％程度）であったが、後述の実施例に示すように、本発明の単一細胞分離用プレートを用いた場合、１つのウェルに１個の細胞が入る確率は４９％程度に向上した。
更に、この点に関して、例えば、従来の井戸状の構造のマイクロアレイでは、５μｍ四方以下の微小なウェルに大腸菌のような１μｍ程度の細菌細胞を、単一細胞として収納することが困難であった。本発明の単一細胞分離用プレートにおいては、それぞれのウェルを、通液可能な開口領域を有する側壁部による囲い構造にすることにより、各ウェルを５μｍ四方以下の大きさとしても、細胞の収納が可能となった。
本発明の細胞分離用プレートによれば、各ウェルが通液可能な開口領域を有する側壁部による囲い構造であるため、細胞への物質の供給が、その物質を含む溶液を流すことにより側壁部の開口領域を通して行うことができるため、従来の井戸状の構造のマイクロアレイのウェルと比較して、容易に行うことができる。
更に本発明の細胞分離用プレートによれば、各ウェルの間が、通液可能な開口領域を有する側壁部により仕切られているため、各ウェル間の細胞の相互作用を解析することも可能である。

本発明の細胞分離用プレートにおけるウェルの１つの態様（正四角形）を示した模式図である。Ａは１つのウェルの斜視図、Ｂはウェルを上面図、Ｃはウェルの配列の例を示す。本発明の細胞分離用プレートにおけるウェルの１つの態様（円形）を示した模式図である。Ａは１つのウェルの斜視図、Ｂはウェルを上面図、Ｃはウェルの配列の例を示す。本発明の細胞分離用プレートにおけるウェルの１つの態様（正六角形）を示した模式図である。Ａは１つのウェルの斜視図、Ｂはウェルを上面図、Ｃはウェルの配列の例を示す。本発明の細胞分離用プレートにおけるウェルの１つの態様（正四角形）を示した模式図である。Ａは１つのウェルの斜視図、Ｂはウェルを上面図、Ｃはウェルの配列の例を示す。本発明の細胞分離用プレートにおけるウェルの１つの態様（正四角形）を示した模式図である。Ａは１つのウェルの斜視図、Ｂはウェルを上面図、Ｃはウェルの配列の例を示す。実施例１（Ａ）、実施例２（Ｂ）、実施例３（Ｃ）のウェルの寸法を示した模式図である。本発明の細胞分離プレートにおけるウェルの開口部の内側における最大の内側長を示した図である。単一細胞に分離される細胞ごとに、本発明の単一細胞分離用プレートにおけるウェルの内側における最大の内側長を決定する、実験方法を模式的に示した図である。分離する細胞を、生理食塩水を用いて、１×１０^５細胞／μＬに調整した細胞懸濁液を、プレート上に１μＬ以上滴下し、ウェル上にカバーガラスを載せた場合に、１個の細胞が分離されるウェルの百分率を計算する。本発明の単一細胞分離用プレートを用いて、大腸菌を分離した場合の結果を示す写真である。Ａは内径が３．２μｍ×３．２μｍの実施例２のウェルを示し、Ｂは内径が４．２μｍ×４．２μｍの実施例３のウェルを示す。実施例１〜３の単一細胞分離用プレートを用いて、大腸菌を分離した結果を示すグラフである。

１．本発明の単一細胞分離用プレート
本発明の単一細胞分離用プレートに含まれる、それぞれのウェルは、通液領域を有する側壁部で包囲されている。側壁部は、通液領域を有する限り、特に限定されるものでなく、例えば、ほぼ直立した柱（以下、マイクロピラーと称することがある）を組みあわせたもの（図１、図２、図３、及び図４）、ウェルの周囲を囲む連続した壁部からなるもの（図５）を挙げることができる。
また、マイクロピラーの形状は限定されるものではなく、例えば、円柱、三角柱、四角柱、五角柱、又は六角柱を挙げることができる。
側壁部の高さは、分離される細胞の大きさに応じて、適宜決定することが可能であるが、分離する細胞の長径の長さ以上であることが好ましい。例えば、分離される細胞が大腸菌の場合、長径の長さが２μｍ〜４μｍであるため、側壁部の高さ（例えば、マイクロピラーの高さ）は、４μｍ以上が好ましい。
側壁部の幅（マイクロピラーの場合、マイクロピラーの径に相当する）も特に限定されるものではなく、ウェルの側壁としての十分な強度を有する幅であればよい。

