JP5618335B2 - Reagent for transcriptional activity regulation - Google Patents
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Description
本発明は、分裂酵母において遺伝子発現を調節することができる化合物及び該化合物を含有する転写活性調節用試薬に関する。 The present invention relates to a compound capable of regulating gene expression in fission yeast and a reagent for regulating transcriptional activity containing the compound.
分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ；Schizosaccharomyces pombe)は、生命科学の研究材料として長年用いられてきたモデル生物である。特に近年は、分裂酵母に外部から遺伝子を導入し、その外来遺伝子の効果を評価する実験が広く行われている。
外来遺伝子の発現レベルを調節する方法としては、nmt1プロモーターを用いた方法が知られている。nmt1プロモーターは、チアミン（ビタミンB1）により不活性化し、チアミンを培地から除去することで活性化されるため、目的遺伝子のon/off型の発現調節には有用である（非特許文献１）。
しかしながら、nmt1プロモーターは低濃度のチアミンにも感受性を示し、転写活性がoffとなるため、チアミン濃度を調節することにより、目的遺伝子の発現量を随意に（例えば30%、60%というように）調節することは実質上不可能であった。この問題の解決を試みた技術として、チアミン非存在下での転写活性が減弱するような変異型nmt1プロモーターの構築例がある（非特許文献２、３）。しかし、この技術では、nmt1プロモーターの変異領域を変化させることにより外来遺伝子の発現量を段階的に調節することはできるものの、変異のタイプごとにプロモーターの活性レベルが決まっているため、随意に調節することはできない。また、この技術を用いて目的遺伝子を所望の量発現させるためには、個々の目的遺伝子ごとに複数のベクターを構築する必要があるため、操作が煩雑となる。
従って、変異型nmt1プロモーターを用いて発現量を調節する技術は、広く普及するには至っていない。
Fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) is a model organism that has been used for many years as a research material in life sciences. In particular, in recent years, experiments have been widely conducted in which a gene is introduced from the outside into fission yeast and the effect of the foreign gene is evaluated.
As a method for regulating the expression level of a foreign gene, a method using the nmt1 promoter is known. Since the nmt1 promoter is inactivated by thiamine (vitamin B1) and activated by removing thiamine from the medium, it is useful for regulating on / off expression of the target gene (Non-patent Document 1).
However, since the nmt1 promoter is sensitive to low concentrations of thiamine and its transcriptional activity is turned off, the expression level of the target gene can be adjusted arbitrarily (eg, 30%, 60%, etc.) by adjusting the thiamine concentration. It was virtually impossible to adjust. As a technique for trying to solve this problem, there is an example of construction of a mutant nmt1 promoter in which transcription activity in the absence of thiamine is attenuated (Non-patent Documents 2 and 3). However, with this technology, although the expression level of the foreign gene can be adjusted in steps by changing the mutation region of the nmt1 promoter, the activity level of the promoter is determined for each type of mutation, so it can be adjusted arbitrarily. I can't do it. In addition, in order to express a target gene in a desired amount using this technique, it is necessary to construct a plurality of vectors for each target gene, which makes the operation complicated.
Therefore, a technique for regulating the expression level using a mutant nmt1 promoter has not been widely spread.
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、酵母において、単なるon/off型の遺伝子発現調節だけではなく、目的遺伝子の発現量を随意に調節できる試薬及び方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is not only simple on / off type gene expression regulation in yeast, but also the expression level of the target gene can be arbitrarily regulated. It is to provide reagents and methods.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐な化合物であって、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を抑制する化合物を見出した。そして、当該化合物の存在下でnmt1プロモーターにより制御される外来遺伝子を発現させることにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 次式（I）：
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物を含有する、nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬。
（２）式（I）で示される化合物が、次式：
（３）nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母において、前記目的遺伝子の発現量を随意に調節するものである、上記（１）又は（２）に記載の試薬。
（４）目的遺伝子の発現量の随意調節は、前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより行うものである、上記（３）に記載の試薬。
（５）上記（１）又は（２）に記載の化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とする、nmt1プロモーターの転写活性の調節方法。
（６）前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより、前記目的遺伝子の発現量を当該濃度依存的に調節することができる、上記（５）に記載の方法。
（７）次式（I）：
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物。
（８）式（I）で示される化合物が、次式：
That is, the present invention is as follows.
(1) The following formula (I):
A reagent for regulating the transcriptional activity of the nmt1 promoter, which comprises a compound represented by the formula: pharmaceutically acceptable salts thereof or hydrates thereof.
(2) The compound represented by the formula (I) has the following formula:
(3) The reagent according to (1) or (2) above, wherein the expression level of the target gene is arbitrarily controlled in a fission yeast containing the nmt1 promoter and the target gene to be expressed.
(4) The reagent according to (3) above, wherein voluntary adjustment of the expression level of the target gene is performed by adjusting the concentration of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(5) culturing fission yeast containing the nmt1 promoter and the target gene of expression in the presence of the compound according to (1) or (2) above, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof. A method for regulating the transcriptional activity of the nmt1 promoter.
(6) The method according to (5) above, wherein the expression level of the target gene can be regulated depending on the concentration by adjusting the concentration of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(7) Formula (I):
Or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof.
