JP5597366B2 - 新規セロビオヒドロラーゼ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードするDNA:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
〔2〕以下の(c)又は(d)のDNA:
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
〔3〕以下の(a)又は(b)のポリペプチド:
(a)配列番号2により示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
〔4〕上記〔1〕又は〔2〕に記載のDNAを含む組換えベクター。
〔6〕形質転換体がマグナポルテ属(Magnaporthe)子嚢菌である、上記〔5〕に記載の形質転換体。
〔7〕植物由来原料を請求項3に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、植物由来原料の糖化のための方法。
〔8〕以下のステップ:
(a)上記〔5〕又は〔6〕に記載の形質転換体を培養するステップ、及び
(b)培養後の培地及び/又は形質転換体からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
あるいは、以下の(c)又は(d)のDNA:
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
を意味する。
(a)本発明のセロビオヒドロラーゼ遺伝子で形質転換された形質転換体を培養するステップ、及び
(b)培養後の培地及び/又は宿主からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法にも関する。
イネいもち病菌(マグナポルテ・オリゼ(Magnaporthe oryzae))由来セロビオヒドロラーゼのクローニング
マグナポルテ・オリゼ(イネいもち病菌)がイネに感染する際に発現している細胞壁分解酵素の遺伝子を解析した結果、マグナポルテ・グリセアのMG05520.6遺伝子に相同性を有する遺伝子が高発現していることを見出した。MG05520.6遺伝子配列に基づき、以下のプライマーを作製した。
アンチセンス:5’−ctacaagggtgggttggcgttggtg−3’(配列番号4)
イネいもち病菌(マグナポルテ・オリゼ(Magnaporthe oryzae))のイネ感染時におけるセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)遺伝子の発現解析
イネいもち病菌(マグナポルテ・オリゼ(Magnaporthe oryzae)Ina72株)(神戸大学 土佐幸雄教授から供与)をスプレーによりイネへ感染し、1、2、3、4日後のイネの葉を回収した。これらから抽出したtotal RNAに対して、オリゴdTと逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、First strand cDNAを合成した。本発明のセロビオヒロドラーゼ(MoCel6A)遺伝子に対する特異的なプライマーを用いてPCRを行い、セロビオヒロドラーゼ(MoCel6A)のDNA断片を増幅した。アガロース電気泳動により本発明のセロビオヒロドラーゼ(MoCel6A)の発現量を測定した。
本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)を生産するイネいもち病菌の作出
配列番号1に示されるセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の遺伝子(1〜1461塩基)及び連続する7個のヒスチジン(ヒスチジンタグ)をコードする遺伝子を含むpBAFベクターをPEG法によりイネいもち病菌(マグナポルテ・オリゼ(Magnaporthe oryzae))に遺伝子導入した(Jeong,J.S.,Mitchell, T.K. and Dean,R.A.(2007)The Magnaporthe grisea snodprot1 homolog, MSP1, is required for virulence.FEMS Microbiol Lett.273(2),157−165)。遺伝子導入されたイネいもち病菌(形質転換イネいもち病菌)はビアラフォス(Bialaphos sodium salt、250μg/mL、和光純薬工業)を含むYSプレート(1%Yeast extract、1% Sucrose、1.5% Agar)上で選抜し、それぞれの形質転換イネいもち病菌をYG液体培地で25℃、4日間培養した。フィルター濾過と遠心分離により液体培地を回収し、限外濾過により濃縮及び脱塩(グルコースやオリゴ糖の除去も含む)した後、加水分解活性を測定した。加水分解反応は、セルロース(Sigmacell 20(Sigma)、5mg)とリン酸ナトリウム(100mM、pH6.0)、酵素標品(液体培地の濃縮液)を含む100μLの反応液を30℃で18時間処理した後、PARBAR法(Miller,M.(1972)A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.Anal.Biochem.47,273−279)により水可溶性画分の還元力を測定することにより、加水分解活性を決定した。以上の方法により加水分解活性を有し、本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)を生産するイネいもち病菌を作出した。
セロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の精製及びウエスタンブロット
本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)を生産する形質転換イネいもち病菌を4日間培養した培地を限外濾過で濃縮した後、ヒスチジン結合樹脂(TALON Metal Affinity Resin、Clontech)を用いてセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の精製を行った。
結果を図2及び図3に示す。
セロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の活性測定