前記通液領域は、液体が側壁部の外側からウェルの内側に、又はウェルの内側から側壁部の外側に通過できる領域であり、且つ分離する細胞の通過できない領域であれば、特に限定されるものではない。例えば、側壁部を構成するマイクロピラーの間の間隙（図１、図２、図３、及び図４）、及び側壁の開口部（図５）を挙げることができる。例えば、分離される細胞が大腸菌の場合、短径の長さが平均１μｍであるため、マイクロピラーの間の間隙は、０．０１μｍ以上、１μｍ未満が好ましく、０．１μｍ〜０．５μｍがより好ましい。０．０１μｍ未満であると通液が困難になることがあり、１μｍ以上になると大腸菌が間隙を通過することがあるからである。

通液領域は、側壁部の外側からウェルの内側へ液体を流入させる通路にもなる。従って、細胞を本発明の単一細胞分離用プレートで培養する場合には、通液領域を通して培養液を供給することができる。また、緩衝液に化合物（例えば、薬剤や成長因子など）を溶解させ、通液領域を通して、ウェル内の細胞に供給することが可能であり、細胞ごとにそれらの化合物に対する反応を調べることが可能である。

それぞれのウェルは、側壁部によってウェルの外部と隔てられるが、それぞれのウェルが隣り合わせに配列されてもよく（図１、図３、図４及び図５）、それぞれのウェルが側壁部によって１つずつ独立に配置されてもよい（図２）が、単一の細胞を効率よく分離するために、隣り合わせに配列されるのが好ましい。また、単一細胞分離用プレートに含まれるウェルの数も特に限定されるものではなく、目的に合わせて適宜選択することができるが、細胞の分離の効率を考えると、例えば４００以上が好ましく、２０００以上がより好ましい。
各ウェルは、通液領域を有する側壁部で包囲されているため、通液領域の大きさ（例えば、間隙の幅、側壁の開口部の大きさ）及び位置によっては、ウェルの内部に細胞の培養液又は緩衝液などを十分に保持することができないことがある。従って、本発明の単一細胞分離用プレートを用いて細胞の培養を行う場合は、培養液又は緩衝液などを保持するために、プレートに配置されたウェルの周囲に通液領域を有しない側壁を、更に有することが好ましい。

前記ウェルは、上方に開口部を有しており、この開口部から単一の細胞を各ウェルに進入させ、単一細胞として分離することができる。開口部の形状は、特に限定されるものではないが、分離される細胞が進入できる形状を有するものである。より具体的には、円形、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形などを挙げることができるが、円形、正四角形、正六角形が好ましく、正四角形が、ウェルの有効利用と、隣接のウェルと干渉も少ないことから一軸の走査で観察や分析及び細胞回収が容易となり、より好ましい。

前記開口部の内側における最大の内側長は、分離される細胞の大きさに応じて、適宜選択することができる。具体的には、最大の内側長は、分離する細胞の長径の長さの平均値に対して、１倍を超えて４倍以下であり、１．５〜４倍が好ましく、２倍〜３倍がより好ましい。１倍未満では、細胞のウェルへの進入が困難であり、４倍を超えると１つのウェルに２つ以上の細胞が進入する確率が高くなるからである。

前記開口部の内側における最大の内側長は、開口部の内側において、最大の長さを確保できる２点の間の長さを意味する。具体的には、図７に示すように、正四角形又は正六角形のウェルでは、対頂角の間の長さを示す。また、正五角形では、１つの内角を挿んだ２つの内角の間の長さを意味する。

本発明において分離される細胞は、単一の細胞であれば特に限定されるものではなく、細菌細胞、マイコプラズマの細胞、微生物細胞、動物細胞、及び植物細胞を挙げることができる。なお、２つ以上の細胞からなる多細胞生物であっても、その生物の長径の長さが、１００μｍ以下であれば、本発明の単一細胞分離用プレートを用いて、その多細胞生物を単独で分離することが可能である。