(8) The compound represented by the formula (I) has the following formula:
本発明により、分裂酵母に導入した外来遺伝子の発現量を随意に調節することができる。 According to the present invention, the expression level of a foreign gene introduced into fission yeast can be arbitrarily controlled.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to this embodiment alone. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
１．概要
本発明者らは、ある外来タンパク質（HIV-1 Vpr）をnmt1プロモーターにより発現する分裂酵母株（Masuda et al., J. Virol., 2000, 74:2636-2646）を用いて、約20,000種類の化合物をスクリーニングした結果、nmt1プロモーターの転写活性を抑制する化合物を見出した。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であり、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。従って、当該化合物の存在下で外来遺伝子を含む分裂酵母を培養することにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
本発明により、式（I）で示される化合物の培地中の濃度を調節するという簡便な方法で外来性遺伝子の発現レベルを随意に調節することが可能となるため、タンパク質とその作用との関係などについて定量的な解析が容易に行うことができる。これにより、従来は技術的困難のために実施することができなかった実験、研究を積極的に行うことができる。
1. Summary The present inventors have used about 20,000 fission yeast strains (Masuda et al., J. Virol., 2000, 74: 2636-2646) expressing a foreign protein (HIV-1 Vpr) with the nmt1 promoter. As a result of screening a variety of compounds, a compound that suppresses the transcriptional activity of the nmt1 promoter was found. The thiamine regulates the expression of nmt1 promoter in an on / off manner, while the inhibitory action on nmt1 promoter is slow, and the transcriptional activity of nmt1 promoter can be regulated in a concentration-dependent manner over a wide range of concentrations. . Therefore, by cultivating fission yeast containing a foreign gene in the presence of the compound, the expression level of the gene can be arbitrarily controlled.
According to the present invention, it becomes possible to arbitrarily adjust the expression level of a foreign gene by a simple method of adjusting the concentration of a compound represented by formula (I) in a medium. Quantitative analysis can be easily performed. As a result, it is possible to actively conduct experiments and research that could not be performed due to technical difficulties.
２．式（I）で示される化合物
本発明に用いられる化合物は、以下の式（I）で示される。
式（I）：
Formula (I):
式（I）において、
R1及びR2で表される置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC3-12シクロアルキル基、置換基を有していてもよいC6-12アリール基、置換基を有していてもよいC7-13アラルキル基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいC1-6ヒドロキシルアルキル基、-NO2、-SH、-NH2、=Oが挙げられる。
また、Xとしては、例えば-CO-、-CONH-、-(PO3H)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(OPO2)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(CH2)n-（nは1〜5の整数を表す）又は-(CH2CH2O)n-（nは1〜5の整数を表す）が含まれる。
部分構造 ---- は単結合又は二重結合を表す。
In formula (I):
Examples of the substituent represented by R 1 and R 2 include a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, and an optionally substituted C 2− 6 alkenyl group, C 2-6 alkynyl group which may have a substituent, C 1-6 alkoxy group which may have a substituent, C 3-12 cyclo which may have a substituent An alkyl group, an optionally substituted C 6-12 aryl group, an optionally substituted C 7-13 aralkyl group, an optionally substituted C 1-6 alkylamino Group, a C 1-6 hydroxylalkyl group which may have a substituent, —NO 2 , —SH, —NH 2 , and ═O.
X is, for example, —CO—, —CONH—, — (PO 3 H) n — (where n represents an integer of 1 to 2), — (OPO 2 ) n — (n is an integer of 1 to 2 ) the represented), - (CH 2) n - (n represents an integer of 1 to 5) or - (CH 2 CH 2 O) n - (n is included represents) an integer of 1-5.
The partial structure ---- represents a single bond or a double bond.
本発明において、「C1-6アルキル基」とは、炭素数が１〜６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
「C2-6アルケニル基」とは、炭素数が２〜６個のアルケニル基を意味し、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基などが挙げられる。
「C2-6アルキニル基」とは、炭素数が２〜６個のアルキニル基を意味し、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基などが挙げられる。
「C1-6アルコキシ基」とは、炭素数１〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基、sec-プロポキシ基、n-ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、n-ヘキソキシ基などが挙げられる。
「C3-12シクロアルキル基」とは、炭素数３〜１２のシクロアルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基などが挙げられるが、中でもシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などの炭素数３〜７のシクロアルキル基が好ましい。
In the present invention, the “C 1-6 alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group. Isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group and the like.
The “C 2-6 alkenyl group” means an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and examples thereof include an ethenyl group, a propenyl group, a butenyl group, and a pentenyl group.
The “C 2-6 alkynyl group” means an alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, and examples thereof include an ethynyl group, a propynyl group, a butynyl group, and a pentynyl group.
“C 1-6 alkoxy group” means an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, iso-propoxy group, sec-propoxy group, n-butoxy group. , Iso-butoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, n-hexoxy group and the like.
“C 3-12 cycloalkyl group” means a cycloalkyl group having 3 to 12 carbon atoms, such as cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctyl group, cyclononyl group. Among them, a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms such as a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group is preferable.
「C6-12アリール基」とは、炭素数が6〜12個の芳香族炭化水素環式基を意味し、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、ビフェニル基などが挙げられる。
「C7-13アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、2-フェニルプロピル基などが挙げられる。
「C1-6アルキルアミノ基」としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、n-ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、sec-ブチルアミノ基、tert-ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などが挙げられる。
「C1-6ヒドロキシルアルキル基」としては、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、ヒドロキシヘキシル基などが挙げられる。
「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子、塩素原子が好ましい。
なお、「置換基を有していてもよい」とは、置換基の置換可能な位置にさらに置換基を有していてもよいことを意味し、その置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、C3-12シクロアルキル基、C6-12アリール基、C7-13アラルキル基などが挙げられる。各置換基の定義は上記と同じである。置換基の数は例えば１〜３個である。
The “C 6-12 aryl group” means an aromatic hydrocarbon cyclic group having 6 to 12 carbon atoms, such as a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, indenyl group, azulenyl group. , Heptalenyl group, biphenyl group and the like.
Examples of the “C 7-13 aralkyl group” include benzyl group, phenethyl group, 1-phenylethyl group, 2-phenylethyl group, 1-phenylpropyl group, 2-phenylpropyl group and the like.