本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)、セルロース(Sigmacell 20、5mg)又はセロオリゴ糖(0.8mg)、リン酸ナトリウム(100mM、pH6.0)を含んだ反応液(100μL)を30℃、18時間処理した。その後、PARBAR法及びLC/MASS解析、TLC(Thin layer chromatography)により本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の加水分解活性を決定した。
結果を図4〜図7及び表1、2に示す。
セロオリゴ糖の蛍光標識化
10mgのセロオリゴ糖(C2:セロビオース、C3:セロトリオース、C4:セロテトラオース、C5:セロペンタオース、C6:セロへキサオース、生化学工業)を3mLのSodium cyanoborohydoride(4%)を含む飽和炭酸水素アンモニウムに溶解し、室温、7日間放置した。この溶液を凍結乾燥及びBio−Gel P−2(Bio−Rad)によるゲル濾過を行った後、ニンヒドリン反応により陽性を示す画分を再度凍結乾燥した。次にホウ酸ナトリウム(3%、pH9.0)にアミノ化したセロオリゴ糖を溶解し、Lissamine Rhodamine B−Sulfonyl Chloride(1.33%)(Polysciences)を加え、室温、16時間放置した。未反応の蛍光色素を除くため、反応液をBio−Gel P−2にアプライし、蛍光標識したセロオリゴ糖を精製した。蛍光標識したセロオリゴ糖を基質として本発明のセロビオヒドロラーゼの加水分解反応を解析する際、反応産物をシリカゲル上においてブタノール:酢酸:水=3:1:1で分離した。
蛍光標識セロオリゴ糖を用いた本発明のセロビオヒドロラーゼの酵素活性解析
上記で調製した蛍光標識したセロテトラオース(C4−SR)、セロペンタオース(C5−SR)、セロへキサオース(C6−SR)を基質として、本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)による加水分解反応産物を調べた。具体的には、以下の反応条件を用いた:蛍光標識したセロオリゴ糖200μg、本発明のセロビオヒドロラーゼ0.5μg、リン酸ナトリウム100mMを含む反応液20μLを、30℃でインキュベートした。反応産物はシリカゲル上でブタノール:酢酸:水=3:1:1で展開した。
結果を図8に示す。
セロビオースによる本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の加水分解活性の阻害
セロビオヒドロラーゼによるセルロースやセロオリゴ糖の加水分解により生じるセロビオース及び反応系に加えられたセロビオースは、セロビオヒドロラーゼの加水分解反応を阻害することが報告されている(Morag,E.,Halevy,I.,Bayer,E.A.and Lamed,R.(1991)Isolation and properties of a major cellobiohydrolase from the cellulosome of Clostridium thermocellum.J.Bacteriol.173,4155−4162)。したがって、本発明のセロビオヒドロラーゼの加水分解活性に対するセロビオースの影響を調べるために、本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の加水分解反応系に1〜15%のセロビオースを添加し、基質となるセロペンタオース及びセロへキサオースの加水分解を調べた。セロビオース(0〜15%)、本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)、セロペンタオース(0.8%)又はセロへキサオース(0.8%)、リン酸ナトリウム(100mM、pH6.0)を加えた反応液(100μL)を30℃でインキュベートした。反応産物はTLC、LC−MASS、蛍光標識セロオリゴ糖を利用することにより解析した。本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の加水分解のメカニズムを表
す模式図を、図9に示す。白丸はグルコース残基、斜線は蛍光標識の施された1−amino−1−deoxyglucitolを表す。
結果を図10〜12に示す。
本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)の加水分解活性に対する金属イオンの影響
本発明のセロビオヒドロラーゼ(MoCel6A)とセルロース(Sigmacell 20)、リン酸ナトリウム(100mM、pH6.0)、金属塩化物(CaCl2、MnCl2、ZnCl2、FeCl2、SnCl2、又はNaCl)を加えた反応液(100μL)を30℃、18時間インキュベートした。反応産物の解析はPARBAR法(Miller,M.(1972)A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.Anal.Biochem.47,273−279)により行った。
結果を図13A及びBに示す。
Claims (8)
- 以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードするDNA:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 以下の(c)又は(d)のDNA:
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号1に示される塩基配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 以下の(a)又は(b)のポリペプチド:
(a)配列番号2により示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。 - 請求項1又は2に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項1又は2に記載のDNAにより形質転換された形質転換体。
- 形質転換体がマグナポルテ属(Magnaporthe)子嚢菌である、請求項5に記載の形質転換体。
- 植物由来原料を請求項3に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、植物由来原料の糖化のための方法。
- 以下のステップ:
(a)請求項5又は6に記載の形質転換体を培養するステップ、及び
(b)培養後の培地及び/又は形質転換体からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法。
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