細胞の長径の長さとしては、例えば、細菌細胞は１〜１０μｍ程度、マイコプラズマは０．２μｍ程度、動物細胞が１０〜３０μｍ程度、そして植物細胞が１０〜１００μｍ程度である。これらの分離する細胞の長径の長さに基づいて、単一細胞分離用プレートのウェルの内側における最大の内側長を適宜、選択することができる。具体的には、大腸菌の場合、大腸菌の細胞の大きさを１×２μｍとすると、細胞の長径の長さは、２μｍであり、従って、開口部の内側における最大の内側長は、３〜８μｍが好ましく、４μｍ〜６μｍがより好ましく、それによって、効率よく単一の大腸菌細胞を分離することができる。
下記の表１に、代表的な細胞について、その平均的な長径の長さ及び短径の長さ、及び開口部の内側における最大の内側長を示す。
なお、実際に単一細胞の分離において、例えば同じ大腸菌であっても、細胞の大きさが少しずつ異なることがある。このような場合は、実際に分離を行う細胞の大きさに応じて、開口部の内側における最大の内側長が最適な、単一細胞分離用プレートを用いることが好ましい。

本発明の別の態様として、単一細胞分離用プレートにおけるウェルの内側における最大の内側長は、分離する細胞を１×１０^５細胞／μＬに調整した細胞懸濁液を、前記プレート上に滴下し、ウェル上にカバーガラスを載せた場合に、２０％以上のウェルに１個の細胞が分離される条件を満たす最大の内側長である。
細胞懸濁液は、分離する細胞を生理食塩水を用いて、１×１０^５細胞／μＬに調整する。プレートのウェル上に１μＬ以上の細胞懸濁液を滴下し、ウェル上部にカバーガラスをかぶせる。少なくとも１００のウェルを観察し、１個の細胞が進入したウェルの百分率を計算する。

ウェルの開口部の面積は、２０％以上のウェルに１個の細胞が分離される内側長であり、好ましくは２５％以上のウェルに１個の細胞が分離される内側長であり、より好ましくは３０％以上のウェルに１個の細胞が分離される内側長であり、最も好ましくは３５％以上のウェルに１個の細胞が分離される内側長である。

本発明の単一細胞分離用プレートは、半導体プロセス技術を用いて製造することが可能である。例えば、（１）リソグラフィープロセス（ナノインプリント又はホトエンボス等を含む）及びドライエッチング（例えば、反応性イオンエッチング）又はウエットエッチングを組み合わせる方法、及び（２）リソグラフィープロセス（ナノインプリント又はホトエンボス等を含む）のみを用いる方法（例えば、ＳＵ−８などの超厚膜レジストを用いる方法）により作製することができる。

前記方法（１）の方法の場合、基板上となる材料に、マスクとなる材料をコーティングし、リソグラフィープロセスにより、目的のマスクパターンを形成させる。このマスクパターンの形成された基板に対して、側壁部を残すようにドライエッチング又はウエットエッチングを行うことにより、本発明の単一細胞分離用プレートを製造することができる。また、側壁部の上面のマスク材料は、必要に応じて、除去することができる。
マスクパターンの形成のための電子線レジストとしては、化学増幅型レジスト、及びＰＭＭＡ等を挙げることができる。フォトレジストとしては、化学増幅型レジスト、ＰＭＭＡ、架橋型レジスト、エポキシ系レジスト、ノボラック樹脂系レジスト、及びポリイミド等を挙げることができる。
ドライエッチングは、好ましくは反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）である。反応性イオンエッチングとしては、結合型プラズマエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）、容量結合型プラズマエッチング（ＣＣＰ−ＲＩＥ）、及びＥＣＲ−ＲＩＥなどを挙げることができるが、特には結合型プラズマエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）が、高速エッチング性と面内均一性の点で好ましい。

プレートの材質は、通液領域を有する側壁部を作製することができる限り、限定されるものではないが、前記（１）の方法を用いて製造する場合、基材として、Ｓｉ、ＳｉＯ_２、ＧａＡｓ、ＩｎＰ、化合物半導体及びサファイアなどを挙げることができる。また、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）又はポリカーボネート（ＰＣ）等のポリマー材料を用いることもできる。以下の表２に、それぞれの基材、及び反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）に用いるイオンの組み合わせを例示する。
表２に記載の基材とエッチングガスの組み合わせにおいて、用いることのできるマスク材料としては、それぞれのエッチングガスに耐性のある材料、例えば酸化物や樹脂あるいは金属を挙げることができる。