Examples of the “C 1-6 alkylamino group” include a methylamino group, an ethylamino group, a propylamino group, an isopropylamino group, an n-butylamino group, an isobutylamino group, a sec-butylamino group, and a tert-butylamino group. Group, pentylamino group, hexylamino group and the like.
Examples of the “C 1-6 hydroxylalkyl group” include hydroxymethyl group, hydroxyethyl group, hydroxypropyl group, hydroxybutyl group, hydroxypentyl group, hydroxyhexyl group and the like.
Examples of the “halogen atom” include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, and a fluorine atom and a chlorine atom are preferable.
Note that “may have a substituent” means that a substituent may be further substituted at a substitutable position of the substituent, and examples of the substituent include a hydrogen atom, Halogen atom, C 1-6 alkyl group, C 2-6 alkenyl group, C 2-6 alkynyl group, C 1-6 alkoxy group, C 3-12 cycloalkyl group, C 6-12 aryl group, C 7-13 And aralkyl groups. The definition of each substituent is the same as the above. The number of substituents is, for example, 1 to 3.
式（I）で示される化合物は、nmt1プロモーターの転写活性を抑制することができる。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であり、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。従って、当該化合物の存在下で外来遺伝子を含む分裂酵母を培養することにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節することができる。 The compound represented by the formula (I) can suppress the transcriptional activity of the nmt1 promoter. The thiamine regulates the expression of nmt1 promoter in an on / off manner, while the inhibitory action on nmt1 promoter is slow, and the transcriptional activity of nmt1 promoter can be regulated in a concentration-dependent manner over a wide range of concentrations. . Therefore, by cultivating fission yeast containing a foreign gene in the presence of the compound, the expression level of the gene can be arbitrarily controlled.
本発明に使用される式（I）で示される化合物は、ENAMINE社（日本代理店：ナミキ商事株式会社）などから市販品として入手可能である。 The compound represented by the formula (I) used in the present invention is commercially available from ENAMINE (Japanese agency: Namiki Shoji).
本発明において、式（I）で示される化合物としては、限定されるものではないが、例えば、以下の化合物：
YAM2は、チアミンの構造類似体であるが、チアミンがピリミジンとチアゾールが結合した構造であるのに対し、YAM2のチアゾール部位には、さらにアダマンタン基がエステル結合している。このような構造を有することから、YAM2は化学合成による量産が可能である。
YAM2は、分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））において、nmt1プロモーターやその変異型誘導体を用いて外来遺伝子の発現を行う際に、プロモーターの転写活性、すなわち遺伝子の発現レベルを随意に調節するために有用である。
また、YAM2はnmt1プロモーターの転写活性をoffにするのに必要な高濃度においても、分裂酵母の増殖能には明らかな影響を与えない。従って、nmt1プロモーターにより制御される外来遺伝子を持つ分裂酵母を、培地中に適量のYAM2 を添加するという簡単な操作により培養することで、必要十分量の遺伝子発現レベルを得ることができる。
In the present invention, the compound represented by the formula (I) is not limited, but examples thereof include the following compounds:
YAM2 is a structural analog of thiamine, but thiamine has a structure in which pyrimidine and thiazole are bonded, whereas an adamantane group is further ester-bonded to the thiazole site of YAM2. Due to this structure, YAM2 can be mass-produced by chemical synthesis.
When YAM2 is used to express foreign genes in the fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) using the nmt1 promoter and its mutant derivatives, the transcriptional activity of the promoter, that is, the expression level of the gene is optionally determined. Useful for adjusting.
YAM2 does not clearly affect the growth ability of fission yeast even at the high concentration necessary to turn off the transcriptional activity of the nmt1 promoter. Therefore, a necessary and sufficient amount of gene expression can be obtained by culturing fission yeast having a foreign gene controlled by the nmt1 promoter by a simple operation of adding an appropriate amount of YAM2 to the medium.
本発明において使用される化合物は、製薬上許容される塩や水和物を形成してもよい。
製薬上許容される塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。
塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。
また、本発明において使用される化合物は、その使用形態によっては、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。
The compounds used in the present invention may form pharmaceutically acceptable salts and hydrates.
The pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited as long as it has the effect of the present invention, and may form a salt with an acid or a salt with a base.
Examples of salts with acids include salts with inorganic acids such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, formic acid, acetic acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, citric acid, tartaric acid, Examples thereof include salts with organic acids such as benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and trifluoroacetic acid.
Examples of the salt with a base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzyl. Examples thereof include salts with organic bases such as ethylenediamine (organic amine salts) and ammonium salts.
Moreover, what is called a free body which does not form a salt can also be selected for the compound used in this invention depending on the usage form.
３．nmt1プロモーター
nmt1プロモーターは、分裂酵母への遺伝子導入に際し、外来遺伝子を発現するためによく用いられる。nmt1プロモーターは、チアミンの添加、不添加により、転写活性をonとoffの二段階で切り替えることができる。しかし、これまでnmt1プロモーターの転写活性レベルを随意に調節することは容易ではなかった。本発明は、簡便な方法によりnmt1プロモーター活性の随意調節を可能にするものである。
nmt1プロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。nmt1プロモーターの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能であり、例えばGenbankアクセッション番号J05493が利用可能である。
また、本発明のnmt1プロモーターとしては、上記配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドだけでなく、変異型nmt1プロモーターも用いることもできる。変異型nmt1プロモーターとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがあげられる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
3. nmt1 promoter
The nmt1 promoter is often used for expressing foreign genes during gene transfer into fission yeast. The nmt1 promoter can switch transcriptional activity in two steps, on and off, with or without the addition of thiamine. However, it has not been easy to arbitrarily control the transcriptional activity level of the nmt1 promoter so far. The present invention enables voluntary regulation of nmt1 promoter activity by a simple method.
The nucleotide sequence of nmt1 promoter is shown in SEQ ID NO: 1. The base sequence of the nmt1 promoter can be obtained from a predetermined database, for example, Genbank accession number J05493 can be used.
Further, as the nmt1 promoter of the present invention, not only a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 but also a mutant nmt1 promoter can be used. Examples of the mutant nmt1 promoter include a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. As such a polynucleotide, for example, a polynucleotide containing a base sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in one or several nucleic acids in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
ここで、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列としては、例えば、
(a) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が欠失した塩基配列、
(b) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が他の核酸で置換された塩基配列、
(c) 配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が付加した塩基配列、
(d)上記(a)〜(c)の組合せにより変異された塩基配列
などが挙げられる。
Here, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, as a base sequence having a mutation such as deletion, substitution or addition in one or several nucleic acids, for example,
(a) 1 to 10 (eg, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is missing. Lost base sequence,
(b) 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 A base sequence substituted with the nucleic acid of
(c) 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid was added to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Base sequence,
(d) Examples include base sequences mutated by the combinations (a) to (c) above.
このようなポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発法を利用して得ることができる。詳細については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））等を参照することができる。 Such polynucleotides can be obtained using site-directed mutagenesis. For details, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) and the like can be referred to.
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜２×SSC、0.1％〜0.5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58）等を参照することができる。 Examples of stringent conditions in the above hybridization include 1 × SSC to 2 × SSC, 0.1% to 0.5% SDS, and 42 ° C. to 68 ° C., and more specifically, 30 to 60 ° C. to 68 ° C. An example is a condition in which after prehybridization is performed for at least 5 minutes, washing is performed 4 to 6 times in 2 × SSC and 0.1% SDS at room temperature for 5 to 15 minutes. For the detailed procedure of the hybridization method, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989); especially Sections 9.47-9.58) can be referred to.
４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬
本発明の試薬は、式(I)で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物（以下「式(I)で示される化合物等」）を含むものである。上記の通り、式(I)で示される化合物は、nmt1プロモーターの転写活性を抑制することができる。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であるため、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。
4). Reagent for regulating transcription activity of nmt1 promoter The reagent of the present invention comprises a compound represented by the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof (hereinafter referred to as "compound represented by the formula (I)"). Is included. As described above, the compound represented by the formula (I) can suppress the transcription activity of the nmt1 promoter. This compound regulates the nmt1 promoter transcription activity in a concentration-dependent manner over a wide range of concentrations, while thiamine regulates the expression of the nmt1 promoter on / off, while the inhibitory action on the nmt1 promoter is slow. it can.
本発明の試薬は、式(I)で示される化合物等を単独で用いてもよいし、その他に添加剤を含んでいてもよい。当該添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤などが挙げられる。これらを単独又は適宜組み合わせ、定法により本発明の試薬を製造することができる。 In the reagent of the present invention, the compound represented by the formula (I) or the like may be used alone, or may further contain additives. Examples of such additives include excipients, binders, lubricants, disintegrants, colorants, flavoring agents, emulsifiers, surfactants, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers. Agents, preservatives, antioxidants, stabilizers, absorption promoters and the like. These can be used alone or in appropriate combination to produce the reagent of the present invention by a conventional method.
本発明の試薬は、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母において、当該目的遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
「発現の目的遺伝子」とは、nmt1プロモーターに制御され、遺伝子発現の目的となる所望の外来遺伝子を意味する（本明細書において、単に「外来遺伝子」とも称する）。このような遺伝子としては、例えば、宿主細胞の増殖、生存等に関わる遺伝子（例えば、癌遺伝子、癌抑制遺伝子等）、蛍光タンパク質（GFP、RFP、YFP等）をコードする遺伝子、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子、免疫調節機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、生体物質の代謝を司る酵素タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられるが、当業者であればそれぞれの目的に応じて任意に選択することができ、限定されるものではない。
また、分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe)、シゾサッカロミセス・ジャポニクス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポルス（Schizosaccharomyces octosporus）等が挙げられるが、好ましくはシゾサッカロミセス・ポンベである。
The reagent of the present invention can arbitrarily regulate the expression level of the target gene in a fission yeast containing the nmt1 promoter and the target gene to be expressed.
The “target gene for expression” means a desired foreign gene that is controlled by the nmt1 promoter and is the target of gene expression (in this specification, it is also simply referred to as “foreign gene”). Examples of such genes include genes related to the growth and survival of host cells (eg, oncogenes, tumor suppressor genes, etc.), genes encoding fluorescent proteins (GFP, RFP, YFP, etc.), and viral proteins. A gene encoding a protein having an immunoregulatory function, a gene encoding an enzyme protein that controls metabolism of biological substances, etc., but those skilled in the art can arbitrarily select them according to their respective purposes. It is not limited.
Further, examples of the fission yeast include Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces japonicus, and Schizosaccharomyces octosporus. is there.
nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母（形質転換株）は、公知の方法、例えば以下の方法により調製することができる。
(１)組換えベクターの作製
目的遺伝子をクローニングしたプラスミドを制限酵素で切断し、目的遺伝子のDNA断片を調製する。あるいは、目的遺伝子をPCRで増幅し、DNA断片を調製する。nmt1プロモーターとleu1遺伝子を含むプラスミド（pREP1など）のnmt1プロモーター下流部位を制限酵素で切断したものと、上記により得られた目的遺伝子DNA断片とを混合し、DNAリガーゼにより結合する。形成された環状DNAを適当な宿主大腸菌（DH5αなど）に導入し、形質転換大腸菌を分離する。得られた大腸菌株を培養し、プラスミドを抽出、精製すれば、分裂酵母に導入可能な組換えベクターを調製することができる。
（２）形質転換株の作製
（１）により調製した組換えベクターを、酢酸リチウム法（Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18:6485-6489）や市販の酵母用DNA 導入試薬により、ロイシン要求性変異を有する分裂酵母に導入する。導入後の酵母細胞をロイシンを含まない寒天培地で培養し、形成された集落を単離することで、形質転換株を得ることができる。
Fission yeast (transformed strain) containing the nmt1 promoter and the target gene to be expressed can be prepared by a known method, for example, the following method.