前記方法（２）の方法の場合、基板上となる材料に、厚膜レジストをコーティングし、リソグラフィープロセスにより、不要なレジストを除去し、目的のレジストパターンを形成させる。この場合、残ったレジストパターンが、側壁部となり、本発明の単一細胞分離用プレートを得ることができる。厚膜レジストとしては、化学増幅型レジスト、ＰＭＭＡ、架橋型レジスト、エポキシ系レジスト、ノボラック樹脂系レジスト、及びポリイミドを挙げることができるが、好ましくはＳＵ−８（商品名）である。前記の材料をエッチングプロセスのマスク材料として用いて、マスクパターンを作成することも可能である。

２．単一細胞の分離方法
単一細胞分離用プレートは、本発明の単一細胞の分離方法に用いることができる。
本発明の単一細胞の分離方法は、前記単一細胞分離用プレートを用いるものであり、
（ａ）細胞懸濁液を調整する工程、及び（ｂ）細胞懸濁液を、前記単一細胞分離用プレートに添加する工程、を含む。
本発明の単一細胞の分離方法に用いることのできる細胞の大きさは、限定されるものではないが、０．１〜１００μｍ程度の長径の長さを有するものが好ましい。
また、工程（ａ）において調整される細胞懸濁液の細胞濃度は、特に限定されるものではないが、単一細胞の分離の効率を上げるために、１×１０^６〜１×１０^１０細胞／ｍＬが好ましく、１×１０^７〜１×１０^９細胞／ｍＬがより好ましい。
細胞懸濁液に用いる細胞の希釈液も特に限定されないが、それぞれの細胞を培養する時に用いる培養液、又はＰＢＳなどの緩衝液などを、目的に応じて使い分けることができる。

前記添加工程（ｂ）においては、工程（ａ）で調整した細胞懸濁液を、ウェルの上方から、単一細胞分離用プレートに添加する。細胞懸濁液を添加後、適当な時間放置して、細胞がウェル中に沈降することによって、分離することも可能である。また、添加した細胞懸濁液の上部から、カバーガラス等でカバーをして、分離する細胞をウェル中に進入させ、分離することもできる。

分離した細胞は、単一細胞分離用プレートで培養に用いることができる。また、単一細胞分離用プレート上で、目的に応じた試験を行うこともできる。具体的な試験としては、最小発育阻止濃度（MIC）の測定（いくつかの濃度の薬剤を供給して、細胞が生育できるかどうかを判別し、細胞が生育できない最小の濃度を決定する）を挙げることができる。
更に、分離した細胞は、公知の技術を用いて、回収することができ、例えば、レーザービームを用いた光ピンセット、又はマイクロマニィピュレーションシステムなどを用いることによって、回収することが可能である。回収した細胞は、更に、試験、検査、又は培養に用いることができる。

《単一細胞分離の機構》
従来のマイクロウェル構造のプレートを用いて細胞を分離する方法においては、基板に「穴を掘って、細胞を落とし込む」という方法により、細胞を分離していた。本発明の単一細胞分離用プレート及びそれを用いる単一細胞の分離方法においては、「柵（通液領域を有する側壁部、特にはマイクロピラー）を立てて、細胞を囲う」という方法により細胞を分離するものである。すなわち、本発明は従来技術とは全く異なる発想に基づいた方法である。
本発明の単一細胞分離用プレートにおいては、「柵を立てて、細胞を囲う」という概念を実現するために、半導体などの基板上に半導体プロセス技術を用いてマイクロピラーの格子からなるウェル構造（マイクロ囲い）を作製する。従って、前記ウェル構造の側壁部は、通液領域を有している。後述の実施例で示すように、本発明の単一細胞分離用プレートを用いた場合、従来のマイクロウェル構造のプレートを用いた場合と比較して、単一細胞への分離される比率が高い。この結果は、側壁部の通液領域から、余分な液体が排出されることによって、効率よく単一細胞が分離されるものであると考えられる。