(1) Preparation of recombinant vector The plasmid in which the target gene is cloned is cut with a restriction enzyme to prepare a DNA fragment of the target gene. Alternatively, the target gene is amplified by PCR to prepare a DNA fragment. A plasmid containing the nmt1 promoter and the leu1 gene (such as pREP1) obtained by cleaving the downstream site of the nmt1 promoter with a restriction enzyme and the DNA fragment of the target gene obtained above are mixed and combined by DNA ligase. The formed circular DNA is introduced into an appropriate host E. coli (DH5α etc.), and transformed E. coli is isolated. By culturing the obtained Escherichia coli strain and extracting and purifying the plasmid, a recombinant vector that can be introduced into fission yeast can be prepared.
(2) Preparation of transformant strain The recombinant vector prepared in (1) can be prepared using the lithium acetate method (Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18: 6485-6489) or a commercially available DNA introduction reagent for yeast. , Introduced into fission yeast having a leucine-requiring mutation. The transformed yeast can be obtained by culturing the introduced yeast cells on an agar medium not containing leucine and isolating the formed colonies.
本発明において、「随意に」とは、任意のレベル（例えば、転写活性レベル、発現量等）に、ということを意味する。例えば、転写活性について「随意に調節」とは、化合物の非存在下におけるnmt1プロモーターの転写活性を100％とした場合に、所望の転写活性レベルが60％であるときは、約60％の転写活性レベルに調節できるということを意味する。また、発現量について「随意に調節」とは、化合物の非存在下におけるnmt1プロモーターに制御された目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を100％とした場合に、所望の発現量が60％であるときは、約60％の発現量に調節できるということを意味する。但し、所望の転写活性レベル又は発現量と実際の転写活性レベル又は発現量とが完全に一致することを意味するものではなく、最大で±10％の差が生じたとしても、随意に調節できたといえる。 In the present invention, “optionally” means to an arbitrary level (eg, transcriptional activity level, expression level, etc.). For example, “optionally regulating” transcriptional activity means that when the transcriptional activity of the nmt1 promoter in the absence of a compound is 100% and the desired level of transcriptional activity is 60%, about 60% transcription is achieved. It means that the activity level can be adjusted. In addition, “optionally controlling” the expression level means that when the expression level of the protein encoded by the target gene controlled by the nmt1 promoter in the absence of the compound is 100%, the desired expression level is 60%. In some cases, it means that the expression level can be adjusted to about 60%. However, this does not mean that the desired transcriptional activity level or expression level and the actual transcriptional activity level or expression level completely match, and even if there is a difference of ± 10% at maximum, it can be adjusted arbitrarily. It can be said that.
例えば、式(I)で示される化合物としてYAM2を使用した場合、培地中のYAM2濃度を10μMとしたときは、nmt1プロモーターの転写活性又は発現タンパク質の発現量は、化合物の非存在下における活性又は量を100％とした場合に、約80％に調節でき、培地中のYAM2濃度を30μMとしたときは、約40％に調節でき、培地中のYAM2濃度を100μMとしたときは、約0％に調節できる。 For example, when YAM2 is used as the compound represented by formula (I), when the YAM2 concentration in the medium is 10 μM, the transcriptional activity of the nmt1 promoter or the expression level of the expressed protein is the activity in the absence of the compound or When the amount is 100%, it can be adjusted to about 80%. When the YAM2 concentration in the medium is 30 μM, it can be adjusted to about 40%. When the YAM2 concentration in the medium is 100 μM, it is about 0%. Can be adjusted.
上記転写活性レベルや目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量等は、公知の測定方法を用いて測定することができる。そのような測定方法としては、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロッティング法、ELISA法、免疫染色法等が挙げられる。また、転写活性レベルやタンパク質の発現量を定量するため、レーザースキャニングサイトメーター（Compucyte社）、HSオールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス社）等の測定装置を使用することもできる。 The transcriptional activity level and the expression level of the protein encoded by the target gene can be measured using a known measurement method. Examples of such measurement methods include PCR, RT-PCR, real-time RT-PCR, flow cytometry, western blotting, ELISA, and immunostaining. In addition, in order to quantify the transcriptional activity level and the protein expression level, a measuring device such as a laser scanning cytometer (Compucyte) or an HS all-in-one fluorescence microscope (Keyence) can also be used.
上記目的遺伝子の発現量の随意調節は、式（I）で示される化合物の濃度を調節することによって行うことができる。
本発明の試薬を分裂酵母の培地に添加して使用する場合、当該培地中の式（I）で示される化合物の濃度は、各実験条件において異なるが、例えば、0〜約100μMの範囲である。当該化合物を培地に100μM添加すると、nmt1プロモーターの活性はほぼ完全に抑制される。そして、当該化合物を除去することで、nmt1プロモーターを100％活性化し、遺伝子発現を誘導することができる。さらに、培地中の化合物濃度を0〜100μMの範囲で調節することにより、濃度依存的にnmt1プロモーターの活性又は目的遺伝子の発現量を100〜0%の範囲（例えば、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％）で任意に調節できる。従って、本発明の試薬を使用すれば、単にon/off型の遺伝子発現調節だけでなく、求めるレベルの転写活性及び遺伝子発現量を随意に調節することができる（図１）。図１は、式（I）で示される化合物によるnmt1プロモーター制御の概念図である。チアミン（T）を用いた従来の方法の場合、低濃度のチアミン存在下でもnmt1プロモーターの活性が強く抑えられるため、全か無かというon/off型の発現調節しかできない（図１A）。一方、式（I）で示される化合物の一つであるYAM2（Y）を用いた方法では、YAM2の濃度依存的にnmt1プロモーターの活性が徐々に変わるため、種々のレベルの遺伝子発現が得られる（図１B）。
具体的なnmt1プロモーターの転写活性等の調節方法については、以下の「５．nmt1プロモーターの転写活性調節方法」に記載する。
Voluntary adjustment of the expression level of the target gene can be performed by adjusting the concentration of the compound represented by the formula (I).
When the reagent of the present invention is used by adding it to a fission yeast medium, the concentration of the compound represented by formula (I) in the medium varies depending on each experimental condition, but is, for example, in the range of 0 to about 100 μM. . When 100 μM of the compound is added to the medium, the activity of the nmt1 promoter is almost completely suppressed. Then, by removing the compound, the nmt1 promoter can be activated 100% and gene expression can be induced. Furthermore, by adjusting the compound concentration in the medium in the range of 0 to 100 μM, the activity of the nmt1 promoter or the expression level of the target gene is controlled in a concentration range of 100 to 0% (for example, 100%, 90%, 80%). %, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 0%). Therefore, when the reagent of the present invention is used, not only on / off-type gene expression regulation but also a desired level of transcription activity and gene expression level can be arbitrarily regulated (FIG. 1). FIG. 1 is a conceptual diagram of nmt1 promoter control by a compound represented by formula (I). In the case of the conventional method using thiamine (T), the activity of the nmt1 promoter is strongly suppressed even in the presence of a low concentration of thiamine, so that only on / off type expression regulation can be performed (FIG. 1A). On the other hand, in the method using YAM2 (Y), which is one of the compounds represented by formula (I), the activity of the nmt1 promoter gradually changes depending on the concentration of YAM2, so that various levels of gene expression can be obtained. (FIG. 1B).
Specific methods for regulating the transcriptional activity and the like of nmt1 promoter are described in “5. Method for regulating transcriptional activity of nmt1 promoter” below.
５．nmt1プロモーターの転写活性調節方法
本発明の方法は、式（I）で示される化合物等の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とするものであり、前記化合物等の濃度を調節することにより、前記目的遺伝子の発現量を当該濃度依存的に調節することができるものである。
5. Method for regulating transcription activity of nmt1 promoter The method of the present invention is characterized by culturing fission yeast containing the nmt1 promoter and a target gene for expression in the presence of a compound represented by formula (I), etc. By adjusting the concentration of the compound or the like, the expression level of the target gene can be regulated depending on the concentration.
本発明の方法は、例えば以下の工程のうち少なくとも一つを含むことができる。
(i)nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を調製する工程、
(ii)前記分裂酵母の培地に式（I）で示される化合物等を添加する工程、
(iii)前記分裂酵母を式（I）で示される化合物等の存在下で培養する工程、
(iv)nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する工程、及び
(v)前記測定結果に基づいて、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度を調節することにより、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を当該濃度依存的に調節する工程。
The method of the present invention can include, for example, at least one of the following steps.
(i) a step of preparing a fission yeast containing the nmt1 promoter and a target gene for expression,
(ii) adding a compound represented by the formula (I) to the fission yeast medium,
(iii) culturing the fission yeast in the presence of a compound or the like represented by the formula (I),
(iv) a step of measuring the transcriptional activity of the nmt1 promoter or the expression level of the protein encoded by the target gene of expression, and
(v) Based on the measurement result, by adjusting the concentration of the compound represented by the formula (I) in the medium, the transcriptional activity of the nmt1 promoter or the expression level of the protein encoded by the target gene of the expression Adjusting in a dependent manner.
上記工程(i)におけるnmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母の調製方法については、上記「４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬」に記載した通りである。 The method for preparing the fission yeast containing the nmt1 promoter and the target gene to be expressed in the step (i) is as described in “4. Reagents for regulating transcriptional activity of the nmt1 promoter”.
上記工程(ii)において、分裂酵母の培地としては、最小培地（MM）やMB培地等（Experiments with Fission Yeast: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993）が挙げられる。培地には、Geneticin、Aureobacidin等の抗生物質や、その他の添加物としてアデニン、ウラシル等を添加してもよい。また、式（I）で示される化合物の添加量は、各実験条件において異なるが、例えば、培地中の濃度が0〜約100μMとなるような範囲の量である。当該培地中の化合物濃度の範囲は、当業者であれば各実験条件により適宜変更することができる。 In the step (ii), examples of the fission yeast medium include minimal medium (MM) and MB medium (Experiments with Fission Yeast: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Antibiotics such as Geneticin and Aureobacidin, and other additives such as adenine and uracil may be added to the medium. The amount of the compound represented by formula (I) varies depending on each experimental condition, but is, for example, an amount in a range such that the concentration in the medium is 0 to about 100 μM. Those skilled in the art can appropriately change the range of the compound concentration in the medium depending on each experimental condition.
上記工程(iii)において、「式（I）で示される化合物等の存在下で培養する」とは、具体的には、式（I）で示される化合物等を含む培地中で培養することを意味する。
培養時間は、化合物を添加してから約10〜48時間であり、好ましくは約16〜24時間である。なお、化合物を添加する前に約16〜24時間プレインキュベーションをすることができる。
培養温度は、約20〜36℃であり、好ましくは約25〜30℃である。
In the above step (iii), “culturing in the presence of the compound represented by the formula (I)” specifically means culturing in a medium containing the compound represented by the formula (I). means.