更に、本発明の単一細胞分離用プレートにおけるウェルの実施態様の１つとして、マイクロピラーを用いた場合、液体がウェル中に容易に進入することが観察できた。一方、通常の通液領域を有さない側壁からなるウェルでは、液体のウェルへの進入が困難であった。これは、エアポケット等が形成され、液体の進入が困難になっている可能性が考えられる。本発明においては、マイクロピラー構造の採用により通液領域が確保され、エアポケットの形成が抑えられている可能性が考えられる。

３．本発明の細胞分離用プレート
本発明の細胞分離用プレートは、通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む細胞分離プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の面積が５００μｍ^２以下である。
本発明の細胞分離プレートは、前記単一細胞分離用プレートと、同じ構造を有しており、また同様の方法で作製することができるものであるが、単一の細胞を分離する用途以外に使用することのできるものである。従って、単一細胞を分離するために、それぞれの細胞ごとに規定される、ウェルの開口部の内側における最大の内側長、又は開口部の面積は、細胞ごとに規定されるものではない。
しかしながら、本発明の細胞分離用プレートは、１〜数百個の細胞をそれぞれのウェルに分離して、細胞の相互作用などを調べるために用いることができるために、開口部の面積は、３００μｍ^２が好ましく、１００μｍ^２以下がより好ましく、５０μｍ^２以下が更に好ましく、２０μｍ^２以下が最も好ましい。

前記ウェルは、通液領域を有する側壁部で包囲されているため、それぞれのウェルに外部から容易に液体を供給することが可能である。すなわち、従来のマイクロウェル構造では、液体の流れる面とウェルが同一平面内になかったが、本発明の細胞分離用プレートはウェルと液体の流れる面とが同一平面内にあるため、分離された細胞への液体の供給が、従来に比べて容易になる。
供給される液体としては、培養液、又は培養液や緩衝液に化合物（例えば、薬剤や成長因子など）を溶解させ、供給することが可能である。従って、ウェルに分離された細胞ごとに、薬剤や成長因子に対する反応を調べることが可能である。更に、隣り合わせのウェルに種類の異なる細胞を配置し、それらの細胞の相互作用（例えば、一方の細胞が分泌する化合物に対する、他方の細胞の反応）を調べることも可能である。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１》
本実施例においては、円柱形のマイクロピラーにより、ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、１．５４μｍのウェル構造を有するプレートを作製した。
円柱形のマイクロピラーは、半導体プロセス技術により以下のように製作した。ＧａＡｓ基板上に電子線レジストをスピンコーティングし、電子線リソグラフィープロセスにより、直径０．８μｍ、ピッチ１μｍの円形パターン列を直交させた一辺の長さが３μｍの格子状のレジストパターンを製作した。このレジストパターンをマスクとし、塩素ガスを用いたドライエッチング装置（誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）エッチング装置）を用いて、高さ３μｍの円柱の２次元アレイ構造を製作した。ドライエッチングのプロセス条件は、塩素流量２ｓｃｃｍ、プロセス圧力１Ｐａ、ＩＣＰパワー３００Ｗ、基板側のバイアスＲＦパワー２０Ｗとした。その後、酸素ガスを用いたプラズマエッチングによりレジストを除去し、ウェルの開口部が２．２μｍ×２．２μｍ、内側長が３．１μｍのウェルを有するプレートを作製した（図６Ａ）。

《実施例２》
本実施例においては、円柱形のマイクロピラーにより、ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、２．２４μｍのウェル構造を有するプレートを作製した。
一辺の長さが３μｍの格子状のレジストパターンに代えて、一辺の長さが４μｍの格子状のレジストパターンを用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、ウェルの開口部が３．２μｍ×３．２μｍ、内側長が４．５μｍのウェルを有するプレートを作製した（図６Ｂ）。

《実施例３》
本実施例においては、円柱形のマイクロピラーにより、ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、２．９４μｍのウェル構造を有するプレートを作製した。
一辺の長さが３μｍの格子状のレジストパターンに代えて、一辺の長さが５μｍの格子状のレジストパターンを用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、ウェルの開口部が４．２μｍ×４．２μｍ、内側長が５．９μｍのウェルを有するプレートを作製した（図６Ｃ）。