The culture time is about 10 to 48 hours after the compound is added, and preferably about 16 to 24 hours. In addition, pre-incubation can be performed for about 16 to 24 hours before adding the compound.
The culture temperature is about 20 to 36 ° C, preferably about 25 to 30 ° C.
工程(iv)において、nmt1プロモーターの転写活性を測定する方法、並びに発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量の測定方法については、上記「４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬」に記載した通りである。
例えば、発現の目的遺伝子としてGFP遺伝子を使用した場合、フローサイトメトリー法を用いて、GFP発現細胞の数を測定することにより、nmt1プロモーターの転写活性及びGFPの発現量を測定することができる。
また、nmt1プロモーター依存的に発現したタンパク質を分裂酵母から抽出し、ウエスタンブロッティング法等により、当該タンパク質の発現量を測定することもできる。
The method for measuring the transcriptional activity of the nmt1 promoter in step (iv) and the method for measuring the expression level of the protein encoded by the target gene of expression are described in “4. Reagents for regulating transcriptional activity of the nmt1 promoter” above. Street.
For example, when the GFP gene is used as a target gene for expression, the transcriptional activity of nmt1 promoter and the expression level of GFP can be measured by measuring the number of GFP-expressing cells using flow cytometry.
In addition, a protein expressed depending on the nmt1 promoter can be extracted from fission yeast, and the expression level of the protein can be measured by Western blotting or the like.
工程(v)においては、上記工程(iv)において得られた測定結果に基づき、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度と、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量との関係について、標準曲線を作成することができる。
そして、標準曲線に基づき、所望の量のタンパク質発現に至適な化合物濃度を決定する。
これにより、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度を調節することにより、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を当該濃度依存的に調節することができる。
In step (v), based on the measurement result obtained in step (iv) above, the concentration of the compound represented by formula (I) in the medium and the target gene for transcriptional activity or expression of nmt1 promoter are encoded. A standard curve can be created for the relationship with the protein expression level.
Based on the standard curve, the optimum compound concentration for the desired amount of protein expression is determined.
Thereby, by adjusting the concentration of the compound represented by the formula (I) in the medium, the transcriptional activity of the nmt1 promoter or the expression level of the protein encoded by the target gene to be expressed can be regulated depending on the concentration. it can.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
１．式(I)で示される化合物の取得
本発明の化合物は、以下の方法により約20,000種類の低分子化合物群からスクリーニングすることにより取得した。
まず、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のアクセサリータンパクの一種であるVprにヒスチジン（His）標識したもの（His-Vpr）をnmt1プロモーター依存的に発現する分裂酵母株Sp-His-Vprを樹立した。この株は、チアミン存在下ではnmt1プロモーターの転写活性が抑制され、His-Vprを発現しないため、正常に増殖する。一方、チアミン非存在下では、nmt1プロモーターが活性化し、His-Vprが発現するため、Vprの効果によりSp-His-Vpr株の増殖は著しく阻害される。96穴プラスチックプレートの各穴にスクリーニング対象となる各化合物（1 mMのDMSO溶液）をあらかじめ2μl入れておき、これにSp-His-Vpr株細胞の細胞懸濁液（0.15% のBactoagarを含むMM培地にSp-His-Vpr株の細胞を3,000個／ml含む）を100μlずつ添加した。これを30℃で5日間培養し、Sp-His-Vpr株細胞の増殖を肉眼および実体顕微鏡で観察した。チアミンやスクリーニング対象化合物を添加していない対照サンプルと比較して、細胞増殖が明らかに促進している穴を見出すことでスクリーニングを行った。
1. Acquisition of Compound represented by Formula (I) The compound of the present invention was acquired by screening from about 20,000 kinds of low molecular weight compounds by the following method.
First, a fission yeast strain Sp-His-Vpr that expresses Vpr, a kind of accessory protein of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), labeled with histidine (His) (His-Vpr) in an nmt1 promoter-dependent manner Was established. This strain grows normally in the presence of thiamine because the transcriptional activity of the nmt1 promoter is suppressed and His-Vpr is not expressed. On the other hand, in the absence of thiamine, the nmt1 promoter is activated and His-Vpr is expressed. Therefore, the growth of the Sp-His-Vpr strain is remarkably inhibited by the effect of Vpr. 2 μl of each compound to be screened (1 mM DMSO solution) is placed in each well of a 96-well plastic plate in advance, and a cell suspension of Sp-His-Vpr cell line (MM containing 0.15% Bactoagar) 100 μl each of Sp-His-Vpr strain cells (containing 3,000 cells / ml) was added to the medium. This was cultured at 30 ° C. for 5 days, and the growth of Sp-His-Vpr strain cells was observed with the naked eye and a stereomicroscope. Screening was performed by finding holes where cell growth was clearly promoted compared to control samples without addition of thiamine or compounds to be screened.
上記スクリーニングの結果、式(I)で示される化合物を取得した。式（I）で示される化合物の代表例として、下記式で示す化合物（以下、「YAM2」と称する）を以下の実施例に用いた。
２．形質転換体の作製
（１）組換ベクターの作製
組換えベクターは、以下のようにして作製した。
市販のプラスミドpEGFP-N1（CLONTECH社）を制限酵素により切断し、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子断片を調製した。既知のプラスミドpREP1（Maundrell K. Thiamine-repressible expression vectors pREP and pRIP for fission yeast. Gene. 123:127-130, 1993）のnmt1プロモーターの下流で制限酵素切断したものを調製し、上記のGFP遺伝子断片と混合し、DNAリガーゼ処理により環状DNAを作製した。これを、大腸菌DH5α株に導入し、アンピシリン含有寒天培地で培養することで形質転換株を選択し、この形質転換株からnmt1プロモーターの下流にGFP遺伝子が結合した組換えベクターを単離した。
2. Preparation of transformant (1) Preparation of recombinant vector A recombinant vector was prepared as follows.
A commercially available plasmid pEGFP-N1 (CLONTECH) was cleaved with a restriction enzyme to prepare a gene fragment encoding green fluorescent protein (GFP). Prepare a plasmid pREP1 (Maundrell K. Thiamine-repressible expression vectors pREP and pRIP for fission yeast. Gene. 123: 127-130, 1993) cleaved with a restriction enzyme downstream of the nmt1 promoter, and the GFP gene fragment And circular DNA was prepared by DNA ligase treatment. This was introduced into Escherichia coli DH5α strain and cultured on ampicillin-containing agar medium to select a transformant. A recombinant vector having a GFP gene bound downstream of the nmt1 promoter was isolated from this transformant.
（２）形質転換体の作製
上記（１）で作製した組換えベクターを分裂酵母に形質転換することにより、GFPを発現する形質転換体を取得した。形質転換は、市販の酵母用DNA導入試薬（Fast Yeast Transformation kit; G-Bioscience社）を用いて行った。
(2) Preparation of transformant A transformant expressing GFP was obtained by transforming the recombinant vector prepared in (1) above into fission yeast. The transformation was performed using a commercially available yeast DNA introduction reagent (Fast Yeast Transformation kit; G-Bioscience).
３．式（I）で示される化合物によるnmt1プロモーターの転写活性調節
上記２．で取得した形質転換株を0、0.3、1、3、10μMのチアミン、あるいは1、3、10、30、100μMのYAM2を含む液体培地で振盪培養したものを顕微鏡で観察した。
その結果、培地にチアミンを添加した場合、0.3μMの低濃度でも、GFPの発現は顕著に低下し、1μM以上では、ほぼ完全に発現が抑制された。一方、YAM2を培地に添加した場合は、0〜100μMの範囲で、濃度依存的にGFPの発現が調節（抑制）されることが確認された（図２A）。また、100μMのYAM2存在下で分裂酵母を培養しても、YAM2自体による細胞毒性や細胞増殖への影響は認められなかった。図２Aにおいて、上段は通常の白色光観察を示し、下段は蛍光観察を示す。
3. Regulation of transcriptional activity of nmt1 promoter by the compound represented by formula (I) The transformants obtained in the above were shake-cultured in a liquid medium containing 0, 0.3, 1, 3, 10 μM thiamine or 1, 3, 10, 30, 100 μM YAM2 and observed under a microscope.
As a result, when thiamine was added to the medium, the expression of GFP was remarkably reduced even at a low concentration of 0.3 μM, and the expression was almost completely suppressed at 1 μM or more. On the other hand, when YAM2 was added to the medium, it was confirmed that the expression of GFP was regulated (suppressed) in a concentration range in the range of 0 to 100 μM (FIG. 2A). Further, even when fission yeast was cultured in the presence of 100 μM YAM2, cytotoxicity and cell proliferation by YAM2 itself were not observed. In FIG. 2A, the upper row shows normal white light observation, and the lower row shows fluorescence observation.
また、上記の細胞におけるGFPの発現についてフローサイトメーターFACS Caliber（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて解析した。顕微鏡観察の結果に合致して、チアミンでは低濃度でもGFPの発現強度や発現細胞数が激減するのに対し、YAM2では100μMまでの広い範囲でYAM2濃度依存的にGFP発現の変化が認められた（図２B）。 In addition, the expression of GFP in the above cells was analyzed using a flow cytometer FACS Caliber (Becton Dickinson). Consistent with the results of microscopic observation, GFP expression intensity and the number of cells were drastically decreased with thiamin even at low concentrations, while YAM2 showed changes in GFP expression in a wide range up to 100 μM depending on the YAM2 concentration. (Figure 2B).
以上より、式（I）で示される化合物の濃度を調節することにより、当該濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができ、また、発現の目的となる遺伝子の発現量を随意に調節できることが示された。 From the above, by adjusting the concentration of the compound represented by formula (I), the transcriptional activity of the nmt1 promoter can be regulated in a concentration-dependent manner, and the expression level of the gene targeted for expression can be optionally set. It was shown that it can be adjusted.
本発明により、分裂酵母に導入した外来遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
分裂酵母は研究用モデル生物として長年用いられているため、本発明は分裂酵母を用いた研究における試薬として有用である。また、分裂酵母を用いた組換えタンパク質の製造産業における応用も考えられる。
According to the present invention, the expression level of a foreign gene introduced into fission yeast can be arbitrarily controlled.
Since fission yeast has been used for many years as a model organism for research, the present invention is useful as a reagent in research using fission yeast. Moreover, the application in the manufacturing industry of the recombinant protein using a fission yeast is also considered.
配列番号１：合成DNA SEQ ID NO: 1 synthetic DNA
Claims (5)
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物を含有する、nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬。 The following formula:
A reagent for regulating the transcriptional activity of the nmt1 promoter, which comprises a compound represented by the formula: pharmaceutically acceptable salts thereof or hydrates thereof.
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とする、nmt1プロモーターの転写活性の調節方法。 The following formula:
The transcriptional activity of nmt1 promoter is characterized by culturing fission yeast containing the nmt1 promoter and a target gene of expression in the presence of a compound represented by the formula: pharmaceutically acceptable salts thereof or hydrates thereof. Method.
The method according to claim 4 , wherein the expression level of the target gene can be regulated depending on the concentration by regulating the concentration of the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
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