《実施例４》
本実施例では、大腸菌Ｋ−１２株Ｗ３１１０を用いて、細菌細胞の分離を行った。Ｌｅｎｎｏｘ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．１％グルコース、ｐＨ７．０）を用いて培養した静止期の大腸菌細胞を、０．８５％塩化ナトリウム水溶液（生理食塩水）で１×１０^５細胞／μＬに調整し、細胞懸濁液として用いた。本液１μＬをウェル上に滴下し、カバーガラスを載せ、分離の様子を光学顕微鏡を用いて観察した。
その結果、実施例２で作製した一辺の長さが４μｍのウェルを含むプレート、又は実施例３で作製した一辺の長さが５μｍのウェルを含むプレートを用いた場合、大腸菌細胞を分離できることが確認された（図９）。また、ウェルに収納された細胞数を計数することにより分離頻度を算出した結果、一辺の長さが４μｍのウェル（内側長４．５μｍ）においては４９％の頻度で単一細胞を分離することが可能であり、一辺の長さが５μｍのウェル（内側長５．９μｍ）を用いた場合では、３０％の頻度で単一細胞を分離することが可能であった（図１０）。
非特許文献２に記載の従来型のマイクロウェルの配列構造を用いた場合は、１２．５％程度のウェルにしか、単一の細胞が分離できないが、本発明のプレートを用いることにより、効率的に単一の細胞を分離することが可能である

本発明の単一細胞分離用プレートは、単一細胞を分離する方法に用いることができる。本発明の単一細胞分離用プレート及び単一細胞を分離する方法は、細胞を単一で分析する研究へ幅広く応用することが可能である。具体的には、モノクローナル抗体の取得、大腸菌による外来タンパク質の発現の確認、ニューロンと半導体回路の融合、及び各種マイクロ検査チップへ応用することができる。

１・・・ウェル；
１１・・・マイクロピラー；
１２・・・通液領域；
１３・・・側壁部；
１４・・・開口部の面積；
２１・・・開口部の内側における最大の内側長；
３・・・細胞分離用プレート；
３１・・・カバーガラス；
３２・・・大腸菌。

Claims

通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む単一細胞分離用プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、分離する細胞の長径の長さの平均値に対して、１倍を超えて４倍以下である、前記プレート。
通液領域を有する側壁部が、マイクロピラーからなる側壁部である、請求項１に記載の、単一細胞分離用プレート。
前記細胞が大腸菌である、請求項１又は２に記載の、単一細胞分離用プレート。
通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む単一細胞分離用プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の内側における最大の内側長が、
分離する細胞を１×１０^５細胞／μＬに調整した細胞懸濁液を、前記プレート上に滴下し、ウェル上にカバーガラスを載せた場合に、２０％以上のウェルに１個の細胞が分離される条件を満たす最大の内側長である、前記プレート。
通液領域を有する側壁部が、マイクロピラーからなる側壁部である、請求項４に記載の、単一細胞分離用プレート。
前記細胞が大腸菌である、請求項４又は５に記載の、単一細胞分離用プレート。
通液領域を有する側壁部で包囲されたウェルを含む細胞分離プレートであって、前記通液領域はウェルの側方外部からの側壁を通過する通液を可能にし、且つ分離する細胞が通過できないものであり、そして前記ウェルの開口部の面積が５００μｍ^２以下である、前記プレート。
通液領域を有する側壁部が、マイクロピラーからなる側壁部である、請求項７に記載の、細胞分離プレート。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単一細胞分離用プレートを用いた、単一細胞の分離方法であって、
（ａ）細胞懸濁液を調整する工程、及び
（ｂ）細胞懸濁液を、前記単一細胞分離用プレートに添加する工程、
を含む前記方法。
前記細胞が、大腸菌である請求項７に記載の単一細胞の分離方法。
半導体プロセス技術を用いて製造される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプレート。
前記半導体プロセス技術が、リソグラフィープロセス及びドライエッチング又はリソグラフィープロセス及びウエットエッチングである、請求項１１に記載の単一細胞分離用プレート。